CN110804637B - 一种活性寡肽的制备方法 - Google Patents
一种活性寡肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110804637B CN110804637B CN201911178816.2A CN201911178816A CN110804637B CN 110804637 B CN110804637 B CN 110804637B CN 201911178816 A CN201911178816 A CN 201911178816A CN 110804637 B CN110804637 B CN 110804637B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- permeate
- enzymolysis
- protein
- ultrafiltration
- effluent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 title claims abstract description 68
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 82
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims abstract description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims abstract description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 12
- 101710180316 Protease 2 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 54
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 54
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 46
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 15
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims description 15
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 claims description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 11
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 claims description 11
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 claims description 11
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 7
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 7
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 12
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 53
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 52
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 14
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 12
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- OCZVHBZNPVABKX-UHFFFAOYSA-N 1,1-diphenyl-2-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazine;ethanol Chemical compound CCO.[O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1NN(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OCZVHBZNPVABKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 2
- 244000247812 Amorphophallus rivieri Species 0.000 description 1
- 235000001206 Amorphophallus rivieri Nutrition 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 229920002752 Konjac Polymers 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- JYYOBHFYCIDXHH-UHFFFAOYSA-N carbonic acid;hydrate Chemical compound O.OC(O)=O JYYOBHFYCIDXHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011208 chromatographic data Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000000252 konjac Substances 0.000 description 1
- 235000010485 konjac Nutrition 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Birds (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种寡肽的制备方法：将蛋白质溶液预酶解；再进行首次过滤：将预酶解液泵入超滤设备1，酶解后获得透过液1；透过液1进入超滤设备2，加入复合蛋白酶II酶解后获得透过液2；透过液2进行纳滤，获得透过液3和流出液，收集流出液（含寡肽的溶液），透过液3流回至超滤设备1；然后重复循环：持续向超滤设备1补充蛋白质溶液的溶剂，持续获得透过液1、透过液2、透过液3和流出液；流出液中寡肽浓度小于设定阈值，再次泵入预酶解液。本发明的制备方法，通过两种复合蛋白酶和串联式超滤偶联酶解，控制了蛋白和多肽的水解程度，最大程度提取寡肽，提高原料利用率。该制备方法步骤简单，获得的产品寡肽含量高、收率高，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于寡肽制备领域，涉及一种抗氧化寡肽的制备方法，具体涉及一种以大米蛋白为原料制备抗氧化寡肽的方法。
背景技术
我国稻米资源丰富，产量居世界首位。大米蛋白中氨基酸组成平衡，配比合理，接近FAO/WHO推荐的理想模式。大米蛋白经蛋白酶水解成短肽或氨基酸后，可以制成营养价值更高的多肽产品，而进一步用于保健品、饮料、调味品、化妆品等行业。稻谷在加工生产过程中产生约15%的碎米，碎米的蛋白含量接近8%，其营养价值与大米相近，但价格仅为大米的1/3-1/2。目前碎米大多用于米粉、饲料、酿酒、味精生产等，附加值较低。通过碎米生产高品质的大米蛋白产品，或者进一步通过大米蛋白生产附加值更高的活性多肽产品，不仅会提高碎米的综合利用水平，同时也将会大大提高企业的经济效益。
目前，以碎米为原料制备生物活性肽的发明较多，其中CN 102229643 A以大米或碎米为原料，在碱提酸沉方法制备大米蛋白粗品的基础上，通过由淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶组成的高效复合酶的除杂作用去除其中的非蛋白类物质，制备蛋白含量高于90％的高纯度大米蛋白，并进一步在此基础上通过复合蛋白酶作用和交替式酶解超滤偶联技术，控制大米蛋白的水解程度，分离制备得到蛋白含量高于90％、多肽含量高于70％、200-1200Da寡肽含量高于50％的蛋白高纯度大米肽。CN 101253925 A以大米为原料，经粉碎、碱溶酸沉、离心分离、上清液等电点沉淀、沉淀洗涤、加水匀质后再经中性蛋白酶水解、离心分离、上清液经冷冻干燥得到了分子量分布范围在392-1367Da，具有抗氧化活性的大米蛋白肽。CN102876762 A将碎米超微粉碎，加水及碳酸氢钠调配并发生酶解反应，固液分离后制备大米淀粉及大米蛋白。CN 109880874 A中将大米蛋白粉、水和复合蛋白酶混合后水解，得到水解物；将水解物依次进行压滤、陶瓷膜过滤、纳滤，得到小分子蛋白肽溶液，干燥，得到大米活性肽。CN 105349607 A将酶解过程和多级超滤串联同步连续酶解制备甘露醇聚肽，获得魔芋飞粉甘露醇聚肽的提取率达2-3%，纯度达70-75%。
可见，现有技术中虽然获得的寡肽纯度最高能够达到70%左右，但是酶解控制过程差，或者多肽含量高、需要反复酶解、步骤繁琐、成本高，或者酶解过度、氨基酸含量高，导致最终得率低。
发明内容
针对目前寡肽制备过程中酶解控制差、寡肽得率低的问题，本发明提供一种抗氧化寡肽的制备方法，能够控制酶解过程，获得的产品寡肽含量高、收率高，步骤简便，获得的寡肽抗氧化活性好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种寡肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）将蛋白质溶液与复合蛋白酶I混合后在酶解反应器中预酶解，获得预酶解液；
（2）首次过滤：将预酶解液泵入超滤设备1，酶解一段时间后开启超滤设备1，获得透过液1；
透过液1进入超滤设备2至一定量，加入复合蛋白酶II，酶解一段时间后开启超滤设备2，获得透过液2；
透过液2进入纳滤设备进行纳滤，获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；
（3）重复循环：超滤设备1开启后持续补充蛋白质溶液的溶剂，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液；
（4）流出液中寡肽浓度小于设定阈值时，超滤设备1中再次泵入预酶解液。
步骤（1）中，所述蛋白质溶液的浓度为5-15mg/mL。所述蛋白质溶液的pH为6-9。所述蛋白质溶液的溶剂选自NaOH溶液、Britton-Robinson广泛缓冲溶液、PB缓冲溶液、PBS缓冲溶液。所述蛋白质来源为植物；优选为谷物；更优选为大米。
所述复合蛋白酶I包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶；其用量分别为1000-2000 U/g蛋白、1500-2500 U/g蛋白和1500-2500 U/g蛋白。
步骤（1）中，预酶解的条件为：40-60℃，20-60min。
步骤（2）中，超滤设备1中酶解的条件为：40-60℃，10-30min。超滤设备2中酶解的条件为：40-60℃，5-20min。
步骤（2）中，超滤设备1的超滤膜截留分子量为4000-6000Da。超滤设备2的超滤膜截留分子量为1500-2500Da。纳滤膜截留分子量200Da。
所述复合蛋白酶II包括木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和端肽酶；其用量分别是1000-2000 U/g蛋白、1000-2000U/g蛋白和500-1500 U/g蛋白。
步骤（2）中，所述超滤膜选自切向流板式膜、卷式膜或中空纤维膜；优选为切向流板式膜。所述超滤膜的材料选自再生纤维素膜或聚砜膜；优选为再生纤维素膜。
步骤（4）中，所述阈值为0.1mg/mL。
优选的，上述方法还包括将流出液浓缩或干燥获得产品的步骤。
一种上述方法获得的寡肽。
一种含上述寡肽的化妆品或保健食品。
本发明具有以下优点：
本发明提供了一种高纯度寡肽的制备方法，以植物蛋白为原料，通过两种复合蛋白酶和串联式超滤偶联酶解技术，控制蛋白和多肽的水解程度，最大程度的提取寡肽，提高原料的利用率。本发明通过对复合蛋白酶I和复合蛋白酶II的优化组合提高大米蛋白水解率，复合蛋白酶I将蛋白酶解成大分子肽，复合蛋白酶II将大分子肽进一步酶解成小分子肽，酶解过程更具针对性，酶解效率更高。本发明中预酶解液以一定的时间间隔进入串联的超滤装置，通过控制预酶解时间、超滤间隔时间，最大限度的提升蛋白的水解程度，定向生产寡肽，又可以及时将生成的寡肽与酶分离，避免寡肽被进一步水解。本发明获得的寡肽产品中寡肽的含量高于80%，寡肽收率大于3.8%，其对对DPPH自由基清除的IC50小于1.5mg/mL。本发明提供的抗氧化寡肽的制备方法，能够控制酶解过程、步骤简单，获得的产品寡肽含量高、收率高，适于工业化生产。
附图说明
图1是实施例寡肽制备过程流程示意图；
图2是多肽分子量校正标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 大米蛋白的制备
（1）蛋白提取：取10kg碎米，粉碎至60目，加入100L水搅拌均匀，调pH至13，置于50℃水浴锅中，水浴搅拌3 h，5000 r/min离心20 min，保留上清液，用0.1 M HCl调pH至5.5，于4 ℃静置30 min，收集蛋白沉淀，经冷冻干燥、粉碎得到粗大米蛋白。
（2）蛋白除杂：按料液比1:10加水搅拌均匀，调pH至5.5，置于55 ℃水浴锅中，按照粗蛋白的量添加35U/g淀粉酶和10U/g纤维素酶，水浴搅拌3 h，5000 r/min离心20 min，收集蛋白沉淀，经冷冻干燥、粉碎得到大米蛋白512.4g，蛋白得率为5.12%。
实施例2 抗氧化寡肽的制备
（1）取实施例1中制备的大米蛋白，加pH 7.5的PBS缓冲液配制成10L浓度为10 mg/mL的蛋白溶液，搅拌均匀，置于55℃酶解反应器中，按照大米蛋白质量添加包含1600 U/g碱性蛋白酶、2000 U/g胰蛋白酶和2000 U/g中性蛋白酶的复合蛋白酶I，搅拌预酶解30min，获得预酶解液；
（2）将预酶解液泵入超滤设备1，55℃酶解20min，开启超滤设备1（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量5000Da），获得透过液1；
透过液1中按照大米蛋白质量添加包括1500 U/g木瓜蛋白酶、1500 U/g中性蛋白酶和1000 U/g端肽酶的复合蛋白酶II，55℃酶解10min后启动超滤设备2（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量2000Da），获得透过液2；
透过液2进入纳滤设备进行纳滤（截留分子量200Da），获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；
（3）超滤设备1开启后持续补充pH 7.5的PBS缓冲液，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液，透过液3连续流入超滤设备1；
（4）运行5h后，流出液中寡肽浓度小于0.1mg/mL，收集全部流出液，超滤设备1中再次泵入预酶解液开始新的酶解；
（5）将步骤（4）中收集的流出液冷冻干燥获得寡肽固体产品93.1g，产品收率为93.1%。
实施例3 抗氧化寡肽的制备
（1）取实施例1中制备的大米蛋白，加pH 8.0的PB缓冲液配制成10L浓度为8 mg/mL的蛋白溶液，搅拌均匀，置于50℃酶解反应器中，按照大米蛋白质量添加包含1600 U/g碱性蛋白酶、2000 U/g胰蛋白酶和2000 U/g中性蛋白酶的复合蛋白酶I，搅拌预酶解20min，获得预酶解液；
（2）将预酶解液泵入超滤设备1，50℃酶解30min，开启超滤设备1（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量5000Da），获得透过液1；
透过液1中按照大米蛋白质量添加包括1200 U/g木瓜蛋白酶、1000 U/g中性蛋白酶和800 U/g端肽酶的复合蛋白酶II，50℃酶解15min后启动超滤设备2（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量2000Da），获得透过液2；
透过液2进入纳滤设备进行纳滤（截留分子量200Da），获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；
（3）超滤设备1开启后持续补充pH 8.0的PB缓冲液，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液，透过液3连续流入超滤设备1；
（4）运行约5 h后，流出液中寡肽浓度小于0.1mg/mL，收集全部流出液，超滤设备1中再次泵入预酶解液开始新的酶解；
（5）将收集的流出液冷冻干燥获得寡肽固体产品73.5g，产品收率为91.9%。
实施例4 抗氧化寡肽的制备
（1）取实施例1中制备的大米蛋白，加pH 8.5的NaOH溶液配制成10L浓度为15 mg/mL的蛋白溶液，搅拌均匀，置于45℃酶解反应器中，按照大米蛋白质量添加包含2000 U/g碱性蛋白酶、2500 U/g胰蛋白酶和2500 U/g中性蛋白酶的复合蛋白酶I，搅拌预酶解40min，获得预酶解液；
（2）将预酶解液泵入超滤设备1，45℃酶解30min，开启超滤设备1（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量5000Da），获得透过液1；
透过液1中按照大米蛋白质量添加包括2000 U/g木瓜蛋白酶、1500 U/g中性蛋白酶和1500 U/g端肽酶的复合蛋白酶II，45℃酶解20min后启动超滤设备2（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量2000Da），获得透过液2；
透过液2进入纳滤设备进行纳滤（截留分子量200Da），获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；
（3）超滤设备1开启后持续补充pH 8.5的NaOH溶液，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液，透过液3连续流入超滤设备1；
（4）运行4.5h后，流出液中寡肽浓度小于0.1mg/mL，收集全部流出液，超滤设备1中再次泵入预酶解液开始新的酶解；
（5）将收集的流出液冷冻干燥获得寡肽固体产品137.2g，产品收率为91.5%。
实施例5 抗氧化寡肽的制备
（1）取实施例1中制备的大米蛋白，加pH 8.04的PB缓冲液配制成10L浓度为5 mg/mL的蛋白溶液，搅拌均匀，置于50℃酶解反应器中，按照大米蛋白质量添加包含1600 U/g碱性蛋白酶、2000 U/g胰蛋白酶和2000 U/g中性蛋白酶的复合蛋白酶I，搅拌预酶解40min，获得预酶解液；
（2）将预酶解液泵入超滤设备1，50℃酶解15min，开启超滤设备1（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量5000Da），获得透过液1；
透过液1中按照大米蛋白质量添加包括1200 U/g木瓜蛋白酶、1000 U/g中性蛋白酶和500 U/g端肽酶的复合蛋白酶II，50℃酶解20min后启动超滤设备2（密理博切向流板式再生纤维素膜膜，膜截留分子量2000Da），获得透过液2；
透过液2进入纳滤设备进行纳滤（截留分子量200Da），获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；
（3）超滤设备1开启后持续补充pH 8.04的PB缓冲液，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液，透过液3连续流入超滤设备1；
（4）运行约5 h后，流出液中寡肽浓度小于0.1mg/mL，收集全部流出液，超滤设备1中再次泵入预酶解液开始新的酶解；
（5）将收集的流出液冷冻干燥获得寡肽固体产品46.0g，产品收率为92.0%。
对比例1 抗氧化寡肽的制备
（1）取实施例1中制备的大米蛋白，加pH 7.5的PBS缓冲液配制成10L浓度为10 mg/mL的蛋白溶液，搅拌均匀，置于55℃酶解反应器中，按照大米蛋白质量添加包含1600 U/g碱性蛋白酶、2000 U/g胰蛋白酶和2000 U/g中性蛋白酶的复合蛋白酶I，搅拌预酶解30min，获得预酶解液；
（2）将预酶解液泵入超滤设备1，开启超滤设备1（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量5000Da）、超滤设备2（密理博切向流板式再生纤维素膜，膜截留分子量2000Da）和纳滤设备（截留分子量200Da），超滤设备2中按照大米蛋白质量添加包括1500 U/g木瓜蛋白酶、1000 U/g中性蛋白酶和1000 U/g端肽酶的复合蛋白酶II；
向超滤设备1中持续补充pH 7.5的PBS缓冲液，获得透过液和流出液，透过液返回超滤设备1；
（3）运行5h后，收集全部流出液，冷冻干燥获得寡肽固体产品58.8g，产品收率为58.8%。
实施例6 产品效果
1. 寡肽含量
取不同实施例和对比例制备的寡肽溶液（全部流出液），采用高效凝胶过滤色谱法测定寡肽含量，色谱条件如下：
色谱柱：Superdex peptide 10/ 300 GL凝胶过滤柱；
流动相：0.15 M NaCl、50 mM pH 7.2磷酸盐缓冲液；
流速：0.5mL/min；
检测波长：214nm；
压力：1.8Mpa；
进样体积：50µL；
柱温：室温。
标准肽段混合液：
分子量校正曲线的制作：按以上色谱条件分析标准肽段混合液，以分子量的对数（Lg Mw）对保留时间作图或作线性回归得到分子校正曲线（图2）及其方程。
样品分子量分布的计算：将制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。然后用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线中进行计算，即可得到样品的分于量分布范围。用峰面积归一法可计得不同分子量范围肽的相对百分比，其中分子量范围在200-1200Da的多肽含量即为寡肽含量。计算公式如下：
X — 试样中某相对分子质量肽段所占肽段的质量分数；
A — 某相对分子质量肽段的峰面积；
A总—各相对分子质量肽段的峰面积之和；
结果如表1所示。
表1 不同实施例和对比例中寡肽（200-1200Da）含量
可见，本发明的方法制备的产品中寡肽含量更高，即寡肽的收率也更高。
2. 寡肽收率
分别按照以下公式计算各实施例和对比例制备的产品由大米蛋白和碎米计的寡肽收率：
寡肽收率蛋白(%) = (产品质量×寡肽含量/ 蛋白质质量)×100%；
寡肽收率米(%) = [(产品质量×寡肽含量) / (蛋白质质量 / 蛋白得率)]×100%；
其中，蛋白质质量为制备产品时使用的蛋白质质量。
结果如表2所示。
表2 不同实施例和对比例中寡肽（200-1200Da）收率
3. 抗氧化能力
用清除有机自由基DPPH法测定水解液中多肽的抗氧化能力：
精密称取DPPH 19.7 mg，用无水乙醇溶解于250 mL容量瓶中，摇匀即得0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存0-4 ℃，备用。分别取水解液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，并以无水乙醇补足至2 mL，加入1.0 mL DPPH乙醇溶液，混匀，于37 ℃反应30 min，在517 nm处测吸光度值。DPPH自由基清除率用以下公式计算：
Y — DPPH自由基清除率；
A c — 517 nm下对照品的吸光度值；
A s — 517 nm下不同浓度样品的吸光度值。
各实施例和对比例流出液对DPPH自由基的清除效果如表3所示。
表3 不同实施例和对比例中流出液对DPPH清除效果
Claims (8)
1.一种寡肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将蛋白质溶液与复合蛋白酶I混合后在酶解反应器中预酶解，获得预酶解液；
（2）首次过滤：将预酶解液泵入超滤设备1，酶解一段时间后开启超滤设备1，获得透过液1；
透过液1进入超滤设备2至一定量，加入复合蛋白酶II，酶解一段时间后开启超滤设备2，获得透过液2；
透过液2进入纳滤设备进行纳滤，获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；
（3）重复循环：超滤设备1开启后持续补充蛋白质溶液的溶剂，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液；
（4）流出液中寡肽浓度小于设定阈值时，超滤设备1中再次泵入预酶解液；
所述蛋白质来源为大米；
所述复合蛋白酶I包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶；其用量分别为1000-2000U/g蛋白、1500-2500 U/g蛋白和1500-2500 U/g蛋白；
所述复合蛋白酶II包括木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和端肽酶；其用量分别是1000-2000U/g蛋白、1000-2000 U/g蛋白和500-1500 U/g蛋白；
步骤（1）中，预酶解的条件为：40-60℃，20-60min；
步骤（2）中，超滤设备1中酶解的条件为：40-60℃，10-30min；超滤设备2中酶解的条件为：40-60℃，5-20min；
步骤（2）中，超滤设备1的超滤膜截留分子量为4000-6000Da；超滤设备2的超滤膜截留分子量为1500-2500Da；纳滤膜截留分子量200Da；
步骤（4）中，所述阈值为0.1mg/mL。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述蛋白质溶液的浓度为5-15mg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述蛋白质溶液的pH为6-9；
所述蛋白质溶液的溶剂选自NaOH溶液、Britton-Robinson广泛缓冲溶液、PB缓冲溶液、PBS缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述超滤膜选自切向流板式膜、卷式膜或中空纤维膜；所述超滤膜的材料选自再生纤维素膜或聚砜膜。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述超滤膜为切向流板式膜；所述超滤膜的材料为再生纤维素膜。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）后还包括将流出液浓缩或干燥获得产品的步骤。
7.一种如权利要求1-6任一所述制备方法获得的寡肽。
8.一种含如权利要求7所述寡肽的化妆品或保健食品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911178816.2A CN110804637B (zh) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 一种活性寡肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911178816.2A CN110804637B (zh) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 一种活性寡肽的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110804637A CN110804637A (zh) | 2020-02-18 |
| CN110804637B true CN110804637B (zh) | 2021-09-10 |
Family
ID=69491531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911178816.2A Active CN110804637B (zh) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 一种活性寡肽的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110804637B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101768551A (zh) * | 2010-02-04 | 2010-07-07 | 南京工业大学 | 一种多级固定化酶膜反应装置及利用其制备酪蛋白磷酸肽的方法 |
| CN103045707A (zh) * | 2013-01-07 | 2013-04-17 | 广西大学 | 一种连续酶解与二级膜过滤提纯制备大米蛋白活性多肽的方法 |
| CN110353084A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-10-22 | 浙江工业大学 | 一种连续酶解制备鱼蛋白粉的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102229643A (zh) * | 2011-05-30 | 2011-11-02 | 天津科技大学 | 一种高纯度大米蛋白和高纯度大米肽的制备方法 |
| KR101433239B1 (ko) * | 2012-01-05 | 2014-08-25 | 주식회사 비케이바이오 | 수용성 쌀 펩타이드의 제조방법 |
-
2019
- 2019-11-27 CN CN201911178816.2A patent/CN110804637B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101768551A (zh) * | 2010-02-04 | 2010-07-07 | 南京工业大学 | 一种多级固定化酶膜反应装置及利用其制备酪蛋白磷酸肽的方法 |
| CN103045707A (zh) * | 2013-01-07 | 2013-04-17 | 广西大学 | 一种连续酶解与二级膜过滤提纯制备大米蛋白活性多肽的方法 |
| CN110353084A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-10-22 | 浙江工业大学 | 一种连续酶解制备鱼蛋白粉的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 3种大米蛋白肽的制备及其抗氧化活性比较;赵佳佳;《食品科技》;20181231;第43卷(第12期);191-195 * |
| 大米肽酶解工艺的优化及抗氧化肽的分离鉴定;赵晓蕾;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20170215;B024-292 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110804637A (zh) | 2020-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101096696B (zh) | 从玉米蛋白粉中酶法制取玉米蛋白多肽的工业生产方法 | |
| CN108823273B (zh) | 一种具有抗氧化活性的牡丹籽粕多肽及其制备方法和应用 | |
| CN102115774B (zh) | 一种酶法制备植物多肽的方法 | |
| CN101736065B (zh) | 一种利用啤酒麦糟制备多肽的方法 | |
| US9609883B2 (en) | Method for producing wheat glutamine peptide | |
| CN103290086B (zh) | 具有ace抑制活性的绿豆蛋白肽及其制备方法与应用 | |
| CN103045707B (zh) | 一种连续酶解与二级膜过滤提纯制备大米蛋白活性多肽的方法 | |
| CN105385737A (zh) | 一种牦牛骨胶原寡肽的制备工艺 | |
| CN102229643A (zh) | 一种高纯度大米蛋白和高纯度大米肽的制备方法 | |
| CN104726527A (zh) | 鱼鳞酶解生产胶原蛋白的制备工艺 | |
| CN103160559B (zh) | 改性玉米醇溶蛋白肽的制备方法 | |
| KR102493618B1 (ko) | 쌀단백질 및 쌀전분의 제조방법 | |
| CN101869169B (zh) | 以鱼下脚料发酵耦合膜技术制备鱼低聚肽的方法 | |
| CN103627768A (zh) | 鱼皮胶原蛋白生物活性小肽及其制备方法 | |
| CN111454375A (zh) | 一种银耳多糖的提取方法 | |
| CN102994598A (zh) | 丙氨酸和亮氨酸含量高的弱苦味玉米低聚肽及其制备方法 | |
| CN103435682B (zh) | 小麦胚芽蛋白源抗氧化肽、其制备方法及其应用 | |
| CN103130904A (zh) | 一种虾夷扇贝下脚料高值化利用的方法 | |
| CN102972779A (zh) | 一种微波辅助酶解制备莲子壳膳食纤维的方法 | |
| CN102228125A (zh) | 海藻活性肽的制备方法 | |
| CN110804637B (zh) | 一种活性寡肽的制备方法 | |
| CN109576331B (zh) | 一种小麦胚芽肽的提取方法 | |
| CN1280400C (zh) | 啤酒麦精的生产方法 | |
| CN103289968B (zh) | 从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法 | |
| CN109576330B (zh) | 郁李仁多肽及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230609 Address after: Tianchen Avenue, Ji'nan hi tech Development Zone of Shandong Province, No. 678 250101 Patentee after: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd. Address before: Tianchen Avenue, Ji'nan hi tech Development Zone of Shandong Province, No. 678 250101 Patentee before: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd. Patentee before: SHANDONG BLOOMAGE HYINC BIOPHARM Corp.,Ltd. |