KR101806299B1

KR101806299B1 - 보리 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101806299B1
Application number: KR1020127005059A
Authority: KR
Inventors: 종이 리; 매튜 케네디 모렐
Original assignee: 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션; 오스트레일리안 캐피탈 벤처스 리미티드
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2017-12-07
Also published as: EP2458974A1; BR112012002114A2; US11026384B2; ZA201200766B; CA2769311A1; EA032207B1; US20190150385A1; AU2010278678B9; SG178164A1; KR20120079057A; US10154632B2; EP2458974A4; NZ597971A; US20120129805A1; JP5982282B2; EA201270200A1; WO2011011833A1; MY159360A; MX2012001376A; UA116969C2

Abstract

본 발명은 감소된 수준 또는 활성의 전분 합성효소 IIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물, 및 이의 생산, 확인 및 이용 방법에 관한 것이다. 상기 곡물은 적어도 50%의 아밀라아제 함량, 5-9% (w/w) 또는 9% (w/w) 보다 큰 β-글루칸 함량, 및/또는 3-11% (w/w)의 프룩탄 함량을 포함할 수 있다. 상기 프룩탄은 약 3 내지 약 12의 중합도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 식물 및 곡물은 sex6 -292 대립 유전자 및/또는 amo1 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 식품 또는 음료 제품, 및 대상 곡물을 수득 또는 생산하는 단계 및 상기 곡물을 가공하여 상기 제품을 제조하는 단계를 포함하는 식품 또는 음료 제품의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대상 보리 곡물을 포함하는 조성물 또는 이를 포함하는 제품을 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물 내에 하나 이상의 건강 지표를 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

보리 및 이의 용도{BARLEY AND USES THEREOF}

본 명세서는 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질을 포함하고 원하는 전분 및 비전분 성분을 비교적 고수율로 나타내는 변종 보리 식물 및 그로부터의 곡물에 대하여 기재한다.

야생형 보리 종자는 그 배유 내에 대략 50 내지 60%의 전분을 함유하고 있으며, 이는 대략 25% 아밀로오스 및 75% 아밀로펙틴을 가진다. 아밀로오스는 주로 선형 α-(1-4) 결합 글루코실 사슬으로 몇 개의 α-(1-6) 결합 글루칸 사슬을 가지며, 10⁴ 내지 10⁵의 분자량을 가진다. 아밀로펙틴은 주로 3 내지 60 글루코실 단위를 가지는 α-(1-4) 결합 글루코실 사슬이 α-(1-6) 결합에 의하여 연결되어, 대략 5-6%의 글루코실 결합이 α-(1-6)-결합인 고분지형 글루칸이며, 10⁵ 내지 10⁶의 분자량을 가진다.

ADP-글루코오스 피로포스포릴라아제 (EC 2.7.7.27), 전분 합성효소 (EC 2.4.1.21), 전분 분지 효소 (EC 2.4.1.18) 및 전분 탈분지 효소 (EC 3.2.1.41 및 3.2.1.68)를 포함하는 일련의 효소가 시리얼 전분 생합성에 수반된다. 전분 합성의 첫번째 단계는 글루코오스-1-P 및 ATP로부터 ADP-글루코오스의 합성으로, 이는 효소 ADP-글루코오스 피로포스포릴라아제에 의하여 촉매화된다. 다음, 상기 ADP-글루코오스는 글루코오스를 전분의 이미 존재하는 α-(1-4) 결합 글루코실 사슬의 비환원 말단으로 전달하는 전분 합성효소에 의한 전분 합성을 위한 기질로서 사용된다. α-(1-6) 결합으로 연결되는 전분의 분지형 글루칸 사슬이 전분 분지 효소에 의하여 α-(1-4) 결합 글루칸 영역의 절단 및 연이은 짧은 글루칸의 전분의 α-(1-4) 결합 글루칸 상의 위치로의 전달을 통하여 형성된다. 과량의 α-(1-6) 결합 글루칸 사슬이 탈분지 효소에 의하여 제거되어 전분을 소정의 구조로 유지한다 (Kossmann and Lloyd, Crit Rev Plant Sci , 19: 171-226, 2000; Rahman et al ., J Cereal Sci, 31: 91-110, 2000; Smith, Biomacromolecules , 2: 335-341, 2001; Morell et al., Euphytica , 119: 55-58, 2001; Morell et al ., J Appl Glycosci , 50: 217-224, 2003a; Morell et al., Control of starch biosynthesis in vascular plants and algae . In : Plaxton WC , McManus MT ( eds ) Control of primary metabolism in plants . Annual plant reviews , vol 22, Blackwell, Oxford, pp 258-289, 2006; Ball and Morell, Annu Rev Plant Biol , 54: 207-233, 2003; James et al ., Curr Opin Plant Biol , 6: 215-222, 2003; Tetlow et al ., J Exp Bot , 55: 2131-2145, 2004 참조).

열 개의 전분 합성효소 유전자가 쌀 게놈 내에서 동정되었으며 (Hirose and Terao, Planta , 220: 9-16, 2004), 다섯 개의 구분되는 클래스로 나뉘어진다: 전분립 합성 효소 (GBSS: granule-bound starch synthase), 전분 합성효소 I (SSI), 전분 합성효소 II (SSII), 전분 합성효소 III (SSIII), 및 전분 합성효소 IV (SSIV) (Li et al., Funct Integr Genomics , 3: 76-85, 2003). 쌀 내에 두 개의 GBSS 이소폼 (GBSSI 및 GBSSII), 하나의 SSI 이소폼, 세 개의 SSII 이소폼 (SSIIa [SSII-3], SSIIb [SSII-2], 및 SSIIc [SSII-1]), 두 개의 SSIII 이소폼 (SSIIIa [SSIII-2] 및 SSIIIb [SSIII-1]), 두 개의 SSIV 이소폼 SSIIIa [SSIII-2] 및 SSIIIb [SSIII-1])이 있다 (Hirose and Terao, 2004 (supra); Fujita et al ., Plant Physiol , 144: 2009-2023, 2007). SSI, SSIIa 및 GBSSI에 상응하는 단백질이 전분립 내에서 검출된 반면, SSIIIa 단백질은 아밀로플라스티다의 가용성 상 내에서만 검출되었다 (Li et al ., Plant Physiology , 123: 613-624, 2000). 일부 전분 합성효소의 잠재적 역할이 상이한 기관 및 상이한 종 내에서 규명되었으나, 전분립의 최종 구조를 결정함에 있어서 이들 전분 합성효소의 개별적 및 협동적인 정확한 역할은 대체로 정의되지 않은 채 남아 있다.

전분 합성효소 내 돌연변이체는 일부 곡류 종 내에서 역할을 결정함에 있어 유용하였다. BGSSI는 아밀로오스의 생합성에 있어 결정적인 역할을 하나 (Ball et al., Cell 86(3): 349-52, 1996), 이는 또한 아밀로펙틴의 장 사슬 합성에도 기여할 수 있다 (Maddelein et al ., J Biol Chem . 269(40): 25150-7, 1994; Denyer et al., Plant Physiol . 112(2):779-85, 1996). 보리 및 밀 내 BGSSI 삭제 돌연변이체 (null mutant)에 대하여 전분 특성에 대한 영향을 조사하였다 (Andersson et al., J. Cereal Sci 30: 183-191, 1999; Yamamori and Quynh, Theor Appl Genet , 100: 32-38, 2000). GBSSI 삭제 돌연변이 보리는 야생형과 비교하여 5% 미만의 아밀로오스 함량을 가졌다 (Andersson et al., 1999 (supra)). 밀의 BGSSI 삭제 돌연변이체 또한 낮은 아밀로오스 함량을 가졌다 (Kim et al ., J Cereal Sci , 37: 195-204, 2003; Miura et al ., Euphytica , 108: 91-95, 1999; Miura et al.,Euphytica, 123: 353-359, 2002). GBSSI 삭제 돌연변이 밀은 또한 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의하여 측정시 야생형으로부터의 것보다 더 높은 피크 젤라틴화 온도 및 엔탈피를 가졌다 (Yasui et al ., J Cereal Sci , 24: 131-137, 1996).

SSI, SSIIa 및 SSIII는 전분 분자 내 특정 서브세트의 유용한 비-환원 말단의 연장에 수반되는 아밀로펙틴 합성에 일차적으로 수반되는 것으로 생각된다. 아라비돕시스 (Arabidopsis) 및 쌀 SSI 삭제 돌연변이체에 대한 연구는 SSI가 Arabidopsis의 엽 내 전분 내 (Delvalle et al ., Plant J. 43(3): 398-412, 2005) 및 쌀의 배유 전분 내 (Fujita et al ., Plant Physiol . 140: 1070-1084, 2006) 아밀로펙틴 클러스터 (8-12 dp)의 작은 외부 사슬의 생합성에 수반됨을 보였다. 보리 및 밀 SSIIa 돌연변이체로부터의 전분은 DP3-8의 사슬 증가가 있었으며, 이는 SSIIa 효소가 DP3-8의 더 짧은 글루칸 사슬을 DP12-35의 더 긴 글루칸 사슬으로 연장함에 있어 역할을 하였음을 나타낸다 (Morell et al ., Plant J. 34: 173-185, 2003b; Yamamori et al ., Theor Appl Genet , 101: 21-29, 2000; Konik-Rose et al ., Theor Appl Genet , 115: 1053-1065, 2007). 옥수수 및 쌀 내 SSIIIa 손실은 매우 긴 사슬의 비율 감소 (옥수수 내에서 DP > 50, 또는 쌀 내에서 DP > 30) 및 약간 감소된 젤라틴화 온도와 함께, 증가된 아밀로오스 표현형을 부여한다 (Jane et al ., Cereal Chem . 76: 629-637, 1999; Fujita et al ., 2007 (supra)). SSIV 결손 Arabidopsis 돌연변이체는 색소체 내 더 작은, 더 큰 전분립을 가지는 것으로 보이며, SSIV 단백질에 대하여 프라이밍 전분립 형성에 있어서의 역할이 상정되었다 (Roldan et al., Plant J. 49: 492-504, 2007).

보리 SSIIa 돌연변이체는 전분 생합성 감소로 인한 감소된 전분 함량 및 감소된 종자 중량과 함께 높은 아밀로오스 표현형을 가지는 것으로 보여져 왔다. SSIIa를 인코딩하는 유전자 내에 삭제 돌연변이에 대하여 동형 접합성인 보리 돌연변이 계통 M292 및 M342를 아지드화 나트륨을 이용하여 보리 품종 '히말라야 (Himalaya)'의 곡물의 돌연변이 생성 후 얻었다. 돌연변이 종자를 줄어든 곡물 표현형에 근거하여 돌연변이 유발된 집단의 자손 곡물로부터 처음 선별하였다. 상기 돌연변이 계통을 그들의 변화된 전분 특성, 감소된 SSIIa 단백질 수준 및 활성, 및 유전적으로 SSIIa를 인코딩하는 유전자의 단백질 코딩 영역 내에 조기 정지 코돈의 존재에 의하여 추가로 규명하였다 (본원에 참조로 그 전체로서 포함되는 Morell et al., 2003b (supra)). 이는 배유 내 SSIIa 효소 손실을 야기하였다. 그러나, 상기 SSIIa 돌연변이 곡물은 또한 실질적으로 감소된 전분 함량을 가졌으며, 이는 보리 식물이 밭에서 재배될 때 보통의 수율 감소와 관련된다. 수율을 향상시킬 수 있는지, 또는 높은 아밀로오스 표현형을 유지하면서 어떻게 할 수 있는지는 알려지지 않았다.

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따라서, 향상된 작물 특성을 가지는 고아밀로오스 보리에 대한 요구가 있다.

발명의 개요

본원 명세서를 통하여, 달리 요구하지 않으면, "포함하다" 또는 "포함하는"은 기재된 구성 요소 또는 정수 또는 구성 요소들 또는 정수들의 군을 포함하는 것을 의미하나 다른 구성 요소 또는 정수 또는 구성요소들 또는 정수들의 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.

본원에서 단수 형태는 달리 분명히 기재하지 않는 한 복수 측면을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "돌연변이"에 대한 참조는 단일 돌연변이 및 2 이상의 돌연변이들을 포함하고; "제제"에 대한 참조는 하나의 제제 및 2 이상의 제제들에 대한 참조를 포함한다.

뉴클레오티드 및 핵산 서열은 서열 식별 번호 (SEQ ID NO:)에 의하여 언급된다. 서열 번호들은 수적으로 서열 식별자 <400>1 (서열 번호 1), <400>2 (서열 번호 2) 등에 상응한다. 서열 식별자의 요약은 표 8에 제공된다. 서열 목록이 청구범위 뒤에 제공된다.

유전자 및 기타 유전물질 (예를 들어, mRNA, 핵산 구조체 등)은 본원에 이탤릭체로 표시되는 반면, 그들의 단백질 발현 생성물은 비-이탤릭체 형태로 표시된다. 따라서, 예를 들어, 전분 합성효소 II (SSII) 폴리펩타이드는 SSII 핵산 서열의 발현 생성물이다.

SSIIa 분자의 핵산 및 아미노산 서열의 대표적인 예가 표 8에 추가로 기재되는 서열 목록에 제공된다.

본원 명세서에서 저자에 의하여 언급되는 문헌의 서지 세부 사항은 발명의 상세한 설명의 후반부에 수집된다.

본원 명세서에서 임의의 종래 문헌 (또는 그로부터 유래되는 정보), 또는 공지 사항에 대한 참고는 종래 문헌 (또는 그로부터 유래되는 정보) 또는 공지 사항은 본원 명세서와 관련된 노력의 분야에서 통상적이고 일반적인 지식의 일부를 형성하는 것이 아니며 이에 대한 시인 또는 인정 또는 어떠한 형태의 시사로 간주되어서는 안 된다.

본원에 기재되는 각각의 구현예들은 달리 특별히 기재되지 않는 한, 각각의 모든 구현예에 준용될 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물을 제공한다. 상기 곡물, 이로부터의 생성물 및 이의 수득, 확인 또는 이용 방법은 적어도 이러한 두 가지를 특징으로 한다. 특히, 예를 들어 정제 곡물의 "전분 함량"은 더 높을 것이므로, "전분 함량"은 전곡(wholegrain)의 전분 함량이다. 일부 구현예에서, 보리 곡물은 적어도 43% (w/w), 적어도 45% (w/w), 적어도 47% (w/w), 적어도 50% (w/w)의 전분 함량, 또는 41-65% (w/w)의 전분 함량을 포함한다.

관련된 구현예에서, 상기 곡물은 곡물 내에 총 전분의 비율로서 적어도 50% 또는 적어도 60%의 아밀로오스 함량을 포함한다. 나아가, 일부 구현예에서, 상기 곡물은 5-9% (w/w), 또는 9% (w/w) 보다 큰 β-글루칸 함량을 포함한다.

다른 구현예에서, 상기 곡물은 3-11% (w/w) 또는 4-11% (w/w)의 프룩탄 함량을 포함한다. 적합하게, 상기 프룩탄은 약 3 내지 약 12의 중합도를 포함한다.

추가적으로 관련된 구현예에서, 상기 곡물은 SSIIa 활성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 내인성 유전자 내에 돌연변이를 포함하며, 상기 돌연변이는 보리 식물 내에 SSIIa를 인코딩하는 유전자 발현을 감소시키거나 감소된 수준 또는 활성을 가지는 SSIIa의 발현을 초래한다. 예시적 구현예에서, sex6-292 대립 유전자에 대하여 동형 접합성인 식물 또는 곡물이 제공된다. 일부 구현예에서, SSIIa의 수준은 보리 식물 내에서 SSIIa를 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하는 외인성 핵산 분자에 의하여 감소된다. 여기서, 일부 구현예에서, 상기 외인성 핵산 분자는 내인성 SSII 발현을 하향 조절하는 유전자 침묵 키메릭 유전자, 안티센스, 리보자임, 동시 억제, dsRNA 분자, 헤어핀 RNA 분자 또는 마이크로RNA를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 amo1 유전자 활성을 감소시키는 유전적 변이를 추가로 포함하는 보리 곡물을 제공한다. 적합하게, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이, 상기 amo1 유전자 활성은, 품종 히말라야의 보리 곡물과 비교하여 감소와 같이, 비조절된 대조군에 대하여 감소된다. 예시적 구현예에서, 상기 유전적 변이는 amo1 유전자 내에 돌연변이를 포함한다. 추가적 실시예에서, 그로부터의 식물 또는 곡물은 amo1-AC38 대립 유전자에 대하여 동형 접합성이다 (본원에 전체로서 참조로 포함되는, Schondelmaier et al ., Plant Breeding , 109: 274-281, 1992). 특정 구현예에서, 상기 보리 곡물은 amo1 유전자 내에 돌연변이 및 SSIIa 이외의 전분 합성효소의 감소된 활성, 바람직하게 감소된 수준의 GBSS, 더 바람직하게 감소된 수준의 GBSSI를 포함한다. 상기 곡물은 또한 증가된 수준의 라이신 (단백질 100g 당 >4g)을 포함할 수 있다. 이러한 곡물은 보리 품종 Prowashonupana와 고아밀로오스 글래시어(High Amylose Glacier)와 같이 amo1 돌연변이 자리를 함유하는 보리를 교배함으로써 얻어질 수 있다.

상기 곡물은 제한 없이 전곡(wholegrain) 또는 균열된(cracked), 제분된(ground), 정제된(polished), 도정된(milled), 거칠게 빻은(kibbled), 압착된(rolled) 또는 정맥(pearled) 곡물과 같은 임의의 사용가능한 형태일 수 있다.

본 발명은 본원에 기재되는 곡물을 생산할 수 있는 보리 식물 및 상기 곡물로부터 생산되는 보리 통밀 또는 가루에도 연장된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물로서, 상기 곡물이 돌연변이 SSIIa 및 돌연변이 amo1 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 보리 곡물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 SSIIa 돌연변이체는 sex6-292 대립 유전자이고, amo1 돌연변이를 수득하거나 생산하고 가공하여 식품 또는 음료 제품을 제조한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본원에 기재되는 보리 곡물을 수득 또는 생산하는 단계; 및 (ii) 상기 곡물을 가공하여 식품 또는 음료 제품을 생산하는 단계

를 포함하는 식품 또는 음료 제품의 제조 방법을 제공한다. 상기 제품은 적합하게 통밀(wholemeal), 가루(flour), 전분(starch), 겨(bran), β-글루칸, 프룩탄, 비-전분 폴리사카라이드, 및 균열된, 제분된, 정제된, 도정된, 거칠게 빻은, 압착된 또는 정맥 곡물로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 가공된 보리 곡물은 직접 사용되거나, 또는 다른 구현예에서, 상기 가공된 곡물은 하나 이상의 다른 성분과 혼합되어 식품 또는 음료 제품을 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (iii) 보리 곡물 또는 이로부터의 제품 내에 전분의 수준 또는 유형, 전분 함량, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비-전분 폴리사카라이드, 식이 섬유, 저항성 전분을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 식품 또는 음료 제품은 곡물, 가루, 아침 식사용 시리얼, 비스킷, 머핀, 뮤즐리 바, 국수, 감미제, 저칼로리 첨가제, 증량제, 식이 섬유, 조직화제, 방부제, 정장제 등, 또는 이들의 조합이다. 상기 식품은 압출된 아침식사용 시리얼 또는 스낵과 같은 압출된 식품, 또는 박편(flaked) 또는 압착(rolled)된 제품일 수 있다. 상기 식품은 베이킹 성분 또는 베이킹 믹스와 같은 식품 성분일 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명은 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 가지는 곡물을 생산할 수 있는 보리 식물의 제조 방법으로서, (i) 대조 식물에 대하여 상기 식물 내에 내인성 전분 합성효소 II (SSII)의 수준 또는 활성을 하향 조절하는 제제를 상기 식물 내로 도입하거나, 또는 상기 식물 내에 SSII를 인코딩하는 내인성 유전자 내에 돌연변이를 도입하는 단계; 및

(ii) 상기 곡물을 생산하는 보리 식물을 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 식물 내로 amo1 유전자 활성을 감소시키는 유전적 변이를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 제제는 적합하게 유전자 침묵 키메릭 유전자, 안티센스, 리보자임, 동시 억제, dsRNA 분자, 헤어핀 RNA 분자 또는 내인성 SSII 발현을 하향 조절하는 기타 외인성 핵산 분자와 같은, 내인성 SSII 유전자 발현을 하향 조절하는 핵산 분자를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 보리 곡물 또는 이로부터의 제품 내에 전분의 수준, 활성 및/또는 유형, 전분 함량, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비-전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 유전자 마커로 상기 식물을 분석하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 SSIIa 단백질의 감소된 수준 또는 활성은 대조 식물 또는 상기 제제 또는 돌연변이의 도입 이전의 식물의 것과 비교하여 25% 미만, 10% 미만, 5% 미만이거나, 또는 실질적으로 결핍된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 보리 식물을 재배하는 단계 및 보리 곡물을 수확하는 단계를 포함하는, 본원에 기재되는 보리 곡물의 생산 방법을 제공한다. 다른 구현에에서, 본 발명은 제품 내에 저항성 전분, 식이 섬유, 수용성 탄수화물, β-글루칸, 프룩탄 또는 비-전분 탄수화물 수준을 증가시키거나, 또는 제품의 당 지수(GI)를 감소시키기 위한 제품의 제조에 사용하기 위한 또는 사용될 때의 본원에 개시되는 식물 또는 곡물 또는 통밀 또는 가루를 제공한다. 본 발명의 식물, 곡물 또는 통밀 또는 가루로부터 분리되는 프룩탄, 전분 또는 β-글루칸이 예를 들어, 식품 내에 감미제, 저칼로리 첨가제, 증량제, 식이 섬유, 조직화제, 방부제, 정장제 등 또는 이들의 조합으로서 사용된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 식물, 곡물, 통밀 또는 가루로부터 분리되는 곡물, 가루, 통밀, 전분, β-글루칸 또는 프룩탄이 식품 내에 저항성 전분, 식이 섬유, 수용성 탄수화물, β-글루칸 또는 프룩탄 수준을 증가시키기 위한 또는 식품 내에 당지수(GI)를 감소시키기 위한 식품의 제조에 사용된다. 일부 구현예에서, 아밀로오스, β-글루칸 및 프룩탄, 바람직하게 저항성 전분의 수준이 증가된다. 따라서, 본 발명은 건조 중량 기준으로 적어도 10% 수준으로 식품 성분을 포함하는 식품으로서, 상기 식품 성분은 본원에 기재되는 적어도 41% 전분 (w/w)을 포함하는 보리 곡물, 또는 이로부터 얻어지는 통밀 또는 가루이며, 상기 통밀 또는 가루는 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 통밀 또는 가루는 중량 기준으로 3-11% 프룩탄 (w/w) 또는 4-11% (w/w) 프룩탄을 포함한다.

일부 다른 구현예에서, 상기 통밀 또는 가루는 5-9% (w/w), 또는 9% 보다 큰 (w/w) β-글루칸 함량을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 통밀 또는 가루는 상기 통밀 또는 가루 내 총 전분의 비율로서 50% 또는 60% 아밀로오스를 포함한다.

예시적 구현예에서, 상기 보리는 sex6 -292 대립 유전자를 포함한다.

다른 예시적 구현예에서, 상기 제품은 빵, 번, 아침식사용 시리얼, 케이크, 비스킷, 페이스트리, 크래커, 머핀, 피자, 크로와상, 베이글, 프레첼, 파스타, 국수, 베이킹 성분, 베이킹 믹스, 수프, 소스, 증점제, 사탕 과자류, 토르티야, 그라놀라 바, 스낵 및 기타 전분질 식품으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 상기 제품은 고에너지 드링크 또는 스무디와 같은 음료일 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명은 식품 내 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비-전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분 중 하나 또는 둘 이상의 수준을 증가시키기 위한 식품의 제조에 있어서, 본원에 기재되는 식물 또는 곡물로부터 분리되는 곡물 또는 가루의 용도를 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비-전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분 중 하나 또는 둘 이상의 증가된 수준을 가지는 보리 곡물 품종을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (i) 합성 또는 이화 작용을 통하여 전분이 변성되는 보리 곡물을 수득하는 단계, 및 (ii) 상기 곡물 내 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비-전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분 중 하나 또는 둘 이상의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 상기 방법은 (iii) 단계 (ii)에서의 수준을 합성 또는 이화작용을 통하여 전분이 변성되지 않은 야생형 곡물 또는 모 곡물 또는 기타 대조 식물 내의 것과 비교하는 단계를 포함한다. 다른 추가적인 구현예에서, 상기 방법은 단계 (ii)에서의 수준(들)이 변성된 곡물 내에서 증가된 경우, 상기 곡물을 선별하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (i) 전에, 돌연변이 유발 또는 식물 세포 형질전환을 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 보리 곡물은 amo1 유전자 내에 돌연변이 및, 감소된 수준의 GBSSI와 같은, 감소된 활성의 SSIIa, SSIIa 또는 GBSS일 수 있는 전분 합성효소를 포함한다. 이러한 곡물은 곡물 돌연변이 M292 또는 기타 sex6 -292 대립 유전자를 포함하는 보리 또는 품종 Prowashonupana와 고아밀로오스 글래시어와 같은 amo1 돌연변이 자리를 함유하는 보리를 교배시킴으로써 얻어질 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 41% (w/w) 전분을 포함하는 곡물을 수득하는 단계, 상기 곡물을 가공하여 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분을 추출하는 단계, 및 추출된 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분의 양을 측정하여 상기 곡물 내 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 보리 곡물 내 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분의 양을 결정하는 방법을 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 보리 곡물 또는 본원에 개시되는 방법에 의하여 얻어지는 제품을 다른 식품 또는 음료 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 식품 또는 음료의 제조 방법을 제공한다. 따라서, 상기 방법은 (i) 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물을 수득하거나 생산하는 단계; 및 (ii) 상기 곡물을 가공하여 상기 제품을 생산하는 단계를 포함한다. 상기 제품은 적합하게 통밀, 가루, 전분, 겨, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 및 균열된, 제분된, 정제된, 도정된, 거칠게 빻은, 압착된 또는 정맥 곡물로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 방법은 상기 제품을 다른 식품 또는 음료 제품 또는 이의 전구체와 혼합하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명은 포유 동물 내에서 하나 이상의 건강 지표를 향상시키기 위하여 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분을 제공하는 방법으로서, 상기 포유 동물에, 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물, 이로부터의 통밀 또는 가루 또는 이로부터 얻어지는 식품 또는 음료, 또는 본원에 기재되는 식품을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 곡물, 가루, 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분은 식품, 음료 또는 약학적 조성물의 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 곡물 또는 가루는 프룩탄 제품의 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 건강 지표는 이로운 장내 세균 수 증가, 이상함몰점 수 감소, 무기 이온 흡수 증가, 인슐린 수준 감소, 당지수 감소, 당부하지수 감소, 혈당 감소, 혈압 감소, 체중 감소, 혈중 콜레스테롤 수준 감소, HDL 콜레스테롤 수준 증가, 골밀도 증가, 칼슘 수준 증가, 더 잦은 배변 운동, 또는 향상된 혈청 심혈관 프로필이다.

관련 구현예에서, 본 발명은 대상 내에 낮은 수준의 식이 섬유, 전분 함량, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분과 관련된 상태의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법으로서, 상기 대상에, 본원에 기재되는 곡물, 또는 이로부터 얻어지는 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분 중 하나 이상을 포함하는 가공된 제품을 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 조건 하에 소정 시간 동안 경구 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 상태는 당뇨병, 비만, 심장병, 고혈압, 변비, 골다공증 및 암으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 방법 또는 조성물로부터 이로울 수 있는 임의의 대상이 포함된다. 상기 용어 "대상"은 제한 없이, 인간 및 비인간 영장류, 소, 돼지 또는 닭과 같은 가축, 또는 송아지 또는 새끼 돼지와 같은 어린 동물, 또는 개 또는 고양이, 말과 같은 애완 동물, 실험실 시험 동물, 포획 야생 동물, 파충류 및 양서류, 어류, 및 조류를 포함한다. 대상은 인간이든 비인간 생물이든 관계없이 환자, 개체, 대상, 동물, 숙주 또는 수용자로 언급할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 대상은 인간이다.

상기 개요는 본 발명의 모든 구현예들의 철저한 설명이 아니며 어떠한 방식으로도 이와 같이 보여서는 안 된다.

본 발명은 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질을 포함하고 원하는 전분 및 비전분 성분을 비교적 고수율로 나타내는 변종 보리 식물 및 그로부터의 곡물을 제공한다.

도 1은 종자 형태를 보이는 종자의 사진을 나타낸 것이다. 사용되는 계통은 Himalaya292 및 HAG 사이의 BC3F6 개체군으로부터 유래되는 야생형 계통 (HH21 및 HH61), amo1 돌연변이 계통 (HH17 및 HH30), SSIIa 돌연변이 계통 (HH35 및 HH50), SSIIa-amo1 이중 돌연변이 계통 (HH4 및 HH8)이었다. 두 개의 모 계통 및 두 개의 대조 계통 또한 사용되었다.
도 2는 네 가지 유전자형: 야생형, SSIIa-amo1, ssIIa - amo1 및 ssIIa - amo1에 대한 종자 건조 중량의 백분율로서 전분 함량을 예시하는 막대 그래프이다.
표에 대한 간단한 설명
표 1은 보리 통밀의 RS 함량 및 GI 수준을 제공한다.
표 2는 100% 보리 통밀을 사용하여 제조되는 빵의 RS 함량 및 GI 수준을 제공한다.
표 3은 30% 또는 100% 보리 가루로 제조되는 빵의 RS 함량에 대한 유전자형의 영향에 대한 통계학적 분석을 제공한다.
표 4는 30% 보리 가루로 제조되는 빵의 RS 함량 및 GI 수준을 제공한다.
표 5는 100% 보리 가루로 제조되는 빵의 RS 함량 (g 전분 당 mg RS)에 대한 유전자형의 영향에 대한 통계학적 분석을 제공한다.
표 6은 30% 보리 가루로 제조되는 빵의 RS 함량 (g 전분 당 mg RS)에 대한 유전자형의 영향에 대한 통계학적 분석을 제공한다.
표 7은 30% 또는 100% 보리 가루로 제조되는 10g 빵의 GI 수준에 대한 유전자형의 영향에 대한 통계학적 분석을 제공한다.
표 8은 본원에 제공되는 서열 번호들에 대한 기재를 제공한다.
표 9는 아미노산 하위 분류를 제공한다.
표 10은 예시적 아미노산 치환을 제공한다.

본 발명은 SSIIa 돌연변이 보리의 이점, 그 중에서도 고아밀로오스 및 프룩탄의 작물학적 이점이 amo1 유전자 활성을 감소시키는 유전적 변이와 함께 SSIIa 유전자 내 결실 기능 돌연변이를 포함하는 품종 내에서 추가로 증진될 수 있다는 놀라운 발견에 근거한 것이다. 특히, 도 2에 도시되는 바와 같이, 이중 보리 돌연변이체는 단일 SSIIa 돌연변이체에 비하여 향상된 전분 수준을 보였다.

따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물이 제공된다. 관련된 구현예에서, 상기 곡물은 상기 곡물 내에 총 전분의 비율로서 적어도 50%의 아밀로오스 함량을 포함한다. 나아가, 일부 구현예에서, 상기 곡물은 5-9% (w/w), 또는 9% (w/w) 보다 큰 β-글루칸 함량을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 곡물은 3-11% (w/w) 또는 4-11% (w/w)의 프룩탄 함량을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 곡물 내 라이신 함량은 100g 단백질 당 적어도 4g이다.

전분은 글루코시드 잔기로만 구성되고, 두 가지 유형의 분자, 아밀로오스 및 아밀로펙틴으로서 발견되며, 이는 분자 크기 또는 기타 특성에 근거하여 구별될 수 있다. 아밀로오스 분자는 α-1,4 결합 글루코시드 단위로 이루어지는 실질적으로 선형 폴리머인 반면, 아밀로펙틴은 α-1,4 결합 글루코시드 단위의 많은 선형 사슬을 연결하는 α-1,6 글루코시드 결합을 가지는 고분지형 분자이다. 아밀로펙틴은 수 만 내지 수 십만의 글루코스 단위의 크기를 가지며 주위의 5% α-1,6 가지를 가지는 큰 분자로 이루어진다. 반면, 아밀로오스는 수백 내지 수천 글루코시드 잔기의 크기를 가지며 1% 미만의 가지를 가지는 분자로 이루어진다 (Buleon et al., International Journal of Biological Macromolecules, 23: 85-112, 1998를 참조한다). 야생형 시리얼 전분은 전형적으로 20-30% 아밀로오스를 함유하며 나머지는 아밀로펙틴이다.

고등 식물의 배유 내에서 전분 합성은 네 가지 주요 단계를 촉매화하는 한 세트의 효소에 의하여 수행된다. 첫째로, ADP-글루코오스 피로포스포릴라아제가 G-1-0 및 ATP로부터 ADP-글루코오스 합성을 통하여 전분의 모노머 전구체를 활성화한다. 두번째로, 상기 활성화된 글루코실 공여체, ADP-글루코오스가 전분 합성효소에 의하여 이미 존재하는 α-1,4 결합의 비환원 말단으로 전달된다. 세번째로, 전분 분지 효소가 α-1,4- 결합 글루칸 영역의 절단을 통하여 분지점을 도입한 후, 절단된 사슬을 수용체 사슬으로 전달하여, 새로운 α-1,6 결합을 형성한다. 전분 분지 효소는 α-16 결합을 α-폴리글루칸 내로 도입시킬 수 있는 유일한 효소이며, 따라서 아밀로펙틴 형성에 있어서 필수적인 역할을 한다. 마지막으로, 그것이 작용하는 메커니즘은 미해결이나, 전분 탈분지 효소가 분지 결합 중 일부를 제거한다.

적어도 이들 네 가지 작용이 고등 식물 내에서 정상적인 전분립 합성을 위하여 요구된다는 것은 분명하나, 상기 네 가지 작용 각각의 복수 이소폼이 고등 식물의 배유 내에서 발견되며, 돌연변이 분석에 근거하여 또는 유전자 이식 (transgenic) 접근법을 이용하는 유전자 발현 수준의 변화를 통하여 개별적인 이소폼에 대한 특정 역할이 제안되어 왔다. 곡류 배유 내에서 네 가지 부류의 전분 합성효소가 발견되며, 아밀로오스 합성에 필수적인 전분립 합성효소 (GBSS: granule-bound starch synthase)가 전분립 내에 독점적으로 위치하고, 전분립과 가용성 분획 사이에 두 가지 형태 (SSI, Li et al ., Plant Physiology , 120: 1147-1155, 1999a, SSII, Li et al., Theoretical and Applied Genetics , 98: 1208-1216, 1999b)가 분할되고, 및 상기 가용성 분획 내에 네번째 형태 SSIII가 전적으로 위치한다 (Cao et al ., Archives of Biochemistry and Biophysics , 373: 135-146, 2000; Li et al ., 1999b (supra); Li et al ., 2000 (supra)). SSI 작용에 대한 역할을 정의하는 어떠한 돌연변이도 기재되지 않았다.

세 가지 형태의 분지 효소, 분지 효소 I (SBEI), 분지 효소 IIa (SBEIIa) 및 분지 효소 IIb (SBEIIb)가 곡류 배유 내에서 발현된다 Hedman and Boyer, Biochemical Genetics , 20: 483-492, 1982; Boyer and Preiss, Carbohydrate Research, 61: 321-334, 1978; Mizuno et al ., Journal of Biochemistry , 112: 643-651, 1992; Sun et al ., The New Phytologist , 137: 215-215, 1997). SBE 서열의 정렬은 핵산 및 아미노산 수준 모두에 있어서 높은 정도의 서열 유사성을 드러내며, 이에 따라 SBEI, SBEIIa 및 SBEIIb 클래스로 구분하는 것이 허용된다.

두 가지 유형의 탈분지 효소가 고등 식물 내에 존재하며, 그들이 기질 특이성에 근거하여, 이소아밀라아제 타입 탈분지 효소, 및 풀루라나아제 타입 탈분지 효소로 정의된다 (Myers et al ., Plant Physiology , 122: 989-997, 2000). 옥수수 및 쌀 내에서 sugary-1 돌연변이는 두 탈분지 효소 모두의 결핍과 관련이 있으나 (James et al ., Plant Cell , 7: 417-429, 1995; Kubo et al ., Plant Physiology , 121: 399-409, 1999), 원인이 되는 돌연변이는 이소아밀라아제 타입 탈분지 효소 유전자와 동일 위치로 매핑된다.

M292 또는 M324로 지정되는 보리의 돌연변이 형태는 증가된 아밀로오스 전분 표현형 및 감소된 아밀로펙틴 전분 표현형을 가지는 것으로 보여져 왔다. 이러한 표현형은 인간 건강에 대하여 이점을 가질 것이다 (Morell et al ., Plant J. 34: 173-185, 2003b; Topping et al ., Starch / Starke 55: 539-545, 2003; Bird et al ., J. Nutr . 134: 831-835, 2004a; Bird et al . Br . J. Nutr . 92: 607-615, 2004b). 이는 국제 특허 출원 PCT/AU01/01452 (공개 번호 WO 02/37955)에 기재된 바와 같이, 보리의 염색체 7H에 위치하는 전분 합성효소 IIa 유전자 내 돌연변이에 의하여 야기되며, 상기 문헌은 본원에 참조로 그 전체로서 포함된다.

보리 sex6 돌연변이는 전분 합성효소 IIa (SSIIa) 유전자 내 정지 코돈의 존재에 의하여 야기된다. 상기 정지 코돈은 전사체 번역의 조기 종결을 초래한다. 상기 SSIIa 단백질은 이러한 돌연변이체의 배유 내에서 검출가능하지 않다 (Morell et al. 2003 (supra)). SSIIa 활성 손실은 아밀로텍틴 합성의 80% 감소를 초래하며, 나머지 아밀로펙틴 폴리머는 일반적으로 변화된 사슬 길이 분포를 가지며 따라서 변화된 아밀로오스: 아밀로펙틴 비율을 가져 곡물의 전분이 약 70% 아밀로오스를 함유하게 된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 곡물 내 전분 및 비전분 성분의 수율을 증가시킴으로써 보리 식물 유용성에 대한 개선을 제공한다. 이러한 변화는 곡물에 제한되거나, 또는 이러한 변화는 식물을 통하여 다양한 그 조직 및 부분 내일 수 있다. 본원에 사용되는 "변성" 또는 "변성된"은, 감소된 수준 또는 활성의 전분 합성효소 II가 있는 한, 양, 활성, 생산율, 불활성화율, 분해율, 개시 지연, 조기 개시, 물질 첨가 또는 제거, 돌연변이 또는 이들의 조합의 증가 또는 감소일 수 있는 식물 또는 곡물 내 변화를 의미한다. 상기 용어는 해당 유전자 또는 단백질의 기능적 수준의 증가 또는 감소를 포함한다. "기능적 수준"은 활성 단백질의 수준을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 상기 기능적 수준은 숙주 세포 내에 존재하는 단백질의 실제 수준 및 상기 단백질의 특정 활성의 조합이다. 따라서, 상기 기능적 수준은 예를 들어, 숙주 세포 내 실제 단백질 농도를 증가 또는 감소시킴으로써 변화될 수 있으며, 이는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자 발현을 변화시킴으로써 용이하게 달성될 수 있다. 상기 기능적 수준은 또한 단백질의 특정 활성을 조정함으로써 변화될 수 있다. 이러한 특정 활성의 증가 또는 감소는 더 높거나 낮은 특정 활성을 가지는 변이 단백질을 발현시킴으로써 또는 관련되는 단백질을 인코딩하는 내인성 유전자를 이러한 변이체를 인코딩하는 대립 유전자로 대체함으로써 달성될 수 있다. 특정 활성의 증가 또는 감소는 또한 이펙터 분자의 발현을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 적절한 코딩 서열의 발현 수준 또는 효소의 활성 또는 양은 참조 발현 수준보다 적어도 약 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 80%, 또는 심지어 적어도 약 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000% 더 높도록, 또는 적어도 약 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 낮도록, 또는 검출 불가능한 수준으로 감소되도록 선택된다.

SSII 수준 또는 활성의 요구되는 감소를 식별하는 다른 방법은 변성된 식물 또는 이로부터의 곡물 내에 다양한 형태의 프룩탄 증가 또는 증가된 수준을 정량함에 의해서이다.

본원에 사용되는 용어 "변성, "변화", "증가하는", "증가된", "감소하는", "감소된", "억제된", "돌연변이" 등은 야생형 또는 변화되지 않은 또는 대조 상태와 비교하여 상대적인 용어로 간주된다. 일부 구현예에서, 야생형 식물은 적절한 "대조 식물"이나, 많은 상황에서, 대조 식물은 당업자에 의하여 결정되어야 한다.

"단백질 수준"은 예를 들어 웨스턴 블롯 분석 또는 기타 면역학적 수단과 같은 당업계에 공지된 수단에 의하여 측정될 수 있는 특정 단백질, 예를 들어, SSII의 양을 의미한다.

"효소 활성 수준"은 효소 분석에서 측정되는 특정 효소의 양을 의미한다.

"SSIIa 단백질 활성"은 효소 분석에서 측정되는 특정 효소의 양을 의미한다.

효소 활성 수준은 다소 활성인 단백질이 도입되면 돌연변이 내에서 변화될 수 있으나, 단백질 자체의 발현 수준은 (양)은 그러하지 않은 것으로 이해될 것이다. 반대로, 단백질 양은 변화될 수 있으나, 그 활성 (단위 단백질 당)은 동일하게 유지된다. 양 및 활성 모두의 감소가 예를 들어 상기 효소를 인코딩하는 유전자 발현이 전사적으로 또는 전사-후 감소될 때와 같이 가능하다. 특정 구현예에서, SSII 단백질 수준 또는 활성 감소는 변성되지 않은 보리 곡물 내 단백질 수준 또는 활성과 비교하여 적어도 40% 또는 적어도 60%, 또는 적어도 75%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이다. 단백질 수준 또는 효소 활성 또는 유전자 발현 감소는 잎, 종자 또는 곡물 성장 중 임의의 단계에, 특히 광합성이 일어나는 낮시간 동안, 또는 성장하는 배유 내에서 전분이 합성되는 곡물 충전 단계 중에, 또는 곡물이 성숙한 상태까지 성장하는 모든 단계에서 일어날 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "야생형"은 유전학 분야의 통상적인 의미를 가지며, 본원에 교시되는 바와 같이 변형되지 않은 보리, 품종 또는 유전자형을 포함한다. 일부 바람직한 "야생형" 보리 품종들이 예를 들어 품종 Himalaya와 같이 본원에 기재된다.

변성된 표현형은 SSIIa 유전자 발현의 부분적 또는 완전한 억제에 의하여 달성될 수 있다. SDS-PAGE 및 면역블로팅과 같은 당업계에 잘 알려진 기법을 가수분해 및 비가수분해된 곡물 및 그 분획 상에서 수행하여, 전분 합성 효소에 변성이 일어난 식물 또는 곡물을 확인한다. 이러한 방법은 본원에 기재되는 방법 또는 나아가 마이크로어레이 분석, 전기영동, 크로마토그래피 (종이 크로마토그래피, 박막크로마토그래피, 기체 크로마토그래피, 기액 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피) 기법과 같은 방법에 의한 식물 분석을 포함한다. 분리된 성분들은 전형적으로 알려진 정체의 표준을 이용하여 분리 프로필의 비교에 의하여, 또는 질량 분석법 및 핵자기 공명 분광법과 같은 분석학적 기법에 의하여 확인된다. 예를 들어, Example 9, Robinson, The Organic Constituents of Higher Plants, Cordus Press, North Amherst, USA, 1980; Adams et al ., Anal . Biochem ., 266: 77-84, 1999; Veronese et al ., Enz . Microbial Tech ., 24: 263-269, 1999; Hendrix et al., J. Insect Physiol ., 47: 423-432, 2001; Thompson et al ., Carbohydrate Res., 331: 149-161, 2001; 및 상기 문헌 내에 인용된 참조 문헌들을 참조할 수 있다. 탄수화물을 당업자에게 공지된 표준 프로토콜을 이용하여 분석할 수 있다.

SSIIa 수준 또는 활성 변화는 보리 식물 내로 하나 이상의 유전적 변이를 도입함으로써 달성될 수 있다. 즉, 상기 유전적 변이는 직접적으로 또는 간접적으로 성장 또는 발달 중에 식물 부분 내에 효소 활성 또는 수준 변성을 초래하며, 결과적으로 본원에 기재되는 효소, 전분 및 프룩탄 변성을 초래한다. 상기 유전적 변이는 예를 들어 형질전환 또는 돌연변이 유발에 의하여 식물 또는 전구 세포 내로 도입되는 이종 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 유전적 변이는 식물 사육 분야에 공지된 교배에 의하여 연이어 상이한 유전적 배경 내로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, SSIIa의 수준 또는 기능적 활성이 상응하는 대조 식물에 비하여 약 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 15% 미만, 및 적합하게 약 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 수준으로 하향 조절되어, 바람직하게 곡물의 전분 함량 내 아밀로오스 비율에 있어서 증가된 수준의 전분 또는 비전분 성분을 달성한다. 바람직한 구현예에서, 증가된 수준은 대조군의 적어도 2 배이다. 바람직하게, 이러한 구현예에서, 이러한 감소는 일반적으로 동일 환경 조건 하에 성장하는 상응하는 대조 식물에 대하여 적어도 약 50% 또는 55% 및 특히 적어도 약 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상의 프룩탄 수준 증가인 프룩탄 수준과 같은 비전분 폴리사카라이드의 실질적인 향상을 가져온다. 감소된 SSIIa 수준 또는 요구 활성의 양은 식물 종 또는 계통 환경 요인과 같은 기타 요인에 의존한다. 그러나, 이와 같은 경우에 요구될 수 있는 최적화는 본원에 기재되는 것을 포함하는 통상적인 방법을 이용하여 달성 가능한 것으로 생각된다.

감소된 SSIIa 수준은 예를 들어 SSIIa를 하향 조절하는 이종 폴리뉴클레오티드 발현을 구동시키는 구성 프로모터를 이용하여 식물 전체를 통하여 조직 내에서 달성될 수 있다. 바람직하게, 이는 씽크 (sink) 조직 내에서, 더 바람직하게 성장 배유 내에서, 조직 특이적 또는 생육단계 조절 프로모터를 이용하여 달성될 수 있다. 본원에 사용되는 "씽크 세포" 및 "씽크 조직"은 이산화탄소 고정 이외의 형태로, 즉, 슈가 또는 기타 탄수화물로서 세포 내로 들어온 유기 탄소의 순 유입을 포함하는 세포, 조직 또는 기관을 의미한다. 식물 내에서, 씽크 조직은 모든 비-광합성 조직, 및 다른 광합성 세포에 의하여 고정되거나 또는 이산화탄소 직접 고정 이외의 수단에 의하여 주변 매질 또는 환경으로부터 얻어지는 유기 탄소의 순 유입을 가지는 광합성 조직을 포함한다.

유전자

일부 구현예에서, 본 발명은 유전자 활성 변성 및 키메릭 유전자 구성 및 이용을 수반한다. 본원에 사용되는 용어 "유전자"는 세포 내에서 전사되나 번역되지 않은 단백질 코딩 영역, 및 관련 비코딩 및 조절 영역을 포함하는 임의의 디옥시리보뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 관련 영역은 전형적으로 5' 및 3' 말단 모두에 양면 상에 약 2 kb 거리로 상기 코딩 영역 또는 전사 영역에 인접하여 위치한다. 이와 관련하여, 상기 유전자는 소정의 유전자와 자연적으로 관련되는 프로모터, 인핸서, 종결 및/또는 폴리아데닐레이션 시그널과 같은 조절 신호, 또는 이종 조절 신호 (이 경우, 유전자는 "키메릭 유전자"로 언급됨)을 포함할 수 있다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열을 5' 비-번역 서열로 언급한다. 3' 또는 코딩 영역의 다운스트림에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열을 3' 비-번역 서열로 언급한다. 용어 "유전자"는 cDNA 및 게놈 형태 유전자 모두를 포함한다.

본원에 사용되는 "전분 합성효소 II 유전자", "SSII" 등은 보리 내에서 전분 합성효소 II (SSII) 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 이는 당업자에 의하여 다른 전분 합성효소 또는 다른 단백질로부터 쉽게 구별될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 보리 SSII 유전자는 서열 번호 1에 나타내는 cDNA 서열과 적어도 80% 동일성을 가지는 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함하는, 보리 내에 존재하거나 이로부터 분리되거나 유도될 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 구현예에서, 상기 SSII 유전자는 SSIIa 유전자이거나, 상기 SSII 단백질은 SSIIa 단백질이며, 이들 각각이 본원에 개시되는 본 발명의 임의의 또는 모든 측면에 적용될 수 있다. M292로부터 SSIIa 유전자의 cDNA의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 9에 기재되어 있다.

전사 영역을 함유하는 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"로 불리우는 비-코딩 서열이 개재될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "인트론"은 일차 RNA 전사체의 부분으로서 전사되나 성숙한 mRNA 분자 내에는 존재하지 않는 유전자 단편이다. 인트론은 핵 또는 1차 전사체로부터 제거 또는 "스플라이싱"되며, 따라서 메신저 RNA (mRNA) 내에 존재하지 않는다. 인트론은 인핸서와 같은 조절 요소를 함유할 수 있다. 본원에 사용되는 "엑손"은 RNA 분자가 번역되지 않는 성숙한 mRNA 또는 성숙한 RNA 분자 내에 존재하는 RNA 서열에 상응하는 DNA 영역을 의미한다. mRNA는 번역 중 초기 폴리펩타이드 내 아미노산 서열 또는 순서를 명시하는 기능을 한다. 용어 "유전자"는 본원에 기재되는 본 발명의 단백질의 일부 또는 모두를 인코딩하는 합성 또는 융합 분자 및 상기한 것들 중 임의의 것에 대한 상보적 핵산 서열을 포함한다. 유전자는 세포 내 염색체외 유지를 위하여 또는 숙주 게놈 내로의 통합을 위하여 적합한 벡터 내로 도입될 수 있다.

본원에 사용되는 "키메릭 유전자"는 그 고유 위치에서 고유 유전자가 아닌 임의의 유전자를 의미한다. 전형적으로, 키메릭 유전자는 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 전사된 또는 단백질 코딩 서열을 포함한다. 따라서, 키메릭 유전자는 상이한 급원으로부터 유도되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일 급원으로부터 유도되는 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있으나, 자연에서 발견되는 것과 다른 방식으로 정렬된다. 본원에서 용어 "내인성"은 조사 중인 식물과 동일 발달 단계에서 비변형 식물 내에 정상적으로 존재하거나 생산되는 물질을 의미하기 위하여 사용된다. "내인성 유전자"는 생물의 게놈 내에 그 자연적 위치 내에 고유 유전자를 의미한다. 본원에 사용되는 "재조합 핵산 분자"는 재조합 DNA 기술에 의하여 구성되거나 변성되는 핵산 분자를 의미한다. 용어 "외부 폴리뉴클레오티드" 또는 "외인성 폴리뉴클레오티드" 또는 "이종 폴리뉴클레오티드" 등은 실험 조작에 의하여 세포 게놈 내로 도입되는 핵산을 의미한다. 이들은 도입되는 유전자가 자연 발생 유전자와 비교하여 일부 변성 (예를 들어, 돌연변이, 선별가능한 마커 유전자의 존재 등)을 함유하는 한, 그 세포 내에서 발견되는 유전자 서열을 포함한다. 외부 또는 외인성 유전자는 비-천연 생물 내로 삽입되는 유전자, 천연 숙주 내에 새로운 위치 내로 도입되는 천연 유전자, 또는 키메릭 유전자일 수 있다. "이식유전자 (transgene)"는 형질 전환 절차에 의하여 게놈 내로 도입된 유전자를 의미한다. 용어 "유전적으로 변성된"은 형질전환 또는 형질도입에 의하여 세포 내로 유전자 도입, 세포 내 유전자 돌연변이, 및 그 작용이 이루어지는 세포 또는 생물 내 또는 그 자손 내에서 유전자 조절 변성 또는 조정을 포함한다.

폴리뉴클레오티드

상세한 설명, 표 및 서열 목록을 포함하여 본 발명은 다양한 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 본원에 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 조합일 수 있는 뉴클레오티드의 폴리머를 의미하며, mRNA, cRNA, cDNA, tRNA, siRNA, shRNA 및 hpRNA를 포함한다. 이는 예를 들어 자동화 합성기 상에서 생산되는 세포, 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 탄수화물, 지질, 단백질 또는 기타 물질과 조합되거나, 형광물질 또는 다른 기로 표지되거나, 또는 고체 지지체에 부착되어 본원에 기재되는 특정 작용을 수행하거나, 또는 당업자에게 잘 알려진 자연에서 발견되지 않는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 폴리머는 단일 가닥, 실질적으로 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥일 수 있다. 부분적 이중 가닥 RNA 분자의 예는 핵산 서열과 그 상보 서열 사이의 염기 페어링에 의하여 형성되는 이중 가닥 줄기 및 상기 핵산 서열 및 그 상보 서열을 공유 결합시키는 루프 서열을 포함하는, 헤어핀 RA (hpRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 자기-상보적 RNA이다. 본원에서 염기 페어링은 G:U 염기쌍을 포함하는 뉴클레오티드 사이의 표준 염기 페어링을 의미한다. "상보적"은 두 개의 폴리뉴클레오티드가 그들의 길이의 부분을 따라 또는 하나 또는 둘의 전장을 따라 염기 페어링 (혼성화)할 수 있음을 의미한다. "혼성화된 폴리뉴클레오티드"는 그 폴리뉴클레오티드가 실제로 그 상보 서열에 염기 페어링됨을 의미한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 용어 "핵산"과 상호 교환가능하게 사용된다.

"분리된"은 그 자연 상태에서 정상적으로 수반하는 성분이 실질적으로 또는 필수적으로 없는 물질을 의미한다. 본원에 사용되는 "분리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "분리된 핵산 분자"는 그 자연 상태에서 관련되거나 결합되는 동일 유형의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 적어도 부분적으로 분리되는, 바람직하게 실질적으로 또는 필수적으로 이러한 것이 없는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, "분리된 폴리뉴클레오티드"는 자연적으로 발생하는 상태에서 이를 플랭킹하는 서열로부터 정제 또는 분리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 그 단편에 정상적으로 인접하는 서열로부터 제거된 DNA 단편을 포함한다. 바람직하게, 분리된 폴리뉴클레오티드는 또한 단백질, 탄수화물, 지질 등과 같은 다른 성분들이 적어도 90% 없다. 본원에 사용되는 용어 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 핵산을 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 형태로 조작함에 의하여 시험관 내 형성되는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 형태일 수 있다. 일반적으로, 이러한 발현 벡터는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 및 번역 조절 핵산을 포함한다.

본 발명은 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용되는 "올리고뉴클레오티드"는 50 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 이들은 RNA, DNA 또는 이의 조합 또는 유도체일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 10 내지 30 뉴클레오티드, 통상적으로 15-25 뉴클레오티드 길이의 비교적 짧은 단일 가닥 분자이다. 증폭 반응에서 프로브 또는 프라이머로 사용될 때, 이러한 올리고뉴클레오티드의 최소 크기는 표적 핵산 분자 상에서 올리고뉴클레오티드와 상보 서열 사이의 안정한 하이브리드 형성에 요구되는 크기이다. 바람직하게, 올리고뉴클레오티드는 적어도 15 뉴클레오티드, 더 바람직하게 적어도 18 뉴클레오티드, 더 바람직하게 적어도 19 뉴클레오티드, 더 바람직하게 적어도 20 뉴클레오티드, 훨씬 더 바람직하게 적어도 25 뉴클레오티드 길이이다.

프로브로서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 방사성 동위원소, 합텐, 효소, 비오틴, 형광 분자 또는 화학 발광 분자와 같은 검출가능한 표지와 컨쥬게이트된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 SSII의 대립 유전자 또는 관련 특성, 예를 들어 변성 전분 또는 프룩탄 수준과 관련되는 다른 유전자 검출 방법에 유용하다. 이러한 방법은 예를 들어 핵산 혼성화를 이용하며, 많은 경우에 있어서 적합한 폴리머라아제 (PCR에 사용되는 것과 같은)에 의한 올리고뉴클레오티드 프라이머 연장을 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 변이체는 본원에 정의되는 특정 올리고뉴클레오티드 분자의 변화하는 크기의, 및/또는 예를 들어 그에 근접하는 시리얼 게놈으로 혼성화할 수 있는 분자를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 그들이 여전히 표적 영역에 혼성화하는 한, 부가적인 뉴클레오티드 (1, 2, 3, 4 또는 그 이상과 같은), 또는 더 작은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 몇몇 개의 뉴클레오티드를 그 올리고뉴클레오티드가 표적 영역에 혼성화하는 능력에 부정적인 영향을 미치지 않고 치환할 수 있다. 또한, 예를 들어 50 뉴클레오티드 이내로, 본원에 정의되는 특정 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 식물 게놈 영역에 인접하여 혼성화하는 변이체를 용이하게 고안할 수 있다. 프로브, 올리고뉴클레오티드 등은 본원에 기재되는 서열 또는 그 정정된 버젼 또는 변이체 또는 다른 곡류 식물로부터의 기능적 동족체에 근거한다.

용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체" 등은 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 보이는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 형태를 의미한다. 이러한 용어는 또한 적어도 하나의 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 치환에 의하여 참조 폴리뉴클레오티드로부터 구별되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체"는 하나 이상의 뉴클레오티드가 첨가 또는 결실되거나, 상이한 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 부가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변성이 참조 폴리뉴클레오티드에 대하여 이루어질 수 있으며 이에 따라 변성된 폴리뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 또는 작용을 유지하는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 이러한 용어는 효소적 또는 기타 조절 작용을 나타내는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 선택적 프로브 또는 기타 혼성화제로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특히, 이는 동일 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열을 인코딩하나 유전적 코드의 중복에 의하여 뉴클레오티드 서열이 다른 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체"는 또한 자연 발생 대립 유전자 변이체를 포함한다.

"상응하다" 또는 "상응하는"은 (a) 참조 폴리뉴클레오티드 서열 모두 또는 대부분에 실질적으로 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지거나, (b) 펩타이드 또는 단백질 내 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 문구는 또한 참조 펩타이드 또는 단백질 내 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 그 범위 내에 포함한다. 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 상관 관계를 기재하는데에 사용되는 용도는 "참조 서열(reference sequence)", 비교 창(comparison window)", 서열 동일성(sequence identity)", 서열 동일성 백분율", "실질적 동일성" 및 "동일한"을 포함하며, 최소 수의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 대하여 또는 전장에 걸쳐 정의된다. 용어 "서열 동일성" 및 "동일성"은 본원에서 서열이 뉴클레오티드-뉴클레오티드 기준으로 또는 아미노산-아미노산 기준으로 비교 창에 걸쳐 동일한 정도를 의미하기 위하여 상호 교환 가능하게 사용된다. 따라서, "서열 동일성 백분율"은 비교 창에 걸쳐 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예를 들어, A, T, C, G, U) 또는 동일한 아미노산 잔기 (예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys and Met)가 두 서열 모두에서 일어나는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 창 내 총 위치 수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과 얻어진 값에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다.

폴리뉴클레오티드의 % 동일성은 GAP (Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . 48: 443-453, 1970) 분석 (GCG 프로그램)에 의하여 결정될 수 있다 (gap creation penalty=5, gap extension penalty=0.3). 달리 기재하지 않으면, 질의(query) 서열은 적어도 45 뉴클레오티드 길이이며, GAP 분석은 구 개의 서열을 적어도 45 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 정렬한다. 바람직하게, 상기 질의 서열은 적어도 150 뉴클레오티드 길이이며, GAP 분석은 두 개의 서열을 적어도 150 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 정렬한다. 더 바람직하게, 상기 질의 서열은 적어도 300 뉴클레오티드 길이이며, GAP 분석은 두 개의 서열을 적어도 300 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 정렬하거나, 또는 각각의 경우 적어도 400, 적어도 500 또는 적어도 600 뉴클레오티드이다. 또한, Altschul et al ., Nucleic Acids Res . 25: 3389, 1997에 개시된 것과 같은 BLAST 패밀리의 프로그램을 참조할 수 있다. 서열 분석에 대한 상세한 논의는 Altschul et al ., Nucleic Acids Res . 25: 3389, 1997에서 찾을 수 있다.

뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 이러한 서열들이 적어도 80%, 구체적으로 적어도 85%, 더 구체적으로 적어도 90%, 특히 적어도 95% 서열 동일성을 가지거나, 더 특히 동일할 때 "실질적으로 유사한" 것으로 표시된다. RNA 서열이 DNA 서열과 실질적으로 유사하거나, 이에 상응하거나, 또는 이와 특정 정도의 서열 동일성을 가지는 것으로 기재될 때, cDNA 서열 내 티민 (T)이 RNA 서열 내 우라실 (U)과 동등한 것으로 간주됨이 분명하다.

상기 정의된 폴리뉴클레오티드와 관련하여, 위에 제공된 것보다 높은 % 동일성 수치는 바람직한 구현에를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 적용가능하다면, 최소의 % 동일성 수치의 견지에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 또는 3 내지 6과 같은 관련된 지정된 서열 번호와 적어도 80%, 더 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 91%, 더 바람직하게 적어도 92%, 더 바람직하게 적어도 93%, 더 바람직하게 적어도 94%, 더 바람직하게 적어도 95%, 더 바람직하게 적어도 96%, 더 바람직하게 적어도 97%, 더 바람직하게 적어도 98%, 더 바람직하게 적어도 99%, 더 바람직하게 적어도 99.1%, 더 바람직하게 적어도 99.2%, 더 바람직하게 적어도 99.5%, 더 바람직하게 적어도 99.6%, 더 바람직하게 적어도 99.4%, 더 바람직하게 적어도 99.5%, 더 바람직하게 적어도 99.6%, 더 바람직하게 적어도 99.7%, 더 바람직하게 적어도 99.8%, 및 훨씬 더 바람직하게 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

바람직하게, SSII 활성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 800 이상, 바람직하게 900 이상, 더 바람직하게 1,000 또는 2000 이상의 뉴클레오티드 길이이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 자연 발생 분자와 비교하여, 뉴클레오티드 잔기의 결실, 삽입 또는 치환인 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 돌연변이주는 자연 발생 (즉, 천연 급원으로부터 분리된) 또는 합성 (예를 들어, 핵산 상에서 부위 지정 돌연변이 유발을 수행함으로써)일 수 있다.

본 발명은 두 폴리뉴클레오티드의 상보성 정도를 정의하기 위한 혼성화 조건의 엄격함에 관한 것이다. 본원에 사용되는 "엄격함(stringency)"은 혼성화 및 세척 중 온도 및 이온 강도 조건, 및 특정 유기 용매의 존재 또는 부재를 의미한다. 엄격함이 더 높을수록, 표적 핵산 서열과 표지된 폴리뉴클레오티드 서열 (프롭) 간의 상보성 정도가 더 높을 것이다. "엄격한 조건"은 높은 빈도의 상보적 염기를 가지는 뉴클레오티드 서열만이 혼성화하는 온도 및 이온 조건을 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "낮은 엄격함, 매질 엄격함, 높은 엄격함, 또는 매우 높은 엄격한 조건"은 혼성화 및 세척을 위한 조건에 대한 기재이다. 혼성화 반응 수행을 위한 가이드는 Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 6.3.1-6.3.6., 1989에서 찾을 수 있다. 수성 및 비수성 방법이 상기 문헌에 기재되어 있으며, 모두 사용 가능하다. 본원에 기재되는 특정 혼성화 조건은 다음과 같다: 1) 45℃에서 6 X 염화나트륨/시트르산 나트륨 (SSC) 내에 혼성화 및 이후의 50-55℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS 내에 세척을 위하여 낮은 엄격 혼성화 조건; 2) 약 45℃에서 6 X SSC 내 혼성화 및 이후의 60℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS 내 1회 이상의 세척을 위하여 중간 엄격 혼성화 조건; 3) 45℃에서 6X SSC 내 혼성화 및 이후의 65℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS 내 1회 이상의 세척을 위하여 높은 엄격 혼성화 조건; 4) 65℃에서 0.5 M 인산나트륨 완충액, 7% SDS 내 혼성화 및 이후의 65℃에서 0.2 X SSC, 1% SDS에서 1회 이상의 세척을 위하여 매우 높은 엄격 혼성화 조건이다.

폴리펩타이드

용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 일반적으로 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 또한 본원에 기재되는 본 발명의 폴리펩타이드의 변이체, 돌연변이체, 변형, 유사체 및/또는 유도체를 포함한다. 본원에 사용되는 "실질적으로 정제된 폴리펩타이드"는 그 자연 상태에서 결합되는 지질, 핵산, 기타 펩타이드 및 기타 분자로부터 분리된 폴리펩타이드를 의미한다. 바람직하게, 상기 실질적으로 정제된 폴리펩타이드는 그것이 자연적으로 결합되는 기타 성분들이 적어도 90% 없다. "재조합 폴리펩타이드"는 재조합 기법을 이용하여, 즉, 세포, 바람직하게 식물 세포 및 더 바람직하게 곡류 식물 세포 내 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현을 통하여 제조되는 폴리펩타이드를 의미한다.

SSII 활성을 가지는 예시적 폴리펩타이드가 서열 목록에 정리되며 표 8에 기재된다. 따라서, 본 발명은 제한 없이 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열을 가지는 SSII 폴리펩타이드의 변형 및 자연 발생 변이체, 이의 정정 버젼 및 약 80% 서열 동일성을 가지는 변이체와 같은 본원에 기재되는 바와 같은 변이체를 제안한다.

정의된 폴리펩타이드와 관련하여, 위에 제공되는 것보다 높은 % 동일성 수치는 바람직한 구현예를 포함하는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 적용가능하다면, 최소 % 동일성 수치의 견지에서, 폴리펩타이드가 관련된 지정 서열 번호 2에 적어도 75%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 91%, 더 바람직하게 적어도 92%, 더 바람직하게 적어도 93%, 더 바람직하게 적어도 94%, 더 바람직하게 적어도 95%, 더 바람직하게 적어도 96%, 더 바람직하게 적어도 97%, 더 바람직하게 적어도 98%, 더 바람직하게 적어도 99%, 더 바람직하게 적어도 99.1%, 더 바람직하게 적어도 99.2%, 더 바람직하게 적어도 99.3%, 더 바람직하게 적어도 99.4%, 더 바람직하게 적어도 99.5%, 더 바람직하게 적어도 99.6%, 더 바람직하게 적어도 99.7%, 더 바람직하게 적어도 99.8%, 더 바람직하게 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

다른 폴리펩타이드에 대한 폴리펩타이드의 % 동일성은 GAP (Needleman and Wunsch, 1970 (supra)) 분석 (GCG 프로그램)에 의하여 갭 생성 페널티=5, 및 갭 연장 페널티=0.3을 이용하여 결정될 수 있다. 질의 서열은 적어도 15 아미노산 길이이고, GAP 분석은 적어도 15 아미노산의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더 바람직하게, 질의 서열은 적어도 50 아미노산 길이이고, GAP 분석은 적어도 50 아미노산의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더 바람직하게, 질의 서열은 적어도 100 아미노산 길이이고, GAP 분석은 적어도 100 아미노산의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 훨씬 더 바람직하게, 질의 서열은 적어도 250 아미노산 길이이고, GAP 분석은 적어도 250 아미노산의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다.

본원에 사용되는 폴리펩타이드의 "생물학적 활성" 단편은 전장 폴리펩타이드의 정의된 활성을 유지하는 전장보다 작은 본 발명의 폴리펩타이드의 일부이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 단편은 전분을 합성하여 적어도 15의 DP를 가지는 아밀로오스 사슬을 생산할 수 있다. 생물학적 활성 단편은 그들이 정의된 활성을 유지하는 한 임의의 크기일 수 있으나, 바람직하게 적어도 200 또는 적어도 250 아미노산 잔기 길이이다.

본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 돌연변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 본 발명의 핵산 내로 도입함으로써, 또는 원하는 폴리펩타이드의 시험관내 합성에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 돌연변이체는 예를 들어 아미노산 서열 내에 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 최종 펩타이드 생성물이 원하는 특성을 가진다면, 결실, 삽입 및 치환의 조합을 행하여 최종 구조체에 도달할 수 있다.

돌연변이 (변형된) 펩타이드는 당업계에 공지된 임의의 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 시험관내 돌연변이 유발을 가할 수 있다. 이러한 시험관내 돌연변이 유발 기법은 상기 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내로 서브 클로닝하고, E. coli XL-1 레드 (Stratagene) 와 같은 "돌연변이 유발(mutator)" 균주 내로 상기 벡터를 형질전환하고, 상기 형질전환된 박테리아를 적합한 수의 발생을 위하여 번식시키는 것을 포함한다. 다른 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 Harayama, Trends Biotechnol . 16: 76-82, 1998에 대략적으로 기재되는 바와 같은 DNA 셔플링 기술을 가한다. 이러한 DNA 셔플링 기술은 밀 또는 보리 이외의 식물 종으로부터의 SSII 유전자와 같은, 본 발명의 것과 관련된 유전자를 포함할 수 있으며, 및/또는 밀 또는 보리 전분 합성효소 I 또는 III 유전자와 같은, 유사한 단백질을 인코딩하는 동일 식물로부터의 상이한 유전자를 포함할 수 있다. 돌연변이된/변형된 DNA로부터 유도되는 생성물을 본원에 기재되는 기술을 이용하여 용이하게 스크리닝하여 이들이 예를 들어 전분 합성효소 활성을 가지는지를 결정할 수 있다.

아미노산 서열 돌연변이체의 디자인에 있어서, 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이의 특성은 변형될 특성(들)에 의존한다. 돌연변위 부위는 예를 들어 (1) 먼저 보존 아미노산 선택으로 다음 달성되는 결과에 따라 더 근본적인 선택으로 치환, (2) 표적 잔기를 결실, 또는 (3) 위치하는 부위에 인접하여 다른 잔기를 삽입함으로써 개별적으로 또는 연속적으로 변형될 수 있다.

아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1 내지 15 잔기, 더 바람직하게 약 1 내지 10 잔기, 및 전형적으로 약 1 내지 5 인접 잔기의 범위이다.

치환 돌연변이체는 폴리펩타이드 분자 내에 제거된 적어도 하나의 아미노산 잔기 및 그 위치에 삽입된 상이한 잔기를 가진다. 치환 돌연변이 유발에 대한 최대 관심 부위는 활성 부위(들)로 확인되는 부위들을 포함한다. 기타 관심 부위들은 다양한 균주 또는 종으로부터 얻어지는 특정 잔기가 동일한 부위들이다. 이러한 포지션들은 생물학적 활성에 있어서 중요할 것이다. 이러한 부위들, 특히 적어도 세 개의 기타 동일하게 보존되는 부위들의 서열 내에 속하는 것들은 바람직하게 상대적으로 보존적 방식으로 치환된다. 이러한 보존적 치환은 "예시적 치환"의 제목 아래 표 10에 보인다.

본 발명의 폴리펩타이드는 천연 폴리펩타이드의 생산 및 회수, 재조합 폴리펩타이드의 생산 및 회수, 및 폴리펩타이드의 화학적 합성을 포함하는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 분리된 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드를 생산하기에 효과적인 조건하에 상기 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 세포를 배양하고 상기 폴리펩타이드를 회수함으로써 제조될 수 있다. 바람직한 배양 세포는 본 발명의 재조합 세포이다. 효과적인 배양 조건은 이에 제한되지 않으나, 폴리펩타이드 생산을 허용하는 효과적인 매질, 생물 반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함한다. 효과적인 매질은 세포가 배양되어 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 임의의 매질을 의미한다. 이러한 매질은 전형적으로 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 인산염 급원, 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 비타민과 같은 기타 영양소를 가지는 수성 매질을 포함한다. 본 발명의 세포는 전형적인 발효 생물 반응기, 진탕 플라스크, 시험관, 마이크로티터 디쉬, 및 페트리 플레이트 내에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 이러한 배양 조건은 당업자의 전문 지식 이내이다.

본 발명은 작동가능하게 연결 또는 결합되는 요소들에 관한 것이다. "작동가능하게 연결되는" 또는 "작동가능하게 결합되는" 등은 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 요소들의 결합을 의미한다. 전형적으로, 작동가능하게 연결되는 핵산 서열들은 인접하여 결합되고, 두 단백질 코딩 영역을 결합시키는 것이 필요한 경우, 인접하고 리딩 프레임 내이다. RNA 폴리머라아제가 두 코딩 서열을 단일 RNA 내로 전사하고, 이것이 번역된다면, 두 코딩 서열로부터 유도되는 아미노산을 가지는 단일 폴리펩타이드로 번역되는 경우, 코딩 서열은 다른 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된다". 상기 코딩 서열들은 발현되는 서열들이 궁극적으로 원하는 단백질을 생산하도록 프로세싱되는 한, 서로 인접할 필요는 없다.

본원에 사용되는 용어 "cis-작용 서열", "cis-작용 요소" 또는 "cis-조절 영역" 또는 "조절 영역" 또는 유사한 용어는, 발현가능한 유전자 서열에 대하여 적절하게 포지셔닝되고 연결될 때 적어도 부분적으로 유전자 서열의 발현을 조절할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 간주될 것이다. 당업자는 cis-조절 영역이 유전자 서열의 발현 수준 및/또는 세포 타입 특이성 및/또는 발달 특이성을 전사 또는 후-전사 수준에서 활성화, 사일런싱, 증진, 억압 또는 변경시킬 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 cis-작용 서열은 발현가능한 유전자 서열의 발현을 증진 또는 자극하는 액티베이터 서열이다.

전사가능한 폴리뉴클레오티드에 프로모터 또는 인핸서 요소를 "작동가능하게 연결함"은 상기 전사가능한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 단백질-인코딩 폴리뉴클레오티드 또는 기타 전사체)를 그 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는 프로모터 조절 하에 배치하는 것을 의미한다. 이종 프로모터/구조 유전자 조합의 구성에 있어서, 일반적으로 프로모터 또는 그 변이체를 상기 전사가능한 폴리뉴클레오티드의 전사 시작 부위로부터 떨어진 곳에 배치하는 것이 바람직하며, 이는 그 프로모터와 그것이 그 자연적 설정에서 조절하는 단백질 코딩 영역: 즉, 상기 프로모터가 유도되는 유전자 사이의 거리와 대략적으로 동일하다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이러한 거리의 일부 변형이 기능 손실 없이 수용될 수 있다. 유사하게, 그 조절하에 배치될 전사가능한 폴리뉴클레오티드에 대한 조절 서열 요소 (예를 들어, 작동자(operator), 인핸서 등)의 바람직한 배치는 그 자연적 설정에서 요소: 즉, 그것이 유도되는 유전자 배치에 의하여 정의된다.

본원에 사용되는 "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 해당 세포 내 전사 수준 및 개시를 조절하는, 일반적으로 RNA 인코딩 영역의 업스트림 (5')의 유전자 영역을 의미한다. "프로모터"는 TATA 박스 및 CCAAT 박스 서열을 포함하는 전통적인 게놈 유전자의 전사 조절 서열, 및 발달 및/또는 환경 자극에 반응하여 또는 조직-특이적 또는 세포 유형-특이적 방식으로 유전자 발현을 변경시키는 부가적 조절 요소 (즉, 업스트림 활성화 서열, 인핸서 및 사일렌서)를 포함한다. 프로모터는 대개 그 발현을 조절하는 구조 유전아 업스트림에 배치되나 반드시 그러할 필요는 없다 (예를 들어, 일부 Po1III 프로모터). 또한, 프로모터를 포함하는 조절 요소는 대개 유전자 전사 시작 부위의 2 kb 이내에 배치된다. 프로모터는 세포 내 발현을 추가로 증진시키기 위하여 및/또는 그것이 작동가능하게 연결되는 구조 유전자 발현 시기 또는 유발 가능성을 변경시키기 위하여, 상기 시작 부위에 더 먼 쪽에 위치하는 부가적인 특이적 조절 요소를 함유할 수 있다.

"구성적 프로모터"는 식물의 많은 또는 모든 조직 내에서 작동가능하게 결합되는 전사된 서열의 발현을 총괄하는 프로모터를 의미한다. 본원에 사용되는 용어 구성적은 유전자가 모든 세포 유형 내에서 동일한 수준으로 발현되는 것을 반드시 나타낼 필요는 없으나, 일부 수준 변화가 종종 관찰되기는 하나 유전자가 광범위한 세포 유형 내에서 발현됨을 나타낸다. 본원에 사용되는 "선택적 발현"은 예를 들어 배유, 배아, 잎, 열매, 덩이줄기, 또는 뿌리와 같은 식물의 특정 기관 내 거의 독점적 발현을 의미한다. 일 구현예에서, 프로모터는 식물의 모든 지상부에 해당하는 모든 광합성 조직 내에서 발현된다; 예를 들어, 루비스토(rubisco) 작은 서브유닛 프로모터와 같은 광합성을 위하여 요구되는 유전자 발현에 수반되는 프로모터. 상기 용어는 또한 초기 또는 말기 배형성 또는 상이한 성숙 단계에서와 같은, 기관 내 특정 발달 단계에서 발현; 또는 특정 환경 조건 또는 처리에 의하여 유발될 수 있는 발현을 의미할 수 있다. 선택적 발현은 따라서, 식물이 경험하는 대부분의 또는 모든 조건 하에 식물의 많은 또는 모든 조직 내 발현을 의미하는 구성적 발현과 대조될 수 있다.

선택적 발현은 또한 특정 식물 조직, 기관 또는 발달 단계에서 유전자 발현 생성물의 구획을 초래할 수 있다. 내배유, 시토졸, 액포 또는 아포프라스트(apoplastic) 공간과 같은 특정 세포내 위치 내의 구획은 요구되는 세포 구획으로의 이송을 위한 적절한 신호를 유전자 생성물의 구조 내에 포함시킴으로써, 또는 반-독립적 세포기관 (색소체 및 미토콘드리아)의 경우 적절한 조절 서열을 가지는 이식 유전자를 세포기관 게놈 내로 직접 통합시킴으로써 달성될 수 있다.

"조직-특이적 프로모터" 또는 "기관-특이적 프로모터"는 식물 내 많은 다른 조직 또는 기관, 바람직하게 대부분의 다른 조직 또는 기관에 대하여 하나의 조직 또는 기관 내에서 우선적으로 발현되는 프로모터이다. 전형적으로, 상기 프로모터는 다른 조직 또는 기관 내에서보다 특정 조직 또는 기관 내에서 10배 더 높은 수준으로 발현된다. 예시적 조직 특이적 프로모터는 곡류 식물의 성장 배유 내에서 우선적으로 발현되는, 고분자량 (HMW) 글루테닌 유전자, Bx17에 대한 프로모터이다. 추가적인 배유 특이적 프로모터는 고분자량 글루테닌 프로모터, 밀 SSI 프로모터, 및 밀 BEII 프로모터를 포함한다. 다른 배유-특이적 프로모터는 전분 생합성 효소 또는 성장 곡물 내 저장 단백질을 인코딩하는 유전자로부터 용이하게 얻을 수 있다.

본 발명에서 고려되는 프로모터는 형질전환될 숙주 식물에 선천적이거나 또는 대안적 급원으로부터 유도될 수 있으며, 그 영역은 숙주 식물 내에서 기능적이다. 다른 급원은 노팔린(nopaline), 옥타핀(octapine), 만노핀(mannopine), 또는 기타 오파인(opine) 프로모터의 생합성을 위한 유전자의 프로모터; 옥수수 ubi-1 유전자로부터의 Ubi 프로모터, Christensen et al., (1996) (예를 들어, 미국 특허 제 4,962,028 호 참조)와 같은 유비퀴틴 프로모터 또는 액틴 프로모터와 같은 식물로부터의 프로모터; 조직 특이적 프로모터 (예를 들어, Conkling et al의 미국 특허 제 5,459,252; Advanced Technologies의 WO 91/13992); 바이러스로부터의 프로모터 (숙주 특이적 바이러스를 포함), 또는 부분적 또는 전체적 합성 프로모터와 같은, 아그로박테리움(Agrobacterium) T-DNA 유전자를 포함한다. 외- 또는 쌍떡잎 식물 내에서 기능적인 많은 프로모터가 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Greve, J. Mol . Appl . Genet ., 1: 499-511, 1983; Salomon et al ., EMBO J., 3: 141-146, 1984; Garfinkel et al., Cell , 27: 143-153, 1983; Barker et al., Plant Mol . Biol ., 2: 235-350, 1983 참조; 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터 (CaMV 35S, 19S)와 같은 식물 및 바이러스로부터 분리되는 다양한 프로모터를 포함). 많은 조직 특이적 프로모터 영역이 공지되어 있다. 특정 조직 내에서 또는 특정 성장 조건 하에 전사를 우선적으로 제공하는 기타 전사 개시 영역은 나핀(napin) 인코딩 유전자, 종자 ACP, 제인(zein), 또는 기타 종자 저장 단백질로부터의 것을 포함한다. 열매 특이적 프로모터 또한 공지되어 있으며, 이러한 하나의 프로모터는 Deikman et al ., EMBO J., 2: 3315-3320, 1998 및 DellaPenna et al., Plant Cell , 1: 53-63, 1989에 기재된 E8 프로모터이다. 프로모터 활성 평가를 위한 비-제한적 방법이 Medberry et al ., Plant Cell , 4: 185-192, 1992; Medberry et al ., Plant J. 3: 619-626, 1993, Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.). Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1989, 및 McPherson et al. (미국 특허 제 5,164,316)에 개시되어 있다.

대안적으로 또는 부가적으로, 상기 프로모터는 도입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 적절한 식물의 발달 단계에서 유도할 수 있는 유도성 프로모터 또는 생육단계 조절 프로모터일 수 있다. 사용될 수 있는 기타 cis-작용 서열은 전사 및/또는 번역 인핸서를 포함한다. 인핸서 영역은 당업자에게 잘 알려져 있으며, ATG 번역 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있다. 상기 개시 코돈은 외부 또는 외인성 폴리뉴클레오티드에 대한 코딩 서열의 리딩 프레임과 함께 작동하여 전체 서열의 번역을 보증하여야 한다. 상기 번경 조절 신호 및 개시 코돈은 다양한 기원, 모두 천연 및 합성일 수 있다. 번역 개시 영역은 전사 개시 영역의 급원으로부터 또는 외부 또는 외인성 폴리뉴클레오티드로부터 제공될 수 있다. 상기 서열은 또한 전사를 유도하도록 선택되는 프로모터 급원으로부터 유도될 수 있으며, mRNA의 번역을 증가시키도록 특이적으로 변형될 수 있다.

본 발명의 핵산 구조체는 전형적으로 전사 종결 서열을 포함할 수 있는 약 50 내지 1,000 뉴클레오티드 염기 쌍의 3' 비-번역 서열을 포함한다. 3' 비-번역 서열은 폴리아데닐레이션 신호 및 mRNA 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 기타 조절 신호를 포함하거나 하지 않을 수 있는 전사 종결 신호를 함유할 수 있다. 폴리아데닐레이션 신호는 폴리아데닐산 구역의 mRNA 전구체 3' 말단에의 첨가를 가져옴을 특징으로 한다. 폴리아데닐레이션 신호는 통상적으로 정규형 5' AATAAA-3'에 대한 상동의 존재에 의하여 인지되나, 변이가 흔하지 않은 것이 아니다. 폴리아데닐레이션 신호를 포함하지 않는 전사 종결 서열은 4 이상의 티미딘의 연속을 포함하는 Po1I 또는 Po1III RNA 폴리어라아제에 대한 종결자를 포함한다. 적합한 3' 비-번역 서열의 예는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 노팔린 합성효소 (nos) 유전자로부터의 폴리아데닐레이션 신호 (Bevan et al., Nucl . Acid Res., 11: 369, 1983) 및 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 합성효소 유전자로부터의 T7 전사체에 대한 종결자를 함유하는 3' 전사되고 비-번역된 영역이다. 대안적으로, 적합한 3' 비-번역 서열은 감자 또는 토마토로부터의 프로테아제 억제제 I 또는 II의 3' 말단, 대두 저장 단백질 유전자 및 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카복실라아제 (ssRUBISCO) 유전자의 작은 서브유닛와 같은 식물 유전자로부터 유도될 수 있으나, 기타 당업자에게 공지된 3' 요소 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 3' 비-번역 조절 서열은 예를 들어 An, Methods in Enzymology , 153: 292, 1987에 기재된 바와 같이 드 노보(de novo) 수득될 수 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함된다.

전사 개시 부위 및 코딩 서열의 시작 사이에 삽입되는 DNA 서열, 즉 비번역 5' 리더 서열 (5'UTR)은 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있으므로, 또한 특정 리더 서열을 사용할 수 있다. 적합한 리더 서열은 외부 또는 외인선 DNA 서열의 최적 발현을 유도하도록 선택되는 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 이러한 리더 서열은 mRNA 안정성을 증가 또는 유지시키고 예를 들어 Joshi, Nucl . Acid Res . 15: 6643, 1987에 기재된 바와 같이 번역의 부적절한 개시를 방지할 수 있는 바람직한 공통(consensus) 서열을 포함한다.

부가적으로, 표적 서열을 사용하여 외부 또는 외인성 폴리뉴클레오티드에 의하여 인코딩되는 효소를 식물 세포 내 세포내 구획, 예를 들어 엽록체에 또는 세포외 환경에 표적화할 수 있다. 예를 들어, 트랜지트 또는 신호 펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 본 발명의 선택된 효소를 인코딩하는 서열에 작동가능하게 결합시켜, 번역될 때, 상기 트랜지트 또는 신호 펩타이드가 상기 효소를 특정 세포내 또는 세포외 목적지로 이동시킨 다음, 선택적으로 후-번역 제거할 수 있다. 트랜지트 또는 신호 펩타이드는 세포내 막, 예를 들어, 소포체, 액포, 소포, 색소체, 미토콘드리아 및 식물세포막을 통하여 단백질 수송을 촉진시킴으로써 작용한다. 예를 들어, 상기 표적화 서열은 원하는 단백질을 시토졸 보다는 액포 또는 색소체 (예를 들어, 엽록체)와 같은 특정 세포 기관으로 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 구조체는 프로모터 영역과 외부 또는 외인성 폴리뉴클레오티드 사이에 작동가능하게 결합되는 색소체 트랜지트 펩타이드-인코딩 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

벡터

본 발명은 유전자 구조체의 조작 또는 전달을 위한 벡터의 이용을 포함한다. "벡터"는 핵산 분자, 바람직하게 핵산 서열이 삽입되거나 클로닝될 수 있는 예를 들어 플라스미드, 박테리오파지 또는 식물 바이러스로부터 유도되는 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 바람직하게 하나 이상의 고유 제한 부위를 함유하며, 표적 세포 또는 조직 또는 전구 세포 또는 그 조직을 포함하는 소정의 숙주 세포 내에 자율적 복제가 가능하거나, 클로닝된 서열이 복제가능하도록 상기 소정의 숙주의 게놈과 통합될 수 있다. 따라서, 상기 벡터는 자율 복제 벡터, 즉, 엽록체외 독립체로서 존재하고, 그 복제가 엽록체 복제와 무관한 벡터, 예를 들어, 선형 또는 폐환형 플라스미드, 엽록체외 요소, 꼬마염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 상기 벡터는 자기 복제를 보증하는 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 벡터는 세포 내로 도입될 때 수용체 세포의 게놈 내로 통합되고 그것이 통합된 엽록체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터 시스템은 숙주 세포의 게놈 내로 도입될 총 DNA, 또는 트랜스포손을 함께 함유하는, 단일 벡터 또는 플라스미드, 2 이상의 벡터 또는 플라스미드를 함유할 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터의 상기 벡터가 도입될 세포와의 상용가능성에 달려 있다. 상기 벡터는 또한 항생물질 내성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 또는 적합한 형질전환체 선택을 위하여 사용될 수 있는 기타 유전자와 같은 선발 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 이와 같은 유전자의 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 핵산 구조체는 플라스미드와 같은 벡터 내로 도입될 수 있다. 플라스미드 벡터는 전형적으로 원핵 및 진핵 세포 내에서 발현 카세트의 용이한 선별, 증폭 및 형질전환을 제공하는 부가적 핵산 서열을 포함한다, 예를 들어, pUC-유도 벡터, pSK-유도 벡터, pGEM-유도 벡터, pSP-유도 벡터 또는 pBS-유도 벡터. 부가적인 핵산 서열은 자율적 벡터 복제를 제공하기 위한 복제 기원, 바람직하게 항생물질 또는 제초제 저항성을 인코딩하는 선별가능한 마커 유전자, 핵산 서열 또는 인코딩되는 유전자를 핵산 구조체 내에 삽입하기 위한 복수 부위를 제공하는 고유의 복수 클로닝 부위, 및 원핵 및 진핵 (특히 식물) 세포의 형질전환을 증진시키는 서열을 포함한다.

"마커 유전자"는 구분되는 표현형을 상기 마커 유전자를 발현하는 세포에 부여하여 이와 같이 형질전환된 세포가 상기 마커를 가지지 않는 세포로부터 구별되도록 하는 유전자를 의미한다. 선택 마커 유전자는 선택적 제제 (예를 들어, 제초제, 항생제, 방사선, 열 또는 기타 비형질전환된 세포를 손상시키는 처리)에 대한 저항성에 근거하여 "선별"할 수 있는 특성을 부여한다. 스크리닝가능한 마커 유전자 (또는 리포터 유전자)는 관찰 또는 시험을 통하여, 즉 "스크리닝"에 의하여 확인할 수 있는 특성을 부여한다 (예를 들어, β-글루쿠로니다아제, 루시퍼라아제, GFP 또는 비형질전환된 세포 내에 존재하지 않는 기타 효소 활성). 상기 마커 유전자 및 관련 뉴클레오티드 서열은 결합될 필요가 없다.

형질전환체의 확인을 용이하게 하기 위하여, 상기 핵산 구조체는 바람직하게 선별가능한 또는 스크리닝 가능한 마커 유전자를 외부 또는 외인성 폴리뉴클레오티드로서 또는 이에 부가하여 포함한다. 마커의 실제 선택은 그것이 선택되는 식물 세포와 함께 기능적인 (선택적인) 한 결정적이지 않다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,399,216 호에 기재된 바와 같은 비결합된 유전자의 동시 형질전환 또한 식물 형질전환에 있어 효율적 공정이므로, 상기 마커 유전자 및 관련된 외부 또는 외인성 폴리뉴클레오티드는 결합될 필요는 없다.

박테리아 선택 마커의 예는 암피실린, 카나마이신, 에리트로마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생물질 내성을 부여하는 마커이다. 식물 형질전환체의 선택을 위한 예시적 선택 마커는 이에 제한되지 않으나, 하이그로마이신 B 저항성을 인코딩하는 hyg 유전자; 예를 들어, Potrykus et al ., Mol . Gen . Genet. 199: 183, 1985에 기재된 것과 같은 카나마이신, 파로모마이신, G-418 등에 대한 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt) 유전자; 예를 들어, EP-1 256223에 기재된 것과 같은 글루타티온 유도 제초제에 대한 저항성을 부여하는 래트 간으로부터의 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 유전자; 예를 들어 WO 87/05327에 기재된 것과 같은, 과발현시 포스피노트리신과 같은 글루타민 합성효소 억제제에 대한 저항성을 부여하는 글루타민 합성효소 유전자; 예를 들어 EP-A 275957에 기재된 것과 같은 선택 제제 포스피노트리신에 대한 저항성을 부여하는 스트렙토마이세스 비리도크로모겐스(Streptomyces viridochromogenes )로부터의 아세틸트랜스퍼라아제 유전자; 예를 들어 Hinchee et al ., Biotech . 6: 915, 1988에 기재된 것과 같은, N-포스포노메틸글리신에 대한 내성을 부여하는 3-에놀시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)를 인코딩하는 유전자; 예를 들어 WO　91/02071에 기재된 것과 같은, 바이알라포스(bialaphos)에 대한 저항성을 부여하는 bar 유전자; 브로목시닐(bromoxynil)에 대한 저항성을 부여하는 클렙시엘라 오자이나이(Klebsiella ozaenae)로부터의 bxn과 같은 니트릴라아제 유전자 (Stalker et al ., Science , 242: 419, 1988); 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 디하이드로폴레이트 리덕타아제 (BHFR) 유전자 (Thillet et al ., J. Biol. Chem . 263: 12500, 1988); 이미다졸리논, 술포닐우레아 또는 기타 ALS-억제 화학물질에 대한 저항성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 합성효소 유전자 (ALS) (EP-A-154 204); 5-메틸 트립토판에 대한 저항성을 부여하는 돌연변이된 안트라닐레이트 합성효소 유전자; 또는 제초제에 대한 저항성을 부여하는 달라폰(dalapon) 디할로게나아제 유전자를 포함한다.

바람직한 스크리닝 가능한 마커는 이에 제한되지 않으나, 이에 대한 다양한 발색 기질이 알려져 있는 β-글루쿠로니다아제 (GUS) 효소를 인코딩하는 uidA 유전자, 이에 대한 발색 기질이 알려져 있는 효소를 인코딩하는 β-갈락토시다아제 유전자, 칼슘-민감성 생물 발광 검출에 사용될 수 있는 에쿼린 (aequorin) 유전자 (Prasher et al., Biochem . Biophys . Res . Comm. 126: 1259-68, 1985); 녹색 형광 단백질 유전자 (Niedz et al ., Plant Cell Reports , 14: 403, 1995); 생물 발광 검출을 허용하는 루시퍼라아제 (luc) 유전자 (Ow et al ., Science , 234: 856, 1986), 및 당업계에 공지된 기타를 포함한다. 본원에 사용되는 "리포터 분자"는 그 화학적 성질에 의하여 단백질 생성물에 대한 참조로 프로모터 활성의 결정을 용이하게 하는 분석적으로 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다.

유전자 발현을 변화시키는 방법

단백질, 예를 들어 보리 식물의 발육 배유 내 전분 합성에 수반되는 효소의 수준은 식물 세포 내 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 발현 수준을 증가시킴으로써 또는 식물 내 상기 단백질을 인코딩하는 유전자 발현 수준을 감소시켜, 곡물 내 변화된 프룩탄 축적을 유도함으로써 조정될 수 있다. 유전자 발현 수준은 예를 들어 상기 코딩 서열 및 이에 작동가능하게 연결되고 세포 내에서 기능적인 전사 조절 요소를 포함하는 합성 유전자 구조체를 도입함으로써 세포 당 복제수를 변화시킴으로써 조정될 수 있다. 복수의 형질전환체를 선택하고, 이식 유전자 통합 부위 근처의 내인성 서열의 영향으로부터 유도되는 이식 유전자 발현의 유리한 수준 및/또는 특이성에 대하여 스크리닝할 수 있다. 이식 유전자 발현의 유리한 수준 및 패턴은 프룩탄 수준의 상당한 증가를 가져오는 것이다. 이는 형질전환체로부터의 곡물을 단순히 시험함으로써 검출될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이 유발된 곡물 집단 또는 사육 프로그램으로부터의 식물 집단을 변화된 프룩탄 축적에 대하여 개별 주에 대하여 스크리닝할 수 있다.

유전자 발현 감소는 식물 세포 내로 도입되는 "유전자-침묵 키메릭 유전자"의 도입 및 전사를 통하여 달성될 수 있다. 상기 유전자-침묵 키메릭 유전자는 식물 세포 게놈, 바람직하게 핵 게놈 내로 안정하게 도입되거나, 또는 예를 들어 바이러스 벡터 상에 일시적으로 도입될 수 있다. 본원에 사용되는 "유전자-침묵 효과"는 식물 세포 내 표적 핵산의 발현 감소를 의미하며, 이는 침묵 RNA 도입에 의하여 달성될 수 있다. 이러한 감소는 염색질 개조의 메틸화를 통한 것을 포함하는 전사 감소, 또는 RNA 분해를 통한 것을 포함하는 RNA 분자의 전사후 변형, 또는 이들 모두의 결과일 수 있다. 유전자-침묵은 표적 핵산 또는 유전자 발현 제거 및 정도 또는 기간에 있어서 부분적 효과를 포함한다. 침묵 RNA 존재하에 표적 핵산의 발현 수준이 그 부재 하에보다 낮은 것으로 충분하다. 발현 수준은 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 감소될 수 있다. 표적 핵산은 전분 합성 또는 대사, 예를 들어, 전분 분해에 수반되는 유전자일 수 있으나, 기타 내인성 유전자, 이식 유전자 또는 이식 유전자 도입시 식물 세포 내에 존재하지 않을 바이러스 유전자와 같은 외인성 유전자를 포함할 수 있다.

안티센스 RNA 분자

안티센스 기술이 본 발명에 따른 유전자 발현을 감소시키는데에 이용될 수 있다. 용어 "안티센스 RNA"는 특정 mRNA 분자의 적어도 일부에 상보적이고 상기 mRNA를 인코딩하는 유전자 발현을 감소시킬 수 있는 RNA 분자를 의미하는 것으로 간주될 것이다. 이러한 감소는 전형적으로 서열-독립적 방식으로 일어나며, 핵으로부터 세포질로의 mRNA 수송, mRNA 안정성 또는 번역 억제와 같은 전사 후 이벤트를 간섭함에 의하여 일어나는 것으로 생각된다. 안티센스 방법의 이용은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Hartmann and Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer, 1999 참조). 식물 내 안티센스 기술의 이용은 Bourque, Plant Sci . 105: 125-149, 1995 및 Senior, Biotech . Genet . Engin . Revs . 15: 79-119, 1998에 의하여 검토된 바 있다. Bourque, 1995 (supra)는 안티센스 서열이 식물계 내에서 유전자 불활성화 방법으로서 어떻게 이용되는지에 대한 다수의 예를 열거한다. 저자는 또한 부분적 억제가 식물계 내에 측정가능한 변화를 초래할 가능성이 높으므로 효소 활성의 100% 억제 달성이 필요하지 않을 것임을 기재한다. Senior, 1998 (supra) 는 안티센스 방법이 현재 유전자 발현 조작을 위한 매우 잘 확립한 기술임을 기재한다.

본원에 사용되는 용어 "생리학적 조건 하에 혼성화하는 안티센스 폴리뉴클레오티드"는 상기 폴리뉴클레오티드 (완전히 또는 부분적으로 단일 가닥인)가 적어도 세포 내에서 정상 조건 하에 억제될 유전자의 RNA 생성물, 본원에 제공되는 것과 같은 단백질을 인코딩하는 mRNBA와 함께 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있음을 의미한다. 안티센스 분자는 구조 유전자에 상응하는 유전자 또는 유전자 발현 또는 스플라이싱에 대한 조절을 가져오는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 서열은 표적화된 유전자의 코딩 영역, 또는 5'-비번역 영역 (UTR) 또는 3'-UTR 또는 이들의 조합에 상응할 수 있다. 이는 전사 중 또는 후에 스플라이싱되는 인트론 서열에 부분적으로 상보적일 수 있으나, 바람직하게 표적 유전자의 엑손 서열에만 상보적이다. 일반적으로 더 큰 분기의 UTRs에 있어서, 이러한 영역의 표적화는 더 큰 유전자 억제 특이성을 제공한다.

안티센스 서열의 길이는 적어도 19 연속 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 25 또는 30 또는 50 뉴클레오티드, 및 더 바람직하게 적어도 100, 200, 500 또는 1000 뉴클레오티드, 내지 최대 억제될 유전자의 전장이다. 전체 유전자 전사체에 상보적인 전장 서열이 사용될 수 있다. 그 길이는 가장 바람직하게 100-2000 뉴클레오티드이다. 표적화되는 전사체에 대한 안티센스 서열의 동일성 정도는 적어도 90% 및 더 바람직하게 95-100%이어야 한다. 안티센스 RNA 분자는 물론 상기 분자를 안정화하는 기능을 할 수 있는 관련되지 않은 서열을 포함할 수 있다.

안티센스 RNA 발현을 위한 유전자 구조체는 "안티센스" 배향으로 프로모터 서열을 표적 유전자 영역에 결합시킴으로써 용이하게 제조될 수 있으며, 이는 본원에서 식물 세포 내 표적 유전자 내 서열의 전사 및 번역 (일어난다면)의 배향에 대하여 역 배향으로 언급된다. 따라서, 핵산 분자를 포함하는 세포, 조직, 기관, 식물, 곡물 등을 포함하는 본 발명의 안티센스 RNA를 코딩하는 키메릭 DNA와 같은 핵산 분자가 또한 본 발명에 의하여 제공된다.

리보자임

본원에 사용되는 용어 "리보자임"은 뚜렷한 기질 RNA를 특이적으로 인지하고 그 절단을 촉매화하는 RNA 분자를 의미한다. 전형적으로, 리보자임은 표적 RNA 영역에 상보적이며, 예를 들어, 상기 리보자임이 작용하는 세포 내에서 생리학적 조건 하에 상기 리보자임이 표적 RNA에 특이적으로 혼성화할 수 있도록 하는 뉴클레오티드 영역 및 본원에서 "촉매 도메인"으로 언급되는 효소 영역을 함유한다. 본 발명에 특히 유용한 리보자임 유형은 해머헤드 리보자임 (Haseloff and Gerlach, Nature 334: 585-591, 1988; Perriman et al ., Gene , 113: 157-163, 1992) 및 헤어핀 리보자임 (Haseloff and Gerlach, Nature 334: 585-591, 1988; Perriman et al ., Gene , 113: 157-163, 1992)이다. 리보자임을 인코딩하는 DNA는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 합성될 수 있으며, 관련 세포 내에서 유전자 구조체 또는 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 따라서, 핵산 분자를 포함하는 세포, 조직, 기관, 식물, 곡물 등을 포함하는 본 발명의 리보자임을 코딩하는 키메릭 DNA와 같은 핵산 분자가 또한 본 발명에 의하여 제공된다. 전형적으로, 리보자임을 인코딩하는 DNA가 프로모터 및 세포 내에서 작용하는 전사 종결 신호의 조절 하에 발현 카세트 내로 삽입된다. 트리뉴클레오티드 서열 GUA, GUU 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위를 위한 표적 분자를 스캐닝함으로써 임의의 잠재적인 RNA 표적 내에 특이적 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 일단 확인되면, 절단 부위의 표적 유전자 5' 및 3' 영역에 상응하는 약 5 내지 20 리보뉴클레오티드의 짧은 RNA 서열을 올리고뉴클레오티드 서열을 덜 적합하게 할 수 있는 2차 구조와 같은 예측되는 구조적 특징에 대하여 평가할 수 있다. 리보자임은, 사용될 때, 해머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임, 액스헤드 리보자임, 새로운 미위성체 리보자임, 테트라히메나 리보자임 및 RNAse P 리보자임으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 표적 유전자 서열에 근거하여 당업계에 공지된 방법에 따라 설계된다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,741,679 호 참조). 후보 표적의 적합성을 또한 리보뉴클레아제 보호 분석을 이용하여 상보적 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 접근성을 시험함으로써 평가할 수 있다.

본원에 기재되는 안티센스 폴리뉴클레오티드와 함께, 본 발명의 리보자임은 "생리적 조건", 즉 세포 내 조건, 특히 밀 또는 보리 세포와 같은 식물 세포 내 조건 하에 표적 핵산 분자 (예를 들어, 서열 번호 2에 제공되는 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA)에 혼성화할 수 있어야 한다.

RNA 간섭/ 이중가닥 RNA

본원에 사용되는 "인공적으로 도입되는 dsRNA 분자"는 예를 들어 그러한 dsRNA 분자를 인코딩하는 키메릭 유전자로부터 전사에 의하여 내부적으로 일어날 수 있는 dsRNA 분자의 도입을 의미하나, 진핵 세포 또는 식물 세포 내부에서 단일 가닥 RNA 분자의 dsRNA로의 전환을 의미하지는 않는다. RNA 간섭 (RNAi)은 유전자 발현을 특이적으로 감소시키거나 특정 단백질 생산을 억제하기 위하여 특히 유용하다. 이론에 제한되고자 하는 것은 아니지만, Waterhouse et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 95: 13959-13964, 1998는 dsRNA를 이용하여 단백질 생산을 감소시키는 메커니즘에 대한 모델을 제공하였다. 이러한 기술은 해당 유전자의 mRNA 또는 그 일부와 실질적으로 동일한 서열을 함유하는 dsRNA 분자의 존재에 의존한다. 편리하게, dsRNA는 재조합 벡터 또는 숙주 세포 내에서 단일 프로모터로부터 생산될 수 있으며, 여기서 센스 및 안티센스 서열들이 전사되어, 센스 및 안티센스 서열들이 혼성화되어 루프 구조를 형성하는 개재 서열 또는 스페이서 영역을 가지는 dsRNA 영역을 형성하는 헤어핀 RNA를 생산하므로, 상기 헤어핀RNA는 스템-루프 구조를 포함한다. 본 발명에 적합한 dsRNA 분자의 설계 및 생산은 특히 Waterhouse et al., 1998 (supra), Smith et al ., Nature , 407: 319-320, 2000, WO 99/53050, WO 99/49029, 및 WO 01/34815를 고려하여, 당업자의 지식 범위 내이다. 따라서, 핵산 분자를 포함하는 세포, 조직, 기관, 식물, 곡물 등을 포함하는, 본 발명의 헤어핀 RNA와 같은 이중 가닥 RNA를 코딩하는 키메릭 DNA와 같은 핵산 분자가 또한 본 발명에 의하여 제공된다.

일 실시예에서, 불활성화될 표적 유전자에 상동성을 가지는 적어도 부분적인 이중 가닥 RNA 생성물의 합성을 유도하는 DNA가 도입된다. 따라서, 상기 DNA는, RNA 내로 전사될 때 혼성화하여 이중 가닥 RNA 영역을 형성할 수 있는 센스 및 안티센스 서열들 모두를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 센스 및 안티센스 서열들은, RNA 내로 전사될 때 스플라이싱되는 인트론을 포함하는 스페이서 영역에 의하여 분리된다. 이러한 배열은 유전자 침묵의 더 높은 효율성을 가져오는 것으로 보여졌다 (Smith et al., 2000 (supra)). 상기 이중 가닥 영역은 하나의 DNA 영역 또는 두 영역으로부터 전사되는 하나 또는 두 개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. 상기 dsRNA는 대체로 상보적이나 전적으로 상보적일 필요는 없는 (전형적으로 약 100 bp 보다 큰, 바람직하게 200-100 bp의 염기페어링된 영역을 형성하는) 긴 hpRNA로서 분류될 수 있다. hpRNA는 또한 이중 가닥 부분이 약 30 내지 약 50 bp, 또는 30 내지 약 100 bp 크기 범위로 더 작을 수 있다 (본원에 참조로 포함되는 WO 04/073390을 참조). 상기 이중 가닥 RNA 영역의 존재는 상기 이중 가닥 RNA를 가지는 내인성 식물계로부터 21-24 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드에 반응을 유발하는 것으로 생각되며, 또한 이러한 올리고뉴클레오티드를 표적 식물 유전자로부터의 상동 RNA 전사체의 서열-특이적 절단에 사용하여, 표적 유전자의 활성을 효율적으로 감소 또는 제거한다.

혼성화하는 센스 및 안티센스 서열들의 길이는 적어도 19 연속 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 27 또는 30 또는 50 뉴클레오티드, 및 더 바람직하게 적어도 100, 200 또는 500 뉴클레오티드, 최대 전체 유전자 전사체에 해당하는 전장 서열이다. 상기 길이는 가장 바람직하게 100-2000 뉴클레오티드이다. 표적화되는 전사체에 대한 센스 및 안티센스 서열들의 동일성 정도는 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 및 더 바람직하게 95-100%이다. 서열이 더 길수록, 전체 서열 동일성에 대한 요구 조건이 덜 엄격해진다. RNA 분자는 물론 상기 분자를 안정화하는 작용을 할 수 있는 관련되지 않은 서열을 포함할 수 있다. RNA 분자는 상이한 표적 RNAs를 표적화하여, 하나 이상의 표적 유전자 발현 감소를 허용하는 상이한 서열들 간의 하이브리드이거나, 또는 다유전자군과 같은 관련되는 표적 유전자 군에 상응하는 하나의 서열일 수 있다. dsRNA 내에 사용되는 서열은 바람직하게 표적 유전자의 엑손 서열에 상응하며, 5' 및/또는 3' 비번역 서열 또는 단백질 코딩 서열 또는 이의 조합에 상응할 수 있다.

dsRNA-형성 구조체를 발현하는데에 사용되는 프로모터는 결과적인 dsRNA가 파괴를 위하여 표적화된 세포계보 내 유전자 생성물에 대하여 특이적이라면 임의의 유형의 프로모터일 수 있다. 대안적으로, 상기 프로모터는 특정 발달 계보의 세포 내에서만 발현된다는 점에서 계보 특이적일 수 있다. 이는 비-표적화 세포 계보 내 발현되는 유전자와 일부 상동성 중첩이 관찰되는 경우 이로울 수 있다. 상기 프로모터는 또한 외부 조절 요인에 의하여 또는 세포내 환경 요인에 의하여 유도될 수 있다. 전형적으로, RNA 분자는 RNA 폴리머라아제 II 또는 RNA 폴리머라아제 II 프로모터의 조절 하에 발현된다. 후자의 예는 tRNA 또는 snRNA 프로모터를 포함한다.

기타 침묵 RNA는 WO 01/12824 또는 US 6,423,885 (두 문헌 모두 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것과 같은, 표적 유전자의 RNA 전사체의 뉴클레오티드 서열의 상보체에 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 적어도 20 연속 뉴클레오티드를 포함하는 "비-폴리아데닐화된 RNA"일 수 있다. 또 다른 유형의 침묵 RNA는 표적 핵산 서열 또는 그 상보체에 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 적어도 20 연속 뉴클레오티드 및 WO 03/076619에 기재된 바와 같은 대체로 이중 가닥 영역을 추가로 포함하는 WO 03/076619 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 RNA 분자이다.

마이크로RNA 조절은 전형적인 RNAi/PTGS로부터 분기되는, 유전자 조절을 진전시키는 RNA 침묵 경로의 특수 분야이다. 마이크로RNAs는 특징적인 부분적 역반복 내 유전자형 요소 내에 인코딩되는 특정 부류의 작은 RNAs이다. 전사될 때, 마이크로RNA 유전자는 부분적으로 염기페어링된 스템-루프형 전구체 RNAs를 발생시키며, 이로부터 마이크로RNAs가 연이어 프로세싱된다. 마이크로RNAs는 전형적으로 약 21 뉴클레오티드 길이이다. 배출된 miRNAs는 서열 특이적 유전자 억압을 발휘하는 특정 서브세트의 아고너트(Argonaute) 단백질을 함유하는 RISC-유사 복합체 내로 혼입된다 (예를 들어, Millar and Waterhouse, Funct Integr Genomics , 5: 129-135, 2005; Pasquinelli et al ., Curr Opin Genet Develop 15: 200-205, 2005; Almeida and Allshire, Trends Cell Biol . 15: 251-258, 2005 참조, 상기 문헌들은 본원에 참조로 포함됨).

동시억제 ( Cosuppression )

유전자 발현을 특이적으로 감소시키기 위하여 사용될 수 있는 다른 분자 생물학적 접근법은 동시-억제이다. 동시-억제의 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있으나, 전사후 유전자 침묵 (PTGS)을 수반하는 것으로 생각되며, 이러한 점에서 안티센스 억제의 많은 예들와 매우 유사할 것이다. 이는 추가의 유전자 복제 또는 그 단편을 식물 내로, 본원에서 표적 유전자 서열에 대하여 서열의 전사 및 번역 (일어난다면)과 동일한 배향으로 언급되는, 그 발현을 위한 프로모터에 대하여 "센스 배향"으로 도입하는 것을 수반한다. 센스 단편의 크기, 표적 유전자 영역에의 유사성, 및 표적 유전자에 대한 상동성 정도는 앞서 기재된 안티센스 서열에 대한 것과 같다. 일부 예에서, 추가적인 유전자 서열 복제가 표적 식물 유전자 발현을 간섭한다. 동시 억제 접근법의 실행 방법에 대하여 특허 명세서 WO 97/20936 및 유럽 특허 명세서 0465572를 참조한다. 안티센스, 동시 억제 또는 이중 가닥 RNA 분자는 또한 WO 03/076619에 기재된 바와 같은 핵 위치 신호를 포함하는 대체로 이중 가닥 RNA 영역을 포함할 수 있다.

유전자 발현 감소를 위한 이러한 기술 중 하나를 이용하여 복수 유전자 활성을 대등하게 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 통상적인 유전자 영역을 표적화함으로써 하나의 RNA 분자를 관련 유전자 집단에 대하여 표적화할 수 있다. 대안적으로, 하나의 RNA 분자 내에 각각 상이한 유전자를 표적화하는 복수 영역을 포함시킴으로써 관련되지 않은 유전자를 표적화할 수 있다. 이는 복수 영역을 단일 프로모터 조절 하에 융합시킴으로써 용이하게 수행될 수 있다.

핵산을 식물 세포 내로 도입하는 방법/형질전환

핵산 분자를 식물 숙주 세포 내로 도입하기 위하여 당업자에게 잘 알려진 많은 기술이 이용가능하다. 용어 "형질전환"은 외부 또는 외인성 핵산 도입에 의한 생물, 예를 들어, 박테리아 또는 식물의 유전형 변형을 의미한다. "형질전환체"는 이와 같이 하여 변형된 생물을 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "유전자이식 (transgenic)"은 내인성 게놈이 도입되는 외부 또는 외인성 유전자 또는 서열의 통합 또는 복제가능한 비통합된 형태로 안정한 유지에 의하여 보충 또는 변형되는 유전자 변형된 식물을 의미한다. "이식유전자(transgene)"는 식물의 게놈 내로 도입되는 외부 또는 외인성 유전자 또는 서열을 의미한다. 핵산 분자가 식물의 게놈 내로 안정하게 통합되거나, 또는 염색체외 요소로서 복제될 수 있다. "게놈"은 세포, 식물 또는 식물 부분의 총 선천적인 유전자 보체를 의미하며, 염색체 DNA, 색소체 DNA, 미토콘드리아 DNA 및 염색체외 DNA 분자를 포함한다. 본원에서 식물 물질과 관련하여 사용되는 용어 "재생"은 예를 들어 배유, 배반(scutellum), 프로토플라스트, 칼루스(callus), 또는 기타 조직으로부터와 같이, 식물 세포, 식물 세포 군, 식물 부분으로부터 전체 분화된 식물을 성장시키는 것을 의미하나, 종자로부터 식물의 성장을 포함하지 않는다.

형질전환 기술의 특정 선택은 특정 식물 종을 형질전환시키는 효율성 및 본 발명을 특정 선택 방법을 이용하여 실행하는 사람의 경험 및 기호에 의하여 결정될 것이다. 핵산 전달의 허용가능한 수준에 도달한다면, 핵산 구조체를 식물 세포 내로 도입시키기 위한 형질전환 시스템의 특정 선택은 본 발명에 필수적인 것이 아니거나 이를 제한하는 것이 아님이 당업자에게 분명할 것이다. 식물 개량을 위한 형질전환 시스템의 실제 실행에 대한 가이드는 Birch, Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol . 48: 297-326, 1997에 의하여 제공된다.

외부 또는 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입 및 발현은 아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도 (Ti) 플라스미드의 T-DNA를 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Umbeck, U.S. Patent No. 5,004,863, 및 International application PCT/US93/02480 참조). 본 발명의 구조체는 상기 Ti 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스 배양액을 형질전환 베히클로서 사용함에 있어서, 아그로박테리움의 비-종양유발성 균주를 벡터 담체로서 이용하여 형질전환된 조직의 정상적인 비-종양유발 분화가 가능하도록 하는 것이 가장 유리하다. 아그로박테리움이 이성분 Ti 플라스미드 시스템을 받는 것이 바람직하다. 상기 이성분 시스템은 (1) 운반 DNA (T-DNA)를 식물 내로의 도입을 위하여 필수적인 독성 영역을 가지는 제1 Ti 플라스미다, 및 (2) 키메릭 플라스미드를 포함한다. 상기 키메릭 플라스미드는 운반될 핵산을 플랭킹하는 야생형 Ti 플라스미드의 T-DNA 영역의 적어도 하나의 경계 영역을 함유한다. 이성분 Ti 플라스미드 시스템은 예를 들어 De Framond, Biotechnology, 1: 262, 1983 및 Hoekema et al ., Nature , 303: 179, 1983에 기재된 바와 같이 식물 세포를 형질전환시키는데에 효율적인 것으로 보여져 왔다. 이러한 이성분 시스템은 무엇보다도 아그로박테리움 내에서 Ti 플라스미드 내로 통합될 필요가 없기 때문에 바람직하다.

아그로박테리움의 사용을 수반하는 방법은 이에 제한되지 않으나 다음을 포함한다: (a) 배양되고 분리된 프로토플라스트와 함께 아그로박테리움의 동시-배양; (b) 아그로박테리움을 이용하여 식물 세포 또는 조직의 형질 전환; (c) 종자, 말단 또는 분열조직을 아그로박테리움을 이용하여 형질전환, 또는 (d) Bechtold et al., C.R. Acad. Sci . Paris, 316: 1194, 1993 에 기재된 바와 같은 floral-dip 방법과 같은 식물체 내 (in planta), 또는 밀 내 (WO 00/63398에 기재, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함됨) 접종. 이러한 접근법은 아그로박테리움 세포 현탁액의 침투에 근거한다. 대안적으로, 아그로박테리움의 루트-유도 (Ri) 플라스미드를 벡터로서 사용하여 키메릭 구조체를 도입할 수 있다.

외인성 핵산 도입에 의하여 식물 내로 유전자 변이를 도입하고 프로토플라스트 또는 미성숙 식물 배아로부터 식물을 재생시키기 위한 밀 및 보리와 같은 곡류 식물의 형질전환 방법은 당업계에 잘 알려져 있다: 예를 들어, Wan and Lemaux, Plant Physiol . 104: 37-48, 1994, Tingay et al ., Plant J. 11: 1369-1376, 1997, 캐나다 특허 출원 제 2,092,588호, 오스트레일리아 특허 출원 제 61781/94, 오스트레일리아 특허 제 667939호, 미국 특허 제 6,100,447호, 국제 특허 출원 PCT/US97/10621, 미국 특허 제 5,589,617호, 미국 특허 제 6,541,257호를 참조. 바람직하게, 유전자 이식 식물은 아그로박테리움 투메파시엔스 개재 형질전환 절차에 의하여 생산된다. 원하는 핵산 구조체를 운반하는 벡터를 조직 배양 식물 또는 절편의 재생가능한 곡물 세포 내로 도입할 수 있다. 재생가능한 세포는 바람직하게 미성숙 배아의 배반, 성숙 배아, 이들로부터 유도되는 칼루스, 또는 분열조직으로부터이다. 미성숙 배아는 바람직하게 개화 후 약 10-15일 지난 꽃으로부터의 것들이다.

유전자 구조체는 또한 예를 들어 by Fromm et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 82: 5824, 1985 및 Shimamoto et al ., Nature , 338: 274-276, 1989에 기재된 바와 같이 전기영동에 의하여 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술에서, 식물 프로토플라스트는 관련 핵산 서열을 함유하는 벡터 또는 핵산 존재 하에 전기영동된다. 높은 장 강도의 전기 임펄스는 가역적으로 막을 투과화하여 핵산의 도입을 허용한다. 전기영동된 식물 프로토플라스트는 세포벽을 재형성하고, 나누고 식물 칼루스를 형성한다.

핵산 구조체를 식물 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법은, 예를 들어 Klein et al ., Nature , 327: 70, 1987에 기재된 바와 같은, 작은 비드 또는 입자 매트릭스 내에 또는 그 표면에 함유되는 도입될 핵산을 이용하는 소입자에 의한 고속 탄환 관통이다 (유전자총(particle bombardment 또는 microprojectile bombardment)으로도 공지됨).

대안적으로, 기계적 또는 화학적 수단을 이용하여 식물 세포를 접촉시킴으로써 핵산 구조체를 식물 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 핵산을 마이크로피펫을 이용하여 식물 세포 내로 직접 미세주입함으로써 기계적으로 운반할 수 있다. 대안적으로, 세포에 의하여 채취되는 유전 물질과 침전 복합체를 형성하는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 핵산을 식물 세포 내로 운반할 수 있다.

돌연변이 유발

본 발명의 식물은 돌연변이 유발 후 생산 및 확인될 수 있다. 이는 일부 시장에서 원하는 비-유전자 이식 식물을 제공할 것이다.

돌연변이체는 자연 발생 (즉, 자연 급원으로부터 분리된) 또는 합성 (예를 들어, 핵산에 돌연변이 유발을 수행함에 의하여)일 수 있다. 일반적으로, 전구 식물 세포, 조직, 종자 또는 식물에 돌연변이를 유발하여, 뉴클레오티드 치환, 결실, 부가 및/또는 코돈 변형과 같은 단일 또는 복수 돌연변이를 생산한다. 본원의 문맥상, "유도된 돌연변이"는 예를 들어 트랜스포손 또는 T-DNA 삽입과 같은, 화학적, 방사선 또는 생물학적 돌연변이 유발의 결과일 수 있는 인공적으로 유도되는 유전 변이이다. 바람직한 돌연변이는 유전자를 완전히 불활성화시키는 넌센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 삽입 돌연변이 또는 스플라이스-부위 변이체와 같은 삭제 돌연변이이다. 뉴클레오티드 삽입 유도체는 단일 또는 복수 뉴클레오티드의 서열 내 삽입뿐 아니라, 5' 및 3' 말단 융합을 포함한다. 삽입 뉴클레오티드 서열 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 서열 내로 도입되는 것들이며, 이는 결과 생성물의 적합한 스크리닝을 이용하여 무작위 삽입에 의하여 얻어질 수 있다. 결실 변이체 서열로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 제거를 특징으로 한다. 바람직하게, 돌연변이 유전자는 야생형 유전자에 대하여 단지 하나의 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 결실을 가진다. 치환 뉴클레오티드 변이체는 서열 내 적어도 하나의 뉴클레오티드가 제거되고 다른 뉴클레오티드가 그 자리에 삽입되는 것들이다. 야생형 유전자에 대하여 돌연변이 유전자 내 치환에 의하여 영향을 받는 뉴클레오티드의 바람직한 수는 최대 10 뉴클레오티드, 더 바람직하게 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2, 또는 단지 하나의 뉴클레오티드이다. 이러한 치환은 그 치환이 코돈에 의하여 정의되는 아미노산을 변화시키지 않는다는 점에서 "침묵(silent)"이다. 대안적으로, 보존적 치환체를 설계하여 하나의 아미노산을 다른 유사하게 작용하는 아미노산에 대하여 변형시킨다. 전형적인 보존적 치환은 표 10 "예시적 치환"에 따라 행하여진 것들이다.

본원에 사용되는 용어 "돌연변이"는 유전자 활성에 영향을 미치지 않는 사일런트 뉴클레오티드 치환을 포함하지 않으며, 따라서 유전자 활성에 영향을 미치는 유전자 서열 변형만을 포함한다. 용어 "다형성(polymorphism)"은 이러한 사일런트 뉴클레오티드 치환을 포함하는 뉴클레오티드 서열 내 임의의 변화를 의미한다.

바람직한 구현예에서, 식물은 이러한 유전자 내에 SSII 유전자의 적어도 일부의 결실 또는 프레임시프트 또는 스플라이스 부위 변이를 포함한다.

다른 바람직한 구현예에서, 식물은 당업계에 공지된 AC38 대립 유전자과 같은 amol 유전자 내 돌연변이를 포함한다.

돌연변이 유발은 화학적 또는 방사선 수단, 예를 들어, 당업계에 공지된 종자의 EMS 또는 아지드화나트륨 (Zwar and Chandler, Planta 197: 39-48, 1995) 처리, 또는 감마 방사선에 의하여 달성될 수 있다.

화학적 돌연변이 유발은 결실 보다는 유리한 뉴클레오티드 치환의 경향이 있다. 중이온 빔 (HIB) 조사는 새로운 식물 품종 생산을 위한 돌연변이 육종을 위한 효과적인 기술로 알려져 있다; 예를 들어, Hayashi et al ., Effects of ion beam irradiation on mutation induction in rice. Cyclotrons and Their Applications 2007, Eighteenth International Conference 237-239, 2007 및 Kazama et al ., Plant Biotechnology 25: 113-117, 2008 참조. 이온 빔 조사는 DNA 손상 양 및 DNA 결실 크기를 결정하는 생물학적 효과에 대한 두 가지 물리적 요인, 투여량 (gy) 및 LET (선에너지 전달, keV/um)을 가지며, 이들은 원하는 돌연변이 유발 정도에 따라 조정될 수 있다. HIB는 특정 SSIIa 또는 Amo1 유전자 내 돌연변이에 대하여 스크리닝될 수 있는, 이들 중 많은 것이 결실을 포함하는 돌연변이체 집단을 생성한다. 확인되는 돌연변이체들은 돌연변이 유발된 게놈 내 관련없는 돌연변이의 효과를 제거 및 따라서 감소시키기 위하여 반복친(recurrent parents)으로서 비-돌연변이된 밀과 역교배될 수 있다.

부위 특이적 돌연변이 생산에 유용한 생물학적 제제는 내인성 복구 기작을 자극하는 DNA 내 이중 가닥 분해를 포함하는 효소를 포함한다. 이는 엔도뉴클레아제, 유전자 가위 (zinc finger nuclease), 전이효소 (transposase), 및 부위 특이적 재조합 효소를 포함한다. 유전자 가위 (ZFNs)는 예를 들어 게놈 내 부위-특이적 절단을 용이하게 하여, 내인성 또는 기타 말단-결합 복구 기작을 허용함으로써 결실 또는 삽입을 도입하여 갭을 복구시킨다. 유전자 가위 기술은 Le Provost et al., Trends in Biotechnology 28(3): 134-141, 2009에 검토되어 있으며, 또한 Durai et al ., Nucleic Acids Research 33(18): 5978-5990, 2005 and Liu et al ., Biotechnology and Bioengineering, 106: 97-105, 2010을 참조한다.

돌연변이체의 분리는 돌연변이 유발된 식물 또는 종자를 스크리닝함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 유발된 보리 식물 집단을 PCR 또는 이형 2중 가닥 기반 분석에 의하여 잎 또는 곡물 전분 내 낮은 SSIIa 활성, SSIIa 또는 amo1 유전자의 돌연변이에 대하여, 또는 ELISA에 의하여 SSII 단백질 손실에 대하여 스크리닝할 수 있다. 배수체 식물 내에서, 스크리닝은 바람직하게 하나 또는 두 개의 SSII 활성을 이미 결여한 유전자형 내에서, 예를 들어 세 개의 게놈 중 두 개 상의 SSII 유전자 내 돌연변이가 이미 존재하는 밀 식물 내에서 행하여져, 기능적 활성을 완전히 결여하는 돌연변이를 찾는다. 대안적으로, 돌연변이는 EMS와 같은 제제로 돌연변이 유발된 군 내 "틸링(tilling)" 과 같은 기술을 이용하여 확인될 수 있다 (Slade and Knauf, Transgenic Res . 14: 109-115, 2005). 다음, 이러한 돌연변이를 상기 돌연변이를 원하는 유전적 배경의 식물과 교배하고 적합한 수의 역교배를 수행하여 본래의 원하지 않는 모 배경을 삭제함으로써 원하는 유전적 배경 내로 도입할 수 있다.

돌연변이는 돌연변이 유발에 의하여 직접적으로, 또는 이들 중 하나가 도입되는 돌연변이를 포함하는 두 개의 모 식물의 교배에 의하여 간접적으로 식물 내로 도입되어 왔다. 곡류 식물과 같은 변형된 식물은 유전자 이식 또는 비-유전자 이식일 수 있다. 돌연변이 유발을 이용하여, 관련 기능이 결여된 비-유전자 이식 식물을 생산할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 식물로부터 생산되는 곡물 또는 기타 식물 부분, 및 배양 조직 또는 세포와 같은, 원하는 특징을 하지는 식물을 생산하는데 사용될 수 있는 식물의 번식 재료에 연장된다. 본 발명은 이러한 식물 또는 이러한 식물에 의하여 생산되는 곡물을 생산 또는 확인하는 방법에 분명히 연장된다.

본 발명의 식물은 TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)로 공지된 프로세스를 이용하여 생산될 수 있다. 첫번째 단계로, 세포, 종자, 화분 또는 기타 식물 부분을 화학적 돌연변이원 또는 방사선으로 처리한 다음, 식물을 돌연변이가 안정하게 유전될 세대로 전진시킴으로써, 새로운 단일 염기쌍 변화와 같은 도입되는 돌연변이를 식물 집단 내에 유도한다. DNA를 추출하고, 종자를 그 군의 모든 멤버로부터 저장하여 시간에 걸쳐 반복 접근가능한 자원을 형성한다.

TILLING 분석을 위하여, PCR 프라이머를 관련 단일 유전자 표적을 특이적으로 증폭시키도록 설계한다. 특이성은 표적이 유전자군의 일원 또는 배수체 게놈의 일부인 경우 특히 중요하다. 다음, 염료-표지된 프라이머를 이용하여 복수 개체의 풀링된 DNA로부터 PCR 생성물을 증폭시킨다. 이러한 PCR 생성물을 변성시키고 복원하여 미스매칭된 염기 쌍의 형성을 허용한다. 미스매치, 또는 이형 2중 가닥은 자연적으로 발생하는 단일 염기 다형성 (SNPs) (즉, 그 군으로부터의 몇몇 식물이 동일한 다형성을 가질 가능성이 있다) 및 유도된 SNPs (즉, 개별 식물이 돌연변이를 나타내는 것이 드물다) 모두를 나타낸다. 이형 2중 가닥 형성 후, 미스매칭된 DNA를 인지하고 절단하는 Ce1I과 같은 엔도뉴클레아제 이용은 TILLING 집단 내에서 새로운 SNPs를 발견하는 데에 있어 핵심이다.

이러한 접근법을 이용하여, 수천 개의 식물을 스크리닝하여 유전자 또는 게놈의 특정 영역 내에 단일 염기 변화 및 작은 삽입 또는 결실(1-30 bp)을 가지는 개체를 확인할 수 있다. 분석되는 게놈 단편은 0.3 내지 1.6 kb 크기 범위일 수 있다. 8-배 풀링, 1.4 kb 단편 (SNP 검출이 노이즈로 인하여 문제가 되는 단편의 말단을 무시함) 및 분석 당 96 레인으로, 이러한 조합은 백만 이하의 게놈 DNA 염기쌍이 단일 분석에서 스크리닝됨을 허용하여, TILLING을 높은 처리율의 기술이 되도록 한다. TILLING은 추가로 Slade and Knauf, 2005 (supra), 및 Henikoff et al ., Plant Physiol . 135: 630-636, 2004에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함된다.

효율적인 돌연변이 검출을 허용하는 것 이외에, 높은 처리량의 TILLING 기술은 자연적 다형성의 검출에 이상적이다. 따라서, 공지의 서열로 이형 2중 가닥 형성함에 의하여 미지의 상동 DNA에 대한 정보를 얻는 것은 다형성 부위의 수 및 위치를 드러낸다. 적어도 일부 반복 수 다형성을 포함하여, 뉴클레오티드 변화 및 작은 삽입 및 결실 모두 확인된다. 이는 Ecotilling으로 불리웠다 (Comai et al ., Plant J. 37: 778-786, 2004).

각각의 SNP를 몇몇 개의 뉴클레오티드 내 근사치 위치에 의하여 기록한다. 따라서, 각각의 일배체형(haplotype)을 그 이동성에 근거하여 기록할 수 있다. 서열 데이터를 미스매치-절단 분석에 사용되는 동일한 증폭된 DNA의 부분 표본을 이용하여 비교적 적은 노력으로 얻을 수 있다. 단일 반응을 위한 좌측 또는 우측 시퀀싱 프라이머를 그 다형성에의 근접에 의하여 선택한다. Sequencher 소프트웨어는 복수 정렬을 수행하고 염기 변화를 발견하며, 각각의 경우 겔 밴드를 확인한다.

Ecotilling은 현재 대부분의 SNP 발견을 위하여 사용되는 방법인 전체 시퀀싱보다 더 저렴하게 수행될 수 있다. 돌연변이 유발된 식물로부터의 DNA 풀 보다는 배열된 생태형 DNA를 함유하는 플레이트를 스크리닝할 수 있다. 검출이 거의 염기쌍 분해를 가지는 겔 상에서 이루어지며 배경 패턴이 레인을 통하여 균일하므로, 동일한 크기의 밴드가 매칭될 수 있고, 따라서 SNPs를 단일 단계로 발견하고 지노타이핑(genotyping)할 수 있다. 이러한 방식으로, SNP의 최종적인 시퀀싱은 단순하고 효율적이며, 스크리닝을 위하여 사용되는 동일한 PCR 생성물의 부분 표본을 DNA 시퀀싱할 수 있다는 사실로 인하여 더욱 그러하다.

유전자 연관

본원에 사용되는 용어 "유전자적으로 연관된(genetically linked)"은 마커 자리와 제2 자리가 염색체 상에서 충분히 가까워 감수분열의 50% 이상에서 (즉, 무작위가 아님) 함께 유전될 것임을 의미한다. 이러한 정의는 마커 자리 및 제2 자리가 동일한 유전자 부분을 형성하는 상황을 포함한다. 나아가, 이러한 정의는 마커 자리가 관련 특성에 대하여 책임 있는 다형성을 포함하는 상황(즉, 마커 자리가 표현형에 직접적으로 "관련됨")을 포함한다. 따라서, 세대 당 자리들 사이에 관찰되는 재조합 백분율 (센티모건 (cM))은 50 미만일 것이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 유전자적으로 관련된 자리들은 염색체 상에서 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1 이하 cM 떨어진 것일 수 있다. 바람직하게, 마커들은 5 cM 또는 2 cM 미만으로 떨어져 있으며, 가장 바람직하게 약 0 cM 떨어져 있다.

본원에 사용되는 "기타 유전자 마커"는 밀 또는 보리와 같은 곡류 식물의 원하는 특성과 관련되는 임의의 분자일 수 있다. 이러한 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 질병 저항성, 수확량, 식물 형태학, 곡물 품질, 곡물 색상과 같은 휴면 특성, 종자 내 지베렐린산 함량, 식물 길이, 가루 색상 등과 같은 특성을 결정하는 유전자와 관련되는 분자 마커를 포함한다.

마커 의존 선발은 전통적인 번식 프로그램에서 반복친과 역교배시 요구되는 이형접합성 식물의 선택을 위한 잘 알려진 방법이다. 각각의 역교배 세대에서 식물군은 역교배 군 내 1:1 비율로 정상적으로 존재하는 해당 유전자에 대하여 이형접합성일 것이며, 분자 마커를 이용하여 유전자의 두 개의 대립 유전자를 구별할 수 있다. 예를 들어 새싹으로부터 DNA를 추출하고 침투되는 원하는 특성에 대하여 특정 마커를 이용하여 시험함으로써, 에너지 및 자원을 더 적은 식물에 농축시키면서 추가의 역교배를 위한 식물의 조기 선발이 이루어진다.

SSI 또는 기타 유전자의 대립 유전자를 검출할 수 있는 당업계에 공지된 분자 생물학적 기술을 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 그러한 방법은 이에 제한되지 않으나, 핵산 증폭, 핵산 시퀀싱, 적합하게 표지된 프로브로 핵산 혼성화, 단일 가닥 형태 분석 (SSCA), 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE), 이형 2중가닥 분석 (HET), 화학적 절단 분석 (CCM), 촉매적 핵산 절단 또는 이의 조합의 이용을 포함한다 (예를 들어, Lemieux, Current Genomics , 1: 301-311, 2000; Langridge et al ., Aust J Agric Res 52: 1043-1077, 2001를 참조). 본 발명은 또한 분자 마커 기술을 이용하여, (예를 들어) 프룩탄 축적 변형을 가져오는 SSI 유전자와 관련되는 다형성을 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 제한효소 절편 길이 다형성 (RFLP: restriction fragment length polymorphisms), RAPD, 증폭 절편 길이 다형성 (AFLP) 및 미위성체 (microsatellite) (단순 서열 반복, SSR) 다형성의 검출 또는 분석을 포함한다. 밀접하게 연관되는 마커들을 Bulked Segregant Analysis, as reviewed by Langridge et al., 2001 (supra)와 같이 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 용이하게 얻을 수 있다.

"중합효소 연쇄 반응 (PCR)"은 "업스트림" 및 "다운스트림" 프라이머로 이루어지는 "한 쌍의 프라이머" 또는 "한 세트의 프라이머" 및 DNA 폴리머라아제, 및 전형적으로 열 안정성 폴리머라아제 효소와 같은 중합 촉매를 이용하는 복제본이 표적 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 반응이다. PCR 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 "PCR" (McPherson and Moller (Ed), BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, 2000)에 교시되어 있다. PCR을 SSII 유전자를 발현하는 식물 세포로부터 분리되는 역전사 mRNA로부터 얻어지는 cDNA 또는 식물로부터 분리되는 게놈 DNA 상에서 수행할 수 있다.

프라이머는 표적 서열에 서열 특이적 방식으로 혼성화할 수 있고 PCR 동안 연장될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열이다. 증폭절(amplicons) 또는 PCR 생성물 또는 PCR 단편 또는 증폭 생성물은 프라이머 및 새롭게 합성된 표적 서열 복제본을 포함하는 연장 생성물이다. 다중 (multiplex) PCR 시스템은 2 이상의 증폭절의 동시 생산을 가져오는 복수 세트의 프라이머를 함유한다. 프라이머를 표적 서열에 완벽하게 매칭시키거나, 또는 프라이머는 특정 표적 서열 내에 제한 효소 또는 촉매적 핵산 인지/절단 부위의 도입을 가져올 수 있는 내부 미스매칭된 염기를 함유할 수 있다. 프라이머는 또한 부가적인 서열을 함유하고/하거나 변형된 또는 표지된 뉴클레오티드를 함유하여 증폭절의 포획 또는 검출을 용이하게 할 수 있다. DNA 열 변성, 상보 서열에의 프라이머 어닐링 및 폴리머라아제를 이용한 어닐링된 프라이머의 연장의 반복 사이클은 표적 서열의 대수 증폭을 초래한다. 표적 또는 표적 서열 또는 주형은 증폭되는 핵산 서열을 의미한다.

핵산 서열의 시퀀싱 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Ausubel et al. (supra) 및 Sambrook et al . (supra)에서 찾을 수 있다. 시퀀싱은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 디디옥시(dideoxy) 시퀀싱, 화학적 시퀀싱 또는 이의 변형에 의하여 수행될 수 있다. 직접 시퀀싱은 특정 서열의 임의의 염기쌍 내 변이를 결정하는 이점을 가진다.

식물

본원에 명사로서 사용되는 용어 "식물"은 전체 식물을 의미하나, 형용사로서 예를 들어 식물 기관 (예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃), 단일 세포 (예를 들어, 화분), 종자, 식물 세포 등과 같은, 식물 내에 존재하거나 이로부터 얻어지거나 유도되거나 이와 관련되는 임의의 물질을 의미한다. 이로부터 뿌리 및 싹이 나오는 묘목 및 발아 종자 또한 "식물" 의미 내에 포함된다. 용어 "식물 부분"은 식물로부터 얻어지고 식물의 게놈 DNA를 포함하는 하나 이상의 식물 조직 또는 기관을 의미한다. 식물 부분은 식물 생장 구조 (예를 들어, 잎, 줄기), 뿌리, 꽃 기관/구조, 종자 (배아, 배유, 및 종피를 포함), 식물 조직 (예를 들어, 유관속 조직, 기본 조직 등), 세포 및 이의 자손을 포함한다. 용어 "식물 세포"는 식물로부터 얻어지거나 식물 내 세포를 의미하며, 프로토플라스트 또는 식물로부터 유도되는 기타 세포, 생식세포-생산 세포, 및 전체 식물로 재생되는 세포를 포함한다. 식물 세포는 배양액 내 세포일 수 있다. "식물 조직"은 식물 내 또는 식물로부터 얻어지는 ("외식편") 분화 조직 또는 미성숙 또는 성숙 배아, 종자, 뿌리, 싹, 열매, 화분, 근두암종과 같은 종양 조직, 및 calli와 같은 배양액 내 식물 세포 응집체의 다양한 형태로부터 유도되는 미분화 조직을 의미한다. 본 발명은 따라서 식물 및 식물 부분 및 이를 포함하는 생성물, 특히 프룩탄을 포함하는 곡물을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "곡물"은 전형적으로 밭에서 상업적으로 수확되는 것과 같은 식물의 성숙한 종자를 의미한다. 따라서, 상기 용어는 수확된 종자 및 수확 준비가 된 식물의 종자를 포함한다. 밀 또는 보리와 같은 성숙한 곡물은 통상적으로 약 18-20% 미만의 수분 함량을 가진다.

본원에 사용되는 "유전자 이식(transgenic) 식물"은 동일 종 또는 품종의 야생형 식물 내에서 발견되지 않는 유전자 구조체를 함유하는 식물을 의미한다. 즉, 유전자이식 식물 (형질전환된 식물)은 형질전환 이전에 함유하지 않았던 유전 물질(이식 유전자)을 함유한다. 상기 이식 유전자는 식물 세포 또는 다른 식물 세포 또는 비-식물 급원으로부터 얻어지거나 유도되는 유전자 서열, 또는 합성 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 이식 유전자는 예를 들어 형질전환과 같은 인간 조작에 의하여 식물 내로 도입되어 왔으나, 당업자가 인지하는 임의의 방법을 사용할 수 있다. 상기 유전 물질은 바람직하게 식물의 게놈 내로 안정하게 통합된다. 도입되는 유전 물질은 동일 종에서 자연적으로 발생하는 서열을 포함하나, 재배열된 순서 또는 상이한 요소 배열로 포함한다; 예를 들어, 안티센스 서열. 이러한 서열을 함유하는 식물은 본원의 "유전자 이식 식물" 내에 포함된다. "비-유전자 이식 식물"은 재조합 DNA 기술에 의한 유전 물질 도입에 의하여 유전자 변형되지 않은 것이다. 바람직한 구현예에서, 유전자 이식 식물은 그들의 자손이 원하는 표현형에 대하여 구분되지 않도록 도입된 각각의 모든 유전자(이식유전자)에 대하여 동형접합성이다.

본원에 사용되는 용어 "상응하는 비-유전자 이식 식물"은 유전자 이식 식물에 대하여 동질 유전자이나 해당 이식 유전자가 없는 식물을 의미한다. 바람직하게, 상응하는 비-유전자 이식 식물은 해당 유전자 이식 식물의 조상과 동일 품종이거나, "분리 개체(segregant)"로도 불리우는, 구조체를 결여한 시블링(sibling) 식물주, 또는 "빈 벡터" 구조체로 형질전환된 동일 품종의 식물이며, 비-유전자 이식 식물일 수 있다. 본원에 사용되는 "야생형"은 본 발명에 따라 변형되지 않은 세포, 조직 또는 식물을 의미한다. 야생형 세포, 조직 또는 식물을 대조군으로 사용하여 외인성 핵산 발현 수준 또는 특성 변성 정도 및 성질을 본원에 기재되는 바와 같이 변형된 세포, 조직 또는 식물과 비교할 수 있다.

본원에 정의된 바와 같은 유전자 이식 식물은 해당 이식유전자를 포함하는, 재조합 기술을 이용하여 유전자 변형된 식물의 자손을 포함한다. 이러한 자손은 1차 유전자 이식 식물의 자가수정 또는 이러한 식물을 동종의 다른 식물과 교배함으로써 얻어질 수 있다. 이는 일반적으로 원하는 식물 또는 식물 기관 내 본원에 정의되는 적어도 하나의 단백질/효소의 생산을 조정하기 위한 것일 것이다. 유전자 이식 식물 부분은 예를 들어 배양 조직, 칼루스 및 프로토플라스트와 같은 이식 유전자를 포함하는 상기 식물의 모든 부분 및 세포를 포함한다.

몇몇 방법 중 임의의 것을 이용하여 형질전환된 식물 내 이식 유전자의 존재를 결정할 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여, 겔 전기영동 또는 기타 방법에 의하여 증폭된 생성물을 검출하면서, 형질전환된 식물 고유의 서열을 증폭시킬 수 있다. 전형적인 방법을 이용하여 DNA를 식물로부터 추출하고, 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하여 특정 DNA를 증폭시킬 수 있으며, 그 존재는 형질전환된 및 비-형질전환된 식물을 구분할 것이다. 예를 들어, 구조체 내로 판독하는 형질전환 벡터 및 해당 유전자로부터 설계된 역 프라이머로부터 DNA 영역을 증폭시킬 프라이머를 설계할 수 있다. 이러한 프라이머는 식물이 성공적으로 형질전환된다면 단편만을 증폭시킬 것이다. 양성 형질전환체를 확인하는 대안적 방법은 당업계에 잘 알려진 Southern 블롯 혼성화에 의해서이다. 형질전환되는 식물이 또한 확인, 즉 비-형질전환 또는 야생형 식물로부터 예를 들어 선택 마커 유전자의 존재에 의하여 부여되는 또는 식물의 곡물의 변화된 프룩탄 함량의 표현형에 의하여 부여되는 그들의 표현형, 또는 변화된 전분 합성효소 활성과 같은 관련 표현형에 의하여 구별될 수 있을 것이다.

본원에 사용되는 "발아"는 침윤(imbibition) 후 종피로부터 근단의 출현을 의미한다. "발아율"은 침윤 후 일정 기간, 예를 들어 7 또는 10일에 걸쳐 발아된 집단 내 종자 백분율을 의미한다. 종자 집단을 수일에 걸쳐 매일 평가하여 시간 경과에 따른 발아 백분율을 결정할 수 있다. 본 발명의 종자와 관련하여, 본원에 사용되는 용어 "실질적으로 동일한 발아율"은 유전자 이식 종자의 발아율이 동질 유전자 야생형 종자의 것의 적어도 90%임을 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "보리"는 다른 종과의 교배에 의하여 생산되는 그들의 자손뿐 아니라 그들의 조상을 포함하는, 보리속 (Genus Hordeum)의 임의의 종을 의미한다. 상기 식물은 예를 들어 Hordeum vulgare의 균주 또는 품종과 같은 상업적으로 경작되거나 곡물의 상업적 생산에 적합한 Hordeum 종인 것이 바람직하다.

식품 제조

다른 측면에서, 본 발명은 식품 또는 사료 제조에 유용한, 보리 식물 및 곡물, 및 그로부터 얻어지는 생성물을 제공하며, 상기 곡물은 상응하는 SSIIa 돌연변이 곡물에 비하여 증가된 수준의 전분 및 상응한 야생형 곡물에 비하여 증가된 수준의 비전분 성분을 가진다. 바람직하게, 곡물이 얻어지는 식물은 발생 중에 배유 내 감소된 수준의 SSIIa 활성을 가진다. 본 발명의 식물은 식품 제조 및 특히 상업적 식품 제조에 유용하다. 이러한 식품 제조는 가루, 반죽 또는 기타 상업적 식품 제조 성분일 수 있는 생성물을 포함할 수 있다. 식품 제조에 사용하기에 바람직한 구현예에서, 상기 식물의 종자 또는 곡물은 야생형 식물에 비하여 증가되는 프룩탄 함량을 가진다. 상기 곡물은 곡물 내 분해 효소를 인코딩하는 유전자 발현을 감소시키는 도입된 돌연변이 또는 이식 유전자 존재에 의하여 감소되는, 분해 효소, 특히 α-아밀라아제 또는 β-아밀라아제와 같은 하나 이상의 아밀라아제의 활성 수준을 가질 수 있다. 그러한 곡물로부터의 가루 또는 반죽은 베이킹 또는 기타 식품 제조를 위한 바람직한 특성을 가진다.

상기 식물의 바람직한 유전적 배경은 작물 산출량 및 기타 특성의 고려를 포함할 것이다. 이러한 특성은 추파형 또는 춘파형을 가지는 것이 바람직한지 여부, 작물 특성, 질병 저항성 및 무생물적 스트레스 저항성을 포함할 것이다. 기타 품종들이 기타 재배 영역에 대하여 적합할 것이다. 본 발명의 식물 품종은 적어도 일부 재배 영역에서 상응하는 야생형 품종의 80% 미만의 산출량, 더 바람직하게 85% 미만, 및 훨씬 더 바람직하게 90% 미만의 산출량을 가지는 것이 바람직하다.

추가적인 구현예에서, 상기 곡물의 전분 함량은 야생형에 대하여 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 45%, 적어도 약 47%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55% (w/w), 최대 65%, 및 더 바람직하게 감소되지 않는다. 상업적으로 재배된 야생형 보리 곡물은 대개 재배되는 품종에 따라 55-65% 범위의 전분 함량을 가진다. 대안적으로 본 발명의 종자 또는 곡물은 야생형 식물로부터의 곡물의 전분 함량에 비하여 적어도 90%의 전분 함량, 바람직하게 적어도 95%의 전분 함량을 가진다. 기타 바람직한 특성은 곡물 도정(mill) 성능, 특히 곡물 경도를 포함한다. 더 높은 가치의 식물을 만들 수 있는 다른 측면은 곡물로부터 프룩탄 또는 전분 추출물의 정도로서, 더 높은 추출율이 더 유용하며, 또는 단백질 함량, 아밀로펙틴에 대한 아밀로오스 비율, 또는 곡물 생성물의 식이 섬유 함량에도 기여하는 β-글루칸과 같은 기타 비전분 폴리사카라이드 함량이다. 곡물 형상 또한 식물의 상업적 유용성에 영향을 미칠 수 있는 다른 특징이므로, 곡물 형상은 곡물 도정 용이성 등에 영향을 미칠 수 있다.

전분은 표준 방법, 예를 들어 Schulman and Kammiovirta, Starch , 43: 387-389, 1991의 방법을 이용하여 본 발명의 곡물로부터 쉽게 분리될 수 있다. 산업적 규모로, 습식 또는 건식 도정을 이용할 수 있다. 전분립 크기는 더 큰 A 과립을 더 작은 B 과립으로부터 분리하는 전분 프로세싱 산업에서 중요하다.

식품

본 발명은 또한 본 발명의 식물 또는 곡물로부터 얻어지는 바람직하게 증가된 저항성 전분, 식이 섬유, 아밀로오스, β글루칸, 프룩탄 또는 기타 성분을 포함하는 생성물을 이용하여 제조되는 식품, 음료 또는 약학적 제제를 포함한다. 이러한 식품 제조는 가공된 곡물, 통밀, 가루, 반죽 또는 상업적 식품 제조의 성분이 될 수 있는 기타 생성물을 포함할 것이다. 저항성 전분, 식이 섬유, 아밀로오스, β-글루칸 또는 프룩탄을 함유하는, 본 발명의 곡물 또는 이로부터 유도되는 생성물을 인간 섭취를 위한 다양한 식품에 적용할 수 있다. 본원에 사용되는 "인간"은 호모 사피엔스(Homo sapiens)를 의미한다. 상기 곡물은 식품 가공 절차에 쉽게 사용될 수 있으며, 따라서 본 발명은 가루를 포함하여, 도정된, 제분된, 거칠게 빻은, 정맥 또는 압착된 곡물, 또는 본 발명의 식물의 가공된 또는 전곡으로부터 얻어지는 생성물을 포함한다. 이러한 생성물들은 그 다음 다양한 식품, 예를 들어, 아침식사용 시리얼, 빵, 케이크, 비스킷 등과 같은 전분질 식품, 또는 증점제 또는 결합제와 같은 식품 첨가제, 또는 음료, 국수, 파스타 또는 퀵 수프를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 곡물 또는 이로부터 유도되는 생성물은 아침식사용 시리얼 내에 또는 압출 생성물로서 특히 바람직하다. 전분 또는 기타 성분들을 마가린 또는 쇼트닝과 같은 지방 또는 오일 제품, 샐러드 드레싱, 마요네즈와 같은 난제품, 아이스크림, 요구르트 또는 치즈와 같은 유제품, 밀가루와 같은 곡류 제품, 과일 주스, 기타 식품 또는 식품 재료 내로 혼입되거나, 또는 전분 또는 기타 성분들이 음료 또는 빵, 케이크, 비스킷, 아침식사용 시리얼, 파스타, 국수 또는 소스와 같은 식품으로 가공될 수 있다. 프룩탄 또한 저칼로리 감미 제품으로 유용하다.

빵 내에서, 가루 또는 통밀 형태일 수 있는 프룩탄을 포함하는 성분들은 비변성 가루 또는 통밀의 10% (w/w) 이상, 바람직하게 적어도 30% 및 더 바람직하게 적어도 50%를 대체할 수 있다. 따라서, 배합은 가루 70부, 고-프룩탄 전분 30부, 지방 2부, 소금 2부, 개량제 1부, 효모 2.5부일 수 있다. 빵의 제조는 신속한 반죽 기술 또는 당업자에게 알려진 기타 기술에 의해서일 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 제품은 전분질 파스타 제품 내로 혼입될 수 있다. 파스타 조성물 내 사용되는 본 발명의 프룩탄의 양은 전분질 물질의 총 중량을 기준으로 5-20% (w/w), 특히 10-20% 범위일 수 있다. 적합한 기타 전분질 재료를 당업자가 용이하게 선택할 것이다. 기타 재료 또한 조성물, 예를 들어, 건조 또는 액상란 (난황, 난백 또는 이들 모두) 또는 우유 단백질 또는 어류 단백질과 같은 고단백 물질에 첨가될 수 있다. 비타민, 미네랄, 칼슘, 염, 아미노산, 디소듐 하이드로겐 포스페이트와 같은 완충제, 앙념, 검, 글루텐 또는 글리세릴 모노스테아레이트를 또한 첨가할 수 있다.

식용가능한 본 발명의 식물의 기타 부분을 인간 섭취용 식품 또는 동물 사료로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 잎, 줄기 또는 이들 중 어느 것으로부터의 본 발명의 세포를 포함하는 추출물 또는 부분들을 인간 또는 동물 섭취를 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 식물 및 그 부분들의 증가된 전분 저항성, 식이 섬유, 아밀로오스, β-글루칸 또는 프룩탄 함량은 예를 들어 돼지, 소, 말, 닭과 같은 가금, 및 기타 동물용 사료로서와 같은 동물 사료로서 이들 재료의 이용에 대한 이점을 제공할 것이다.

방법

본 발명의 제품 또는 화합물은 전형적인 약학 컴파운딩 기술에 따라 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A. 1990를 참조. 상기 조성물은 활성화제 또는 약학적으로 허용가능한 유도 활성화제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 활성 물질 중 하나에 부가하여, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 기타 당업계에 잘 알려질 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하며, 활성 성분의 효과를 간섭하지 않아야 한다. 상기 담체는 투여를 위하여 요구되는 제제 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다.

경구 투여를 위하여, 상기 화합물은 캡슐, 알약, 정제, 로젠지, 분말, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 고체 또는 액체 제제로 제제화될 수 있다. 경구 제형의 조성물 제조에 있어서, (예를 들어, 현탁액, 엘릭시르 및 용액과 같은) 경구 액상 제제의 경우, 예를 들어 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향미료, 방부제, 착색제, 현탁제 등과 같은 통상적인 약학 매질을 사용할 수 있거나; (예를 들어, 분말, 캡슐 및 정제와 같은) 경구 고체 제제의 경우, 전분, 슈가, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 담체를 사용할 수 있다. 투여의 용이함으로 인하여, 정제 및 캡슐은 가장 유리한 경구 단위 제형을 나타내며, 이 경우 고체 약학적 담체가 분명히 사용된다. 원하는 경우, 정제는 표준 기술에 의한 당의정 또는 장용정일 수 있다.

활성화제는 바람직하게 치료 유효량으로 투여된다. 투여되는 실제 양 및 투여 속도 및 시간-경과는 처리되는 상태의 특성 및 심각성에 따른다. 처방, 예를 들어, 투여량, 시기 등에 대한 결정은 일반적 의사 또는 전문가의 책임 범위 내이며, 전형적으로 치료되는 질병, 개별적 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 기타 의사에게 알려진 요인들을 고려한다. 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, ( supra )에서 찾을 수 있다.

상기 식품 또는 음료 또는 약학적 제제는 판매용으로 또는 대량으로 포장될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 식품, 음료 또는 약학적 제제의 제조 방법, 및 그러한 식품 또는 음료를 제조하기 위한 레시페 또는 지시를 제공한다. 상기 방법은 상기 식물 또는 식물 부분을 수확하는 단계, 기타 식물 부분으로부터 곡물을 분리, 파쇄, 추출, 도정, 조리, 캔으로 만드는 단계, 포장 또는 기타 당업계에 알려진 가공 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법 또는 레시페 또는 지시는 본 발명의 식물 제품을 가공하는 단계 및/또는 상기 혼합물 또는 제품을 적어도 100℃로 가열 또는 베이킹하는 것과 같이, 이를 기타 식품 성분과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 제품을 판매 준비가 되도록 포장하는 단계를 포함할 수 있다.

산업적 용도

상기 식물 생성물, 바람직하게 곡물은 예를 들어 에탄올과 같은 산업적 제품 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 이하 비-제한적 실시예에 의하여 추가로 기재된다.

실시예 1: 예시적 방법 및 재료

식물 재료

사용되는 보리 (Hordeum vulgare) 계통은 본원에서 sex6 -292 대립 유전자로 명명되는 SSIIa 돌연변이를 함유하는 모 품종 Himalaya292 (서열 번호 9 내지 11, Morell et al. 2003b (supra)), 및 품종 고아밀로오스 글래시어 (HAG, AC38로도 명명됨) 사이의 교배로 시작하는 역교배 집단으로부터 얻어진 것이다. 적합한 모 품종이 당업계에서 이용가능하다. HAG 품종 (고아밀로오스 글래시어, AC38로도 명명됨)은 예를 들어 CSIRO 또는 Australian Winter Cereals Collection, Tamworth, NSW로부터 이용 가능하다. 보리 식물의 교배를 표준 방법에 의하여 온실 내에서 수행하였다. 역교배 집단을 Himalaya 292 (수컷)으로부터 HAG (암컷)으로의 3 역교배 후 3 세대의 단주계통법 (SSD: single seed descent)을 통하여 발생시켰다. 세번째 역교배로부터의 종자를 BC3F1로 명명하였으며, 세번째 SSD로부터의 종자를 BC3F4로 명명하였다. 각각의 계통에 대한 종자의 양을 증가시키기 위하여, 2 또는 3 추가 세대를 발생시켰다. 이들을 BC3F6 또는 BC3F7 세대로 명명하였으며 본 연구에 이용하였다.

70 BC3F6 보리 계통을 2005년 CSIRO Plant Industry, Canberra에서 포트 내에서 그 외에는 자연조건 하에 재배시켰다. 선택된 종자 조성 및 패러미터를 확인하기 위하여, 종자 중량, 아밀로오스 함량 및 SSIIa 및 amo1 돌연변이 존재에 의하여 선택된 서브세트의 BC3F7 보리 계통을 2007년 CSIRO Plant Industry, Canberra에서 온실 내에서 자연광 및 온도 18℃ (밤) 및 24℃ (낮)에서, 또는 Yanco, New South Wales, Australia 밭에서 재배하였다.

이삭을 함유하는 지엽의 상부를 통하여 까락이 처음으로 나타난 후 개화 2일에 보리 이삭을 표지하였다. 발육 종자를 개화 후 (DPA) 20일에 수확하고, 배아 제거 후, 발육 배유를 절단 표면을 통하여 압출하고 -80℃에서 저장하였다.

기타 본원에 기재되는 품종들은 Australian Winter Cereals Collection, Tamworth, NSW, Australia로부터 또는 상업적으로 얻었다.

PCR 증폭에 의한 BC3F6 집단의 지노타이핑

역교배 집단의 BC3F6 세대로부터의 어린 밀 잎을 수집하고 동결 건조하였다 (냉동기 FTS 시스템, Stone Ridge, New York). 게놈 DNA를 공급자 지시에 따라 신속 DNA^R 키트로 분리하였다 (Q-BIOgene).

SSIIa 돌연변이의 지노타이핑을 위하여, Morell et al. 2003b (supra) 에 의하여 기재된 바와 같이 (또한 서열 번호 9 참조), SSIIa cDNA의 뉴클레오티드 1616에서 시작하는 프라이머 SSIIaF (5'-CCTGGAACACTTCAGACTGTACG-3' (서열 번호 3) 및 뉴클레오티드 2044에서 시작하는 프라이머 SSIIaR (5'-AGCATCACCAGCTGCACGTCCT-3' (서열 번호 4) ((GenBank no: AY133249) 를 Himalaya292의 뉴클레오티드 1829에서 SSIIa 돌연변위 부위에 걸치는 451 bp 생성물의 PCR 증폭을 위하여 사용하였다. 미위성체 PCR 마커 EBmac0501을 그것이 염색체 1H 상에서 68.0 cM에 위치하며 amo1 자리에 또한 68.0 cM으로 밀접하게 연결되므로 amo1 돌연변이의 검출을 위하여 사용하였다. 프라이머 HHac0501F (5' CACGACGTTGTAAAACGACACTTAAGTGCCATGCAAAG 3' (서열 번호 5) 및 HHac0501R (5' AGGGACAAAAATGGCTAAG 3' (서열 번호 6) (GrainGenes Database)를 amo1 자리로부터 PCR 단편의 증폭을 위하여 사용하였다.

20 ㎕, 50 ng 게놈 DNA의 각각의 PCR 반응을 위하여, 1.5 mM MgCl₂, 0.125 mM 각각 dNTP, 10 pmol 프라이머, 0.5 M 글리신 베타인, 1 ㎕ DMSO 및 1.5 U의 Hotstar Taq 폴리머라아제 (QIAGEN)를 사용하였다. HYBAID PCR 익스프레스 머신 (Intergrated Sciences)을 이용하여 95℃에서 5분 1 사이클, 94℃에서 45초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 35 사이클, 72℃에서 10분 1 사이클, 및 25℃ 1 분 1 사이클로 PCR 반응을 수행하였다. SSIIa 돌연변이 검출을 위하여 PCR 생성물을 제한 효소 NlaIV로 37℃에서 밤새 절단하였다. 절단된 ( SSIIa 돌연변이를 위하여) 및 비-절단된 (amo1 돌연변이를 위하여) PCR 단편 모두를 2% 아가로오스 겔 상에서 분리하고, GelRed (Biotium) 염색 후 겔 다큐멘터리 (UVitec)로 가시화하였다.

Himalaya292 x HAG 간의 역교배 보리 집단으로부터의 보리 계통의 지노타이핑을 위하여, 프라이머 SSIIaF 및 SSIIaR을 모 계통 Himalaya292로부터 SSIIa 돌연변이 검출을 위하여 앞서 기재한 바와 같이 사용하였으며, 미위성체 마커 EBmac0501을 모 계통 HAG로부터 amo1 자리 검출을 위하여 사용하였다. SSIIa 돌연변이에 대하여, NlaIV로 PCR 생성물 절단에 이은 겔 전기영동 후, 돌연변이된 및 야생형 SSIIa 대립 유전자를 구분하는 세 가지 유형의 PCR 단편 패턴이 분명하였다. 347 bp의 단일 DNA 단편은 돌연변이된 SSIIa 유전자의 존재를 나타내었으며, 단일 236 bp DNA 단편은 야생형 SSIIa 유전자의 존재를 나타내었으며, 347 bp 및 236 bp 단편 모두의 존재는 이형접합성 유전자형 계통을 나타내었다. HAG로부터 amo1 돌연변이에 대하여, EBmac0501 미위성체 마커는 또한 세 개의 PCR 단편화 패턴을 생산하였다. 167 bp 단편이 amo1 돌연변이로부터 검출되었으며, 141 bp 단편이 야생형 계통으로부터 검출되었으며, 167 bp 및 141 bp 단편 모두가 동형접합성 계통에서 검출되었다.

곡물 특성

성숙 식물로부터 곡물을 수확하였다. 달리 나타내지 않는 한, 평균 종자 중량을 100 종자를 3회 반복 칭량함으로써 결정하였다. 선택된 계통의 종자 중량을 또한 Yanco, NSW에서 BC3F7 밭에서 재배한 물질에 대하여 500 종자의 3회 반복 평균 종자 중량으로서 결정하였다. 곡물의 종자 수분 함량을 Oxford 4000 NMR Magnet (Oxford analytical instruments Limited)를 이용하여 표준 핵 자기 공명법 (NMR)에 의하여 측정하였다. 곡물 질감을 RACI Cereal Chemistry 공식 시험법 12-01를 이용하여 Single-Kernel 특성 분석 시스템 4100 (Perten Instruments Inc. Springfield, IL 62707 USA)를 이용하여 측정하였다. 종자의 풍만함을 세 가지 카테고리로 분류하였다: 수축됨, 반-불룩함, 불룩함.

보리 종자 단면의 현미경 검사 및 주사 전자 현미경법

보리 종자의 중심부의 횡단면 대략 1 mm 두께를 면도날로 절단함으로써 생산하고 사진 촬영하였다. 이들을 또한 금 입자로 코팅하고, 15 KV에서 작동하는 JSM-6400 주사 전자 현미경 (SEM)으로 검사하였다.

곡물 도정

곡물을 격렬한 밀(Cyclotec 1093, Tecator, Sweden)을 이용하여 0.5 mm 체를 통과할 통밀로 제분하였다. 상기 통밀을 이하 분석에 사용하였다.

β- 글루칸 및 펜토산 분석

β-글루칸 함량을 각각 3 반복 샘플에 대하여 20 mg 통밀을 이용하여 Megazyme Method (AACC32.23)에 기재된 바와 같이 분석하였다. 펜토산 함량을 각각 3 반복 샘플에 대하여 20 mg 통밀을 이용하여 Bell (1985)로부터의 방법을 이용하여 측정하였다.

전분 추출

프로테아제 추출법 (Morrison et al ., J Cereal Sci , 2: 257-271, 1984) 에 이은 물 세척 및 환원물(tailings) 제거에 의하여, 전분을 통밀로부터 분리하였다. 그 다음, 전분을 아세톤으로 세척하고 실온에서 공기 건조시켰다 (Konik-Rose et al., 2007 (supra)).

총 전분 분석

곡물의 총 전분 함량을 각각 3 반복 샘플에 대하여 20 mg 통밀을 이용하여 Megazyme 방법 (AACC76.13)에 기재된 바와 같이 분석하였다.

전분 조성 및 특성 분석

곡물의 전분 내 아밀로오스 및 아밀로펙틴 함량, 또는 아밀로오스 대 아밀로펙틴 비율을 다음과 같이 Sepharose CL-2B 겔 침투에 의하여 측정하였다 (겔 침투법). 대략 10 mg의 총 전분을 3.0 ml의 1M NaOH 내에 용해시키고, 크로마토그래피에 의하여 Sepharose CL-2B 컬럼 상에서 분자량을 기준으로 분류하였다 (Regina et al., Proc Natl Acad Sci USA , 103: 3546-3551, 2006). 컬럼으로부터의 각각의 분획 내 전분의 양을 공급자 지시에 따라 전분 분석 키트 (Sigma)를 이용하여 측정하였다 아밀로펙틴 (첫번째 피크, 고분자량) 및 아밀로오스 (두번째 피크, 저분자량)의 총 양을 계산하고 그 비율 또는 함량을 결정하였다.

대안적으로, 아밀로오스 함량을 소규모 (2 mg 전분) 요오드 흡착법 (Morrison and Laignelet, J Cereal Sci , 1: 9-20, 1983)을 이용하여 Konik-Rose et al., 2007 (supra)에 기재된 바와 같이 일부 변형시켜 측정하였다.

사슬 길이 분포

아르곤 레이저-유도 형광 (LIF) 검출을 이용하여 P/ACE 5510 모세관 전기이동 시스템 (Beckman Coulter, NSW Australia)를 이용하는 O'Shea et al ., Carbohydr Res , 307: 1-12, 1998 방법에 의하여, 전분 샘플의 탈분기 후 아밀로펙틴 사슬 길이 분포를 측정하였다. 동질 유전자의 비-변형 대조군으로부터의 전분에 대한 정규화된 분포로부터 변성 전분에 대한 정규화된 사슬 길이 분포를 감하여, 몰차 (molar difference) 곡선을 만들었다.

전분 샘플의 젤라틴화 온도 프로필을 Pyris 1 시차 주사 열 분석 (Perkin Elmer, Norwalk CT, USA)을 이용하여 측정할 수 있다. 전분 용액의 점도를 Batey et al ., Starch 48: 338-344, 1997에 의하여 보고된 조건을 이용하여, Rapid-Visco-Analyser (RVA, Newport Scientific Pty Ltd, Warriewood, Sydney) 상에서 측정할 수 있다. 측정될 수 있는 패러미터는 피크 점도 (최대 고온 페이스트 점도), 유지 강도, 최종 점도 및 페이스트화 온도를 포함한다. 페이스트화 특성을 신속 점도 측정계 (Rapid Visco Analyser)를 이용하여 다음과 같이 측정할 수 있다. 전분 (3.0 g)을 DSC 팬 내에서 증류수 (25.0 ml)에 첨가하고, RVA 작동 프로필은 50℃에서 2분, 95℃로 6분 동안 가열, 95℃에서 4분 동안 유지, 50℃까지 4분 동안 냉각, 50℃에서 4분 동안 유지이다. 측정되는 패러미터는 다음과 같다: 95℃에서 피크 점도, 95℃ 유지 기간 끝에 유지 강도, 브레이크다운 = 피크 점도 - 유지 강도, 50℃ 유지 기간 끝에 최종 점도, 셋백 = 최종 점도 - 유지 강도. 윈도우즈 버젼 2.2용 소프트웨어 Thermocline (Newport Scientific Pty Ltd, NSW Australia)를 데이터 수집 및 분석을 위하여 이용할 수 있다.

가루 또는 전분의 팽윤 부피를 Konik-Rose et al ., Starch - Starke , 53: 14-20, 2001의 방법에 따라 결정할 수 있다. 소정의 온도 (예를 들어, 90℃) 물 내에 가루 또는 전분 샘플 혼합 전후의 샘플 무게를 잰 후 젤라틴화 물질을 수집함으로써 물 흡수를 측정한다.

전분립 형태, 복굴절율 및 전분립 크기 분포

전분립 형태를 SEM (JSM-6400) 및 평관을 이용하는 광학 현미경에 의하여 검사하였다. 전분립의 형태 및 복굴절율을 Yamamori et al., 2000 (supra)에 기재된 바와 같이 검사하였다. 전분 슬러리의 입자 크기 분포 (부피 기준)를 레이저 회절 방식 입도 크기 분석기 (Mastersizer 2000, Malvern Instruments, Malvern, England)를 이용하여 측정하였다. 작은 B-타입 전분립의 백분율을 7 ㎛의 컷오프 직경을 이용하여 결정하였다.

지질 분석

총 지질 함량을 Oxford 4000 NMR Magnet, Oxford Analytical Instruments Limited, UK를 이용하여 NMR에 의하여 분석할 수 있다. 각각의 샘플에 대하여 1 g의 종자를 38.8℃에서 64 시간 동안 건조시킨다. 그 다음, 건조된 종자를 NMR을 이용하여 측정하고 cv. Himalaya 또는 M292 곡물로부터의 순수 보리 오일 대조군에 대하여 비교한다.

단백질 함량, 지질 함량, 수분 함량 및 회분 함량

자동화 질소 및 탄소 분석기 제조 시스템을 구비하는 Europa 20-20 동위 원소비 질량 분석기를 이용하여 질량분석법에 의하여 질소 함량을 측정하여 단백질 함량을 결정하였다. 3 내지 8 mg의 보리 통밀을 사용하였다. 보리 종자 내 단백질 함량 계산을 위하여 질소에서 단백질 전환 계수 6.25를 이용하였다 (Mosse 1990). 지질 함량, 수분 함량 및 회분 함량을 AOAC 983.23 방법, AACC 방법 44-19 및 AACC 방법 08-01을 이용하여 측정하였다.

총 식이 섬유 분석

Prosky et al. (1985; AOAC 985.29) 의 중량 측정법을 이용하여 통밀의 총 식이 섬유 (TDF)를 측정하였다. 2 샘플을 분석하였다.

비전분 폴리사카라이드 분석

총 중성 비전분 폴리사카라이드 (NSP)를 Theander et al ., J AOAC Int 78: 1030-1044, 1995의 기체 크로마토그래피 절차를 변형시켜 측정하였다. 상기 변형은 1 M 황산으로 2-시간 가수분해에 이어 원심분리에 의하여 불용성 NSP 제거, 및 가용성 NSP에 대한 2 M 트리플루오로아세트산을 이용하여 추가적인 상청액의 가수분해를 포함하였다.

저항성 전분 분석

시험관 내 절차를 이용하여 저항성 전분 (RS) 함량을 측정하였다. 이 방법은 두 단계를 가진다: 첫번째로, 각각의 샘플 내에 전분을 모의 생리 조건 하에 가수분해하였다; 두번째로, 부산물을 세척을 통하여 제거하고, 샘플의 균질화 및 건조 후 잔여 전분을 측정하였다. 소화 처리 끝에 정량된 전분은 그 샘플의 저항성 전분 함량을 나타냈다. 전형적으로, 적절한 표준과 함께 통밀의 3 반복 샘플을 인공타액과 혼합하고, 결과 생성되는 볼루스를 생리적 pH 및 온도에서 췌장 및 위 효소와 함께 인큐베이션하였다. 소화물 내 잔류 전분의 양을 통상적인 효소 기술 및 분광 광도법을 이용하여 측정하고, 샘플의 저항성 전분 함량을 샘플 중량 또는 총 전분 함량의 백분율로서 나타내었다.

1일째에, 500 mg 이하의 탄수화물을 나타내는 생플의 양을 125 mL 삼각 플라스크 내로 칭량하였다. 121 mg의 NaHCO₃ 및 157 mg의 KCl를 대략 90 mL 정제수 내에 용해시키고, 159 μL의 1 M CaCl₂.6H₂O 용액 및 41 μL의 0.49 M MgCl₂.6H₂O을 첨가하고, 0.32 M HCl로 pH를 7 내지 7.1로 조정하고, 부피를 100 mL로 조정함으로써 탄산염 완충액을 제조하였다. 상기 완충액을 4℃에서 5 일 이하 동안 저장하였다. 탄산염 완충액 mL 당 250 단위의 α-아밀로오스를 함유하는 인공 타액 용액 (돼지 췌장으로부터 Sigma A-3176 Type VI-B) 을 제조하였다. 식품의 중량과 거의 동등한 인공 타액 용액의 양을 상기 플라스크에 첨가하였다. 타액 첨가 후 약 15-20 초 후에, HCl (0.02 M HCl 내 1 mg/mL 펩신 (Sigma), pH 2.0, 사용일에 제조됨) 내 5 mL의 펩신 용액을 각각의 플라스크에 첨가하였다. 아밀라아제에 이은 펩신의 혼합은 인간이 샘플을 삼키기 전에 그것을 씹는 것과 유사하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 30 분 동안 85 rpm에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 그 다음, 상기 혼합물을 0.02M NaOH 5 mL로 중화하였다. 아세트산염 완충액 25 mL (0.2 M, pH 6) 및 아세트산염 완충액, pH 6 내 2 mg/mL 판크레아틴(Sigma, 4x USP 활성의 돼지 췌장) 및 아스퍼질러스 나이거로부터의 28U의 아밀로글루코시다아제 (AMG, Sigma)를 함유하는 판크레아틴 효소 혼합물 5 mL를 플라스크 당 첨가하였다. 각각의 플라스크를 알루미늄 호일로 캐핑하고, 85 rpm으로 설정된 왕복 수욕 내에서 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다.

2일째에, 각각의 플라스크의 내용물을 50 mL 폴리프로필렌 튜브로 정량적으로 이동시키고, 실온에서 10 분 동안 2000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 각각의 펠릿을 20 mL 물로 3회 세척하고, 각각의 세척물과 함께 가볍게 와류시켜 펠릿을 분해한 후, 원심분리하였다. 50 uL의 최종 수 세척물을 글루코오스 Trinder 시약을 이용하여 자유 글루코오스의 부재에 대하여 시험하였다. 그 다음, 각각의 펠릿을 정제수 대략 6 mL 내에 재현탁시키고, S25N-8G 분산 도구를 구비하는 Ultra Turrax TP18/10를 이용하여 10 초 동안 3회 균질화하였다. 내용물을 25 mL 부피 플라스크로 정량적으로 이동시키고 부피를 맞추었다. 상기 내용물을 완전히 혼합하고 폴리프로필렌 튜브로 되돌렸다. 각각의 현탁액 5 mL 샘플을 25 mL 배양관으로 이동시키고, 즉시 액체 질소 내에서 겉을 동결시키고 동결 건조하였다.

3일째에, 각각의 샘플 내 총 전분을 Megazyme 총 전분 절차 키트 내에 공급되는 시약을 이용하여 측정하였다. 전분 표준 (표준 옥수수 전분, Sigma S-5296) 및 분석 시약 블랭크를 제조하였다. 샘플, 대조군 및 시약 블랭크를 80% 에탄올 0.4 mL로 습윤시켜 분산을 보조한 후, 와류시켰다. 즉시, DMSO 2 mL를 첨가하고, 용액을 와류 혼합하였다. 상기 튜브를 비등수 내에 5 분 동안 놓고, MOPS 완충액 (pH 7, 5 mM CaCl₂ 및 0.02% 아지드화나트륨 함유) 내 열안정성 α-아밀라아제 (100 U/ml) 3 mL를 즉시 첨가하였다. 용액을 비등수욕 내에서 추가적으로 12 분 동안 3분 간격으로 와류 혼합하면서 인큐베이션하였다. 그 다음, 튜브를 50℃ 수욕 내에 놓고, 아세트산나트륨 완충액 4 mL (200 mM, pH 4.5, 아지드화나트륨 0.02% 함유) 및 아밀로글루코시다아제 0.1 mL를 300 U/ml로 첨가하였다. 상기 혼합물을 50℃에서 30 분 동안 10분 간격으로 가볍게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 부피를 부피 플라스크 내에서 25 mL로 맞추었고 잘 혼합하였다. 분취량을 2000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 50 μL 상청액 내 글루코오스 양을 1.0 mL 글루코오스 Trinder 시약을 이용하여 측정하고, 튜브를 실온에서 어두운 곳에서 최소 18분 최대 45분 인큐베이션한 후 505 nm에서 흡광도를 측정하였다.

수용성 탄수화물 함량의 정량

총 수용성 탄수화물 (WSC)을 다음과 같이 변형된 Lunn and Hatch, Planta 197: 385-391, 1995의 방법에 따라 통밀로부터 추출하였다. 통밀은 본원에서 연이은 분별 (예를 들어, 체질)에 의하여 겨를 제거함이 없이, 성숙 곡물을 도정함으로써 얻어지는 생성물로서 정의된다. 따라서, 통밀은 곡물 내 모든 성분을 함유한다.

보리 통밀 (100 mg)을 비등수욕 내에서 10 분 동안 80% 에탄올 (v/v) 10 ml로 3회 추출하였다. 각각의 추출물로부터의 상청액을 결합하고, 동결 건조하고, 2 ml milliQ 물 내에 재현탁시켰다. 수크로오스, 글루코오스 및 프룩토오스의 양을 Campbell et al ., J Sci Food Agric 79: 232-236, 1999; Ruuska et al ., Funct Plant Biol 33: 799-809, 2006에 기재된 바와 같이 비색 미세적정판 효소 분석을 이용하여 측정하였다. 슈가, 말토오스 및 프룩토-올리고사카라이드 (프룩탄)을 또한 Ruuska et al., 2006 (supra)에 기재된 바와 같이 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC)에 의하여 분석하였다. 두 방법 모두 유사한 값을 나타냈다.

말토오스 수준을 측정하기 위하여, 보리 통밀로부터 추출된 총 슈가를 실질적으로 Bernfeld, 아밀라아제 알파 및 베타에 기재된 바와 같이 분석하였다. Colowick 및 Kaplan (eds), Methods in enzymology, Academic, NY, p. 149, 1955에서, 다음과 같이 비교를 위한 말토오스 표준 용액을 사용한다. 총 슈가를 10 내지 100 배 희석한다. 말토오스 표준 (10튜브)을 ml 당 0.3 내지 5 마이크로몰로 제조하였다. 각각의 말토오스 희석액 (총 슈가 또는 말토오스 희석액 내) 1 ml를 디니트로살리실산 발색제와 혼합하였다. 그 다음, 슈가 용액을 100℃에서 5 분 동안 인큐베이션하고 실온으로 냉각시켰다. 10 ml의 시약 등급수를 각각의 튜브에 첨가하고 잘 혼합하였다. 상기 샘플을 분광광도계를 이용하여 A₅₄₀에서 측정하였다. 말토오스를 또한 앞서 기재한 바와 같이 HPAEC에 의하여 측정하였다.

효소 분석

곡류의 발육 배유와 같은 샘플 내 총 전분 합성효소 활성을 Libessart et al. Plant Cell . 7(8): 1117-1127, 1995 또는 Cao et al ., Plant Physiol . 120(1): 205-16, 1999에 기재된 바와 같은 단백질 추출 및 분석에 의하여 측정할 수 있다. 상기 분석은 14^C 표지된 ADPG 기질을 이용하며, 전분 폴리머 내로의 모노머의 혼입을 측정한다. 추출물 내 전분 합성효소 개별 이소폼을 겔 전기영동에 의하여 분리하고 다음과 같이 겔-내 (지모그람) 분석할 수 있다. 발육 종자와 같은 샘플로부터의 추출물을 50mM 인산칼륨 완충액, pH 7.5, 5mM EDTA, 20% 글리세롤, 10 μM Pefabloc 및0.05mM 디티오쓰레이톨 (DTT)를 이용하여 제조할 수 있다. 종자를 완충액 내에서 펄프로 제분하거나 상기 샘플을 균질화한 후, 상기 혼합물을 14,000g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 빼낸다. 상청액 내 단백질 농도를 Coomassie 단백질 시약 또는 기타 표준 수단을 이용하여 측정할 수 있다. 단백질 추출물을 생 겔(native gel) 상에서 작동하고자 하는 경우, 추출물을 -80℃에서 저장할 수 있다. 겔 전기영동 변성을 위하여, 추출물 100㎕를 SDS 및 β-머캅토에탄올과 혼합하고, 상기 혼합물을 비등수 내에서 4 분 동안 인큐베이션하여 단백질을 변성시킨다. 4.5% 폴리아크릴아미드 스택킹 겔과 오버레이된 8% 폴리아크릴아미드 분리 겔을 이용하여 표준 변성 폴리아크릴아미드 겔 내에서 전기 영동을 수행한다. 전기영동 후, 상기 겔을 40 mM Tris-HCl 완충액 내에 최소 2 시간 동안 담그고, 30분마다 완충액을 교체하고 각각의 완충액 교체에 대하여 적어도 100mL 완충액을 사용함으로써, 단백질을 재생시킬 수 있다. 비-변성 겔에 대하여, SDS 및 β-머캅토에탄올을 이용하는 변성 단계를 생략하고, 겔로부터 SDS를 생략한다. Tris-글리신 (25 mM Tris, 0.19 M 글리신), 0.133 M 암모늄 설페이트, 10 mM MgCl₂, 670㎍/mL BSA 및 1 mM A에ㅎ 기질을 포함하는 전분 합성효소 분석 완충액을 이용하여 전분 합성 효소 밴드를 검출한 후, 2% KI, 0.2% I₂ 요오드 용액으로 염색하여 전분 생성물을 검출할 수 있다.

대안적으로, 전분 합성효소 또는 기타 전분 생합성 효소를 특이 항체 (ELISA)를 이용하여 샘플 내에서 검출할 수 있다.

유전자형과 종자 선분 또는 전분 특성 간의 상관관계에 대한 통계학적 분석

Genstat 버젼 9를 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 종자 중량, 총 전분 함량, 아밀라아제 함량, 베타-글루칸 함량, 슈가 함량, 전분립 크기 및 아밀로펙틴 사슬 길이 분포에 대하여 분산 분석을 수행하여, 최소 유의차 (LSD, P < 0.05)를 구하여, 유전자형 간의 분산을 검토하였다.

실시예 2: 식물 지노타이핑

sex6 -292 공여체 계통 (Himalaya292)으로부터 amo1-AC38 반복친 내로 3 역교배를 수행함으로써, SSIIa 및 amo1 자리에서 돌연변이 존재 또는 부재에 대하여 분리한 계통의 집단을 생성하였다. 전분 합성 및 곡물 조성물에 대한 sex6 및 amo1 자리의 단독 및 조합한 상대적 영향을 조사하기 위하여 충분한 고정된 유전자형을 생성하기 위하여, BC3F2 계통으로부터 3 세대의 단주계통법 (single seed descent)을 수행하였다. SSIIa 유전자 내 원인 돌연변이를 이용하여 BC3F6 계통 내 sex6 자리를 지노타이프하였으며 (Morell et al. 2003b (supra)), 밀접하게 연결된 미위성체 마커 EBmac0501을 실시예 1에 기재된 바와 같이 amo1-38 위치의 대리 마커로 사용하였다.

지노타이핑된 70 BC3F6 계통 중에, 14 계통이 sex6-292 및 amo1-AC38 대립 유전자 모두에 대하여 동형 접합성이었으며(sex6-292/amo1-AC38), 따라서 SSIIa-amo1 이중 돌연변이로서 간주되었고, 17 계통이 sex6-292 및 야생형 amo1-대립 유전자에 대하여 동형 접합성이었으므로(sex6-292/amo1-wt) SSIIa 단일 돌연변이로 지정되었으며, 10 계통이 야생형 sex6 및 돌연변이 amo1-AC38 대립 유전자에 대하여 동형 접합성이었으므로(sex6-wt/amo1-AC38) amo1 단일 돌연변이로 지정된 반면, 15 계통은 sex6 및 amo1 모두에 대하여 야생형이었으며 (sex6-wt/amo1-wt) 야생형으로 지정되었다. 나머지 계통들은 sex6 돌연변이 (7 계통) 또는 EBmac0501 마커에 대하여 이형 접합성이었다.

HAG와 Himalaya292 모 계통 간에 다형성인 SSIIIa 유전자에 대한 DNA 마커 (실시예 3)을 또한 이용하여 56 동형 접합성 계통들을 지노타이프하였다. 이러한 분석은 26 계통 내에 HAG로부터 SSIIIa 유전자, 30 계통 내에 Himalay292로부터 SSIIIa 유전자의 존재를 보였다. EBmac0501 및 SSIIIa 유전자 마커를 이용하여 지노타이프된 56 계통 중, 5 계통은 재조합 유전자형을 보였다. 종자의 풍만함 및 전분 함량을 포함하는 표현형과 유전자형이 상관관계가 있을 때, EBmac0501로 지노타이프된 4 계통 및 SSIIIa 유전자 마커로 지노타이프된 1 계통은 재조합 표현형을 제공하였다. 이는 마커와 amo1 자리 간의 일부 재조합이 있어 전분 표현형을 제공함을 나타내며, 또한 amo1 유전자와 SSIIIa 유전자가 보리 내에서 근접하여 연결되더라도 유전자적으로 구분됨을 나타냈다.

피맥(hulled) 또는 나맥(hulless) 표현형에서 모 품종 또한 상이하였다 - HAG는 피맥 품종이며 Himalaya282는 나맥이다. SSIIa - amo1 이중 돌연변이는 이러한 특성에 대하여 구분되며, 따라서 두 개의 하위 그룹 - 피맥 또는 나맥으로 분류될 수 있다. 따라서, 상기한 바와 같이 구분되는 보리 계통의 네 개의 유전자형을 다섯 개의 군으로 분류하였다: 야생형 계통, SSIIa 단일 돌연변이, amo1 단일 돌연변이, 나맥 이중 돌연변이 및 피맥 이중 돌연변이. 전분립 분포, WSC, CE 및 종자 형태 분석을 위하여 다섯 개의 군 각각으로부터 네 계통을 사용하였다. 각각의 유전자형으로부터 하나의 계통을 배유 구조 및 전분립 형태에 대하여 사용하였다. 11 야생형 계통, 9 계통의 amo1 돌연변이, 13 계통의 SSIIa 돌연변이, 4 계통의 나맥 이중 돌연변이 및 6 계통의 피맥 이중 돌연변이를 다음과 같이 곡물 조성, 아밀로오스 함량 및 종자 중량 분석을 위하여 사용하였다.

종자 중량

BC3F6 집단으로부터 동형접합성 계통에 대하여 평균 종자 중량 (100 종자 중량의 평균)을 측정하였다. 11 야생형 계통에 대하여 평균 종자 중량은 52.7±5.0 mg이었으며, 9 amo1 계통에 대하여 52.8±2.8 mg이었으며, 13 SSIIa 돌연변이 계통에 대하여 38.7±2.5 mg이었으며, 6 피맥 이중 돌연변이 계통에 대하여 47.6±4.5 mg이었으며, 4 나맥 이중 돌연변이 계통에 대하여 44.7±1.0 mg이었다. amo1 돌연변이 계통과 야생형 계통의 종자 중량 간에 통계학적으로 유의한 차이는 없었으며 (P < 0.05), 이는 amo1 돌연변이가 종자 중량에 영향을 미치지 않았음을 보이는 것이다. 그러나, SSIIa 단일 돌연변이와 이중 돌연변이 (피맥 및 나맥) 각각과 세 개의 각각 다른 유전자형 각각 사이에 통계학적으로 유의한 차이가 있었다(P<0.05). 2007년 상기 계통들의 별도의 온실 및 밭 시험에서 BC3F7 집단에 대하여 4 유전자형의 종자 중량에 대한 유사한 관찰이 또한 얻어졌다. 놀랍고 예기치 않은 결과는, SSIIa 활성 부재하에 감소된 아밀로펙틴 합성으로 인한 것으로 알려져 있는, SSIIa 돌연변이의 존재에 의하여 야기되는 감소된 종자 중량이 amo1 돌연변이와의 조합에 의하여 부분적으로 상쇄되었다는 것이다.

종자 형태

각각의 유전자형에 대한 네 개의 대표적인 계통으로부터 미손상 종자를 배면 및 접힌 면 모두에 대하여 입체 현미경으로 검사하였다. SSIIa 단일 돌연변이 계통은 수축된 종자를 생산한 반면, 야생형 및 amo1 단일 돌연변이 계통은 불룩하고 잘 채워진 종자를 생산하였다. 이중 돌연변이 종자는 피맥 및 나맥 모두 SSIIa 돌연변이 종자보다 풍만하나 amo1 및 야생형 종자처럼 잘 채워지지 않은 중간 표현형을 가지는 것으로 관찰되었다. 이러한 관찰은 종자 중량과 일치하는 것이었다.

이들 유전자형으로부터 종자의 풍만함 특성을 추가적으로 예시하기 위하여, 최대 직경을 가로지르는 종자의 중심부의 횡단면을 검사하였다 (도 1). 야생형 및 amo1 돌연변이 계통으로부터의 횡단면은 완전히 채워진 배유를 보인 반면, SSIIa 돌연변이 계통은 배유 충전 밀도의 상당한 감소와 함께 불완전하게 채워진 (줄어든) 종자를 보였다. SSIIa - amo1 이중 돌연변이 계통은 SSIIa 돌연변이 배유보다 더 채워지나 야생형 또는 amo1 돌연변이 계통보다 덜 채워진 중간 표현형을 보였다.

고배율 검사를 위하여, 모든 유전자형으로부터의 보리 종자의 횡단면을 주사 전자 현미경 (SEM)으로 검사하였다. 배면에서 단면의 표면상에, 야생형 보리 곡물은 분화된 하위 호분 세포층을 가지는 대략 20-25 ㎛ x 20-25 ㎛ 크기의 사각형의 호분 세포층을 보였으며, 배유는 대략 210 ㎛ x 130 ㎛의 분명한 세포 경계를 가지는 편평하고 둥근 세포로 채워져 있었다. sex6-wt/amo1-AC38 돌연변이체의 경우, 호분 세포는 대략 20-25 ㎛ x 10-15 ㎛ 크기의 직사각형이었다. 하위 호분 세포는 분명히 구분되었으며, 배유는 대략 230 ㎛ x 30 ㎛ 크기로 야생형 계통으로부터의 것들보다 더 길고 더 좁은 분명한 세포 경계를 가지는 편평한 세포를 함유하였다. sex6-292/amo1-wt 돌연변이체는 45-50 ㎛ x 5-10 ㎛ 크기의 불규칙한 직사각형 호분 세포를 나타냈으며, 하위 호분 세포는 분명히 구분되지 않았고, 배유는 90-95 ㎛ x 25-30 ㎛ 크기의 불규칙한 세포를 함유하였다. sex6-292/amo1-AC38 이중 돌연변이 유전자형의 경우, 호분 세포는 대략 20 ㎛ x 20 ㎛ 크기 및 거의 사각형이었고, 하위 호분 세포는 잘 구분되지 않아 확인될 수 없었으며, 배유는 대략 110 ㎛ x 90 ㎛의 분명한 경계를 가지는 편평하고 둥근 세포를 함유하였다.

총 전분 함량

총 전분 함량을 BC3F6 종자에서 네 가지 유전자형에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 전분 함량은 야생형 계통의 경우 평균 64.3±2.4%인 반면, amo1 돌연변이 계통의 경우 57.2±2.8%, SSIIa 돌연변이 계통의 경우 34.9±4.0%, 나맥 이중 돌연변이 계통의 경우 50.8±2.8%, 및 피맥 이중 돌연변이 계통의 경우 47.6±2.3%였다 (도 2). 야생형 계통과 비교하여, amo1 돌연변이체, 나맥 이중 돌연변이체, 피맥 이중 돌연변이체 및 SSIIa 돌연변이체는 각각 7.1%, 13.5%, 16.7% 및 29.4% 적은 총 전분을 함유하였다. 이러한 값들은 나맥 및 피맥 군에 대한 값이 통계학적으로 차이가 있지 않았음을 제외하고, 다섯 개의 군 중에서 통계학적으로 차이가 있었다 (P<0.05). 또한, 상기 다섯 개의 군의 종자 중량 간의 일치하는 상관 관계가 2007년 별도의 온실 및 밭 시험으로부터의 BC3F7 곡물에 대하여 얻어졌다 (P<0.05). 이러한 데이터는 SSIIa 단일 돌연변이 종자와 비교하여 SSIIa - amo1 이중 돌연변이 종자에 대하여 관찰된 증가된 종자 중량은 증가된 전분 함량으로 인한 것임을 보였다.

아밀로오스 함량

네 개의 유전자형으로부터의 모든 계통에 대하여 아밀로오스 함량을 측정하였다. 아밀로오스 함량은 야생형 계통의 경우 32.0±3.2%, amo1 돌연변이체의 경우 49.5±2.7%, SSIIa 돌연변이 계통의 경우 57.6±10.0%, 나맥 이중 돌연변이의 경우 62.2±4.1%, 및 피맥 이중 돌연변이의 경우 59.8±2.3%였다. 통계학적 분석은 SSIIa 돌연변이 계통 및 이중 돌연변이 계통이 amo1 돌연변이체 및 야생형 계통으로부터의 것들보다 종자 내 유의하게 더 높은 아밀로오스 함량을 함유하나, SSIIa 돌연변이체 및 이중 돌연변이체는 유의하게 다르지 않았음을 (P<0.05) 보였으며, 이는 SSIIa 돌연변이가 곡물의 총 전분 내 아밀로오스 비율을 증가시키고 있으나 amo1 돌연변이의 첨가는 아밀로오스 비율을 추가로 유의하게 증가시키지 않았음을 나타내는 것이다. 유전자형 간의 이러한 아밀로오스 함량 차이는 2007년에 재배한 BC3F7 계통과 일치하는 것이었다.

전분 사슬 길이 분포

전분 사슬 길이 분포에 대한 유전자형의 영향을 조사하기 위하여, bc3f6 교배 집단의 각각의 군으로부터의 네 계통으로부터 전분을 분리하고, 형광단 보조 탄수화물 전기영동 (FACE: Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis)에 의하여 분석하였다. 사슬의 백분율을 DP 6-8, DP 9-14, DP 15-24, DP 35-34, DP 35-44, 및 DP >45로 이루어진 bins 내로 풀링하였다. SSIIa 돌연변이체, 나맥 이중 돌연변이 및 피맥 이중 돌연변이에 대한 bins 중에 통계학적으로 유의한 차이가 없었다 (P<0.05). 그러나, 돌연변이 SSIIa 대립 유전자를 함유하는 군과 비교하여 야생형 SSIIa 대립 유전자를 함유하는 군들 간에 주요한 차이가 있었다 (P<0.05). SSIIa 돌연변이 인자를 가지는 유전자형들은 증가된 비율의 DP6-8 사슬 (이 크기의 사슬이 10% 이상)을 함유하였으며, 또한 증가된 비율의 DP 9-14 사슬을 함유하였다. 이들은 또한 감소된 비율의 DP15-24 사슬을 나타냈다. 야생형 계통은 5% 미만의 DP6-8 사슬 길이를 가졌다. amo1 돌연변이체는 통계학적으로 유의하게 감소된 양의 DP9-14 및 증가된 양의 DP15-24를 함유하였다.

전분립 크기 분포

배유 전분 내 전분립 크기에 대한 sex6 및 amo1 유전자형의 영향을 조사하기 위하여, BC3F6 역교배 집단의 각 군으로부터의 네 개의 선택된 계통에 대하여 전분립 크기 분포를 조사하였다. 결과는 야생형, amo1 돌연변이체, SSIIa 돌연변이체, 나맥 이중 돌연변이체 및 피맥 이중 돌연변이체 내 B 전분립 (< 7 ㎛ 직경으로서 정의됨) 함량이 각각, 각 계통 내 총 전분의 20.2±6.4%, 30.7±3.6%, 17.5±1.8%, 19.7±3.6% 및 18.3±7.2%임을 보였다. amo1 돌연변이 종자는 기타 네 군으로부터의 종자보다 유의하게 더 많은 B 전분립을 함유하였다.

직경이 10 ㎛ 보다 큰 (A 전분립) 분포 피크의 평균 전분립 크기를 또한 평가하였다. A 전분립의 평균 크기는 야생형 계통의 경우 18.9±0.5 ㎛, amo1 돌연변이체의 경우 10.9±0.3 ㎛, SSIIa 돌연변이체의 경우 16.4±2.6 ㎛, 나맥 이중 돌연변이의 경우 18.7±0 ㎛, 및 피맥 이중 돌연변이의 경우 17.5±0.6 ㎛였다. 통계학적 분석은 amo1 돌연변이 종자가 다른 네 군의 보리 각각으로부터의 종자보다 유의하게 작은 A 전분립을 함유하였음을 보였다 (P<0.05). 야생형, SSIIa 돌연변이체, 나맥 이중 돌연변이체 및 피맥 이중 돌연변이체의 종자 내 A 전분립 사이에 통계학적으로 유의한 차이가 없었다 (P<0.05).

전분립 형태

다섯 군으로부터의 계통으로부터의 정제된 보리 전분을 요오드로 염색하고 통상적인 광학 현미경 하에 검사하였다. 그들의 아밀로오스 함량과 일치하여, 모든 유전자형으로부터의 전분립은 요오드로 염색 후 보라색을 나타냈다. 편광 현미경 하에, 야생형 종자 및 amo1 종자로부터의 90% 이상의 전분립이 결정성 전분립의 "말토오스 교배" 복굴절율 신호를 보였다. 그러나, SSIIa 돌연변이 또는 이중 돌연변이 종자로부터의 전분립의 10% 미만이 이러한 복굴절율을 나타냈다.

SEM 하에 관찰하였을 때, 야생형 계통으로부터의 곡물은 통상적인 구형 전분립을 나타낸 반면, amo1 돌연변이 유전자형은 더 작은 구형 A 전분립을 나타냈으며, 이는 앞서 기재한 분석의 결과와 매치되는 것이다. SSIIa 및 이중 돌연변이 종자로부터의 전분은 주로 더 작은 변형된 전분립을 보였다. 변형 전분립을 나타내는 두 개의 돌연변이체 중에서, SSIIa 돌연변이 계통은 관형의 연장된 A 전분립 (26 ㎛ x 12 ㎛)을 생산한 반면, 나맥 이중 돌연변이 종자는 A 전분립의 더 확연한 관형 연장을 나타냈다 (28 ㎛ x 21 ㎛).

배유 매트릭스 내 전분립의 위치를 보리 종자의 횡단면 내에서 검사하였다. 야생형 계통은 복수의 작은 B 전분립을 둘러싸는 복수의 편평한 구형 전분 A 과립을 함유하는 반면, amo1 돌연변이 계통은 더 작은 B 전분립을 둘러싸는 복수의 느슨하게 충전된 전분립을 함유하였다. SSIIa 돌연변이 종자에 대하여 그 횡단면에서 전분립이 분명히 확인될 수 없었다. 속 이중 돌연변이 계통은 배유 세포 내 빽빽하게 충전된 렌즈형 전분 A 과립을 함유하였다.

베타- 글루칸 함량

BC3F6 집단으로부터의 모든 계통에 대하여 베타-글루칸 함량을 측정하였다. β-글루칸 함량은 야생형 계통의 경우 6.0±0.5% (5.3% 내지 7.0% 범위), amo1 돌연변이 계통의 경우 8.2 ±0.5% (7.6% 내지 8.4% 범위), SSIIa 돌연변이체의 경우 7.6±1.4% (5.9% 내지 11.3% 범위), 나맥 이중 돌연변이의 경우 7.1±0.4%, 및 피맥 이중 돌연변이의 경우 6.5±0.8% (5.5% 내지 7.7%)였다. 통계학적 분석은 amo1 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 나맥 이중 돌연변이 종자가 야생형 계통 및 피맥 이중 돌연변이 계통으로부터의 종자보다 유의하게 더 많은 β-글루칸을 함유하나 (P<0.05), amo1 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 나맥 이중 둘연변이 계통 간에, 또는 야생형과 피맥 이중 돌연변이 종자 간에 β-글루칸 함량에 있어서 통계학적으로 유의한 차이가 없음을 보였다.

온실 또는 밭 조건 하에 재배된 다섯 군으로부터의 선택된 F7 계통에 대한 통계학적 분석은 각각의 시험에 있어서 amo1 돌연변이 계통으로부터의 종자는 이중 돌연변이 계통으로부터의 종자보다 많은 β-글루칸을 함유함을 보였다. SSIIa 돌연변이 또는 이중 돌연변이 종자 간에 β-글루칸 함량에 있어서 유의한 차이는 없었다.

펜토산 함량

다섯 군으로부터의 계통에 대하여 펜토산 함량을 측정하였다. 펜토산 함량은 야생형 계통의 경우 4.9±0.6%, amo1 돌연변이 계통의 경우 4.9±1.1%, SSIIa 돌연변이체 계통의 경우 7.3±1.4%, 나맥 이중 돌연변이의 경우 5.0±0.3%, 및 피맥 이중 돌연변이의 경우 6.5±1.0%였다. 통계학적 분석은 SSIIa 돌연변이 계통 및 피맥 이중 돌연변이 계통 모두 야생형 계통, amo1 돌연변이 및 나맥 이중 돌연변이 계통으로부터의 것보다 유의하게 더 많은 펜토산을 함유하나 (P<0.05), SSIIa 돌연변이 계통과 피맥 이중 돌연변이 또는 야생형 계통, amo1 돌연변이 및 나맥 이중 돌연변이 계통 사이에 펜토산 함량에 있어서 유의한 차이는 없음을 보였다.

회분 함량

다섯 군의 종자에 대하여 회분 함량을 측정하였다. 회분 함량은 야생형 종자의 경우 2.5±0.1%, amo1 돌연변이 종자의 경우 2.6±0.2%, SSIIa 돌연변이체 종자의 경우 3.1±0.3%, 나맥 이중 돌연변이 종자의 경우 2.1±0.1%, 및 피맥 이중 돌연변이의 경우 2.7±0.1%였다. SSIIa 돌연변이 종자는 유의하게 더 많은 회분을 함유하였으며, 나맥 이중 돌연변이 종자는 야생형, amo1 돌연변이 또는 피맥 이중 돌연변이 종자보다 유의하게 더 적은 회분을 함유하였으나, 야생형 계통, amo1 돌연변이 계통 및 피맥 이중 돌연변이 계통 간에 회분 함량에 있어서 유의한 차이는 없었다.

수용성 탄수화물

보리 종자 내 수용성 탄수화물 함량에 대한 돌연변이 단독 또는 조합의 영향을 측정하기 위하여, 각 군으로부터 네 계통을 분석하였다. 야생형 종자 내 수용성 탄수화물 조성에 비하여, amo1 종자는 유의하게 다른 수준의 총 WSC, 자유 글루코오스, 수크로오스 또는 말토오스 또는 프룩탄을 함유하지 않았다. 그러나, SSIIa 돌연변이 및 이중 돌연변이 종자는 유의하게 더 많은 양의 이들 탄수화물 각각을 함유하였다 (P<0.05). SSIIa 단일 돌연변이 종자는 유의하게 더 많은 프룩토오스, 수크로오스 및 총 WSC를 함유하였다.

단백질 함량

다섯 군의 종자 내에서 단백질 함량을 측정하였다. 단백질 함량은 야생형 종자의 경우 10.3±0.8%, amo1 돌연변이 종자의 경우 10.4±1.1%, SSIIa 돌연변이 종자의 경우 12.6±0.9%, 나맥 이중 돌연변이 종자의 경우 14.6±0.6%, 및 피맥 이중 돌연변이종자의 경우 13.8±1.4%였다. 나맥 및 피맥 이중 돌연변이 종자 모두 SSIIa 돌연변이 종자, 야생형 종자 또는 amo1 돌연변이 종자보다 유의하게 더 많은 단백질을 함유하였으나, 나맥 및 피맥 이중 돌연변이 종자 간에 또는 amo1 돌연변이과 야생형 종자 간에 단백질 함량에 있어서 유의한 차이는 없었다.

지질 함량

다섯 군의 종자에 대하여 지질 함량을 측정하였다. 총 지질 함량은 야생형 종자의 경우 2.9±0.2%, amo1 돌연변이 종자의 경우 3.5±0.3%, SSIIa 돌연변이 종자의 경우 6.4±0.9%, 나맥 이중 돌연변이 종자의 경우 4.9±0.3%, 및 피맥 이중 돌연변이종자의 경우 5.0±0.3%였다. SSIIa 돌연변이 종자는 나맥 및 피맥 이중 돌연변이 종자, 야생형 종자 및 amo1 돌연변이 종자보다 유의하게 많은 지질을 함유하였으나, 나맥 및 피맥 이중 돌연변이 간에 또는 amo1 돌연변이와 야생형 종자 간에 유의한 차이는 없었다.

논의

본 연구의 목적은 sex6 및 amo1 자리에서 열성 돌연변이 간의 상호작용을 조사하는 것이다. 이들 돌연변이 각각은, SSIIa 돌연변이 종자의 전분 내 전형적으로 60-70% 아밀로오스 함량 및 amo1-AC38 종자 내 35-45% 아밀로오스 함량으로, 야생형에 대하여 증가된 아밀로오스 표현형을 초래한다. sex6 (sex6-wt 및 sex6-292) 및 amo1 (amo1-wt 및 amo1-AC38) 자리에 대한 4 개의 가능한 유전자형의 결정이 본 연구의 중요한 측면이다. Sex6 자리의 돌연변이 및 야생형 대립 유전자는 전분 합성효소 IIa 유전자 내 원인 돌연변이에 근거한 마커를 이용하여 분명하게 구분될 수 있었다. amo1 자리에서의 돌연변이의 정확한 성질은 공지되지 않은 채로 남으며, 따라서 밀접하게 관련된 마커 (Bmac0501, 콘센서스 맵 로케이션 58.0 cM)를 이용하여 amo1 자리를 함유하는 염색체 영역의 존재에 대하여 분석하였다.

본 연구의 목적은 아밀로오스 함량에 대한 이들 돌연변이의 조합의 영향을 조사하는 것이다. 데이터는 SSIIa 돌연변이 자리만을 포함하는 계통에 비하여 SSIIa 돌연변이 및 amo1-AC38 자리가 조합될 때 아밀로오스 비율에 있어서 통계학적으로 유의한 차이가 없음을 보였다. 그러나, SSIIa과 amo1-AC38 돌연변이의 조합은 SSIIa 돌연변이 단독에 비하여 전분 합성 및 곡물 중량, 증가하는 전분 함량 및 종자 중량에 대한 예기치 않은 결과를 가져왔다.

보리 SSIIa 돌연변이체는 높은 백분율의 아밀로오스로 전분을 함유하였다. 데이터는 SSIIa 돌연변이 곡물이 평균적으로 곡물 당 기준으로 야생형 곡물의 단지 40% 전분만을 함유함을 보였다. SSIIa 돌연변이 종자의 고아밀로오스 표현형은 따라서 아밀로펙틴의 우선적 감소로 인한 것이었으며, 이는 단지 25% 감소된 아밀로오스에 비하여 75% 감소되었다. SSIIa - amo1 이중 돌연변이 곡물의 경우, 야생형 (31% 감소)에 비하여 아밀로펙틴 합성 감소가 있었으나 아밀로오스 함량 증가 (종자당 37% 증가) 또한 있었다. 이러한 결과는 amo1 유전자 생성물이 아밀로펙틴 합성에 관여할 뿐 아니라 아밀로오스 합성을 억제함을 시사하는 흥미로운 것이었다.

아라비돕시스 (Arabidopsis ) 내 일시적 전분 합성에 있어서 전분 합성효소 III 유전자의 역할에 대한 이전의 연구들은 전분 합성효소 III이 잎 내 전분 합성의 음성 조절 인자라는 결론을 내리도록 하였다 (Zhang et al ., Plant Physiol . 138: 663-674, 2005). 쌀 내에서, 두 전분 합성효소 III 유전자, SSIIIa 및 SSIIIb가 알려져 있다. 이들 유전자 중, SSIIIa가 전분 합성 중에 배유 내에서 발현되는 반면, SSIIIb는 배유 발육 초기에 발현되나 고활성 전분 합성 기간 중 등숙(grain filling) 기간에 발현되지 않는다 (Ohdan et al ., J Exp Bo 56: 3229-3244, 2005). 쌀 내 SSIIa 돌연변이는 전분 함량을 감소시키지 않았으나, 약 15% 내지 20%의 아밀로오스 함량 증가가 있었으며, 이는 아밀로펙틴 합성 감소 및 이에 수반하는 아밀로오스 합성 증가가 일어났음을 시사하는 것이다 (Fujita et al ., 2007 (supra)). GBSSI 및 SSI 활성 증가는 (Fujita et al ., 2007 (supra)) 이러한 관찰과 일관되는 것이다. Li et al ., 2000 (supra)은 SSIII 유전자 (현재 SSIIIa로 명명됨)를 밀 염색체 1의 짧은 암에 배치하였으며, 이는 보리 내 amo1 자리의 위치와 불일치하지 않는 위치이다. 따라서, SSIIIa 유전자는 amo1 자리에서 분열되는 원인 유전자에 대한 후보 유전자였다. 그러나, 실험은 SSIIIa 단백질이 amo1 돌연변이 내에서 발현되고 전분 합성효소 활성을 가지며, SSIIIa와 amo1 유전자 간에 재조합이 있었음을 입증하였으며, 이는 이들이 구분된 유전자임을 나타내는 것이다.

전분 사슬 길이 분포에 대한 amo1 돌연변이 인자의 영향은 미미하였다. 야생형 배경에서, amo1 돌연변이 인자의 존재는 짧은 사슬 길이 (DP 9-14)의 약간의 감소 및 DP 15-24 분획 증가를 야기하였다. SSIIa 돌연변이 배경에서, amo1 돌연변이 자리의 사슬 길이 분포에 대한 영향은 무시할 정도였다. 이와 대조적으로, SSIIa 돌연변이 인자는 아밀로펙틴 구조 및 따라서 사슬 길이 분포에 주요한 영향을 미쳤으며, 짧은 사슬 (DP 6-8 및 DP 9-14) 비율을 증가시키고 DP15-25 사슬을 감소시켰다.

SSIIa 및 amo1 돌연변이 인자의 조합은 SSIIa 돌연변이 인자만을 함유하는 계통의 특성과 비교하여 전분 함량 및 종자 중량이 부분적으로 복구된 예기치않은 표현형을 제공하였다.

실시예 3: 보리 AMO1 자리에 결합되는 유전자 마커

amo1 돌연변이 자리를 보리의 염색체 1H 상에서 대략 56.5 cM에서 매핑하였다 (Barley- BinMap 2005, GrainGene database). amo1 자리와 밀접하게 연결되는 유전자 마커를 시험하기 위하여, 보리의 염색체 1H 상에서 56.00 cM과 64.60 cM 사이에 위치하는 11 SSR (단순 염기서열 반복) 마커 ((Ramsay et al ., Genetics . 156(4): 1997-2005, 2000)를 선별하고, 두 가지 모 계통, 고아밀로오스 글래시어 (HAG) 및 Himalaya292로부터의 PCR 생성물의 증폭에 대하여 시험하였다. 이들 SSR 마커는 EBmac0405, Bmag0105, Bmac0063, HVM20F, EBmac0560a, EBmac0501, Bmac0044, Bmac0032, Bmag0113, Bmag0211, 및 Bmag0350였다. 이들 SSR 마커를 위한 프라이머를 GrainGenes 데이터베이스에 열거된 서열에 따라 합성하였다.

각각의 PCR 반응 (20 ㎕)을 위하여, 50 ng 게놈 DNA, 1.5 mM MgCl₂, 0.125 mM 각 dNTP, 10 pmol 프라이머, 0.5 M 글리신 베타인, 1 ㎕ DMSO 및 1.5 U의 Hotstar Taq 폴리머라아제 (QIAGEN, 오스트레일리아)를 사용하였다. SSR 마커를 위한 증폭을 위한 PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 4분 동안 1 사이클, 94℃에서 30 초 동안, 65℃에서 50℃로 1℃씩 감소하며 각 사이클 당 30 초 동안, 및 72℃에서 1분 20초 동안의 15 사이클, 94℃에서 15초 동안, 50℃에서 15초 동안, 및 72℃에서 45초 동안의 30 사이클, 및 25℃에서 1분 동안 1사이클. 상기 PCR 생성물을 2% 아가로오스 겔 상에서 전기영동에 의하여 분리하고, GelRed (Biotium) 염색 후 겔 다큐멘터리 (UVitec)으로 가시화하였다.

11 SSR 마커를 시험할 때, 11 마커 중 2, 즉 64.6 cM에 위치하는 Bmac0032 및 58.0 cM에 위치하는 EBmac0501는 HAG 및 Himalaya292 모 식물과 상이한 크기의 DNA에 대한 PCR 생성물을 제공하였다. 즉, 이들 마커들은 두 개의 모 품종 간의 다형성을 나타냈다. 증폭 생성물의 크기는 각각 Bmac0032 및 EBmac0501 마커를 이용하여, HAG에 대하여 175 bp 및 189 bp 단편, 및 Himalaya282에 대하여 230 bp 및 150 bp였다. 그 다음, 두 SSR 마커를 70 BCDF6 계통의 지노타이핑을 위하여 사용하였다. Bmac0032 마커로 지노타이핑된 모든 계통이 HAG와 동일 크기의 단편을 나타냈으며, 이는 모든 계통이 Bmac0032과 amo1 자리 사이에서 재조합되었으며, SSR 마커 Bmac0032는 amo1 자리와 밀접하게 연결되지 않았음을 보였다. 이와 대조적으로, EBmac0501 마커로 지노타이핑된 70 BC3F6 계통 중, 56 개는 상기 단편 패턴의 어느 하나에 대하여 동협 접합성이었다. 56 동형 접합성 계통 중, 25 개는 HAG로부터 EBmac0501 마커를 나타냈으며, 31 개는 Himalaya292로부터 EBmac0501 마커를 나타냈다. 이러한 결과는 EBmac0501 마커가 amo1 자리와 유전자 재조합의 높은 빈도를 가지지 않았음을 보였다. 따라서, 상기 SSR 마커 EBmac0501는 amo1-AC38 자리에 대하여 밀접하게 연결된 미위성체 마커였다.

보리의 SSIIIa 유전자에 근거한 마커

amo1 자리는 보리의 SSIIIa 유전자에 가까울 것으로 생각되었다. 이러한 가능성을 시험하고, 보리 내 SSIIIa 유전자에 근거한 DNA 마커를 개발하기 위하여, SSIIIa 유전자 일부를 먼저 두 모 품종으로부터 분리하였다. HAG 및 Himalay292로부터의 DNAs를 밀 SSIIIa 게놈 DNA 서열에 근거한 프라이머 (Li et al ., 2000 (supra))를 이용하여 PCR 단편의 증폭을 위하여 사용하였다. 밀 SSIIIa 유전자의 엑손 7 내에 위치하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 SSIIIaF (5'-GGAGGTCTCGGGGATGT-3' (서열 번호 7)) 및 엑손 8 내에 위치하는 SSIIIaR (5'-GCTCCAGGAAGTAAACGGTCAGG-3' (서열 번호 8))을 464 bp 생성물의 PCR 증폭을 위하여 사용하였다. 각각의 PCR 반응 (20 ㎕)을 위하여, 50 ng 게놈 DNA, 1.5 mM MgCl₂, 0.125 mM 각 dNTP, 10 pmol 프라이머, 0.5 M 글리신 베타인, 1 ㎕ DMSO 및 1.5 U의 Hotstar Taq 폴리머라아제를 사용하였다. 95℃에서 5분 동안 1 사이클, 94℃에서 45분 동안, 58℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 1분 동안의 35 사이클, 72℃에서 10분 동안 1사이클 및 25℃에서 1분 동안 1 사이클을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 각 증폭에서 464 bp 단편을 생산하였다. PCR 단편을 0.5 단위의 Shrimp 알칼라인 포스파타아제 (USB 사, USA), 2.5 단위의 엑소뉴클레아제 I 및 1x PCR 완충액 (QIAGEN, 오스트레일리아)로 USB 사로부터의 프로토콜에 따라 처리하고, 제조업자에 의하여 기재된 바와 같이 염색 종결제로 자동화 ABI 시스템을 이용하여 시퀀싱하였다.

상기 464 bp 단편들은 하나의 단편 내에 NlaIV 제한효소 절단 부위를 제공하나 다른 하나의 단편 내에는 그렇지 않은 서열 차이를 가졌다. 따라서, PCR 생성물의 상기 효소 처리 후 2% 아가로오스 겔 상에서 전기영동은 SSIIIa 유전자를 두 모 품종으로부터 구분하는 편리한 방법을 제공하였다. 464 bp DNA 단편만의 생산은 Himalaya292로부터 SSIIIa 유전자의 존재를 나타냈으며, 303 bp 및 161 bp DNA 단편 모두의 생산은 HAG로부터 SSIIIa 유전자의 존재를 나타냈다.

실시예 4: SSIIA - AMO1 이중 돌연변이에 대한 시도

밭에서 재배시 SSIIa-amo1 이중 돌연변이의 산출 성능을 평가하기 위하여, 3 나맥 이중 돌연변이 계통, 2 피맥 이중 돌연변이 계통, 4 나맥 SSIIa 돌연변이, 1 피맥 SSIIa 돌연변이 계통, 1 나맥 야생형 보리 계통 (풍좀 Torrens), 2 피맥 야생형 보리 계통 (품종 Tantangara, Sloop)을 2008년 Narrandera 및 Moree, NSW, 오스트레일리아에서 재배하였다. 각각의 보리 계통을 두 장소 모두에서 관개 및 비-관개 (건조지) 조건 하에 재배하였다. 각각의 계통에 대하여 두 플롯을 무작위 패턴으로 두 장소 모두에서 각각의 조건 하에 재배하였다. 보리 종자 (120 g)를 각각의 플롯 (19 m²) 내에 심었다.

2008, 12에 각각의 플롯을 수확한 후 얻어진 곡물 중량을 측정하였다. Narrandera에서, 관개 하에, 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 나맥 야생형 계통은 플롯 당 2.23±0.16kg, 1.14±0.57kg 및1.65±0.79 kg의 곡물을 각각 생산하였다. 건조지 조건 하에, 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 나맥 야생형 계통은 플롯 당 0.55±0.34kg, 0.11±0.12kg, 및 0.41±0.16kg의 곡물을 각각 생산하였다. Moree에서, 관개 하에, 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 나맥 야생형 계통은 플롯 당 1.62±0.72kg, 0.54±0.40kg 및 2.11±0.08 kg의 곡물을 각각 생산하였다. 건조지 조건 하에, 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 나맥 야생형 계통은 플롯 당 0.88±0.33kg, 0.38±0.27kg, 및 1.14±0.34kg의 곡물을 각각 생산하였다.

따라서, 관개 및 비-관개 조건 모두 하에 두 장소에서, 나맥 이중 돌연변이 및 나맥 야생형 계통은 유사한 곡물 산출량을 생산하였으며, 이는 나맥 SSIIa 돌연변이로부터의 산출량보다 현저히 큰 것이었다.

겉보리( hulled barley ) 계통의 곡물 산출량

Narrandera에서, 관개 하에, 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 피맥 야생형 계통은 플롯 당 2.77±0.37 kg, 2.09±0.76 kg 및 4.39±2.59 kg의 곡물을 각각 생산하였다. 건조지 조건 하에, 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 피맥 야생형 계통은 0.60±0.06 kg, 0.35±0.14 kg 및 0.59±0.46 kg의 곡물을 각각 생산하였다.

Moree에서, 관개 조건 하에, 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 피맥 야생형 계통은 플롯 당 2.15±0.81 kg, 1.24±0.12 kg 및 2.73±0.96 kg의 곡물을 각각 생산하였다. 건조지 조건 하에, 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 피맥 야생형 계통은 1.19±0.40 kg, 0.76±0.60 kg 및 2.13±0.23 kg의 곡물을 각각 생산하였다.

따라서, 관개 및 비-관개 조건 모두 하에 두 장소에서, 피맥 야생형 계통은 피맥 이중 돌연변이 및 피맥 SSIIa 돌연변이 계통보다 더 많은 곡물을 생산하였으며, 피맥 이중 돌연변이는 피맥 SSIIa 돌연변이보다 더 많은 곡물을 생산하였다.

실시예 5: 식품 제조

2008년 Yanco, NSW, 오스트레일리아에서 밭에서 재배한 11 개의 보리 계통으로부터 곡물을 수확하고, 도정하여 가루를 생산하였다. 상기 계통은 3 쌀보리 이중 돌연변이, 2 피맥 이중 돌연변이, Himalaya292를 포함하는 3 SSIIa 돌연변이, 2 야생형 (품종 Tantangara 및 Himalaya) 및 1 amo1 돌연변이 (HAG)였다. 이들 계통으로부터 수확된 곡물을 Quadrumat Jnr. 밀(Brabender Quadrumat Jnr. Mill, Cyrulla's Instruments, Sydney, NSW Australia)을 이용하여 도정하여 가루를 생산하고, 그 다음 300 ㎛ 직경으로 체질하였다. Quadrumat 도정 전에 템퍼링이 적용되지 않았다.

각각 11 보리 계통에 대하여 두 가지 유형의 소규모 (10 g) 빵을 베이킹하였다. 소규모 덩어리를 시험 목적으로 베이킹하였으나, 상기 방법은 상업적 양으로 용이하게 규모를 증가시킬 수 있다. 한가지 유형의 빵을 상기한 바와 같이 도정된 100% 보리 가루를 성분으로 하여 제조하였으며, 다른 한가지 유형의 빵을 30% 가루 및 70% 상업적 밀가루의 블렌드를 가루 성분으로 이용하여 제조하였다. 가루 (13.02 g) 및 기타 성분들을 35-g 믹소그래프 내에서 피크 반죽 형성 시간까지 반죽으로 혼합하였다. 각각의 경우, 13.02 g의 가루에 근거하여, 사용되는 레시피는 다음과 같았다: 가루 100%, 염 2%, 건조 효모 1.5%, 식물성 오일 2%, 및 품질 개량제 1.5%. 물 첨가 수준은 전체 포뮬러에 대하여 조정된 마이크로 Z-암 물 흡수 값에 근거하였다. 정형(moulding)과 패닝(panning)을 40℃, 85% 실내 습도에서 두-단계 발효(proofing)로 행하였다. 베이킹을 Rrotel 오븐 내에서 90℃에서 14 분 동안 행하였다.

베이킹 후, 10 g 빵 덩어리를 100% 보리빵 배치에 대하여 -80℃에서 3 주 동안, 또는 30% 보리빵 배치에 대하여 1 주일 동안 저장하고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 RS 함량 및 GI 수준을 분석하였다. RS 함량은, 시험관내 절차에 의하여 저항성 전분 함량을 결정하였다. 10g 빵 덩어리로부터 2 샘플을 적절한 표준과 함께 인공 타액과 혼합하고, 결과 생성되는 볼루스를 췌장 및 위 효소와 함께 생리적 pH 및 온도에서 인큐베이션하였다. 소화물 내 잔류 전분의 양을 전형적인 효소 및 분광광도 기술을 이용하여 측정하고, 샘플의 저항성 전분 함량을 샘플 중량의 백분율로서 나타냈다.

GI 수준 측정을 위하여, 시험관내 절차를 이용하였다.

보리 통밀의 RS 함량

보리 유전자형의 각각의 군으로부터 분쇄된 통밀에 대하여 RS 함량 및 GI 수준을 먼저 측정하였다. RS 함량은 amo1 돌연변이, 나맥 이중 돌연변이, 피맥 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 야생형 통밀에 대하여 각각 0.9%, 3.5±0.3%, 3.4±0.1%, 1.9% 및 0.5±0.1%이었다 (표 1). 예기치 않게, 나맥 및 피맥 이중 돌연변이 통밀 모두 amo1 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 야생형 통밀보다 각각 대략 3.5 2.3 및 10배 더 높은 RS 함량을 함유하였다. 중요한 것은, 나맥 및 피맥 이중 돌연변이 모두로부터의 통밀이 SSIIa 돌연변이로부터의 통밀보다 현저히 더 많은 RS를 함유하였다는 것이다. 나맥 이중 돌연변이와 피맥 이중 돌연변이 통밀 사이에, 또는 amo1 돌연변이와 야생형 통밀 사이에 RS 함량에 있어서 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 5 군의 보리로부터의 통밀 사이에 GI 수준 차이가 있었으나, 통계학적으로 유의하지 않았다.

100% 보리 가루를 함유하는 빵의 RS 함량

100% 보리 가루를 함유하는 빵의 RS 함량을 측정하고 표 2에 기재하였다. 이러한 분석은 100% 보리 통밀을 가루 성분으로 이용하여 제조된 빵 내 RS 함량은 amo1 돌연변이, 나맥 이중 돌연변이, 피맥 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 야생형 곡물에 대하여 각각 2.2±0.3%, 5.5±0.1%, 5.6±0.3%, 2.1±0.4% 및 0.8±0.3%이었음을 보였다 (표 3). 통계학적 분석은 나맥 및 피맥 이중 돌연변이 모두로부터의 통밀로 제조된 빵이 SSIIa 돌연변이, amo1 돌연변이 및 정상 보리 계통보다 유의하게 높은 RS 함량을 제공함을 나타냈다 (표 3). 나맥 및 피맥 이중 돌연변이체의 100% 가루를 함유하는 빵으로부터 RS 함량에 유의한 차이는 없었다. 나맥 및 피맥 이중 돌연변이체로부터의 빵은 SSIIa 돌연변이체, amo1 돌연변이체 및 정상 보리로 제조된 빵보다 각각 2.5배, 2.5배 및 6.7배 더 높은 RS 함량을 나타냈다 (표 3).

30% 보리 가루를 함유하는 빵의 RS 함량

30% 보리 가루를 함유하는 빵의 RS 함량을 측정하고 표 4에 기재하였다. amo1 돌연변이, 나맥 이중 돌연변이, 피맥 이중 돌연변이 SSIIa 돌연변이 및 야생형 통밀로부터 제조된 빵의 RS 함량은 각각 1.9±0.3%, 3.1±0.2%, 3.0±0.1%, 2.0±0.3% 및 0.9±0.1%이었다 (표 3). 나맥 및 피맥 이중 돌연변이로부터 제조된 빵 모두가 SSIIa 돌연변이, amo1 돌연변이 및 정상 보리 곡물보다 유의하게 높은 RS 함량을 나타냈다 (표 3). 나맥 및 피맥 이중 돌연변이체의 30% 가루를 함유하는 빵 사이에 RS 함량에 유의한 차이는 없었다. 나맥 및 피맥 이중 돌연변이체로부터 제조된 빵은 SSIIa 돌연변이체, amo1 돌연변이체 및 정상 보리로 제조된 빵보다 각각 1.6배, 1.6배 및 3.3배 더 높은 RS 함량을 나타냈다 (표 3).

전분 그램(g) 당 RS 밀리그램(mg)으로서 RS 계산을 행하여 이중 돌연변이체로부터 제조된 빵 내 RS 증가 특성을 분석하였다. 이들 데이터를 분석하여 RS 함량 증가가 총 전분 증가로 인한 것인지 전군 구조 변화로 인한 것인지를 조사하였다. 그 결과는 amo1 돌연변이, 나맥 이중 돌연변이, 피맥 이중 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 야생형 곡물로부터의 100% 보리 가루로 제조된 빵은 빵의 전분 g 당 41.7, 105.1±2.8, 106.9±3.3, 75.0±8.1 및 16.3±4.5 mg RS를 가짐을 보였다 (도 4.6). 나맥 이중 돌연변이 및 피맥 이중 돌연변이 빵 모두 amo1 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 야생형 곡물로부터 제조된 빵보다 대략 2.5, 1.4 및 6.5배 더 높은 RS를 나타냈다. 통계학적 분석은 4 군의 보리 모두로부터 제조된 빵이 야생형 계통으로부터 제조된 것보다 많은 RS를 함유하나, 두 이중 돌연변이로부터 제조된 빵 모두의 RS 함량(전분 g 당 RS mg)이 amo1 돌연변이, SSIIa 돌연변이로부터 제조된 것보다 통계학적으로 유의하게 높음을 보였다 (P<0.05). SSIIa 돌연변이 곡물로부터 제조된 빵은 amo1 돌연변이로부터 제조된 것보다 통계학적으로 유의하게 더 높은 RS를 함유하였다.

100% 보리빵의 GI 수준

모든 보리 계통으로부터의 보리 가루를 100% 함유하는 빵의 GI 수준을 측정하고, 표 2에 기재한다. amo1 돌연변이, 나맥 이중 돌연변이, 피맥 이중 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 야생형 곡물로부터 제조된 빵의 GI 수준은 각각 68.5±2.1, 63.5±4.5, 60.8±4.1, 63.9±10.3, 80.3±2.9이었다 (표 7). 통계학적 분석은 나맥 및 피맥 이중 돌연변이, 및 SSIIa 돌연변이 곡물로부터의 빵이 amo1 돌연변이 및 정상적인 보리 계통으로부터의 것보다 유의하게 낮은 GI 값을 나타냄을 보였다 (표 7). 나맥 및 피맥 이중 돌연변이, 및 SSIIa 돌연변이 곡물의 100% 가루를 함유하는 빵의 GI 값에 대하여 유의한 차이는 없었다. 나맥 및 피맥 이중 돌연변이, 및 SSIIa 돌연변이 곡물로부터의 빵은 amo1 돌연변이 및 정상적인 보리 계통으로부터의 것의 대략 80% GI 수준을 각각 나타냈다 (표 7).

30% 보리빵 의 GI 수준

모든 보리 계통으로부터의 보리 가루 30%를 함유하는 빵의 GI 수준을 측정하고, 표 4에 나타낸다. amo1 돌연변이, 나맥 이중 돌연변이, 피맥 이중 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 야생형 계통으로부터 제조된 빵의 GI 수준은 각각 84.5±3.5, 83.2±2.1, 83.5±0.8, 82.3±3.9, 87.8±4.5였다 (표 7). 5 군의 보리로부터 제조된 빵의 GI 값은 통계학적으로 유의하게 다르지 않았다.

결론

나맥 및 피맥 이중 돌연변이 보리 곡물 모두로부터의 통밀은 amo1 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 야생형 곡물로부터의 통밀보다 유의하게 높은 RS 함량을 함유하였다. 두 이중 돌연변이 모두로부터의 통밀은 amo1 돌연변이, SSIIa 돌연변이 및 야생형 계통으로부터의 통밀과 비교하여 대략 3.5, 1.8 및 7.0배 더 높은 RS 함량을 함유하였다. 유사한 패턴으로, 이중 돌연변이 보리 곡물로부터 제조된 빵은 SSIIa 돌연변이, amo1 돌연변이 및 야행성 보리로부터 제조된 빵보다 유의하게 더 높은 RS 함량을 함유하였다. RS 함량 증가는 고아밀로오스 전분의 양의 증가로 인한 것일 뿐 아니라, 전분 g 당 RS 함량 증가가 관찰됨에 따른 전분 구조의 변화로도 인한 것이다.

두 이중 돌연변이 및 SSIIa 돌연변이 곡물로부터의 빵은 amo1 돌연변이 및 야생형 곡물 모두로부터의 것보다 유의하게 더 낮은 GI 값을 나타냈다. SSIIa-amo1 이중 돌연변이 곡물 및 SSIIa 돌연변이 곡물을 함유하는 빵의 GI 값은 빵이 100% 보리 가루로 제조될 때 amo1 돌연변이 및 야생형 곡물을 함유하는 빵의 것 보다 대략 7% 및 20% 더 낮았다.

실시예 6: 프룩탄의 대규모 생산

약 10% 프룩탄을 가지므로, SSIIa 및 amo1 내 보리 곡물 돌연변이를 고아밀로오스 전분 및 β-글루칸과 같은 기타 생성물뿐 아니라 프룩탄의 분리 및 정제에도 이용할 수 있다. 대규모 농업으로 용이하게 생산될 수 있는 곡물로부터의 이러한 생산은, 예를 들어 치커리로부터 이눌린 추출을 포함하는 기존의 프룩탄 생산 방법에 비하여 비용 효과적일 것이다.

프룩탄의 대규모 추출은 곡물을 통밀 가루로 분쇄한 다음 상기 가루로부터 물 내로 프룩탄을 포함하는 총 슈가를 추출함으로써 달성될 수 있다. 이는 주위 온도에서 행하여질 수 있으며, 그 다음 상기 혼합물을 원심분리 또는 여과한다. 그 다음, 상청액을 약 80℃로 가열하고 원심분리하여 단백질을 제거한 후 건조시킨다. 대안적으로, 가루의 추출은 80% 에탄올을 이용하여, 연이은 물/클로로포름 혼합물을 이용하는 상분리로 행하여질 수 있으며, 슈가 및 프룩탄을 함유하는 수상을 건조하고 물 내 재용해한다. 둘 중 하나의 방법으로 제조된 추출물 내 수크로오스를 α-글루코시다아제의 첨가에 의하여 효소적으로 제거한 다음, 헥소오스 (모노사카라이드)를 겔 침투에 의하여 제거하여 다양한 크기의 프룩탄 분획을 생산할 수 있다. 이는 적어도 80% 프룩탄의 프룩탄 강화 분획을 생산할 것이다.

보리 통밀의 RS 함량 및 GI 수준

유전자형	계통명	GI	GI 평균	SD	RS 통밀 (g/100g)	RS 평균	SD
amo1 돌연변이	HAG	64.6	64.6 ^a		0.9	0.9^c
피맥 이중 돌연변이	HHF7-88	81.0	79.0^a	2.8	3.5	3.4^a	0.1
피맥 이중 돌연변이	HHF7-122	77.0			3.3
나맥 이중 돌연변이	HHF7-4	77.3	78.0^a	0.9	3.3	3.5^a	0.3
나맥 이중 돌연변이	HHF7-7	79.1			3.4
나맥 이중 돌연변이	HHF7-29	77.8			3.8
SSIIa 돌연변이	292.0	68.2	68.2^a		1.9	1.9^b
야생형 보리	Himalaya	76.6	70.8^a	9.6	0.6	0.5^c	0.1
야생형 보리	Glacier	76.0			0.4
야생형 보리	Tantangara	59.7			0.4
LSD (5%)			22.6			0.7

L.S.D.: 최소유의차; 이것보다 큰 차이는 유의하다 (P<0.05).

a, b 및 c: LSD에 근거함, 동일 문자를 가지는 평균값은 유의하게 다르지 않으며, 다른 문자를 가진 값은 유의한 차이로 유의하게 다르다 (P<0.05)

100% 보리 통밀을 이용하여 제조된 빵의 RS 함량 및 GI 수준

샘플 ID	유전자형	계통명	RS 함량 (g/100 g)	GI 수준
ZL2.9.1	amo1 돌연변이	HAG	2.39	70
ZL2.9.1	amo1 돌연변이	HAG	2.01	67
10.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_29	5.46	57
10.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_29	5.6	62
6.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_4	5.53	66
6.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_4	5.32	61
2.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_7	5.61	70
2.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_7	5.65	65
11.1	피맥 이중 돌연변이	HHF7_88	5.76	66
11.1	피맥 이중 돌연변이	HHF7_88	5.96	62
1.1	피맥 이중 돌연변이	HHF7_122	5.29	57
1.1	피맥 이중 돌연변이	HHF7_122	5.2	58
ZL1.8.1	SSIIa 돌연변이	871	1.96	49
ZL1.8.1	SSIIa 돌연변이	871	2.08	53
ZL1.1.1	SSIIa 돌연변이	Himalaya292	1.49	57
ZL1.1.1	SSIIa 돌연변이	Himalaya292	1.58	60
4.1	SSIIa 돌연변이	HHF7_50	2.22	74
4.1	SSIIa 돌연변이	HHF7_50	2.26	74
3.1	야생형	Himalaya	0.65	82
3.1	야생형	Himalaya	0.52	82
9.1	야생형	Tantangara	1.04	76
9.1	야생형	Tantangara	1.05	81

30% 또는 100% 보리 가루로 제조된 빵의 RS 함량에 대한 유전자형의 영향의 통계학적 분석

유전자형	No 샘플	RS 함량 100% (g/100g)	SD	RS 함량 30% (g/100g)	SD
amo1 돌연변이	2	2.2^b	0.3	1.9^b	0.3
나맥 이중 돌연변이	6	5.5^a	0.1	3.1 ^a	0.2
피맥 이중 돌연변이	4	5.4^a	0.4	3.0^a	0.1
SSIIa 돌연변이	6	1.9^b	0.4	1.8^b	0.3
야생형	4	0.7^c	0.3	1.0^c	0.1
L.S.D. (P<0.05)		0.5		0.3

주목:

RS 함량 30%: 30% 보리 가루를 함유하는 빵의 RS 함량

RS 함량 100%: 100% 보리 가루를 함유하는 빵의 RS 함량

L.S.D.: 최소유의차; 이것보다 큰 차이는 유의하다 (P<0.05).

30% 보리 가루로 제조된 빵의 RS 함량 및 GI 수준

샘플 ID	유전자형	계통명	RS (g/100 g)	GI 수준
ZL1.4.1	amo1 돌연변이	HAG	2.15	82
ZL1.4.1	amo1 돌연변이	HAG	1.72	87
ZL1.5.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_29	3.01	83
ZL1.5.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_29	3.07	82
ZL2.7.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_4	3.03	83
ZL2.7.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_4	3.27	83
ZL2.6.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_7	3.15	84
ZL2.6.1	나맥 이중 돌연변이	HHF7_7	3.03	84
ZL1.3.1	피맥 이중 돌연변이	HHF7_88	3.04	83
ZL1.3.1	피맥 이중 돌연변이	HHF7_88	3.09	86
ZL1.10.1	피맥 이중 돌연변이	HHF7_122	3.01	81
ZL1.10.1	피맥 이중 돌연변이	HHF7_122	2.71	84
ZL2.1.1	SSIIa 돌연변이	871	1.87	77
ZL2.1.1	SSIIa 돌연변이	871	1.82	81
ZL2.3.1	SSIIa 돌연변이	Himalaya292	1.7	80
ZL2.3.1	SSIIa 돌연변이	Himalaya292	1.87	82
ZL2.2.1	SSIIa 돌연변이	HHF7_50	2.15	86
ZL2.2.1	SSIIa 돌연변이	HHF7_50	1.69	84
ZL1.2.1	야생형	Himalaya	0.96	93
ZL1.2.1	야생형	Himalaya	1.02	94
ZL2.8.1	야생형	Tantangara	0.84	83
ZL2.8.1	야생형	Tantangara	0.89	85

100% 보리 가루로 제조된 빵의 RS 함량 (전분 g 당 RS mg)에 대한 유전자형의 영향의 통계학적 분석

유전자형	샘플 No	RS 함량 100% (g/100g)	SD	빵 내 총 전분 (%)	SD	전분 g 당 RS mg	SD
amo1 돌연변이	1	2.2^b	0.3	57.4^a	-	41.7^c
나맥 이중 돌연변이	3	5.5^a	0.1	52.7^a	1.8	105.1^a	2.8
피맥 이중 돌연변이	2	5.4^a	0.4	51.8^a	4.7	106.9^a	3.3
SSIIa 돌연변이	3	1.9^b	0.4	25.1^b	3.0	75.0^b	8.1
야생형	2	0.7^c	0.3	51.6^a	2.6	16.3^d	4.5
L.S.D. (P<0.05)		0.5		8.9		16.3

30% 보리 가루로 제조된 빵의 RS 함량 (전분 g 당 RS mg)에 대한 유전자형의 영향의 통계학적 분석

유전자형	샘플 No	RS 함량 30% (g/100g)	SD	빵 내 총 전분 (%)	SD	전분 g 당 RS mg	SD
amo1 돌연변이	1	1.9^b	0.3	61.9^a	-	30.7^b
나맥 이중 돌연변이	3	3.1 ^a	0.2	65.3^a	2.2	47.5^a	0.8
피맥 이중 돌연변이	2	3.0^a	0.1	63.7^a	1.1	47.1^a	3.0
SSIIa 돌연변이	3	1.8^b	0.3	58.0^b	2.3	31.6^b	0.3
야생형	2	1.0^c	0.1	65.1^a	0.1	14.6^c	1.1
L.S.D. (P<0.05)		0.3		5.6		4.2

30% 또는 100% 보리 가루로 제조된 10g 빵의 GI 수준에 대한 유전자형의 영향의 통계학적 분석

유전자형	샘플 No	GI 수준 100%	SD	GI 수준 30%	SD
amo1 돌연변이	2	68.5^a	2.1	84.5^a	3.5
나맥 이중 돌연변이	6	63.5^b	4.5	83.2^a	2.1
피맥 이중 돌연변이	4	60.8^b	4.1	83.5^a	0.8
SSIIa 돌연변이	6	63.9^b	10.3	82.3^a	3.9
야생형	4	80.3^a	2.9	87.8^a	4.5
L.S.D. (P<0.05)		12.1		5.8

GI 수준 30%: 30% 보리 가루를 함유하는 빵의 GI 수준

GI 수준 100%: 100% 보리 가루를 함유하는 빵의 GI 수준

L.S.D.: 최소유의차; 이것보다 큰 차이는 유의하다 (P<0.05).

a 및 b: LSD에 근거함, 동일 문자를 가지는 평균값은 유의하게 다르지 않으며, 다른 문자를 가진 값은 유의한 차이로 유의하게 다르다 (P<0.05)

서열 식별자의 요약

서열 번호:	기재
1	Hordeum vulgare 아종 vulgare 전분 합성효소 II mRNA, 완전 cDNA 서열. Accession No. AY133249, 2972 뉴클레오티드, 단백질 코딩 영역: 뉴클레오티드 114-2522, 보리의 염색체 7 상.
2	서열 번호 1에 의하여 인코딩되는 전분 합성효소 II의 아미노산 서열; 802 아미노산
3	SSIIa cDNA (SSIIaF) GenBank No. AY133249의 뉴클레오티드 1616에서 시작하는 올리고뉴클레오티드 프라이머
4	SSIIa cDNA (SSIIaR) GenBank No. AY133249의 뉴클레오티드 2044에서 시작하는 올리고뉴클레오티드 프라이머
5	amo1 자리 HHac0501F에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머
6	amo1 자리 HHac0501R에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머
7	SSIIIaF에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머
8	SSIIIaR에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머
9	M292 (cDNA)의 SSIIa의 뉴클레오티드 서열
10	서열 번호 9의 뉴클레오티드 1-1852에 의하여 인코딩되는 아미노산 서열
11	서열 번호 9의 뉴클레오티드 1856-2946에 의하여 인코딩되는 아미노산 서열

아미노산 하위 분류

서브 클래스	아미노산
산성	아스파르트산, 글루탐산
염기성	비-환형: 아르기닌, 라이신; 환형: 히스티딘
대전됨	아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 라이신, 히스티딘
소	글리신, 세린, 알라닌, 트레오닌, 프롤린
극성/중성	아스파라긴, 히스티딘, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌
극성/대	아스파라긴, 글루타민
소수성	티로신, 발린, 이소류신 , 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판
방향족	트립토판, 티로신, 페닐알라닌
사슬 배향에 영향을 미치는 잔기	글리신 및 프롤린

바람직한 아미노산 치환의 예

본래 잔기	예시적 치환	바람직한 치환
Ala	Val, Leu, Ile	Val
Arg	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn	Gln, His, Lys, Arg	Gln
Asp	Glu	Glu
Cys	Ser	Ser
Gln	Asn, His, Lys,	Asn
Glu	Asp, Lys	Asp
Gly	Pro	Pro
His	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleu	Leu
Leu	Norleu, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys	Arg, Gln, Asn	Arg
Met	Leu, Ile, Phe	Leu
Phe	Leu, Val, Ile, Ala	Leu
Pro	Gly	Gly
Ser	Thr	Thr
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr	Tyr
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val	Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleu	Leu

SEQUENCE LISTING <110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Australian Capital Ventures Limited LI, Zhongyi (US Only) MORELL, Matthew K (US Only) <120> BARLEY AND USES THEREOF <130> 31001967/JEH/DXT <150> AU2009903563 <151> 2009-07-30 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2972 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 1 cctcgaggtg cgtttacccc acacagagta cactccaact ccagtccaat ccagcccact 60 gccgcttctg cccgcccatc gtaccgtcgc ccgccccgat cccggccgcc gccatgtcgt 120 cggcggtcgc gtcccccgcg tccttcctcg cgctcgcgtc cgcctcgccc gggagatcat 180 cacggaggag ggcgagggtg ggcgcgtcgc caacccgcgc tggggccggc aggctgcaat 240 ggcggccgtc gccgctgcag cgcacggctc gcgacggagc ggtggccgcg cgcgccgccg 300 ggatcgacga cgccgcgccc ggtaggcagc cccgcgctcg ccgctatggc gccgccacca 360 aggtcgcgga tcccgtcaag acgctcgatc gcgacgccgc ggaaggtggt gggccgtccc 420 cgccggcacc gaggcaggac gccgcccgtc tgccgagtaa gaacggcacg ctgatcaacg 480 gtgagaacaa acctaccggc ggcggtggcg cgactaaaga cagcgggctg cccacacccg 540 cacgcgcgcc ccatctgtca atccagaaca gagtaccggt gaacggtgaa aacaaacata 600 aggtcgcctc gccgccgacc agcatagtgg atgtcgcgtc tccgggttcc gcagctaaca 660 tttccatcag taacaaggtg ccgccgtccg ttgtcccagc caagaagacg ccgccgtcgt 720 ccgttttccc ggccaagaag acgctgccgt cgtccggctc aaattttgtg tcctcggcct 780 ctgctcccag gctggacact gtcagcgatg tggaacttgc acagaagaag gatgcgctga 840 ttgtcaaaga agctccaaaa ccaaaggctc tttcggcccc tgcagccccc gctgtacaag 900 aagacctttg ggatttcaag aaatacattg gtttcgagga gcccgtggag gccaaggatg 960 atggctcggc tgttgcagat gatgcgggtt cctttgaaca tcaccagaat catgattccg 1020 gacctttggc aggggagaac gtcatgaacg tggtcgtcgt tgctgctgaa tgttctccct 1080 ggtgcaaaac aggtggtctt ggagatgttg cgggtgcttt gcccaaggct ttggctaaga 1140 gaggacatcg tgttatggtt gtggtaccaa ggtatgggga ctatgaggaa gcctacgatg 1200 tcggagtccg aaaatactac aaggctgctg gacaggatat ggaagtgaat tatttccatg 1260 cttatatcga tggagtggat tttgtgttca ttgacgctcc tctcttccga caccgtcagc 1320 aagacattta tgggggcagc agacaggaaa ttatgaagcg catgattttg ttctgcaagg 1380 ccgctgtcga ggttccttgg cacgttccat gcggcggtgt cccttacggg gatggaaatc 1440 tggtcttcat tgcaaatgat tggcacacgg cactcctgcc tgtctatctg aaagcatatt 1500 acagggacca tggtttgatg caatacagtc gctccgttat ggtgatacat aacatcgctc 1560 accagggccg tggccctgta gatgaattcc cgttcaccga gttgcctgag cactacctgg 1620 aacacttcag actgtacgac cccgtcggcg gtgagcacgc caactacttc gccgccggcc 1680 tgaagatggc ggaccaggtt gtcgtcgtga gccccgggta cctgtgggag ctgaagacgg 1740 tggagggcgg ctgggggctt cacgacatca tacggcagaa cgactggaag acccgcggca 1800 tcgtgaacgg catcgacaac atggagtgga accctgaggt ggacgtccac ctgaagtcgg 1860 acggctacac caacttctcc ctgaagacgc tggactccgg caagcggcag tgcaaggagg 1920 ccctgcagcg cgagctgggg ctgcaggtcc gcggcgacgt gccgctgctc gggttcatcg 1980 ggcggctgga cgggcagaag ggcgtggaga tcatcgcgga cgcgatgccc tggatcgtga 2040 gccaggacgt gcagctggtg atgctgggca cggggcgcca cgacctggag agcatgctgc 2100 agcacttcga gcgggagcac cacgacaagg tgcgcgggtg ggtggggttc tccgtgcgcc 2160 tggcgcaccg gatcacggcg ggcgccgacg cgctcctcat gccctcccgg ttcgagccgt 2220 gcgggctgaa ccagctctac gcgatggcct acggcaccat ccctgtcgtg cacgccgtcg 2280 gcggcttgag ggataccgtg ccgccgttcg accccttcaa ccactccggg ctcgggtgga 2340 cgttcgaccg cgccgaggcg cacaagctga tcgaggcgct cgggcactgc ctccgcacct 2400 accgggacca caaggagagc tggaggggcc tccaggagcg cggcatgtcg caggacttca 2460 gctgggaaca tgccgccaag ctctacgagg acgtcctcgt ccaggccaag taccagtggt 2520 gaacgctgct acccggtcca gccccgcatg cgtgcatgag aggatggaaa tgcgcattgc 2580 gcacttgcag atttggcgca cgcaggaacg tgccgtcctt cttgatgaga acgccggcat 2640 ccgcgaggtt gagacgctga ttccgatctg gtccgtcgca gagtagagtg aaacgctcct 2700 tgttgcaggt atatgggaat gttttttttc cttttttttt gcgagggagg tatatgggaa 2760 tgttaacttg gtattgtaat gtggtatgct gtgtgcatta ttacatcggt tgttgttgct 2820 tattcttgct agctaagtcg gaggccaaga gcgaaagcta gctcacatgt ctgatgtatg 2880 caagtgacat ggttggtttg gttgtgcagt gcaaacggca ggaatgggaa gtgaattcct 2940 ccctgcttaa attaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2972 <210> 2 <211> 802 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 2 Met Ser Ser Ala Val Ala Ser Pro Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Gly Ala Ser 20 25 30 Pro Thr Arg Ala Gly Ala Gly Arg Leu Gln Trp Arg Pro Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ile 50 55 60 Asp Asp Ala Ala Pro Gly Arg Gln Pro Arg Ala Arg Arg Tyr Gly Ala 65 70 75 80 Ala Thr Lys Val Ala Asp Pro Val Lys Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ala 85 90 95 Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala Pro Arg Gln Asp Ala Ala Arg 100 105 110 Leu Pro Ser Lys Asn Gly Thr Leu Ile Asn Gly Glu Asn Lys Pro Thr 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg 130 135 140 Ala Pro His Leu Ser Ile Gln Asn Arg Val Pro Val Asn Gly Glu Asn 145 150 155 160 Lys His Lys Val Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ile Val Asp Val Ala Ser 165 170 175 Pro Gly Ser Ala Ala Asn Ile Ser Ile Ser Asn Lys Val Pro Pro Ser 180 185 190 Val Val Pro Ala Lys Lys Thr Pro Pro Ser Ser Val Phe Pro Ala Lys 195 200 205 Lys Thr Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Val Ser Ser Ala Ser Ala 210 215 220 Pro Arg Leu Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Leu Ala Gln Lys Lys Asp 225 230 235 240 Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Ala Pro 245 250 255 Ala Ala Pro Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile 260 265 270 Gly Phe Glu Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Ser Ala Val Ala 275 280 285 Asp Asp Ala Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro 290 295 300 Leu Ala Gly Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys 305 310 315 320 Ser Pro Trp Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu 325 330 335 Pro Lys Ala Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro 340 345 350 Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr 355 360 365 Tyr Lys Ala Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr 370 375 380 Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His 385 390 395 400 Arg Gln Gln Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg 405 410 415 Met Ile Leu Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro 420 425 430 Cys Gly Gly Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn 435 440 445 Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg 450 455 460 Asp His Gly Leu Met Gln Tyr Ser Arg Ser Val Met Val Ile His Asn 465 470 475 480 Ile Ala His Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu 485 490 495 Leu Pro Glu His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly 500 505 510 Gly Glu His Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln 515 520 525 Val Val Val Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu 530 535 540 Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr 545 550 555 560 Arg Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val 565 570 575 Asp Val His Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Lys Thr 580 585 590 Leu Asp Ser Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu 595 600 605 Gly Leu Gln Val Arg Gly Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg 610 615 620 Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp 625 630 635 640 Ile Val Ser Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His 645 650 655 Asp Leu Glu Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys 660 665 670 Val Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr 675 680 685 Ala Gly Ala Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly 690 695 700 Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Ile Pro Val Val His 705 710 715 720 Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn 725 730 735 His Ser Gly Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu 740 745 750 Ile Glu Ala Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp His Lys Glu 755 760 765 Ser Trp Arg Gly Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp 770 775 780 Glu His Ala Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu Val Gln Ala Lys Tyr 785 790 795 800 Gln Trp <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 3 cctggaacac ttcagactgt acg 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 4 agcatcacca gctgcacgtc ct 22 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 5 cacgacgttg taaaacgaca cttaagtgcc atgcaaag 38 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 6 agggacaaaa atggctaag 19 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 7 ggaggtctcg gggatgt 17 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 8 gctccaggaa gtaaacggtc agg 23 <210> 9 <211> 2946 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 9 gtgcgtttac cccacacaga gtacactcca actccagtcc agtccagccc actgccgctt 60 ctgcccgccc atcgtaccgt cgcccgcccc gatcccggcc gccgccatgt cgtcggcggt 120 cgcgtccccc gcgtccttcc tcgcgctcgc gtccgcctcg cccgggagat catcacggag 180 gagggcgagg gtgggcgcgt cgccaacccg cgctggggcc ggcaggctgc aatggcggcc 240 gtcgccgctg cagcgcacgg ctcgcgacgg agcggtggcc gcgcgcgccg ccgggatcga 300 cgacgccgcg cccggtaggc agccccgcgc tcgccgctat ggcgccgcca ccaaggtcgc 360 ggatcccgtc aagacgctcg atcgcgacgc cgcggaaggt ggtgggccgt ccccgccggc 420 accgaggcag gacgccgccc gtctgccgag taagaacggc acgctgatca acggtgagaa 480 caaacctacc ggcggcggtg gcgcgactaa agacagcggg ctgcccacac ccgcacgcgc 540 gccccatctg tcaatccaga acagagtacc ggtgaacggt gaaaacaaac ataaggtcgc 600 ctcgccgccg accagcatag tggatgtcgc gtctccgggt tccgcagcca acatttccat 660 cagtaacaag gtgccgccgt ccgttgtccc agccaagaag acgccgccgt cgtccgtttt 720 cccggccaag aaggcgccgc cgtcgtccgt tgtcccggcc aagaagacgc tgccgtcgtc 780 cggctcaaat tttgtgtcct cggcctctgc tcccaggctg gacactgtca gcgatgtgga 840 acttgcacag aagaaggatg cgctgattgt caaagaagct ccaaaaccaa aggctctttc 900 ggcccctgca gcccccgctg tacaagaaga cctttgggat ttcaagaaat acattggttt 960 cgaggagccc gtggaggcca aggatgatgg ctcggctgtt gcagatgatg cgggttcctt 1020 tgaacatcac cagaatcatg attccggacc tttggcaggg gagaacgtca tgaacgtggt 1080 cgtcgttgct gctgaatgtt ctccctggtg caaaacaggt ggtcttggag atgttgcggg 1140 tgctttgccc aaggctttgg ctaagagagg acatcgtgtt atggttgtgg taccaaggta 1200 tggggactat gaggaagcct acgatgtcgg agtccgaaaa tactacaagg ctgctggaca 1260 ggatatggaa gtgaattatt tccatgctta tatcgatgga gtggattttg tgttcattga 1320 cgctcctctc ttccgacacc gtcagcaaga catttatggg ggcagcagac aggaaattat 1380 gaagcgcatg attttgttct gcaaggccgc tgtcgaggtt ccttggcacg ttccatgcgg 1440 cggtgtccct tacggggatg gaaatctggt cttcattgca aatgattggc acacggcact 1500 cctgcctgtc tatctgaaag catattacag ggaccatggt ttgatgcaat acagtcgctc 1560 cgttatggtg atacataaca tcgctcacca gggccgtggc cctgtagatg aattcccgtt 1620 caccgagttg cctgagcact acctggaaca cttcagactg tacgaccccg tcggcggtga 1680 gcacgccaac tacttcgccg ccggcctgaa gatggcggac caggttgtcg tcgtgagccc 1740 cgggtacctg tgggagctga agacggtgga gggcggctgg gggcttcacg acatcatacg 1800 gcagaacgac tggaagaccc gcggcatcgt gaacggcatc gacaacatgg agtgaaaccc 1860 tgaggtggac gtccacctga agtcggacgg ctacaccaac ttctccctga agacgctgga 1920 ctccggcaag cggcagtgca aggaggccct gcagcgcgag ctggggctgc aggtccgcgg 1980 cgacgtgccg ctgctcgggt tcatcgggcg gctggacggg cagaagggcg tggagatcat 2040 cgcggacgcg atgccctgga tcgtgagcca ggacgtgcag ctggtgatgc tgggcacggg 2100 gcgccacgac ctggagagca tgctgcagca cttcgagcgg gagcaccacg acaaggtgcg 2160 cgggtgggtg gggttctccg tgcgcctggc gcaccggatc acggcgggcg ccgacgcgct 2220 cctcatgccc tcccggttcg agccgtgcgg gctgaaccag ctctacgcga tggcctacgg 2280 caccatccct gtcgtgcacg ccgtcggcgg cctgagggat accgtgccgc cgttcgaccc 2340 cttcaaccac tccgggctcg ggtggacgtt cgaccgcgcc gaggcgcaca agctgatcga 2400 ggcgctcggg cactgcctcc gcacctaccg ggaccacaag gagagctgga ggggcctcca 2460 ggagcgcggc atgtcgcagg acttcagctg ggaacatgcc gccaagctct acgaggacgt 2520 cctcgtccag gccaagtacc agtggtgaac gctgctaccc ggtccagccc cgcatgcgtg 2580 catgagagga tggaaatgcg cattgcgcac ttgcagattt ggcgcacgca ggaacgtgcc 2640 gtccttcttg atgagaacgc cggcatccgc gaggttgaga cgctgattcc gatctggtcc 2700 gtcgcagagt agagtgaaac gctccttgtt gcaggtatat gggaatgttt tttttccttt 2760 ttttttgcga gggaggtata tgggaatgtt aacttggtat tgtaatgtgg tatgctgtgt 2820 gcattattac atcggttgtt gttgcttatt cttgctagct aagtcggagg ccaagagcga 2880 aagctagctc acatgtctga tgtatgcaag tgacatggtt ggtttggttg tgcagtgcaa 2940 acggca 2946 <210> 10 <211> 571 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 10 Met Ser Ser Ala Val Ala Ser Pro Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Gly Ala Ser 20 25 30 Pro Thr Arg Ala Gly Ala Gly Arg Leu Gln Trp Arg Pro Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ile 50 55 60 Asp Asp Ala Ala Pro Gly Arg Gln Pro Arg Ala Arg Arg Tyr Gly Ala 65 70 75 80 Ala Thr Lys Val Ala Asp Pro Val Lys Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ala 85 90 95 Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala Pro Arg Gln Asp Ala Ala Arg 100 105 110 Leu Pro Ser Lys Asn Gly Thr Leu Ile Asn Gly Glu Asn Lys Pro Thr 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg 130 135 140 Ala Pro His Leu Ser Ile Gln Asn Arg Val Pro Val Asn Gly Glu Asn 145 150 155 160 Lys His Lys Val Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ile Val Asp Val Ala Ser 165 170 175 Pro Gly Ser Ala Ala Asn Ile Ser Ile Ser Asn Lys Val Pro Pro Ser 180 185 190 Val Val Pro Ala Lys Lys Thr Pro Pro Ser Ser Val Phe Pro Ala Lys 195 200 205 Lys Thr Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Val Ser Ser Ala Ser Ala 210 215 220 Pro Arg Leu Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Leu Ala Gln Lys Lys Asp 225 230 235 240 Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Ala Pro 245 250 255 Ala Ala Pro Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile 260 265 270 Gly Phe Glu Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Ser Ala Val Ala 275 280 285 Asp Asp Ala Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro 290 295 300 Leu Ala Gly Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys 305 310 315 320 Ser Pro Trp Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu 325 330 335 Pro Lys Ala Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro 340 345 350 Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr 355 360 365 Tyr Lys Ala Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr 370 375 380 Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His 385 390 395 400 Arg Gln Gln Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg 405 410 415 Met Ile Leu Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro 420 425 430 Cys Gly Gly Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn 435 440 445 Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg 450 455 460 Asp His Gly Leu Met Gln Tyr Ser Arg Ser Val Met Val Ile His Asn 465 470 475 480 Ile Ala His Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu 485 490 495 Leu Pro Glu His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly 500 505 510 Gly Glu His Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln 515 520 525 Val Val Val Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu 530 535 540 Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr 545 550 555 560 Arg Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu 565 570 <210> 11 <211> 230 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 11 Asn Pro Glu Val Asp Val His Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe 1 5 10 15 Ser Leu Lys Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu 20 25 30 Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln Val Arg Gly Asp Val Pro Leu Leu Gly 35 40 45 Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp 50 55 60 Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly 65 70 75 80 Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu 85 90 95 His His Asp Lys Val Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala 100 105 110 His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe 115 120 125 Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Ile 130 135 140 Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe 145 150 155 160 Asp Pro Phe Asn His Ser Gly Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu 165 170 175 Ala His Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg 180 185 190 Asp His Lys Glu Ser Trp Arg Gly Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln 195 200 205 Asp Phe Ser Trp Glu His Ala Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu Val 210 215 220 Gln Ala Lys Tyr Gln Trp 225 230 C:\NRPortbl\DCC\DXT\3090569_1.DOC-27/02/2012 - 1 -

Claims

야생형 보리에 비하여 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물로서,
상기 곡물은 SSIIa 활성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 내인성 유전자 내에 돌연변이를 포함하되, 상기 돌연변이는 보리 식물 내에 SSIIa를 인코딩하는 유전자 발현을 감소시키거나 감소된 수준 또는 활성을 가지는 SSIIa의 발현을 초래하거나,
상기 SSIIa의 수준은 보리 식물 내에서 SSIIa를 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하는 외인성 핵산 분자에 의하여 감소되되, 상기 외인성 핵산 분자는 내인성 SSIIa 발현을 하향 조절하는 유전자 침묵 키메릭 유전자, 안티센스 분자, 리보자임 분자, 동시 억제 분자, dsRNA 분자, 헤어핀 RNA 분자 또는 마이크로RNA를 포함하고; 및
상기 곡물은 amo1 유전자 활성을 감소시키는 유전적 변이를 추가로 포함하되, 상기 유전적 변이는 amo1 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 것인, 보리 곡물.
제1항에 있어서,
적어도 43% (w/w) 의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물.
제1항에 있어서,
적어도 41-65% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 보리 곡물.
제1항에 있어서, 상기 곡물은 SSIIa 활성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 내인성 유전자 내에 돌연변이를 포함하며 상기 돌연변이에 대해 동형 접합성인, 보리 곡물.
제1항에 있어서, SSIIa 활성을 가지는 폴리펩타이드를 인코딩하는 내인성 유전자 내 돌연변이는 삭제 돌연변이인, 보리 곡물.
제1항에 있어서,
상기 곡물 내에 총 전분의 비율로서 적어도 50% (w/w)의 아밀로오스 함량을 포함하는 보리 곡물.
제6항에 있어서,
상기 곡물 내에 총 전분의 비율로서 적어도 60% (w/w)의 아밀로오스 함량을 포함하는 보리 곡물.
제1항에 있어서,
sex6-292 대립 유전자에 대하여 동형 접합성인 보리 곡물.
제1항에 있어서,
amo1-AC38 대립 유전자에 대하여 동형 접합성인 보리 곡물.
제1항에 있어서,
전곡, 균열된 곡물, 제분된 곡물, 정제된 곡물, 도정된 곡물, 거칠게 빻은 곡물, 압착된 곡물 또는 정맥 곡물인 것을 특징으로 하는 보리 곡물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 곡물을 생산할 수 있는 보리 식물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 곡물로부터 생산되는 보리 통밀.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 곡물로부터 생산되는 보리 가루.
(i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 보리 곡물을 수득 또는 생산하는 단계; 및
(ii) 상기 곡물을 가공하여 식품 또는 음료 제품을 생산하는 단계
를 포함하는 식품 또는 음료 제품의 제조 방법.
제14항에 있어서,
상기 제품은 통밀, 가루, 전분, 겨, β-글루칸, 프룩탄, 비-전분 폴리사카라이드, 균열된 곡물, 제분된 곡물, 정제된 곡물, 도정된 곡물, 거칠게 빻은 곡물, 압착된 곡물 및 정맥 곡물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 가공된 보리 곡물이 하나 이상의 기타 성분과 혼합되어 상기 식품 또는 음료 제품을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 식품은 아침 식사용 시리얼, 비스킷, 머핀, 뮤즐리 바, 국수 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
야생형 보리에 비하여 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 가지는 곡물을 생산할 수 있는 보리 식물의 제조 방법으로서,
상기 방법은 (i) 대조 식물에 대하여 상기 식물 내에 내인성 전분 합성효소 IIa (SSIIa)의 수준 또는 활성을 하향 조절하는 제제를 상기 식물 내로 도입하거나, 또는 상기 식물 내에 SSIIa를 인코딩하는 내인성 유전자 내 돌연변이를 도입하는 단계, 및
(ii) 상기 곡물 및 amo1 유전자 활성을 감소시키는 유전적 변이를 생산하는 보리 식물을 선별하는 단계를 포함하되, 상기 유전적 변이는 amo1 유전자 내 돌연변이를 포함하고; 및
상기 제제는 내인성 SSIIa 발현을 하향 조절하는 유전자 침묵 키메릭 유전자, 안티센스 분자, 리보자임 분자, 동시 억제 분자, dsRNA 분자, 헤어핀 RNA 분자 또는 마이크로RNA인, 방법.
제18항에 있어서,
상기 SSIIa 단백질의 감소된 수준 또는 활성은 대조 식물 또는 상기 제제 또는 돌연변이의 도입 이전의 식물의 것과 비교하여 25% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 실질적으로 결핍된 것을 특징으로 하는 방법.
보리 식물을 재배하는 단계 및 보리 곡물을 수확하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 보리 곡물의 생산 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
제품 내에 저항성 전분, 식이 섬유, 수용성 탄수화물, β-글루칸, 프룩탄 또는 비-전분 탄수화물 수준을 증가시키거나, 또는 제품의 당 지수(GI)를 감소시키기 위한 제품의 제조에 사용하기 위한 또는 사용될 때의 곡물.
건조 중량 기준으로 적어도 10% 수준으로 식품 성분을 포함하는 식품으로서, 상기 식품 성분은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 보리 곡물, 또는 이로부터 얻어지는 통밀 또는 가루이며, 상기 통밀 또는 가루는 감소된 수준 또는 활성의 SSIIa 단백질 및 적어도 41% (w/w)의 전분 함량을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
제22항에 있어서,
상기 통밀 또는 가루는 중량 기준으로 3-11% (w/w) 프룩탄 또는 4-11% (w/w) 프룩탄을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
제22항에 있어서,
상기 통밀 또는 가루는 5-9% (w/w), 또는 9% (w/w) 보다 큰 β-글루칸 함량을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
제22항에 있어서,
상기 통밀 또는 가루는 상기 통밀 또는 가루 내 총 전분의 비율로서 50% (w/w) 또는 60% (w/w) 아밀로오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
제22항에 있어서,
상기 식품은 빵, 번, 아침식사용 시리얼, 케이크, 비스킷, 페이스트리, 크래커, 머핀, 피자, 크로와상, 베이글, 프레첼, 파스타, 국수, 베이킹 성분, 베이킹 믹스, 수프, 소스, 증점제, 사탕 과자류, 및 기타 전분질 식품으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식품.
제22항에 있어서,
상기 보리는 sex6-292 대립 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 보리 곡물을 다른 식품 또는 음료 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 식품 또는 음료의 제조 방법.
제12항의 보리 통밀을 다른 식품 또는 음료 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 식품 또는 음료의 제조 방법.
제13항의 보리 가루를 다른 식품 또는 음료 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 식품 또는 음료의 제조 방법.
포유 동물 내에서 하나 이상의 건강 지표를 향상시키기 위하여 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분을 제공하는 방법으로서,
상기 포유 동물에, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 보리 곡물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
포유 동물 내에서 하나 이상의 건강 지표를 향상시키기 위하여 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분을 제공하는 방법으로서,
상기 포유 동물에, 제22항에 따른 식품을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제31항에 있어서,
상기 곡물, 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, β-글루칸, 프룩탄, 비전분 폴리사카라이드, 식이 섬유 또는 저항성 전분은 식품, 음료 또는 약학적 조성물의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서,
상기 하나 이상의 건강 지표는 이로운 장내 세균 수 증가, 이상함몰점 수 감소, 무기 이온 흡수 증가, 인슐린 수준 감소, 당지수 감소, 당부하지수 감소, 혈당 감소, 혈압 감소, 체중 감소, 혈중 콜레스테롤 수준 감소, HDL 콜레스테롤 수준 증가, 골밀도 증가, 칼슘 수준 증가, 더 잦은 배변 운동, 또는 향상된 혈청 심혈관 프로필인 것을 특징으로 하는 방법.
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