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KR101791296B1 - 알츠하이머병 관련 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터, 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주 - Google Patents

알츠하이머병 관련 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터, 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주 Download PDF

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KR101791296B1
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Abstract

본 발명은 알츠하이머병과 관련된 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명의 발현 카세트는 알츠하이머병과 관련된 APP(아밀로이드 전구 단백질), Tau(타우 단백질) 및 PS1(프리세닐린 1:Preseniline -1) 돌연변이 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 이들 유전자를 포함한다. 또한 본 발명은 상기 유전자들을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주에 관한 것이며, 나아가 상기 벡터 또는 세포주를 이용하여 형질전환된 동물 모델에 관한 것이다.

Description

알츠하이머병 관련 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터, 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주 {Expression cassette and vector with genes related Alzheimer's disease and transgenic cell line made from it}
본 발명은 알츠하이머병과 관련된 유전자를 포함하는 발현 카세트, 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 세포주에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명의 발현 카세트는 알츠하이머병과 관련된 APP(아밀로이드 전구 단백질), Tau(타우 단백질) 및 PS1(프리세닐린 1:Preseniline-1) 돌연변이 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 이들 유전자를 포함한다. 또한 본 발명은 상기 유전자들을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주에 관한 것이며, 나아가 상기 벡터 또는 세포주를 이용하여 형질전환된 동물 모델에 관한 것이다.
알츠하이머병은 퇴행성 뇌질환 중 하나로서 신경세포의 점진적인 퇴화로 인해 인지능력 상실을 가져오는 치매 중 60%를 차지한다. 알츠하이머는 원인에 따라서 유전적 요인에 의해 나타나는 가족성 알츠하이머병과 정확한 원인은 알 수 없으나 많은 수의 환자에게서 발병하는 산발성 알츠하이머병으로 나뉜다. 현미경으로 알츠하이머병으로 사망한 환자의 뇌 조직을 검사하였을 때, 특징적인 병변으로 신경반 (neuritic plaque) (또는 노인반) 과 신경원섬유 다발(neurofibrillary tangles)등이 관찰되고, 육안 관찰 시에는 신경세포 소실로 인하여 전반적 뇌 위축 소견이 보이다.
이 중 신경반은 세포외부에 단백질과 죽은 세포 등이 축적되어 형성되는 것으로서 주 구성성분은 42개 혹은 43개의 아미노산으로 이루어진 β-아밀로이드(Aβ)라는 펩티드이며, 신경원섬유 다발은 세포 내에서 세포골격(cytoskeleton)이 과다하게 인산화된 Tau 단백질을 중심으로 비정상적으로 뭉쳐져 실뭉치처럼 보이는 것을 말한다.
알츠하이머병의 대표적인 원인유전자로 알려진 APP, Tau 및 PS1이 알츠하이머병을 일으키는 병인기전인 이러한 β-아밀로이드의 과발현과 Tau 단백질의 응집에 기여 한다는 것이 알려져 있다.
β-아밀로이드는 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor protein; APP)로부터 프로테올리시스(proteolysis) 과정을 통해 만들어진다. 전구단백질인 APP는 하나의 트랜스맴브레인 도메인(transmembrane domain)을 가지고 있는 단백질로 교번 스플리싱(alternative splicing)에 의해 몇 가지 이소타입으로 발현되며 세포 내에서 두 가지 대사경로를 거치는 것으로 알려져 있다. 한가지는 α-시크리테아제와 γ-시크리테아제에 의해 p3와 sAPPα가 생성되는 경로이며 다른 한가지는 β-시크리테아제와 γ-시크리테아제에 의해 β-아밀로이드와 APPβ가 생성되는 경로이다. 가족성 알츠하이머병 환자들에서 이 APP 단백질에 돌연변이가 발견된다. 지금까지 발견된 돌연변이는 APP670/671(Swedish), APP672(Flemish), APP716(Florida), APP717 (London) 등이 있으며 이들 돌연변이에서 β-아밀로이드의 형성이 증가하는 것이 밝혀져 있다.
가족성 알츠하이머병을 유발하는 돌연변이를 나타내는 또 다른 한가지의 유전자는 프리세닐린 1(PS1)이다. PS1은 8개의 트랜스맴브레인 도메인을 가진 단백질로서 발생 과정에서 중요한 역할을 하며 γ- 시크리테아제 자체 또는 복합체의 일원으로 작용하는 것으로 알려져 있다. PS1은 단백질 전체에 걸쳐 가족성 알츠하이머병을 유발하는 돌연변이들이 45가지 이상이 보고되어 있으며 이들 돌연변이들 역시 β-아밀로이드의 형성량을 증가시키는 것으로 밝혀져 있다.
생성된 β-아밀로이드에 의한 알츠하이머병의 발병은 Tau 단백질의 과인산화에 의한 신경세포손상의 과정을 동반하며, 이러한 Tau 단백질의 과인산화에는 몇 가지 인산화효소가 작용하는 것으로 알려져 있다. Tau의 과인산화와 더불어 Tau의 tangle 형성 또한 신경세포를 손상시키는 역할을 하며, 다발 (tangle)이 잘 형성되는 Tau의 돌연변이가 발견되었다.
인간 뇌세포의 노화 외에도, β-아밀로이드의 축적과 응집, Tau 단백질의 tangle 형성기전을 밝히는 것이 알츠하이머병의 치료방법에 있어서 중요한 역할을 할 것으로 예상되므로, 이를 연구하기 위하여 APP 유전자 돌연변이, PS1 유전자 돌연변이, 및 Tau 유전자 돌연변이가 동시에 발현하는 세포주 또는 동물 모델을 수립할 필요성이 요구된다.
여러 연구에서 알츠하이머병의 병인기전의 연구를 위해서 형질전환 마우스를 수립하기 위한 시도가 있었다. 이러한 시도의 주 목표가 된 형질전환 유전자는 가족성 알츠하이머병에서 원인 유전자로 밝혀진 APP, PS1, Tau 및 ApoE4 같은 유전자들이다. 현재 연구에 주로 사용되고 있는 형질전환 마우스는 APP 또는 PS1 유전자 돌연변이를 이용하여 뇌 속에 β-아밀로이드의 농도를 올려서 신경반이 형성되게 하는 모델이다. 하지만 β-아밀로이드만으로는 알츠하이머병의 병인기전을 정확히 알기 어렵기 때문에 최근에는 Tau의 돌연변이 유전자를 동시에 넣는 시도들이 이뤄지고 있다. 이는 형질전환 마우스의 뇌 속에 β-아밀로이드 및 Tau를 동시에 발현시켜 인간의 알츠하이머병에 보다 더 근접한 모델을 만들기 위한 것이다.
또한 APP 및 PS1 이 동시에 돌연변이 형태로 존재하면 β-아밀로이드를 보다 이른 시기에 만들어 낼 수 있다. 1세대 형질전환 마우스인 TG2576는 생후 12개월 이상 사육을 해야 뇌 속에 β-아밀로이드의 축적 현상이 시작되는데 반하여, 5XFAD 또는 APP/PS1 마우스의 경우에는 6개월 이내에 β-아밀로이드 축적이 시작된다. 1996년 Duff 그룹에서 APP 및 PS1의 단일 형질전환 마우스를 교배시켜서 얻은 이중 형질전환 마우스의 개발에 성공한 이후 현재까지 여러 연구에서 이 형질전환 마우스가 사용되고 있다. 실제로 이중 형질전환 마우스의 경우 두 가지 유전자의 상승 효과(Synergistic Effect)로 인해 반점 형성기간이 3개월에서 9개월 사이로 앞당겨짐을 관찰할 수 있다. 하지만, 이들 마우스는 대부분이 APP 및 PS1 각각의 형질전환 마우스를 교배하여 얻어진 것이기 때문에 각 유전자의 발현은 각각의 프로모터로부터 독립적으로 조절되며, 사용된 프로모터들은 신경세포에만 특이적으로 발현되는 것이 아닌 경우가 많아 알츠하이머병의 병인 기전 연구에 어려움이 있다. 또한 설치류인 마우스의 경우에는 대사작용이 인간과 많이 달라서 알츠하이머병 약물 개발 시 그 유효성 평가에 많은 차이를 보이기도 한다.
이러한 문제점을 개선하기 위해서는 하나의 염색체 상에 알츠하이머병 돌연변이 유전자들이 존재하여 다음세대로 완전 연관되어 유전될 수 있어야 하며, 비설치류 중에서 형질전환이 자유롭고 인간과 매우 가까운 동물을 이용할 필요성이 요구된다.
본 발명의 목적은, 알츠하이머병과 관련된 APP(아밀로이드 전구 단백질), Tau(타우 단백질) 및 PS1(프리세닐린 1:Presenilin -1) 돌연변이 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 이들 유전자를 포함하는 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주 및 형질전환된 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트는 a) 아밀로이드 전구단백질(APP)을 암호화하는 APP 돌연변이 유전자, b) 타우 단백질(Tau)을 암호화하는 타우 돌연변이 유전자, c) 프리세닐린 1(PS1)을 암호화하는 PS1 돌연변이 유전자 및 d) 상기 세 돌연변이 유전자를 한번에 조절할 수 있는 신경세포 특이적 프로모터를 포함한다.
상기 프로모터는 인간 PDGF-β 융합 프로모터일 수 있으며, 또는 서열번호 2의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트는 CMV 인핸서를 더 포함할 수 있다.
상기 CMV 인핸서는 서열번호 3의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 APP 돌연변이 유전자는 595번 아미노산, 596번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있으며, 또는 서열번호 4의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 타우 돌연변이 유전자는, 243번 아미노산이 돌연변이된 것일 수 있으며, 또는 서열번호 5의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트
상기 PS1 돌연변이 유전자는, 146번 아미노산, 286번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있으며, 또는 서열번호 6의 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 APP 돌연변이 유전자, 상기 타우 돌연변이 유전자 및 상기 PS1 돌연변이 유전자 각각의 사이에 2A 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 2A 서열은, 서열번호 8의 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트를 포함한다.
상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 9의 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 세포주는 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 것이다.
본 발명의 인간을 제외한 동물은 상기 재조합 발현 벡터 또는 상기 형질전환된 세포주를 이용하여 형질전환된 것이다.
상기 인간을 제외한 동물은 포유류일 수 있다.
상기 동물은 돼지일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터 제조방법은, 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계; 제2 벡터 내에 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및 상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함한다.
본 발명은, 하나의 유전자 운반벡터에 하나의 프로모터를 사용하여 세 가지 알츠하이머병 관련 유전자 APP, PS-1 및 타우 (Tau)가 동시에 조절 및 발현될 수 있도록 하는 유전자 발현 카세트, 발현 벡터, 형질전환된 세포주, 및 형질전환된 동물모델을 제공하며, 이는 세 가지 알츠하이머병 관련 유전자들 사이의 병인 기전을 밝히는 연구에 이용될 수 있다. 또한 이렇게 생산된 세포주 또는 동물모델은 발병 시간이 기존의 동물모델의 발병 시간보다 짧으므로 알츠하이머병 관련 약물 개발에 보다 효율적으로 이용될 수 있다.
도 1a는, 본래의 pTet CKOS 레트로바이러스 벡터의 모식도이다.
도 1b는, 구조 변형된 pTet 벡터의 모식도이다.
도 2는, hPDGFb 프로모터, hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자를 포함하는 psCMV 벡터의 구조 모식도이다.
도 3a는, CMV 인핸서 및 hPDGF-β 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조 모식도이다.
도 3b는, CMV 인핸서 및 hPDGF-β 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 고리형 구조 모식도이다.
도 4는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 HEK-293 세포에 일시발현 (transient expression)시킨 후에 웨스턴 블롯 (Western blot) 으로 단백질을 확인한 사진이다.
도 5는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 인테그레이션 (integration) 확인에 사용된 프라이머들이다.
도 6은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 이용한 돼지 세포주 16개를 확인한 사진이다.
도 7은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터로 만든 돼지 세포주를 분석한 사진이다.
이하, 실시예들을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
본 발명은, a) 아밀로이드 전구단백질(APP)을 암호화하는 APP 돌연변이 유전자, b) 타우(Tau)단백질을 암호화하는 타우 돌연변이 유전자, c) 프리세닐린 1(PS1)을 암호화하는 PS1 돌연변이 유전자 및 d) 상기 세 돌연변이 유전자를 한번에 조절할 수 있는 신경세포 특이적 프로모터를 포함하는, 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트를 제공한다.
상기 프로모터는 신경세포에서 유전자가 특이적으로 발현될 수 있게 하는 프로모터이면 그 종류를 구별하지 않고 사용 가능하다. 본 발명의 일실시예로서, 상기 프로모터는 인간 PDGF-β 융합 프로모터 (hPDGF promoter : Platelet Drived Growth Factor promoter)일 수 있으며, 이는 돼지의 뇌세포에서 외래유전자가 발현될 수 있게 하는 프로모터로 알려져있다.
상기 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트는, 유전자의 발현을 보다 향상시키기 위하여 인핸서를 더 포함할 수 있으며, 본 발명의 일실시예로서 CMV (Cytomegalo virus) 인핸서를 포함할 수 있다.
상기 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트는, 상기 APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 및 PS1 돌연변이 유전자 각각의 사이에 2A 서열을 더 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 APP 돌연변이 유전자와 상기 타우 돌연변이 유전자 사이에 2A 서열을 더 포함하고, 상기 타우 돌연변이 유전자와 상기 PS1 돌연변이 유전자 사이에 2A 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 2A 유전자서열은 18 내지 22개 아미노산을 코딩하고 있으며 그 중에서 말단에 위치하는 4개의 아미노산 Asparagine (N), Proline (P), Glycine (G), Proline (P)은 종간에 중요하게 보존되어 있는 아미노산이다. 상기 서열은 펩티드로 합성될 때, 자기-분열 (self-cleavage)이 일어나는 경향을 보인다. 이러한 성질로 인하여 리보좀(Ribosome)이 단백질 전사를 진행할 때 2A 서열 말단에 위치한 N, P, G를 암호화한 유전자 코드 (genetic code)에 도달하면, NPG를 차례로 인지하여 펩티드 결합을 만들고 다음 아미노산인 proline 암호화 코드에 Proline 이 결합된 prolyl-tRNA을 가져오는 대신에 방출 요소 (releasing factor: RF) 인자를 가져온다. RF 인자가 결합하고 난 다음에는 앞에서 이미 형성된 펩티드는 더 이상 펩티드 결합을 이어가지 못하고 리보좀에서 방출된다. 그리고 2A 서열 이후에 암호화된 코드는 정상적으로 작동하여 다음 단백질 전사를 진행하게 된다. 결론적으로 2A 서열을 삽입함으로써 하나의 프로모터를 이용하여 여러 유전자를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 유전자 카세트는 이러한 2A 서열을 세 유전자들 사이 각각에 삽입함으로써, 상기 유전자들을 동시에 발현할 수 있다.
상기 APP 돌연변이 유전자는, 595번 아미노산, 596번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는, 243번 아미노산이 돌연변이된 것일 수 있다. 또한, 상기 PS1 돌연변이 유전자는, 146번 아미노산, 286번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있다. 이러한 돌연변이된 아미노산의 일실시예로서, 상기 APP 돌연변이 유전자는 APP695의 595번 아미노산 Lys 이 Asn 으로 돌연변이 되고, 596번 아미노산 Met 이 Lys 으로 돌연변이 되어있는 유전자일 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는 243번 아미노산 Phe 이 Lys 으로 돌연변이 되어있는 유전자일 수 있다. 또한 상기 PS1 돌연변이 유전자는 146번 아미노산 Met 에서 Leu 으로 돌연변이 되고, 286번 아미노산 Pro 이 Leu 으로 돌연변이된 유전자일 수 있다.
본 발명의 일실시예로, 상기 APP 돌연변이 유전자는 서열번호 4의 서열을 가질 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는 서열번호 5의 서열을 가질 수 있으며, 또한 상기 PS1 돌연변이 유전자는 서열번호 6의 서열을 가질 수 있다.
본 발명은, 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 일실시예로 사용할 수 있는 발현 벡터는, 신경세포에 특이적으로 상기 알츠하이머 관련 단백질을 효율적으로 발현을 유도 하고자 할 때 이용 될 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 사용가능하나, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명은, 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주를 제공하며, 또한 상기 세포주를 이용하여 형질전환된 인간을 제외한 동물을 제공한다.
상기 세포주는 포유류에서 비롯된 것이면 인간을 제외하고 제한 없이 사용가능하다. 하지만 기존에 주로 사용되는 마우스의 경우, 대사가 매우 빠르며 일생의 변화가 인간과 매우 다르기 때문에 정확한 질병모델로 사용하기에 어려운 점이 있어왔다. 따라서 인간의 몸집과 유사한 크기를 갖고 있으며 대사 측면에서 유사한 형태를 가지는 동물이 바람직하며, 그 중에서도 돼지가 가장 바람직하다. 본 발명에 의하여 생산되는 알츠하이머병의 돌연변이 유전자로 형질전환된 돼지를 이용할 경우, 알츠하이머 관련 세 가지 유전자를 동시에 생성하게 함으로써 세 가지 유전자의 작용을 동시에 연구할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 신경세포에서 특이적으로 발현하게 함으로써 알츠하이머병에서 문제가 되는 신경계에서의 변화만을 중점적으로 연구할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 새로운 레트로바이러스 벡터의 제조
레트로바이러스의 벡터인 pTet-CKOS 를 이용하여 이 벡터에 존재하는 TRE 미니멀 CMV 프로모터와 CKOS 유전자 클러스터를 제거하였다. 유전자 클로닝에 유리하도록 BglII, SwaI, PacI, NotI 그리고 XhoI 등의 제한효소부위를 갖도록 벡터를 수정하였다.
도 1a는, 본래의 pTet CKOS 레트로 바이러스 벡터의 모식도이다.
도 1b는, 구조 변형된 pTet 벡터의 모식도이다.
본래의 pTet-CKOS 벡터 총 길이 13,320bp 중에서 TRE 미니멀 프로모터 (TRE minimal promoter)와 CKOS 부분 (5,568bp)를 제거하고, 이곳에 76bp 멀티플 클로닝 사이트 (multiple cloning site)를 삽입하였다 (도 1a 에서 도 1b로). 구조 변형된 pTet 벡터의 염기서열의 일실시예는 첨부된 서열목록 1을 참고할 수 있다.
실시예 2 : CMV 인핸서, hPDGF 프로모터, 알츠하이머병 유전자 도입
인간 PDGF 프로모터, CMV 인핸서, 및 알츠하이머병의 원인이 되는 β-아밀로이드의 전구단백질(APP) 유전자(NM_201414.2), 프리세닐린(PS-1) 유전자(NM_000021.3), 타우(Tau) 유전자(NM_016834.4) 등을 벡터에 삽입하기 위하여 제한효소 사이트가 포함된 프라이머를 제작하여 사용하였다.
표적 프라이머 이름 서열 (5' -> 3') 크기
pTet-enz. insert pTet-Enz-insert-F AGATCTATTTAAATACCGGT 67bp
pTet-Enz-insert-R CTCGAGGCGGCCGCCCTGCA
hPDGFb promoter BamH1-Swa1-PDGFb-F GGATCCATTTAAATGCTGGGACTACAGGAGCTTG 1530bp
PDGFb-Cla1-R ATCGATGTGCGCGCAAAGTATCTCTA
hAPPswcDNA
 Cla1-hAPPsw-F ATCGATATGCTGCCCGGTTTGGCACT 2106bp
hAPPsw-Pac1-Sph1-R GGCATGCTTAATTAAGTTCTGCATCTGCTCAAAGA
hTaucDNA
 Bgl2-hTau-F AGATCTATGGCTGAGCCCCGCCAGGA 1161bp
hTau-EcoR1-R GAATTCCAAACCCTGCTTGGCCAGGG
2A peptide EcoR1-2A-F GAATTCGGAAGCGGAGCTACTAACTT 78bp
2A-Xho1-R CTCGAGAGGTCCAGGGTTCTCCTCCA
hPS1 cDNA
 Xho1-hPS1-F CTCGAGATGACAGAGTTACCTGCACC 1424bp
hPS1-Xba1-R TCTAGACCTGCAGGCTAGATATAAAATTGATGGA
CMV nhancer
 CMVE-F ATTTAAATGCGTTACATAACTTACGG 321bp
CMVE-R ATTTAAATCATGGTAATAGCGATGAC
상기 표 1은 사용된 프라이머들을 나타낸 것이다.
알츠하이머병 관련 유전자들이 뇌신경세포에서 특이적으로 과발현하도록 CMV 인핸서와 PDGF 프로모터를 hybrid 형태로 만들어서 프로모터로 사용하였다. 최종 벡터인 레트로바이러스 벡터를 만들기 전에 각각의 돌연변이 유전자, CMV 인핸서 및 PDGF 프로모터를 psCMV 벡터에 삽입하였다. psCMV 에 유전자를 삽입하기 위해 각각 PCR 을 이용하여 증폭하였으며, 백터 내 도입된 제한효소 사이트를 이용하여 클로닝하였다.
도 2는, 본 발명의 일실시예로 제조된, hPDGFb 프로모터, hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자를 포함하는 psCMV 벡터의 구조 모식도이다.
실시예 3 : 알츠하이머병 유전자의 돌연변이 도입
psCMV 벡터에 삽입한 후에 알츠하이머병 돌연변이 유전자의 아미노산 변이를 유도하기 위하여 위치선택적 돌연변이 키트 (site-directed mutagenesis kit: Stratagene)를 이용하였다.
상기 표 2는 돌연변이를 일으키기 위하여 사용된 프라이머들을 나타낸 것이다.
표적 프라이머 이름 서열 (5' -> 3')
hAPPSw Mutagenesis-1 hAPPsw-M1(KM/NL)-F GAGATCTCTGAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCCGA
hAPPsw-M1(KM/NL)-R TCGGAATTCTGCATCCAGATTCACTTCAGAGATCTC
hAPPSw Mutagenesis-2 hAPPsw-M2(IV/VI)-F GTCATAGCGACAGTGGTCATCATCACCTTGGTGATG
hAPPsw-M2(IV/VI)-R CATCACCAAGGTGATGATGACCACTGTCGCTATGAC
hTau Mutagenesis hTau-M(P/L)-F AATATCAAACACGTCCTGGGAGGCGGCAGTGTGC
hTau-M(P/L)-R CACACTGCCGCCTCCCAGGACGTGTTTGATATT
hPS1 Mutagenesis-1 hPS1-M1(M/V)-F AGTGTCATTGTTGTCCTGACTATCCTCCTGGTG
hPS1-M1(M/V)-R CACCAGGAGGATAGTCAGGACAACAATGACACT
hPS1 Mutagenesis-2 hPS1-M2(L/V)-F TGAAACGCTTTTTCCAGCTGTCATTTACTCCTCAACA
hPS1-M2(L/V)-R TGTTGAGGAGTAAATGACAGCTGGAAAAAGCGTTTCA
APP 의 경우에는 뇌신경세포에 발현되는 APP695 타입의 유전자를 이용하였으며 유전자의 알츠하이머병의 가족적 변이 (familial mutation)가 발견된 595번 및 596번 두 군데 이중 돌연변이를 도입하였다. 이들 돌연변이는 β-아밀로이드 42 형태를 더 많이 만들어 내는 것으로 알려져 있다. 상기 아미노산 변이는 각각 K595N, N596M 으로 명명하였다. 프리세닐린 역시 두 개의 아미노산 돌연변이가 도입되었다. 146번과 286번 아미노산의 돌연변이가 도입되었으며, 각각 M146L, P286L 로 명명되었다. Tau의 경우에는 243번 아미노산 한 개만 변이되었으며 P243L 로 명명되었다.
세 개의 돌연변이 유전자는 하나의 mRNA 로 전사가 된 후에, 각각 단백질로 번역이 될 때 독립적인 펩티드로 분리되도록 하기 위해서 2A서열로 서로 연결되도록 하였다(도 2).
실시예 4 : pTet 레트로바이러스 멀티-시스트로닉 벡터의 완성
PDGF 프로모터와 세 개의 돌연변이 유전자가 일렬로(tandem) 연결된 psCMV 벡터를 제조한 후에, 실시예 1에서 제조한 레트로바이러스 벡터로 SwaI, PAcI 및 NotI 제한효소를 이용하여 옮겨 최종 재조합 발현벡터를 완성하였다. 완성된 재조합 발현벡터는 염기서열 결정을 통해 전체 14,618bp 의 DNA 서열을 확인하였다.
도 3은, CMV 인핸서 및 hPDGF-β 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조 (도 3a) 및 이의 고리형 구조 (도 3b) 이다. 본 발명의 재조합된 최종 벡터의 일실시예로, pTet-CMVE-hPDGFb-APPsw-2A-Tau-2A-PS1 의 염기서열은 첨부된 서열목록 9을 참고할 수 있다.
실시예 5 : 최종 재조합 발현벡터의 발현 확인
최종 재조합 발현벡터를 DNA 프레퍼레이션 (DNA preparation)하여 리포펙타민(Lipofectamine: Invitrogen) 방법을 이용하여 HT22 세포에 트렌스펙션 (transfection)하여 18시간 뒤에 세포 내에 세 개의 유전자가 동시에 발현하는지 확인하였다.
세 가지 유전자의 발현은 각각에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot) 방법으로 확인하였다. APP 발현은 22C11 항체와 6E10 항체를 이용하였으며, Tau 는 Tau5 항체를 이용하였고 PS1 은 PS1 특이적 항체를 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
도 4는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 HEK-293 세포에 일시발현 (transient expression)시킨 후에 웨스턴 블롯으로 단백질을 확인한 사진이다. 도 4에서 각각의 밴드가 뚜렷이 나타난 것으로 미루어보아, 재조합 발현벡터에서 2A 시스템이 제대로 작동하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6 : 알츠하이머병 돌연변이 유전자가 도입된 돼지 세포주 개발
최종 재조합 발현벡터를 DNA 프레퍼레이션하고 전기천공법 (electroporation)으로 돼지 귀세포에 트랜스펙션하여 히그로마이신 (hygromycin)으로 세포주를 선별하였다. 전기천공법은 총 11가지 조건에서 실시하였다.



 3275 세트 파라미터
천공 펄스 (Poring Pulse: PP) 트랜스퍼 펄스 (Transfer Pulse: TP)
V
 시간 간격 횟수
 붕괴율
(Decay rate)		 V
 시간 간격 횟수
 붕괴율
(Decay rate)		 극성
(Polarity)
(ms) (ms) (%) (ms) (ms) (%)
1 대조군 (전기천공 하지 않은 DNA와 세포를 갖는)
2 125 2.5 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
3 125 5 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
4 150 5 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
5 175 5 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
6 200 5 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
7 225 5 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
8 275 0.5 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
9 275 1 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
10 275 1.5 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
11 275 2 50 2 10 20 50 50 5 40 +/-
상기 표는 실시된 전기천공법의 조건을 나타낸 것이다.
유전자 도입 및 발현 효율이 가장 높은 #5조건 (175 V, 5 ms)을 이용하여 히그로마이신 (300 ug/mL)을 5일간 지속적으로 처리하여 세포주 선별을 실시하였다. 선별된 세포주에서 세 가지 돌연변이 유전자가 염색체에 도입되었는지 PCR로 확인하였다.
도 5는, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 인테그레이션 (integration) 확인을 위해 PCR에서 사용된 프라이머들이다.
도 6은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터를 이용한 돼지 세포주 16개를 확인한 사진이다.
총 16개의 콜로니로부터 각각의 세포주를 획득하였으며 프로모터 부분부터 각각의 돌연변이 유전자, 그리고 poly(A)에 이르기까지 모든 유전자 부위가 염색체에 인테그레이션 되어 있는 것을 도 6의 사진을 통하여 확인하였다.
실시예 7 : 알츠하이머병 돌연변이 유전자가 도입된 돼지 세포주 분석
실시예 6에서 얻어진 알츠하이머병 돌연변이 유전자 도입된 세포주를 계대배양하여 세포수를 늘리고 분리하여 스톡을 만들었다. 생산된 세포주는 단백질 추출을 하여 알츠하이머병 유전자 세 가지가 모두 발현하는지를 확인하였다.
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 발현을 확인하였다.
도 7은, pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터로 만든 돼지 세포주를 분석한 사진이다.
단백질의 발현양에서 각각 차이는 있으나 세포주에서 세 가지 단백질 모두를 발현하는 것을 도 7에서 확인할 수 있었다.
실시예 8 : 핵치환 또는 DNA 주입에 의한 알츠하이머질환 모델 돼지의 생산
알츠하이머질환 모델 돼지 생산을 위한 형질전환 수정란 생산은 핵치환 방법과 DNA 주입으로 실시하였다. 핵치환 방법에 의한 형질전환 수정란 생산을 위해 먼저 체외 성숙된 돼지 난자의 탈핵을 실시하고 알츠하이머병 유전자가 도입된 형질전환 세포를 바로 주입하여 0.3M mannitol (Sigma) 용액내에서 LF201 Electro Cell Fusion Generator (NEPA GENE, Shioyaki, Japan) 을 사용하여 세포 융합을 실시하였으며 (120 volt에서 1pulse 60㎲) 30분 후에 세포융합여부를 관찰한 다음 7.5 mg/ml cytochalasin B (sigma) 가 첨가된 PZM-5 배양액에 5시간 처리하였다.
DNA 주입에 의한 형질전환 수정란 생산방법은 체외 성숙된 돼지난자에 신선한 돼지 정자로 체외수정을 5시간 동안 실시하고 (난자 1개당 5,000 마리의 정자농도), 수정 후 18시간째에 15,000rpm 내지 18,000rpm에서 10분 정도 원심분리를 하여 지방구가 한쪽으로 모이게 한 뒤 미세조작기로 고정한 후, eppendorf femtojet을 사용하여 돼지 수정란의 전핵 (pronuclei)에 2 ng/ul 농도의 형질전환 DNA를 주입하여 생산하였다.
생산된 형질전환 수정란 (핵치환법 또는 DNA 주입법) 은 알츠하이머질환 모델 돼지를 생산하기 위해 대리모에 이식을 실시하게 되는데 보통 대리모 한 마리당 대략 150 내지 200여개의 난자를 이식하였다. 이때의 수란돈의 상태는 보통 배란 전 상태의 돼지를 사용하여 이식을 하고 이식 후 100일을 전후하여 1차 초음파 검사를 수행하였다. 2차 초음파 검사는 150일 정도에 관찰을 하고 대략 180일경에 분만을 유도하여 알츠하이머질환 모델 돼지를 생산하였다.
<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Expression cassette and vector with genes related Alzheimer's disease and transgenic cell line made from it <130> APC-2014-0154 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7785 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Tet vector Sequence <400> 1 tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60 ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120 tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180 gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240 ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300 tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360 taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc cgctctccga gctcaataaa 420 agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcttccgat agactgcgtc gcccgggtac 480 ccgtattccc aataaagcct cttgctgttt gcatccgaat cgtggtctcg ctgttccttg 540 ggagggtctc ctctgagtga 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tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta 1440 tccagccctc actccttctc taggcgccgg aattccgatc tgatagcttg ccacaacccg 1500 taccaaagat ggatagatcc ggaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc 1560 tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc 1620 gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg 1680 atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc 1740 cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg 1800 cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg 1860 tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc 1920 cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg 1980 ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg 2040 cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg 2100 tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca 2160 ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct 2220 ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg 2280 agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct 2340 atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg 2400 caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg 2460 ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca 2520 ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagtagat gccgaccgaa caagagctga tttcgagaac 2580 gcctcagcca gcaactcgcg cgagcctagc aaggcaaatg cgagagaacg gccttacgct 2640 tggtggcaca gttctcgtcc acagttcgct aagctcgctc ggctgggtcg cgggagggcc 2700 ggtcgcagtg attcaggccc ttctggattg tgttggtccc cagggcacga ttgtcatgcc 2760 cacgcactcg ggtgatctga ctgatcccgc agattggaga tcgccgcccg tgcctgccga 2820 ttgggtgcag atctatttaa ataccggtac gcgtatgcat ttaattaagt ttaaacatgc 2880 atcctgcagg gcggccgcct cgagagatcc cctcaggata tagtagtttc gcttttgcat 2940 agggaggggg aaatgtagtc ttatgcaata ctcttgtagt cttgcaacat ggtaacgatg 3000 agttagcaac atgccttaca aggagagaaa aagcaccgtg catgccgatt ggtggaagta 3060 aggtggtacg atcgtgcctt attaggaagg caacagacgg gtctgacatg gattggacga 3120 accactgaat tccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacagcaaac 3180 gccatttgac cattcaccac attggtgtgc acctccaagc ttgttaattc accatgtcta 3240 gactggacaa gagcaaagtc ataaacggcg ctctggaatt actcaatgga gtcggtatcg 3300 aaggcctgac gacaaggaaa ctcgctcaaa agctgggagt tgagcagcct accctgtact 3360 ggcacgtgaa gaacaagcgg gccctgctcg atgccctgcc aatcgagatg ctggacaggc 3420 atcataccca cttctgcccc ctggaaggcg agtcatggca agactttctg cggaacaacg 3480 ccaagtcatt ccgctgtgct ctcctctcac atcgcgacgg ggctaaagtg catctcggca 3540 cccgcccaac agagaaacag tacgaaaccc tggaaaatca gctcgcgttc ctgtgtcagc 3600 aaggcttctc cctggagaac gcactgtacg ctctgtccgc cgtgggccac tttacactgg 3660 gctgcgtatt ggaggaacag gagcatcaag tagcaaaaga ggaaagagag acacctacca 3720 ccgattctat gcccccactt ctgagacaag caattgagct gttcgaccgg cagggagccg 3780 aacctgcctt ccttttcggc ctggaactaa tcatatgtgg cctggagaaa cagctaaagt 3840 gcgaaagcgg cgggccggcc gacgcccttg acgattttga cttagacatg ctcccagccg 3900 atgcccttga cgactttgac cttgatatgc 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APPsw sequence <400> 4 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta 60 cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga 120 ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa 180 acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg 240 cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg 300 ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt 360 gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg 420 atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag 480 aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct gcggaattga caagttccga 540 ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat 600 gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg 660 agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa 720 gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa 780 ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca 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tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 12420 gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 12480 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 12540 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 12600 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 12660 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 12720 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 12780 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 12840 ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 12900 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 12960 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 13020 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 13080 acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 13140 gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 13200 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 13260 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 13320 caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 13380 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 13440 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 13500 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 13560 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 13620 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 13680 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt 13740 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 13800 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 13860 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 13920 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 13980 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 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Claims (20)

  1. a) 아밀로이드 전구단백질(APP)을 암호화하는 APP 돌연변이 유전자, b) 타우단백질(Tau)을 암호화하는 타우 돌연변이 유전자, c) 프리세닐린 1(PS1)을 암호화하는 PS1 돌연변이 유전자 및
    d) 상기 세 돌연변이 유전자를 한번에 조절할 수 있는 신경세포 특이적 프로모터를 포함하도록 제작되고,
    상기 세 돌연변이 유전자는 일렬(tandem)로 연결되는, 알츠하이머병 관련 유전자 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프로모터는, 인간 PDGF-β 융합 프로모터인 것인, 발현 카세트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프로모터는, 서열번호 2의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    CMV 인핸서를 더 포함하는, 발현 카세트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 CMV 인핸서는, 서열번호 3의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 APP 돌연변이 유전자는, 595번 아미노산, 596번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것인, 발현 카세트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 APP 돌연변이 유전자는, 서열번호 4의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 타우 돌연변이 유전자는, 243번 아미노산이 돌연변이된 것인, 발현 카세트.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 타우 돌연변이 유전자는, 서열번호 5의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트
  10. 제1항에 있어서,
    상기 PS1 돌연변이 유전자는, 146번 아미노산, 286번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것인, 발현 카세트.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 PS1 돌연변이 유전자는, 서열번호 6의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 APP 돌연변이 유전자, 상기 타우 돌연변이 유전자 및 상기 PS1 돌연변이 유전자 각각의 사이에 2A 서열을 더 포함하는 것인, 발현 카세트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 2A 서열은, 서열번호 8의 서열을 갖는 것인, 발현 카세트.
  14. 제1항의 발현 카세트를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 9의 서열을 갖는 것인, 재조합 발현 벡터.
  16. 제14항의 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 세포주.
  17. 제14항의 재조합 발현 벡터 또는 제16항의 형질전환된 세포주를 이용하여, 형질전환된, 인간을 제외한 동물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 동물은, 포유류인 것인, 형질전환된, 인간을 제외한 동물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 동물은, 돼지인 것인, 형질전환된, 인간을 제외한 동물.
  20. 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계;
    제2 벡터 내에 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계;
    상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및
    상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함하는, 재조합 발현 벡터 제조방법.
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