KR101896834B1

KR101896834B1 - 세포배양 기판 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101896834B1
Application number: KR1020170045246A
Authority: KR
Inventors: 신흥수; 김세정
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-07
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2018-09-07

Abstract

본 발명은 세포배양 기판 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세포배양 기판은 판 (plate) 형상으로 형성되고, 일면을 향해 다수의 세포(1)가 분주되는 본체(10), 및 본체(10)의 일면으로부터 외측으로 돌출 형성되되, 가상의 다각형(P1, P2)의 꼭지점마다 각각 배치되는 다수의 돌기(21)를 포함하여, 가상의 다각형(P1, P2)의 중심부에서 다수의 상기 세포(1)가 응집되어 3차원 세포 구상체 (3D cell spheroid, 3)를 형성하는 배양부(20)를 포함한다.

Description

세포배양 기판 및 이의 제조방법{SUBSTRATE FOR CELL CULTURE AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 세포배양 기판 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 불규칙하고 거친 표면에서 3차원 세포 구상체가 형성되어 배양되는 세포배양 기판 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

대부분 세포 배양은 2차원의 편평한 평면에서 이뤄지고 있지만, 2차원 세포배양이 체내의 세포 환경 조건에 적합하지 않아서, 최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 세포 구상체 배양이 주목받고 있다.

3차원 세포 구상체 (3D cell spheroid)는 수백 개 이상의 단일 세포가 덩어리져서 3차원의 구 (球) 형태를 이루는 세포 집합체를 의미한다. 이러한 3차원 세포 구상체는 생체 내 세포들을 둘러싸고 있는 3차원 조직의 구조적, 물리적 성질을 좀 더 정확하게 모방할 수 있어서 다양한 치료 및 연구영역에서 유용하게 활용되고 있다. 예를 들어, 당뇨 치료 목적으로 인슐린의 정상분비를 유도하기 위해서 췌도세포를 이식하는데, 이때 응집된 세포 덩어리를 이식한다. 또한, 줄기세포를 3차원으로 배양해 3D 줄기세포 구상체를 제작하고 각종 분화 기전 연구에 활용하기도 한다.

이러한 3차원 세포 구상체를 제작하기 위한 종래 3차원 세포배양방법으로는 하기 선행기술문헌의 특허문헌에 개시된 바와 같이, 회전식 배양법, 원심분리법 등이 있다. 그러나 이러한 종래 세포배양방법은 비용이 많이 들고, 배양이 복잡할 뿐만 아니라, 3차원 세포 구상체의 크기 조절이 어렵다. 이들 방법에 의하면 대부분 크기가 큰 세포 구상체 제조만 가능하고 작은 크기로 제작하는 것은 거의 불가능하다. 나아가 크기 조절에 실패하여 세포 구상체가 지나치게 커지면 중심부에서 산소 및 영양분 부족 현상이 발생하여 생존능 및 세포치료제로서의 효율이 크게 저하되는 문제가 발생한다.

이에 3차원 세포 구상체를 제작하는 종래 3차원 세포배양기술의 문제점을 해결하기 위한 방안이 절실히 요구되고 있다.

KR

10-2013-0102506

A

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 일 측면은 세포가 분주되는 표면이 불규칙한 높낮이를 갖는 돌기에 의해 거칠게 형성되어, 세포가 그 표면에 부착되지 않고, 돌기의 경사면을 따라 한 곳으로 수렴하여 자발적으로 크기가 조절되는 3차원 세포 구상체를 형성하게 하는 세포배양 기판을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따른 세포배양 기판은 판 (plate) 형상으로 형성되고, 일면을 향해 다수의 세포가 분주되는 본체; 및 상기 본체의 일면으로부터 외측으로 돌출 형성되되, 가상의 다각형의 꼭지점마다 각각 배치되는 다수의 돌기를 포함하여, 상기 가상의 다각형의 중심부에서 다수의 상기 세포가 응집되어 3차원 세포 구상체 (3D cell spheroid)를 형성하는 배양부; 를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 세포배양 기판에 있어서, 상기 본체 및 상기 배양부는 하이드로젤, 폴리머, 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상으로 이루어진다.

또한, 본 발명에 따른 세포배양 기판에 있어서, 다수의 상기 돌기 각각은 상기 가상의 다각형의 중심부를 향하여 수렴되도록, 상기 본체의 일면에 대해서 소정의 각도로 기울어져 상기 세포를 안내하는 경사면을 구비한다.

또한, 본 발명에 따른 세포배양 기판에 있어서, 상기 경사면은 상기 돌기의 내측을 향하여, 소정의 곡률로 만곡된다.

또한, 본 발명에 따른 세포배양 기판에 있어서, 다수의 상기 돌기 각각은 높이, 및 동일 높이에서의 횡단면의 면적이 서로 다르다.

또한, 본 발명에 따른 세포배양 기판에 있어서, 다수의 상기 돌기 중 적어도 하나 이상의 종단면은 반구형, 반타원형, 사다리꼴, 및 삼각형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형상으로 형성된다.

한편, 본 발명에 따른 세포배양 기판의 제조방법은 (a) 깊이 및 높이가 서로 다르고 상단이 뾰족하게 형성된 요철 (凹凸)이 패턴화된 요철부재를 준비하는 단계; (b) 상기 요철부재의 표면에 폴리머를 도포하여, 일면에 상기 요철 패턴에 대응되는 음각 패턴이 구비된 마스터 몰드를 생성하는 단계; (C) 상기 요철부재와 상기 마스터 몰드를 분리하는 단계; (d) 분리된 상기 마스터 몰드의 일면에 기판조성물을 배치하여, 일면에 상기 마스터 몰드의 음각 패턴에 대응되는 다수의 돌기를 구비하는 세포배양 기판을 생성하는 단계; 및 (e) 상기 세포배양 기판을 상기 마스터 몰드로부터 분리하는 단계;를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 세포배양 기판의 제조방법에 있어서, 상기 요철부재는 샌드페이퍼 (sandpaper)이다.

또한, 본 발명에 따른 세포배양 기판의 제조방법에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 마스터 몰드의 일면으로부터 이격된 소정의 높이에 유리기판을 배치하는 단계; 및 상기 마스터 몰드와 상기 유리가판 사이에 상기 기판조성물을 주입하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.

이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명에 따르면, 세포가 분주되는 표면이 불규칙한 높낮이를 갖는 돌기로써 거칠게 형성되어, 세포가 그 표면에 부착되지 않고, 돌기의 경사면을 따라 한 곳으로 수렴하여 자발적으로 3차원 세포 구상체를 형성할 수 있다.

또한, 한 번의 세포 분주로 다량의 3차원 세포 구상체를 수득할 수 있고, 3차원 세포 구상체의 크기 및 분포를 용이하게 제어할 수 있으며, 나아가 형성된 3차원 세포 구상체는 별도의 처리 과정 없이 바로 간단히 수득 가능한바, 세포 치료제, 약물 유효성 평가 등 다양한 분야에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 세포배양 기판의 사시도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 세포배양 기판의 평면도이다.
도 3은 도 1의 A-A' 라인에 따른 단면도이다.
도 4 내지 도 5는 본 발명의 실시예에 따른 세포배양 기판 제조방법의 공정도이다.
도 6은 샌드페이퍼와 PDMS 마스터 몰드 표면의 주사전자현미경 (SEM) 이미지이다.
도 7은 샌드페이퍼의 입도 수에 따른 본 발명에 따른 하이드포젤 세포배양 기판 표면을 촬영한 이미지이다.
도 8은 본 발명에 따른 PDMS 세포배양 기판 표면을 촬영한 이미지이다.
도 9는 본 발명에 따른 하이드로젤 세포배양 기판에서 배양되어 생존하는 3차원 세포 구성체의 이미지이다.
도 10은 본 발명에 따른 PDMS 세포배양 기판에서 배양되어 생존하는 3차원 세포 구성체의 이미지이다.
도 11a 내지 도 11b는 Tet-A에서 배양되어 생존하는 3차원 세포 구성체의 이미지이다.
도 11c는 아가로오즈 젤에서 배양되어 생존하는 3차원 세포 구성체의 이미지이다.
도 12는 본 발명에 따른 세포배양 기판에서 배양되고 H&E 염색된 3차원 세포 구성체 단면 이미지이다.
도 13은 중합효소연쇄반응을 통해 유전자 발현량을 평가한 그래프이다.
도 14 내지 도 15는 본 발명에 따른 세포배양 기판에서 다양한 세포주를 이용하여 배양한 3차원 세포 구성체의 이미지이다.
도 16은 220 입도를 가지는 하이드로젤 세포배양 기판, 평평한 하이드로젤 세포배양 기판, 및 LAP에서 배양한 3차원 세포 구성체의 이미지이고, 도 17은 각각의 유전자 발현량을 평가한 그래프이며, 도 18은 각각의 혈관형성 인자 관련 유전자의 발현량 및 그와 연관된 단백질 발현량을 평가한 그래프이다.

본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, "제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 상기 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 세포배양 기판의 사시도이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 세포배양 기판의 평면도이며, 도 3은 도 1의 A-A' 라인에 따른 단면도이다.

도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 세포배양 기판은 판 (plate) 형상으로 형성되고, 일면을 향해 다수의 세포(1)가 분주되는 본체(10), 및 본체(10)의 일면으로부터 외측으로 돌출 형성되되, 가상의 다각형(P1, P2)의 꼭지점마다 각각 배치되는 다수의 돌기(21)를 포함하여, 가상의 다각형(P1, P2)의 중심부에서 다수의 상기 세포(1)가 응집되어 3차원 세포 구상체 (3D cell spheroid, 3)를 형성하는 배양부(20)를 포함한다.

3차원 세포 구상체 (3D cell spheroid, 3)는 수백 개 이상의 단일 세포(1)가 덩어리져서 3차원의 구 (球) 형태를 이루는 세포 집합체로서, 2차원 세포배양에 비해 생체 내 3차원 조직의 구조적, 물리적 성질을 좀 더 정확하게 모방할 수 있어서, 치료 및 연구 목적으로 다양하게 활용되고 있다. 이러한 3차원 세포 구상체(3)를 제작하기 위해서 종래에는 회전식 배양법, 원심분리법 등과 같은 3차원 세포배양방법이 사용되었는데, 많은 비용이 소요되고 배양과정이 복잡할 뿐 아니라, 3차원 세포 구상체(3)의 크기 조절이 어려운 문제가 있다. 이에 종래 3차원 세포배양기술의 문제점을 해결하기 위한 방안으로서 본 발명에 따른 세포배양 기판이 안출되었다.

구체적으로, 본 발명에 따른 세포배양 기판은 본체(10), 및 배양부(20)를 포함한다.

여기서, 본체(10)는 판 형상으로 형성된 부재로서, 그 일면에 배양부(20)가 배치되는바, 본체(10)의 일면을 향해 배양하고자 하는 다수의 세포(1)가 분주된다. 이때, 분주되는 세포(1)는 특별히 한정되는 것은 아니므로, 예를 들어 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도, 내장, 피부, 쓸개조직, 전립선, 방광, 배아, 면역계 및 조혈계 등으로부터 분리되거나 활성화할 수 있는 모든 세포를 포함할 수 있다.

한편, 본체(10)와 배양부(20)는 일체로서 형성되거나, 또는 본체(10)에 배양부(20)가 결합되는 방식으로 형성될 수 있고, 이때 본체(10)와 배양부(20)는 모두 세포독성을 가지지 않는 하이드로젤 (hydrogel), 폴리머, 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상으로 이루어질 수 있다. 여기서, 하이드로젤은 콜라겐 젤, 피브린 젤, 마트리 젤, 자가 조립 펩타이드 젤, 폴레에틸렌글리콜 젤, 및 아가로오즈 젤 (agarose gel) 중 적어도 어느 하나를 포함하여, 그 각각을 선택적으로 사용하거나, 이들 중 적어도 2이상을 혼합한 혼합젤을 사용할 수 있다. 폴리머는 예를 들어, 폴리디메틸실록산 (PDMS)을 사용할 수 있다.

다만, 기판조성물이 반드시 상기 하이드로젤, 폴리머, 및 실리콘에 한정되어야 하는 것은 아니고, 배양 세포(1) 및 생체 환경 등을 고려하여 모사하고자 하는 조건에 따라 적절한 조성물을 사용할 수 있다. 따라서, 본체 및 배양부는 하이드로젤, PDMS, 또는 실리콘 기반 물질과 유사한 기계적 강도를 가지고 세포독성이 없는 다양한 소재로 이루어질 수 있다.

배양부(20)는 본체(10)의 일면에 형성되는 구조체로서, 다수의 돌기(21)를 포함한다. 여기서, 돌기(21)는 본체(10)의 일면으로부터 외측으로 돌출되어 형성되는데, 분주된 다수의 세포(1)가 서로 응집하여 3차원 세포 구상체(3)를 이룰 수 있도록, 그 위치 및 형태가 특징적으로 정해진다.

먼저, 다수의 돌기(21)는, 본체(10)의 일면 상에 가상의 다각형(P1, P2)을 그릴 때에, 그 가상의 다각형(P1, P2)의 꼭지점에 대응되는 위치에 배치된다. 따라서, 가상의 다각형(P1, P2)의 중심부가, 모서리에 위치하는 돌기(21a, 21b, 21c)에 의해 둘러싸이는 구조로 이루어진다. 그 결과, 가상의 다각형(P1, P2)의 중심부에서, 세포(1)가 모여들어 응집됨으로써 3차원 세포 구상체(3)를 형성하게 된다. 이때, 돌기(21)가 그 3차원 세포 구상체(3)에 접촉하여, 3차원 세포 구상체(3)를 지지하므로, 그 가상의 다각형(P1, P2)의 크기 및 형태에 의해 3차원 세포 구상체(3)의 크기를 제어할 수 있다. 한편, 가상의 다각형(P1, P2)은 삼각형이나 사각형에 한정되는 것은 아니고, 오각형이나 육각형, 또는 그 이상의 다각형이든 제한이 없다.

돌기(21)의 형태와 관련하여, 다수의 돌기(21) 각각은 가상의 다각형(P1, P2)의 중심부를 향하여 수렴되도록, 본체(10)의 일면에 대해서 소정의 각도로 기울어진 경사면을 구비할 수 있다. 여기서, 돌기(21)의 경사면은 본체(10)를 향해 분주된 세포(1)를 가상의 다각형(P1, P2)의 중심부로 안내한다. 따라서, 돌기(21)의 경사면을 따라 이동하는 세포(1)는 가상의 다각형(P1, P2)의 중심부에 모여 응집되는바, 그 경사면이 세포(1)를 좀 더 효과적으로 응집시키는 기능을 수행한다.

한편, 경사면은 돌기(21)의 내측을 향하여, 소정의 곡률로 만곡된 곡면 형태로 형성될 수 있다. 상술한 바와 같이, 3차원 세포 구상체(3)의 크기는 이웃하는 돌기(21) 사이의 이격거리에 의해 영향을 받는다. 따라서, 돌기(21)의 경사면이 만곡된 경우에는 이웃하는 돌기(21) 사이의 이격거리, 즉 어느 하나의 돌기(21)의 경사면과 다른 돌기(21)의 경사면 사이의 거리가, 평평한 경사면일 때에 비해 상대적으로 더 멀어지기 때문에 3차원 세포 구상체(3)를 더 크게 형성할 수 있다.

또한, 다수의 돌기(21) 각각은 높이가 상이하고, 나아가 동일 높이에서의 횡단면의 면적이 서로 다르게 형성될 수 있다. 즉, 본체(10) 일면이 규칙적이거나 균일하지 않고 거칠게 형성될 수 있는 것이다. 이때, 다수의 돌기(21)는 예를 들어, 적어도 하나 이상의 종단면이 반구형, 반타원형, 사다리꼴, 및 삼각형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형상으로 형성되어, 본체(10) 일면이 거칠게 구현될 수 있다. 다만, 돌기(21)의 형태가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

이렇게 불규칙한 높이와 두께를 갖는 돌기(21)로써, 본체(10)의 일면 (이하 "바닥면"이라 함)이 거칠게 형성되는 경우, 세포(1)가 바닥면에 쉽게 부착되지 않는다. 또한, 돌기(21)의 경사면을 따라 한 곳 (가상의 다각형(P1, P2)의 중심부)으로 수렴된 세포(1)는, 바닥면과의 상호작용에 비해 상대적으로, 세포(1) 간 상호작용이 우세하므로, 자가 조립되어 자발적으로 3차원 세포 구상체(3)를 용이하게 형성한다. 나아가 돌기(21)의 높이 및 형태를 제어함으로써, 3차원 세포 구상체(3)의 크기 및 분포를 용이하게 조절할 수도 있다.

종합적으로, 본 발명에 따르면, 세포(1)가 분주되는 표면이 불규칙한 높낮이를 갖는 돌기(21)로써 거칠게 형성되어, 세포(1)가 그 표면에 부착되지 않고, 돌기(21)의 경사면을 따라 한 곳으로 수렴하여 자발적으로 3차원 세포 구상체(3)를 형성할 수 있다.

또한, 한 번의 세포(1) 분주로 다량의 3차원 세포 구상체(3)를 별도의 처리 없이 간단히 빠르게 수득할 수 있고, 3차원 세포 구상체(3)의 크기 및 분포 제어가 용이하다.

이하에서는 본 발명에 따른 세포배양 기판의 제조방법에 대해서 설명한다. 세포배양 기판에 관한 사항 중 상술한 부분에 대해서는 설명을 생략하거나, 간단하게만 기술한다.

도 4 내지 도 5는 본 발명의 실시예에 따른 세포배양 기판 제조방법의 공정도이다.

도 4 내지 도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 세포배양 기판의 제조방법은 (a) 깊이 및 높이가 서로 다르고 상단이 뾰족하게 형성된 요철이 표면에 패턴화된 요철부재(40)를 준비하는 단계(S100), (b) 상기 요철부재(40)의 표면에 폴리머(51)를 도포하여, 일면에 상기 요철 패턴에 대응되는 음각 패턴이 구비된 마스터 몰드(50)를 생성하는 단계(S200), (C) 상기 요철부재(40)와 상기 마스터 몰드(50)를 분리하는 단계(S300), (d) 분리된 상기 마스터 몰드(50)의 일면에 기판조성물(61)을 배치하여, 일면에 상기 마스터 몰드(50)의 음각 패턴에 대응되는 다수의 돌기를 구비하는 세포배양 기판(60)을 생성하는 단계(S400), 및 (e) 상기 세포배양 기판(60)을 상기 마스터 몰드(50)로부터 분리하는 단계(S500)를 포함한다.

상술한 세포배양 기판(60)은 아래의 방법에 의해 제조된다.

먼저, 표면에 요철 (凹凸)이 패턴화된 요철부재(40)를 준비한다(S100). 여기서, 요철은 깊이 및 높이가 서로 다르고 상단이 뾰족하게 형성된 형태로 패턴화된다. 이렇게 표면이 거친 요철부재(40)로서는 예를 들어, 샌드페이퍼 (sandpaper)를 사용할 수 있다. 이때, 그릿 (grit)에 따라 적절한 샌드페이퍼를 결정함으로써, 후속하여 제조되는 세포배양 기판(60)의 표면 거칠기를 조절할 수 있다. 다만, 요철부재(40)가 반드시 샌드페이퍼에 한정되는 것은 아니고, 표면에 요철이 형성된 공지의 모든 부재를 포함한다.

다음으로, 요철부재(40)의 표면에 마스터 몰드 (master mold, 50)를 생성한다(S200). 마스터 몰드(50)는 요철이 형성된 요철부재(40)의 표면에 폴리머(51)를 도포하고, 이를 경화함으로써 생성된다. 따라서, 마스터 몰드(50)의 일면에는 상기 요철 패턴에 대응되는 음각 패턴이 형성된다. 여기서, 마스터 몰드(50)의 일면은 요철부재(40)의 표면과 접하는 면을 의미한다. 한편, 마스터 몰드(50)의 주원료인 폴리머(51)는 예를 들어, 폴리디메틸실록산 (PDMS)일 수 있다. PDMS는 흐름 성질이 특이하고, 반응성과 독성이 거의 없어서 마스터 몰드(50)로 사용하기에 적합하지만, 그렇다고 하여 마스터 몰드(50)의 소재가 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 다양한 폴리머(51)를 사용할 수 있다.

폴리머(51)가 경화되면, 요철부재(40)로부터 마스터 몰드(50)를 분리한다(S300). 한편, 폴리머(51)를 경화하기 위해서, 폴리머(51)와 함께 경화제를 요철부재(40)에 도포하고, 소정의 온도로 가열하는 공정을 추가적으로 진행할 수도 있다. 또한, 후속 단계 진행 전에 분리된 마스터 몰드(50)를 멸균하는 공정을 수행할 수도 있다. 이때, 멸균은 에탄올에 마스터 몰드(50)를 담지하고 자외선을 조사하는 방식으로 이루어질 수 있는데, 멸균 방식이 반드시 이에 한정되어야 하는 것은 아니다.

마스터 몰드(50) 분리가 완성되면, 분리된 마스터 몰드(50)의 일면, 즉 음각 패턴이 형성된 표면에 기판조성물(61)을 배치한다(S400). 여기서, 기판조성물(61)은 세포독성을 가지지 않는 하이드로젤 (hydrogel), 폴리머, 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상으로 이루어질 수 있다. 여기서, 하이드로젤은 콜라겐 젤, 피브린 젤, 마트리 젤, 자가 조립 펩타이드 젤, 폴레에틸렌글리콜 젤, 및 아가로오즈 젤 (agarose gel) 중 적어도 어느 하나를 포함하여, 그 각각을 선택적으로 사용하거나, 이들 중 적어도 2이상을 혼합한 혼합젤을 사용할 수 있다. 폴리머는 예를 들어, 폴리디메틸실록산 (PDMS)을 사용할 수 있다.

다만, 기판조성물(61)이 반드시 상기 하이드로젤, 폴리머, 및 실리콘에 한정되어야 하는 것은 아니고, 배양 세포(1) 및 생체 환경 등을 고려하여 모사하고자 하는 조건에 따라 적절한 조성물을 사용할 수 있다. 따라서, 기판조성물(61)은 하이드로젤, PDMS, 또는 실리콘 기반 물질과 유사한 기계적 강도를 가지고 세포독성이 없는 다양한 소재로 이루어질 수 있다.

이러한기판조성물(61)은 마스터 몰드(50)의 일면에서 소정의 시간 동안 가교되는데, 이로써 일면에 마스터 몰드(50)의 음각 패턴에 대응하여 다수의 돌기가 구비된 세포배양 기판(60)이 생성된다.

한편, 기판조성물(61)을 마스터 몰드(50)에 배치하고, 세포배양 기판(60)을 일정한 형상으로 형성하기 위해서, 마스터 몰드(50)의 일면으로 이격된 소정의 높이에 유리기판을 배치하고, 마스터 몰드(50)와 유리기판 사이의 이격 공간으로 기판조성물(61)을 주입할 수도 있다 (도시되지 않음).

마지막으로, 마스터 몰드(50)로부터 세포배양 기판(60)을 분리함으로써(S500), 본 발명에 따른 세포배양 기판을 제조하고, 이를 이용해 세포배양에 사용할 수 있다. 한편, 사용에 앞서, 제조된 세포배양 기판(60)을 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS)에 담지하여 멸균할 수도 있다.

종합적으로, 본 발명에 따른 세포배양 기판의 제조방법에 따르면, 시중에서 쉽게 구할 수 있는 샌드페이퍼 등을 이용하여 세포배양 기판 표면의 거칠기를 조절하고, 비교적 간단한 방법으로 제조공정이 이루어지므로, 저렴하면서도, 다양한 크기의 3차원 세포 구상체를 대량생산할 수 있는 세포배양 기판을 제조할 수 있다.

이하에서는 구체적 실시예를 통해 본 발명에 대해 설명한다.

도 6은 샌드페이퍼와 PDMS 마스터 몰드 표면의 주사전자현미경 (SEM) 이미지이고, 도 7은 샌드페이퍼의 입도 수에 따른 본 발명에 따른 하이드포젤 세포배양 기판 표면을 촬영한 이미지이며, 도 8은 본 발명에 따른 PDMS 세포배양 기판 표면을 촬영한 이미지이다. 또한, 도 9는 본 발명에 따른 하이드로젤 세포배양 기판에서 배양되어 생존하는 3차원 세포 구성체의 이미지이고, 도 10은 본 발명에 따른 PDMS 세포배양 기판에서 배양되어 생존하는 3차원 세포 구성체의 이미지이며, 도 11a 내지 도 11b는 Tet-A에서 배양되어 생존하는 3차원 세포 구성체의 이미지이고, 도 11c는 아가로오즈 젤에서 배양되어 생존하는 3차원 세포 구성체의 이미지이다. 도 12는 본 발명에 따른 세포배양 기판에서 배양되고 H&E 염색된 3차원 세포 구성체 단면 이미지이고, 도 13은 중합효소연쇄반응을 통해 유전자 발현량을 평가한 그래프이며, 도 14 내지 도 15는 본 발명에 따른 세포배양 기판에서 다양한 세포주를 이용하여 배양한 3차원 세포 구성체의 이미지이고, 도 16은 220 입도를 가지는 하이드로젤 세포배양 기판 (220), 평평한 하이드로젤 세포배양 기판 (Flat), 및 LAP에서 배양한 3차원 세포 구성체의 이미지이고, 도 17은 각각의 유전자 발현량을 평가한 그래프이며, 도 18은 각각의 혈관형성 인자 관련 유전자의 발현량 및 그와 연관된 단백질 발현량을 평가한 그래프이다.

실시예 1: PDMS 마스터 몰드 제작

시중에서 구매 가능한 샌드페이퍼를 이용하여 PDMS 마스터 몰드를 제작하였다. 샌드페이퍼는 그릿이 60, 100, 220, 320, 1000을 사용하였으며, 샌드페이퍼 표면의 먼지를 제거한 후, 그 표면에 PDMS를 경화시켜(폴리머 : 경화제 = 10 : 1; 질량비, 60 ℃에서 2시간), 샌드페이퍼의 거친 표면을 음각으로 본뜬 마스터 몰드를 형성하였다 (도 6 참조).

한편, 제작된 PDMS 마스터 몰드는 70% 에탄올에 담가 30분간 자외선에서 멸균한 이후 사용하였다.

실시예 2: 하이드로젤 세포배양 기판 제작

Tetronic^® 1307 말단 작용기를 tyramine으로 치환한 Tetronic^®-tyramine (Tet-TA) 고분자를 합성하여 사용하였다. 준비된 Tet-TA는 인산완충생리식염수 (PBS)에 녹여 두 개의 튜브에 나누어 준비한 뒤, H₂O₂와 horseradish peroxidase (HRP) 용액을 각각 따로 섞어준다. Tet-TA 용액이 첨가된 두 종류의 용액을 1:1로 섞은 뒤 주사기를 이용하여 PDMS 마스터 몰드와 유리기판 사이에 주입하였으며 최종 농도는 Tet-TA 12 wt%, H₂O₂ 0.1 wt%, HRP 0.0025 mg/ml로 제작되었다. PDMS 마스터 몰드와 유리판 사이의 간격은 특정한 크기로 재단된 teflon spacer를 이용하여 1mm로 조절되었다. 주입된 하이드로젤은 10분의 가교 후에 유리기판과 PDMS 마스터 몰드로부터 분리되어 지름 10mm 디스크 형태로 재단되었다.

또한, 재료의 확장성을 확인하기 위해 아가로오즈 젤을 이용한 거친 표면의 하이드로젤 세포배양 기판도 제작되었다. 여기서는, 아가로오즈 분말을 물에 넣고 끓여 녹였으며, 완전히 녹은 아가로오즈를 PDMS 마스터 몰드와 유리판 사이에 주입하고 30분 이상 냉각시켜 완전히 굳힌 이후 몰드에서 분리하는 방식을 취했다.

제작된 거친 표면의 하이드로젤 세포배양 기판은 샌드페이퍼의 표면과 유사한 표면 형태를 보였고, 사용 전 PBS에 담가 30분간 자외선에서 멸균한 뒤 37 ℃ 인큐베이터에 보관하였다.

한편, 다양한 수준의 거칠기를 유도하여 3차원 세포 구상체의 크기를 조절하기 위해, 샌드페이퍼의 입도 수를 조절하였다. 입도 수에 따라 하이드로젤 표면의 거칠기가 달라질 수 있으며 이로 인해 달라진 돌기 간 이격거리가 3차원 세포 구상체의 크기에 영향을 주게 된다 (도 7 참조).

실시예 3: PDMS 세포배양 기판 제작

PDMS를 이용하여 표면의 거칠기를 형성한 뒤 3차원 세포 구상체를 배양할 수 있었으며, 마찬가지로 샌드페이퍼를 이용하여 PDMS 마스터 몰드를 제작하였다. (폴리머 : 경화제 = 5: 1; 질량비, 60 ℃에서 2시간) 제작된 PDMS 마스터 몰드 표면에서 다시 PDMS를 경화시켜 샌드페이퍼 표면의 거칠기를 양각으로 본 뜬 PDMS를 얻을 수 있다 (폴리머 : 경화제 = 10 : 1; 질량비, 60 ℃에서 2시간). 제작된 거친 표면의 PDMS는 70% 에탄올에 담가 30분간 자외선에서 멸균한 이후 사용하였다 (도 8 참조).

실험예 1: 지방 유래 줄기 세포 3차원 세포 구상체 제작 및 배양

지방 유래 줄기 세포 (human adipose derived stem cell, hADSC)를 모델 세포주로 이용하여 3차원 세포 구상체 제작 실험을 진행하였다. MesenPro Rs kit (Gibco)를 이용하여 배양액을 준비한 뒤 충분한 수의 세포를 얻기 위해, 먼저 일반 배양 접시에서 배양되었다 (37 ℃, 5% CO₂). 배양된 세포는 0.05% trypsin-EDTA 에 3분간 처리하여 단일 세포의 형태로 얻어지고, 1 × 10⁵ cells/cm² 의 밀도로 하이드로젤과 PDMS 위에 분주하였다.

그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, 220 그릿의 표면 거칠기가 도입된 하이드로젤 세포배양 기판 표면에서 배양된 세포는 24시간 안에 자발적으로 지름 약 100 μm 정도의 3차원 세포 구상체를 형성하였다. 형성된 세포 구상체를 3일 동안 모니터링한 결과 크기와 형태가 안정적으로 유지되며 (도 9의 (A)), 세포의 생존 능력 또한 이상이 없는 것을 확인되었다 (도 9의 (B)).

PDMS 표면에서 배양된 세포도 마찬가지로 3차원 세포 구상체를 형성하였으며 3일 동안 모니터링한 결과 크기와 형태가 유지되며 생존능 또한 이상 없는 것으로 확인하였다 (도 10 참조). 다양한 크기의 3차원 세포 구상체를 제작하기 위해 샌드페이퍼의 입도 수를 달리하여 제작된 하이드로젤 위에 테스트한 결과, 표면의 불규칙한 거칠기가 증가할수록 세포 구상체의 크기가 커지는 것을 확인하였다. 이 같은 현상은 Tet-TA 뿐만 아니라 아가로오즈 젤에서도 공통적으로 발견되었다 (도 11 참조).

실험예 2: hADSC 세포 구상체에 대한 H&E 염색 분석

상기 실험예 1과 같이 형성된 hADSC 세포 구상체가 종래의 일반적인 방법으로 형성된 3차원 세포 구상체와 구조적으로 큰 차이가 없음을 확인하기 위해 H&E 염색 (H&E staining)을 이용하여 분석하였다. 세포 분주 후 24시간 뒤에 세포 구상체를 4% paraformaldehyde에 고정하여 paraffin embedding 후 절편을 만들어 염색을 진행하였다.

그 결과, 빠른 시간 내에 세포 구상체가 형성되었음에도 불구하고 단순히 세포가 모여있는 수준의 aggregate가 아닌 세포 간의 상호작용이 충분히 일어난 형태의 세포 구상체가 형성됨을 확인할 수 있었고, 3일 동안 배양한 세포 구상체와 비교했을 때 구조적인 변형이 생기지 않았으며, 세포 외 기질 또한 충분히 발현 가능함을 확인했다 (도 12 참조).

실험예 3: 유전자 발현량 평가

상기 실험예 1과 같이 제작된 hADSC 세포 구상체의 기능을 파악하기 위해 polymerase chain reaction (PCR)을 통해 특정한 기능을 가진 것으로 알려진 유전자 발현량을 평가하였다. 세포 외 기질의 분비 (FN1, COLA1, LAMA1), 세포 외 기질의 리모델링 (MMP1, MMP2, MMP9), 세포 간 상호작용 (CDH1, GJA1)을 나타내는 유전자를 선정하여 3차원으로 배양된 hADSC 세포 구상체와 일반적인 배양 방법을 이용하여 단층 배양된 세포를 비교하였다.

그 결과, 도 13와 같이, 세포 외 기질의 분비, 리모델링, 세포 간 상호작용을 나타내는 유전자의 발현 모두 단층 배양된 세포에 비해 증가한 것을 확인하였다. 이는 단층 배양된 세포에 비해 활발한 세포 간 상호작용을 할 수 있음을 나타낸다. 이러한 성질들은 종래의 일반적인 방법으로 형성된 3차원 세포 구상체에서도 찾아볼 수 있는 성질인바, 표면의 거칠기만을 이용하는 본 발명을 사용해 제작된 3차원 세포 구상체도 종래의 세포 구상체와 기능면에서 차이가 없음을 알 수 있다.

실험예 4: 다양한 세포주를 이용한 3차원 세포 구상체 제작 및 배양

본 발명에 따른 하이드로젤 세포배양 기판에서 다양한 세포주를 이용하여 3차원 세포 구상체를 형성하고 배양할 수 있음을 확인하기 위해 인간 골수 유래 줄기세포 (human bone marrow derived mesenchymal stem cell, hMSC), 쥐로부터 얻어진 근아세포 (mouse muscle myoblast, C2C12), 인간 유래 간암세포 (human liver cancer cell, HepG2), 인간 비갑개 유래 줄기세포 (human turbinate mesenchymal cell) 등 세포를 얻은 대상 및 정상/암 세포 등 다양한 종류의 세포주를 추가로 이용하여 테스트를 실시하였다.

결과적으로, 네 종류의 세포 모두 거칠기가 도입된 하이드로젤 표면에서 3차원 세포 구상체를 형성하였으며, 실험예 1의 지방 유래 줄기 세포와 마찬가지로 3일간 배양하며 모니터링한 결과, 크기 변화는 크게 일어나지 않았고, 3일 이후에도 생존 능력 또한 안정적으로 유지되는 것으로 확인되었다 (도 14 참조). 인간 비갑개 유래 줄기세포는 도 15를 참조한다.

실험예 5: 종래의 3차원 세포 구상체 배양 기판과의 비교

이미 시중에서 판매중인 3차원 세포 구상체 배양 기판과의 비교를 위해 ultra-low attachment plate (LAP)를 구입하여 비교 분석 하였다. 앞선 실험예와 마찬가지로 지방유래 줄기세포를 준비하였으며, 1 × 10⁵ cells/cm² 의 밀도로 220 입도를 가지는 하이드로젤, 평평한 하이드로젤, LAP에 세포를 분주하였다. 그 결과 표면에 거칠기가 도입된 하이드로젤에서 시중에서 구매한 배양접시에 비해 크기가 잘 조절됨을 알 수 있었으며, 크기가 조절되지 않은 3차원 세포 구상체의 경우 구상체 내부에 심각한 저산소 상태가 유발됨을 확인할 수 있었다 (도 16 참조). 또한 표면에 거칠기가 도입된 하이드로젤 상에서 배양된 3차원 세포 구상체의 경우 시중에서 판매중인 배양접시에서 배양된 그것에 비해 세포-세포 간 상호작용을 나타내는 유전자 (E-cad)의 발현량이 증가되었으며, 세포 외 기질의 발현 (fibronectin, laminin) 또한 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 17 참조). 이에 따라 표면의 거칠기가 세포 간 접합을 촉진하여 3차원 세포 구상체의 형성을 가속시키고 형성된 구상체는 작은 크기를 유지하여 시중에서 구매 가능한 배양접시에 비해 생체 내와 비슷한 환경을 세포에 조성해 줄 수 있다는 것을 확인하였다. 표면의 거칠기가 도입된 하이드로젤 상에서 형성된 3차원 세포 구상체는 또한 향상된 혈관 재생능을 보였으며, LAP에서 배양된 세포 구상체에 비해 혈관형성 인자 관련 유전자의 발현이나, 그것에 연관된 단백질 발현이 증가하는 것으로 확인되었다 (도 18 참조). 따라서, 본 발명을 이용한 3차원 세포 배양은 세포 치료제 개발에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 예상된다.

이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속한 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

P1, P2: 다각형 1: 세포
3: 3차원 세포 구상체 10: 본체
20: 배양부 21: 돌기
40: 요철부재 51: 폴리머
50: 마스터 몰드 60: 세포배양 기판
61: 기판조성물

Claims

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(a) 깊이 및 높이가 서로 다르고 상단이 뾰족하게 형성된 요철 (凹凸)이 패턴화된 요철부재를 준비하는 단계;
(b) 상기 요철부재의 표면에 폴리머를 도포하여, 일면에 상기 요철 패턴에 대응되는 음각 패턴이 구비된 마스터 몰드를 생성하는 단계;
(C) 상기 요철부재와 상기 마스터 몰드를 분리하는 단계;
(d) 분리된 상기 마스터 몰드의 일면에 기판조성물을 배치하여, 일면에 상기 마스터 몰드의 음각 패턴에 대응되는 다수의 돌기를 구비하는 세포배양 기판을 생성하는 단계; 및
(e) 상기 세포배양 기판을 상기 마스터 몰드로부터 분리하는 단계;
를 포함하는 세포배양 기판의 제조방법.
청구항 7에 있어서,
상기 요철부재는 샌드페이퍼 (sandpaper)인 세포배양 기판의 제조방법.
청구항 7에 있어서,
상기 (d) 단계는
상기 마스터 몰드의 일면으로부터 이격된 소정의 높이에 유리기판을 배치하는 단계; 및
상기 마스터 몰드와 상기 유리기판 사이에 상기 기판조성물을 주입하는 단계;
를 포함하는 세포배양 기판의 제조방법.