KR101767456B1 - ｈＩＬ－６ 유전자를 간 특이적으로 발현하는 형질전환 제브라피쉬 및 이의 제조방법 - Google Patents
ｈＩＬ－６ 유전자를 간 특이적으로 발현하는 형질전환 제브라피쉬 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 형질전환된 제브라피쉬, 상기 제브라피쉬를 이용한 간암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법 및 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 간 특이적으로 hIL-6 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬, 상기 제브라피쉬의 제조방법, 상기 제브라피쉬를 이용한 간암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법 및 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 제브라피쉬는 간 특이적으로 hIL-6 유전자를 발현시켜 간의 만성 염증을 촉진하고 간 종양을 형성하여, 상기 hIL-6 유전자가 발현될 때 형광단백질도 함께 발현시킴으로써, 형질전환 제브라피쉬의 성장 단계별로 hIL-6 유전자와 간암과의 상관관계를 시각적으로 관찰할 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 제브라피쉬는 간암 치료 물질 개발에 관한 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 형질전환된 제브라피쉬, 상기 제브라피쉬를 이용한 간암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법 및 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 간 특이적으로 hIL-6 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬, 상기 제브라피쉬의 제조방법, 상기 제브라피쉬를 이용한 간암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법 및 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법에 관한 것이다.
위, 대장, 간, 대장, 췌장, 담도를 포함하는 소화기 계통의 악성 종양은 암 전체의 50%를 차지하여 암으로 인한 사망의 주요 원인이 되고 있다. 최근 검진을 통한 조기 발견에 의해 생존률이 크게 향상되어 위, 대장암은 5년 생존율이 65%에 이르지만, 간암은 10% 안팎, 췌장 담도암은 5%에 미치지 못하는 5년 생존율을 보이고 있다.
과거 수십 년간, 백서 모델을 이용한 종양생물학 연구를 통하여 암화 과정에 관련된 다양한 종양유전자가 발견되었고 그 분자생물학적 기전과 신호전달 경로가 상당 부분 밝혀졌다. 이를 통해 종양의 진행 과정을 규명함을 물론 새로운 치료 약물의 표적을 제공하였다. 실제로, 종양유전자 또는 종양과 관련된 단백질을 표적으로 하는 치료제가 다수 개발되어 탁월한 항암 효과를 보이고 있으며, 부수적으로 막대한 부가가치를 창출하고 있다. 보다 구체적으로, 췌장암의 경우 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 변이가 30~60%로 보고되고 있으며, EGFR의 활성화가 췌장암의 발생에 중요한 역할을 한다는 점이 밝혀지면서 이를 억제하는 소분자 약물(Erlotinib)이 개발되어 임상에 이용되고 있다. 간암에서도 다양한 종양유전자가 발견되고 관련 신호전달 체계에 대한 연구 결과로서 새로운 치료 표적들이 개발되고 있으며, 다중-인산화효소 억제제(multi-kinase inhibitor)인 소라페닙(sorafenib)이 진행성 간암환자에서 우수한 치료 효과를 보이고 있다.
하지만, 형질전환 백서모델은 초기 비용, 유지 비용 및 시간이 많이 소요되는 문제가 있다. 이러한 문제들로 인하여 암과 관련된 연구들이 많은 제한을 받고 있으며, 관련 치료제 개발도 지연되고 있다. 특히, 국내 형질전환 백서 모델의 제조 및 연구는 초보적인 단계에 머물러 있으며, 선진국과의 격차도 상당하다.
한편, 제브라피쉬(Danio rerio)는 3년생 열대담수어로, 25쌍의 염색체를 지니며, 진화상으로 3억년 전에 인류의 공통 조상에서 분리되었음에도 유전자가 보존되어 있어 인간이 가지는 거의 모든 유전자를 보유하고 있다. 이러한 특징으로 인해 제브라피쉬는 1980년대 발생생물학 모델로 이용되기 시작하였고, 2000년대부터 종양생물학 모델로서의 가치가 부각되었다.
제브라피쉬는 다른 동물 모델에 비해 적은 비용이 들고, 척추동물로서 유전적으로 초파리나 선형 동물에 비해 인간에 매우 가깝다. 또한 다수의 수정란을 생산하여 고효율적인 연구가 가능하며, 배아가 투명하고 48시간의 짧은 발생기간을 가져 실시간 관찰이 가능하다. 특히, 기관 특이적으로 형광단백질과 같은 생물표지자를 발현시키면 생체에서 실시간으로 특정기관의 관찰이 가능하고 배아 단계에서는 세포 수준의 추적이 가능한 장점이 있다. 더불어, 체외수정을 하기 때문에 수정란의 난황으로 손쉽게 유전 물질을 주입하여 유전자를 조작하는 것이 용이하다.
이러한 제브라피쉬의 생물학적 특징을 이용하여 제브라피쉬를 실험 모델로 많이 활용하고 있으며, 2000년 이후부터 종양생물학 관련 논문이 다수 발표되고 있으나, 제브라피쉬를 간암 모델로 활용하기 위한 연구는 진행된바 없다.
본 발명자들은 간의 만성염증을 촉진시켜 간암 발생에 중요한 역할을 하는 hIL-6 유전자를 간 특이적으로 발현하는 형질전환 제브라피쉬를 제조하고, 상기 제브라피쉬가 간 특이적으로 만성적 염증이 유도되고, 종양이 발생됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자를 간 특이적으로 발현하는 제브라피쉬 모델을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 제브라피쉬 모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 제브라피쉬 모델을 이용한 간암의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 제브라피쉬 모델을 이용한 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 인터루킨-6(hIL-6; human interleukin-6) 유전자를 간 특이적으로 발현하는 제브라피쉬 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 간 특이적으로 형광단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP))와 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자 서열을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 제브라피쉬(Tg (UAS-hIL6-CG))를 교배하여 간 특이적으로 인간 인터루킨-6(hIL-6; human interleukin-6) 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP/UAS-hIL6-CG))를 제조하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 제조된 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP/UAS-hIL6-CG))의 형질전환 유전자를 제브라피쉬 수정란에 도입하는 단계;를 포함하는, 제브라피쉬 모델 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 상기 제브라피쉬 모델에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 제브라피쉬 모델의 간세포에서의 종양의 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계에서 측정된 간세포에서의 종양의 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제브라피쉬 모델에 간암 치료제를 처리하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계의 제브라피쉬 모델의 간암의 진행 여부를 측정하는 단계;를 포함하는, 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환 제브라피쉬는 간 특이적으로 hIL-6 유전자를 발현시켜 간의 만성 염증을 촉진하고 간 종양을 형성하며, 상기 hIL-6 유전자가 발현될 때 형광단백질도 함께 발현시킴으로써, 형질전환 제브라피쉬의 성장 단계별로 hIL-6 유전자와 간암과의 상관관계를 시각적으로 관찰할 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 제브라피쉬는 간암 치료 물질 개발에 관한 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1의 A는 형질전환 제브라피쉬의 제조시에 사용되는 벡터의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 1의 B 내지 M은 형질전환 제브라피쉬가 간 특이적으로 hIL-6를 발현하는지를 확인한 도이다.
(검은색 화살표 : 간 동양 모세혈관(hepatic sinusoid), 붉은색 화살표 : 간내 혈관(intrahepatic vessel))
도 2는 형질전환 제브라피쉬의 간에서 종양 형성 여부를 확인한 도이다.
(붉은색 화살표 : 다면 발현 증식소(dysplastic foci), 검은색 화살표 : 이핵 세포(binucleated cell))
도 3은 형질전환 제브라피쉬의 신호전달 경로와 관련된 유전자들의 발현 정도를 RT-PCR(도 3의 B) 및 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인하고(도 3의 C), 그래프로 나타낸 도이다(도 3의 A).
도 4는 hIL-6를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 간에서 만성 염증, 세포 사멸, 세포 증식 촉진 유도와 관련된 단백질의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 5는 hIL-6를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 간에서 JAK/Stat3 신호전달 경로의 조절자들의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 6은 형질전환 제브라피쉬에 JAK/Stat3 신호전달 경로 억제제를 처리하여 hIL-6 과발현으로 유도된 간암의 발생원인을 확인한 도이다.
도 1의 B 내지 M은 형질전환 제브라피쉬가 간 특이적으로 hIL-6를 발현하는지를 확인한 도이다.
(검은색 화살표 : 간 동양 모세혈관(hepatic sinusoid), 붉은색 화살표 : 간내 혈관(intrahepatic vessel))
도 2는 형질전환 제브라피쉬의 간에서 종양 형성 여부를 확인한 도이다.
(붉은색 화살표 : 다면 발현 증식소(dysplastic foci), 검은색 화살표 : 이핵 세포(binucleated cell))
도 3은 형질전환 제브라피쉬의 신호전달 경로와 관련된 유전자들의 발현 정도를 RT-PCR(도 3의 B) 및 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인하고(도 3의 C), 그래프로 나타낸 도이다(도 3의 A).
도 4는 hIL-6를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 간에서 만성 염증, 세포 사멸, 세포 증식 촉진 유도와 관련된 단백질의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 5는 hIL-6를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 간에서 JAK/Stat3 신호전달 경로의 조절자들의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 6은 형질전환 제브라피쉬에 JAK/Stat3 신호전달 경로 억제제를 처리하여 hIL-6 과발현으로 유도된 간암의 발생원인을 확인한 도이다.
본 발명은 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자를 간 특이적으로 발현하는 제브라피쉬 모델을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제브라피쉬 모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제브라피쉬 모델을 이용한 간암의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제브라피쉬 모델을 이용한 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법을 제공하는 것이다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에서, 용어 “인터루킨-6(interleukin-6)”는 B-세포 자극인자-2(BSF-2) 또는 인터페론 β2로 명명되는 사이토킨을 말하며(이하, IL-6라 함), B 림프구 계대세포의 활성에 포함되는 미분화 인자로서 발견되었다. 암과 관련된 IL-6 신호전달체계는 그 중간 매개인자인 Stat3와 많은 관련이 있다. 상기 Stat3는 골수종, 유방암종, 전립선 암, 뇌 종양, 두경부 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종, 특히 만성 골수형 및 다발성 골수종 등의 여러 형태의 암에 관여한다. 또한, 본 발명의 인간 인터루킨-6(hIL-6; human interleukin-6)는 인간으로부터 분리된 인터루킨-6일 수 있다.
본 발명에서 용어, “간 특이적”이란 간 이외의 기관에서는 발현되지 않거나 낮은 정도로 발현되는 반면 간에서는 매우 높은 정도로 발현되는 특징을 의미하며, 본 발명의 간 특이적 발현은 간 지방산 결합 단백질(LFABP)에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 용어, “간 표적 서열”은 상기 간 특이적 특징을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 의미한다.
본 발명에서 용어, “형질전환”은 플라스미드 형태의 DNA를 세포에 물리화학적으로 직접 도입하거나 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 외래 유전자를 발현시키는 것을 말하며, 본 발명에서 용어, “형질전환 제브라피쉬”는 목적 뉴클레오타이드 서열의 통합에 의하여 유전체(genome)가 변형된 제브라피쉬를 말한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 간 특이적으로 인간 인터루킨-6(hIL-6)이 발현되는 형질전환 제브라피쉬는 간에서 염증 또는 종양이 형성되며, 상기 hIL-6 유전자가 발현될 때 형광단백질도 함께 발현된다. 따라서, 형질전환 제브라피쉬는 성장 과정 중 hIL-6 유전자와 간암과의 상관관계를 시각적으로 관찰함으로써, 간암 치료 물질 개발에 관한 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 인간 인터루킨-6 유전자를 간 특이적으로 발현하는 제브라피쉬 모델을 제공한다.
본 발명의 제브라피쉬 모델은 간 표적 서열을 포함하는 벡터 및 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 제브라피쉬일 수 있다.
일례로, 본 발명의 제브라피쉬 모델은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
1) 간 특이적으로 형광단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP))와 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자 서열을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 제브라피쉬(Tg (UAS-hIL6-CG))를 교배하여 간 특이적으로 인간 인터루킨-6(hIL-6; human interleukin 6) 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP/UAS-hIL6-CG))를 제조하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계에서 제조된 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP/UAS-hIL6-CG))의 형질전환 유전자를 제브라피쉬 수정란에 도입하는 단계.
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)에서 사용되는 벡터는 외부 DNA에 이를 삽입시킬 수 있는, 통상적으로 이본쇄인 DNA 가닥을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 형광단백질은 생체 안에서 빛을 내는 단백질로, 녹색(green) 형광단백질, 황색(yellow) 형광단백질 등을 포함하며, 바람직하게는 적색(red) 형광단백질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 구성된, 하기 개열지도 3으로 표시되는 벡터의 도입으로 인해 발현되는 형광단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[개열지도 3]
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 간 특이적으로 형광단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP)는 상기 개열지도 3으로 표시되는 벡터와 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 구성된, 하기 개열지도 1로 표시되는 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
[개열지도 1]
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자 서열을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 제브라피쉬(Tg (UAS-hIL6-CG))는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 구성된, 하기 개열지도 2로 표시되는 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
[개열지도 2]
상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 수정란 도입은 미세주입법, 줄기세포 삽입방법, 레트로바이러스를 이용한 삽입 방법 및 정자-매개 유전자 전달 방법 등을 포함하며, 바람직하게는 미세주입법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제브라피쉬 모델은 간 특이적으로 형광 단백질을 발현시킴으로써 형질 도입된 유전자가 발현되는 위치를 시각적으로 확인할 수 있으며, 간 특이적으로 hIL-6 유전자를 발현하여 간에서 염증 또는 종양을 형성시킴으로써, 간암 발생 기전을 밝히고, 간암 치료 물질을 스크리닝하는 데 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제브라피쉬 모델의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제브라피쉬 모델의 제조방법은,
1) 간 특이적으로 형광단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP))와 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자 서열을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 제브라피쉬(Tg (UAS-hIL6-CG))를 교배하여 간 특이적으로 인간 인터루킨-6(hIL-6; human interleukin 6) 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP/UAS-hIL6-CG))를 제조하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계에서 제조된 형질전환 제브라피쉬(Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP/UAS-hIL6-CG))의 형질전환 유전자를 제브라피쉬 수정란에 도입하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 형질전환 제브라피쉬는 개열지도 1 내지 3으로 표시되는 벡터에 의해 형질전환된 제브라피쉬일 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 수정란은 수컷과 암컷 제브라피쉬의 교배를 통해 생성된 수정란으로서, 바람직하게는 1-2 세포기의 수정란일 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 수정란의 도입은 미세주입법, 줄기세포 삽입방법, 레트로바이러스를 이용한 삽입 방법 및 정자-매개 유전자 전달 방법 등을 포함하며, 바람직하게는 미세주입법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제브라피쉬 모델을 이용한 간암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 간암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법은,
1) 상기 제브라피쉬 모델에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 제브라피쉬 모델의 간세포에서의 종양의 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계에서 측정된 간세포에서의 종양의 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 제브라피쉬 모델은 개열지도 1 내지 3으로 표시되는 벡터에 의해 형질전환된 제브라피쉬일 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 피검물질은 화합물은 간암 치료에 효과가 있는지 여부를 확인하기 위해 처리하는 물질로서, 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머, 항체 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2)의 간세포에서의 종양의 정도를 측정하는 것은 제브라피쉬의 간세포에서 종양이 형성되었는지, 형성되었다면 그 특징이 어떠한지를 분석하는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 클리어 세포체(clear cell body), 호산구(eosinophilic), 호염기성 세포체(pasophilic cell body), LCC(large cell change), 유리질체(hyaline body), 호산구성 과립 세포질(eosinophilic granular cytoplasm), 매끈한 핵(rounded nuclei), 돌출된 인(prominent nucleoli), 다면 발현 증식소(dysplastic foci) 등을 포함하는 종양 형성의 특징이 나타나는지 분석하는 것일 수 있으며, 종양 형성과 관련된 유전자의 발현 정도를 RTPCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 노던 블롯(Northern blot), cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응, 및 생체 내(in situ) 혼성화 반응 등의 방법을 통해 측정하는 것일 수 있으며, 종양 형과 관련된 단백질의 활성 정도를 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS) 등의 방법을 통해 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 3)의 선별 단계는 상기 단계 2)의 측정 결과를 정량적 또는 정성적으로 분석하여 피검물질을 처리한 제브라피쉬 모델과 피검물질을 처리하지 않은 대조군의 간세포의 종양 정도 비교를 통해 대조군에 비해 정양 정도가 감소한 피검물질을 선별하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제브라피쉬 모델을 이용한 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법을 제공한다. 본 발명의 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법은,
1) 상기 제브라피쉬 모델에 간암 치료제를 처리하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계의 제브라피쉬 모델의 간암의 진행 여부를 측정하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 치료 효과 예측 방법에 있어서, 단계 1)의 제브라피쉬 모델은 개열지도 1 내지 3으로 표시되는 벡터에 의해 형질전환된 제브라피쉬일 수 있다.
상기 치료 효과 예측 방법에 있어서, 단계 1)의 간암 치료제는 간암 치료에 효과가 있다고 알려져 있거나 새로 개발된 치료제로서, 바람직하게는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머, 항체 등을 포함하며, 더욱 바람직하게는 JAK/Stat3 억제제일 수 있다. 상기 JAK/Stat3 억제제는 JAK/Stat3 신호 또는 이의 하위 조절자를 표적화하거나, 저하시키거나 또는 억제하는 화합물을 지징할 수 있으며, JAK/Stat3 신호 전달 과정에 연루되어 있을 수 있다.
상기 치료 효과 예측 방법에 있어서, 단계 2)의 간암의 진행 여부를 측정하는 단계는 종양 형성과 관련된 유전자의 발현 정도를 RTPCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 노던 블롯(Northern blot), cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응, 및 생체 내(in situ) 혼성화 반응 등의 방법을 통해 측정하는 것일 수 있으며, 종양 형성과 관련된 단백질의 활성 정도를 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS) 등의 방법을 통해 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 JAK/Stat3 신호는 사이토킨, 인터루킨, 성장인자들에 의한 신호 전달에 필수적인 면역 반응을 조절하는 신호 전달 과정이다. JAK/Stat3 신호전달 과정은 세포의 분화, 증식, 생존에 있어 중요한 생리학적 역할을 하지만, 상기 경로가 비정상적으로 조절될 시에는, 염증 이상, 암과 같은 질병이 진행된다. 따라서 JAK/Stat3 경로의 조절 또한 염증 질병 및 암을 치료하기 위한 타겟이 될 수 있다.
본 발명의 JAK/Stat3 신호의 하위 조절자는 상기 JAK/Stat3 신호전달 과정을 조절하는 조절자로서, Socs1, Appa, Cis, Pim1 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 억제제는 JAK/Stat3 신호 또는 이의 하위 조절자를 표적화하거나, 저하시키거나 또는 억제하는 화합물을 지칭하는 것으로서, JAK/Stat3 신호 전달 과정에 연루되어 있으며, 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머, 항체 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 제브라피쉬의 사육 및 교배
제브라피쉬는 인도원산으로 28.5 ℃의 온도와 30~70%의 습도를 유지하는 폐쇄 순환 여과 시스템을 갖춘 수조에서 사육하였다. 하루 14시간은 명처리, 10시간은 암처리를 하여 주광주기를 맞춰주었다. 성숙한 제브라피쉬는 Freshwater Aquarium Flakefood(Tetra Werke, Melle, Germany)와 살아있는 브라인 쉬림프(brine shrimp)(San Francisco Bay Brand, Inc., Newark, CA, USA)를 섞어서 하루에 2번 급이하였다. 약 2~3달이 되면 교배를 할 수 있는 성체가 되고, 교배 전날 오후에 암컷과 수컷을 전용 교미 상자(mating cage)에 넣고, 다음날 아침의 산란을 유도하기 위해 빛을 주었다. 그 후, 수컷과 암컷이 교미를 하여 암컷이 수백 개의 수정란을 산란하였다. 수집된 수정란을 링거 용액(Ringer's solution)(116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2,5 mM HEPES, pH 7.2)으로 씻어 페트리디쉬에 옮기고 28.5℃의 배양기에서 발생시켰다. 해부현미경을 이용하여 각 발생단계의 수정란을 시간별, 형태학적 변화에 따라 선별하여 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하였다.
실시예 2 : 간 특이적으로 hIL-6 유전자를 발현하는 제브라피쉬의 제조
제브라피쉬에서 발생 단계부터 간 특이적으로 유전자가 발현되는 형질 전환 플랫포옴을 구축하기 위하여 간 지방산 결합 단백질(LFABP; liver fatty acid binding protein)을 선택하여 조절서열(5' upstream 2.9kb)을 클로닝하였다. LFABP 조절서열의 특이성을 분석하기 위해 LFABP-GFP 콘스트럭트를 제작하여 LFABP-Gal4/UAS-RFP 형질전환 제브라피쉬를 제조하여 확인하였다. 간의 만성염증을 촉진시켜 간암 발생에 중요한 역할을 하는 IL-6 유전자를 선정하였고, UAS-hIL6-CG 형질전환주를 별도로 수립하여 LFABP-Gal4/UAS-RFP 형질전환주와 교배함으로써 간 특이적으로 hIL-6를 발현하는 형질전환주(LFABP-Gal4 / UAS-RFP / UAS-hIL6-CG)를 제조하였다. hIL-6의 발현은 간에서 만성적인 염증세포의 침윤과 이에 따른 간세포의 손상 및 재생을 유발하였고, 생후 3개월부터 다양한 이형성을 유발하였다. 6개월에는 만성염증성변화와 아울러 AFP양성인 간세포암이 발생하였다.
상기 제브라피쉬 제조에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
상기 표 1에서 제한 효소가 인식하는 서열은 밑줄로 표시하였으며, F-UAS-Seq는 형질전환 제브라피쉬를 확인하는 데 사용되었다.
실시예 3 : 제브라피쉬 수정란 미세주입
상기 실시예 1에서 수득한 1-2 세포기 수정란의 난황에 미세주입기를 이용하여 상기 실시예 2에서 제조한 제브라피쉬의 형질전환 유전자를 주입하였다. 이로써, 세포와 난황 사이의 연락공을 통하여 형질전환 유전자가 세포질 내로 유입된 뒤 분열기에 염색체에 삽입되었다. 형질전환의 효율성을 높이기 위하여 형질전환 유전자와 전이효소 mRNA(transposase mRNA)를 함께 주입하였으며, 이에 의해 발현된 전이효소(transposase)가 Tol2 right/left arm을 인식하여 염색체 내로 형질전환 유전자를 강제 치환시켰다. 그 후, 어버이 세대의 제브라피쉬(F0 founder fish)를 성어로 사육한 다음 수정란을 생산하여 형질전환된 제브라피쉬(transgenic F1 progeny) 모델을 선별하였다.
실험예 1 : 지속적인 hIL-6발현에 의한 만성 염증 유도
실시예 3에서 제조한 형질전환 제브라피쉬의 hIL-6 발현에 따른 표현형 분석을 위하여 리보프로브를 실험관 내 전사를 통해 합성하여 생체 내 혼성화(ISH; in situ hybridization)를 수행하였다. 제브라피쉬 RNA로부터 프라이머를 이용하여 제작한 cDNA를 PCR을 시행하여 증폭한 뒤 T7 IVT 키트(Roche)를 이용하여 디곡시게닌-표지된 안티센스 mRNA 프로브(digoxigenin-labelled anti-sense mRNA probe)를 합성하였다. 이 때 사용된 프라이머의 서열은 정방향은 5'-ATAACGCGTACCATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3', 역방향은 5'- ATAGCTAGCCTACATTTGCCGAAGAGCCC-3'이다. 수정 후 각 단계별 배아를 4% 파라포름알데히드(PBS, pH 8.0)에 넣어 4℃에서 12시간 이상 고정시켰다. 24시간 이후, 버드단계(bud stage, 수정 후 10시간)의 배아들은 0.2mM PTU (phenylthiourea)이 첨가된 엠리오닉 워터(embryonic water)에 넣어서 색소 형성을 방지하였다. 그런 다음, 배아들을 1X PBST(1XPBS, 0.1%Tween-20)로 5분간 3회 씻고 100% 메탄올을 두 번 정도 갈아준 후, 장기간의 보관 기간 동안 배아의 손상 방지를 위해 메탄올에 든 상태로 -20℃에 보관하였다. 그 후, 상기 배아를 1X PBST로 3번 씻고, 프로테이나제 K(Proteinase K)를 30분간 처리한 후 4% 파라포름알데히드로 다시 고정시킨 다음 1X PBST로 씻어 주었다. 다음으로, HYB★★(50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20) 500㎕를 넣어 65℃에서 5분간 둔 후 HYB® (HYB★★, 5㎎/㎖ torula RNA, 50㎍/㎖ heparin, Citricacid, pH 6.0)를 200㎕ 넣고, 65℃에서 2~4시간 전잡종화(prehybridization)를 시킨 다음 프로브 1㎕를 넣고 65℃에서 하룻밤 동안 혼성(hybridization)시켰다. 프로브가 든 용액을 제거한 후 65℃를 유지한 상태에서 75%, 50%, 25% HYB*/2X SSC용액 순으로 각각 10분 간격으로 교환해주었다. 이 후, 2X SSCT로 용액을 바꾸어 같은 온도에서 30분간 둔 다음, 0.2X SSCT로 30분 간격으로 2회 이상 갈아주어 혼성화 되지 못한 프로브를 제거한 후, 상온에서 1X PBST로 15분간 5회 씻어주었다. 그런 다음, 블로킹 용액(PBST + 5% goat serum)을 상온에서 1시간 이상 처리하고, 안티-디곡시게닌 항체(Roche)를 1/5000로 블로킹 용액에 희석한 후 2시간 이상 처리하였다. 1X PBST로 15분씩 5번 씻은 후 NBT/BCIP(Roche Diagnostics GmbH)를 넣어 상온에서 빛을 차단한 상태로 반응시킨 후, 현미경을 통해 발색 여부를 확인하고 그 결과를 도 1의 C, D, F 및 G에 나타내었다. 결과 확인 뒤, 1X PBST로 씻어준 후 100% 글리세롤에 넣어 4℃에 보관하였다.
또한, 상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 제브라피쉬의 조직표본을 분석하기 위해, 3개월 이상된 형질전환 제브라피쉬 50마리를 Tris-buffered tricaine(3-aminobenzoic acid ethylester, pH 7.0; Sigma) 20X으로 안락사시켰다. 그 후, 조직학적 변화 스크리닝 연구를 위하여 전 장기를 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정하고, 상기 고정된 장기에 알콜자일렌(alcoholxylene)을 처리한 후, 파라핀 포매하여 4μm의 슬라이드 절편을 만들어 H&E염색을 하였고 광학 현미경으로 관찰한 결과를 도 1의 H 내지 M에 나타내었다.
도 1의 C, D, F 및 G에 나타낸 바와 같이, hIL-6 유전자가 도입된 형질전환 제브라피쉬는 간 특이적으로 보라색으로 염색되었으므로, 이를 통해 hIL-6 유전자가 도입되었음을 알 수 있다. 이로써, 상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 제브라피쉬는 수정 4일 이후부터 성체까지 hIL-6 유전자가 간 특이적으로 강하게 발현함을 알 수 있다.
또한, 도 1의 H 내지 M에 나타낸 바와 같이, 대조군인 도 1의 H와 비교할 ?, 형질전환 제브라피쉬는 간에서 염증이 발생하였고, 특히 간 동양 모세혈관(hepatic sinusoid, 검은색 화살표)과 간내 혈관(intrahepatic vessel, 붉은색 화살표)에서 다양한 정도의 염증 침윤이 발생하였다. 또한, 침윤이 심할 때는 염증이 간소엽 붕괴를 유발하여 간내 일부 관(intrahepatic portal tract)의 발견이 배제되었는데, 이를 통해, 형질전환 제브라피쉬의 간에서 지속적으로 hIL-6가 발현되어 만성적 간염이 유도됨을 알 수 있다.
실험예 2 :
hIL-6가 발현되는 제브라피쉬에서 다면 발현 증식소(dysplastic foci)를 동반한 간종양 형성
상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 제브라피쉬의 간세포에서의 염증 형성 여부를 확인하기 위해 상기 실험예 1과 같은 방법으로 형질전환 제브라피쉬의 간 조직을 H&E 염색하고 그 결과를 도 2의 A 내지 I에 나타내었다.
또한, 형질전환 제브라피쉬의 간세포에서의 종양 형성 여부를 확인하기 위해 면역조직화학법(IHC; immunohistochemistry, immunostaining)을 통해 단백질 발현을 확인하였다. 보다 구체적으로, 4μm로 박절된 조직을 자일렌(xylene)을 이용하여 탈 파라핀 후 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올을 이용하여 탈수하였다. 0.3% H2O2에 20분 동안 담근 후 15분 동안 반응시키고 1X PBST로 5분씩 3번 세척하였다. 블로킹 용액(10% 정상 염소 혈청)으로 한 시간 동안 처리한 후 1X PBST 로 5분씩 3번 세척하고, 일차 항체는 rabbit anti-IL6(1:200), 7 mouse anti-proliferating cell nuclear antigen(PCNA)(1:2000), goat anti-AFP(1:200)(Santa Cruz, CA)으로서, 상기 일차 항체를 한 시간 동안 상온에서 처리하였다. 1X PBST로 5분씩 3번 세척한 후 2차 항체인 goat anti-rabbit alexa fluor 488(Molecular Probes, Eugene, USA)을 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. ABC 용액(Vector Laboratories)을 실온에서 1시간 동안 처리한 후, 1X PBST에 10분씩 2번 세척하고 3'-다이아미노벤지딘 테트라클로라이드(diaminobenzidine tetrachloride) (DAB, peroxidase substrate kit DAB(Vector Laboratories))를 처리하고, 1차 증류수로 10분씩 3번 세척하였다. 세척 후 각 2분씩 85%, 90%, 100% 에탄올을 처리한 후 자일렌(xylene, Sigma)을 5분 동안 처리하고, 이후 자일렌이 마르면 봉입하여 형광현미경(Olympus BX51, Japan)으로 관찰하고 그 결과를 도 2의 J 내지 L에 나타내었다.
도 2의 A 내지 I에 나타낸 바와 같이, 형질전환 제브라피쉬의 간에서 클리어 세포체(clear cell body), 호산구(eosinophilic), 호염기성 세포체(basophilic cell body)를 동반한 종양증(A 내지 E), 및 Large cell chage와 투명체(hyaline body)와 같은 종양 형성의 특징들(F 및 G)이 관찰되었다. 보다 구체적으로, 호산구성 돌기 세포질(eosinophilic granular cytoplasm), 매끈한 핵(rounded nuclei), 돌출된 인(prominent nucleoli)와 같은 전형적인 간암(HCC)의 특징들이 발견되었으며(D), 6개월된 제브라피쉬 전체적으로 간암(HCC)이 나타났다(I).
또한, 도 2의 J 및 K에 나타낸 바와 같이, 형질전환 제브라피쉬는 간세포에서 다면 발현 증식소(dysplatic foci)를 보여주고 있으며(J 및 K), 종양세포에서 높은 정도의 αFP 발현을 보였다(L).
이를 통해, 형질전환 제브라피쉬 간세포에서 지속적으로 hIL-6가 발현되어 만성적 간염 및 간암(HCC)이 유도된 것을 알 수 있다.
실험예 3 : hIL-6 과발현에 의한 염증 및 종양 발생 과정의 조절 기전
상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 제브라피쉬 모델의 염증 및 종양 발생 조절 기전을 분석하기 위하여, RT-PCR 및 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였다.
실험예 3-1 : RT-PCR 수행
상기 실시예 3에서 제조한 3개월된 형질전환 제브라피쉬 모델의 간조직을 떼어내서 균질화(homogenized)한 후 RNeasy mini-kit(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)를 이용하여 RNA 전체를 추출하였다. 정제된 RNA시료를 역전사(reverse transcription, RT)하여 cDNA로 합성하였다. 이때 사용된 PCR 반응 조건은 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
역전사를 마친 후에 합성된 cDNA를 이용하여 실시간 PCR을 수행하고, 유전자의 발현 정도를 정량적으로 평가하였으며, 그 결과를 도 3의 A 및 B에 나타내었다. 실시간 PCR을 위해서 ABI 7300 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)이 사용되었으며, PCR 산물의 양은 threshold cycle(Ct) 값을 이용한 상대정량법(-2ΔΔCt)으로 정량하였다.
실험예 3-2 : 웨스턴 블롯 수행
상기 형질전환 제브라피쉬 실험군과 대조군의 간 조직을 샘플링하여 라이시스 버퍼(lysis buffer)(1% NP, 100 mM MgCl2, 1 M Tris-HCl(8.0), 100 mM sodium fluoric, 100 mM DTT, 2 mM sodium orthovanadate, 1 μg/㎕ aprotinin, 10 μg/㎕ pepstatin, 50 mM Hepes)를 에펜드로프 튜브(ependrof tube)에 각 500 ㎕씩 첨가한 다음 아이스 박스에 넣고 4℃에서 30분간 반응시킨 후, 12000 rpm, 4℃, 20분 조건에서 원심분리하였다. 원심분리 후 세포기질인 상등액 부분을 취하여 BCA 시약(BCATM Protein Assay Kit, Pierce)을 이용하여 단백질 분석을 실시하였다. 먼저 96 웰 플레이트에 BCA 시약 100 ㎕/well을 취한 후, 표준곡선(standard curve)을 위해 표준 시약(BSA, 2 mg/㎖)을 각 농도별(2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 및 31.2 ㎍/㎖)로 10 ㎕씩 첨가한 다음, 시료 10 ㎕씩 첨가하여 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 562㎚에서 흡광도를 측정하였다. 10% 겔을 조제 후, 90V에서 3시간 동안 SDS-PAGE를 실시하였으며, 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane, Bio-rad)에 로딩된 겔 판을 조심히 옮긴 후, 250mA, 4℃에서 2시간 30분간 교반기를 이용해서 막 트랜스퍼(membrane transfer)하였다. 그 후, 밴드 확인을 위해 0.2% 폰소 s 시약(ponceau s reagent, Biobasic Inc.)으로 1분간 염색하고, 증류수로 수회 세척한 다음, 막에 로딩된 단백질 밴드를 확인하였다. 필름 현상을 위해 필름 현상 키트에 막을 고정시킨 후, SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate 시약(Pierce)을 막에 충분히 도포시킨 다음 5분간 실온에서 반응시켰다. 이후, 암실에서 필름을 막에 일정 시간 반응시키고, 현상액 및 고정 시약(Kodak GBX)을 이용하여 단백질 밴드를 확인하였으며, 그 결과를 도 3의 C에 나타내었다.
도 3의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 형질전환 제브라피쉬는 세포 성장을 조절하는 것으로 알려져 있는 c-Myc, 세포생존과 세포주기 조절자로 알려진 MAPK1와 cyclin D1(CcnD1)을 상향 발현시켰으며, 염증반응의 지표로 알려진 IL1b와 IL12a의 발현도 증가하였다. JAK/Stat3, P13K/Akt 신호전달 경로의 하위 조절자인 Eif10, Appa, Socs, Pim1, Cisd 역시 상향 발현하였다.
또한, 도 3의 C에 나타낸 바와 같이, 형질전환 제브라피쉬의 간에서 JAK/Stat3 및 P13K/Akt 신호전달 경로의 하위조절 단백질인 pMAPK, mP13K 및 pStat3이 높은 정도로 발현되었다.
이를 통해, 형질전환 제브라피쉬에서 hIL-6의 과발현은 간세포의 증식 및 염증 생성을 유도하고, JAK/Stat3 및 P13K/Akt 신호전달 경로의 조절자들의 발현을 증가시켜 간암을 발생시킴을 알 수 있다.
실험예 4 : 신호전달 경로 및 하위 조절자들의 간 종양 형성 기전 확인
상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 제브라피쉬의 간암 발생 기전을 구체적으로 확인하기 위해 면역조직화학법(IHC; immunohistochemistry)과 생체 내 혼성화(ISH; in situ hybridization)을 이용하여 하위 조절자들의 발현 양상을 확인하였다.
면역조직화학법(IHC)는 실험예 3과 동일한 방법으로 수행하였으며, 이 때 사용된 일차 항체는 rabbit anti-IL6 (1:200), rabbit anti-Caspase 3 (1:100), mouse anti-proliferating cell nuclear antigen (PCNA)(1:2000), Anti-AKT1 (phospho T308)(1:200)(Abcam, Cambridge, MA), Mouse anti-phospho-PI3K (1:100) Rabbit antibodies, phospho-Tuberin/TSC2 (1:200), phospho-mTOR (1:200), phospho-4EBP1 (1:200), phospho-p70RS6K(1:200), phospho-Stat3 (1:200), β-actin (1:300)(Cell Signaling ,Danvers, MA), anti-AFP(C-19) (1:200)(Santa cruz, CA), Anti-Caspase-3a (p17)(NT) (1:500), Anti-MAPK-1/2 (CT), Z-FishTM (1:500), Anti-Cyclin-D1 (NT) (1:500)(ANASPEC, Fremont, CA)이며, 그 결과를 도 4의 A 내지 H 및 도 5의 A 내지 D에 나타내었다.
생체 내 혼성화(ISH)는 실험예 1과 같은 방법으로 수행하였으며, 특히 염증 침윤 세포의 분석은 백혈구 마커를 이용한 ISH 실험으로 이루어졌으며, 그 결과를 도 4의 I 내지 P 및 도 5의 E 내지 I에 나타내었다. ISH법 수행시 이용된 리보프로브 제작을 위한 프라이머의 염기 서열은 하기 표 3과 같다.
[표 3]
도 4에 나타낸 바와 같이, Caspase3 항체 반응을 통해 hIL-6를 발현하는 간세포에서 세포사멸이 일어나고 있음을 알 수 있다(B). 또한, 간 유조직(hepatic parenchyma)에서 CD4-양성 및 CD8-양성 T 세포가 함께 나타났으며(J, L), Ighm-양성 B세포 및 Spi1-양성 골수 세포 역시 간 동양 모세혈관(hepatic sinusoid)과 간의 일부 관(portal tract)에서 발견되었다(N, P). 세포 증식 마커인 PCNA, pMARK, 및 CyclinD1의 발현은 다면 발현 증식소(dysplastic foci) 및 비다면 발현 증식소(non-dysplastic foci)를 동반한 부위에서 고루 나타났다(D, F, H). 이를 통해 hIL-6가 과별현되는 제브라피쉬 간에서 세포 손상을 동반한 염증과 염증적 침윤현상이 나타나고 있음을 알 수 있다
또한, 도 5에서 나타낸 바와 같이, hIL-6이 발현되는 모든 세포에서 pStat3와 반응하는 것으로 나타났으며(D), pStat3의 발현은 다면 발현 증식소(dysplastic foci)를 동반한 부위에서 가장 강하게 나타났다(B, C). 또한, 침윤적인 염증세포는 pStat3에 비 반응적이었으며, Socs1, Appa, Cis, 및 Pim1와 같은 JAK/Stat3 신호전달 경로의 하위조절자들은 다면 발현 증식소 부위에서 강하게 발현되고 있었다(F 내지 I). 이를 통해 JAK/Stat3 경로가 간암 발생의 주된 원인이라는 것을 알 수 있다.
실험예 5 : JAK/Stat3 경로 억제제 처리를 통한 hIL-6로 유도된 간암 발생원인의 확인
상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 제브라피쉬 모델에서 상기 JAK/Stat3 신호전달 경로가 간 염증 형성 및 간암의 발생의 원인인지를 확인하기 위해 상기 신호전달 경로를 억제하였다. 보다 구체적으로, PI3K 억제제인 BKM120와 Stat3 억제제인 Nicolsamide와 Stattic을 형질전환 제브라피쉬에 처리하고, 하위조절자들의 분자세포학적 분석을 실행하였다. 처리과정에서 이 억제제들은 지브라피쉬에 치명적일 수 있어서 25%가 넘지 않는 선에서 처리되었으며 점차적인 농도 증가로 억제를 유도하였다.
상기 실험예 3-1과 같은 방법으로 수행한 RT-PCR 결과를 도 6의 A에 나타냈으며, 상기 실험예 4와 같은 방법으로 수행한 면역조직화학법(IHC; immunohistochemistry)과 생체 내 혼성화(ISH; in situ hybridization)의 결과를 도 6의 B에 나타냈다.
도 6에 나타낸 바와 같이, Stat3 억제제의 처리는 JAK/Stat3경로의 하위조절자들의 점차적인 감소발현을 보여주었고 BKM120는 PI3K경로를 억제하지 못하였다(A). IHC 및 ISH 분석 실험 결과 역시 Appa1, Cis, 및 Pim1와 같은 JAK/Stat3경로의 하위조절자의 발현은 Stagt3 억제제에 의한 뚜렷한 발현 감소를 보여주며(B), 이를 통해 간세포의 증식이 JAK/Stat3 신호전달 경로에 의하여 발생됨을 알 수 있다(도 6의 B, 붉은 원).
따라서, 형질전환 제브라피쉬에서 JAK/Stat3 신호전달 경로가 hIL-6의 과발현으로 유도된 간암 발생의 직접적인 원인임을 알 수 있다.
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ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
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ccctaattaa cctagttaag cctttaaatg tcactttaag ctgtatagaa gtgtcttgaa 4140
gaatatctag tctaatatta ttgactgtca tcatggcaaa gataaaataa atcagttatt 4200
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caaaataaac aggggggcta ataaatttaa ggggttaaat aattctgatt gcaaaaaaat 4320
gatgtctgca aaactgttgc aaataattta tttgtgttga ttttaagcaa acaaattaaa 4380
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<211> 9587
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 2
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ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 8220
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 8280
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 8340
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 8400
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 8460
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 8520
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 8580
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 8640
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 8700
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 8760
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 8820
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 8880
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 8940
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 9000
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 9060
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 9120
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 9180
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 9240
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 9300
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 9360
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 9420
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 9480
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 9540
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 9587
<210> 3
<211> 7804
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UAS-RFP
<400> 3
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccaa 660
atagtaggaa ttacccacct gtacaagtgc tgaaaacttg gatgaataag cccgtttgcc 720
attttctact gctattttaa atcttttctg tatttgtctg catttgtctt tacccttgaa 780
taaatgtttt agttgttttt tttcaattat gactgtgttt aacagacatt attacaataa 840
tatgtaatag tagtacacac tattattatg taatagtact tgttgactgt atttgagaac 900
tggaccgagt gagtgttacg tcacccattc aaaatgactt acttctggct ccaacaaaat 960
gaagttaatt cagttgccat ttttcactgt atggacatcg ccgtgttgga gctagacgtc 1020
gccaataagc aagaaagagc cgagatgcgt cgagtctgag tcaccgttcc tatggcaacc 1080
cctctaacca atcagaagta agcttgttgg aagtccacag cctaccactt gaaagcgggc 1140
tgcacaaaat ctgtcaaacg ttttgaacgt tggatgtgag agcacatact tttattaagg 1200
catctggttg gtcagtttat aatatcaaca acttgggcta cagaaaagaa aagttattac 1260
agaaattatg attaacaagt acatgttaaa taaagatttt aatatgaatg ccaccactgg 1320
agcattcatg ccatttggag cttcttcctg tttggatcac tagaaggagg aggtcactca 1380
ttacagttct catatacagt cgttggttgg ttggttggtt ggttggttgg tagattgatt 1440
gattgattga ttgattgatt gattgattga ttgattgatt gattgattga ttgattgatt 1500
gattgattga ttgattgatt gattgattga ttgattggta gtcaaaataa gaaataattt 1560
ccacagattc attacagaaa tgattaaatg catacataaa aaactggggg gggggggata 1620
caacaacaca cttaagtcac atttgcctac gtaaagaaaa gtaaagaaaa tcaatagcta 1680
tattttacat ctcctttttt tgctgtcttt taattagcct tgttttgctg ttatcttgat 1740
tgaaactgta acttcttcac ctgcttcttt tctttgtagg ttttgccagc ccagaaacag 1800
gcatggctgt gcaaggccag agcaccatgc acaatgcgct gcatgtcttc atgaacggct 1860
caatgtcctc agtccagggc tcagccaacg accccatctt cctccttcac catgctttca 1920
ttgacaggta acaaacacgt catgacatta gactgcacag tttttgacaa agttcataca 1980
atctgttgtt tatagctgct acaattagtg aagtttgtga atgtacttgg atgagcagcg 2040
aaagatcaat tgagatcaat tgttagagtt tggttgccct gcagagcaaa gaacaaaaaa 2100
taatctggtg gctttactgc gtgaggttat tattggtgga atagaaacac aaaacataat 2160
tgcatttatt tgtttaattt tttatcttat cttaactttc atcttgcata tttgtttctt 2220
acatcatttc tagcatcttt gagcgctggc taagaactca tcagcctccc cggtccatct 2280
acccacgtac caatgcacca attggccaca atgacggcta ctacatggtg ccattccttc 2340
ctctttatag gaatggagac tacctcctgt ccaacaaggc tcttggatac gagtacgcct 2400
acctgttgga cccaggtcat tgcacaacac cagaaatgcc ctctgatctg caaaagacgt 2460
gaatatctgt tcagacaccc atatccactc tgttccacac aggtcagagg tttgtccagg 2520
agttcttgac atatttgttt cttacatcat ttctagcatc tttgagcgct ggctaagaac 2580
tcatcagcct ccccggtcca tctactcacg taccaatgca ccaattggcc acaatgacgg 2640
ctactacatg gtgccattcc ttcctcttta taggaatgga gactacctcc tgtccaacaa 2700
tgctcttgga tacgagtacg cctacctgtt ggacccaggt cattgcacaa caccagaaat 2760
gccctctgat ctgcaaaaga cgtgaatatc tgttcagaca cccatatcca ctctgttcca 2820
cacaggtcag aggtttgtcc aggagttctt gacagaggtg taaaaagtac tcaaaaattt 2880
tactcaagtg aaagtacaag tacttaggga aaattttact caattaaaag taaaagtatc 2940
tggctagaat cttacttgag taaaagtaaa aaagtactcc attaaaattg tacttgagta 3000
ttaaggaagt aaaagtaaaa gcaagaaaga aaactagaga ttcttgttta agcttttaat 3060
ctcaaaaaac attaaatgaa atgcatacaa ggttttatcc tgctttagaa ctgtttgtat 3120
ttaattatca aactataaga cagacaatct aatgccagta cacgctactc aaagttgtaa 3180
aacctcagat ttaacttcag tagaagctga ttctcaaaat tgttagtgtc aagcctagct 3240
cttttggggc tgaaaagcaa tcctgcagtg ctgaaaagcc tctcacaggc agccgatgcg 3300
ggaagaggtg tattagtctt gatagagagg ctgcaaatag caggaaacgt gagcagagac 3360
tccctggtgt ctgaaacaca ggccagatgg gcccctctgc taaccatgtt catgccttct 3420
tctctttcct acagctcctg ggcaacgtgc tggttgttgt gctgtctcat cattttggca 3480
aagaattcct cgacggatct catcaagctt aggcctccaa ggcggagtac tgtcctccgg 3540
gctggcggag tactgtcctc cggcaaggtc ggagtactgt cctccgacac tagaggtcgg 3600
agtactgtcc tccgacgcaa ggcggagtac tgtcctccgg gctgcggagt actgtcctcc 3660
ggcaaggtcg gagtactgtc ctccgacact agaggtcgga gtactgtcct ccgacgcaag 3720
gtcggagtac tgtcctccga cactagaggt cggagtactg tcctccgacg caaggtcgga 3780
gtactgtcct ccgacactag aggtcggagt actgtcctcc gacgcaaggc ggagtactgt 3840
cctccgggct ggcggagtac tgtcctccgg caagggtcga ctctagaggg tatataatgg 3900
atcccatcgc gtctcagcct cactttgagc tcctccacac gaattccctc gacctcgaag 3960
acgcgtctgt ttgggatcca ccggtcgcca ccatggcctc tttgctgaag aagaccatgc 4020
ccttcaggac caccatcgag ggcaccgtga acggccacta cttcaagtgc accggcaagg 4080
gcgagggcaa ccccctggag ggcacccagg agatgaagat cgaggtgatc gagggcggcc 4140
ccctgccctt cgccttccac atcctgtcca cctcctgcat gtacggctcc aaggccttca 4200
tcaagtacgt gtccggcatc cccgactact tcaagcagtc cctccccgag ggcttcacct 4260
gggagcgcac caccacctac gaggacggcg gcttcctgac cgcccaccag gacacctccc 4320
tggacggcga ctgcctggtg tacaaggtga agatcctggg caacaacttc cccgccgacg 4380
gccccgtgat gcagaacaag gccggccgct gggagccctc caccgagatc gtgtacgagg 4440
tggacggcgt gctgcgcggc cagtccctga tggccctgga gtgccccggc ggtcgccacc 4500
tgacctgcca cctgcacacc acctaccgct ccaagaagcc cgcctccgcc ctgaagatgc 4560
ccggcttcca cttcgaggac caccgcatcg agatcctgga ggaggtggag aagggcaagt 4620
gctacaagca gtacgaggcc gccgtgggcc gctactgcga cgccgccccc tccaagctgg 4680
gccacaactg aatcgatgat gatgatccag acatgataag atacattgat gagtttggac 4740
aaaccacaat tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 4800
ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 4860
ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 4920
aatgtggtat ggctgattat gatcctctag atcaagatct gcgaagatac ggccacgggt 4980
gctcttgatc ctgtggctga ttttggactg tgctgctcgc agctgctgat gaatcacata 5040
cttcctccat tttcttccac tgattgactg ttataatttc cctaatttcc aggtcaaggt 5100
gctgtgcatt gtggtaatag atgtgacatg acgtcacttc caaaggacca atgaacatgt 5160
ctgaccaatt tcatataatg tgaaaacgat tttcataggc agaataaata acatttaaat 5220
taaactgggc atcagcgcaa ttcaattggt ttggtaatag caagggaaaa tagaatgaag 5280
tgatctccaa aaaataagta ctttttgact gtaaataaaa ttgtaaggag taaaaagtac 5340
ttttttttct aaaaaaatgt aattaagtaa aagtaaaagt attgattttt aattgtactc 5400
aagtaaagta aaaatcccca aaaataatac ttaagtacag taatcaagta aaattactca 5460
agtactttac acctctggtt cttgaccccc taccttcagc aagcccagca gatccactag 5520
ttctagagcg ttcttgaccc cctaccttca gcaagcccag cagatccact agttctagag 5580
cggccgccac cgcggtggag ctccagcttt tgttcccttt agtgagggtt aattgcgcgc 5640
ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 5700
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 5760
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 5820
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 5880
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 5940
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 6000
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 6060
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 6120
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 6180
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 6240
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 6300
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 6360
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 6420
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 6480
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 6540
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6600
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 6660
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6720
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 6780
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6840
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6900
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6960
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 7020
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 7080
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 7140
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 7200
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 7260
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 7320
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 7380
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 7440
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 7500
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 7560
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7620
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 7680
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7740
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 7800
ccac 7804
Claims (10)
- 인간 인터루킨-6(hIL-6; human interleukin 6) 유전자를 간 특이적으로 발현하는 제브라피쉬 모델로서,
상기 제브라피쉬 모델은 다음 단계를 포함하는 방법으로 제작되는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬 모델:
1) (a) 간 지방산 결합 단백질(LFABP; liver fatty acid binding protein) 및 형광단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬와 (b) 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자 서열을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 제브라피쉬를 교배하여, 간 특이적으로 인간 인터루킨 6(hIL 6; human interleukin 6) 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬인 Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP/UAS-hIL6-CG)를 제조하는 단계로서,
상기 (a) 간 지방산 결합 단백질(LFABP; liver fatty acid binding protein) 및 형광단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬는, 하기 개열지도 3으로 표시되는 벡터 및 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 구성된 하기 개열지도 1로 표시되는 벡터에 의해 형질전환된 Tg (LFABP-Gal4/UAS-RFP)이고,
상기 (b) 인간 인터루킨-6(hIL-6) 유전자 서열을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 제브라피쉬는, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 구성된 하기 개열지도 2로 표시되는 벡터에 의해 형질전환된 Tg (UAS-hIL6-CG)이며
[개열지도 1]
[개열지도 2]
[개열지도 3]
; 및
2) 상기 1) 단계에서 제조된 형질전환 제브라피쉬인 Tg(LFABP-Gal4/UAS-RFP/UAS-hIL6-CG)의 형질전환 유전자를 제브라피쉬 수정란에 도입하는 단계.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 제브라피쉬 모델은 간염 또는 간암이 발병한 것을 특징으로 하는, 제브라피쉬 모델.
- 삭제
- 삭제
- 1) 제1항의 제브라피쉬 모델에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 제브라피쉬 모델의 간세포에서의 종양의 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계에서 측정된 간세포에서의 종양의 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법.
- 1) 제1항의 제브라피쉬 모델에 간암 치료제를 처리하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계의 제브라피쉬 모델에 간암의 진행 여부를 측정하는 단계;를 포함하는, 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 방법은,
3) 제브라피쉬 모델의 간암이 진행되면, 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과가 존재하지 않고, 제브라피쉬 모델의 간암이 진행되지 않으면 간암 치료제의 치료 효과가 존재한다고 예측하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 간암 치료제는 JAK/Stat3 신호 또는 이의 하위 조절자를 억제하는 억제제인 것을 특징으로 하는, 간암 치료제의 간암에 대한 치료 효과 예측 방법.
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| Developmental and Comparative Immunology vol. 37, pp. 97-106(2012) |
| In Hye Hung 의 연세대학교 박사학위 논문 ‘Exploiting zebrafish model by transgenic technology for the study of gastrointestinal diseases’(2014년 7월 공개) |
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