KR101459391B1 - 즉효형 핵산 송달용 캐리어 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 siRNA 등의 핵산을 동물 유래 세포 또는 동물에 투여한 경우에 핵산을 효율적으로 세포 내에 송달시킬 수 있고, 또한 낮은 독성으로 안전성이 높은 핵산 송달용 캐리어 및 상기 캐리어와 핵산을 함유하는 핵산 송달용 조성물을 제공하는 것이다. (A)디아실포스파티딜콜린, (B)콜레스테롤 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 및 (C)지방족 제1급 아민을 조합하여 배합해서 핵산 송달용 캐리어를 조제한다. 또한, 해당 핵산 송달용 캐리어와 핵산을 혼합하여 핵산 송달용 조성물을 조제한다.
핵산, 송달, 캐리어, 디아실포파티딜콜린, 콜레스테롤, 지방족 제1급 아민
Description
본 발명은 핵산을 동물 유래 세포 또는 생물에 투여한 경우에 효율적으로 세포 내에 송달시킬 수 있고, 낮은 독성으로 안전성이 높은 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 핵산 송달용 조성물에 관한 것이다.
최근 바이오 테크놀러지의 발전에 따라 세포 내에서 생리 활성기능을 발휘하는 핵산이 다양하게 밝혀지고 있다. 예를 들면, siRNA(small interfering RNA)는 세포에 존재하는 표적 유전자의 mRNA의 분해를 야기하고, 표적 유전자의 발현을 저지하는 것(RNA interference, RNA간섭)이 알려져 있다. 이 RNA간섭에 따른 표적 유전자의 발현 저지기능은 특정한 유전자 또는 유전자군의 비정상적인 발현이 원인이 되어 생기는 질환증상을 경감 내지 치료함으로써 유용하고, siRNA는 치료약으로서의 개발이 기대되고 있다. 그러나, siRNA를 비롯한 핵산을 치료약으로서 이용하기 위해서는 표적 세포 내에서 siRNA의 기능을 발휘하는 것이 중요하고, 이를 위해서는 핵산을 표적 세포 내에 효율적으로 송달시키는 기술을 확립하는 것이 필요 불가 결하다.
외래성 핵산분자 혹은 유전자를 세포 내에 송달하는 기술로서 캐리어(벡터)의 이용이 알려져 있다. 벡터는 바이러스성과 비바이러스성의 벡터로 구분될 수 있다. 바이러스성 벡터는 높은 유전자 도입 효율을 나타내지만, 병원성, 면역원생, 세포독성 등의 안전성 면에서 불명확한 점이 많아 보다 안정성이 높은 비바이러스 벡터의 개발이 기대되고 있다.
지금까지 siRNA 등의 핵산의 세포 내로의 송달을 촉진하는 비바이러스성 핵산 송달용 캐리어로서, 예를 들면 특허문헌 1에는 특정 구조의 양이온성 지질이 보고되고 있다. 그러나, 특허문헌 1에서 보고되고 있는 양이온성 지질에서는 배양 세포 또는 생체에 투여한 경우에는 독성을 보인다는 결점이 있었다. 또한, 특허문헌 2에는 비교적 독성이 낮고 siRNA를 세포 내에 송달가능한 캐리어 조성물로서, 양친매성 화합물 및 폴리 양이온을 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 특허문헌 2에 보고되고 있는 조성물에서도 충분량의 siRNA를 세포 내에 도입하는 경우에는 세포에 대한 독성이 현저히 존재하기 때문에 안전성의 면에서 여전히 문제가 있었다.
이러한 종래 기술을 배경으로 하여 낮은 독성을 가지며, siRNA를 비롯한 핵산을 효율적으로 세포 내에 송달시킬 수 있는 핵산 송달용 캐리어 조성물의 개발이 갈망되어 있었다.
[특허문헌 1] 일본국 특표2002―529439호 공보
[특허문헌 2] 일본국 특표2005―508394호 공보
여기에서 본 발명은 상기 종래기술의 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로는, 본 발명의 목적은 siRNA 등의 핵산을 동물 유래세포 또는 동물에 투여한 경우에 핵산을 효율적으로 세포 내에 송달시킬 수 있고, 낮은 독성으로 높은 안전성을 나타내는 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 상기 캐리어 조성물과 핵산을 함유하는 핵산 송달용 조성물을 제공하는 것에 있다. 또한 본 발명의 다른 목적은 높은 안전성을 가져 핵산을 효율적으로 세포 내에 송달시킬 수 있는 세포 내로의 핵산 도입 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, (A)디아실포스파티딜콜린, (B)콜레스테롤 및／또는 그 유도체, 및 (C)지방족 제1급 아민을 조합하여 함유하는 조성물은 독성이 낮고 높은 안전성을 나타내고, 또한 핵산을 효율적으로 세포 내에 송달시킬 수 있고, 핵산 송달용 캐리어로서 유용하다는 것을 발견하였다. 특히, 상기 (A)∼(C)성분을 포함하는 조성물을, 리포솜 형태로 조제하여 사용함으로써, 한층 뛰어난 안전성 및 핵산 도입성을 가지게 할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 이들의 지견에 기초하여 검토를 더 거듭함으로써 완성된 것이다.
즉 본 발명은 하기와 같은 태양의 발명을 제공한다 :
항 1. (A)디아실포스파티딜콜린, (B)콜레스테롤 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 및 (C)지방족 제1급 아민을 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 2. (A)성분이 아실기 부분의 탄소수가 4∼23의 디아실포스파티딜콜린인 항 1에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 3. (B)성분이 콜레스테롤인 항 1 또는 2에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 4. (C)성분이 탄소수가 10∼20의 알킬아민인 항 1에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 5. (A)성분이 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며, (B)성분이 콜레스테롤이고, 또한 (C)성분이 스테아릴아민인 항 1에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 6. (A)성분: (B)성분: (C)성분의 몰비가 5∼9: 1∼5: 1인 항 1에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 7. siRNA송달용 캐리어인 항 1에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 8. (A)∼(C)성분에 의해 리포솜막이 형성된 리포솜 제제인 항 1에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 9. 핵산 및 항 1에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물을 함유하는 핵산 송달용 조성물.
항 10. 핵산이 siRNA인 항 9에 기재된 핵산 송달용 조성물.
항 11. 리포솜 제제인 항 9에 기재된 핵산 송달용 조성물.
항 12. 항 9에 기재된 핵산 송달용 조성물을 세포에 접촉시킴으로써, 핵산을 세포 내에 도입시키는 공정을 포함하는 핵산 도입방법.
항 13. 세포가 배양 세포, 생체로부터 분리한 세포 또는 생체 내에 존재하는 세포인 항 12에 기재된 핵산 도입방법.
항 14. 핵산 송달용 캐리어의 제조를 위한 (A)디아실포스파티딜콜린, (B)콜레스테롤 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 및 (C)지방족 제1급 아민을 함유하는 조성물의 사용.
항 15. 핵산 송달용 캐리어가 siRNA송달용 캐리어인 항 14에 기재된 사용.
발명의 효과
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 핵산 송달용 조성물은, 세포 내에 효율적으로 핵산을 송달하고, 세포 내에서 핵산의 유용기능을 유효하게 발휘시킬 수 있으며, 또한 독성이 낮고 안전성이 높다는 이점이 있다. 따라서, 상기 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 핵산 송달용 조성물은 핵산의 도입에 따른 각종 질환의 치료, 특히 저분자 화합물 등으로는 치료가 곤란한 난치성 질환 치료에 유용하다.
또한 특히, 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 핵산 송달용 조성물은 siRNA의 부작용인 인터페론의 발현 유도를 효과적으로 억제할 수 있으므로, siRNA를 세포 내에 도입하는데 특히 적합하다.
또한, 본 발명의 핵산 송달용 조성물은 동결 건조처리가 가능하므로 동결건조 상태로 보존할 수 있다는 이점도 있다.
도 1은 시험예 1의 결과, 즉 핵산 송달용 조성물의 세포 안전성을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 2는 시험예 2에 있어서, 각 핵산 송달용 조성물에 있어서의 siRNA의 세포 내로의 도입을 평가한 결과를 도시한 도면이다. 도 2의 세로축은 1세포당 형광강도의 평균치를 나타낸다.
도 3은 시험예 2에 있어서, 핵산 송달용 조성물 중에서 핵산 송달용 캐리어의 구성 지질(DSPC, 콜레스테롤 및 스테아릴아민)의 농도를 변화시켜 siRNA의 세포 내로의 도입을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 4는 시험예 3에 있어서, siRNA를 포함하는 핵산 송달용 조성물의 인터페론 유도 억제를 평가한 결과를 도시한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
핵산 송달용
캐리어
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 (A)디아실포스파티딜콜린, (B)콜레스테롤 및／또는 그 유도체 및 (C)지방족 제1급 아민을 함유하는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 핵산을 세포 내에 송달(도입)하기 위한 핵산의 캐리어로서 사용된다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물이 적용되는 핵산은 세포 내로의 송달을 필요로 하는 것이라면, 그 종류나 구조에 대해서는 특별히 제한되지 않는다. 해당 핵산의 구체적인 예로서, siRNA, mRNA, tRNA, rRNA, cDNA, miRNA(마이크로RNA), 리보자임, 안티센스올리고, 데코이올리고뉴클레오티드, 플라스미드 DNA, 펩티드 핵산, 3중 사슬 형성성 올리고뉴클레오티드(Triplex Forming Oligonucleotide, TFO), 압타머, 유전자 등이 예시된다. 그 중에서도, 특히 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 siRNA의 부작용인 인터페론의 발현 유도를 억제하는 유리한 특징이 있고, siRNA의 세포 내로의 송달용으로서 유용하다. 본 발명의 핵산 송달용 캐리어가 적용되는 핵산은 사람, 동물, 식물, 세균, 바이러스 등에 유래하는 것이어도 좋고, 또한 화학 합성에 의해 제조된 것이어도 좋다. 또한 이들의 핵산은, 1개 사슬, 2개 사슬, 3개 사슬의 어떠한 것이어도 좋고, 더욱 그 분자량에 관해서도 특별히 제한되지 않는다. 또한 본 발명에 있어서 핵산은 화학 물질, 효소 또는 펩티드로 수식된 것이어도 좋다. 본 발명에 있어서, 핵산은 1종의 것을 단독으로 사용해도 좋고,또한 2종 이상의 것을 적절하게 조합하여 사용해도 좋다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 사용되는 디아실포스파티딜콜린 (이하, 「(A)성분」이라고 표기할 수도 있음)으로서는 약리학적으로 허용되는 것을 한도로 하여 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 아실기 부분의 탄소수가 4∼23인 것을 들 수 있다. 또한, 해당 디아실포스파티딜콜린을 구성하는 2개의 아실기의 탄소수는 동일 또는 상이해도 좋다.
본 발명에서 사용되는 디아실포스파티딜콜린의 구체적인 예로서는, 디라우로 일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 미리스토일팔미토일포스파티딜콜린, 미리스토일스테아로일포스파티딜콜린, 팔미토일스테아로일포스파티딜콜린, 디부티로일포스파티딜콜린, 디헥사노일포스파티딜콜린, 디헵타노일포스파티딜콜린, 디데카노일포스파티딜콜린, 디부타노일포스파티딜콜린, 디도데실포스파티딜콜린, 디이코세노일포스파티딜콜린, 디헤니코사노일포스파티딜콜린, 디에르코일포스파티딜콜린, 디아라키도노일포스파티딜콜린, 비스(트리코사디노일)포스파티딜콜린 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 바람직하게는, 아실기 부분의 탄소수가 12∼18의 디아실포스파티딜콜린을 들 수 있고; 더 바람직하게는, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 미리스토일팔미토일포스파티딜콜린, 미리스토일스테아로일포스파티딜콜린 및 팔미토일스테아로일포스파티딜콜린 등의 아실기 부분의 탄소수가 13∼17의 디아실포스파티딜콜린을 들 수 있고; 특히 바람직하게는, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 들 수 있고; 가장 바람직하게는, 디스테아로일포스파티딜콜린을 들 수 있다. 이들의 디아실포스파티딜콜린은 1종 단독으로 사용해도 좋고, 또한 2종 이상을 조합하여 사용해도 좋다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 사용되는 콜레스테롤 및／또는 그 유도체(이하, 「(B)성분」으로 표기할 수도 있음)로서는 약리학적으로 허용되는 것을 한도로 하여 특별히 제한되지 않는다. 콜레스테롤의 유도체란, 콜레스테롤 골격을 가지는 양이온성 지질이며, 구체적으로는, 3β―[N―(N’,N’―디메틸아미노에 탄)―카바모일]콜레스테롤(DC―Chol), 3β―[N’,N’,N’―트리메틸아미노에탄]요오드화 콜레스테롤(TC―Chol), 비스(구아니디움)―트렌―콜레스테로스(BGTC), N―콜레스테릴옥시카르보닐―3,7―디아자노난―1,9―디아민, β―알라닌―디에탄올아민―콜레스테롤, N4―스페르민콜레스테릴카바메이트(GL―67; N4―spermine cholesteryl carbamate), N[N4―3―아미노프로필스페르미딘]콜레스테릴카바메이트(GL―78; N[N4―3―aminopropylspermidine] cholesteryl carbamate), N4―스페르민콜레스테릴카복사마이드(GL―90; N4―spermine cholesteryl carboxamide), N1,N8―비스(아르기닉카복사마이드)―N4―스페르미딘콜레스테릴카바메이트(GL―95; N1,N8―Bis(argininc carboxamide)―N4―spermidine cholestery carbamate), N―[N1,N4,N8―트리스(3―아미노프로필)스페르미딘]콜레스테릴카바메이트(GL―96; N―[N1,N4,N8―Tris(3―aminopropyl)spermidine]cholesteryl carbamate)가 예시된다. 본 발명에 있어서 적합한 (B)성분으로서 콜레스테롤을 들 수 있다. 본 발명에서는 (B)성분으로서 콜레스테롤 및 그 유도체 중 1종의 것을 단독으로 사용해도 좋고, 또한 2종 이상의 것을 조합하여 사용해도 좋다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 사용되는 지방족 제1급 아민(이하,「(C)성분」이라고 표기할 수도 있음)으로서는 약리학적으로 허용되는 것을 한도로하여 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 알킬기 부분의 탄소수가 10∼20의 알킬아 민을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 지방족 제1급 아민의 구체적인 예로서는, 라우릴아민, 미리스틸아민, 팔미틸아민, 스테아릴아민, 올레일아민, 데카노일아민, 프타노일아민 등을 들 수 있다. 이 중에서도 바람직하게는, 알킬기 부분의 탄소수가 12∼18의 알킬아민을 들 수 있고; 더 바람직하게는, 스테아릴아민, 올레일아민 및 팔미토일아민을 들 수 있고; 특히 바람직하게는 스테아릴아민을 들 수 있다. 이들 지방족 제1급 아민은 1종 단독으로 사용해도 좋고, 또한 2종 이상을 조합하여 사용해도 좋다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 상기 (A)∼(C)성분을 조합하여 함유하면 좋지만, 하기의 조합 태양을 채용함으로써 핵산의 세포 내로의 송달 효율 및 낮은 독성을 한층 더 높인다는 관점으로부터 이하에 예시하는 조합이 적합하다; (A)아실기 부분의 탄소수가 4∼23의 디아실포스파티딜콜린, (B)콜레스테롤 및／또는 그 유도체, 및 (C)탄소수가 10∼20의 알킬아민의 조합; 더 바람직하게는 (A)디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및／또는 디스테아로일포스파티딜콜린, (B)콜레스테롤, 및 (C)스테아릴아민의 조합.
또한, 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 있어서 (A)∼(C)성분의 배합 비율에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, (A)성분: (B)성분: (C)성분의 몰비가 5∼9: 1∼5: 1, 바람직하게는 6∼9: 1∼4: 1, 더 바람직하게는 7∼8: 2∼3: 1이 예시된다. 이러한 비율을 충족함으로써, 핵산의 세포 내로의 송달 효율 및 낮은 독성을 한층 더 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 송달용 캐리어의 총량에 대한 (A)∼(C)성분의 합계량으로서는, 예를 들면 1∼100중량%, 바람직하게는 20∼90중량%, 더 바람직하게는 30∼70중량%를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 상기 (A)∼(C)성분에 더하여 또 다른 양이온성 지질을 포함하고 있어도 좋다. 이와 같은 양이온성 지질로서, 구체적으로는 스쿠알라민(Squalamine), 3a,7a,12a―트리스(3―아미노프로폭시)―5β―콜란―24―(N,N―비스(3―아미노프로필)아민(3a,7a,12a―Tris(3―aminopropoxy)―5β―cholan―24―(N,N―bis(3―aminopropyl)amine), 3a,7a,12a―트리스(3―아미노프로폭시)―5β―콜란―24―(N―(N―(3―아미노프로필))―3―아미노프로필)―아민(3a,7a,12a―Tris(3―aminopropoxy)―5b―cholan―24―(N―(N―(3―aminopropyl))―3―aminopropyl)―amine), 3a,7a,12a―트리스(3―아지도프로폭시)―5β―콜란―24―(N,N―비스(2―시아노에틸)아민)(3a,7a,12a―Tris(3―azidopropoxy)―5b―cholan―24―(N,N―bis(2―cyanoethyl)amine)), 3a,7a,12a―트리스(3―아지도프로폭시)―5β―콜란―24―(N―(벤질옥시카르보닐)―N―(히드록시프로필)―아민)(3a,7a,12a―Tris(3―azidopropoxy)―5b―cholan―24―(N―(benzyloxycarbonyl)―N―(3―hydroxypropyl)―amine)) 등의 스테로이드가 결합하고 있는 양이온성 지질; 앰브렐라―스페르민 복합체(Umbrella―spermine conjugates) 등의 콜산이 결합하고 있는 양이온성 지질; 스테롤글리코시드가 결합하고 있는 양이온성 지질; 스테로이드사포닌이 결합하고 있는 양이온성 지질; 디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염(DDAB), 1,2―디미리스토일―3―트리메틸암모늄프로판, 1,2―디올레오일―3―트리메틸암모늄프로 판(DOTAP), 1,2―디올레오일―3―트리메틸암모늄프로판메틸황산염, 1,2―디팔미토일―3―트리메틸암모늄프로판, 1,2―디스테아로일―3―트리메틸암모늄프로판, N―(1―(2,3―비스(올레오일옥시)프로필)―N,N,N―트리메틸암모늄염산염(DOTMA), 디미리스토일옥시프로필디메틸히드록시에틸암모늄브로마이드염(DMRIE), 디올레오일옥시프로필디메틸히드록시에틸암모늄브로마이드(DORIE), 디메틸디도데실암모늄브로마이드, N―(a―트리메틸암모니오아세틸)―디도데실―D―글루타민염산염, N―(a―트리메틸암모니오아세틸)―O,O’―비스(1H,1H,2H,2H―퍼플루오로데실)―L―글루타민염산염, O,O’―디도데카노일―N―(a―트리메틸암모니오아세틸)디에탄올아민염산염, 메틸알릴디도데실암모늄브로마이드, N―{p―(w―트리메틸암모니오부틸옥시)―벤조일}―디도데실―L―글루타민염산염, 9―(w―트리메틸암모니오부틸)―3,6―비스(도데카노일)카바졸브로마이드, 디메틸디옥타데실암모늄염산염, N―w―트리메틸암모니오데카노일―디헥사데실―D―글루타민브로마이드, N―{p―(w―트리메틸암모니오헥실옥시)―벤조일}―디테트라데실―L―글루타민브로마이드, p―(w―트리메틸암모니오데실옥시)―p’―옥틸옥시아조벤젠브로마이드염(MC―1―0810), p―{w―(b―히드록시에틸)디메틸―암모니오―데실옥시}―p’―옥틸옥시아조벤젠브로마이드염(MC―3―0810), O,O’,O’’―트리도데카노일―N―(w―트리메틸―암모니오데카노일)―트리스(히드록시메틸)아미노메탄브로마이드염(TC―1―12), 1,2―디라우릴―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1,2―디미리스토일―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1,2―디팔미토일―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1,2―디스테아로일―글리세로―3―에틸포스포코린, 1,2―디올레오일―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1―팔미토일― 2―올레오일―글리세로―3―에틸포스포콜린 등의 제4급 암모늄염형의 양이온성 지질 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, (A)∼(C)성분 이외의 다른 양이온성 지질을 함유하는 경우, 상기 양이온성 지질의 비율로서는 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 특별히 제한되지 않지만, 상기 (A)∼(C)성분의 총량 100중량부에 대하여 상기 양이온성 지질이 1∼10중량부, 바람직하게는 2∼8중량부, 더 바람직하게는 4∼6중량부가 되는 비율이 예시된다.
또한, 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 필요에 따라 유성기제를 포함하고 있어도 좋다. 유성기제를 배합하여 그 특성을 이용함으로써, 핵산 송달용 캐리어 조성물에 따른 핵산의 도입 효율의 제어가 가능하게 된다. 예를 들면, 유성기제를 배합해서 핵산 송달용 캐리어 조성물의 비중을 조정함으로써, 세포와 핵산 송달용 캐리어 조성물의 접촉성을 제어하고, in vitro에서의 도입 효율을 개선하는 것이 가능하게 된다. 또한 예를 들면, 유성기제로서 온도 감수성 기능을 가지는 것을 배합함으로써, 소정 온도의 조건하에서 핵산 캐리어 조성물의 코어를 붕괴시켜 세포 표면에서의 흔들림을 유인하고, 핵산의 도입 효율을 향상시키는 것이 가능하게 된다. 또한 예를 들면, 유성기제로서 외부 자극 붕괴성을 가지는 것을 배합함으로써, 외부 자극에 의해 핵산 캐리어 조성물의 코어를 붕괴시켜 세포 표면에서의 흔들림을 유인하고, 핵산의 도입 효율을 향상시키는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 배합되는 유성기제로서는, 예를 들면 퍼플루오로카본, 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로옥틸브로마이드, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로트리부틸아민, 대두유, 정제 대두유, 대두 경화유, 대두유 불감화물, 스쿠알렌, 피마자유, 정향유, 트리올레인산 소르비탄, 테레빈유, 홍화유, 홍화유 지방산, 올레인산, 야자유, 유채유, 퓨젤유, 올리브유, 아마인유, 참기름, 클로로필유, 파두유, 베르가못유, 시더유, 오렌지유, 회향유, 유칼리유, 옥수수유, 라벤더유, 마조람유, 레몬유, 면실유, 난황유, 로즈유, 송유, 아몬드유, 땅콩기름, 동백기름, 장뇌백유, 카밀레유, 계피유, 박하유, 에스테르화 옥수수유, 생강유, 로만카밀레유, 사유(snake oil), 스피아민트유, 해바라기유, 카카오유, 밀배아유, 징크유, 경화유, 수소첨가 식물유, 경질 유동 파라핀, 유동 파라핀, 중쇄지방산 트리글리세라이드, 밍크유, 등피유, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 10, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 100, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 20, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 40, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 5, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 50, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 폴리옥실 35 피마자유, 프로세스유 등을 들 수 있다. 이들의 유성기제 중, 퍼플루오로펜탄에는 온도 감수성이 있고, 29.5℃에서 비등에 의해 가스화하는 특성이 있다. 또한 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로옥틸브로마이드 및 퍼플루오로트리부틸아민에는 외부 자극 붕괴성이 있고, 초음파 조사에 의한 자극 등의 외부로부터의 자극에 의해 캐리어 조성물의 코어에 캐비테이션을 발생시켜 붕괴시키는 특성이 있다.
해당 유성기제를 함유하는 경우, 상기 유성기제의 비율로서는 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 특별히 제한되지 않지만, 상기 (A)∼(C)성분의 총량 100중 량부에 대하여 상기 유성기재가 0.1∼50중량부, 바람직하게는 1∼30중량부, 더 바람직하게는 5∼20중량부가 되는 비율이 예시된다.
또한, 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에는 필요에 따라 막 융합성 지질(헬퍼 지질)을 포함하고 있어도 좋다. 이러한 막 융합성 지질을 함유함으로써, 세포 내로의 핵산의 송달 효율을 한층 향상시킬 수 있게 된다. 이러한 막 융합성 지질로서는 예를 들면, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티딜콜린, 트랜스포스파티딜포스파티딜에탄올아민, 1,2―비스(10,12―트리코사디노일)―포스포에탄올아민, 1,2―디에라이도일포스포에탄올아민, 1,2―디헥사데실포스포에탄올아민, 1,2―디헥사노일포스포에탄올아민, 1,2―디라우로일포스포에탄올아민, 1,2―디리놀레오일포스포에탄올아민, 1,2―디미리스토일포스포에탄올아민, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민, 1,2―디팔미토올레오일포스포에탄올아민, 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민, 1,2―디피타노일포스포에탄올아민, 1,2―디스테아로일포스포에탄올아민, 1―팔미토일―2―올레오일포스포에탄올아민, 1―팔미토일―2―(10,12―트리코사디노일)포스포에탄올아민, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―카프로일아민, 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―카프로일아민, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N, N―디메틸, 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N, N―디메틸, 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―도데카노일, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―도데카노일, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―도데카닐아민, 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―도데카닐아민, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―글루타릴, 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―글루타릴, 1,2―디올레 오일포스포에탄올아민―N―락토오스, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―[4(p―말레이미드 메틸)사이클로헥산―카르복시산염, 디팔미토릴포스포에탄올아민―N―[4(p―말레이미드메틸)사이클로헥산―카르복시산염, 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―[4(p―말레이미드페닐)부티라미드, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―[4(p―말레이미드페닐)부티르산염], 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―메틸, 디팔미토일포스포에탄올아민―N―메틸, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―[3―(2―피리딜디티오)프로피온산염, 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―[3―(2―피리딜디티오)프로피온산염, 1,2―디올레오일포스포에탄올아민―N―(석시닐), 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―(석시닐) 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 디올레오일포스파티딜에탄올아민은 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 있어서 적합하게 사용된다.
해당 막 융합성 지질을 함유하는 경우, 상기 막 융합성 지질의 비율로서는 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 특별히 제한되지 않지만, 상기 (A)∼(C)성분의 총량 100중량부에 대하여 상기 막 융합성 지질이 1∼500중량부, 바람직하게는 10∼250중량부, 더 바람직하게는 25∼100중량부가 되는 비율이 예시된다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 사용 형태에 따라 등장화제, 부형제, 희석제, 증점제, 안정화제, 완충제, 보존제 등의 각종 첨가제; 정제수, 당수용액, 완충액, 생리식염수, 고분자 수용액, RNase 무함유 수(RNase free water) 등의 수성 담체를 함유할 수 있다. 이들의 첨가제나 수성 담체의 배합량은 핵산 송달용 캐리어의 사용 형태에 따라 적절히 설정할 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 세포 내에 송달하는 대상이 되는 핵산을 포함할 수 있는 한 그 형태에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 리포솜의 형태인 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물을 리포솜의 형태로 하는 경우, 상기 (A)∼(C)성분 및 필요에 따라 첨가되는 것 이외의 지질은 리포솜막을 형성한다. 리포솜의 형태로 하는 경우, 작은 1매 막 리포솜(small unilamellar. vesicles: SUV), 큰 1매 막 리포솜(large unilamellar vesicles: LUV) 및 다중층 리포솜(multilamellar vesicles: MLV)의 어느 것이어도 좋다. 또한, 그 입자 지름에 대해서는 송달 대상의 세포의 종류 등에 따라 적절히 설정하면 좋지만, 예를 들면 SUV에서는 20∼100㎚, LUV에서는 200∼1000㎚, MLV에서는 400∼3500㎚ 정도가 예시된다. 리포솜의 입자 지름은 동적 광 산란법에 의해 측정된다.
리포솜의 제조 및 그 입자 지름의 조절은 당업계에서 공지의 방법에 의해 실시된다. 즉, 상기 (A)∼(C)성분을 포함하는 유상(oil phase)과, 수상(water phase)(수성 담체)을 이용하여 박막법, 역상 증발법, 에테르 주입법, 계면 활성제법, 가온법 등에 의해 리포솜을 형성시킬 수 있다. 또한, 압출(extrusion)법, 프렌치 프레스(French press)법, 균질화(homogenization)법 등에 의해 입자 지름을 조절할 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 상기 (A)성분, (B)성분 및 필요에 따라 타성분을 혼합하여 목적으로 하는 형태에 따라 적절하게 제제화함으로써 조제된다.
핵산 송달용 조성물
본 발명의 핵산 송달용 조성물은 상기의 핵산 송달용 캐리어 조성물과 핵산을 함유하는 것이다. 즉, 해당 핵산 송달용 조성물은 상기 조성물 내에 포함되는 핵산을 송달 대상이 되는 세포 내로 도입하기 위해서 사용되는 것이다.
핵산 송달용 캐리어 조성물이 리포솜 형태인 경우, 해당 핵산 송달용 조성물에 있어서 리포솜 내의 수상에 핵산이 봉입된 상태로 존재하고 있어도 좋고, 또한 리포솜막의 내측 또는 외측에 이온 결합 또는 소수 결합에 의해 결합하여 존재하고 있어도 좋다. 또한, 핵산 송달용 캐리어 조성물이 리포솜 이외의 형태인 경우라면, 해당 핵산 송달용 조성물에 있어서 핵산은 핵산 송달용 캐리어 조성물의 배합 성분과 이온 결합 또는 소수 결합에 의해 복합체를 형성하고 있으면 좋다.
본 발명의 핵산 송달용 조성물은 상기의 핵산 송달용 캐리어 조성물과 핵산을 혼합하여 희망하는 형태로 조제하거나, 또는 핵산 및 상기의 핵산 송달용 캐리어 조성물의 배합 성분을 임의의 순서로 혼합하여 희망하는 형태로 조제함으로써 제조된다.
본 발명의 핵산 송달용 조성물에 있어서 핵산과 핵산 송달용 캐리어 조성물의 배합 비율로서는, 사용하는 핵산이나 핵산 송달용 캐리어의 종류나 핵산의 송달 대상이 되는 세포의 종류 등에 따라 상이하지만, 예를 들면 핵산 송달용 캐리어 조성물에 포함되는 (A)∼(C)성분의 총량 100중량부에 대하여, 핵산이 1.0×10―5∼1.0 중량부, 바람직하게는 1.0×10―4∼1.0×10―1 중량부, 더 바람직하게는 1.0×10―3∼1.0×10― 2중량부가 되는 비율을 들 수 있다.
또한, 핵산 송달용 조성물에 포함되는 (A)∼(C)성분의 합계량으로서는 상기조성물의 총량에 대하여, 예를 들면 10∼90중량%, 바람직하게는 30∼80중량%, 더 바람직하게는 40∼60중량%를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 조성물은 사용 형태에 따라 등장화제, 부형제, 희석제, 증점제, 안정화제, 완충제, 보존제 등의 각종 첨가제; 정제수, 글루코스 수용액, 완충액, 생리식염수 등의 수성 담체를 함유할 수 있다. 이들의 첨가제나 수성 담체의 배합량은 핵산 송달용 조성물의 사용 형태에 따라 적절히 설정할 수 있다.
본 발명에 있어서 핵산이 송달되는 세포로서는 배양 세포, 생체로부터 추출한 세포(주화세포를 포함), 사람 등의 생체 내에 존재하는 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 조성물의 사용 태양으로서는 해당 핵산 송달용 조성물의 적당량이 핵산 도입 대상이 되는 세포에 접촉하도록 적용되는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 사람 등의 생체 내의 세포에 핵산을 송달하는 경우, 예를 들면 조직으로의 직접 주입; 정맥, 피하, 근육, 복강, 눈 안, 소화기관 내, 이(齒) 안으로의 주사; 비강, 구강, 폐 등으로의 흡입 투여; 경구투여; 피부를 통한 경피 투여; 및 구강 점막, 질 점막, 안(眼) 점막, 직장 점막, 자궁 점막을 통한 경점막 투여 등이 예시된다. 또한, 배양 세포나 생체로부터 추출한 세포에 핵산을 송달하는 경우라면, 배양시에 미리 적당량의 핵산 송달용 조성물이 있는 상태에서 세포를 배양하는 방법이 예시된다. 또한, 배양 세포나 생체로부터 추출한 세포에 핵산을 송달하는 경우, 혈청의 존재 하에서도 핵산의 세포 내로의 송달이 가능하다.
또한, 핵산도입 대상이 되는 세포에 대하여 본 발명의 핵산 송달용 조성물이 적용되는 양에 대해서는 사용하는 핵산의 종류, 상기 핵산 송달용 조성물의 종류, 대상이 되는 세포의 종류 등에 따라 적절하게 설정된다. 예를 들면, 핵산의 송달 대상이 사람의 세포인 경우, 핵산의 투여에 의해 치료 효과가 기대되는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 핵산 송달용 조성물을 투여하면 좋다.
(실시예)
이하, 실시예 등에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것이 아니다. 또한, 이하의 실시예 등에 있어서 디스테아로일 포스파티딜콜린을 「DSPC」, 디팔미토일포스파티딜콜린을 「DPPC」, 디미리스토일포스파티딜콜린을 「DMPC」로 표기한다. 또한 이하의 시험예 1 및 2에서는 siRNA로서 GL3―siRNA (반딧불의 루시페라제(firefly luciferase)에 대한 siRNA;Dharmacon사, Boulder, CO, USA;sense:5’―CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT, antisense:5’―UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)를 이용하였다. 또한, 시험예 3에는 siRNA로서 Human MMP―9―siRNA (Samchully Pharm. Co., Ltd, Korea; Sense 5’―CCAACUAUGACCAGGAUAAdTdT―3’, antisense:5’―UUAUCCUGGUCAUAGUUGGdTdT―3’)를 이용하였다.
실시예 1 DSPC를 포함하는 핵산 송달용 캐리어 조성물의 조제
몰비로 DSPC: 콜레스테롤: 스테아릴아민 ＝ 7:3:1이 되도록 칭량하고, 이를 가지형 플라스크에서 클로로포름 중에 용해시켰다. 로터리 증발기에 의해 감압 건조시켜 지질 박막을 형성하였다. 이에 DSPC 농도로 30㎎/㎖가 되도록 DEPC―treated water(Ambion사제;Rnase 무함유 수(Rnase free water))를 더한 후, 압출기를 이용하여 홀 지름 100㎚의 막에 통과시켜 입자 지름을 갖추고, 양이온성 리포솜 형태인 핵산 송달용 캐리어 조성물을 조제하였다.
실시예 2 DPPC를 포함하는 핵산 송달용 캐리어 조성물의 조제
DSPC 대신에 DPPC를 사용하는 것 이외는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 양이온성 리포솜 형태의 핵산 송달용 캐리어 조성물을 조제하였다.
실시예 3 DMPC를 포함하는 핵산 송달용 캐리어 조성물의 조제
DSPC 대신에 DMPC를 사용하는 것 이외는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 양이온성 리포솜 형태의 핵산 송달용 캐리어 조성물을 조제하였다.
실시예 4 DSPC를 포함하는 핵산 송달용 조성물의 조제
20×Tris―EDTA(TE)완충액(Invitrogen사제)을 DEPC―treated water(Ambion사제; Rnase 무함유 수(Rnase free water))로 20배 희석한 용액을 이용하여, 2μM의 농도로 siRNA를 포함하는 용액(siRNA용액)을 조제하였다. 그 후, 실시예 1의 핵산 송달용 캐리어 조성물과 siRNA용액을 등량 혼합하고 리포플랙스(복합체)를 형성시켜 핵산 송달용 조성물을 조제하였다.
실시예 5 DPPC를 포함하는 핵산 송달용 조성물의 조제
20×Tris―EDTA(TE)완충액(Invitrogen사제)을 DEPC―treated water(Ambion사제; Rnase 무함유 수(Rnase free water))로 20배 희석한 용액을 이용하여, 2μM의 농도로 siRNA를 포함하는 용액(siRNA용액)을 조제하였다. 그 후, 실시예 2의 핵산 송달용 캐리어 조성물과 siRNA용액을 등량 혼합하고 리포플랙스(복합체)를 형성시켜 핵산 송달용 조성물을 조제하였다.
실시예 6 DMPC를 포함하는 핵산 송달용 조성물의 조제
20×Tris―EDTA(TE)완충액(Invitrogen사제)을 DEPC―treated water(Ambion사제;Rnase 무함유 수(Rnase free water))로 20배 희석한 용액을 이용하여, 2μM의 농도로 siRNA를 포함하는 용액(siRNA용액)을 조제하였다. 그 후, 실시예 3의 핵산 송달용 캐리어 조성물과 siRNA용액을 등량 혼합하고 리포플랙스(복합체)를 형성시켜 핵산 송달용 조성물을 조제하였다.
시험예 1 세포 안전성의 평가시험
MTS시험법을 이용하여 수행하였다. MTS시험은 Promega사제의 「CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay」를 이용하여 수행하였다. 구체적 으로는 96구멍 플레이트에 A594세포(ATCC, USA)를 3.16×104cells/well로 10용량% 우태아혈청(FBS)을 포함하는 둘베코(Dulbecco)변법 이글 배지(DMEM) 200㎕중에 파종하고, 37℃ 하에서 24시간 배양하였다. 행크스 밸런스드 솔트 솔루션(Hank’s buffered salt solution)(HBSS)으로 3회 세정 후, FBS를 포함하지 않는 DMEM으로 대체하여 상기 실시예 4∼6의 핵산 송달용 조성물을 각각 1 구멍당 20㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 4시간 인큐베이트하였다. 그 후, 구멍 중의 배양 상청을 10용량% FBS함유DMEM으로 대체하여 37℃, 5%CO2 조건하에서 20시간 더 인큐베이트하였다. 그 후, 각 구멍에 MTS(Methanethiosulfonate)시약 20㎕ 및 FBS 10용량% 함유 DMEM 배지 100㎕를 더하고 2시간 인큐베이트한 후, 492㎚에서의 흡광도를 측정하고 세포 생존율을 산출하였다. 또한, 세포 생존율은 핵산 송달용 조성물을 첨가하지 않고 상기 조건에서 인큐베이트하였을 때에 측정된 490㎚에서의 흡광도를 100%로서 산출하였다.
획득된 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 나타내어지는 바와 같이 실시예 4∼6의 핵산 송달용 조성물의 어느 것이라도 세포독성이 낮고 안전성이 높은 것이 밝혀졌다. 특히, 디아실포스파티딜콜린으로서 DSPC 또는 DPPC를 사용한 핵산 송달용 조성물(실시예 4 또는 5)에서는 안전성이 현저하게 높은 것으로 확인되었다.
시험예 2 siRNA의 세포 내로의 송달 효율의 평가시험
플로우 싸이토메트리(flow cytometry)를 이용하여 siRNA에 표지한 FITC의 형 광 강도를 측정함으로써 세포 내 도입을 평가하였다. 또한, 본 시험에서는 siRNA에 미리 FITC 표지한 것을 이용하여 조제한 핵산 송달용 조성물을 이용하였다. 구체적으로는, 24구멍 플레이트에 A594 세포(ATCC, USA)를 5×105cells/well로 10용량% FBS를 포함하는 DMEM 500㎕중에 파종하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. HBSS로 3회 세정 후, FBS를 포함하지 않는 DMEM으로 대체하여 상기 실시예 4∼6의 핵산 송달용 조성물을 각각 1 구멍당 0.05㎖ 더 첨가하고, 37℃, 5% CO2조건하에서 4시간 인큐베이트하였다. 그 후, 구멍 중의 배양 상청을 10용량% FBS함유 DMEM으로 대체하여 37℃, 5% CO2조건하에서 20시간 더 인큐베이트하였다. 각 구멍을 HBSS로 1회 세정 후, CellScrubBuffer(Gene Therapy Systems, Inc.제)를 0.2㎖ 첨가하여 37℃, 5% CO2조건하에서 15분간 인큐베이트하였다. 또한, HBSS에서 2회 세정 후, 트립신을 이용하여 구멍 바닥부에 부착되어 있는 세포를 벗겨내고, 원심분리에 의해 세포를 회수하여 획득된 세포를 HBSS로 현탁시켰다. 그 현탁액을 홀 지름 41㎛의 막에 통과시켰다. 핵산 송달용 조성물의 첨가 2시간 후 및 24시간 후의 세포의 형광강도를 플로우싸이토메트리를 이용하여 측정하였다. 또한, 비교 대상으로서, 시판에서 유전자 벡터로서 자주 이용되는 Lipofectamine 2000TM(Invitrogen사제)을 OptiMEM 배지에서 0.1㎎/㎖로 희석한 용액과, TE완충액에 siRNA를 2μM의 농도로 희석한 siRNA용액을 용량비 1:1로 혼합해서 획득된 비교용 핵산 송달용 조성물을 이용하여, 상기와 마찬가지로 세포의 형광강도를 측정하였다.
획득된 결과를 도 2에 나타낸다. 이 결과로, 실시예 4∼6의 핵산 송달용 조성물의 어느 경우에도 siRNA가 세포 내에 효율적으로 받아들여지는 것으로 확인되었다. 특히, 디아실포스파티딜콜린으로서 DSPC 또는 DMPC를 사용한 핵산 송달용 조성물(실시예 4 및 6)에서는 첨가 2시간 후에 siRNA의 세포 내로의 도입이 시판에서 유전자 벡터로서 자주 이용되는 LipofectamineTM2000에 비해서 현저하고, 즉효성이 뛰어나다는 유리한 특징을 구비하고 있다는 것도 밝혀졌다.
또한 DSPC, 콜레스테롤 및 스테아릴아민(몰비로 DSPC:콜레스테롤:스테아릴아민＝7:3:1, 이하, 이를 정리하여 「핵산 송달용 캐리어의 구성 지질」이라고 표기함)을 이용하여, DSPC의 농도가 7.5∼30㎎/㎖의 핵산 송달용 캐리어를 실시예 1에 기재된 방법에 준하여 제조하였다. 그 후, 이 핵산 송달용 캐리어와 200nM의 siRNA 포함하는 TE완충액을 동일량 혼합하고, 리포플랙스(복합체)를 형성시켜 핵산 송달용 조성물을 조제하였다. 이렇게 하여 조제한 핵산 송달용 조성물을 이용하여 상기와 같은 방법으로 세포 내로의 도입을 평가하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. 이 결과로부터 핵산 송달용 캐리어의 구성 지질의 농도를 변화시키면 핵산 송달용 조성물에 의한 핵산의 세포 내로의 도입량은 그에 따라 변화되었다. 또한 핵산 송달용 캐리어 구성 지질의 어떠한 농도의 경우라도 24시간 후의 값은 2시간과 비교해서 낮은 값을 나타내고, 24시간 후에는 siRNA의 소실을 개시하고 있다는 것이 밝혀졌다. 즉, 본 결과로부터도 DSPC, 콜레스테롤 및 스테아릴아민을 조합하여 핵산 송달용 캐리어로서 사용함으로써 첨가 2시간 후라는 단시간으로 siRNA의 세포 내로의 송달이 가능하게 되어 즉효성이 우수하다는 것이 확인되었다.
시험예 3 인터페론 유도 억제의 평가시험
24구멍 플레이트에 A594세포(ATCC, USA)를 5×105cells/well로 10용량% FBS를 포함하는 DMEM 500㎕중에 파종하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. HBSS로 3회 세정 후, 각 구멍에 FBS를 포함하지 않는 DMEM배지 450㎕를 더하여 각 구멍에 상기 실시예 4의 핵산 송달용 조성물 50㎕를 더 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 4시간 인큐베이트하였다. 그 후, 구멍 중의 배양 상청을 10용량% FBS함유 DMEM으로 대체하여 37℃, 5%CO2 조건하에서 20시간 인큐베이트하였다. 또한, HBSS로 3회 세정 후, 트립신을 이용하여 구멍 바닥부에 부착되어 있는 세포를 벗겨 내어 원심분리에 의해 세포를 회수하였다. 획득된 세포로부터 Rneasy Plus Mini(Qiagen사제)를 이용하여 RNA를 추출하고, QutantiTect Reverse Transcription (Qiagen사제)을 이용하여 전사해서 cDNA를 획득하였다. 획득된 cDNA를 QutantiTectPrimer Assay(Qiagen사제)와 iCycler iQ(Bio―RAD사제)를 이용하여 인터페론 유도 유전자인 IFIT―1의 mRNA를 리얼타임 PCR에 의해 정량하였다. 비교 대상으로서, 시판에서 유전자 벡터로서 자주 이용되는 Lipofectamine 2000TM(Invitrogen사제)을 OptiMEM 배지에서 0.1㎎/㎖로 희석한 용액과 TE완충액에 siRNA를 2μM의 농도로 희석한 siRNA용액을 용량비 1:1로 혼합해서 획득된 비교용 핵산 송달용 조성물을 이용하여, 상기와 마찬가지로 IFIT―1의 mRNA를 정량하였다. 정량을 보정하기 위한 하우스키핑 유전자는 18rRNA를 이용하였다. 또한, 블랭크로서 핵산 송달용 조성물을 첨가하지 않고 상기 조건에서 IFIT―1의 mRNA를 정량하였다.
획득된 결과를 도 4에 나타낸다. DSPC를 사용한 실시예 4의 핵산 송달용 조성물에서는 LipofectTMamine2000을 사용한 비교용 핵산 송달용 조성물에 비하여 현저하게 낮은 인터페론 유도를 제시하였다. 본 결과로부터, 본 발명의 핵산 송달용 조성물을 이용함으로써 siRNA의 부작용인 인터페론 유도를 억제하는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다.
Claims (15)
- (A)아실기 부분의 탄소수가 4∼23인 디아실포스파티딜콜린, (B)콜레스테롤 및 콜레스테롤 골격을 갖는 양이온성 지질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 및 (C)탄소수가 10~20인 알킬아민을 (A)성분: (B)성분: (C)성분의 몰비 6~9:1~4:1로 함유하는 것을 특징으로 하는 siRNA 송달용 캐리어 조성물.
- 제1항에 있어서,(B)성분이 콜레스테롤인siRNA 송달용 캐리어 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,(A)성분이 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이고, (B)성분이 콜레스테롤이고, 또한 (C)성분이 스테아릴아민인siRNA 송달용 캐리어 조성물.
- 제1항에 있어서,(A)∼(C)성분에 의해 리포솜막이 형성된 리포솜 제제인siRNA 송달용 캐리어 조성물.
- siRNA 및 제1항에 기재된 siRNA 송달용 캐리어 조성물을 함유하는siRNA 송달용 조성물.
- 제5항에 있어서,리포솜 제제인siRNA 송달용 조성물.
- 제5항에 기재된 siRNA 송달용 조성물을 세포에 접촉시킴으로써 siRNA을 세포 내에 도입시키는 공정을 포함하는 siRNA 도입의 시험관내 방법.
- 제7항에 있어서,세포가 배양 세포 또는 생체로부터 분리한 세포인siRNA 도입의 시험관내 방법.
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