KR101908905B1 - 인플루엔자 바이러스의 h9 및 h5의 다중 아형에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 각기 다른 아형 H9 및 H5의 인플루엔자 바이러스에 대한 교차 면역반응에 효과가 있는 신규한 인플루엔자 바이러스, 이를 유효성분으로 함유하는 백신 및 상기 백신을 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 각기 다른 두 가지 아형(subtype)에서 유래된 헤마글루티닌 HA1 영역과 HA2 영역을 융합하여 제조한 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함함으로써 다양한 종류의 아형(subtype) 및 계통(clade)을 가진 바이러스에 대해 교차 면역반응 효과를 나타냄에 따라, 광범위한 중화 항체 효과를 가진 바이러스 백신의 용도로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인플루엔자 바이러스의 H9 및 H5의 다중 아형에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신{RECOMBINANT INFLUENZA VIRUS TO FORM CROSS-PROTECTION AGAINST MULTIPLE SUBTYPES H9 AND H5 OF INFLUENZA VIRUSES AND VACCINE COMPRISING THE SAME}

본 발명은 각기 다른 H9 및 H5의 다중 아형의 인플루엔자 바이러스에 대한 교차 면역반응에 효과가 있는 신규한 인플루엔자 바이러스, 이를 유효성분으로 함유하는 백신, 상기 백신을 개체에 투여하여 H9 및 H5 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법, 상기 바이러스 또는 이의 항원을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 진단용 조성물 또는 상기 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 직경이 약 125nm인 입자 크기를 갖는 RNA 외피 바이러스이다. 바이러스는 기본적으로 리피드 이중층 구조 및 외부 글리코단백질을 갖는 바이러스 외피에 의해 둘러 쌓여진 내부 뉴클레오캡시드 또는 핵단백질과 결합된 리보핵산(RNA)의 코어로 이루어져 있다. 바이러스 외피의 내부층은 주로 매트릭스 단백질로 이루어지며, 외부층은 주로 숙주-유래 리피드 물질로 이루어진다.

인플루엔자 바이러스 게놈은 11개의 단백질 (HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2)를 코드화시키는 8개의 단일 RNA 가닥 상에 함유된다. 게놈의 분절화 성질은 세포 공동서식 동안 상이한 바이러스 균주 사이에서 전체 유전자의 교환을 허용한다. 8개의 RNA 분절은 혈구응집소를 인코딩하는 HA; 뉴라미니다아제를 인코딩하는 NA; 핵단백질을 인코딩하는 NP; 동일한 RNA 분절로부터 상이한 해독 구조를 사용함으로써 2개의 매트릭스 단백질 (M1 및 M2)을 인코딩하는 M; 동일한 RNA 분절로부터 상이한 해독 구조를 사용함으로써 2개의 독특한 비구조 단백질 (NS1 및 NEP)을 인코딩하는 NS; RNA 폴리머라아제를 인코딩하는 PA; 동일한 RNA 분절로부터 상이한 해독 구조를 사용함으로써 RNA 폴리머라아제 및 PB1-F2 단백질 (아팝토시스를 유도함)을 인코딩하는 PB1; 및 RNA 폴리머라아제를 인코딩하는 PB2로 이루어져 있다.

이러한 인플루엔자 바이러스는 두 개의 표면 당단백질인, 헤마글루티닌(Hemagglutinin: HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase: NA)로 구성된 고도의 다형성 입자로서, 헤마글루티닌은 바이러스의 숙주 세포에의 부착과 바이러스의 세포 침투 동안 바이러스-세포막의 융합을 매개하며, 이러한 표면 단백질, 특히 헤마글루티닌은 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 것으로 알려져 있다.

인플루엔자 바이러스는 항원의 차이에 기초하여 A형, B형 및 C형으로 분류한다. 인플루엔자 A 바이러스는 서브타입 또는 타입, 지리적 기원, 균주 번호 및 단리 연도를 포함하는 명명법에 의하여, 예를 들면 A/베이징/353/89로 기술된다. 적어도 16개의 HA 서브타입(H1-H16)과 9개의 NA 서브타입(N1-N9)이 있다. 모든 서브타입은 조류에서 발견되나, H1-H3 및 N1-N2는 인간, 돼지 및 말에서 발견된다[참고 문헌 : Murphy and Webster, orthomyxoviruses, in Virology, ed. Fields, B.N., Knipe, D.M., Chanock,R.M., 1091-1152(Raven Press, New York, (1990)]. 최근 HA서브타입의 경우 H18, NA N11까지도 발견되었다는 보고가 있다[참고: Suxiang Tong et al,"New World Bats Harbor Diverse Influenza A Viruses" PLoS Pathogens,(October 2013)].

인플루엔자는 인수 공통 전염병으로서, 인플루엔자 바이러스는 변이성이 크며 한 종에서 다른 종으로 바로 전파될 수 있는 가능성을 가지고 있어, 고병원성 인플루엔자의 세계적인 전파를 해결하는 일이 큰 과제로 떠오르고 있다. 수의분야와 관련하여 인플루엔자 바이러스는 거의 모든 포유류에 감염을 일으키므로 숙주 범위가 넓은 질병에 속한다. 돼지, 닭과 같은 산업동물의 경우 단일 감염으로 소모성 질병 혹은 다른 바이러스 및 세균과 혼합 감염됨으로써 농가에 막대한 경제적 피해를 주기 때문에, 지속적인 생독 및 사독백신을 통한 주기적인 백신접종을 실시하고 있다.

본 발명자들은 다양한 아형을 가지고 있는 A형 인플루엔자를 보다 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 백신을 개발하기 위하여 노력하였으며, 그 결과 각기 다른 두 가지 아형(subtype, H9 및 H5)에서 유래된 헤마글루티닌 HA1 영역과 HA2 영역을 융합하여 제조한 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스의 경우 H9N2 혈청형, H5N8 혈청형을 가진 A형 인플루엔자 바이러스에 대해 교차 면역반응을 효과적으로 형성하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제10-2010-0102593호 한국공개특허 제10-2008-0113217호

따라서 본 발명의 목적은, 두 가지 아형 H9 및 H5의 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 다중 아형 H9 및 H5에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 바이러스 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 이용하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 바이러스 또는 항원을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 이용한 항원-항체 반응을 통해 감염될 또는 감염된 세포 내에서 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)의 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 두 가지 아형(subtype) H9 및 H5의 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키메릭 헤마글루티닌 유전자는 A/CK/Korea/04163/04 (H9N2) 유래의 HA1 과; A/MD/Korea/W452/2014 (H5N8) 유래의 HA2 유전자 영역이 융합된 형태일 수 있다.

본 발명의 일 실시에 있어서, 상기 A/CK/Korea/04163/04 바이러스는 2004년 이후로 주로 분류되는 조류 인플루엔자 바이러스로서, 양계농장의 산란저하 및 낮은 폐사율, 난각변색, 난질저하, 사료섭취 저하 등을 유발하는 것으로 보고되었다. 또한 상기 A/MDk/Korea/W452/2014 바이러스는 2014년 분리된 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 A/MDk/Korea/W452/2014 (H5N8) 유래의 HA2 유전자 영역은 엑토도메인, 막관통과 및 세포질 영역을 포함한 부분으로, 분절 부위는 A/CK/Korea/04163/04 바이러스의 유전자 서열을 사용하였기에, 2014년 발생한 고병원성 조류인플루엔자 바이러스가 지니는 특징 중 하나인 multibasic 분절 부위(multibasic cleavage site)가 결여된 H5N8(A/MDk/Korea/W452/2014)을 융합한 하나의 키메릭 H9/H5 HA 구조일 수 있다. (HA1 part는 A/CK/Korea/04163/04 바이러스의 부분을 이용하였기에 cleavage site는 A/CK/Korea/04163/04 바이러스의 유전자 서열을 사용하였습니다)

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키메릭 헤마글루티닌 유전자는 서열번호 3로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 백신은 바이러스를 약독화된 생독 백신, 사독 백신 또는 서브유닛 백신(면역원성 단편)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이러스는 H9N2 혈청형, H5N1, H5N8을 포함한 모든 H5 혈청형을 가진 A형 인플루엔자 바이러스 모두에 대해 교차 면역반응을 형성할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 백신을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 진단용 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 이용한 항원-항체 반응을 통해 감염될 또는 감염된 세포 내에서 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)는 두 가지 아형(subtype) H9 및 H5에서 유래된 헤마글루티닌 HA1 및 융합 펩타이드 영역과 HA2 영역을 융합하여 제조한 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함함으로써 다양한 종류의 아형(subtype) 및 계통(clade)을 가진 바이러스에 대해 교차 면역반응(Cross-protection) 효과를 나타냄에 따라, 범 혈청형의 백신 효과를 가지며, 같은 그룹형의 조류인플루엔자 바이러스 항체에 대한 범 중화 항체의 선별을 통한 감별 진단법 및 중화항체 능력검증이 가능해 질 수 있다.

도 1의 (A)는 일반적인 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 유전자 구조를 모식화하여 나타낸 것이며, (B)는 본 발명의 키메릭 헤마글루티닌 유전자(cH9/H5 HA) 구조를 모식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 역유전학(Reverse Genetics) 시스템으로 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조하는 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스의 효능을 확인하기 위하여 실험동물인 마우스 및 닭에 대한 백신 스케쥴을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스의 중화 항체에 대한 능력 검증을 위해, 재조합 인플루엔자 바이러스 백신 또는 대조 백신을 마우스 1차 또는 2차 접종한 다음 동종 바이러스(H9N2), 이형 바이러스(H5H8) 및 이종 바이러스(H5N2)를 100 MLD₅₀의 양으로 감염한 뒤 14일 동안 마우스의 체중변화 및 생존율을 나타낸 것이다: (A) 동종 바이러스(H9N2)에 대한 마우스의 체중변화 및 생존율; (B) 이형 바이러스(H5H8)에 대한 마우스의 체중변화 및 생존율; (C) 이종 바이러스(H5N2)에 대한 마우스의 체중변화 및 생존율.
도 5는 재조합 인플루엔자 바이러스 백신 또는 대조 백신의 1차 또는 2차 접종 사이의 혈청을 분리한 후 동형(H9N2) 및 이형(H5H8) 바이러스에 대한 닭 및 마우스의 IgY 항체 역가를 ELISA 방법을 통하여 측정한 결과이다.
도 6은 H9N2 및 cHA H9/H5N2 백신을 닭에게 접종 후 동형(H9N2) 및 이형(H5H8) 바이러스로 공격 접종한 후 (A) 폐, (B) nasal swab 및 (C) cloacal swab에서의 바이러스 역가를 나타낸 것이다.
도 7은 H9N2 및 cHA H9/H5N2 백신을 닭에게 접종 후 이형 바이러스(H5H8)에 대한 장기에서의 바이러스 역가를 나타낸 것이다.
도 8은 재조합 인플루엔자 바이러스 백신 또는 대조 백신의 1차 또는 2차 접종 후 장기에서의 이형(H5N1) 바이러스에 대한 바이러스 역가를 나타낸 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)에 관한 것이다.

"헤마글루티닌(hemagglutinin)"은 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질 중 하나로서 바이러스의 숙주 세포에의 부착과 바이러스의 세포 침투 동안 바이러스-세포막의 융합을 매개하며, 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 인플루엔자 바이러스의 표면 항원단백질이다.

본 발명에서 상기 키메릭 헤마글루티닌 유전자는 A/CK/Korea/04163/04 (H9N2) 유래의 HA1 구상 헤드 도메인 영역과; A/MDk/Korea/W452/2014 (H5N8) 유래의 HA2 유전자 영역이 융합된 형태이다. 상기 HA2 부분은 엑토도메인과 transmembrane cytopalsmic domain으로 구성되어 있으며, 엑토도메인은 fusion peptide, a helix loop, 그리고 coiled part 등으로 구성되어 있다.

본 발명의 상기 키메릭 헤마글루티닌 유전자는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.2%, 적어도 99.4%, 적어도 99.6%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스는 상기 키메릭 헤마글루티닌 유전자 외의 6개 혹은 7개의 다른 유전자는 현재 인체백신의 백본(backbone) 바이러스로 이용되는 A/PR/8/1934 (H1N1) 또는 조류 유래의 바이러스인A/CK/Korea/04163/2004(H9N2)로부터 유래된 것을 이용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명자들은 상기한 키메릭 헤마글루티닌 유전자와 이외 7개의 유전자를 A/CK/Korea/04163/04(H9N2)로부터 제공받아 역유전학(Reverse Genetics) 시스템을 이용하여 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조하였으며, 이를 'cHA H9/H5N2'로 명명하였다. 또한, 본 바이러스를 2016년 4월 15일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 13008BP를 부여받았다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 감수성 숙주 동물을 감염시키고 질병을 일으킬 수 있는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 백신에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 백신은 상기 cHA H9/H5N2 바이러스(기탁번호 KCTC 13008BP)를 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 닭, 오리, 칠면조, 페럿 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인간 과 닭이다.

본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 생독 백신이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 용어 "생독 백신"이란 살아있는 바이러스 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한 용어 "약독화된(attenuation)"이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입 및 변이에 의해 달성될 수 있다.

용어 "사독 백신"이란 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조가능하다. 예컨대 전 바이러스 백신은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할 백신은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득하여 제조할 수 있다.

용어 "서브유닛 백신"은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 백신으로, 바이러스 방어에 필요한 항원 부위에 대해서면 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스의 키메릭 헤마글루티닌(HA) 단백질을 추출하여 사용할 수 있다.

"유전공학 백신"은 바이러스의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거한 것일 수 있다.

또한 본 발명의 백신으로 사용되는 바이러스 폴리펩티드(키메릭 헤마글루티닌) 또는 이의 단편들은 업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 폴리펩티드는 고체상 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있으며, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수도 있다.

본 발명의 백신으로 사용되는 재조합 바이러스는 예를 들어, 도 2에서와 같은 역유전학(Revers genetic) 시스템에 의해 제조될 수 있다. 70%가량 자란 vero cell line에 vPHW 벡터(vector)를 사용한 플라스미드(plasmid)와 시약(reagent)을 사용하여 형질주입(transfection)을 유도하여 인플루엔자 바이러스가 재조합되도록 할 수 있다. HA 유전자는 도 1의 (B)에서 도시된 바와 같은 키메릭 H9/H5 HA 유전자일 수 있으며, 이를 제외한 나머지는 backbone은 A/PR/8/1934 (H1N1)혹은 A/CK/Korea/04163/04 바이러스의 유전자를 사용할 수 있다. 이와 같은 공정에 의해 제조된 바이러스를 9~10일 가량 된 유정란에 접종한 혹은 세포 내 감염 후 36~48시간 경과 후에 재조합된 바이러스를 수득할 수 있다.

본 발명의 백신은 나출된(naked) 핵산 조성물들도 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 핵산은 본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스의 키메릭 헤마글루티닌(HA) 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 핵산 백신접종 방법들은 업계에 공지되어 있는 방법을 통해 실시할 수 있다. 예를 들어, 미국등록특허 제6,063,385호 및 제6,472,375호에 설명되어 있다. 상기 핵산은 플라스미드 또는 유전자 발현 카세트(expression cassette)의 형태일 수 있다. 일실시예에서, 상기 핵산은 동물에 투여되는 리포좀에 둘러싸여진 채로 제공된다.

또한, 본 발명의 백신은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 2³~2⁸ HAU(hemagglutination unit, 혈구응집 단위)로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 백신의 혈구응집 단위가 2³ HAU 미만인 경우, 투여 대상 개체에 효과적으로 항체형성을 유도하지 못할 수 있으며, 2⁸ HAU을 초과하는 경우, 효율대비 비경제적일 수 있다.

본 발명의 백신은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 백신을 인플루엔자 바이러스 감염이 의심되는 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "인플루엔자 바이러스 감염 질환"이란 인플루엔자 바이러스의 감염으로 유발되는 질환으로서, 부비강염, 발작적 천식, 중이염, 낭성 섬유종, 기관지염, 폐렴, 설사 등을 예시할 수 있으나(Pitkaranta와 Hayden, 1998. Ann. Med.), 본 발명은 이들에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "개체"란 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 질환을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 인플루엔자 바이러스로 감염된 인간을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 조류 인플루엔자로 감염된 닭 또는 돼지를 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

실험에 필요한 바이러스 준비

<1-1> A/CK/Korea/04163/04 ( H9N2 ) 및 A/MD/Korea/W452/2014 ( H5N8 ) 바이러스 준비

A/CK/Korea/04163/04 (H9N2) 바이러스는 충북대학교 의과대학으로부터 수득하였고, A/MDk/Korea/W452/2014 (H5N8) 바이러스는 충북대학교 의과대학으로부터 수득하였다.

< 실시예 2>

본 발명의 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 제조

본 발명자들은 A형 인플루엔자 바이러스의 각기 다른 아형(subtype) 및 각기 다른 그룹형(clade)의 인플루엔자에 대한 교차 면역반응(cross-protection) 효과를 가지는 범 중화 항체를 개발하기 위하여, 먼저 헤마글루티닌의 HA1(globular head domain)과 HA2(stalk region) 유전자간 영역을 각각 두 가지 아형(혈청형)으로부터 분리 융합하여 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 제조하였으며, 이를 현재 인체 및 조류 백신의 백본 바이러스 (A/PR/8/19345 (H1N1) 또는 조류 유래의 A/Ck/Korea/04163/04 (H9N2))에 포함시켜 재조합 바이러스를 제조하였다.

<2-1> 키메릭 헤마글루티닌 유전자 제조

먼저, 본 발명자들은 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 제조하기 위하여, A/CK/Korea/04163/04 (H9N2)의 HA1 영역(서열번호 1)과; A/MDk/Korea/W452/2014 (H5N8)의 HA2 영역(서열번호 2)을 융합하여 하나의 키메릭 H9/H5N2 헤마글루티닌 유전자를 제조하였다.

A/CK/Korea/04163/04 (H9N2)는 Bm HA 1F (5-TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG G- 3; 서열번호 5)와 HA1을 특정하게 인식하는 프라이머(5-AGCTATGGCACCAAATAG- 3; 서열번호 6)를 사용하여 A/CK/Korea/04163/04 (H9N2)의 HA1 구상 헤드 도메인 영역(서열번호 1)을 만들고, HA2를 특정하게 인식하는 프라이머(5-CTATTTGGAGCTATAGCA- 3; 서열번호 7)와 Bm NS 890R(5-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT- 3; 서열번호 8), A/MD/Korea/W452/2014 (H5N8)의 HA2 유전자 영역(서열번호 2)을 사용하여 각각의 유전자 단편을 만들고, Bm HA 1F(서열번호 5) 및 Bm NS 890R 프라이머(서열번호 8)를 사용하여 fusion PCR 과정을 통하여 융합, 증폭과정을 거쳐 본 발명의 키메릭 유전자(서열번호 3)를 제조하였다.

<2-2> 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 제조

상기 실시예<2-1>에서 준비한 본 발명의 키메릭 헤마글루티닌 유전자(서열번호 3) 및 A/Ck/Korea/04163/04 (H9N2)의 유전자(서열번호 4) 유전자를 발현벡터 vPHW2000(사용논문:J Gen Virol. 2013 Jun;94(Pt 6):1230-5. doi: 10.1099/vir.0.051284-0. Epub 2013 Mar 13.)에 삽입하여 준비하였다. 상기 서열번호 3 (HA)과 서열번호 4의 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터를 형질감염 시약 TransIT-LT1 transfection reagent (Mirus Bio)를 이용하여 모두 혼합한 후 40분간 실온에 놓아두었다.

24시간 전에 준비해 둔 Vero 세포(ATCCCCL-81™)에 벡터 혼합액을 조심스럽게 넣은 다음 6시간 후에 배양액을 무혈청 배양액(GIBCO™ Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X) liquid)으로 교체해 주었다. 형질감염 후 36시간이 지나면 0.2μg/ml의 L-1-tosylamido-2-phenylehtyl chlorometyl ketone(TPCK)-트립신(Sigma-Aldrich)를 함유하는 Opti-MEM I 1ml를 형질감염된 세포에 첨가해주고, 48시간이 지난 후부터 10일령 SPF 유정란을 이용하여 상층액을 접종하였으며, 48시간 후 상기 유정란에서 본 발명의 재조합 바이러스를 분리하였으며, 이렇게 분리된 재조합 바이러스는 cHA H9/H5N2라 명명하였으며, 불활성화하여 하기 실험에서 사용하였다.

상기 방법에 따라 제조한 본 발명의 재조합 바이러스는 2016년 4월 15일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 13008BP를 부여받았다.

< 실시예 3>

본 발명의 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 바이러스의 마우스 동물실험을 통한 항원성 평가

본 발명에서 개발된 재조합 백신 후보주 바이러스 cHA H9/H5N2의 항원성을 평가화하기 위하여, 실시예 2에서 제조한 재조합 바이러스(기탁번호:KCTC 13008BP)를 10일령의 SPF 유정란에 10개씩 접종하고 48시간 후에 요수를 검출하여 0.5% 칠면조 RBC로 헤마글루티닌 테스트를 통해 역가를 확인하였다. 분리된 요수를 0.025% 농도로 포르말린을 처리하고 72시간 동안 4℃에서 보관한 후 완전히 불활화되어 증식 가능한 바이러스가 없는 것을 10일령 SPF 유정란에 접종하여 확인하였다.

20% 수크로오스 쿠션을 넣은 SW Ti28 스윙로터 버켓(Beckman, USA)에 불활화된 바이러스 요수를 넣고 25,000rpm에서 3시간동안 침강시켜 바이러스만 순수하게 분리하였다. 분리된 바이러스는 단백질량을 측정한 후 헤마글루티닌 단백질의 농도가 1.7μg/1ml 및 3.5μg/1ml가 되도록 만들어 백신으로 이용하였다.

도 3의 백신 스케쥴에 따라, 원하는 농도의 바이러스 용액을 5-6주령의 BALB/C 마우스에 헤마글루티닌 단백질의 함량(3.5g/HA)과 alumn을 어쥬번트로 사용하여 2주 간격으로 회 및 2회 접종하였다.

상기 1차 및 2차 접종 후 2주가 경과한 시점에 마우스의 혈청을 채취하여 중화항체에 대한 능력 검증을 실시하였으며, 백신 효과가 입증되는지 확인하기 위하여 동종(H9N2) 및 이종(H5N2), 이형(H5N8, H5N1) 바이러스에 감염시킨 후 몸무게 변화와 생존율을 측정하였다. 모든 실험에서는 대조군으로 A/CK/Korea/04163/04 (H9N2) 바이러스만을 접종한 그룹과 PBS(control)로 접종한 두 개의 그룹을 포함시켰다. 또한 감염 3, 5, 7일 후 마우스의 폐 조직을 채취하여 바이러스의 역가를 측정하였다. 본 실험에서 사용된 마우스는 각 그룹당(실험군 및 대조군의 마우스 사용량은 동일함) 폐조직 채취용 3마리씩(3, 5, 7일간 1일 3마리씩: 총 9마리의 마우스 사용)과 몸무게 변화 및 생존율에 5마리 사용하였다.

또한, 도 3의 백신 스케쥴에 따라 닭(white Leghorn chickens, 6주령, CAVac Lab. Co.,Ltd)을 농도 3.5ug/500ul으로 2주 간격 1회 및 2회 백신 접종하였으며, 백신효과 입증을 위하여 동형(H9N2) 및 이형 (H5N8) 바이러스로 공격 접종 후 14일까지 임상증상을 모니터링하였다. 공격 접종 후 1, 3, 5, 7일에 nasal swab 및 cloacal swab을 3, 5, 7 일에는 장기를 통한 바이러스 역가를 측정하였다.

<3-1> 백신접종 후 동종, 이형 및 이종 바이러스 감염에 따른 마우스의 몸무게 및 생존율 측정

본 발명의 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 백신의 범 인플루엔자 중화 능력효력을 검증하기 알아보기 위하여, 상기 과정을 통해 제조된 본 발명의 재조합 바이러스 백신을 마우스에 접종한 다음 동종(H9N2) 및 이종(H5N2), 이형(H5N8, H5N1) 바이러스를 10 MLD₅₀의 양으로 감염한 뒤 14일 동안 마우스의 체중변화 및 생존율을 측정하고 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타냈다.

도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 마우스 적응 바이러스인 ma A/Ck/Korea/04163/04 동형 바이러스로 공격 접종하였을 경우, H9N2 백신 그룹은 14일 동안 모니터링한 결과 10%의 체중감소가 발생하였으며, 본 발명 백신 실시 후에는 14일까지 15% 정도 체중변화가 발생하였다(도 4의 A). 생존율의 경우 H9N2 백신그룹, cHA H9/H5N2 백신 그룹 모두 100%의 생존율을 모니터링할 수 있었다(도 4의 A). 이형 바이러스(H5N8)에 대한 체중변화에서는 감염 후에는 H9N2 단독 백신의 경우에는 14일까지 지속적으로 몸무게가 빠지는 것을 확인할 수 있으며 모든 마우스가 죽는 것을 확인할 수 있었으나, 본 발명 백신의 경우 PBS나 H9N2 백신에 비해 몸무게 작게 빠지는 것을 확인하였으며, 90%의 생존률을 확인할 수 있었다 (도 4의 B). 또한 다른 이형 바이러스인 A/AB/ma81/07 (H5N2) 바이러스로 공격접종시, H9N2 백신을 단독으로 실시한 경우 14일째 20% 이상의 몸무게의 감소가 있었으나 14일 이전에 모든 마우스가 죽는 것을 확인할 수 있었으나, 본 발명 백신의 경우 8일까지 약 15%의 마우스 무게가 빠지나 이후에는 회복하며, 또한 80%가 생존하는

<3-2> 닭과 마우스 백신접종에서의 동형 및 이형 바이러스에 대한 IgY 혹은 IgG 항체 역가측정

H9N2 및 cHA H9/H5N2 백신 후 1차 및 2차 접종 간 혈청을 분리하여 동형 및 이형 바이러스에 대한 IgY항체 역가를 ELISA 방법을 통하여 측정하고 그 결과를 도 5에 나타냈다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, H9N2 바이러스 코팅 시 H9N2와 cHA H9/H5N2 백신 세럼에서 유사한 항체 역가가 나타남을 확인하였으나, 이형 바이러스인 H5N8 바이러스 코팅 후 ELISA 시험 시 cHA H9/H5N2 백신 그룹에서 높은 항체가가 나타나며, H9N2 백신의 경우 PBS 백신 그룹과 유사한 항체가가 나타남을 확인 할 수 있었다.

<3-3> 닭 백신접종에서의 동형 및 이형 바이러스의 역가 측정

H9N2 및 cHA H9/H5N2 백신을 닭에게 접종한 후, 동형(H9N2) 및 이형 (H5N1) 바이러스로 공격 접종 후 nasal swab, cloacal swab그리고 폐를 적출하여 감염 후 3, 5 일 바이러스 역가를 측정하고 그 결과를 도 6 내지 8에 나타냈다.

닭에 동형 바이러스로 공격접종 시 H9N2, 그리고 cHA H9/H5N2 백신 모두 PBS 백신 그룹보다 바이러스 역가가 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 6).

또한 이형 바이러스인 H5N8 바이러스로 공격 접종 후 3,5 일 때 닭의 장기와 nasal swab, cloacal swab에서 바이러스 역가 측정 시 H9N2 백신의 경우 이형 바이러스에 대한 보호능이 작용하지 않아 PBS 백신 그룹과 유사한 역가가 나타났으며, 공격 접종 5일째에는 모든 닭이 죽어 바이러스 역가를 측정할 수 없었으나, cHA H9/H5N2 백신의 경우 공격접종 3일 차에는 장기와 swab 샘플에서 바이러스 역가가 나타나나, 5일 차 때에는 바이러스가 모두 사라졌음을 확인할 수 있기에 (도 8) 본 발명 백신은 동형바이러스인 H9N2 뿐만이 아니라 이형 바이러스인 H5N8 바이러스에도 백신의 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC13008BP 20160415

<110> I.D.Bio. <120> RECOMBINANT INFLUENZA VIRUS TO FORM CROSS-PROTECTION AGAINST MULTIPLE SUBTYPES H9 AND H5 OF INFLUENZA VIRUSES AND VACCINE COMPRISING THE SAME <130> PN1604-114 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1014 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 1 atggaagtaa tagcactaat agctatactg gtagtgacag gaacgagcaa tgctgataaa 60 atttgcattg gataccagtc aacaaactcc acagaaactg ttgatacact agtagaaacc 120 aatgtccctg tgacacatgc caaagaattg cttcacacag agcacaatgg aatgttatgt 180 gcaacaaatc aggggcatcc tcttaaccta gacacctgca ccgttgaagg gttggtgtat 240 ggcaatcctt cctgtgattt gctactggga ggaaaagaat ggtcttacat tgtcgaaaga 300 tcatcagcca ttaatggggt gtgttaccct ggaagggtag agaatctgga agaactaaga 360 tcttttttca gttctgctca ctcctacaaa agactcctgc tcttcccaga ccacacttgg 420 aatgtgactt acactggaac aagcaaagca tgctcaggtt cattctacag aagtatgaga 480 tggctgacac acaagagcaa ttcttaccct attcaagacg ctcaatatac caacgattgg 540 ggaaagaata ttctcttcat gtggggcata caccattcac ctactgatac tgagcaaatg 600 aatctataca aaaaagctga tacaacaacg agcataacaa cggaagatat caatcggact 660 ttcaaaccag tgataggacc aaggcccctt gtcaatggtc aacaagggag gattgattat 720 tattggtcag tactaaagcc aggccagaca ttgcgaataa gatccaatgg aaatctaatt 780 gctccatggt atggacacac tctttcagga gaaagccatg gaagaatcct gaagaccgat 840 ttaaatagtg gcaactgcgt agtacagtgc caaactgaga aaggtggttt gaatacgacc 900 ttgccattcc acaatgtcag caagtatgca tttgggaact gccccaaata tgttggagtg 960 aagagtctca aactggcagt tggtctaaga aatgtgcctg ctgcatcagg taga 1014 <210> 2 <211> 669 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 2 ggactatttg gagctatagc agggtttata gagggaggat ggcagggaat ggtagacggt 60 tggtatgggt accaccatag caatgagcag gggagtgggt acgctgcaga caaagaatcc 120 acccaaaagg caatagatgg agttaccaat aaggtcaact caatcattga caaaatgaac 180 actcaatttg aggccgttgg aagggaattt aataacttag aaaggagaat agagaattta 240 aacaagaaaa tggaagacgg attcctagat gtctggactt ataatgctga acttttagtt 300 ctcatggaaa atgagagaac tctagatttc catgactcaa atgtcaagaa cctttacgac 360 aaagtccgac tacagcttag ggataatgca aaggagctgg gtaatggttg 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Claims (9)

1. H9 및 H5 아형(subtype)의 키메릭 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP).
2. 제1항에 있어서,
   상기 키메릭 헤마글루티닌 유전자는 A/CK/Korea/04163/04 (H9N2) 유래의 HA1 구상 헤드 도메인과; A/MD/Korea/W452/2014 (H5N8) 유래의 HA2 유전자가 융합된 형태인 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
3. 제1항에 있어서,
   상기 키메릭 헤마글루티닌 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
4. 제1항의 바이러스를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신.
5. 제4항에 있어서,
   상기 백신은 바이러스를 약독화된 생독 백신, 또는 사독 백신인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 백신.
6. 제4항에 있어서,
   상기 바이러스가 H9 혈청형 및 H5 혈청형을 가진 A형 인플루엔자 바이러스 모두에 대해 교차 면역반응을 형성하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 백신.
7. 제4항의 백신을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
8. 제1항의 바이러스 또는 이의 항원을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 진단용 조성물.
9. 제1항의 바이러스 또는 이의 항원을 이용한 항원-항체 반응을 통해 감염될 또는 감염된 세포 내에서 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 인플루엔자 바이러스(기탁번호: KCTC 13008BP)의 검출 방법.

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