KR101433239B1

KR101433239B1 - 수용성 쌀 펩타이드의 제조방법

Info

Publication number: KR101433239B1
Application number: KR1020120001494A
Authority: KR
Inventors: 최혁준; 한복경; 최문실
Original assignee: 주식회사 비케이바이오
Priority date: 2012-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2014-08-25
Also published as: KR20130130113A

Abstract

본 발명은 쌀 가공 부산물인 쌀 시럽박으로부터 수용해성이 뛰어나고 쓴 맛이 저감되며 운동 후 피로 회복 활성이 뛰어난 쌀 펩타이드의 제조방법을 제공함으로써, 쌀 가공 부산물의 고효율 처리방안을 제시하고, 기존에 수입되고 있는 대두 또는 우유 유래 단백질의 유전자변형농산물(GMO)나 알레르기 반응 등의 문제로부터 자유로운 쌀 펩타이드를 제공함과 동시에, 특히 물에 대한 용해도가 뛰어나기 때문에 음료 등에 손쉽게 적용할 수 있는 기능성 식품소재로서 활용성을 제시한다.

Description

수용성 쌀 펩타이드의 제조방법{Preparation method for water soluble rice peptide}

본 발명은 수용성 쌀 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 쌀 시럽박으로부터 수용해성이 뛰어나고 쓴 맛이 저감되며 지구력 운동능력 증대 또는 피로 억제 활성이 뛰어난 쌀 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

통계청 조사 결과 2008년도 국내 쌀 생산량은 2007년에 비해 4.7% 증가하였으나 쌀의 국내소비량은 2007년 1인당 76.9 kg으로 2006년에 비해 2.4% 감소하였다.

쌀의 생산량은 증가하는 반면 소비량은 매년 줄고 있기 때문에 남는 쌀을 이용하여 탁주 등을 만들어 판매하고 있으며, 쌀을 이용한 식용유 및 조청 등의 개발 및 생산이 점차 증가하고 있고 이로부터 막대한 양의 쌀 가공 부산물이 생성되고 있다. 쌀 가공 부산물을 처리하기 위해서는 막대한 비용과 환경문제가 뒤따르게 되므로 현재 대부분 사료용이나 퇴비용으로 쓰이고 있는 실정이다.

따라서 부산물을 재가공하여 새로운 고부가가치 소재와 제품을 개발하여 부산물을 활용할 수 있는 연구가 절실히 필요하다.

쌀 단백질의 경우 대두단백질에 비해 알러지 유발문제에 있어 자유롭고 영양가도 풍부하여 현재 세계적으로 주목을 받고 있다. 현재 널리 사용되어지고 있는 대두유래 소재의 경우 GMO 관련 문제가 있는 반면 쌀의 경우는 GMO의 문제가 없기 때문에 쌀을 이용한 단백질을 더 선호하는 경향으로 바뀌고 있는 추세이다.

미국 Sunrich사를 비롯한 유수의 해외 기업들이 쌀 단백질에 대한 연구를 진행하고 있으나, 현재까지 구체적인 개발 성과가 없고, 쌀을 주산지로 하는 동남아시아를 비롯한 여러 국가에서 부산물을 활용한 연구들이 활발히 진행되고 있으나, 쌀 유래 단백질에 대한 연구는 미국, 파키스탄 등에 국한되어 있으며, 기술적인 한계로 인해 상업화 진행에 한계가 있는 실정이다.

또한 현재 국내 시장 상황을 미루어 볼 때, 시판중인 쌀 단백질 제품의 경우 단백질의 수용화 관련 문제 및 원료 수급 문제 그리고 맛에 있어 문제점을 가지고 있기 때문에 소재 사용에 있어 소비자들의 선호도는 매우 높으나 제품에의 적용에 있어 그 요구에 부흥하고 있지 못하고 있는 실정이다.

한국등록특허 제10-0503100호는 쌀겨로부터 식물성 단백질 분해효소를 이용하여 저분자화된 펩타이드를 제조하는 방법을 설명하고 있으나, 쌀겨의 경우 원료 단백질의 함량이 20 % 미만이고, 셀룰로오스와 결합되어 단백질의 분리가 어렵다는 한계가 있고, 단백질 함량이 낮은 원료로부터 효소처리를 진행할 경우 갈변이나 이미, 이취의 생성 문제를 해결하기 어렵고, 더 나아가 식물성 단백질 분해효소는 그 역가에 비해 고가로서 상업화에 한계가 있다.

일본등록특허 제4663001호는 쌀겨에 수산화나트륨을 처리하여 단백질을 추출하고, 다시 염산으로 처리하여 단백질을 침전시킨 후 물로 세척하는 쌀겨 단백질 추출물의 제조방법을 설명하고 있으나, 불용성 단백질로서 액상의 음료 제품에 활용되기 어렵고, 쌀겨에 포함된 당류가 갈변되어 단백질의 색택을 어둡게 하는 문제가 있었다.

본 발명의 목적은 쌀 시럽박으로부터 수용해성이 뛰어나고 쓴 맛이 저감되며 운동 후 피로 회복 활성이 뛰어난 쌀 펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 쌀 시럽박과 알파-아밀라아제를 반응시키는 알파-아밀라아제 처리단계; 상기 알파-아밀라아제로 처리된 쌀 시럽박을 세척하는 수용성 물질을 제거단계; 및 상기 세척된 쌀 시럽박과 단백분해효소를 반응시키는 단백분해효소 처리단계;를 포함하는 쌀 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 알파-아밀라아제는 터마밀(Temamyl)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법은, 상기 터마밀(Termamyl)을 80 내지 100 ℃에서 반응시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 수용성 물질 제거단계는 상기 알파-아밀라아제 처리된 쌀 시럽박을 탈수시키고, 그 탈수된 쌀 시럽 고형물 함량의 2 내지 30 배의 물을 혼합한 후, 여과하는 과정을 1 내지 5 회 반복하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 단백분해효소는 알칼라아제 또는 뉴트라아제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 단백분해효소로 분해하는 단계는 0.01 내지 1 중량%의 단백분해효소를 첨가하여 50 내지 70 ℃에서 0.5 내지 3 시간 반응시키고, 반응 초기 pH 8 내지 9로 조정하고, pH가 7 내지 7.5에서 반응을 완료시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 단백분해효소 처리단계 이후에 한외여과를 통해 분자량 1000 Da 이하의 펩타이드를 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 쌀 펩타이드의 분자량은 300 내지 700 Da의 펩타이드가 전체 펩타이드의 80 중량% 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 쌀 펩타이드의 아미노태질소의 함량은 10 내지 1000 mg%인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 쌀 펩타이드의 글루타민산 함량은 전체 아미노산 중의 15 내지 25 중량%이고, 분지아미노산 함량은 전체 아미노산 중의 12 내지 20 중량%인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 쌀 펩타이드의 pH 4.6 내지 pH 12에서의 수용해성은 90 % 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 쌀 시럽박과 터마밀(Termamyl)을 80 내지 100 ℃에서 반응시키는 알파-아밀라아제 처리단계; 상기 알파-아밀라아제로 처리된 쌀 시럽박을 탈수시키고, 그 탈수된 쌀 시럽 고형물 함량의 2 내지 30 배의 물을 혼합한 후, 여과하는 과정을 1 내지 5 회 반복하는 수용성 물질 제거단계; 및 상기 세척된 쌀 시럽박을 0.01 내지 1 중량%의 알칼라아제 또는 뉴트라아제를 첨가하여 50 내지 70 ℃에서 0.5 내지 3 시간 반응시키는 단백분해효소 처리단계;를 포함하고, 상기 쌀 펩타이드의 분자량은 300 내지 700 Da의 펩타이드가 전체 펩타이드의 80 중량% 이상이고, 상기 쌀 펩타이드의 아미노태질소의 함량은 10 내지 1000 mg%이며, 상기 쌀 펩타이드의 글루타민산 함량은 전체 아미노산 중의 15 내지 25 중량%이고, 분지아미노산 함량은 전체 아미노산 중의 12 내지 20 중량%이고, 상기 쌀 펩타이드의 pH 4.6 내지 pH 12에서의 수용해성은 90 % 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 쌀 펩타이드 제조방법에서, 상기 쌀 펩타이드는 운동 후 피로 회복 활성을 가진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 운동 후 피로 회복 활성을 가지는 수용성 쌀 펩타이드는 아스파르트산 9 내지 12 중량부, 트레오닌 3 내지 5 중량부, 세린 5 내지 7 중량부, 글루타민산 19 내지 22 중량부, 프롤린 3 내지 5 중량부, 글리신 4 내지 6 중량부, 알라닌 5 내지 7 중량부, 발린 5 내지 7 중량부, 메치오닌 1 내지 3 중량부, 이소로이신 3 내지 5 중량부, 로이신 7 내지 9 중량부, 티로신 4 내지 6 중량부, 페닐알라닌 5 내지 7 중량부, 라이신 2 내지 4 중량부, 히스티딘 1 내지 3 중량부 및 아르기닌 7 내지 10 중량부로 이루어진 아미노산 조성을 가지는 것을 특징으로 한다.

도 1은 실험예 8에서 실시예의 수용성 쌀 펩타이드를 분자량 분획별로 확인한 MS 크로마토그램이다.
도 2는 실험예 8에서 실시예의 수용성 쌀 펩타이드의 분자량 300 내지 1000 Da 부분의 매스 스팩트럼이다.
도 3은 실험예 9에서 실시예의 수용성 쌀 펩타이드의 pH에 따른 수용해성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 9에서 실시예의 수용성 쌀 펩타이드의 가열온도 및 시간에 따른 수용해성을 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 쌀 펩타이드는 시럽박으로부터 제조되는 것이 바람직하다. 쌀 가공 부산물로는 술을 제조하고 남은 주박, 예를 들어 막걸리를 제조하고 남은 탁주박, 쌀을 도정하고 남은 미강, 또는 이로부터 미강유를 얻고 남은 탈지미강도 이용될 수 있으나, 부산물 상태에서 단백질 함량이 40 중량% 이상인 쌀 시럽박이 바람직하다. 쌀 시럽박은 쌀 시럽박은 물엿 생산공정의 부산물로서, 시럽박 그 자체를 원료로 쌀 펩타이드를 제조할 수 있고 또는 원료의 저장성을 높이기 위하여 수분 함량 10 중량% 이하로 60 내지 70 ℃에서 열풍건조한 뒤 분쇄하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 먼저 원료인 쌀 시럽박과 알파-아밀라아제를 반응시키는 알파-아밀라아제 처리를 수행한다.

본 발명에서 쌀 펩타이드 제조를 위하여 쌀 시럽박을 바로 단백분해효소와 반응시킬 경우 쌀 시럽박에 남아있는 전분이나 그 분해물에 의해 갈변이 발생하고 불용성 침전물을 형성시킬 수 있고, 단백질 함량 80 중량% 이상의 고순도 제품을 생산할 수 없다.

본 발명에서 알파-아밀라아제로는 노보자임(novozyme)사의 터마밀(Termamyl)이 바람직하다. 터마밀의 경우 단시간 내에 전분 분해능력이 뛰어나고, 최적 반응 온도가 93 ℃로서, 80 내지 100 ℃에서 반응을 통해 전분 분해와 동시에 원료의 살균을 진행할 수 있다.

다음으로 본 발명에서는 쌀 시럽박과 알파-아밀라아제를 반응시키는 알파-아밀라아제 처리를 수행한 후, 알파-아밀라아제로 처리된 쌀 시럽박을 세척하여 수용성 물질을 제거단계를 수행한다.

알파-아밀라아제로 처리된 쌀 시럽박에는 쌀 시럽박 고형분, 효소분해된 수용성 탄수화물(주로 단당류, 이당류 또는 올리고당류 등), 및 효소가 혼합된 액상의 반응액으로서, 이를 원심분리기, 필터프레스, 디칸터(decanter) 등을 이용하여 탈수시킨다.

그러나 효소 반응액을 탈수처리하는 것만으로는 수용성 탄수화물이 충분히 제거될 수 없으므로, 상기 알파-아밀라아제 처리된 쌀 시럽박을 탈수시키고, 그 탈수된 쌀 시럽 고형물 함량의 2 내지 30 배, 바람직하게는 5 내지 15 배의 물을 혼합하여 충분히 교반시킨 후 탈수하는 과정을 1 내지 5 회 바람직하게는 3회 이상 반복함으로써 수용성 탄수화물이 제거되고 단백질 함량이 증가하게 된다.

다음으로 본 발명에서는 수용성 물질을 제거하기 위해 세척한 쌀 시럽박과 단백분해효소를 반응시키는 단백분해효소 처리단계를 수행한다.

본 발명의 단백분해효소로는 노보자임(novozyme)사의 알칼라아제(Alcalase) 또는 뉴트라아제(Neutrase)가 바람직하다. 상기 단백분해효소는 쌀 시럽박의 단백질을 분해함에 있어서, 아미노산 단위 또는 짧은 잔기의 펩타이드로 분해하지 않으면서도 쌀단백을 분자량 1000 Da 이하, 바람직하게는 300 내지 700 Da사이가 전체 펩타이드의 80 중량% 이상, 바람직하게는 90 중량% 이상이 되도록 충분히 분해하기 때문에, 쓴 맛이나 이미가 낮은 수용성 쌀 펩타이드의 생산이 가능하게 한다. 상기 단백분해효소로 처리할 경우 아미노태 질소 함량이 1000 mg% 이하, 바람직하게는 200 내지 800 mg%가 되고, 별도의 한외여과를 통한 아미노산 또는 짧은 잔기의 펩타이드의 제거 없이도 충분히 쓴 맛이 낮고 기호성이 높은 펩타이드를 제조할 수 있다.

본 발명에서 상기 단백분해효소로 분해하는 단계는 0.01 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량%의 단백분해효소를 첨가하여 50 내지 70 ℃에서 0.5 내지 3 시간 반응시킨다.

단백질분해효소의 첨가량은 농도가 상기 하한치 미만에서는 단백질 분해효율이 충분치 않아 쌀 시럽박 사용량 대비 수용성 쌀 펩타이드의 생산량이 충분치 않고, 0.1 중량%까지는 단백질 분해효율이 증가하다가 그 이상이 첨가되더라도 단백질 분해효율이 더 이상 증가하지 않는다.

또한 단백분해효소의 첨가에 따른 반응시간은 반응시간이 길어질수록 단백질 분해율은 상승하지만, 3 시간째 이후의 분해율의 증가가 확연하지 않고, 오히려 3 시간을 초과할 경우 pH가 급락하면서 변패취가 심해진다.

또한 단백분해효소에 의한 효소분해반응 초기 pH 8 내지 9로 조정하고, pH가 7 내지 7.5에서 반응을 완료시킬 경우, 변패취의 발생 우려가 적고, 반응 종료 후 별도의 중화과정이 필요치 않아, 수용성 쌀 펩타이드에 염 함량이 높아지는 것을 방지할 수 있다.

다음으로 본 발명에서는 단백분해효소 처리단계를 수행하고, 효소 반응액에서 수용성 쌀 펩타이드를 얻기위해 효소 반응액을 먼저 75 ℃ 이상, 바람직하게는 85 내지 100 ℃에서 10분 내지 1 시간, 바람직하게는 15 내지 30분 가열하여 효소를 실활시킨 후, 효소 반응액에서 원심분리 또는 필터프레스를 이용해 고형물을 제거하고 액상부분을 농축 및 건조하여 수용성 쌀 펩타이드를 제조한다.

본 발명의 수용성 쌀 펩타이드는 본 발명의 조건에서 단백분해효소로 처리시 펩타이드의 대부분, 예를 들어 70 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량%이상이 분자량 1000 Da 이하의 펩타이드이다. 다만, 본 발명에서는 분자량 1000 Da을 초과하는 펩타이드를 제거하고, 원하는 분자량 범위의 펩타이드의 농도를 더욱 높이기 위해 효소 반응액의 액상부분을 추가로 한외여과막을 투과시켜 분자량 1000 Da 이하의 부분을 농축할 수 있다.

본 발명의 수용성 쌀 펩타이드의 분자량은 300 내지 700 Da의 펩타이드가 전체 펩타이드의 80 중량% 이상이고, 바람직하게는 90 중량% 이상이며, 더욱 바람직하게는 95 중량% 이상이다.

본 발명의 수용성 쌀 펩타이드의 쌀 펩타이드의 아미노태질소의 함량은 10 내지 1000 mg%, 바람직하게는 800 mg% 이하, 더욱 바람직하게는 700 mg% 이하이다. 아미노태질소의 함량은 쓴 맛과 이취의 원인이 되는 아미노산 또는 짧은 잔기의 펩타이드가 적게 포함되는 것으로 낮을수록 유리하지만, 통상 본 발명의 펩타이드에서는 400 내지 700 mg% 정도 이다.

본 발명의 수용성 쌀 펩타이드의 글루타민산 함량은 전체 아미노산 중의 15 내지 25 중량%이고, 분지아미노산 함량은 전체 아미노산 중의 12 내지 20 중량%로서 글루타치온의 원재료 및 운동능력 향상에 도움이 되는 것으로 알려진 분지아미노산의 함량이 높다.

또한 본 발명의 수용성 쌀 펩타이드는 바람직하게는 아스파르트산 9 내지 12 중량부, 트레오닌 3 내지 5 중량부, 세린 5 내지 7 중량부, 글루타민산 19 내지 22 중량부, 프롤린 3 내지 5 중량부, 글리신 4 내지 6 중량부, 알라닌 5 내지 7 중량부, 발린 5 내지 7 중량부, 메치오닌 1 내지 3 중량부, 이소로이신 3 내지 5 중량부, 로이신 7 내지 9 중량부, 티로신 4 내지 6 중량부, 페닐알라닌 5 내지 7 중량부, 라이신 2 내지 4 중량부, 히스티딘 1 내지 3 중량부 및 아르기닌 7 내지 10 중량부로 이루어진 아미노산 조성을 가진다.

또한 본 발명의 수용성 쌀 펩타이드는 pH 4.6 내지 pH 12에서의 수용해성은 90 % 이상, 바람직하게는 95 % 이상으로서, 특히 종래 시판되는 쌀 단백과 달리 산성영역인 pH 4.6에서도 매우 높은 수용성인 것으로, 산성 음료에도 쉽게 적용될 수 있다.

또한 본 발명의 수용성 쌀 펩타이드는 경구섭취시 혈중 글루코오스 농도를 증대시키고 및 혈장 암모니아 농도를 저감시켜 지구력 운동능력 증대 또는 운동 후피로 억제 활성을 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 쌀 가공 부산물의 일반성분 분석

쌀 가공 부산물로서 청주박, 탁주박, 탈지미강 및 쌀 시럽박을 사용하였다. 청주박, 탁주박 및 쌀 시럽박은 건조 후 사용하였다.

다만, 상대적으로 수분 함량이 많은 청주박(수분 함량 91.56 중량%)의 경우 열풍건조를 할 경우 심한 악취와 함께 곰팡이가 피어 사용할 수 없는 상태가 되어 시료를 분석할 수 없었고, 탁주박(수분 함량 69.68 중량%)는 60 ℃ 이상의 온도로 열풍건조할 경우 탄화로 인하여 시료의 사용이 불가능하여, 50 ℃에서 72시간 건조한 것을 사용하였다.

탁주박은 탁주 생산 공장에서, 탈지미강은 미강유 제조사에서, 쌀시럽박은 물엿 제조사에서 시료를 얻었으며, 일반 성분은 단백질, 지방, 회분, 수분 및 탄수화물로 나뉘어 분석하였으며, 각각의 성분 분석은 A.O.A.C방법에 따라 Kjeldahl Nitrogen Analysis(조단백), Soxhlet method(조지방), Dry ashing(조회분), Air oven method(수분)으로 분석하였다. 탄수화물의 경우 단백질, 지방, 회분 그리고 수분을 제외한 나머지 분획으로 계산하였다.

구분	쌀	탁주박	탈지미강	쌀 시럽박
조단백 (중량%)	6.12-8.67	25.3±0.6	18.7±0.1	45.1±0.9
조지방 (중량%)	0.35-0.45	4.3±0.0	4.3±0.0	8.1±0.2
조회분 (중량%)	0.59-0.63	0.4±0.0	11.2±0.2	0.8±0.0
수분 (중량%)	13.22-14.23	6.4±0.2	7.2±0.3	6.3±0.3
탄수화물 (중량%)	76.6-79.12	63.6±0.4	58.6±0.3	36.7±0.1

탁주박의 경우 효모에 의한 분해로 탄수화물 분획이 감소한 것을 알 수 있고, 탈지미강의 경우 회분 분획이 온전한 쌀에 비해 증가한 것으로 나타났다. 또한, 쌀 시럽박의 경우 탄수화물 당화 효소반응으로 인해 탄수화물 분획이 현저히 적어진 것으로 나타났다.

실험예 2: 효소별 최적 반응시간 확인

쌀 시럽박에 잔존하는 탄수화물을 추가적으로 분해하기 위하여 전분, 셀룰로오스, 훌루란 등의 탄수화물 분해효소를 대상으로 최적 반응시간을 확인하였다. 실험에 사용한 6 종의 효소의 성상, 조성, 활성, 밀도, 최적 pH 및 최적 온도를 정리하여 표 2에 나타내었다.

구분	성상	구성효소	최소활성	밀도	최적 pH	최적 온도 (℃)
Celluclast	Brown liquid	cellulase	700 EGU/g	1.22 g/mL	4.5-6.0 (4.5)	50-60 (60)
Fungamyl 800L	brown liquid	α-amylase	800 FAU/g	1.25 g/ml	5 (5)	55-60 (60)
Liquozyme supra	amber liquid	α-amylase	135 KNU/g	1.26 g/ml	5.5~7.0 (6.5)	50 (50)
Promozyme D2	brown liquid	pullulanse	400 PUN/ml	1.25g/ml	5 (5)	60 (60)
Termamyl type L	brown liquid	α-amylase	120 KNU/g	1.20~1.25 g/ml	6.5 (6.5)	93 (90)
Viscozyme L	brown liquid	β-glucanase arabanase, cellulase, hemicellulase, xylanase	120 FBG/ml	1.2 g/ml	4.6 (4.6)	44 (44)

각 효소에 의한 최적 반응 시간을 확립하기 위해 쌀 시럽박 시료 5g에 증류수(28.3 mL)를 첨가하여 15% 현탁액 형태로 제조하고, 각 효소의 최적 pH와 최적 온도에 맞게 환경을 조절한 후, 효소별로 각각 1.5, 3, 4,5, 6, 7.5, 9, 10.5, 12, 24시간을 반응시켰다. 그 후 그 무게손실 양을 이용하여 효소별 최적 반응시간을 결정하였고 이를 표 3에 나타내었다.

구분	Celluclast	Fungamyl 800L	Liquozyme supra	Promozyme D2	Termamyl type L	Viscozyme L
최적 반응시간(hrs)	24	9	4.5	9	1.5	24

알파-아밀라아제 중에서는 터마밀의 경우가 최적 반응시간이 가장 짧게 나타났기 때문에 쌀 시럽박의 전분분해를 위한 효소로 선정하였다. 또한 터마밀과 함께 사용했을 때 상승효과가 기대되는 셀룰로오스 분해효소로서 셀루클라스트(Celluclast)와 복합효소인 비스코자임(Viscozyme)을 선택하여 이들 각각 및 복합 사용에 따른 탄수화물 분해 효과를 확인하였다.

실험예 3: 알파-아밀라아제 처리에 따른 탄수화물 분해 확인

탄수화물 분해량(Weight loss)는 효소 반응전과 후의 침전물의 무게 차이를 이용해 탄수화물 분획의 수용화로 인한 분해량으로 계산하여 표 4에 나타내었다. 효소의 첨가량은 쌀 시럽박 고형분 함량의 1 중량%로 하였고, 단일 효소처리의 경우 표 2에 기재된 사용하는 효소의 최적 pH 및 온도에서 각각 터마밀1.5 시간, 비스코자임 24 시간, 셀룰크라스트 24 시간 반응을 수행하였고, 복합 효소처리의 경우 최적 온도가 높은 순서에서 낮은 온도로 순차적으로 효소처리를 수행하였다. 상기 반응이 끝난 반응액은 20분간 원심분리(3000g)를 하고 이때 얻어진 침전물의 무게와 침전물을 분석하여 단백질 함량의 변화를 비교분석하였다.

구분	탄수화물 분해량 ( mg /g)	조단백 (중량%)
쌀시럽박	^-	43.06
Termamyl	85.69±0.60 ^A	70.68
Viscozyme	61.74±7.12 ^C	74.01
Celluclast	68.43±5.13 ^BC	75.00
T+V	68.03±1.54 ^BC	73.69
V+C	64.03±2.40 ^BC	74.62
T+C	69.70±0.90 ^BC	72.40
T+V+C	72.04±4.75 ^B	72.11

상기 표 4에서 T는 Termamyl, V는 Viscozyme, C는 Celluclast의 약자이다.

단일효소로 무게변화에 가장 큰 영향을 주는 것은 termamyl (85.69 mg/g)인 것으로 나타났다. 이는 세가지 효소를 모두 처리했을 경우(72.04 mg/g) 보다 무게 변화가 더 큰 것이다. 또한 시럽박의 단백질 함량이 43.06 중량%에서 터마밀의 처리로 70 중량% 이상으로 증가하였다.

또한 터마밀의 처리를 통해 탄수화물 중에서 전분이 분해되어 중량 감소가 나타나면서 단백질 함량이 상대적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

한편 비스코자임이나 셀룰크라스트의 경우 탄수화물 분해량은 터마밀에 비해 낮았으나, 조단백 함량은 증대될 수 있음을 확인하였다. 그러나 효소처리를 위한 반응시간의 증가 폭에 비해서 조단백의 함량 증가가 미미하다는 점에서 터마밀 단독 처리가 가장 바람직한 것으로 판단하여 이후 실험에 사용하였다.

실험예 4: 알파-아밀라아제 처리 후 세척 회수에 따른 단백질 함량 변화 확인

쌀 시럽박 고형분에 대하여 터마밀 0.1 중량%를 첨가하여 90 ℃에서 1.5시간 반응시킨 후, 상등액을 제거하고 horizontal decanter를 통해 탈수해서 얻은 고형물(제조예4-1), 상기 시료 1의 고형물에 고형물 양의 10배의 물을 첨가하고 20 분 교반하면서 혼합한 후 다시 탈수시킨 고형물(제조예4-2: 세척 1회), 시료 2에 다시 10 배의 물을 첨가하고 20분 교반하면서 혼합한 후 다시 탈수시킨 고형물(제조예 4-3: 세척 2회) 및 이러한 세척을 3 회 실시한 제조예4-4, 세척을 4 회 실시한 제조예4-5, 세척을 5 회 실시한 제조예4-6을 각각 제조하여 단백질 함량의 증가 여부를 확인하여 표 5에 나타내었다.

구분	제조예4-1	제조예4-2	제조예4-3	제조예4-4	제조예4-5	제조예4-6
조단백 (중량%)	67.6	72.69	74.14	78.01	78.45	78.61

효소 반응 후 탈수시킨 고형물의 단백질 함량은 67.6 중량%로서 이를 세척하여 수용성 물질을 제거할 때 마다 단백질 함량이 증가되어 3 회 세척시 78.01 중량%로서 단백질 함량이 약 10 중량% 증가하였다. 그러나 4 회 이상 세척하더라도 더 이상의 단백질 함량 증가는 확인할 수 없었다.

실험예 5: 단백분해효소에 따른 단백질 분해율 및 쓴 맛 확인

쌀 시럽박의 단백질 분해에 적합한 단백분해효소를 확인하기 위하여 다음 표 6의 단백분해효소를 이용한 단백질 분해율을 확인하였다.

구분	제조사	최적pH	최적온도(℃)
Protamex	novozyme	5.5-7.5 (7)	35-60 (40)
Neutrase	novozyme	5.5-7.5 (7)	45-55 (45)
Flavourzyme	novozyme	5-7 (7)	50 (50)
Alcalase	novozyme	6.5-8.5 (7)	60 (60)
Protease M	amano	4.5 (4.5)	50 (50)
Protease N	amano	7 (7)	55 (55)
Protease A	amano	7 (7)	50 (50)
Protease F	kikoman	3 (3)	50 (50)

상기 실험예 4의 제조예4-4의 세척된 쌀 시럽박 5g에 증류수(28.3 ml)를 첨가하여 15% 현탁액 형태로 제조하고, 1 N HCl 혹은 1 N NaOH를 사용하여 기존에 알려진 효소들의 최적 pH를 조절하고, 최적 온도에서 시료의 고형분 대비 0.1%의 효소를 첨가한 후 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 현탁액을 20분간 원심분리(3000g)를 하고 이때 얻어진 각각의 상등액에 대한 단백질 함량을 상대적으로 비교하여 표 7에 나타내었다.

구분	단백질 (%)
Protamex	75.43±1.81
Flavourzyme	78.60±0.56
Neutrase	32.73±1.75
Alcalase	82.46±1.24
Protease M	83.32±0.33
Protease N	86.43±2.12
Protease A	62.73±0.35
Protease F	58.07±0.56

상기 반응에서 얻어진 수용성 쌀 펩타이드를 함유한 원심분리 상등액을 시료로 훈련받은 관능검사 패널 17명을 대상으로 9점 평점법을 이용하여 쓴 맛과 기호도에 대하여 관능검사를 실시하였고, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

구분	쓴 맛	기호도
Protamex	7.2±0.5	2.4±0.6
Flavourzyme	5.7±0.4	3.4±0.5
Neutrase	4.1±0.2	4.2±0.3
Alcalase	3.6±0.4	5.5±0.5
Protease M	7.7±0.4	1.9±0.3
Protease N	8.0±0.4	1.3±0.2
Protease A	7.4±0.4	2.3±0.3
Protease F	4.4±0.4	5.1±0.5

상기 결과로부터 쌀 시럽박으로부터 수용성 쌀 펩타이드를 제조할 때 뉴트라아제 또는 알칼라아제를 사용하는 것이 기호성이 높은 쌀 펩타이드를 생산할 수 있고, 특히 알칼라아제를 사용할 경우 기호성은 물론 수용성 쌀 펩타이드 생성 수율은 높게 됨을 확인하였다.

실험예 6: 단백분해효소의 반응조건

실험예 5에서 선택된 단백분해효소 중 알카라아제의 반응시간에 따른 단백질 분해율, pH 및 관능특성과, 단백분해효소의 첨가량에 따른 효소 분해물의 단백질 함량을 분석하였다.

알카라아제의 최적 반응시간을 결정하기 위해, 상기 실험예 4의 제조예4-4의 세척된 쌀 시럽박 5g에 증류수(28.3 ml)를 첨가하여 15% 현탁액 형태로 제조하고, 1 N HCl 혹은 1 N NaOH를 사용하여 최적 pH인 7로 조절하고, 최적 온도 60 ℃에서 시료의 고형분 대비 1%의 효소를 첨가한 후, 1, 2, 3, 5 및 24 시간에 따른 효소 분해물의 단백질 함량 및 pH를 측정하였고, 변패취의 강도는 관능검사 패널 17명을 대상으로 9점 평점법을 이용하여 관능검사를 실시하여 표 9에 나타내었다.

반응시간 (h)	단백질 (%)	pH	변패취의 강도
1	71.5	6.5	2.4
2	77.3	6.3	2.6
3	81.5	6.1	2.7
5	85.2	5.4	4.2
24	90.3	4.5	5.8

반응 시간에 따라 점차 단백질 분해율이 증가되는 현상을 보였다. 그러나 3시간 이후 pH가 급격히 저하되면서 변패취가 발생하기 시작하여 품질상 문제가 있다고 판단하여 최적 반응시간을 3시간으로 결정하였다.

알카라아제의 최적 효소 첨가량을 결정하기 위하여, 상기 실험예 4의 제조예4-4의 세척된 쌀 시럽박을 기질로 기질 대비 0.005, 0.01, 0.2, 1 중량%로 정하여 실시하였고, 반응시간은 3시간으로 고정한 후, 단백질을 lowry 법으로 정량하였다.

효소 첨가량(중량%)	0.005	0.01	0.1	0.5	1
단백질 (%)	42.5	71.2	82.2	83.4	83.5

단백분해효소 함량이 0.01 중량% 이상일 경우 쌀 시럽박을 분해하기에 충분하였고, 0.1 중량%까지는 효소량의 증가량에 따라 단백질 분해율이 증가하였으나, 그 이상에서는 단백질 분해율이 더 이상 증가하지 않았다.

실시예:

건조고형물 중 조단백 45 중량%이고, 수분 함량 52 중량%인 쌀 시럽박에 0.1 중량%의 터마밀 에스씨(Termamyl SC)를 첨가하고 90 ℃에서 1.5 시간 반응시켰다. 반응 상등액을 제거하고 horizontal decanter를 통해 탈수해서 얻은 고형물에 고형물 양의 10배의 물을 첨가하고 20 분 교반하면서 혼합한 후 다시 탈수시키는 세척 과정을 3회 반복하여 얻은 탈수된 고형물에, 고형물 양의 10 배의 물을 혼합하고 pH 8.5로 조절한 후 고형물 양 대비 알칼라아제 0.1 중량%를 첨가하고 60 ℃에서 3시간 반응시켰다. 효소 반응액의 최종 pH는 7.2 이었고, 이를 85 ℃에서 15분 가열하여 효소를 불활성화시킨 후, 불활성화시킨 효소 반응액을 horizontal decanter를 통해 탈수시켜 얻은 액상부분을 먼저 20 중량%로 농축한 후 60 ℃에서 12 시간 열풍건조하고, 이를 분쇄하여 수용성 쌀 펩타이드 분말을 제조하였다.

실험예 7: 수용성 쌀 펩타이드 분말의 일반성분 및 아미노산 조성

상기 실시예의 수용성 쌀 펩타이드 분말의 조단백, 조지방, 조회분 및 탄수화물 함량을 실험예 1과 동일한 방법으로 분석하였다.

구분	수용성 쌀 펩타이드 분말
조단백 (중량%)	82.1
조지방 (중량%)	2.2
조회분 (중량%)	3.1
수분 (중량%)	6.4
탄수화물 (중량%)	6.2

수용성 쌀 펩타이드의 구성 아미노산 16종에 대한 정량시험을 진행하였다. 분석은 ninhydrin HPLC 분석을 통해 이루어 졌으며 결과는 표 12에 나타내었다.

구성아미노산	현미 (한국농화학학회지 1977)	수용성 쌀 펩타이드 (%)
Aspartic acid	9.5	10.45
Threonine	3.9	3.41
Serine	5.2	5.72
Glutamic acid	19.4	21.64
Proline	4.6	4.34
Glycine	4.7	5.10
Alanine	6.5	5.91
Valine	6.2	5.71
Methionine	2.1	1.86
Isoleucine	4.0	3.68
Leucine	8.5	7.59
Tyrosine	4.4	4.98
Phenylalanine	5.7	5.73
Lysine	3.6	2.90
Histidine	2.5	2.38
Arginine	9.3	8.60
total	100.1	100
*BCAA	18.7	16.98

쌀 펩타이드의 구성 아미노산은 그 출발물질인 쌀과 거의 동일하였으며, 글루타민산의 함량이 약 20%의 높은 비율로 함유되어 있음이 확인되었다. 또한 운동능력 증진 및 피로 회복 등에 관한 효과가 보고되어지고 있는 BCAA(Branched Chain Amino Acid)의 함량이 16.98 % 의 높은 비율로 함유하고 있음 또한 확인되었다.

실험예 8: 수용성 쌀 펩타이드 분말의 분자량 분포 및 아미노태 질소 함량

상기 실시예의 수용성 쌀 펩타이드의 분자량 분포를 확인하기 위하여 HR-MS 분석을 실시하였다. 시료의 농도는 2 mg/mL로 하였고, 용매는 증류수와 아세토니트릴, 시약은 포름산을 하였으며, 실험방법 및 기기 조건은 각각 표 13 및 표 14에 나타내었다.

1	Chromatography	Thermo Accela UPLC
2	Mass spectrometry	Thermo LTQ-Orbitrap XL
3	Colum	ACQUITY BEH130C18, 1.7um, 100*2.1mm
4	Solvent	A: DW(0.1% Formic acid)
4	Solvent	B: Acetonitrile(0.1% Formic acid)
5	Elution condition	Time	A	B
		0.0	99	1
		3.0	99	1
		53.0	50	50
		53.5	0	100
		56.0	0	100
		56.5	99	1
		60.0	99	1
6	Flow rate	0.3 ml/min
7	Injection	3 ㎕

1	Detection ion mode	Positive ion ((M+H]+)
2	Scan range	MS: m/z 300~1600
3	Spray voltage	4.5 kV
4	Capillary voltage	35 V
5	Capillary Temp	300
6	CID energy	35
7	Software	Xcalibur

상기 조건으로 분자량 분획별로 확인한 MS 크로마토그램을 도 1에 나타내었다. 도 1에 따르면 대부분 분자량 1000 Da 이하를 나타내고 있으며 그 중에서도 300 내지 700 Da 정도의 분자량이 95 % 이상임을 확인할 수 있었다.

또한 분자량 300 내지 1000 Da 부분의 매스 스팩트럼을 도 2에 나타내었다.

또한 실시예의 수용성 쌀 펩타이드가 아미노산으로 분해된 정도를 확인하기 위하여 아미노태 질소 함량을 측정하였다. Formol 적정법에 따라 용출액 2 ml를 100 ml measuring flask에 취하고 증류수로 100ml에 맞추어 교반하였다. 희석된 용출액 25 ml를 100 ml 비이커에 취하여 0.1N NaOH를 첨가하여 pH meter로 pH 8.4가 되도록 하였다. 여기에 35% formaldehyde solution(v/v)(Samchun Pure Chemical) 20 ml를 가한 다음, 다시 0.1 N NaOH로 pH 8.4까지 중화 적정하였다. 아미노태 질소값은 "[(A-B)x1.4xFxDx100]/S"로 계산하였다. A는 0.1 N NaOH의 소비 ml, B는0.1 N NaOH의 공실험 소비 ml, F는 0.1 N NaOH의 factor 값, D는 희석배수, S는 시료 채취량(g)이고, "1.4"는 0.1N NaOH 1ml에 상당하는 질소량(mg)이다.

실시예의 수용성 쌀 펩타이드의 아미노태질소 함량은 600 mg%로, 아미노산 단위로의 분해 정도가 크지 않음을 확인 할 수 있었다.

실험예 9: 수용성 쌀 펩타이드 분말의 pH, 열 및 저장에 따른 용해성의 변화

실시예의 수용성 쌀 펩타이드 분말의 pH에 따른 안정성을 확인하기 위하여 각 pH에서 수용액의 단백질 함량을 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 일반적으로 단백질의 경우 pH 4 부근에서 등전점을 가지며 침전되는 현상을 나타내며, 대표적인 우유 단백질인 알부민의 경우 pH 4.6에서 등전점을 나타낸다. 수용성 쌀 펩타이드의 경우 pH 5 내지 12 범위의 수용액에서 매우 안정적이었으며, pH 4.8에서부터 점차 침전 현상이 그리고 pH 4.2에서 최대 침전도를 보였다. pH 4.6 이상에서는 95 % 이상의 수용성을 나타냄을 확인하였다.

또한 열안정성을 확인하기 위하여 수용성 쌀 펩타이드 분말을 증류수로 100배 희석한 뒤 15ml test tube에 10ml 씩 분주한 다음 60, 80, 100, 120 ℃의 온도에서 각각 0.5h 및 1h 처리하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과 80 ℃, 1h 처리 조건에서부터 단백질의 감소가 점차 시작되었으며, 100 1h에서 약 2%의 손실이 그리고 120 1h에서 약 6%의 단백질 손실이 관찰되었다. 따라서 실시예의 수용성 쌀 펩타이드 분말은 열에 비교적 안정한 물질임을 확인할 수 있었고 특히 통상의 일반적인 음료 제조 공정에서의 살균 및 공정 온도에서도 안정할 수 있음이 확인되었다.

수용성 쌀 펩타이드의 음료에의 가공 적성을 시험해 보기 위하여 물에 3 중량%로 용해하여 수용액을 제조한 뒤 100 ℃에서 15분간 살균하고, 저장 기간에 따른 단백질 함량 변화를 시험해 보았다. 또한 저장기간에 따른 위생 안정성을 확인해 보기 위하여 살균 후 저장 기간에 따른 미생물 시험도 동시에 진행하였다. 시험결과 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12 주간 단백질 함량에 유의적인 변화는 없었으며, 살균 후 12주 이후까지 일반세균 및 대장균, 대장균군 모두 불검출로 판정되어 12주간 멸균상태가 유지되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 10: 수용성 쌀 펩타이드 분말의 운동 후 피로 회복 활성

운동을 지속적으로 실시하게 되면 근육의 글리코겐 함량이 감소하면서 혈중 글루코오스가 근육으로 유입되는 양이 증가하는데, 이로 인해 혈중 글루코오스가 감소하고, 이로 인해 피로감을 느끼게 된다.

또한 아스파르트산(aspartic acid)은 근육 내에서 purine nucleotide 회로의 주요 구성 성분으로서 극심한 고강도 운동 중에 ATP 풀을 재생시켜 근육에 에너지를 제공하고, 이 과정에서 유리 암모니아를 형성하게 된다. 운동 시 아미노산의 분해 결과 생성된 암모니아는 근육으로부터 혈액으로 방출되고, 혈중 암모니아는 뇌에 전달되어 중추피로를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 한편 근육세포 내에 축적된 암모니아는 근육의 통증감지와 관련이 있는 구심성 신경을 자극하고, TCA cycle 및 당신생 작용을 저해하며, 젖산 생성을 초래함으로써 근육의 피로를 유발하게 된다.

따라서 본 발명의 수용성 쌀 펩타이드가 운동 후 피로 회복 활성에 영향을 줄 수 있는지를 확인하기 위하여 랫트에 4주간 경구 투여한 후, 혈중 글루코오스와 혈장 암모니아 농도의 변화를 확인하였다.

실험은 국내 비임상 분야 민간 시험기관으로 GLP(Good Laboratory Practice) 인증기관인 (주)켐온에서 진행되었으며 랫트의 혈액 분석은 (의)녹십자의료재단을 통하여 진행하였다. 본 발명의 수용성 쌀 펩타이드는 저용량, 중간 용량 및 고용량으로 각각 투여하였고, 비교군으로 분리대두단백을 중간 용량으로 투여하였으며, 음성 대조군은 증류수만을 투여하였다. 각각의 투여량은 저용량군의 경우 단백질 함량을 기준으로 67 mg/kg/day이고, 중간 용량은 335 mg/kg/day, 고용량은 670 mg/kg/day이었다.

4주간 투여로 사망 동물은 관찰되지 않았고, 모든 투여군에서 대조군에 비하여 유의적인 체중변화는 관찰되지 않았다.

각 실험군의 4주 후 혈중 글루코오스 농도를 표 15에 나타내었다.

구분	평균( mg/ ㎗)	표준편차
대조군	70.80	11.81
실시예(저용량)	88.00	12.30
실시예(중간 용량)	91.71	12.15
실시예(고용량)	98.80	10.52
분리대두단백(중간용량)	87.37	11.60

실시예의 수용성 쌀 펩타이드의 투여량이 증가할수록 혈중 글루코오스의 농도가 점차 증가함을 알 수 있었다.

각 실험군의 4주 후 혈장 암모니아 농도를 표 16에 나타내었다.

구분	평균(㎍/㎗)	표준편차
대조군	753.57	199.33
실시예(저용량)	694.29	160.32
실시예(중간 용량)	638.00	140.19
실시예(고용량)	600.71	67.27
분리대두단백(중간용량)	705.43	192.78

대조군의 혈장 암모니아 농도는 753.57 ㎍/㎗이며 실시예의 수용성 쌀 펩타이드의 투여 농도가 높아질수록 혈장 암모니아 농도가 감소되었고, 비교군인 분리대두단백에 비해서도 뛰어난 혈장 암모니아 저감 효과를 나타내었다.

따라서 본 발명의 수용성 쌀 펩타이드 섭취가 운동 후 랫드의 피로 저하 효능에 효과가 있는 것으로 해석할 수 있었다.

Claims

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단백질 함량이 40 중량% 이상인 쌀 시럽박과 터마밀(Termamyl)을 80 내지 100 ℃에서 반응시키는 알파-아밀라아제 처리단계;
상기 알파-아밀라아제로 처리된 쌀 시럽박을 탈수시키고, 그 탈수된 쌀 시럽박 고형물 함량의 2 내지 30 배의 물을 혼합하여 교반한 후, 탈수하는 과정을 1 내지 5 회 반복하는 수용성 물질 제거단계; 및
상기 세척된 쌀 시럽박을 0.1 내지 1 중량%의 알칼라아제를 첨가하여 50 내지 70 ℃에서 0.5 내지 3 시간 반응시키는 단백분해효소 처리단계;를 포함하고,
상기 쌀 시럽박을 단백분해효소로 처리하여 얻은 쌀 펩타이드의 분자량은 300 내지 700 Da의 펩타이드가 전체 펩타이드의 90 중량% 이상이고, 상기 쌀 펩타이드의 아미노태질소의 함량은 10 내지 700 mg%이며, 상기 쌀 펩타이드의 글루타민산 함량은 전체 아미노산 중의 15 내지 25 중량%이고, 분지아미노산 함량은 전체 아미노산 중의 12 내지 20 중량%이고, 상기 쌀 펩타이드의 pH 4.6 내지 pH 12에서의 수용해성은 90 % 이상이며,
상기 쌀 펩타이드의 아미노산 조성은 아스파르트산 9 내지 12 중량부, 트레오닌 3 내지 5 중량부, 세린 5 내지 7 중량부, 글루타민산 19 내지 22 중량부, 프롤린 3 내지 5 중량부, 글리신 4 내지 6 중량부, 알라닌 5 내지 7 중량부, 발린 5 내지 7 중량부, 메치오닌 1 내지 3 중량부, 이소로이신 3 내지 5 중량부, 로이신 7 내지 9 중량부, 티로신 4 내지 6 중량부, 페닐알라닌 5 내지 7 중량부, 라이신 2 내지 4 중량부, 히스티딘 1 내지 3 중량부 및 아르기닌 7 내지 10 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 운동 후 피로 회복 활성을 가지는 수용성 쌀 펩타이드의 제조방법.
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