KR101373464B1

KR101373464B1 - 단백질 티로신 키나제 7(ｐｔｋ7)에 대한 인간 단일클론항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101373464B1
Application number: KR1020087015763A
Authority: KR
Inventors: 리-셍 루; 조나단 알렉산더 테렛; 친 판
Original assignee: 메다렉스, 엘.엘.시.
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2014-03-14
Also published as: SI1957539T1; AU2006321841B2; AU2006321841C1; US8222375B2; CA2632552A1; US20120207764A1; KR20080082660A; RS52804B; US9505845B2; EA200801509A1; CA2632552C; WO2007067730A2; IL191788A0; US9102738B2; NO20082559L; NZ569236A; NZ594466A; PT1957539E; HK1121174A1; WO2007067730A3

Abstract

본 발명은 고 친화도로 PTK7에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체, 특히, 인간 단일클론 항체를 제공한다. 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 숙주 세포, 및 본 발명의 항체를 발현시키는 방법 또한 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체, 이중 특이성 분자 및 약제학적 조성물 또한 제공한다. 본 발명은 또한 항-PTK7 항체를 사용하여 PTK7을 검출하는 방법 뿐만 아니라, 암 및 감염성 질환을 비롯한 다양한 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

단백질 티로신 키나제 7(ＰＴＫ7)에 대한 인간 단일클론 항체 및 그의 용도{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROTEIN TYROSINE KINASE 7(PTK7) AND THEIR USE}

관련 출원

본 출원은 2005년 12월 8일 출원된 미국 가출원 번호 제60/748,373호(본원에서 그의 전문이 참고로 인용된다)에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명의 배경기술

수용체 티로신 키나제(RTKs: Receptor tyrosine kinases)는 세포외 환경으로부터 세포 내부로 생물학적 신호를 전달하는 막횡단 신호전달 단백질이다. RTK 신호 조절은 세포 성장, 분화, 축삭 성장, 상피 성장, 발생, 부착, 이동, 및 아포프토시스 조절에 중요하다([Prenzel et al. (2001) Endocr . Relat . Cancer 8:11-31]; [Hubbard and Till (2000) Annu . Rev . Biochem. 69:373-98]). RTKs는 여러 형태의 암의 발생과 진행에 관여하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 RTK-관련 암에서는 유전자의 돌연변이보다는 수용체 단백질의 증폭이 존재한다[Kobus and Fleming (2005) Biochemistry 44:1464-70].

수용체 단백질 티로신 키나제 계열의 일원인 단백질 티로신 키나제 7(PTK7: protein tyrosine kinase 7)은 최초로 정상적인 인간 멜라닌 세포로부터 단리되었고, RT-PCR에 의해 클로닝되었다([Lee et al., (1993) Oncogene 8:3403-10]; [Park et al, (1996) J. Biochem 119:235-9]). 별도로, 유전자는 인간 결장암종-유래 세포주로부터 클로닝되었고, 결장암종 키나제 4(CCK4: colon carcinoma kinase 4)로 명명된다[Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84]. PTK7은 검출가능한 촉매성 티로신 키나제 활성은 없지만, 신호 전달 활성을 보유하고 있고, 가능하게는 세포 부착 분자로서 작용할 것으로 판단되는, RTKs의 하위세트에 속한다.

PTK7에 대한 mRNA는 결장암종 유래 세포주에서 다양하게 발현되는 것으로 밝혀졌지만, 인간 성인 결장 조직에서 발현된다고 밝혀진 적은 없다[Mossie et al., 상기 동일 문헌]. PTK7 발현은 또한 몇몇 흑색종 세포주 및 흑색종 생검에서도 관찰되었다[Easty, et al. (1997) Int . J. Cancer 71:1061-5]. 선택적으로 스플라이싱된 형태가 간암 및 결장암 세포에서 발현된다는 것이 밝혀졌다[Jung et al. (2002) Biochim Biophys Acta 1579:153-63]. 추가로, PTK7은 급성 골수성 백혈병 샘플에서 고도로 과다 발현되는 것으로 밝혀졌다[Muller-Tidow et al., (2004) Clin . Cancer Res. 10:1241-9]. PCT 공보 WO 04/17992에 기재되어 있는 바와 같이, 면역조직화학법에 의해, PTK7의 종양 특이 염색은 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 신장암 및 방광암에서 관찰되었다.

따라서, PTK7을 인식하는 제제, 및 그러한 제제를 사용하는 방법이 바람직하다.

본 발명의 요약

본 발명은 PTK7에 결합하고, 다수의 바람직한 성질을 나타내는 단리된 단일클론 항체, 특히, 인간 단일클론 항체를 제공한다. 이러한 성질은 인간 PTK7에 결합하고, 빌름스 종양 세포에 결합하는 고 친화성을 포함한다. 또한 본 발명의 항체 및 조성물을 사용하여, 각종 PTK7 매개 질환을 치료하는 방법도 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은

(a) 인간 PTK7에 특이적으로 결합하고;

(b) 빌름스 종양(Wilms' tumor) 세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-1441)에 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이다.

대체 실시태양에서는 항체가 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체일 수 있지만, 항체가 인간 항체인 것이 바람직하다.

더욱 바람직한 실시태양에서, 항체는 4.0 nM 이하의 EC₅₀으로 빌름스 종양 세포에 결합하거나, 3.5 nM 이하의 EC₅₀으로 빌름스 종양 세포에 결합한다.

또다른 실시태양에서, 항체는 A-431(ATCC 수탁 번호 CRL-1555), Saos-2(ATCC 수탁 번호 HTB-85), SKOV-3(ATCC 수탁 번호 HTB-77), PC3(ATCC 수탁 번호 CRL-1435), DMS 114(ATCC 수탁 번호 CRL-2066), ACHN(ATCC 수탁 번호 CRL-1611), LNCaP(ATCC 수탁 번호 CRL-1740), DU 145(ATCC 수탁 번호 HTB-81), LoVo(ATCC 수탁 번호 CCL-229) 및 MIA PaCa-2(ATCC 수탁 번호 CRL-1420) 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 암 세포주에 결합한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 PTK7에 대한 결합에 관해서 기준 항체와 교차-경쟁하며, 여기에서, 기준 항체는:

(a) 인간 PTK7에 특이적으로 결합하고;

(b) 빌름스 종양 세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-1441)에 결합하는 것인, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.

다양한 실시태양에서, 기준 항체는:

(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;

기준 항체는

(b) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;

기준 항체는

(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,

기준 항체는

(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;

기준 항체는

(b) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;

기준 항체는

(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(b) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 인간 V_H 3-30.3 유전자의 산물이거나, 인간 V_H 3-30.3 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 V_H DP44 유전자의 산물이거나, 인간 V_H DP44 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 V_H 3-33 유전자의 산물이거나, 인간 V_H 3-33 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 본 발명은 추가로 인간 V_k L15 유전자의 산물이거나, 인간 V_k L15 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 본 발명은 추가로 인간 V_k A1O 유전자의 산물이거나, 인간 V_k A1O 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 본 발명은 추가로 인간 V_k A27 유전자의 산물이거나, 인간 V_k A27 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 본 발명은 추가로 인간 V_k L6 유전자의 산물이거나, 인간 V_k L6 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.

바람직한 조합은:

(a) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 29를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(a) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 30을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(a) 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(a) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(a) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 27을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(a) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 항체, 또는 그의 항원 결합부는:

(b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(b) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

(b) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 바람직한 조합은:

본 발명의 항체는 예를 들면, 전장 항체, 예를 들면, IgG1 또는 IgG4 이소타입의 전장 항체일 수 있다. 별법으로, 항체는 항체 단편, 예로서, Fab 또는 Fab'2 단편, 또는 단일 쇄 항체일 수 있다.

본 발명은 또한 예로서, 세포 독소 또는 방사성 동위 원소와 같은 치료제에 결합된, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부와는 다른 결합 특이성을 갖는 제2의 기능성 부분에 결합된, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 분자를 제공한다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부, 또는 면역접합체 또는 이중 특이성 분자, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물도 제공한다.

항체 또는 그의 항원 결합부를 코딩하는 핵산 분자 뿐만 아니라, 그러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 발명에 포함된다. 게다가, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 마우스 뿐만 아니라, 본 발명의 항체를 생산하는, 상기 마우스로부터 제조된 하이브리도마를 제공한다.

추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 피험체에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부를 질환 치료 또는 예방에 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, PTK7을 발현시키는 종양 세포의 성장을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 질환은 예를 들면, 암, 예컨대, 결장암(소장암 포함), 폐암, 유방암, 췌장암, 흑색종(예컨대, 전이성 악성 흑색종), 급성 골수성 백혈병, 신장암, 방광암, 난소암 및 전립선암일 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명은 항-PTK7 항체를 사용하여 생체내에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 항-PTK7 항체는 뮤린, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체일 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 다른 암의 일례로는 신장암(예컨대, 신장 세포암종), 아교모세포종, 뇌종양, 급성 림프성 백혈병(ALL: acute lymphocytic leukemia), 성인 T-세포 백혈병(T-ALL: adult T-cell leukemia), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병을 비롯한 만성 또는 급성 백혈병, 림프종(예컨대, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 림프성 림프종, 원발성 CNS 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종, 퇴행성 대세포 림프종(ALCL: anaplastic large-cell lymphoma), 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할-세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트(Lennert's) 림프종, 면역모세포 림프종, T-세포 백혈병/림프종(ATLL: T-cell leukemia/lymphoma), 중심모세포/중심세포(cb/cc: centroblastic/centrocytic) 소포 림프종암, B 계통 미만성 대세포 림프종, 혈관면역모구성 림프절증(AILD: angioimmunoblastic lymphadenopathy)-양 T 세포 림프종 및 HIV 관련 체강계 림프종, 배아암종, 미분화성 비강인두 암종(예컨대, 슈민케 종양), 캐슬맨병, 카포시 육종, 다발 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 기타 B-세포 림프종, 비강인두암종, 골암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 자궁관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직암, 요도암, 음경암, 소아기 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암종, 중추 신경계(CNS: central nervous system) 신생물, 종양 혈관형성인자, 척추 종양, 뇌관교종, 뇌하수체 선종, 유표피암, 편평세포암, 석면증에 의해 유도된 것을 비롯한, 환경적으로 유도된 암, 예컨대, 중피종 및 상기 암의 조합을 포함한다.

본 발명의 다른 특성과 장점은, 제한적 의미로서 해석되지 않아야 하는 하기의 상세한 설명과 실시예로부터 명백해질 것이다. 본 출원을 통해 인용된 모든 참고 문헌, 진뱅크(Genbank) 기재 사항, 특허, 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에서 참고로 명백하게 인용된다.

도 1A는 3G8 및 3G8a 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 41) 및 아미노산 서열(서열 번호 1)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 11), CDR2(서열 번호 15) 및 CDR3(서열 번호 19) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 1B는 3G8 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 45) 및 아미노산 서열(서열 번호 5)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 23), CDR2(서열 번호 29) 및 CDR3(서열 번호 35) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 1C는 3G8a 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 46) 및 아미노산 서열(서열 번호 6)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 24), CDR2(서열 번호 30) 및 CDR3(서열 번호 36) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 2A는 4D5 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 42) 및 아미노산 서열(서열 번호 2)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 12), CDR2(서열 번호 16) 및 CDR3(서열 번호 20) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 2B는 4D5 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 47) 및 아미노산 서열(서열 번호 7)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 25), CDR2(서열 번호 31) 및 CDR3(서열 번호 37) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 3A는 12C6 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 43) 및 아미노산 서열(서열 번호 3)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 13), CDR2(서열 번호 17) 및 CDR3(서열 번호 21) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 3B는 12C6 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 48) 및 아미노산 서열(서열 번호 8)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 26), CDR2(서열 번호 32) 및 CDR3(서열 번호 38) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 3C는 12C6a 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 49) 및 아미노산 서열(서열 번호 9)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 27), CDR2(서열 번호 33) 및 CDR3(서열 번호 39) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 4A는 7C8 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 44) 및 아미노산 서열(서열 번호 4)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 14), CDR2(서열 번호 18) 및 CDR3(서열 번호 22) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 4B는 7C8 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 50) 및 아미노산 서열(서열 번호 10)을 나타낸다. CDR1(서열 번호 28), CDR2(서열 번호 34) 및 CDR3 (SEQ ED NO:40) 영역은 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.

도 5는 인간 생식계열 V_H 3-30.3 아미노산 서열(서열 번호 51)과 3G8(서열 번호 1) 및 3G8a(서열 번호 1)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(JH4b 생식계열은 서열 번호 59로 개시되어 있다).

도 6은 인간 생식계열 V_H 3-30.3 아미노산 서열(서열 번호 51)과 4D5(서열 번호 2)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(JH4b 생식계열은 서열 번호 60로 개시되어 있다).

도 7은 인간 생식계열 VH DP44 아미노산 서열(서열 번호 52)과 12C6(서열 번호 3) 및 12C6a(서열 번호 2)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(3-7, 3-23, 및 JH4b 생식계열은 각각 서열 번호 61-63으로 개시되어 있다).

도 8은 인간 생식계열 V_H 3-33 아미노산 서열(서열 번호 53)과 7C8(서열 번호 4)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(JH6b 생식계열은 서열 번호 64로 개시되어 있다).

도 9는 인간 생식계열 V_K L15 아미노산 서열(서열 번호 54)과 3G8(서열 번호 5) 및 3G8a(서열 번호 6)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(JK1은 서열 번호 65로 개시되어 있다).

도 10은 인간 생식계열 V_K A10 아미노산 서열(서열 번호 55)과 4D5(서열 번호 7)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(JK5는 서열 번호 66으로 개시되어 있다).

도 11은 인간 생식계열 V_k A27 아미노산 서열(서열 번호 56)과 12C6(서열 번호 8)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(JK2는 서열 번호 67로 개시되어 있다).

도 12는 인간 생식계열 V_K L15 아미노산 서열(서열 번호 54)과 12C6a(서열 번호 9)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(JK2는 서열 번호 68로 개시되어 있다).

도 13은 인간 생식계열 V_K L6 아미노산 서열(서열 번호 57)을 갖는 7C8(서열 번호 10)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타내는 것이다(JK3은 서열 번호 69로 개시되어 있다).

도 14는 인간 PTK7에 대한 인간 단일클론 항체 7C8이 전장의 인간 PTK7로 형질감염된 HEK3 세포의 세포 표면에 결합한다는 것을 입증하는 유동 세포 분석 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 15는 인간 PTK7에 대한 인간 단일클론 항체가 PTK7에 특이적으로 결합한다는 것을 입증하는 ELISA 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 16은 인간 PTK7에 대한 항체가 빌름스 종양 세포의 세포 표면에 결합한다는 것을 입증하는 유동 세포 분석 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 17은 인간 PTK7에 대한 항체가 다양한 암 세포주의 세포 표면에 결합한다는 것을 입증하는 유동 세포 분석 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 18은 인간 PTK7에 대한 항체가 수지상 세포의 세포 표면에 결합한다는 것을 입증하는 유동 세포 분석 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 19는 인간 PTK7에 대한 항체가 CD4+ 및 CD8+ T-림프구에는 결합하지만, B-림프구에는 결합하지 않는다는 것을 입증하는 유동 세포 분석 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 20은 인간 PTK7에 대한 인간 단일클론 항체가 PTK7+ 세포로 내재화되었음 을 입증하는 Hum-Zap 내재화 실험의 결과를 나타내는 것이다. (A) 인간 항체 3G8, 4D5 및 7C8의 빌름스 종양 세포로의 내재화. (B) 인간 항체 12C6의 빌름스 종양 세포로의 내재화. (C) 인간 항체 7C8 및 12C6의 A-431 종양 세포로의 내재화. (D) 인간 항체 7C8 및 12C6의 PC3 종양 세포로의 내재화.

도 21은 독소-접합된 인간 단일클론 항-PTK7 항체가 인간 신장암 세포주를 사멸시킨다는 것을 입증하는 세포 증식 검정법의 결과를 나타내는 것이다.

도 22는 독소-접합된 인간 단일클론 항-PTK7 항체가 저수준 내지 고수준으로 PTK7을 발현시키는 세포주를 사멸시킨다는 것을 입증하는 세포 증식 검정법의 결과를 나타내는 것이다.

도 23은 항-PTK7 항체가 세포 표면상에 PTK7을 발현시키는 세포의 침윤 이동성을 저해한다는 것을 입증하는 침윤 검정법의 결과를 나타내는 것이다.

도 24는 독소에 접합된 항-PTK7 항체가 췌장암에서 종양 성장 진행을 저속화시킨다는 것을 입증하는 생체내 종양 이종이식 연구의 결과를 나타내는 것이다.

도 25는 독소에 접합된 항-PTK7 항체가 유방암에서 종양 성장 진행을 저속화시킨다는 것을 입증하는 생체내 종양 이종이식 연구의 결과를 나타내는 것이다.

본 발명의 상세한 설명

하나의 측면에서, 본 발명은 PTK7에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체, 특히, 인간 단일클론 항체에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 바람직한 기능적 성질, 예로서, 시험관내 또는 생체내에서 PTK7 에 결합하는 고 친화성 및/또는 종양 세포의 성장을 저해할 수 있는 능력을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 생식계열 서열로부터 유래된 것이고/거나, 특정 아미노산 서열을 포함하는 특정의 구조적 특징, 예로서, CDR 영역을 포함한다. 본 발명은 단리된 항체, 상기 항체를 제조하는 방법, 상기 항체를 포함하는 면역접합체 및 이중 특이성 분자, 항체, 면역접합체 또는 이중 특이성 분자를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 예로서, 암과 같은 질환을 치료하기 위하여 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명을 더욱 잘 이해하기 위해서는 우선 몇 가지 용어에 관하여 정의해 두어야 할 것이다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시되어 있다.

용어 "PTK7" 및 "CCK4"는 상호교환적으로 사용되며, 인간 PTK7의 변이체, 아형 및 종간 상동체(species homolog)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 인간 항체는 특정 경우에, 인간을 제외한 다른 종으로부터의 PTK7과 교차-반응할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 항체는 하나 이상의 인간 PTK7에 완전히 특이적일 수 있고, 인간을 제외한 종 또는 다른 유형의 교차-반응성을 나타내지 않을 것이다. 예시적인 인간 PTK7의 완전한 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_002821(서열 번호 58)을 갖는다.

"면역 반응"이란 용어는 병원체가 침입한 인체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병적 염증의 경우, 정상적인 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 파괴 또는 제거를 초래하는 예를 들면, 림프구, 항원 전달 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분 자(항체, 사이토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.

"신호 전달 경로"란, 신호를 세포의 일부에서 세포의 다른 부분으로 전달하는 역할을 하는 다수의 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 의미하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포 표면 수용체"란 어구는 예를 들면, 신호를 받아들일 수 있고 이러한 신호를 세포의 원형질막을 통과하여 전달할 수 있는 분자 및 이러한 분자들의 복합체를 포함한다. 본 발명의 "세포 표면 수용체"의 예로서는 PTK7 수용체가 있다.

본원에 사용된 "항체"란 용어는 전 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합부") 또는 단일 쇄를 포함한다. "항체"란, 디설파이드 결합에 의하여 상호 연결되어 있는 2개 이상의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 또는 그의 항원 결합부를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(이하, "V_H"라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 즉, C_H1, C_H2 및 C_H3으로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(이하, "V_L"이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉, C_L로 이루어져 있다. V_H 및 V_L 영역은 추가로 세분화될 수 있는데, 즉, 과 변이가 일어난 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region), 보다 보존적인 부위가 산재되어 있는 프레임워크 영역(FR: framework region)으로 세분화될 수 있다. V_H 및 V_L은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어져 있으며, 이들은 아미노-말단에 서 카복시-말단의 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서에 따라서 배열되어 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자 예를 들면, 면역계의 다양한 세포(예를 들면, 효과기 세포) 및 전통적 보체계의 제1 성분(C1q)에 면역글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다.

본원에 사용된 항체(또는 간단하게는 "항체 부분")의 "항원 결합부"라는 용어는, 항원(예컨대, PTK7)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 이루어질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로서는 (i) Fab 단편 즉, V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 즉, 힌지 영역에 디설파이드 결합에 의해서 연결되어 있는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 일부를 포함하는 Fab인 Fab' 단편([FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3^rd ed. 1993)]을 참조할 수 있다); (iv) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 항체의 한쪽 팔(arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편; (vi) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]; (vii) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 단일의 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노체를 포함한다. 추가로, 비록 Fv 단편의 2개의 도메인인 V_L 및 V_H는 별도의 유전 자에 의해서 코딩되지만, 이 도메인들은 재조합법을 통하여, 상기 도메인들이 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로서 알려져 있음; 예컨대, ([Bird et al (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al (1988) Proc . Natl . Acad . Sci USA 85:5879-5883])를 참조할 수 있다)를 형성한 단일의 단백질 쇄로서 생산되도록 만드는 합성 링커에 의해서 서로 결합될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되기도 한다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 기술을 이용하여 생산되며, 이 단편들은 원래의 항체에서와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

본원에 사용된 "단리된 항체"란 용어는, 상이한 항원 특이성을 갖는 기타 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 의미하는 것이다(예컨대, 특이적으로 PTK7와 결합하는 단리된 항체는 PTK7을 제외한 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않는다). 그러나, PTK7와 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 기타 항원, 예로서, 다른 종으로부터 유래한 PTK7 분자와의 교차-반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체에는 실질적으로 기타 세포 물질 및/또는 화학 물질이 존재하지 않는 것일 수 있다.

본원에 사용된 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"이란 용어는, 단일의 분자 조성물인 항체 분자 제제를 의미한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.

본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 프레임워크 및 CDR 영역, 둘 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 의미이다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유할 경우, 이러한 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 것이다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예컨대, 시험관내 무작위 또는 위치-특이 돌연변이 유발법 또는 생체내 체세포 돌연변이 유발법에 의해 도입된 돌연변이가 일어난 잔기)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 "인간 항체"란 용어는, 다른 포유동물 종 예로서, 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열상으로 이식된 항체들을 포함하는 의미는 아니다.

"인간 단일클론 항체"라는 용어는 프레임워크 및 CDR 영역, 둘 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 단일의 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 인간의 단일클론 항체는 하이브리도마, 즉, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물, 예컨대, 트랜스제닉 마우스로부터 얻어지는 B 세포를 포함하고, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진이 무한 증식 세포에 융합되어 있는 게놈을 갖는 하이브리도마에 의하여 생산된다.

본원에 사용된 "재조합 인간 항체"란 용어는, 재조합 수단, 예로서, (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대하여 트랜스제닉이거나, 이에 대한 트랜스염색체를 갖는 동물(예컨대, 마우스) 또는 그로부터 생산된 하이브리도마로부터 단리된 항체(이하, 상세히 설명함), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 형질감염 세포(트랜스펙토마(transfectoma))로부터 단리된 항체, (c) 재조합된 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 기타 DNA 서열로 스플라이싱하는 단계를 포함하는 임의의 기타 방법에 의해 제조, 발현, 생산 또는 단리된 항체에 의하여 제조, 발현, 생산 또는 단리되는 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간의 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 영역을 갖는다. 그러나, 임의의 실시태양에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내에서 돌연변이가 유발될 수 있으므로(또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에는, 생체내 체세포 돌연 변이가 유발될 수 있으므로), 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은 천연적으로 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 존재할 수 없는 서열임과 동시에, 인간 생식계열 V_H 및 V_L 서열로부터 유래하고 이와 관련된 서열이다.

본원에 사용된 "이소타입(isotype)"이란, 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류(예컨대, IgM 또는 IgG1)를 의미한다.

"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호 교환적으로 사용된다.

"인간 항체 유도체"란 용어는, 인간 항체의 임의의 변형된 형태의 것으로서, 예컨대, 항체와 기타 제제 또는 항체의 접합체를 의미한다.

"인간화된 항체"란 용어는, 또다른 포유동물 종, 예로서, 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 의미하는 것이 다. 추가의 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 일어날 수 있다.

"키메라 항체"란 용어는, 가변 영역 서열은 하나의 종에서 유래되고, 불변 영역 서열은 다른 종으로부터 유래된 항체, 예로서, 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, "인간 PTK7에 특이적으로 결합하는" 항체란, 항체가 인간 PTK7과 1 x 10^-7 M 이하, 더욱 바람직하게, 5 x 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게, 1 x 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게, 5 x 10^-9 M 이하의 K_D로 결합하는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 세포"에 실질적으로 결합하지 않는"이라는 용어는, 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나, 고 친화도로 결합하는 것이 아닌 것, 즉, 단백질 또는 세포에 10^-6 M 이상, 더욱 바람직하게, 1 x 10^-5 M 이상, 더욱 바람직하게, 1 x 10^-4 M 이상, 더욱 바람직하게, 1 x 10^-3 M 이상, 더욱더 바람직하게, 1 x 10^-2 M 이상의 K_D로 결합한다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 "K_결합" 또는 "K_a"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하는 것인 반면, 본원에 사용된 "K_해리" 또는 "K_d"란 용어는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것이다. 본원에 사용된 "K_D"란 용어는, K_d 대 K_a의 비(즉, K_d/K_a)로부터 수득되는 해리 상수를 의미하는 것으로서, 몰 농도(M)로서 표시한다. 항체에 대한 K_D 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 항체의 K_D를 측정하기 위한 바람직한 방법으로서는 표면 플라스몬 공명을 이용하는 방법이 있는데, 바람직하게는 바이오센서 시스템, 예로서, 바이어코어(Biacore)? 시스템을 사용하는 방법이 있다.

본원에 사용된 IgG 항체가 "고 친화성"이란 용어는, 표적 항원에 대한 K_D값이 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게, 10^-9 M 이하, 및 더욱더 바람직하게, 10^-10 M 이하인 항체를 지칭하는 것이다. 그러나, "고 친화성" 결합은 기타 항체의 이소타입에 있어서 다양할 수 있다. 예를 들면, IgM 이소타입에 대한 "고 친화성" 결합이란, 항체의 K_D값이 10^-7M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-8M 이하, 더욱더 바람직하게는 10^-9M 이하인 경우를 지칭한다.

본원에 사용된 "피험체"란 용어는 임의의 인간 또는 인간을 제외한 동물을 포함한다. "인간을 제외한 동물"이란 용어는, 모든 척추 동물, 예컨대, 포유동물 및 포유동물을 제외한 것, 예로서, 인간을 제외한 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류 및 파충류 등을 포함한다.

본 발명의 다양한 측면에 관하여는 이하 섹션에 보다 상세히 기술한다.

항- PTK7 항체

본 발명의 항체는 항체의 특정한 기능상의 특성 또는 성질을 특징으로 한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 인간 PTK7에 특이적으로 결합한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 PTK7과 고 친화도, 예로서, 1 x 10^-7 M 이하의 K_D로 결합한다. 본 발명의 항-PTK7 항체는 하기 특징들중 하나 이상을 나타낸다:

(a) 인간 PTK7에 특이적으로 결합하거나;

(b) 빌름스 종양 세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-1441)에 결합한다.

바람직하게, 항체는 5 X 10^-8 M 이하의 K_D로 인간 PTK7과 결합하거나, 1 x 10^-8 M 이하의 K_D로 인간 PTK7과 결합하거나, 5 x 10^-9 M 이하의 K_D로 인간 PTK7과 결합하거나, 1 x 10^-8 M 내지 1 x 10^-10 M 이하의 K_D로 인간 PTK7과 결합한다. 바람직하게, 항체는 4.0 nM 이하의 EC₅₀으로 빌름스 종양 세포에 결합하거나, 3.5 nM 이하의 EC₅₀으로 빌름스 종양 세포에 결합한다. PTK7에 대한 항체의 결합능을 평가하는 표준 검정법이 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯, 및 RIA를 포함한다. 항체의 결합 동력학적 특성(예컨대, 결합 친화도) 또한 당업계에 공지된 표준 검정법, 예로서, ELISA, 스캐처드(Scatchard) 및 바이어코어(Biacore) 분석법에 의하여 평가할 수 있다. 또다른 일례로, 본 발명의 항체는 신장암종 종양 세포주, 예를 들면, 빌름스 종양 세포주에 결합할 수 있다. 상술한 특징들중 임의의 것을 평가하는데 적합한 검정법에 관하여는 실시예에 보다 상세히 기술되어 있다.

단일클론 항체 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8

본 발명의 바람직한 항체는 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 단리되고 구조적으로 특징지워진 인간 단일클론 항체 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8이다. 당업계의 통상의 숙련인은 항체 3G8 및 3G8a 뿐만 아니라, 항체 12C6 및 12C6a가 동일한 중쇄 서열을 갖는 반면, 그의 경쇄 서열은 상이하다는 것을 인지하여야 한다. 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 V_H 아미노산 서열은 서열 번호 1(3G8 및 3G8a), 2(4D5), 3(12C6 및 12C6a) 및 4(7C8)에 나타낸다. 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a, 및 7C8의 V_L 아미노산 서열은 각각 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9 및 10에 나타낸다.

이러한 항체들 각각이 PTK7과 결합할 수 있다면, V_H 및 V_L 서열은 "혼합 및 매치되어(mixed and matched)" 본 발명의 기타 항-PTK7 결합 분자를 생산할 수 있다. 그러한 "혼합 및 매치된" 항체의 PTK7 결합은 상술한 결합 검정법 및 실시예에 기술된 방법(예컨대, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게, V_H 및 V_L 쇄가 혼합 및 매치되는 경우, 특정 V_H/V_L 쌍으로부터의 V_H 서열은 구조적으로 유사한 V_H 서열로 대체된다. 유사하게, 특정 V_H/V_L 쌍으로부터의 V_L 서열은 구조적으로 유사한 V_L 서열로 대체되는 것이 바람직하다.

따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은

(a) 서열 번호 1, 2, 3 및 4로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(b) 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.

바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은:

(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 그의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 V_H CDR1의 아미노산 서열은 서열 번호 11(3G8 및 3G8a), 12(4D5), 13(12C6 및 12C6a) 및 14(7C8)에 나타낸다. 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 V_H CDR2의 아미노산 서열은 서열 번호 15(3G8 및 3G8a), 16(4D5), 17(12C6 및 12C6a) 및 18(7C8)에 나타낸다. 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 V_H CDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 19(3G8 및 3G8a), 20(4D5), 21(12C6 및 12C6a) 및 22(7C8)에 나타낸다. 3G8, 3GSa, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 V_K CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 23, 24, 25, 26, 27 및 28에 나타낸다. 3G8, 3GSa, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 V_K CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34에 나타낸다. 3G8, 3GSa, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 V_K CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40에 나타낸다. 카뱃 체계를 사용하여 CDR 영역을 라인으로 표시한다[Kabat, E. A., et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242].

이러한 항체들 각각이 PTK7과 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 제공될 경우, V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 V_K CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 "혼합 및 매치"되어(즉, 각각의 항체는 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3와, V_KCDR1, CDR2 및 CDR3을 함유해야 하지만, 상이한 항체로부터 유래된 CDR은 혼합 및 매치 될 수 있음), 본 발명의 기타 항-PTK7 결합 분자를 생산할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치된" 항체의 PTK7 결합은 상술한 결합 검정법과 실시예에 기술된 방법(예컨대, ELISA, 바이어코어 분석법)을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게, V_H CDR 서열이 혼합 및 매치될 때, 특정 V_H 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 유사하게, VK CDR 서열이 혼합 및 매치될 때, 특정 V_K 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 신규의 V_H 및 V_L 서열은 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L CDR 영역 서열을 단일클론 항체인 항체 G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8에 관하여 본원에 개시되어 있는 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 생산될 수 있다는 사실은 당업계의 숙련인에게 자명할 것이다.

따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은

(a) 서열 번호 11, 12, 13 및 14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 19, 20, 21 및 22로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 23, 24, 25, 26, 27 및 28로 구성된 군으로부터 선택되는 아 미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하고, PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.

바람직한 실시태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 29를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 30을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 27을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) 서열 번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, CDR3 도메인은 단독으로 동족체 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 가능하게는 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 여러 항체들을 생성할 수 있다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, ([Klimka et al, British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)](뮤린 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 도메인 CDR3만을 사용하여 인간화된 항-CD30 항체를 생산하는 것에 관하여 기재); [Beiboer et al, J. Mol Biol. 296:833-849 (2000)](모체 뮤린 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열만을 사용한 재조합 상피 당단백질-2(EGP-2) 항체에 관하여 기재); [Rader et.al, Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A. 95:8910-8915 (1998)(뮤린 항-인테그린 α_vβ₃ 항체 LM609의 중쇄 및 경쇄 가변 CDR3 도메인을 사용한 인간화된 항-인테그린 α_vβ₃ 항 체 패널로서, 여기에서, 각 구성원인 항체는 CDR3 도메인 바깥쪽에 있는 별개의 서열을 포함하고, 모체 뮤린 항체만큼 높거나, 그보다 더 높은 친화도를 갖는 모체 뮤린 항체와 동일한 에피토프와 결합할 수 있는 인간화된 항-인테그린 α_vβ₃ 항체 패널에 관하여 기재); [Barbas et al, J. Am . Chem . Soc . 116:2161-2162(1994)](항원 결합에 대하여 가장 중요한 것은 CDR3 도메인이라는 것을 개시); [Barbas et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 92:2529-2533 (1995)](항-파상풍 톡소이드 Fab의 중쇄상에 인간 태반 DNA에 대한 3개의 Fab(SI-1, SI-40, 및 SI-32)의 중쇄 CDR3 서열을 이식함으로써 현 중쇄 CDR3을 대체하는 것에 관하여 기재, 및 오직 CDR3 도메인만이 결합 특이성을 부여한다는 것에 관하여 입증); 및 [Ditzel et al, J. Immunol . 157:739-749 (1996)](모체 다중특이성 Fab LNA3의 중쇄 CDR3만을 단일특이성 IgG 파상풍 톡소이드-결합 Fab p313 항체의 중쇄로 전달하는 것이 모체 Fab의 결합 특이성을 보유하는데 충분하였다는 이식 연구에 관하여 기재))를 참조할 수 있다. 이들 참고 문헌 각각은 본원에서 그의 전문이 참고로 인용된다.

따라서, 본 발명은 인간 또는 인간을 제외한 동물로부터 유래된 항체로부터의, 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체를 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명은 인간을 제외한 것의 항체, 예로서, 마우스 또는 래트 항체로부터의, 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하며, PTK7에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 인간을 제외한 것의 항체로부터의, 하나 이상의 중 쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 본 항체는 상응하는 모체 인간을 제외한 것의 항체와 (a) 결합에 관하여 경쟁할 수 있고/거나; (b) 그의 기능상의 특징들을 보유하고/거나; (c) 그와 동일한 에피토프에 결합하고/거나; (d) 그와 동일한 결합 친화성을 갖는다.

다른 측면에서, 본 발명은 PTK7에 특이적으로 결합할 수 있는 인간 항체, 예를 들면, 인간을 제외한 동물로부터 수득한 인간 항체로부터의, 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 제1 인간 항체로부터의, 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체로서, 여기에서, 제1 인간 항체는 PTK7에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 제1 인간 항체로부터의 CDR3 도메인은 PTK7에 대한 결합 특이성이 결여되어 있는 인간 항체내 CDR3 도메인을 대체함으로써 PTK7에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 인간 항체를 생성하는 것인 단일클론 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 제1 인간 항체로부터의, 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 본 항체는 상응하는 모체 제1 인간 항체와 (a) 결합에 관하여 경쟁할 수 있고/거나; (b) 그의 기능상의 특징들을 보유하고/거나; (c) 그와 동일한 에피토프에 결합하고/거나; (d) 그와 동일한 결합 친화성을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 제1 인간 항체는 3G8, #g8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8이다.

특정 생식계열 서열을 갖는 항체

특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자로 부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.

예를 들면, 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인간 V_H 3-30.3 유전자의 산물이거나, 인간 V_H 3-30.3 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인간 V_H DP44의 산물이거나, 인간 V_H DP44로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인간 V_H 3-33 유전자의 산물이거나, 인간 V_H 3-33 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 추가의 또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인간 V_K L15 유전자의 산물이거나, 인간 V_K L15 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 추가의 또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인간 V_K A10 유전자의 산물이거나, 인간 V_K A10 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한 다. 추가의 또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인간 V_K A27 유전자의 산물이거나, 인간 V_K A27 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 추가의 또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인간 V_K L6 유전자의 산물이거나, 인간 V_K L6 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 PTK7, 바람직하게, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 추가의 또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 항체가:

(a) V_H 3-30.3, DP44 또는 3-33 유전자의 산물이거나, V_H 3-30.3, DP44 또는 3-33 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고(상기 유전자는 각각 서열 번호 51, 52 또는 53에 기재된 아미노산 서열을 코딩한다);

(b) 인간 V_K L15, A10, A27 또는 L6 유전자의 산물이거나, 인간 V_K L15, A10, A27 또는 L6 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고(상기 유전자는 각각 서열 번호 54, 55, 56 또는 57에 기재된 아미노산 서열을 코딩한다); 및

(c) PTK7에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.

각각 V_H 3-30.3 및 VK L15의 V_H 및 VK를 갖는 항체의 일례는 3G8 및 3G8a이다. V_H 3-30.3 및 VK A10의 V_H 및 V_K를 갖는 항체의 일례는 4D5이다. 각각 V_H DP44 및 VK A27의 V_H 및 V_K를 갖는 항체의 일례는 12C6이다. 각각 V_H DP44 및 V_K L15의 V_H 및 V_K를 갖는 항체의 일례는 12C6a이다. 각각 V_H 3-33 및 V_K L6의 V_H 및 V_K를 갖는 항체의 일례는 7C8이다.

본원에서 사용되는 바, 인간의 항체는 항체 가변 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 이용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 특정 생식계열 서열의 "산물"이거나 "그로부터 유래된 것"인 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은 인간의 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심의 대상이 되는 항원으로 면역화시키는 것, 또는 파지 상에 나타난 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심의 대상이 되는 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"이거나 "그로부터 유래된 것"인 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열과 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열을 비교한 후, 인간 항체의 서열과 가장 가까운 서열을 갖는(즉, 동일성(%)이 가장 큰) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 동정될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 인간 항체는 예로서, 천연적으로 존재하는 체세포 돌연변이 유발법 또는 위치-지정 돌연변이 유발법의 의도적인 도입으로 인하여, 생식계열 서열과 비교하였을 때, 아미노산에 차이가 있을 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 통상적으로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하였을 때, 아미노산 서열에 있어서 90% 이상 동일하고, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열(예컨 대, 뮤린 생식계열 서열)과 비교하였을 때, 인간 항체가 인간의 것임을 확인시켜 주는 아미노산 잔기들을 함유한다. 임의의 경우에 있어서, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하였을 때, 아미노산 서열이 95% 이상, 또는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상으로 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하로 아미노산이 상이할 것이다. 특정 경우에 있어서, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산이 상이할 수 있다.

상동성 항체

추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 본원에 기술된 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는데, 여기에서, 항체는 본 발명의 항-PTK7 항체의 바람직한 기능상의 성질을 보유한다.

예를 들면, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공하는데, 여기에서,

(a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1, 2, 3 및 4로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;

(b) 경쇄 가변 영역은 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하며;

본 항체는 하기 성질들중 하나 이상을 나타낸다:

(c) 항체는 1 x 10^-7 M 이하의 K_D로 인간 PTK7과 결합하고;

(d) 항체는 빌름스 종양 세포주에 결합한다.

다른 실시태양에서, V_H 및/또는 V_L 아미노산 서열은 상기 기재한 서열에 대해서 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 상기 기재한 서열의 V_H 및 V_L 영역에 대해서 높은(즉, 80% 이상) 상동성을 갖는 V_H 및 V_L 영역을 갖는 항체는 서열 번호 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발(예컨대, 위치-지정 또는 PCR-매개된 돌연변이 유발)에 이어, 코딩된 변형된 항체를 본원에 기술된 기능 검정법을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기 (c) 내지 (d)에 기재된 기능)에 대해서 시험함으로써 수득할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성(%)은 2개의 서열 사이의 동일성(%)과 등가이다. 2개의 서열 사이의 동일성(%)은 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수(즉, 상동성(%) = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)로서, 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려한 것이다. 서열 비교와 2개 서열 사이의 동일성(%)의 측정은 이하의 비-제한적 실시예에 기술된 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다.

2개의 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 ALIGN 프로그램(2.0 버전)에 활용되는 (E. Meyer) 및 (W. Miller)의 알고리즘[Comput . Appl . Biosci ., 4:11-17 (1988)]을 사용하여 측정될 수 있는데, 여기서는 PAM120 가중치 잔기 테이블, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 이용한다. 추가로, 2개 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 (Needleman) 및 (Wunsch)[J. Mol . Biol. 48:444-453 (1970)] 알고리즘을 이용하여 측정될 수 있는데, 이 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지(http:/www.gcg.com에서 입수 가능)의 GAP 프로그램에 활용되며, 또한 이는 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용한다.

추가적으로 또는 별법으로, 본 발명의 단백질 서열은 또한 예로서, 관련 서열들을 동정하기 위해 공중이 이용 가능한 데이터베이스에 대해 검색하기 위한 "의문 서열"로서 사용될 수도 있다. 이러한 검색은 XBLAST 프로그램(2.0 버전)을 통하여 이루어질 수 있다[Altschul, et at. (1990) J. Mol . Biol. 215:403-10]. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 워드 길이 = 3)을 통하여 행하여지며, 그 결과 본 발명의 항체 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교를 위하여 갭 형성 정렬을 얻기 위해서는, [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재되어 있는 바와 같이, 갭이 형성된 BLAST를 사용할 수 있다. BLAST 및 갭 형성 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개 변수를 사용할 수 있다. (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)를 참조할 수 있다.

보존적 변형을 갖는 항체

특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 데, 여기에서, 이들 CDR 서열들중 하나 이상은 본원에 기술된 바람직한 항체(예컨대, 3G8, 3GSa, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8)에 기초하여 특정 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변형체를 포함하고, 상기 항체는 본 발명의 항-PTK7 항체의 바람직한 기능상의 성질을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공하는데, 여기에서,

(a) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 번호 19, 20, 21 및 22로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형체를 포함하고;

(b) 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형체를 포함하고;

본 항체는 하기 성질들중 하나 이상을 나타낸다:

(c) 인간 PTK7에 특이적으로 결합하고;

(d) 빌름스 종양 세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-1441)에 결합한다.

바람직한 실시태양에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 번호 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형체를 포함한다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 번호 11, 12, 13 및 14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 번호 23, 24, 25, 26, 27 및 28로 구성된 군 으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형체를 포함한다.

본원에 사용된 "보존적 서열 변형"이란 용어는, 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의적인 영향을 미치지 않거나, 이를 변형시키지 않는 아미노산의 변형을 지칭하는 것이다. 그러한 보존적 변형으로서는 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기법, 예로서, 위치-지정 돌연변이 유발법 및 PCR-매개 돌연변이 유발법에 의하여 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 경우이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 군은 당업계에 규명되어 있다. 이러한 군으로서는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 아스파르트산 및 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 및 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌 및 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 트레오닌, 발린 및 이소류신), 및 방향성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 군에 속하는 다른 아미노산 잔기와 대체될 수 있으며, 변경된 항체는 본원에 기술된 기능 검정법의 사용으로 보유하고 있는 기능(즉, 상기 (c) 및 (d)에 기재된 기능)에 대해 시험될 수 있다.

본 발명의 항-PTK7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체

또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 PTK7 단일클론 항체중 임의의 것과 동일한, 인간 PTK7 상의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다(즉, 본 발명의 단일클론 항체중 임의의 항체와 PTK7 결합에 대해 교차-경쟁하는 성질을 갖는 항체). 바람직한 실시태양에서, 교차-경쟁 연구에 대한 기준 항체는, 단일클론 항체 3G8(서열 번호 1 및 5에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 갖는 항체), 또는 단일클론 항체 3G8a(서열 번호 1 및 6에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 갖는 항체), 또는 단일클론 항체 4D5(서열 번호 2 및 7에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 갖는 항체), 또는 단일클론 항체 12C6(서열 번호 3 및 8에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 갖는 항체), 또는 단일클론 항체 12C6a(서열 번호 3 및 9에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 갖는 항체), 또는 단일클론 항체 7C8(서열 번호 4 및 10에 각각 나타낸 V_H 및 V_L 서열을 갖는 항체)일 수 있다. 그러한 교차-경쟁 항체는 표준 PTK7 결합 검정법에서 이 항체가 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8과 교차-경쟁하는 능력에 기초하여 동정될 수 있다. 예를 들면, 바이어코어 분석법, ELISA 검정법 또는 유동 세포 분석법은 본 발명의 항체와의 교차-경쟁 능력을 입증하는데에 사용될 수 있다. 시험 항체가 예로서, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8과 인간 PTK7의 결합을 저해하는 능력을 통하여, 이 시험 항체는 인간 PTK7과의 결합에 대해 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8과 경쟁할 수 있으므로, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8과 동일한, 인간 PTK7 상의 에피토프와 결합함을 알 수 있다. 바람직한 실시태 양에서, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8과 동일한, 인간 PTK7 상의 에피토프와 결합하는 항체는 인간 단일클론 항체이다. 그러한 인간 단일클론 항체는 실시예에 기술된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다.

조작 및 변형된 항체

본 발명의 항체는 또한 출발 물질로서 본원에 기술된 V_H 및/또는 V_L 서열중 하나 이상을 갖는 항체를 이용하여 제조되어 변형된 항체를 조작할 수 있는데, 여기에서, 변형된 항체는 출발 항체와는 다른 성질을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 2개의 가변 영역(즉, V_H 및/또는 V_L), 예로서, 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 존재하는 하나 이상의 잔기들을 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 별법으로, 항체는 불변 영역(들) 내에 존재하는 잔기들을 변형시켜 조작함으로써, 예를 들면, 항체의 효과기 기능(들)을 변형시킬 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형으로는 CDR 이식이 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 내에 존재하는 아미노산 잔기들을 통하여 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내에 존재하는 아미노산 서열은 각각의 항체 간에 있어서 CDR 외부 서열보다 더욱 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용에 관여하므로, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터 유래된 프레임워크 서열에 특정한 천연적으로 생성된 항체로부터 유래된 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제함으로써 특정한 천연적으로 생성된 항체의 성질을 모사 하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다(예컨대, [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Queen, C. et al. (1989) Proc . Natl . Acad . See . U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 제5,225,539호(Winter), 및 미국 특허 번호 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제 5,693,762호 및 제6,180,370호(Queen et al.)을 참조할 수 있다).

따라서, 본 발명의 또다른 실시태양은 각각 서열 번호 11, 12, 13 및 14, 서열 번호 15, 16, 17 및 18 및 서열 번호 19, 20, 21 및 22로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 번호 23, 24, 25, 26, 27 및 28, 서열 번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34 및 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이다. 따라서, 그러한 항체는, 이들 항체와 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있는 단일클론 항체 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8을 함유할 수 있다.

그러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고 문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열에 관하여는 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(인터넷 상에서 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능) 및 ([Kabat, E. A., et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol . Biol . 227:776-798]; 및 [Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur . J. Immunol . 24:827-836](이들 각각의 내용은 본원에서 명확하게 참고로 인용된다)를 참조할 수 있다)에서 찾아볼 수 있다. 또다른 일례로, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 진뱅크 데이타베이스에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견된 하기 중쇄 생식계열 서열은 첨부하는 진뱅크 수탁 번호: 1-69(NG_0010109, NT_024637 및 BCO7O333), 3-33(NG_0010109 및 NT_024637) 및 3-7(NGJ)010109 및 NTJ)24637)로 이용가능하다. 또다른 일례로, HCo 12 HuMAb 마우스에서 발견된 하기 중쇄 생식계열 서열은 첨부하는 진뱅크 수탁 번호: 1-69(NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 5-51(NG_0010109 및 NT_024637), 4-34(NG_0010109 및 NT_024637), 3-30.3(?) 및 3-23(AJ406678)으로 이용가능하다.

항체 단백질 서열은 당업자에게 잘 알려진 소위 갭 형성 BLAST[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402]라고 불리는 서열 유사성 검색 방법중 하나를 사용하여 종합된 단백질 서열 데이타베이스에 대해 비교한다. BLAST는 항체 서열과 데이타베이스 서열 간에 통계적으로 유의성이 있는 배열이 배열된 워드의 하이-스코어링 분절 쌍(HSP: high-scoring segment pairs)을 포함하기 쉬운 발견적 알고리즘이다. 스코어가 신장이나 트리밍에 의하여 개선될 수 없는 분절 쌍은 "히트(hit)"로 불린다. 간략하게는, VBASE 유래의 뉴클레오티드 서열(vbase . mrc - cpe . cam . ac . uk / vbasel / list2 . php)는 전사되고 FR1 내지 FR3 프레임워크 영역 사이의 영역 및 이를 포함하는 영역은 보유된다. 데이타베이스 서열은 98 잔기의 평균 길이를 갖는다. 단백질의 전체 길이에 걸쳐 정확하게 매치하는 중복 서열이 제거된다. 디폴트, 턴 오프된 낮은 복잡도 필터를 제외한 표준 파라미터 및 블로섬62의 치환 매트릭스로 프로그램 blastp를 사용하여 단백질에 대한 BLAST 검색은 상부 5개의 히트를 여과한다. 뉴클레오티드 서열은 총 6개의 프레임으로 전사되고, 데이타베이스 서열의 매치 분절에서 정지 코돈을 갖지 않는 프레임은 잠정적인 히트로 간주된다. 이것은 다시, 총 6 개의 프레임에서 항체 서열을 전사하고, 이들 전사체를 총 6개의 프레임에서 동력학적으로 전사된 VBASE 뉴클레오타이드 서열과 비교하는BLAST 프로그램 tblastx를 사용하여 확인된다.

동일성은 서열의 전체 길이에 걸쳐 단백질 데이타베이스와 항체 서열 사이의 정확한 아미노산 매치이다. 양성(동일성 + 치환 매치)은 블로섬62 치환 매트릭스에 의해서 유도된 동일하지 않은 아미노산 치환이다. 만일 항체 서열이 2개의 데이타베이스 서열과 같은 동일성으로 매치된다면, 가장 양성인 히트가 매치되는 서열 히트인 것으로 결정된다.

본 발명의 항체에 사용하기 위한 바람직한 프레임워크 서열은 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조상 유사한 것, 예컨대, 본 발명 의 바람직한 단일클론 항체에 의해 사용되는 V_H 3-30.3 프레임워크 서열(서열 번호 51) 및/또는 VH DP44 프레임워크 서열(서열 번호 52) 및/또는 V_H 3-33 프레임워크 서열(서열 번호 53) 및/또는 V_K L15 프레임워크 서열(서열 번호 54) 및/또는 V_K A10 프레임워크 서열(서열 번호 55) 및/또는 V_K L15 프레임워크 서열(서열 번호 54) 및/또는 V_K A27 프레임워크 서열(서열 번호 56) 및/또는 V_K L15 프레임워크 서열(서열 번호 54) 및/또는 V_K L6 프레임워크 서열(서열 번호 57)과 유사한 것이다. V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 V_K CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 프레임워크 서열이 유도되는 생식계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 이식될 수 있거나, CDR 서열은 생식계열 서열에 비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프레임워크 영역 상에 이식될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에는 항체의 항원 결합능을 유지하거나 증진시키기 위하여 프레임워크 영역 내에서 잔기를 변이시키는 것이 유리하다고 밝혀졌다(예컨대, 미국 특허 번호 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호(Queen et al)를 참조할 수 있다).

또다른 유형의 가변 영역 변형은 V_H 및/또는 V_K CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이하여 관심의 대상이 되는 항체의 하나 이상의 결합 성질(예컨대, 친화도)을 개선하기 위한 것이다. 위치-지정 돌연변이 유발법 또는 PCR-매개 돌연변이 유발법은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 실시될 수 있고, 항 체 결합에 대한 효과, 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 성질은 본원에 기술되어 있는 것과 같이, 그리고 실시예에서 제공되는 것과 같이 시험관내 또는 생체내에서 평가될 수 있다. 바람직하게, (상기 논의되어 있는 바와 같은) 보존적 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 치환이 바람직하다. 게다가, 전형적으로는 CDR 영역 내에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.

따라서, 또다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 11, 12, 13 및 14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11, 12, 13 및 14와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR1 영역; (b) 서열 번호 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 15, 16, 17 및 18과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR2 영역; (c) 서열 번호 19, 20, 21 및 22로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 19, 20, 21 및 22와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR3 영역; (d) 서열 번호 23, 24, 25, 26, 27 및 28로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 23, 24, 25, 26, 27 및 28과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_K CDR1 영역; (e) 서열 번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34로 구성된 군으로부터 선택되는 아 미노산 서열, 또는 서열 번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_K CDR2 영역; 및 (f) 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_K CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-PTK7 단일클론 항체, 또는 그의 항원 결합부를 제공한다

본 발명의 조작된 항체에는 변형이 V_H 및/또는 V_K 내의 프레임워크 잔기에 대해서 이루어져, 예컨대, 항체의 성질을 개선시키는 것이 포함된다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키도록 이루어진다. 예를 들면, 한가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "복귀 돌연변이(backmutate)"시키는 것이다. 더욱 특히, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 항체가 유도된 생식계열 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유도된 생식계열 서열과 비교함으로써 동정될 수 있다.

예를 들면, 3G8(및 3G8a)의 경우, V_H의 (FR1 내의) 28번 아미노산 잔기는 이소류신인 반면, 상응하는 V_H 3-30.3 생식계열 서열에서의 잔기는 트레오닌이다. 프레임워크 영역 서열을 그들의 생식계열 배열로 복귀시키기 위해서, 체세포 돌연변 이는 예를 들면, 위치-지정 돌연변이 유발법 또는 PCR-매개된 돌연변이 유발법에 의해서 생식계열 서열로 "복귀 돌연변이"될 수 있다(예컨대, 3G8(및 3G8a)의 V_H의 FR1 내의 28번 잔기는 이소류신으로부터 트레오닌으로 "복귀 돌연변이"될 수 있다).

또다른 일례로서, 12C6(및 12C6a)의 경우, V_H의 (FR2 내의) 44번 아미노산 잔기는 트레오닌인 반면, 상응하는 VH DP44 생식계열 서열에서의 잔기는 글리신이다. 프레임워크 영역 서열을 그들의 생식계열 배열로 복귀시키기 위해서, 예를 들면, 12C6(및 12C6a)의 V_H의 44번 잔기(FR2의 9번 잔기)는 트레오닌으로부터 글리신으로 "복귀 돌연변이"될 수 있다. 그러한 "복귀 돌연변이된" 항체 또한 본 발명에 포함되는 것으로 한다.

또다른 유형의 프레임워크 변형에는 프레임워크 영역 내의, 또는 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것이다. 이러한 접근법 또한 "면역제거 (deimmunization)"로 불리며, 미국 특허 공개 번호 제20030153043호(Carr et al .)에 추가로 상세히 기재되어 있다.

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 이외에도, 또는 그에 대한 별법으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 예로서, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존적 세포성 세포 독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 변화시키기 위하여 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 추가 로, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예컨대, 하나 이상의 화학적 부위를 항체에 부착시킬 수 있다), 그의 글리코실화를 변화시키고, 다시 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 변화시키기 위하여 변형될 수 있다. 이러한 각 실시태양은 이하에 더 상세하게 기술된다. Fc 영역에서 잔기의 번호 매김 방식은 카뱃의 EU 인덱스의 것이다.

하나의 실시태양에서, CH1의 힌지 영역은 변형되어 힌지 영역 내에 존재하는 시스테인 잔기의 수는 변화되는데, 예컨대, 증가 또는 감소된다. 이러한 접근법에 관하여는 미국 특허 번호 제5,677,425호(Bodmer et al.)에 더 상세히 기술되어 있다. CH1의 힌지 영역 내에 존재하는 시스테인 잔기의 수는 예를 들면, 경쇄 또는 중쇄의 조립을 촉진하거나, 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변화된다.

다른 실시태양에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 돌연변이되어 항체의 생물학적 반감기를 감소시킬 수 있다. 더욱 특히, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면부에 도입되면, 항체는 원래의 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여 스타필로코실 단백질 A(SpA: Staphylococcyl protein A) 결합에 손상을 입게 된다. 이러한 접근법에 관하여는 미국 특허 번호 제6,165,745호(Ward et al.)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

또다른 실시태양에서, 항체는 변형되어 그의 생물학적 반감기가 증가할 수 있다. 이에는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 다음과 같은 돌연변이중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F(미국 특허 번호 제6,277,375호(Ward et al.). 별법으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서, 항체는 미국 특허 번호 제5,869,046호 및 제6,121,022호(Presta et al.)에 기재되어 있는 바와 같이, 항체의 CH1 또는 CL 부위 내에 변형이 일어나 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 채택된 구제 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 부위 내에서 변형될 수 있다.

추가의 다른 실시태양에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 효과기 기능(들)을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들면, 항체가 효과기 리간드에 대한 친화성은 변경되지만, 모 항체의 항원 결합능은 보유하도록, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322번 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 친화성이 변경된 효과기 리간드는 예를 들면, 보체의 C1 성분 또는 Fc 수용체일 수 있다. 이러한 접근법에 관하여는 미국 특허 번호 제5,624,821호 및 제5,648,260호(둘 모두 Winter et al.)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

또다른 예에 있어서, 항체가 변화된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 소멸된 보체 의존적 세포 독성(CDC: complement dependent cytotoxicity)을 갖도록 329, 331 및 322번 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 이러한 접근법에 관하여는 미국 특허 번호 제6,194,551호(Idusogie et al.)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

또다른 예에 있어서, 231 및 239번 아미노산 위치 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시킬 수 있는 항체의 능력을 변경시킬 수 있다. 이러한 접근법에 관하여는 PCT 공보 WO94/29351(Bodmer et al.)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

추가의 또다른 예에 있어서, Fc 영역은 항체가 항체 의존성 세포내 세포 독성(ADCC: antibody dependent cellular cytotoxicity)을 매개하는 능력을 증가시키고/거나, 하기 위치: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439번 위치의 아미노산중 하나 이상을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 이러한 접근법에 관하여는 PCT 공보 WO 00/42072(Presta)에 더욱 상세히 기술되어 있다. 게다가, 인간 IgG1 상에 존재하는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 위치는 이미 지도화되어 있으며, 결합이 개선된 변이체에 관하여는 기재되어 있다([Shields, R.L. et al.(2001) J. Biol . Chem . 276:6591-6604]를 참조할 수 있다). 256, 290, 298, 333, 334 및 339번 위치에서 발생한 특이적 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 하기 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.

추가의 또다른 실시태양에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들면, 글리코실화되지 않은 항체(즉, 글리코실화가 일어나지 않는 항체)가 생산될 수 있다. 글리코실화는 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화성이 증가하도록 변경될 수 있 다. 이러한 당질 변형은 예를 들면, 항체 서열 내에서 글리코실화에 관여하는 위치들중 하나 이상의 위치를 변경시킴으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 위치를 제거하여 이 위치에서 글리코실화가 일어나지 않도록 만드는 하나 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법에 관하여는 미국 특허 번호 제5,714,350호 및 제6,350,861호(Co et al.)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

추가적으로 또는 별법으로, 글리코실화 유형이 변경된 항체, 예로서, 푸코실 잔기 수가 감소된 하이포푸코실화된 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가한 항체가 생산될 수 있다. 이와 같이 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 당질 변형은 예를 들면, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 이루어질 수 있다. 변형된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기술되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜, 글리코실화가 변경된 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8(알파(1,6)푸코실트랜스퍼라제)가 결여되어 있어서, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체들은 이 항체의 당질에 푸코스가 존재하지 않는다. 상기 Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8^-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포내 FUT8 유전자를 표적 파괴하여 생산되었다(미국 특허 공개 번호 제20040110704 호(Yamane et al.) 및 [Yamane-Ohnuki et al.(2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22]를 참조할 수 있다). 또다른 일례로, EP 1,176,195(Hanai et al.)에는, FUT8 유전자가 기능상 파괴된 세포주에 관하여 기술되어 있는데, 상기 유전자는 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 바, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거하여 하이포푸코실화된다. (Hanai et al.)에 의한 문헌에는 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 효소 활성이 낮은 세포주, 또는 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들면, 래트 골수종 세포주인 YB2/0(ATCC CRL 1662)에 관하여 기술되어 있다. PCT 공보 WO 03/035835(Presta)에는, 변이체 CHO 세포주, 푸코스를 Asn(297)-결합 당질에 결합시키는 능력이 감소되었으며, 또한 이 숙주 세포내 발현된 항체를 하이포푸코실화시키는 Lec13 세포에 관하여 기술되어 있다([Shields, R.L. et al.(2002) J. Biol . Chem. 277:26733-26740]도 참조할 수 있다). PCT 공보 WO 99/54342(Umana et al.)에는, 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예컨대, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제III(GnTIII))를 발현하도록 세포주를 조작하여, 이 조작된 세포주 내에서 발현된 항체의 이분화 GlcNAc 구조가 증가하도록 만들고, 결국에는 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것에 관하여 기술되어 있다([Umana et al.(1999) Nat . Biotech. 17 :176-180]도 참조할 수 있다). 별법으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 제거할 수 있다. 예를 들면, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다[Tarentino, A.L. et al.(1975) Biochem . 14:5516-23].

본 발명에 의해 주시되는 본원의 항체의 다른 변형으로서는 페길 화(pegylation)가 있다. 항체는 페길화되어, 예를 들면, 항체의 생물학적(예를 들면, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체 또는 그의 단편을, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 결합하는 조건하에서, 전형적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol), 예로서, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게, 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 이루어진다. 본원에 사용된 "폴리에틸렌 글리콜"이란 용어는, 기타 단백질을 유도체화하는데에 사용되는 임의 형태의 PEG, 예로서, 모노(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 의미이다. 특정 실시태양에서, 페길화되는 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 단백질을 페길화하는 방법에 관하여는 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들면, EP 0 154 316(Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384(Ishikawa et al.)를 참조할 수 있다.

항체의 물리적 성질

본 발명의 항체는 항-PTK7 항체의 다양한 물리적 성질에 의해서 추가로 특징화될 수 있다. 이들 물리적 성질을 기초로 하여 상이한 부류의 항체를 검출 및/또는 식별하기 위해서 다양한 검정법이 사용될 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역내 하나 이상의 글리코실화 위치를 함유할 수 있다. 가변 영역내 하나 이상의 글리코실화가 존재하는 경우, 항원 결합의 변경으로 인하여 항체의 면역원성은 증가할 수 있거 나, 항체의 pK는 변경될 수 있다([Marshall et al. (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702]; [Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94]; [Wallick et al., (1988) J Exp Med 168: 1099-109]; [Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R]; [Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7]; [Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706]). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 부분에서 일어나는 것으로 알려져 있다. 가변 영역 글리코실화는, 항체를 분해시켜 Fab를 생성시킨 후, 과요오드 산화 반응 및 시프(Schiff) 염기 형성을 측정하는 검정법을 사용하여 글리코실화에 대해서 시험하는 글리코블롯(Glycoblot) 검정법을 사용하여 시험할 수 있다. 별법으로, 가변 영역 글리코실화는 Fab로부터 당류를 단당류로 분해시키고, 각각의 당류 함량을 분석하는 디오넥스 광학 크로마토그래피(Dionex-LC: Dionex light chromatography)를 사용하여 시험할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 가변 영역 글리코실화를 함유하지 않는 항-PTK7 항체가 바람직하다. 가변 영역내 글리코실화 부분을 함유하지 않는 항체를 선택하거나, 당업계에 잘 알려진 표준 기법을 사용하여 글리코실화 부분 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 아스파라긴 이성체화 위치를 함유하지 않는다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 각각 N-G 또는 D-G 서열 상에서 나타날 수 있다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 주쇄보다는 측쇄 카복시 말단의 꼬인 구조(kinked structure)를 형성함으로써 항체의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산을 생성한다. 이소아스파르트산의 생성은 이소아스파르트산을 시험하기 위하여 역상 HPLC를 사용하는 이소-콴트 검정법(iso-quant assay)을 사용하여 측정될 수 있다.

각각의 항체는 독특한 등전점(pI: isoelectric point)을 가질 수 있지만, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5 사이의 pH 범위에 속할 수 있다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7-9.5의 pH 범위에 속하며, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6-8의 pH 범위에 속한다. 항체는 이 범위를 벗어나는 pI를 가질 수도 있다. 효과는 일반적으로 공지되어 있지 않지만, 정상적인 범위를 벗어나는 pI를 갖는 항체가 생체내 조건하에서 약간의 언폴딩 및 불안정성을 가질 수 있는 것으로 추측된다. 등전점은 pH 구배를 발생시키고 증가된 정확도를 위해서 레이저 집중화를 이용할 수 있는 모세관 등전성 집중화 검정법(capillary isoelectric focusing assay)을 사용하여 시험할 수 있다 ([Janini et al. (2002) Electrophoresis 23:1605-11]; [Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89]; [Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67]). 몇몇 경우에는, 정상 범위에 속하는 pI 값을 함유하는 항-PTK7 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택하거나, 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 표준 기술을 사용하여 하전된 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

각각의 항체는 열안정성을 지시하는 융점을 가질 것이다[Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71]. 더 큰 열안정성은 생체내에서의 더 큰 전반적인 항체 안정성을 나타낸다. 항체의 융점은 시차주사열량분석과 같은 기술을 사용하여 측정될 수 있다([Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; [Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett 68:47-52]). T_M1은 항체의 초기의 언폴딩 온도를 나타낸다. T_M2는 항체의 완전 언폴딩 온도를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 T_M1은 60℃ 초과, 바람직하게는 65℃ 초과, 더더욱 바람직하게는 70℃ 초과인 것이 바람직하다. 별법으로, 항체의 열안정성은 원편광 이색성을 사용하여 측정될 수 있다[Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9].

바람직한 실시태양에서, 빠르게 분해되지 않는 항체가 선택된다. 항-PTK7 항체의 분획화는 당업계에서 잘 이해되고 있는 바와 같이 모세관 전기영동(CE: capillary electrophoresis) 및 MALDI-MS를 사용하여 측정될 수 있다[Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32].

또다른 바람직한 실시태양에서, 최소의 응집 효과를 갖는 항체가 선택된다. 응집은 원치 않는 면역반응 및/또는 변화되거나 바람직하지 않은 약물 동력학적 성질의 유발을 유도할 수 있다. 일반적으로, 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 더 더욱 바람직하게는 15% 이하, 더 더욱 바람직하게는 10% 이하, 더욱더 바람직하게는 5% 이하의 응집을 갖는 항체가 허용될 수 있다. 응집은 크기-배제 칼럼(SEC: size-exclusion column), 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC: high performance liquid chromatography), 및 단량체, 이량체, 삼량체, 또는 다량체를 확인하기 위한 광산란을 비롯한, 당업계에 잘 알려져 있는 수개의 기법에 의해서 측정될 수 있다.

항체를 조작하는 방법

상기에서 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 V_H 및 V_K 서열을 갖는 항-PTK7 항체를 사용하여 V_H 및/또는 V_K 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 항-PTK7 항체를 생성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 항-PTK7 항체, 예컨대 3G8, 3GSa, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8의 구조적 특징을 사용하여 인간 PTK7에 결합하는 것과 같은 본 발명의 항체의 기능적 성질을 1개 이상 보유하는, 구조적으로 관련된 항-PTK7 항체를 생성한다. 예를 들면, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8, 또는 그의 돌연변이의 하나 이상의 CDR 영역을 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDRs와 재조합적으로 결합시켜 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합적으로-조작된 항-PTK7 항체를 생성시킬 수 있다. 다른 유형의 변형에는 이전의 섹션에 기술된 것을 포함한다. 조작방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공된 하나 이상의 V_H 및/또는 V_K 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성시키기 위해서, 본원에 제공된 하나 이상의 V_H 및/또는 V_K 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영여을 갖는 항체를 실제로 제조(즉, 단백질로서 발현)할 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유도된 "제2 세대" 서열(들)을 생성시킨 다음에, "제2 세대" 서열(들)을 제조하고 단백질로 발현시킨다.

따라서, 또다른 실시태양에서 본 발명은

(a) (i) 서열 번호 11, 12, 13 및 14로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, (b) 서열 번호 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR2 서열, 및 /또는 서열 번호 19, 20, 21 및 22로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 번호 23, 24, 25, 26, 27 및 28로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, 서열 번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR2 서열, 및 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하고;

(b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 1종 이상의 항체 서열을 생성하고;

(c) 단백질로서 변경된 항체 서열을 발현시키는 단계를 포함하는, 항-PTK7을 제조하는 방법을 제공한다.

변경된 항체 서열을 제조하고 발현시키는데 표준 분자생물학 기법이 사용될 수 있다.

바람직하게, 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는 본원에 기술된 항-PTK7 항체의 기능적 성질을 하나, 몇몇 또는 모두를 보유하는 것으로, 상기의 기능적 성질로는

(a) 항체가 1 x 10^-7 M 이하의 K_D로 인간 PTK7과 결합하고;

(b) 항체는 빌름스 종양 세포주에 결합하는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

변경된 항체의 기능적 성질은 당업계에서 이용가능하고/거나, 본원에 기술된 표준 검정법, 예로서, 본 실시예에 기재되어 있는 것(예컨대, 유동 세포 분석법, 결합 검정법)을 사용하여 평가될 수 있다.

본 발명의 항체를 조작하는 방법에 관한 특정 실시태양에서, 돌연변이는 항-PTK7 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부에 따라서 무작위적으로 또는 선택적으로 도입될 수 있으며, 생성된 변형된 항-PTK7 항체는 본원에 기술된 바와 같이 결합 활성 및/또는 다른 기능적 성질에 대해서 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 개시되어 있다. 예를 들면, PCT 공보 WO 02/092780(Short)은 포화 돌연변이 유발법, 합성적 결찰 조립, 또는 그의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 발생시키고 스크리닝하는 방법을 기재하고 있다. 별법으로, PCT 공보 WO 03/074679(Lazar et al.)는 항체의 물리화학적 성질을 최적화시키기 위하여 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기재하고 있다.

본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이 핵산은 전 세포(whole cell), 세포 용해물중에 존재할 수 있거나, 부분적으로 정제 또는 실질적으로 순수한 형태일 수 있다. 핵산은 알칼리 처리/SDS 처리, CsCl 밴딩(CsCl banding), 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 기타 당업계에 잘 알려져 있는 기법을 비롯한 표준 기법에 의해 기타 세포 성분 또는 기타 오염물, 예컨대, 기타 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제되었을 때, "단리된" 또는 "실질적으로 순수하게 제조된" 것이다. [F. Ausubel et al. ed(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조할 수 있다. 본 발명의 핵산은, 예를 들면, DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 함유하거나, 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 핵산은 cDNA 분자이다.

본 발명의 핵산은 표준 분자생물학 기법을 이용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마(예컨대, 이하 더욱 상세히 기술된 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의하여 발현된 항체에 있어서, 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭법 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해 수득할 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한(예컨대, 파지 디스플레이 기법 이용) 항체에 있어서, 이 항체를 코딩하는 핵산은 상기 라이브러리로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 바람직한 핵산 분자는 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 또는 7C8 단일클론 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 것이다. 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 VH 서열을 코딩하는 DNA 서열은 서열 번호 41(3G8 및 3G8a), 42(4D5), 43 (12C6 및 12C6a) 및 44(7C8)에 나타낸다. 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8의 VL 서열을 코딩하는 DNA 서열은 각각 서열 번호 45, 46, 47, 48, 49 및 50에 나타낸다.

일단 VH 및 VL 분절을 코딩하는 DNA 단편을 수득하면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기법에 의해 추가로 조작하여 예를 들면, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이러한 조작 과정에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또다른 단백질을 코딩하는 DNA 단편 예 로서, 항체 불변 영역 또는 가요성 링커에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해서 코딩된 아미노산 서열이 프레임 내에 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미하고자 하는 것이다.

VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA를 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간의 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있으며(예컨대, [Kabat, E.A. et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242]를 참조할 수 있다), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭법에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나, IgG1 또는 IgG4 불변 영역이 가장 바람직하다. Fab 단편 중쇄 유전자에 있어서, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만이 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다.

VL 부위를 코딩하는 단리된 DNA는, VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역인 CL을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있으며(예컨대, [Kabat, E. A. et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]를 참조할 수 있다), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭법에 의하여 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카 파 또는 람다 불변 영역일 수 있지만, 카파 불변 영역이 가장 바람직하다.

scFv 유전자를 생산하기 위해서, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편은 가요성 링커, 예컨대, 아미노산 서열(Gly₄-Ser)₃을 코딩하는 또다른 단편에 작동적으로 연결시킴으로써 VH 및 VL 서열이 가요성 링커에 의해 결합되어 인접한 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 할 수 있다(예로서, [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554]을 참조할 수 있다).

본 발명의 단일클론 항체의 생산

본 발명의 단일클론 항체(mAb)는 종래의 단일클론 항체 방법 예컨대, 표준 체세포 혼성화 기법[Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]을 비롯한, 다양한 기법에 의해 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 바람직하지만, 원칙적으로 단일클론 항체를 생산하는 다른 기법, 예컨대, B 림프구의 바이러스 형질전환 기법 또는 발암 형질전환 기법도 사용할 수 있다.

하이브리도마를 생산하는데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생산하는 방법은 매우 잘-확립된 방법이다. 융합용으로 면역화된 비장 세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기법은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예컨대, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화된 항체는 전술한 바와 같이 제조된 뮤린의 단일클론 항체의 서열을 기초로 하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA는 관심의 대상이 되는 뮤린의 하이브리도마로부터 수득할 수 있으며, 표준 분자생물학적 기법을 이용하여 뮤린을 제외한 동물(예컨대, 인간)의 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생산하기 위해서, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린의 가변 영역을 인간의 불변 영역에 연결시킬 수 있다(예컨대, 미국 특허 번호 제4,816,567호(Cabilly et al.)를 참조할 수 있다). 인간화된 항체를 생산하기 위해, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린의 CDR 영역들을 인간 프레임워크에 삽입할 수 있다(예컨대, 미국 특허 번호 제5,225,539호(Winter) 및 미국 특허 번호 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제 6,180,370호(Queen et al)를 참조할 수 있다).

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간의 단일클론 항체이다. PTK7 에 대해 유도된 인간의 단일클론 항체는 마우스계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 마우스 또는 트랜스염색체 함유 마우스를 이용하여 생산될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 함유 마우스로서는 HuMAb 마우스 및 KM 마우스™라 불리는 마우스를 포함하며, 이들을 총칭하여 본원에서는 "인간 Ig 마우스"라 부른다.

HuMAb 마우스?(Medarex, Inc.)는 정렬되지 않은 인간의 중쇄(μ 및 γ)와 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간의 면역글로불린 유전자 미니 유전자좌(miniloci)와, 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화하는 표적화된 돌연변이를 함유한다(예로서, [Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859]를 참조할 수 있다). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ를 조금 발현시키고, 면역화됨 에 따라서, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스 유전자는 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 일으켜 고 친화성 인간 IgGκ 단일클론 항체를 생산한다([Lonberg, N. et al. (1994), 상기 동일 문헌]; [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol. 13: 65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann . N.Y. Acad . Sci. 764:536-546]). HuMab 마우스의 제조 및 사용 방법과 마우스에 의해 수행되는 게놈 변형에 관하여는 ([Taylor, L. et al (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:3720-3724]; [Choi et al (1993) Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830]; [Tuaillon et al (1994) J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al (1994) International Immunology 6: 579-591]; 및 [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851](상기 문헌에 기술된 내용은 모두 그 자체로서 참고로 인용된다))에 더욱 상세히 기술되어 있다. 추가로, 미국 특허 번호 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호(모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 번호 제5,545,807호(Surani et al); PCT 공보 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962(Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공보 WO 01/14424(Korman et al.)를 참조할 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스잔 및 트랜스염색체 상에 인간의 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예로서, 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 마우스 본원에서는 "KM 마우스™"라 지칭하며, 이에 관하여는 PCT 공보 WO 02/43478(Ishida et al.)에 상세히 기재되어 있다.

추가로, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대체 트랜스제닉 동물 시스템도 당업계에서 이용가능하며, 이를 본 발명의 항-PTK7 항체를 생성하는데에 사용할 수 있다. 예를 들면, 제노마우스(Xenomouse)(Abgenix, Inc.)라 불리는 대체 트랜스제닉계가 사용될 수 있으며; 이 마우스에 관하여는, 예로서, 미국 특허 번호 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호(Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.

게다가, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대체 트랜스염색체 동물 시스템도 당업계에서 이용가능하며, 이를 본 발명의 항-PTK7 항체를 생성하는데에 사용할 수 있다. 예로서, "TC 마우스"로 불리는 인간 중쇄 트랜스염색체와 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 모두를 보유하는 마우스가 사용될 수 있으며; 이 마우스에 관하여는 [Tomizuka et al.(2000) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 추가로, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 소는 당업계에 공지되어 있으며[Kuroiwa et al.(2002) Nature Biotechnology 20:889-894), 이 또한 본 발명의 항-PTK7 항체를 생성하는데에 사용될 수 있다.

본 발명의 인간 단일클론 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러 리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 이와 같이, 인간 항체를 단리시키기 위한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호(Ladner et al.); 미국 특허 번호 제5,427,908호 및 제5,580,717호(Dower et al.); 미국 특허 번호 제5,969,108호 및 제6,172,197호(McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호(Griffiths et al.)를 참조할 수 있다.

본 발명의 인간 단일클론 항체는 또한 인간 면역 세포가 재구성되어, 면역화함에 따라서 인간 항체 반응이 일어날 수 있는 SCID 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 마우스에 관하여는, 예를 들면, 미국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호(Wilson et al.)에 기재되어 있다.

인간 Ig 마우스의 면역화

인간 Ig 마우스가 본 발명의 인간 항체를 생성하는데에 사용될 때, 그러한 마우스는 ([Loriberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859]; [Fishwild, D. et al (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]; 및 PCT 공보 WO 98/24884 및 WO 01/14424)에 기재되어 있는 바와 같이, 정제 또는 농축된 PTK7 항원 및/또는 재조합 PTK7, 또는 PTK7 융합 단백질로 면역화될 수 있다. 처음 주입시의 마우스는 6 내지 16주령인 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, PTK7 항원의 정제된 제제 또는 재조합 제제(5 내지 50 ㎍)는 복강 내로 인간 Ig 마우스를 면역화하는데에 사용될 수 있다.

PTK7에 대한 완전히 인간의 것인 단일클론 항체를 생산하는 방법에 관하여는 이하 실시예 1에 더욱 상세히 기술되어 있다. 다양한 항원에 의해 누적된 경험을 통하여, 먼저 복강내(IP)로 완전 프로인트 애쥬반트중의 항원으로 면역화시킨 후, 2주에 한 번씩 불완전 프로인트 애쥬반트중 항원으로 IP 면역화(총 6회 이하)하였을 때, 트랜스제닉 마우스는 반응을 나타냄을 알 수 있다. 그러나, 프로인트 애쥬반트 이외의 애쥬반트도 효과적인 것으로 파악된다. 추가로, 애쥬반트 부재하에서의 전 세포는 면역원성이 큰 것으로 파악된다. 면역 반응은 후 안와 채혈(retroorbital bleed)로 얻은 혈장 샘플을 사용하여 면역화함으로써 관찰될 수 있다. 상기 혈장은 ELISA(이하 기술됨)에 의해 스크리닝될 수 있으며, 항-PTK7 인간 면역글로불린 역가가 충분한 마우스는 융합에 사용될 수 있다. 마우스를 안락사시켜 비장을 제거하기 3일 전, 마우스에 항원을 정맥 투여하여 면역 증강(boosting)시킨다. 각 면역화당 2 내지 3회의 융합이 이루어질 필요가 있다. 전형적으로 6 내지 24 마리의 마우스를 각각의 항원에 대해 면역화시킨다. 일반적으로, HCo7 및 HCo12 변종, 둘 모두가 사용된다. 추가로, HCo7 및 HCo12의 트랜스진, 둘 모두는 함께 한 마리의 마우스(2개의 상이한 인간 중쇄 트랜스유전자를 갖는 마우스(HCo7/HCo12))에 도입될 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, KM 마우스™ 변종이 사용될 수 있다.

본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조

본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 비장 세포 및/또는 림프 소절 세포를 단리하여 적당한 무한 증식 세포주, 예로서, 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체를 생산하는지 여부에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 면역화된 마우스로부터 유래하는 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 1/6 P3X63-Ag8.653 비-분비형 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)에 50% PEG와 함께 융합시킬 수 있다. 세포를 편평 바닥 미세역가 플레이트중에 약 2 x 10⁵의 농도로 플레이팅한 후, 20% 태아 클론 혈청(fetal Clone Serum), 18% "653" 조건 배지(conditioned medium), 5% 오리겐(IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 단위/ml의 페니실린, 50 mg/ml의 스트렙토마이신, 50 mg/ml의 겐타마이신 및 1X HAT(Sigma; HAT는 융합 후 24시간 경과시 첨가한다)를 함유하는 선별 배지 중에서 2주 동안 인큐베이션시킨다. 약 2주 경과 후, HAT를 HT로 교체한 배지 중에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 각각의 웰을 인간 단일클론 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단, 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 일반적으로는 10 내지 14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하여 다시 스크리닝할 수 있으며, 만일 인간 IgG에 대해 여전히 양성 반응을 보이면, 단일클론 항체는 희석을 제한함으로써 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 이후, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 추가의 특징화를 위한 조직 배양 배지 내에서 소량의 항체를 생성시킬 수 있다.

인간 단일클론 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마를 단일클론 항 체 정제용의 2ℓ들이 스피너-플라스크 내에서 배양할 수 있다. 상등액을 여과 및 농축한 후, 단백질 A-세파로스(뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 Pharmacia)를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 용리된 IgG는 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 검사하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교체할 수 있으며, 농도는 1.43 흡광 계수를 이용하여 OD₂₈₀에서 측정할 수 있다. 단일클론 항체를 분취하여 -80℃에 보관할 수 있다.

본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 제조

본 발명의 항체는 또한 예를 들면, 당업계에 잘 공지된(예를 들면, [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]) 재조합 DNA 기법과 유전자 형질감염법을 조합하여 수행함으로써 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다.

예를 들면, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해서, 일부 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자생물학 기법(예컨대, 관심의 대상이 되는 항체를 발현시키는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭법)에 의해 수득할 수 있으며, DNA는, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있도록 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 본 명세서에서, "작동적으로 연결된"이란 용어는, 항체 유전자가 벡터에 결찰되어 벡터 내에 존재하는 전사 및 번역조절 서열이 상기 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 기능을 갖게 된다는 의미이다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 혼화 가능한 것으로 선택된다. 항체의 경쇄 유전자와 항체의 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있는 데, 보다 전형적으로는 이들 두 유전자가 동일한 발현 벡터 내에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예컨대, 항체 유전자 단편 및 벡터상의 상보성 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내에 삽입된다. 본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여 원하는 이소타입의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하게 된 발현 벡터에 삽입하여, V_H 분절은 벡터내 C_H 분절(들)에 작동적으로 연결시키고, V_K 분절은 벡터내 C_L 분절에 작동적으로 연결시킴으로써, 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 제조할 수 있다. 추가적으로 또는 별법으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 프레임 내에서 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내에서 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터 유래하는 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. "조절 서열"이란 용어는, 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소(예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 이러한 조절서열은 예를 들면, [Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다. 발현 벡터 디자인, 예로서, 조절 서열의 선택은 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질 의 발현 수준 등과 같은 요소에 의존할 수 있다는 사실은 당업자에 의해 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포 내에서 단백질 발현 수준을 높이는 바이러스 요소, 예로서, 거대 세포 바이러스(CMV: cytomegalovirus), 유인원 바이러스 40(SV40: Simian Virus 40), 아데노바이러스(예를 들면, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP: adenovirus major late promoter) 및 폴리오마로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 별법으로, 비-바이러스 조절 서열, 예로서, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터도 사용될 수 있다. 추가로, 상이한 근원으로부터 유래하는 서열들로 이루어진 조절 요소, 예로서, SRα 프로모터 시스템은 SV40 초기 프로모터 및 제1형 인간 T 세포 백혈병 바이러스의 장 말단 반복부로부터 유래하는 서열들을 함유한다[Takebe, Y. et al., (1988) Mol . Cell . Biol. 8:466-472].

항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예로서, 숙주 세포 내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예컨대, 복제 기원) 및 선별 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 촉진한다(예컨대, 미국 특허 번호 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호(모두 Axel et al.). 예를 들면, 전형적으로 벡터가 도입된 숙주 세포상에서 선별 마커 유전자는 약물, 예로서, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자로서는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR: dihydrofolate reductase) 유전자(dhfr-숙주 세포 내에서 메토트렉세이트 선택/증폭용으로 사용) 및 neo 유전자 (G418 선택용으로 사용)를 포 함한다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기법에 의해 숙주 세포에 형질감염된다. 다양한 형태의, "형질감염"이라는 용어는 외인성 DNA를 원핵 생물 또는 진핵 생물 숙주 세포에 도입하는데에 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기법, 예컨대, 전기천공법, 칼슘-인산염 침전법, DEAE-덱스트란 형질감염법 등을 포함하고자 함이다. 비록 이론적으로는 본 발명의 항체를 원핵 생물 또는 진핵 생물 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있지만, 진핵 생물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포내 항체의 발현이 가장 바람직한데, 그 이유는 이러한 진핵 생물 세포 구체적으로, 포유동물 세포는 원핵 생물 세포보다 적당히 폴딩되어 면역학적으로 활성인 항체를 조립 및 분비하기 쉽기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 생물내 발현은 활성 항체를 고수율로 생산하기에는 비효율적이라고 보고된 바 있다 [Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13].

본 발명의 재조합 항체를 발현하는데 바람직한 포유동물 숙주 세포로서는 중국 햄스터 난소(CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포)(DHFR 선별 마커와 함께 사용되는(예컨대, [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol . Biol . 159:601-621]), [Urlaub and Chasin, (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포를 사용하는 경우, 또다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내에 도입될 때, 숙주 세포 내에 서 항체를 발현시키기에 충분한 시간 동안, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 배양하는 배양 배지에 항체가 분비되는데에 충분한 시간 동안, 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산한다. 항체는 표준 단백질 증폭 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

항원에 대한 항체 결합의 특징화

본 발명의 항체는 예를 들면, 표준 ELISA에 의해 PTK7와의 결합 여부에 대해 시험될 수 있다. 요약하면, 미세역가 플레이트를 PBS중 0.25 ㎍/ml의 정제된 PTK7을 이용하여 코팅한 후, 이를 PBS중 5% 소 혈청 알부민으로 차단한다. 항체 희석액(예컨대, PTK7-면역화된 마우스로부터 유래한 혈장 희석액)을 각 웰에 가한 후, 이를 37℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 이 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후, 알칼리성 포스파타제에 접합된 2차 시약(예컨대, 인간 항체의 경우, 염소-항-인간 IgG Fc-특이 다중클론 시약)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질(1 mg/ml)로 전개하고, 이를 OD405-OD650에서 분석한다. 바람직하게, 역가가 가장 높은 마우스가 융합용으로 사용될 것이다.

전술한 바와 같이 ELISA 검정법은 또한 PTK7 면역원과의 양성 반응을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. PTK7와 높은 결합도로 결합하는 하이브리도마는 서브클로닝되어 추가로 특징화된다. 모체 세포의 반응성을 보유하는, 각 하이브리도마로부터 유래하는 하나의 클론을 선택하여(ELISA에 의해), 5-10개의 바이알 세포 은행(-140℃ 보관)을 제조하고, 항체를 정제하는데 사용할 수 있다.

항-PTK7 항체를 정제하기 위해서, 선택된 하이브리도마를 2ℓ들이 스피너-플라스크 내에서 배양하여 단일클론 항체를 정제할 수 있다. 상등액을 여과 및 농축한 후, 단백질 A-세파로스(뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 Pharmacia)를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 용리된 IgG는 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 검사하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교체할 수 있으며, 농도는 1.43 흡광 계수를 이용하여 OD₂₈₀에서 측정할 수 있다. 단일클론 항체를 분취하여 -80℃에 보관할 수 있다.

선택된 항-PTK7 단일클론 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지 여부를 측정하기 위해서, 상업적으로 구입가능한 시약(일리노이주 록퍼드에 소재하는 Pierce)을 사용하여 각각의 항체를 바이오틴화할 수 있다. 전술한 바와 같이, PTK7 코팅 -ELISA 플레이트를 사용하여 비표지화 단일클론 항체 및 바이오틴화 단일클론 항체를 이용하는 경쟁 연구를 수행할 수 있다. 바이오틴화된 mAb의 결합 여부는 스트렙트아비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로써 검출할 수 있다.

정제된 항체의 이소타입을 측정하기 위해서, 이소타입 ELISA는 특정 이소타입 항체에 특이적인 시약을 이용하여 수행될 수 있다. 예로서, 인간 단일클론 항체의 이소타입을 측정하기 위해, 미세역가 플레이트 웰을 1 ㎍/ml의 항-인간 면역글로불린으로 4℃에서 밤새도록 코팅할 수 있다. 1% BSA로 차단시킨 후, 플레이트를 주변 온도에서 1 내지 2시간 동안 1 ㎍/ml 이하의 시험 단일클론 항체 또는 정제된 이소타입 대조구와 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이 알칼 리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전술한 바와 같이 전개하고 분석한다.

항-PTK7 인간 IgG 는 웨스턴 블롯팅에 의해 PTK7 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간단히 말해서, PTK7을 제조하여 이를 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킬 수 있다. 전기영동 이후, 분리된 항원들을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 이를 10% 우태아 혈청으로 차단한 다음, 시험하고자 하는 단일클론 항체로 프로빙한다. 인간 IgG의 결합 여부는 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 이용하여 검출할 수 있으며, BCIP/NBT 기질 정제(미주리주 세인트루이스에 소재하는 Sigma Chem. Co.)로써 전개될 수 있다.

면역접합체

또다른 측면에서, 본 발명은 치료제 부분, 예로서, 세포 독소, 약물(예컨대로, 면역억제제) 또는 방사성 독소에 접합된 항-PTK7 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 이러한 접합체를 본원에서는 "면역접합체"라 지칭한다. 하나 이상의 세포 독소를 포함하는 면역접합체를 "면역독소"라 지칭한다. 세포 독소 또는 세포 독성제로서는 세포에 유해한(예컨대, 세포를 사멸시키는) 임의의 제제를 포함한다. 그 예로서는, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블래스틴, 콜히친, 독소루비신, 도노루비신, 디하이드록실 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료제로서 는, 예를 들면, 대사 길항 물질(예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 디카바진), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜파란, 카머스틴(BSNU) 및 로머스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 cis-디클로로디아민 플래티늄(II)(DDP 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 도노루비신(구 도노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(구 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 항-유사 분열 제제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블래스틴)도 포함한다.

본 발명의 항체에 접합될 수 있는 치료용 세포 독소에 관한 기타 바람직한 예로서는, 듀오카마이신, 칼리키아마이신, 메이탄신 및 오리스타틴, 및 그의 유도체를 포함한다. 칼리키아마이신 항체 접합체의 예는 상업적으로 구입가능하다(Mylotarg™; Wyeth-Ayerst). 치료용 세포 독소의 예는 예를 들면, 미국 특허 번호 제6548530호 및 제6281354호 및 미국 특허 출원 번호 US 2003/0064984, US 2003/0073852 및 US 2003/0050331에서 찾아볼 수 있다.

세포 독소는 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 사용하여 본 발명의 항체에 접합시킬 수 있다. 항체에 세포 독소를 접합시키는데 사용되는 링커의 유형으로는 예로서, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 디설파이드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 링커는, 예로서, 리소좀 구획내 낮은 pH에서 분해되기 쉽거나, 프로테아제, 예로서, 종양 조직 내에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예로서, 카텝신(예컨대, 카텝신 B, C, D)에 분해되기 쉬운 것으로 선택 될 수 있다.

세포 독소 및 링커의 유형과, 항체에 치료제를 접합시키는 방법에 관한 추가적인 논의를 위해서는 ([Saito, G. et al. (2003) AdV, Drug Deliv. Rev. 55:199-215]; [Trail, P. A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337]; [Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212]; [Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-163]; [Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091]; [Senter, P.D. and Springer, CJ. (2001) AdV , Drug Deliv . Rev . 53:247-264])도 참조할 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 방사성 동위 원소에 접합되어, 방사성 면역접합체라고 지칭되는, 세포 독성 방사성 약제를 생산할 수 있다. 진단용 또는 치료용으로 사용되는 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위 원소로서는 요오드¹³¹, 인듐¹¹¹, 이트륨⁹⁰ 및 루테튬¹⁷⁷을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 방사성 면역접합체를 제조하는 방법은 당업계에 확립되어 있다. 방사성 면역접합체는 상업적으로 구입가능하며, 그 예로서는 제발린(Zevalin)™(IDEC Pharmaceuticals) 및 벡사(Bexxar)™(Corixa Pharmaceuticals)를 포함하고, 또한 본 발명의 항체를 사용하여 방사성 면역접합체를 제조하는데 유사한 방법이 사용될 수도 있다.

본 발명의 항체 접합체는 소정의 생물 반응을 개선시키는데에 사용될 수 있으며, 약물 부분은 전통적인 화학 치료제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 약물 부분은 원하는 생물 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있 다. 이러한 단백질로서는, 예로서, 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 활성 단편, 예로서, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예로서, 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물 반응 개질제, 예로서, 림포카인, 인터루킨-1("IL(interleukin)-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6( "IL--6"), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF: granulocyte colony stimulating factor") 또는 기타 성장 인자를 포함할 수 있다.

그러한 치료제 부분을 항체에 접합시키는 기법은 잘 알려져 있으며, 예컨대, [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)]; 및 [Thorpe et al, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)])을 참조할 수 있 다.

이중 특이성 분자

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-PTK7 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중 특이성 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부는 또다른 기능성 분자, 예로서, 다른 펩티드 또는 단백질(예컨대, 또다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화되거나, 그와 결합하여, 2개 이상의 상이한 결합 위치 또는 표적 분자와 결합하는 이중 특이성 분자를 생성할 수 있다. 실제로, 본 발명의 항체는 1 초과의 기타 기능성 분자로 유도체화되거나, 그와 결합하여 2 초과의 상이한 결합 위치 및/또는 표적 분자와 결합하는 다중 특이성 분자를 생성할 수 있으며; 이러한 다중 특이성 분자는 본원에 사용된 "이중 특이성 분자"라는 용어에 포함되기도 한다. 본 발명의 이중 특이성 분자를 생산하기 위하여, 본 발명의 항체는 (예를 들면, 화학 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의해) 기능상으로 하나 이상의 기타 결합 분자, 예로서, 기타 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모사체에 결합되어 이중 특이성 분자를 형성할 수 있다.

그러므로, 본 발명은 PTK7에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성과 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중 특이성 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예컨대, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89)이다. 그러므로, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR 발현 효과기 세포(예컨대, 단핵구, 대식 세포 또는 다형핵 백혈구(PMN: polymorphonuclear cell))와, PTK7을 발현하는 표적 세포 둘 모두와 결합할 수 있 는 이중 특이성 분자를 포함한다. 이와 같은 이중 특이성 분자는 PTK7 발현 세포를 효과기 세포에 표적화하여, Fc 수용체-매개 효과기 세포 활성, 예로서, PTK7 발현 세포의 식세포 작용, 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC), 사이토카인 방출 또는 과산화 음이온의 발생을 유발시킨다.

이중 특이성 분자가 다중 특이성인 본 발명의 실시태양에서, 이 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-PTK7 결합 특이성 이외에 제3의 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 제3의 결합 특이성은 항-증진 인자(EF: enhancement factor) 부분, 예로서, 세포 독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자의 것이 있다. "항-증진 인자 부분"은 소정의 분자, 예로서, 항원 또는 수용체에 결합하여, Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정기의 효과를 증진시키는, 항체, 기능성 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-증진 인자 부분 "은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 별볍으로, 항-증진 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성 분자가 결합하는 실체와는 상이한 실체와 결합할 수 있다. 예를 들면, 항-증진 인자 부분은 세포 독성 T-세포에 (예컨대, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 기타 면역 세포를 통하여) 결합할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중 특이성 분자는 결합 특이성 분자로서 하나 이상의 항체, 그의 항체 단편, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 단일 쇄 Fv를 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 제4,946,778호(Ladner et al.)(그의 내용은 명확하게 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이, 경쇄 또는 중쇄 이합체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예로서, Fv 또는 단일 쇄 작제물일 수도 있다.

하나의 실시태양에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이성은 단일클론 항체에 의하여 제공되며, 여기서, 이러한 결합은 인간 면역글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에 사용된 "IgG 수용체 "란 용어는, 1번 염색체 상에 위치하는 8개의 γ-쇄 유전자 중 임의의 것을 지칭한다. 이 유전자들은 총 12개의 막횡단 또는 가용성 수용체 아형을 코딩하는데, 이 아형들은 3개의 Fcγ 수용체 군으로 분류된다: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16). 하나의 바람직한 실시태양에서, Fcγ 수용체는 인간의 고 친화성 FcγRI이다. 인간의 FcγRI는 72kDa의 분자로서, 단량체 IgG에 대해서는 높은 친화도를 나타낸다(10⁸ - 10⁹M^-1).

특정 바람직한 항-Fcγ 단일클론 항체의 생산 방법 및 특징화는 PCT 공보 WO 88/00052(Fanger et al.) 및 미국 특허 번호 제4,954,617호(Fanger et al.)에 기재되어 있고; 상기 문헌에서 교시하는 바는 본원에 전체로서 참고로 인용된다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ 결합 위치와 구별되는 위치에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하므로, 그의 결합은 생리적 수준의 IgG에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이적 항-FcγRI 항체로서는 mAb22, mAb 32, mAb44, mAb62 및 mAb197이 있다. mAb32를 생산하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 ATCC 수탁 번호 HB9469로 이용가능하다. 다른 실시태양에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 단일클론 항체 22(H22)의 인간화된 형태이다. H22 항체의 생산 방법 및 특징화는 [Graziano, R.F. et al (1995). J. Immunol 155 (10):4996-5002] 및 PCT 공보 WO 94/10332에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 HA022CL1로 기탁되어 있으며, 수탁 번호는 CRL 11177이다.

추가의 다른 바람직한 실시태양에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예컨대, Fc-알파 수용체(FcαRI(CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되며, 이러한 결합은 인간 면역글로불린 A(IgA: immunoglobulin A)에 의해 차단되지 않는다. "IgA 수용체"란 용어는 19번 염색체상에 위치하는 하나의 α-유전자(FcαRI)의 유전자 산물을 포함하는 의미이다. 이 유전자는 선택적으로 스플라이싱된 55 내지 110 kDa의 몇몇 막횡단 아형 분자를 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI(CD89)는 단핵구/대식 세포, 호산성 및 호중성 과립구상에 구성적으로 발현되지만, 비-효과기 세포 군집 상에는 그러하지 아니하다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2에 대해 중간 정도의 친화도를 갖는데(약 5 x 10⁷M^-1), 이 친화도는 사이토카인, 예로서, G-CSF 또는 GM-CSF에 노출될 경우 증가한다[Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. IgA 리간드 결합 도메인 외에서 FcαRI에 결합하는 4개의 FcαRI-특이적 단일클론 항체, 즉, A3, A59, A62 및 A77에 관하여는 [Monteiro, R.C. et al.(1992) J Immunol . 148:1764)]에 기재되어 있다.

FcαRI 및 FcγRI는 본 발명의 이중 특이성 분자에 사용되는데 바람직한 유 발 수용체인데, 그 이유는 이 수용체가 (1) 면역 효과기 세포, 예컨대, 단핵구, PMN, 대식 세포 및 수지상 세포 상에 주로 발현되고; (2) 높은 수준으로(예컨대, 세포당 5,000-100,000개) 발현되며; (3) 세포 독성 활성(예컨대, ADCC, 식세포 작용)의 매개 인자이고; (4) 수용체에 표적화된 항원, 예로서, 자가-항원의 증진된 항원 제시 작용을 매개하기 때문이다.

인간 단일클론 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중 특이성 분자에 사용될 수 있는 기타 항체들로서는 뮤린, 키메라 및 인간화된 단일클론 항체가 있다.

본 발명의 이중 특이성 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성적 결합 특이성 분자, 예컨대, 항-FcR 및 항-PTK7 결합 특이성 분자를 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 이중 특이성 분자의 각 결합 특이성 분자는 개별적으로 형성된 후, 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성 분자가 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제가 공유 결합성 접합에 사용될 수 있다. 가교제의 예로서는 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA: N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB: 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)), o-페닐렌디말레이미드(o-PDM: o- phenylenedimaleimide), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP: N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate )및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC: sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohaxane-1-carboxylate)를 포함한다(예를 들면, [Karpovsky et al. (1984) J Exp . Med. 160:1686]; [Liu, MA et al.(1985) Proc . Natl Acad . Sci. USA 82:8648]을 참조할 수 있다). 기타 방법으로서는 ([Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132]; [Brennan et al.(1985) Science 229:81-83], 및 [Glennie et al.(1987) J Immunol 139: 2367-2375])에 기술된 방법들을 포함한다. 바람직한 접합제로는 SATA 및 설포-SMCC가 있는데, 이들은 모두 피어스 케미컬스 코포레이션(Pierce Chemical Co.)(일리노이주 록퍼드 소재)으로부터 입수 가능하다.

결합 특이성 분자가 항체일 때, 이는 2개의 중쇄 사이에 존재하는 C-말단 힌지 영역의 설프하이드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 힌지 영역은 접합 이전에, 홀수개, 바람직하게는 1개의 설프하이드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.

별법으로, 둘 모두의 결합 특이성 분자는 동일한 벡터 내에서 코딩되고, 동일한 숙주 세포 내에서 발현 및 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중 특이성 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')₂ 또는 리간드 x Fab 융합 단백질일 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중 특이성 분자는 하나의 단일 쇄 항체와 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자이거나, 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중 특이성 분자일 수 있다. 이중 특이적 분자들은 2개 이상의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중 특이성 분자를 제조하는 방법에 관하여는, 예로서, 미국 특허 번호 제5,260,203호; 미국 특허 번호 제5,455,030호; 미국 특허 번호 제4,881,175호; 미국 특허 번호 제5,132,405호; 미국 특허 번호 제5,091,513호; 미국 특허 번호 제 5,476,786호; 미국 특허 번호 제5,013,653호; 미국 특허 번호 제5,258,498호; 및 미국 특허 번호 제5,482,858호에 기술되어 있다.

이중 특이성 분자가 그의 특이적 표적에 결합되었는지 여부는, 예로서, 효소-결합 면역 흡착 검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 방사성 면역검정법(RIA: radioimmunoassay), FACS 분석법, 생물 검정법(예를 들면, 성장 억제법), 또는 웨스턴 블롯 검정법에 의해 확인할 수 있다. 이러한 검정법은 각각 일반적으로 관심의 대상이 되는 복합체에 특이적인 표지화 시약(예컨대, 항체)을 사용하여 관심의 대상이 되는 단백질-항체 복합체의 존재를 확인하는 방법이다. 예를 들면, FcR-항체 복합체는 예를 들면, 항체-FcR 복합체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 이용하여 검출될 수 있다. 별법으로, 상기 복합체는 기타 다양한 면역검정법중 임의의 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 항체는 방사성 표지화될 수 있으며, 방사성 면역검정법(RIA)에서 사용될 수 있다[예를 들면, [Weintraub, B. Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986](본원에서 참고로 인용된다)). 방사성 동위 원소는 γ 카운터 또는 신틸레이션 카운터를 사용하거나, 방사능 사진 촬영 기술과 같은 수단에 의해 검출될 수 있다.

약제학적 조성물

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체, 또는 그의 항원 결합부(들)중 어느 하나 또는 그의 조합물을 함유하고, 약제학적으로 허용가능한 담체 와 함께 제형화된 조성물, 예컨대, 약제학적 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 본 발명의 항체(예컨대, 2개 이상의 상이한 항체), 또는 면역접합체 또는 이중 특이성 분자중 어느 하나 또는 그의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약제학적 조성물은 표적 항원 상에 존재하는 상이한 에피토프와 결합하거나, 상보성 활성을 갖는 항체(또는 면역접합체 또는 이중 특이성 분자)의 조합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 병용 요법으로, 즉, 다른 치료제와 배합되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 병용 요법은 1종 이상의 기타 소염제 또는 면역 억제제와 함께 본 발명의 항-PTK7 항체를 포함할 수 있다. 병용 요법에서 사용될 수 있는 치료제의 일례는 이하 본 발명의 항체의 용도에 관한 섹션에 더욱 상세히 기술된다.

본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 담체"는, 생리학적으로 혼화 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡착 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여용으로서 적합하다(예를 들면, 주사 또는 주입). 투여 경로에 따라서, 활성 화합물 즉, 항체, 면역접합체 또는 이중 특이성 분자는 이 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용과 기타 천연 환경으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질 중에 코팅될 수 있다.

본 발명의 약제학적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용가능한 염"이란, 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고, 어떠한 바람직하지 않은 독성학적 효과도 나타내지도 않는 염을 지칭한다(예를 들면, [Berge, S.M., et al.(1977) J. Pharm . Sci . 66:1-19]을 참조할 수 있다). 그러한 염의 예로서는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산, 예로서, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래하는 것들과, 비독성 유기산, 예로서, 지방족 모노카복시산 및 디카복시산, 페닐-치환 알카논산, 하이드록시 알카논산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래하는 것들을 포함한다. 염기 부가염으로서는 알칼리토금속, 예로서, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등으로부터 유래하는 것들과, 비독성 유기 아민, 예로서, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래하는 것들을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수도 있다. 약제학적으로 허용가능한 항산화제의 예로서는 (1) 수용성 항산화제, 예로서, 아스코르브산, 염화수소산시스테인, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유성 항산화제, 예로서, 팔미트산아스코르빌, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA: butylated hydroxyanisole), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT: butylated hydroxytoluene), 레시틴, 몰식자산프로필 및 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예로서, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA: ethylenediamine tetraacetic acid), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로서는 물, 에탄올, 폴리올(예로서, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등)과, 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예로서, 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예로서, 올레산에틸을 포함한다. 유동성은, 예를 들면, 코팅 물질, 예로서, 레시틴을 사용하거나, 분산액의 경우에는 필요한 입도를 유지시키거나, 계면활성제를 사용함으로써 적당히 유지될 수 있다.

이러한 조성물은 또한 애주번트, 예로서, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수도 있다. 미생물이 존재하는 것을 막기 위해 멸균 방법(상동)에 의하거나, 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시키는 방법이 확실하다. 또한, 등장제, 예로서, 설탕 및 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 추가로, 흡수를 지연시키는 제제, 예로서, 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴을 포함시켜 주사 가능한 약제학적 제형을 오랜 시간에 걸쳐 흡수시킬 수도 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체로서는, 멸균 주사 용액 또는 분산액을 즉석으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 이와 같이 약제학적으로 활성인 물질을 위해 상기와 같은 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 지금까지 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비 혼화성이라는 점을 제외하면, 이들을 본 발명의 약제학적 조성물에 사용하는 것도 본 발명에서 고려해볼 수 있다. 추가의 활성 화합물도 본 조성물에 포함될 수 있다.

치료용 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 상태하에서 멸균 및 안정한 것이 어야 한다. 본 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 기타 고농도 약물에 적합한 정렬된 구조를 갖는 물질로서 제형화될 수 있다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 그의 적합한 혼합물을 함유하는 분산액 또는 용매일 수 있다. 유동성은, 예로서, 코팅제 예를 들어 레시틴을 사용하거나, 분산액일 경우 필요한 입도로 유지시키거나, 계면활성제를 사용함으로써 적당히 유지될 수 있다. 다수의 경우, 등장제, 예를 들면, 설탕, 폴리알콜, 예로서, 만닛톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예로서, 모노스테아르산 염 및 젤라틴을 포함시켜, 주사 가능한 조성물을 오랜 시간에 걸쳐 흡수시킬 수 있다.

멸균 주사 용액은 필요에 따라서, 적당한 용매 중에 전술한 성분들 중 어느 하나 또는 이들을 조합하여 필요량 만큼의 활성 화합물과 함께 포함시킨 후, 멸균 미세 여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 기타 필요로 하는 전술한 성분들을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼합시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조용인 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로서는 미리 멸균-여과시킨 활성 성분 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 바람직한 부가 성분들을 만들어내는 진공 건조법 및 냉동-건조법(동결 건조법)이 있다.

단일 투여형을 만들기 위하여 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 피험체와 특정 투여 방식에 따라서 달라질 것이다. 담체 물질과 혼합되어 단일 투여형을 만들 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 이 양은 약제학적으로 허용가능한 담체와 활성 성분을 합하여 100이라고 보았을 때, 활성 성분 약 0.01 내지 약 99%, 바람직하게는, 약 0.1 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 30%일 것이다.

투여 방식은 최적의 바람직한 반응(예컨대, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들면, 볼루스로서 단일 투여될 수 있으며, 경시적으로 수회 나누어 투여할 수도 있거나, 치료 경과의 응급도에 비례하여 투여량을 감소 또는 증가시킬 수도 있다. 투여의 용이함과 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 본원에 사용된 투여 단위형이란, 치료하고자 하는 피험체에 대하여 단위 투여형으로서 적당하고 물리적으로 별개인 단위를 의미하는데; 여기서, 각 단위는 필요로 하는 약제학적 담체와 함께, 원하는 치료 효과를 나타내도록 책정된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위형의 특징은, (a) 활성 화합물의 독특한 특징과 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 화합물 제조업계에 고질적인 한계점, 예로서, 활성 화합물에 대한 개체의 치료 민감성 정도에 의해 설명되고, 또한 이에 직접적으로 의존한다.

항체 투여에 있어서, 투여량 범위는 호스트의 체중 1 ㎏당 약 0.0001 내지 100 mg이고, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 5 mg이다. 예를 들면, 투여량은 0.3 mg/kg(체중), 1 mg/kg(체중), 3 mg/kg(체중), 5 mg/kg(체중) 또는 10 mg/kg(체중)일 수 있고, 또는 1-10 mg/kg 범위 내일 수 있다. 대표적인 치료 방식은 매주 1회, 매 2주마다 1회, 매 3주마다 1회, 매 4주마다 1회, 1개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 항-PTK7 항체에 바람직한 투여 방식은 정맥내 투여를 통하여 1 mg/kg(체중) 또는 3 mg/kg(체중) 투여하는 것을 포함하며, 여기에서, 항체는 하기와 같은 투여 스케줄중 어느 하나를 적용하여 투여한다:(i) 매 4주마다 총 6회 투여, 이어서, 3개월마다 투여; (ii) 매 3주마다 투여; (iii) 3 mg/kg(체중) 1회 투여한 후, 3주마다 1 mg/kg(체중) 투여.

몇몇 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 단일클론 항체는 동시에 투여되는데, 이 경우 투여된 각 항체의 투여량은 전술한 범위에 포함된다. 항체는 일반적으로 다수의 경우로 투여된다. 매 투여 사이의 간격은, 예를 들면, 1주일, 1개월, 3개월 또는 1년일 수 있다. 간격은 또한 환자의 표적 항원에 대한 항체의 혈액내 수준을 측정함으로써 상기와 같이 일정하지 않을 수 있다. 몇몇 방법에서, 투여량은 혈장내 항체 농도 약 1-1000 ㎍/ml, 그리고 몇몇 방법에서는, 약 25-300 ㎍/ml가 되도록 조정된다.

별법으로, 항체는 지효성 방출 제형으로서 투여될 수 있는데, 이 경우 투여 횟수를 줄여야 한다. 투여량과 투여 횟수는 환자 체내 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간 항체의 반감기가 가장 길며, 그 다음은 인간화된 항체, 키메라 항체 그리고 비-인간 항체의 순이다. 투여량 및 투여 횟수는 처치가 예방을 목적으로 하는 것인지 아니면 치료를 목적으로 하는 것인지의 여부에 따라서 달라진다. 예방의 목적으로 처치하는 경우, 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 비교적 낮은 투여량만큼 투여된다. 일부 환자들은 여생 동안 계속해서 처치를 받는다. 치료의 목적으로 처치하는 경우, 병의 진행이 늦춰지거나 또는 멈춰질 때까지, 바 람직하게는 환자의 병의 증상이 부분적으로 또는 완전히 완화될 때까지 비교적 단기의 간격으로 비교적 다량 투여된다. 이후, 환자는 예방 차원에서 처치를 받을 수 있다.

환자에게 독성을 미치지 않고서, 특정 환자, 조성물 그리고 투여 방식에 대한 치료 효과를 원하는 바와 같이 이루는데에 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해서, 본 발명의 약제학적 조성물중 활성 성분의 실제 투여 수준은 다양할 수 있다. 선택된 투여 수준은 다양한 약물 동력학적 요인, 예로서, 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용될 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용된 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받을 환자의 연령, 성별, 체중, 몸 상태, 전체적인 건강 상태 및 이전 치료 경험과 기타 의료업계에 널리 공지된 요인들에 따라서 달라질 것이다.

본 발명의 항-PTK7 항체의 "치료학적 유효량"이란, 바람직하게는 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 투여 횟수와 질환의 증상이 나타나지 않는 기간을 늘리거나, 또는 질환의 발병으로 인한 손상이나 장애를 예방할 수 있는 양을 의미하는 것이다. 예로서, 종양 치료시, "치료학적 유효량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 치료받지 않은 피험체에 비하여 바람직하게는 약 20% 이상, 더욱 바람직하게는 약 40% 이상, 더더욱 바람직하게는 약 60% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 80% 이상 저해하는 것이다. 종양의 성장을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측할 수 있는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 별법으 로, 이와 같은 조성물의 성질은 이 화합물의 저해 능력, 즉, 당업자에게 공지된 시험관내 검정법에 있어서의 저해 능력을 관찰함으로써 평가될 수 있다. 치료용 화합물의 치료학적 유효량은 종양의 크기를 감소시킬 수 있거나, 피험체의 증상들을 경감시킬 수도 있다. 당업자는 이러한 요인들 즉, 피험체의 크기, 피험체 증상의 중증도, 그리고 특정 조성물 또는 선택된 투여 경로를 바탕으로 하여 그 양을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 사용함으로써 하나 이상의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 의도로 하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 투여 경로로서는, 예로서, 주사 또는 주입에 의한, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 "비경구 투여"란 어구는, 일반적으로 주사에 의한, 장내 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하는 것으로서, 정맥내, 근육내, 동맥내, 초내, 낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 피내, 복강내, 경기관,피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다 .

별법으로, 본 발명의 항체는 비경구 외(non-parenteral) 경로, 예로서 , 국소, 상피 또는 점막 투여 경로, 예를 들면, 비내, 경구, 질내, 직장내, 설하 또는 국소 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다.

활성 화합물은 이 화합물이 급속하게 방출되는 것을 막아주는 담체와 함께 제조될 수 있는데, 예로서, 방출 조절형 제형, 예로서, 임플란트, 경피 패취 및 미세 캡슐화 전달 시스템의 형태로서 제조될 수 있다 . 생체 분해성 및 생체 혼화성 중합체, 예로서, 아세트산 에틸렌 비닐, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법의 대다수는 특허 받았거나, 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예로서, [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed. Marcel Dekker, Inc. New York, 1978]을 참조할 수 있다.

치료용 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 치료용 조성물은 바늘이 없는 피하 주사용 장치, 예로서, 미국 특허 번호 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 개시된 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 잘 알려져 있는 임플란트 및 본 발명에 유용한 모듈의 예로서는, 조절된 속도로 약물을 분배하는 이식 가능 미소-주입 펌프에 관하여 개시하는 미국 특허 번호 제4,487,603호에 개시된 것; 피부를 통하여 약물을 투여하는 치료용 장치에 관하여 개시하는 미국 특허 번호 제4,486,194호에 개시된 것들; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프에 관하여 개시하는 미국 특허 번호 제4,447,233 호에 개시된 것들; 연속적으로 약물을 전달하기 위한 다양한 유동성 이식 주입 장치에 관하여 개시하는 미국 특허 번호 제4,447,224 호에 개시된 것들; 다중 챔버 구획을 가지는 삼투성 약물 전달 시스템에 관하여 개시하는 미국 특허 번호 제4,439,196 호에 개시된 것들; 및 삼투성 약물 전달 시스 템에 관하여 개시하는 미국 특허 번호 제4,475,196 호에 개시된 것들을 포함한다. 상기 특허들은 본원에서 참고로 인용된다. 다수의 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.

임의의 실시태양에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 생체내에서 적당히 분배될 수 있도록 제형화될 수 있다. 예로서, 혈뇌 장벽(BBB: blood-brain barrier)은 친수성이 큰 다수의 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료용 화합물이 상기 BBB를 통과하게 하기 위해서는(원할 경우), 이 화합물을, 예로서, 리포좀 내에 제형화시킬 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법에 관하여는, 예로서, 미국 특허 번호 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조할 수 있다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관에 선택적으로 운반되는 하나 이상의 부분들을 포함하여, 목적으로 하는 약물 전달을 증진시킬 수 있다(예로서, [V.V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685]를 참조할 수 있다). 대표적인 표적화 부분으로서는 엽산염 또는 바이오틴(예로서, 미국 특허 번호 제5,416,016호(Low et al.,)를 참조할 수 있다); 만노시드[Umezawa et al. (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun. 153:1038]; 항체([P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al. (1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39:180]); 계면 활성 단백질 A 수용체[Briscoe et al. (1995) Am . J. Physiol . 1233:134]; p120[Schreier et al. (1994) J. Biol . Chem . 269:9090]; 및 ([K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273])에 개시된 것을 포함한다.

본 발명의 용도 및 방법

본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 PTK7 매개 질병의 치료 및 진단과 관련된, 시험관내 및 생체내 진단 및 치료에 관한 유용성을 다수 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 예를 들면, 이러한 분자들은 배양액중, 시험관내, 또는 생체외에서 세포에 투여될 수 있거나, 인간 피험체에게, 예컨대, 생체내 투여될 수 있으며, 이로써 다양한 질병을 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 본원에 사용된 "피험체"란 용어는 인간 및 인간을 제외한 동물들을 포함하는 의미이다. 인간을 제외한 동물로서는 모든 척추 동물, 예로서, 포유동물 및 비-포유동물, 예로서, 인간을 제외한 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 닭, 조류, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 피험체로서는 PTK7 활성에 의해 매개되는 질병을 앓는 인간 환자를 포함한다. 본 발명은 비정상적인 PTK7 발현과 관련된 질병을 앓는 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. PTK7에 대한 항체가 다른 제제와 함께 투여될 때, 상기 항체와 다른 제제는 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명의 항체가 PTK7에 대한 특이적으로 결합한다면, 본 발명의 항체를 사용하여 세포 표면 상의 PTK7 발현을 특이적으로 검출할 수 있고, 게다가, 상기를 사용하여 면역친화성 정제를 통해 PTK7을 정제할 수 있다.

본 발명은 추가로, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체, 또는 그의 항원 결합부와 샘플 및 대조군 샘플을 항체 또는 그의 일부분과 인간 PTK7 사이에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 접촉시키는 단계를 포함 하는, 샘플중 인간 PTK7 항원의 존재를 검출하는 방법 또는 인간 PTK7 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이어서, 복합체 형성 여부를 검출하는데, 여기에서, 대조군 샘플과 비교하여, 샘플간의 복합체 형성이 샘플내 인간 PTK7 항원의 존재를 지시하는 것이다.

PTK7은 결장암종 유래 세포주에서 발현되지만, 인간 성인 결장 조직에서 발현되는 것으로 밝혀진 바는 없다[Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84). PTK7 발현은 또한 몇몇 흑색종 세포주 및 흑색종 생검에서도 관찰되었다[Easty, et al. (1997) Int . J. Cancer 71:1061-5]. 추가로, PTK7은 급성 골수성 백혈병 샘플에서 고도로 과다발현되는 것으로 밝혀졌다[Muller-Tidow et al., (2004) Clin . Cancer Res . 10:1241-9]. 항-PTK7 항체는 암성 종양의 성장을 저해하기 위하여 단독으로 사용될 수 있다. 별법으로, 항-PTK7 항체는 하기 기술되는 바와 같이, 기타 면연원성 약제, 표준 암 요법 또는 다른 항체와 함께 사용될 수 있다.

그의 성장이 본 발명의 항체를 사용함으로써 저해될 수 있는 바람직한 암으로는 면역요법에 대하여 전형적으로 반응을 나타내는 암을 포함한다. 치료에 바람직한 암으로서 비제한적인 일례로는 결장암(소장암 포함), 폐암, 유방암, 췌장암, 흑색종(예컨대, 전이성 악성 흑색종), 급성 골수성 백혈병, 신장암, 방광암, 난소암 및 전립선암을 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있다는 기타 암의 일례로는 신장암(예컨대, 신장 세포암종), 아교모세포종, 뇌종양, 급성 림프성 백혈병(ALL), 성인 T-세포 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병을 비롯한 만성 또는 급성 백혈병, 림프종(예컨대, 호지 킨 및 비-호지킨 림프종, 림프성 림프종, 원발성 CNS 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종, 퇴행성 대세포 림프종(ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할-세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역모세포 림프종, T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 중심모세포/중심세포(cb/cc) 소포 림프종암, B 계통 미만성 대세포 림프종, 혈관면역모구성 림프절증(AILD)-양 T 세포 림프종 및 HIV 관련 체강계 림프종, 배아암종, 미분화성 비강인두 암종(예컨대, 슈민케 종양), 캐슬맨병, 카포시 육종, 다발 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 기타 B-세포 림프종, 비강인두암종, 골암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 자궁관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직암, 요도암, 음경암, 소아기 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암종, 중추 신경계(CNS) 신생물, 종양 혈관형성인자, 척추 종양, 뇌관교종, 뇌하수체 선종, 유표피암, 편평세포암, 석면증에 의해 유도된 것을 비롯한, 환경적으로 유도된 암, 예컨대, 중피종 및 상기 암의 조합을 포함한다.

추가로, 다양한 세포상에 PTK7가 발현된다면, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물, 및 방법은 예를 들면, 결장암(소장암), 흑색종(예컨대, 전이성 악성 흑색종), 급성 골수성 백혈병, 폐암, 유방암, 방광암, 췌장암, 난소암 및 전립선암을 비롯한, PTK7을 발현시키는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 질병과 같은, 종양형성 질병을 앓는 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다. 종양형성 질병을 앓는 기타 피험체의 일례로는 신장암(예컨대, 신장 세포암종), 아교모세포종, 뇌종양, 급성 림프성 백혈병(ALL), 성인 T-세포 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병을 비롯한 만성 또는 급성 백혈병, 림프종(예컨대, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 림프성 림프종, 원발성 CNS 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종, 퇴행성 대세포 림프종(ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할-세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역모세포 림프종, T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 중심모세포/중심세포(cb/cc) 소포 림프종암, B 계통 미만성 대세포 림프종, 혈관면역모구성 림프절증(AILD)-양 T 세포 림프종 및 HIV 관련 체강계 림프종, 배아암종, 미분화성 비강인두 암종(예컨대, 슈민케 종양), 캐슬맨병, 카포시 육종, 다발 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 기타 B-세포 림프종, 비강인두암종, 골암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 자궁관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직암, 요도암, 음경암, 소아기 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암종, 중추 신경계(CNS) 신생물, 종양 혈관형성인자, 척추 종양, 뇌관교종, 뇌하수체 선종, 유표피암, 편평세포암, 석면증에 의해 유도된 것을 비롯한, 환경적으로 유도된 암, 예컨대, 중피종 및 상기 암의 조합을 앓는 피험체를 포함한다.

따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-PTK7 항체 또는 그의 항원 결합부를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 종양 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 항체는 인간 항-PTK7 항체 (예로서, 본원에 기술된 인간 항-인간 PTK7 항체중 임의의 것)이다. 추가적으로 또는 별법으로, 항체는 키메라 또는 인간화된 항-PTK7 항체일 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체(예컨대, 인간 단일클론 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자 및 조성물)를 사용하여 PTK7의 수준, 또는 세포 그 표면상에 PTK7을 함유하는 세포의 수준을 검출하고, 상기 수준을 특정 질환 증상과 연관시킬 수 있다. 별법으로 항체를 사용하여, PTK7 기능을 저해하거나 차단함으로써, 이는 결국은 특정 질환 증상의 예방 또는 호전에 연관지어질 수 있고, 이로써 PTK7은 상기 질환의 매개 인자로서 연루될 수 있다. 이는, 항체와 PTK7 사이에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 실험 샘플 및 대조군 샘플을 항-PTK7 항체과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체와 PTK7 사이에 형성된 임의의 복합체는 검출되고, 실험 샘플과 대조군에서 비교된다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체(예컨대, 인간 단일클론 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자 및 조성물)는 먼저 시험관내에서 치료학적 또는 진단학적 용도와 관련된 결합 활성에 대하여 시험될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 하기 실시예에 기술되는 유동 세포 분석법을 사용하여 시험될 수 있다.

본 발명의 항체(예컨대, 인간 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자, 면역접합체 및 조성물)는 PTK7-관련 질환의 치료 요법 및 진단에서 추가의 유용성을 갖는다. 예를 들면, 인간 단일클론 항체, 다중 특이성 또는 이중 특이성 분자 및 면역접합체를 사용하여 하기의 생물학적 활성: PTK7을 발현시키는 세포의 성장을 저해하고/거나 세포를 사멸시키거나; 인간 효과기 세포의 존재하에서 PTK7을 발현시 키는 세포의 식세포 작용 또는 ADCC를 매개하거나; PTK7에 결합하는 PTK7 리간드를 차단하는 것과 같은 활성들중 중 하나 이상을 생체내 또는 시험관내에서 유도할 수 있다.

특정 실시태양에서, 항체(예컨대, 인간 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자 및 조성물)는 생체내에서 다양한 PTK7-관련 질환을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용된다. PTK7-관련 질환의 일례로는 다른 것들중 결장암(소장암), 흑색종(예컨대, 전이성 악성 흑색종), 급성 골수성 백혈병, 폐암, 유방암, 방광암, 췌장암, 난소암 및 전립선암을 포함한다.

생체내 또는 시험관내에서 본 발명의 항체 조성물(예컨대, 인간 단일클론 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자 및 면역접합체)의 적합한 투여 경로는 당업계에 잘 알려져 있고, 숙련인에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면, 항체 조성물은 주사(예컨대, 정맥 또는 피부하)에 의해 투여될 수 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 피험체의 연령과 체중, 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 따라서 달라질 것이다.

앞서 기술된 바와 같이, 본 발명의 인간 항-PTK7 항체는 예컨대, 세포 독성제, 방사능 독성제 또는 면역억제제와 같은 하나 이상의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 항체는 상기 제제에 연결될 수 있거나(면역복합체로서), 상기 제제와는 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우(별도 투여), 항체는 상기 제제 이전, 이후, 또는 그와 동시에 투여될 수 있거나, 다른 공지 요법, 예컨대, 항암 요법, 예컨대, 방사선 요법과 함께 공동-투여될 수 있다. 그러한 요법제로는 다른 것들중 예로서, 항 -신생물제, 예로서, 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 설페이트, 카머스틴, 클로람부실 및 사이클로포스파미드 하이드록시우레아(이들 자체는 환자에게 독성이거나 또는 아급성 독성인 수준에서만 효과를 나타냄)를 포함한다. 시스플라틴은 4주에 한 번씩 100 mg/ml투여량으로 정맥내 투여되고, 아드리아마이신은 21일마다 한 번씩 60 내지 75 mg/ml의 투여량으로 정맥내 투여된다. 본 발명의 인간 항-PTK7 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 화학 요법 제제와 공동-투여하면, 인간 종양 세포에 세포 독성 효과를 나타내며, 상이한 기작을 통하여 작용하는 2가지의 항암제가 제공된다. 이러한 공동-투여를 통하여, 약물에 대한 내성이 생기거나, 종양 세포의 항원성이 변경됨으로써 발생되는 문제점으로서, 이 종양 세포가 항체에 무 반응성이 되는 문제점을 해결할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 면역접합체는 화합물(예컨대, 치료제, 표지, 세포 독소, 방사성 독소, 면역억제제 등)을 항체에 결합시킴으로써 이러한 화합물을 PTK7 세포 표면 수용체를 갖는 세포에 대해서 표적화시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 항-PTK7 항체는 미국 특허 번호 제6,281,354호 및 제6,548,530 호, 미국 특허 공개 제20030050331호, 제20030064984호, 제20030073852호 및 제20040087497호에 기재되어 있거나, WO 03/022806(상기 문헌의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 공개된 독소 화합물중 임의의 것에 접합될수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 PTK7을 발현하는 세포를 (예컨대, 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 효소, 또는 효소 보조 인자와 같은 검출가능한 표지를 사용하여) 생체외 또는 생체내에서 국재화시키는 방법을 제공한다. 별법으로, 면역접합체는 세포 독소 또는 방사성 독소를 PTK7에 표적화시킴으로써 PTK7 세포 표면 수용체를 갖는 세포를 사멸시키기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물(예컨대, 인간 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자)에 연결된 표적-특이성 효과기 세포, 예컨대, 효과기 세포 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 표적을 위한 효과기 세포는 예로서, 대식 세포, 호중구, 또는 단핵구와 같은 인간 백혈구일 수 있다. 다른 세포로는 호산구, 자연살세포 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체를 포함하는 세포를 포함한다. 원하는 경우, 효과기 세포를 치료하고자 하는 피험체로부터 수득할 수 있다. 표적-특이성 효과기 세포는 생리학적으로 허용가능한 용액중의 세포 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 대략 10⁸-10⁹개일 수 있지만, 이는 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 상기 양은 표적 세포, 예컨대, PTK7을 발현시키는 종양 세포를 국재화하는데, 그리고, 예컨대, 식세포 작용에 의해 세포를 사멸시키는데 충분할 것이다. 투여 경로 또한 다양할 수 있다.

표적-특이성 효과기 세포를 사용하는 요법은 표적된 세포를 제거하기 위한 다른 기법들과 함께 실시될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물(예컨대, 인간 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자) 및/또는 상기 조성물로 보강된 효과기 세포를 사용하는 항-종양 요법은 화학요법과 함께 사용될 수 있다. 추가적으로, 병용 면역요법은 종양 세포 거부에 대한 별개의 세포 독성 효과기 군집 둘을 유도하는데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 연결된 항-PTK7 항체 는 IgG- 또는 IgA-수용체 특이 결합제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 이중 특이성 및 다중 특이성 분자를 사용함으로써 또한 세포 표면 상에 존재하는 수용체를 캡핑 및 제거함으로써, 효과기 세포 상의 효과기 세포 수준을 조절할 수도 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물도 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다.

보체 결합 부위, 예로서, 보체에 결합하는 IgG1, -2 또는 -3 또는 IgM으로부터의 부분을 갖는, 본 발명의 조성물(예컨대, 인간 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자 및 면역접합체) 또한 보체 존재하에서 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 표적 세포를 포함하는 세포 군집을 생체외에서 본 발명의 결합 제제와 적절한 효과기 세포로 치료하는 것은 보체 또는 보체를 함유하는 혈청을 가함으로써 보충될 수 있다. 본 발명의 결합 제제로 코팅된 표적 세포의 식세포 작용은 보체 단백질의 결합에 의해 개선될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물(예컨대, 인간 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자)로 코팅된 표적 세포는 또한 보체에 의해 용해될 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.

본 발명의 조성물(예컨대, 인간 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자 및 면역접합체)는 또한 보체와 함꼐 투여될 수 있다. 따라서, 인간 항체, 다중 특이성 또는 이중 특이성 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물이 본 발명의 범주내 포함된다. 이들 조성물은, 보체가 인간 항체, 다중 특이성 또는 이중 특이성 분자에 대하여 근접하게 위치하고 있다는 점을 잇점으로 한다. 별법으로, 본 발명의 인 간 항체, 다중 특이성 또는 이중 특이성 분자 및 보체 또는 혈청은 별도로 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료를 받는 환자는 인간 항체의 치료학적 효과를 증진 또는 증강시키는 또다른 치료제, 예로서, 세포 독성제 또는 방사능 독성제와 함께 추가적으로 (본 발명의 인간 항체의 투여 이전, 그와 동시에, 또는 그 이후에) 투여받을 수 있다.

다른 실시태양에서, 예를 들면, 피험체를 사이토카인으로 치료함으로써 Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예컨대, 증진 또는 저해하는 제제로 피험체를 추가로 치료할 수 있다. 다중 특이성 분자로 치료하는 동안 투여하는데 바람직한 사이토카인은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자(TNF: tumor necrosis factor)를 포함한다.

본 발명의 조성물(인간 항체, 다중 특이성 및 이중 특이성 분자)을 사용하여, FcγR 또는 PTK7을 발현시키는 세포를 표적, 예를 들면, 상기 세포를 표지할 수도 있다. 그러한 용도를 위해, 결합 제제는 검출될 수 있는 분자에 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명은 Fc 수용체, 예컨대, FcγR 또는 PTK7을 발현시키는 세포를 생체외 또는 시험과내에서 국재화하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는 예컨대, 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 효소, 또는 효소 보조 인자일 수 있다.

본 발명의 항체 조성물(예컨대, 인간 항체, 이중 특이성 또는 다중 특이성 분자, 또는 면역접합체)과 그의 사용 설명서를 포함하는 키트도 본 발명의 범주 내 에 포함된다. 키트는 추가로 하나 이상의 추가의 시약, 예로서, 면역억제 시약, 세포 독성제, 또는 방사능 독성제 또는 하나 이상의 추가의 본 발명의 인간 항체(예컨대, 제1 인간 항체와는 상이한 것으로, PTK7 항원에 존재하는 에피토프에 결합하는 보체 활성을 갖는 인간 항체)를 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 의도된 용도를 나타내는 표지를 포함한다. 용어 표지는 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 그렇지 않을 경우, 키트에 첨부되는 임의의 기입 사항 또는 기록 사항을 포함한다.

본 발명은 하기 실시예를 통하여 더욱 자세히 기술되어 있지만, 하기 실시예는 본 발명을 추가로 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 될 것이다. 본 출원에 전반적으로 인용된 모든 도면과 참고 문헌들, 특허 및 공개된 특허 출원들의 내용은 본원에 참고용으로서 인용되어 있음을 밝힌다.

실시예 1 : PTK7 에 대한 인간 단일클론 항체 제조

항원

면역화 프로토콜에서는 항원으로서, (i) myc 및 his 태그와 함께 PTK7의 세포외 부위를 포함하는 재조합 융합 단백질과, (ii) 막에 결합된 전장의 PTK7, 둘 모두를 사용하였다. 2개의 항원 모두 CHO 세포주에서 재조합 형질감염 방법에 의해 제조되었다.

트랜스제닉 HuMab 및 KM 마우스™

PTK7에 대한, 완전히 인간의 것인 단일클론 항체는, 각각 인간 항체 유전자를 발현시키는 HuMab 트랜스제닉 마우스의 HCo7 및 HCo12 변종 및 트랜스제닉 트랜스염색체 마우스의 KM 변종을 사용하여 제조하였다. 각각의 이러한 마우스 변종에서 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 [Chen et al (1993) EMBO J. 12:811-820]에 기재되어 있는 바와 같이, 한 쌍의 염색체상 동일 위치가 파괴되어 있으며(homozygously disrupted), 내인성 마우스 카파 중쇄 유전자는 PCT 공보 WO 01/09187의 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, 한 쌍의 염색체상 동일 위치가 파괴되어 있다. [Fishwild et al (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기재되어 있는 바와 같이, 이들 마우스 변종 각각은 인간 카파 경쇄 트랜스진, KCo5를 보유한다. 미국 특허 번호 제5,770,429호; 제5,545,806호; 제5,625,825호; 및 제5,545,807호에 기재되어 있는 바와 같이, HCo7 변종은 HCo7 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. WO 01/09187의 실시예 2 또는 WO 01/14424의 실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, HCo12 변종은 HCo 12 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. PCT 공보 WO 02/43478에 기재되어 있는 바와 같이, KM 변종은 SC20 트랜스염색체를 함유한다.

HuMab 및 KM 면역화:

PTK7에 대한, 완전히 인간의 것인 단일클론 항체를 제조하기 위하여 HuMab 마우스 및 KM 마우스™을 항원으로서 정제된 재조합 PTK7 융합 단백질 및 PTK7-형질감염된 CHO 세포로 면역화시켰다. HuMab 마우스에 대한 일반 면역화 방법은 ( [Lonberg, N. et al (1994,) Nature 368(6474): 856-859]; [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 및 PCT 공보 WO 98/24884)에 기재되어 있다. 항원 1차 주입시, 마우스는 6-16주령된 것이었다. PTK7 융합 단백질 항원의 정제된 재조합 제제(5-50 ㎍) 및 5 - 10 x 10⁶개의 세포를 사용하여 복강내(IP) 주사, 피하(Sc) 주사 또는 발바닥 주사하여 HuMab 마우스 및 KM 마우스™를 면역화시켰다.

트랜스제닉 마우스를 완전 프로인트 애주번트 또는 리비(Ribi) 애주번트중 항원으로 2회 IP 면역화시킨 후, 불완전 프로인트 애주번트 또는 리비 애주번트중 항원으로 3 내지 21일 동안 IP 면역화시켰다(총 11회 이하 면역화 실시). 역 안와 채혈에 의해 면역 반응을 관찰하였다. 혈장은 ELISA(전술함)에 의해 스크리닝하고, 항-PTK7 인간 면역글로불린이 충분한 역가를 나타내는 마우스는 융합용으로 사용하였다. 마우스를 안락사시키기 3일 전에 항원을 정맥내 투여하여 면역 증강시킨 후, 비장을 제거하였다. 전형적으로, 각 항원에 대하여 10 내지 35회 융합시켰다. 수십 마리의 마우스를 각 항원에 대해 면역화시켰다.

항- PTK7 항체 생산 HuMab 또는 KM 마우스™의 선택:

PTK7과 결합하는 항체를 생산하는 HuMab 또는 KM 마우스™를 선택하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 얻은 혈청을 [Fishwild, D. et al. (1996)]에 기재되어 있는 것과 같이 ELISA에 의해 시험하였다. 요약하면, 미세역가 플레이트를 형질감염된 CHO 세포로부터 유래된 재조합 PTK7 융합 단백질(PBS중 1 내지 2 ㎍/ml, 100 ㎕/웰)로 코팅한 후, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시키고, 이어서, PBS/Tween(0.05%)중 5% 우태아 혈청(200 ㎕/웰)으로 차단시켰다. PTK7-면역화 마우 스로부터 얻은 혈청의 희석액을 각 웰에 가하고, 주변 온도에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP: horseradish peroxidase)와 접합된 염소-항-인간 IgG 다중클론 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세척후, 플레이트를 ABTS 기질(Sigma, A1888, 0.22 mg/ml)을 사용하여 전개시키고, OD 415 내지 495에서 분광계로 분석하였다. 항-PTK7 항체의 역가가 가장 높게 나타났던 마우스를 융합용으로 사용하였다. 이하에 기술된 바와 같이 융합을 수행하였으며, 하이브리도마 상등액은 ELISA에 의해 항-PTK7 활성에 대해 시험하였다.

PTK7 에 대한 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조:

HuMab 마우스로부터 단리된 마우스 비장 세포를 PEG와 함께 표준 프로토콜에 기초하여 마우스 골수종 세포주에 융합시켰다. 이후, 제조된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산 여부에 대해 스크리닝하였다. 면역화된 마우스로부터 유래된 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 1/4 SP2/0인 비-분비형 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 50% PEG(Sigma)와 함께 융합시켰다. 세포를 약 1 x 10⁵/웰 만큼 편평 바닥 미세역가 플레이트에 플레이팅시킨 후, 10% 우태아 혈청, 10% P388D1(ATCC, CRL TIB-63) 조건 배지, DMEM중 3 내지 5% 오리겐(IGEN)(Mediatech, CRL 10013, 고 농도 글루코스, L-글루타민 및 피루브산나트륨 함유) + 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50mg/ml 겐타마이신 및 1 x HAT(Sigma, CRL P-7185)를 함유하는 선별 배지 중에서 약 2주 동안 인큐베이션시켰다. 1 내지 2주 경과 후, 세포를, HAT를 HT로 대체한 배지중에서 배양하였다. 이후, 각 웰을 ELISA(전술함)를 이용하여 인간 항-PTK7 단일클론 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 일반적으로는 10 내지 14일 경과 후에 배지를 관찰하였다. 만일 인간 IgG에 대해 여전히 양성 반응을 나타내면, 항체-분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하여, 이를 다시 스크리닝하였으며, 항-PTK7 단일클론 항체는 희석을 제한함으로써 2회 이상 서브클로닝하였다. 이후, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 추가의 특징화를 위한 조직 배양 배지 내에서 소량의 항체를 생성하였다. 이후, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여, 추가로 특징화하기 위한 것으로 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 수득하였다.

하이브리도마 클론 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8을 추가 분석을 위해 선택하였다.

실시예 2 : 인간 단일클론 항체인 3 G8 , 3 G8a , 4 D5 , 12 C6 , 12 C6a 및 7 C8 의 구조적 특징화

표준적인 PCR 기법을 사용하여 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 각각 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a 및 7C8 하이브리도마로부터 수득하고, 이를 표준 DNA 서열 분석 기법을 사용하여 서열을 분석하였다.

3G8의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 도 1A, 및 서열 번호 41과 1에 나타낸다.

3G8의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 도 1B, 및 서열 번호 45와 1에 나타낸다.

3G8 중쇄 면역글로불린 서열과 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 3G8 중쇄는 인간 생식계열 VH 3-30.3으로부터 유래하는 VH 분절, 미결정 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 3G8 VH 서열을 생식계열 VH 3-30.3 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 5에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 사용하여 3G8 VH 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 1A 및 5에 각각 서열 번호: 11, 15 및 19로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 3G8 경쇄 면역글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 3G8 경쇄는 인간 생식계열 VK L15로부터 유래하는 VL 분절과, 인간 생식계열 JK1로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 3G8 VL 서열을 생식계열 VK L15 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 9에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 이용하여 3G8 VL 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 1B 및 9에 각각 서열 번호: 23, 29 및 35로 나타낼 수 있었다.

3G8a의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 1A, 및 서열 번호 41과 1에 나타낸다.

3G8a의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 1C, 및 서열 번호 46과 6에 나타낸다.

3G8a 중쇄 면역글로불린 서열과 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서 열을 비교한 결과, 3G8a 중쇄는 인간 생식계열 VH 3-30.3으로부터 유래하는 VH 분절, 미결정 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 3G8a VH 서열을 생식계열 VH 3-30.3 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 5에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 사용하여 3G8a VH 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 1A 및 5에 각각 서열 번호: 11, 15 및 19로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 3G8a 경쇄 면역글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 3G8a 경쇄는 인간 생식계열 VK L15로부터 유래하는 VL 분절과, 인간 생식계열 JK3으로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 3G8a VL 서열을 생식계열 VK L15 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 9에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 이용하여 3G8a VL 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 1C 및 9에 각각 서열 번호: 24, 30 및 36으로 나타낼 수 있었다.

4D5의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 2A, 및 서열 번호 42와 2에 나타낸다.

4D5의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 2B, 및 서열 번호 47과 7에 나타낸다.

중쇄 면역글로불린 서열과 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 4D5 중쇄는 인간 생식계열 VH 3-30.3으로부터 유래하는 VH 분절, 미결정 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 4D5 VH 서열을 생식계열 VH 3-30.3 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 6에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 사용하여 4D5 VH 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 2A 및 6에 각각 서열 번호: 12, 16 및 20으로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 4D5 경쇄 면역글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 4D5 경쇄는 인간 생식계열 VK A10으로부터 유래하는 VL 분절과, 인간 생식계열 JK5로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 4D5 VL 서열을 생식계열 VK A10 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 10에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 이용하여 4D5 VL 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 2B 및 10에 각각 서열 번호: 25, 31 및 37로 나타낼 수 있었다.

12C6의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 3A, 및 서열 번호 43과 3에 나타낸다.

12C6의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 3B, 및 서열 번호 48과 8에 나타낸다.

중쇄 면역글로불린 서열과 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 12C6 중쇄는 인간 생식계열 DP44로부터 유래하는 VH 분절, 미결정 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 12C6 VH 서열을 생식계열 DP44 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 7에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 사용하여 12C6 VH 서열을 추가로 분석한 결 과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 3A 및 7에 각각 서열 번호: 13, 17 및 21로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 12C6 경쇄 면역글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 12C6 경쇄는 인간 생식계열 VK A27로부터 유래하는 VL 분절과, 인간 생식계열 JK2로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 12C6 VL 서열을 생식계열 VK A27 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 11에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 이용하여 12C6 VL 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 3B 및 11에 각각 서열 번호: 26, 32 및 38로 나타낼 수 있었다.

12C6a의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 3A, 및 서열 번호 43과 3에 나타낸다.

12C6a의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 3C, 및 서열 번호 49와 9에 나타낸다.

중쇄 면역글로불린 서열과 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 12C6a 중쇄는 인간 생식계열 DP44로부터 유래하는 VH 분절, 미결정 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 12C6a VH 서열을 생식계열 DP44 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 7에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 사용하여 12C6a VH 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 3A 및 7에 각각 서열 번호: 13, 17 및 21로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 12C6a 경쇄 면역글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 12C6a 경쇄는 인간 생식계열 VK L15로부터 유래하는 VL 분절과, 인간 생식계열 JK2로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 12C6a VL 서열을 생식계열 VK L15 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 12에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 이용하여 12C6a VL 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 3C 및 12에 각각 서열 번호: 27, 33 및 39로 나타낼 수 있었다.

7C8의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 4A, 및 서열 번호 44과 4에 나타낸다.

7C8의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 4B, 및 서열 번호 50와 10에 나타낸다.

중쇄 면역글로불린 서열과 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열을 비교한 결과, 7C8 중쇄는 인간 생식계열 VH 3-33으로부터 유래하는 VH 분절, 인간 생식계열 3-10으로부터 유래된 D 분절, 및 인간 생식계열 JH 6b로부터 유래하는 JH 분절을 이용함을 알 수 있었다. 상기 7C8 VH 서열을 생식계열 VH 3-33 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 8에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 사용하여 7C8 VH 서열을 추가로 분석한 결과, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 4A 및 8에 각각 서열 번호: 14, 18 및 22로 나타낼 수 있었다.

공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 7C8 경쇄 면역글로불린 서열을 비교한 결과, 상기 7C8 경쇄는 인간 생식계열 VK L6으로부터 유래하는 VL 분 절과, 인간 생식계열 JK 3으로부터 유래하는 JK 분절을 이용함을 알 수 있었다. 7C8 VL 서열을 생식계열 VK L6 서열에 대해 정렬시킨 결과를 도 13에 나타내었다. CDR 영역 결정에 관한 카뱃 체계를 이용하여 7C8 VL 서열을 추가로 분석한 결과, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 도 4B 및 13에 각각 서열 번호: 28, 34 및 40로 나타낼 수 있었다.

실시예 3: mAb 12 C6 의 돌연변이화 및 대안적 생식계열 용법

상기 실시예 2에 논의되어 있는 바와 같이, 단일클론 항체 12C6 및 12C6a는 HuMab 마우스^? 변종의 HCo7 트랜스진에 존재하는 인간 DP-44 생식계열 서열로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 사용한다. DP-44는, 원래의 인간 면역글로불린 레파토리에서 사용되는 생식계열 서열이 아니기 때문에, 인간 면역글로불린의 VH 서열을 돌연변이화하여 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게, 12C6 또는 12C6a VH 서열의 하나 이상의 프레임워크 잔기는, 원래의 인간 면역글로불린 레파토리에서 사용되는 구조상 관련된 VH 생식계열 서열의 프레임워크에 존재한 잔기(들)로 돌연변이화된다. 예를 들면, 도 7은 12C6 및 12C6a VH 서열을 DP44 생식계열 서열과 함께 정렬시킨 결과와, 2개의 구조적으로 관련된 인간 생식계열 서열, VH 3-23 및 VH 3-7에 대해 정렬시킨 결과를 나타낸다. 이들 서열이 관련이 있다면, 인간 PTK7에 특이적으로 결합하고, VH 3-23 또는 VH 3-7 생식계열 서열로부터 유래된 VH 영역을 사용하는 인간 항체를 선택할 수 있다고 예측할 수 있다. 게다가, VH 3-23 또는 VH 3-7 서열내 동일 위치 상에 있는 잔기(들)가 상이한 12C6 또는 12C6a VH 서열내 하나 이상의 잔기를 VH 3-23 또는 VH 3-7에 존재하는 잔기(들), 또는 그의 보존적 아미노산 치환체로 돌연변이시킬 수 있다.

실시예 4 : 항- PTK7 인간 단일클론 항체의 결합 특이성 및 결합 동력학적 특징화

본 실시예에서는, 항-PTK7 항체의 결합 특이성 및 결합 동력학은 바이어코어 분석법에 의해 조사하였다. 결합 특이성, 및 교차-경쟁은 유동 세포 분석법에 의해 조사하였다.

유동 세포 분석법에 의한 결합 특이성

세포 표면상에 재조합 인간 PTK7을 발현시키는 HEK3 세포주를 제조하고, 이를 사용하여 유동 세포 분석법에 의해 PTK7 인간 단일클론 항체의 특이성을 측정하였다. 막횡단 형태의 PTK7을 코딩하는 전장의 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드로 HEK3 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 10㎍/ml 농도의 항-PTK7 인간 단일클론 항체를 함께 인큐베이션시킴으로써 7C8 항-PTK7 인간 단일클론 항체의 결합을 평가하였다. 세포를 세척하고, FITC-표지된 항-인간 IgG Ab를 사용하여 결합 여부를 검출하였다. FACScan 유동 세포 분석기(캘리포니아주 산호세에 소재하는 Becton Dickinson)를 사용하여 유동 세포 분석법을 실시하였다. 본 결과는 도 14에 도시한다. 항-PTK7 인간 단일클론 항체 7C8은 PTK7로 형질감염된 HEK3 세포에는 결합하지만, 인간 PTK7로 형질감염되지 않은 HEK3 세포에는 결합하지 않았다. 이러한 데이타가 PTK7에 대한 항-PTK7 인간 단일클론 항체의 특이성을 입증한다.

ELISA 에 의한 결합 특이성

PTK7에 대한 결합 특이성을 조사하기 위하여 표준 ELISA에 의해 항-PTK7 항체의 결합도 평가하였다.

농도가 상이한 항-PTK7 인간 단일클론 항체 3G8, 4D5, 12C6 및 12C6a에 대한 결합에 의하여 PTK7의 재조합 세포외 도메인을 시험하였다. 표준 ELISA 방법을 실시하였다. 출발 농도를 10 ㎍/ml로 하여 항-PTK7 인간 단일클론 항체를 가하고, 1:2의 희석율로 일련의 희석액을 제조하였다. 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 접합된 염소-항-인간 IgG(카파 쇄-특이) 다중클론 항체를 2차 항체로서 사용하였다. 본 결과는 도 15에 나타낸다. 각각의 항-PTK7 인간 단일클론 항체 3G8, 4D5, 12C6 및 12C6a가 PTK7에 결합하였다. 이러한 데이타는 PTK7에 대한 항-PTK7 인간 단일클론 항체의 특이성을 입증한다.

항- PTK7 항체의 에피토프 지도화

유동 세포 분석법을 사용하여 항-PTK7 HuMAbs의 에피토프 분류를 결정지었다. 유동 세포 분석법을 사용하여 항-PTK7 HuMAbs의 에피토프 유형을 분류하였다. 빌름스 종양 세포 G-401(ATCC 수탁 번호 CRL-1441)을 막횡단 형태의 PTK7을 코딩하는 전장의 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 1 x 10⁵개의 형질감염된 세포를 10 ㎍/ml의 냉 항-PTK7 인간 단일클론 항체와 함께 인큐베이션시키고, 세척한 후, 10 ㎍/ml의 형광-접합된 항-PTK7 인간 단일클론 항체를 가함으로써 각 항-PTK7 인간 단일클론 항체의 에피토프 결합을 평가하였다. FITC-표지된 항-인간 IgG Ab를 사용하여 결합 여부를 검출하였다. FACScan 유동 세포 분석기(캘리포니아 주 산호세에 소재하는 Becton Dickinson)를 사용하여 유동 세포 분석법을 실시하였다. 데이타 분석시, 항-PTK7 항체는 3개의 에피토프 군으로 분류되었다 - 7D11을 포함하는 A군, 3G8 및 3G8a를 포함하는 B군, 및 7C8, 12C6 및 12C6a를 포함하는 C군.

실시예 5 : 인간암 세포의 표면상에서 발현되는 PTK7 에 결합하는 항- PTK7 항체의 특징화

상이한 농도의 HuMAb 항-PTK7 인간 단일클론 항체 12C6 및 7C8의 농도에 대하여 신장모세포종 빌름스 종양 세포주 G-401(ATCC 수탁 번호 CRL-1441)을 시험하였다. 1 x 10⁵개의 세포와, 출발 농도를 30 ㎍/ml로 하는 항체 및 1:10의 희석율로 희석된 일련의 항체 희석액을 함께 인큐베이션시켜 항-PTK7 인간 단일클론 항체의 결합을 평가하였다. 세포를 세척하고, PE-표지된 항-인간 IgG Ab를 사용하여 결합 여부를 검출하였다. FACScan 유동 세포 분석기(캘리포니아주 산호세에 소재하는 Becton Dickinson)를 사용하여 유동 세포 분석법을 실시하였다. 본 결과는 도 16에 나타낸다. 염색의 평균 형광 강도(MFI: mean fluorescent intensity)에 의해 측정된 바와 같이, 농도에 의존하는 방식으로 항-PTK7 단일클론 항체 12C6 및 7C8은 신장모세포종 빌름스 종양 세포주에 결합하였다. 항-PTK7 단일클론 항체 12C6 및 7C8의 EC₅₀ 값은 각각 4.035 nM 및 3.428 nM이었다.

이러한 데이타는 항-PTK7 HuMAbs가 신장암 세포주에 결합한다는 것을 입증한다.

실시예 6: 암 세포주에 대한 인간 항- PTK7 항체의 결합

유동 세포 분석법에 의해 항-PTK7 항체를 다양한 암 세포주에 대하여 시험하였다.

암 세포주를 10 ㎍/ml 농도의 항-PTK7 인간 단일클론 항체와 인큐베이션시켜 암 세포주 패널에 대한 3G8, 12C6a, 4D5 및 12C6 항-PTK7 인간 단일클론 항체의 결합을 평가하였다. 시험된 암 세포주는 A-431(ATCC 수탁 번호 CRL-1555), 빌름스 종양 세포 G-401(ATCC 수탁 번호 CRL-1441), Saos-2(ATCC 수탁 번호 HTB-85), SKOV-3(ATCC 수탁 번호 HTB-77)5 PC3(ATCC 수탁 번호 CRL-1435), DMS 114(ATCC 수탁 번호 CRL-2066), ACHN(ATCC 수탁 번호 CRL-1611), LNCaP(ATCC 수탁 번호 CRL-1740), DU 145(ATCC 수탁 번호 HTB-81), LoVo(ATCC 수탁 번호 CCL-229) 및 MIA PaCa-2(ATCC 수탁 번호 CRL-1420)였다. 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 세척하고, FITC-표지된 항-인간 IgG Ab를 사용하여 결합 여부를 검출하였다. FACScan 유동 세포 분석기(캘리포니아주 산호세에 소재하는 Becton Dickinson)를 사용하여 유동 세포 분석법을 실시하였다. 본 결과는 도 17에 나타낸다. 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이, 항-PTK7 단일클론 항체 3G8, 12C6a, 4D5 및 12C6은 암 세포주 A-431, 빌름스 종양 세포 G-401, Saos- 2, SKOV-3, PC3, DMS 114, ACHN, LNCaP, DU 145, LoVo 및 MIA PaCa-2에 결합하였다. 이러한 데이타는 항-PTK7 HuMAbs가 세포 표면에 PTK7을 발현시키는 다양한 암 세포에 결합하는 것을 입증한다.

실시예 7 : 인간 T, B 및 수지상 세포에 대한 항- PTK7 의 결합

유동 세포 분석법에 의해 세포 상에 PTK7을 발현시키는 CD4+, CD8+ T-세포, CD19+ B-세포 및 인간 혈액 골수성 수지상 세포에 대한 항-PTK7 항체의 결합에 대하여 시험하였다.

인간 항-PTK7 단일클론 항체와의 결합 이전에 T 세포 상에서 PTK7 발현을 유도하기 위하여 항-CD3 항체로 인간 T 세포를 활성화시켰다. 세포를 10 ㎍/ml 농도의 항-PTK7 인간 단일클론 항체와 인큐베이션시켜 7c8 항-PTK7 인간 단일클론 항체의 결합에 대하여 평가하였다. 일부 실험에서는 T 및 B-세포 특이 마커에 결합하는 공지 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 세척하고, FITC-표지된 항-인간 IgG Ab를 사용하여 결합 여부를 검출하였다. FACScan 유동 세포 분석기(캘리포니아주 산호세에 소재하는 Becton Dickinson)를 사용하여 유동 세포 분석법을 실시하였다. 본 결과는 도 18(활성화된 인간 T 세포 및 B-세포) 및 19(수지상 세포)에 나타낸다. 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이, 항-PTK7 단일클론 항체 7C8은 활성화된 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 수지상 세포에 결합하였지만, B 세포에는 결합하지 못했다. 이러한 데이타는 항- PTK7 HuMAbs가 인간 T-세포 및 수지상 세포에 결합한다는 것을 입증한다.

실시예 8 : 항- PTK7 단일클론 항체의 내재화

Hum-Zap 내재화 검정법을 이용하여 항-PTK7 HuMab이 PTK7-발현 세포주 내로 내재화될 수 있는 능력에 대해 시험하였다. Hum-Zap 검정법은 독소 사포린에 접합된 인간 IgG에 대한 친화도를 가지고 2차 항체와 결합함으로써 1차 인간 항체의 내재화에 대하여 시험한다.

PTK7-발현 암 세포주인 빌름스 종양 G-401(ATCC 수탁 번호 CRL-1441), A-431(ATCC 수탁 번호 CRL-1555) 및 PC3(ATCC 수탁 번호 CRL-1435)를 직접 100㎕ 웰중 1 x 10⁴개의 세포/웰로 접종하였다. 출발 농도를 30 nM로 하여 1:3의 희석율로 연속 희석시켜 역가를 낮추었다. 항-PTK7 HuMAb 항체 3G8, 4D5, 12C6 또는 7C8을 웰에 가하였다. PTK7에 비-특이성인 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. Hum-Zap(캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 Advanced Targeting Systems, IT-22-25)를 11 nM 농도로 가하고, 플레이트를 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트에 24시간 동안 1.0μCi의 ³H-티미딘 펄스를 주고, 세포를 수집하여 이를 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Top Count Scintillation Counter; 코네티컷주 메리덴에 소재하는 Packard Instruments)로 판독하였다. 그 결과를 도 20A-D에 나타내었다. 항-PTK7 항체 3G8, 4D5, 12C6 및 7C8의 농도는 PTK7-발현 빌름스 종양 암 세포주에 ³H-티미딘이 혼입되는 양이 감소함에 따라서 감소한다는 것을 알 수 있었다. 항-PTK7 항체 12C6 및 7C8의 농도는 PTK7-발현 암 세포주 A-431 및 PC3에 ³H-티미딘이 혼입되는 양이 감소함에 따라서 감소한다는 것을 알 수 있었다. 빌름스 종양 세포에서 항-PTK7 항체 3G8, 4D5, 12C6 및 7C8에 대한 EC₅₀ 값은 각각 0.6437 nM, 0.2516 nM, 0.2053 nM 및 0.1788 nM이었다. A-431 세포에서 항-PTK7 항체 12C6 및 7C8의 EC₅₀ 값은 각각 0.1657 nM 및 0.1826 nM이었다. PC3 종양 세포에서 항-PTK7 항체 12C6 및 7C8에 대한 EC₅₀ 값은 각각 0.3175 nM 및 0.2648 nM이었다. 이러한 데이타는 항-PTK7 항체 3G8, 4D5, 12C6 및 7C8이 암 세포에 내재화됨을 입증한다.

실시예 9: 인간 암 세포주 상에서 독소- 접합된 항- PTK7 항체의 세포 사멸 평가

본 실시예에서는, 세포 증식 검정법으로 독소에 접합된 항-PTK7 단일클론 항체가 PTK7+ 인간 암 세포주를 사멸시키는 능력에 대해 시험하였다 .

항-PTK7 HuMAb 항체 12C6a를 링커, 예로서, 펩티딜, 하이드라존 또는 디설파이드 링커를 통하여 독소에 접합시켰다. 본 발명의 항체에 접합될 수 있는 독소 화합물의 예는, 2005년 9월 26일자 Attorney Docket No.04280/100M629US3으로 출원된 출원에 기재되어 있다. PTK7-발현 빌름스 종양 인간 신장암 세포주 G-401(ATCC 수탁 번호 CRL-1441)을 3시간 동안 100㎕웰중 10⁴개 세포/웰로 접종하였다. 출발 농도를 30 nM로 하여 1:3의 희석율로 연속 희석시켜 역가를 낮추었다. 항-PTK7 항체-독소 접합체를 웰에 가하였다. 플레이트를 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 배양 종결 이전에, 플레이트에 24시간 동안 1.0μCi의 ³H-티미딘 펄스를 주고, 세포를 수집하여 이를 탑 카운트 신틸레이션 카운터로 판독하였다. 도 21은 12C6a-접합체가 빌름스 종양 세포에 미치는 효과를 나타낸다. 항-PTK7 항체 12C6a의 농도는 PTK7-발현 빌름스 종양 인간 신장암 세포주에 ³H-티미딘이 혼입되는 양이 감소함에 따라서 감소한다는 것을 알 수 있었다.

본 데이타는 독소에 접합된 항-PTK7 항체가 인간 신장암 세포에 대하여 특이적인 세포 독성을 나타낸다는 것을 입증한다.

실시예 10 : 인간 종양 세포주 상에서 독소- 접합체된 항- PTK7 항체의 세포 사멸 평가

본 실시예에서는, 세포 증식 검정법으로 독소에 접합된 항-PTK7 단일클론 항체가, 세포 표면 상에 PTK7을 소량, 중간 정도의 양, 또는 다량으로 발현시키는 PTK7+ 인간 종양 세포주를 사멸시키는 능력에 대해 시험하였다.

항-PTK7 HuMAb 항체 12C6a를 링커, 예로서, 펩티딜, 하이드라존 또는 디설파이드 링커를 통하여 독소에 접합시켰다. 본 발명의 항체에 접합될 수 있는 독소 화합물의 예는, 2005년 9월 26일자 Attorney Docket No.04280/100M629US3으로 출원된 출원에 기재되어 있다. PTK7-발현 인간 종양 암 세포주 A-431, SKO V3, 및 LoVo를 100㎕웰중 10⁴개 세포/웰로 접종하였다. 표준 FACS 검정법으로 세포주를 PTK7의 세포 발현에 대하여 상기와 같이 시험하였다. A-431 세포주가 가장 높은 수준으로 PTK7을 세포 표면 상에서 발현시키는 것으로 나타났고, LoVo 세포주는 가장 낮은 수준으로 PTK7을 세포 표면 상에서 발현시키는 것으로 나타났다. 출발 농도를 20 nM로 하여 1:2의 희석율로 연속 희석시켜 역가를 낮추었다. 항-PTK7 항체-독소 접합체를 웰에 가하였다. 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 3시간 동안 인큐베이션시키고, 비결합(유리) 항체-독소 접합체는 세척하였 다. 계속하여 플레이트를 96시간 동안 인큐베이션시키고, 바이오-테크(BIO-TEK) 판독기(미국 버몬트주에 소재하는 Bio-Tek Instruments)를 사용하여 프로토콜에 따라 셀타이터-글로(CELLTITER-GLO)? 발광 검정법(미국 위스콘신주 프로메가 소재, Technical bulletin No. 2S8)으로 세포 생육성에 의해 사멸 활성(FU, 형광 단위)을 측정하였다. 본 결과는 도 22에 나타낸다. 증식 검정법에서 항-PTK7-독소 접합체의 농도는 PTK7-발현 A431^고, SKOV3^중, 및 LoVo^저 양이 감소함에 따라서 감소한다는 것을 알 수 있었다.

본 데이타는 독소에 접합된 항-PTK7 항체가 다양한 인간 암 세포에 대하여 특이적인 세포 독성을 나타낸다는 것을 입증한다.

실시예 11 : 3 G8 , 12 C6a , 2 E11 을 사용한 면역조직화학법

폐암, 유방암, 방광암, 췌장암, 결장암, 난소암, 소장암 & 전립선암으로부터 유래된 임상적 생검을 사용함으로써 항-PTK7 HuMAbs 3G8, 12C6a, 및 2E11이 PTK7을 인식할 수 있는 능력을 면역조직화학법에 의해 조사하였다.

면역조직화학법을 위해, 5㎛ 동결 절편을 사용하였다 (미국 소재의 Ardais Inc). 30분 동안 건조시킨 후, 아세톤으로 상기 절편을 고정시키고(실온에서 10분간), 5분 동안 대기 건조시켰다. 슬라이드를 PBS에서 세정한 후, 20분 동안 PBS중 10% 정상 염소 혈청과 함께 사전-인큐베이션시킨 후, 이어서, 실온에서 30분 동안 10% 정상 염소 혈청를 포함하여, PBS중 10 ㎍/ml의 FITC화된(fitcylated) 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 3회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 마우스 항-FITC(1O㎍/ml DAKO)와 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 다시 3xPBS로 세척하였다. 디아미노벤지딘(Sigma)을 기질로서 사용하여 갈색 염색을 수득하였다. 증류수로 세척한 후, 슬라이드를 1분간 헤마톡실린을 사용하여 대조 염색시켰다. 이어서, 슬라이드를 흐르는 증류수에서 10초간 세척하고, 글리세롤(DAKO)에 탑재하였다. 임상 생검 면역조직화학적 염색법에 의해 폐암, 유방암, 방광암, 췌장암, 결장암, 난소암, 소장암 & 전립선암 절편에서는 양성을 나타내었다. 정상 조직은 PTK7 염색에 대해 항상을 음성을 띠지만, 악성 조직내의 암 활성화된 섬유모세포 및 암성 상피세포, 둘 모두는 PTK7 염색에 대해 양성인 것으로 관찰되었다. 암 활성화된 섬유모세포의 실체는 섬유모세포 활성화 단백질 항체(FAP: Fibroblast Activation Protein, 미국 샌디에고에 소재하는 Alexis Biochemicals)로 염색하여 방광암 및 유방암 절편에서 확인하였다. FAP는 암 활성화된 섬유모세포의 공지된 마커이다[Hofheinz et a (2003) Oncologie 26:44-48].

실시예 12: 침윤 검정법

본 실시예에서는 PTK7로 형질감염된 CHO 세포주에서 PTK7에 대한 항체가 세포 침윤에 영향을 줄 수 있는 능력에 대하여 PTK7에 대한 항체를 시험하였다. 본 검정법은 프로토콜에 따라 HTS 96-멀티웰 이서트 시스템(HTS 96-Multiwell Insert System)(카탈로그 번호 351162, 캘리포니아주에 소재하는 BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다. CHO 모체 세포주, 전장의 PTK7로 형질감염된 CHO 세포 또는 대조군 HEK293 세포주를 삽입체로 가하기 앞서, 상기 세포를 항-PTK7 HuMabs 또는 이소타입 대조군 항체 풀과 혼합하였다. 혼합물(세포+Ab 풀)을 침윤 플레이트내 삽입 웰에 가하였다. 24시간 동안 37℃에서 5%와 함께 인큐베이션시킨 후, 세포를 형광 염료로 표지하고, 형광 플레이트 판독기를 사용하여 막의 바닥으로 침윤된 세포를 정량하였다. 본 결과는 도 23에 나타낸다. 이러한 데이타는 항-PTK7 항체가 세포 표면상에 PTK7을 발현시키는 세포의 침윤성 이동을 저해한다는 것을 입증한다.

실시예 13 : 네이키드 및 세포 독소- 접합된 항- PTK7 항체를 사용한 생체내 췌장암 세포 이종이식 모델의 치료

본 실시예는 항체가 생체내에서 종양 성장에 대하여 미치는 효과를 조사하기 위하여 독소-접합된 항-PTK7 항체를 사용하여 췌장 세포 암종 종양을 이식받은 마우스의 생체내 치료법을 개시한다.

HPAC (인간 췌장 샘암종(human pancreatic adenocarcinoma), ATCC 수탁 번호 CRL-2119) 또는 다른 적합한 췌장암 세포는 표준 실험실 방법을 사용하여 시험관내에서 확장시켰다. 6-8주령된 가슴샘이 없는 Ncr 누드 마우스 수컷(뉴욕주 허드슨에 소재하는 Taconic) 오른쪽 옆구리에 마우스 1마리당 0.2 ml의 PBS/마트리겔(Matrigel)(1:1)중 2.5 x 10⁶ 개의 HPAC 세포를 이식하였다. 마우스의 체중을 측량하고, 이식 후 매주 2회씩 전기 캘리퍼를 사용하여 종양을 3차원으로 측정하였다. 종양 부피는 높이 x 폭 x 길이/2로 계산하였다. 평균 90 ㎣인 HPAC 종양을 갖는 마우스를 처리군으로 임의 추출하였다. 0일째에 지정된 투여량(μmol/kg)으로 PBS 비히클, 네이키드 항-PTK7 항체, 또는 독소-접합된 항-PTK7 HuMAb를 상기 마우스에 단일 정맥 투여하였다. 본 발명의 항체에 접합될 수 있는 독소 화합물의 일례 는 계류중인 미국 특허 출원 시리얼 번호 제11/134,826호, 및 MEDX-0034US4로 명시된 계류중인 미국 특허 출원에 기재되어 있다. 투여후 61일 동안 종양 성장에 대하여 마우스를 관찰하였다. 종양이 종양 종점(2000 ㎣)에 도달하였을 때, 또는 궤양화되었을 때, 마우스를 안락사시켰다. 독소에 접합된 항-PTK7 항체는 종양 성장 진행 속도를 저속화시켰다. 본 결과는 도 24에 나타낸다. 항-PTK7 독소 접합체의 항-종양 효과는 투여량에 의존하였는데, 0.3 μmol/kg의 투여량을 사용하였을 때 가장 효과가 관찰되었다. 항-PTK7 독소 접합체를 사용한 치료법에서는 잘 내성화되었고, 피험체는 5% 초과의 중앙 체중 손실을 경험하지는 못했다(데이타는 나타내지 않음). 따라서, 항-PTK7 항체-독소 접합체를 사용한 치료법이 췌장암 종양 성장에 대하여 직접적인 생체내 저해 효과를 갖고 있었다.

실시예 14 : 네이키드 및 세포 독소- 접합된 항- PTK7 항체를 사용한 생체내 유방암 세포 이종이식 모델의 치료법

본 실시예는 항체가 종양 성장에 미치는 생체내 효과를 조사하기 위하여 아드리아마이신 내성 유방암종 종양을 이식받은 마우스를 독소-접합된 항-PTK7 항체로 생체내에서 치료하는 것에 관하여 개시한다.

표준 실험실 방법을 사용하여 시험관내에서 MCF7-adr(아드리아마이신에 대하여 내성을 띠는 인간 유방암 세포주)을 확장시켰다. 6-8주령된 암컷 CB17.SCID 마우스(뉴욕주 허드슨에 소재하는 Taconic) 1마리당 0.2 ml의 PBS/마트리겔(1:1)중 10 x 10⁶개의 MCF7-Adr 세포를 우측 옆구리에 피하 이식시키기 1일 전에 목 부위에 3.0 mm 크기의 1.7 mg 90-일 방출 에스트로겐 펠릿(플로리다주 새러소타에 소재하는 Innovative Research of America)을 피하 이식시켰다. 마우스의 체중을 측량하고, 이식 후 매주 2회씩 전기 캘리퍼를 사용하여 종양을 3차원으로 측정하였다. 종양 부피는 높이 x 폭 x 길이/2로 계산하였다. 평균 160 ㎣인 MCF7-adr 종양을 갖는 마우스를 처리군으로 임의 추출하였다. 0일째에 0.1 μmol/kg의 PBS 비히클, 네이키드 항-PTK7 항체, 또는 독소-접합된 항-PTK7 HuMAb를 상기 마우스에 단일 정맥 투여하였다. 본 발명의 항체에 접합될 수 있는 독소 화합물의 일례는 계류중인 미국 특허 출원 시리얼 번호 제11/134,826호, 및 MEDX-0034US4로 명시된 계류중인 미국 특허 출원에 기재되어 있다. 투여후 63일 동안 종양 성장에 대하여 마우스를 관찰하였다. 종양이 궤양화되었을 때, 마우스를 안락사시켰다. 본 결과는 도 25에 나타낸다. 독소에 접합된 항-PTK7 항체는 종양 성장 진행 속도를 저속화시켰다. 따라서, 항-PTK7 항체-독소 접합체를 사용한 치료법이 유방암 종양 성장에 대하여 직접적인 생체내 저해 효과를 갖고 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> MEDAREX, INC. <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROTEIN TYROSINE KINASE 7 (PTK7) AND METHODS FOR USING ANTI-PTK7 ANTIBODIES <130> MXI-345PC <140> <141> <150> 60/748,373 <151> 2005-12-08 <160> 69 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Trp Ser Ile Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asn Ser Tyr Tyr Gly 100 105 110 Thr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asn Tyr Ala Met His 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Tyr Ala Phe His 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Thr Tyr Leu Met Tyr 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Ile Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Trp Ser Ile Asp Asn 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Leu Gly Tyr 1 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asn Ser Tyr Tyr Gly Thr Asp 1 5 10 15 Val <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr 1 5 10 <210> 41 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 41 cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg cga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc atc ttc agt aac tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tca tat gat gga aac aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gag gtc tgg agt att gac aac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Arg Glu Val Trp Ser Ile Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 42 cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gct ttc cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Ala Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tca tat gat gga agc att aaa tac tac gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agg acg tac tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc 336 Ala Arg Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 gtc tcc tca 345 Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 43 gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cat cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca ggc tct gga ttc acc ttc agt acc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 ctt atg tac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa act ctg gag tgg gtc 144 Leu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca gct att ggt tct ggt ggt gat aca tac tat gca gac tcc gtg aag 192 Ser Ala Ile Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ttg tat ctt 240 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac atg gct gtg tat tac tgt gca 288 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gga ctg ggc tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 336 Arg Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 44 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <400> 44 cag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tgg gat gat gga agt aat aaa tac tat gta gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gat gat tac tat ggt tcg ggg agt ttt aac tcc tac tac ggt 336 Ala Arg Asp Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asn Ser Tyr Tyr Gly 100 105 110 acg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 378 Thr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 45 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 45 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat aat agt tac cct cgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 46 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat aat agt tac cca ttc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 321 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 47 gaa att gtg ctg act cag tct cca gac ttt cag tct gtg act cca aag 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 gag aaa gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag agc att ggt agt agc 96 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 tta cac tgg tac cag cag aaa cca gat cag tct cca aag ctc ctc atc 144 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 aag tat gct tcc cag tcc ttc tca ggg gtc ccc tcg agg ttc agt ggc 192 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc aat agc ctg gaa gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 gaa gat gct gca gcg tat tac tgt cat cag agt agt agt tta ccg atc 288 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Ile 85 90 95 acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 48 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 48 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt agc tca ccc 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 atg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 327 Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 49 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat aat agt tac ccg tac 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 50 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 50 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc atc tac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Tyr 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac tgg cct cca 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 324 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 51 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 52 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 53 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 54 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 55 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro 85 90 95 <210> 56 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 57 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 58 <211> 1070 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Met Gly Ala Ala Arg Gly Ser Pro Ala Arg Pro Arg Arg Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Ser Val Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Gly Thr Gln Thr Ala Ile 20 25 30 Val Phe Ile Lys Gln Pro Ser Ser Gln Asp Ala Leu Gln Gly Arg Arg 35 40 45 Ala Leu Leu Arg Cys Glu Val Glu Ala Pro Gly Pro Val His Val Tyr 50 55 60 Trp Leu Leu Asp Gly Ala Pro Val Gln Asp Thr Glu Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ser Ser Leu Ser Phe Ala Ala Val Asp Arg Leu Gln Asp Ser 85 90 95 Gly Thr Phe Gln Cys Val Ala Arg Asp Asp Val Thr Gly Glu Glu Ala 100 105 110 Arg Ser Ala Asn Ala Ser Phe Asn Ile Lys Trp Ile Glu Ala Gly Pro 115 120 125 Val Val Leu Lys His Pro Ala Ser Glu Ala Glu Ile Gln Pro Gln Thr 130 135 140 Gln Val Thr Leu Arg Cys His Ile Asp Gly His Pro Arg Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Gln Trp Phe Arg Asp Gly Thr Pro Leu Ser Asp Gly Gln Ser Asn His 165 170 175 Thr Val Ser Ser Lys Glu Arg Asn Leu Thr Leu Arg Pro Ala Gly Pro 180 185 190 Glu His Ser Gly Leu Tyr Ser Cys Cys Ala His Ser Ala Phe Gly Gln 195 200 205 Ala Cys Ser Ser Gln Asn Phe Thr Leu Ser Ile Ala Asp Glu Ser Phe 210 215 220 Ala Arg Val Val Leu Ala Pro Gln Asp Val Val Val Ala Arg Tyr Glu 225 230 235 240 Glu Ala Met Phe His Cys Gln Phe Ser Ala Gln Pro Pro Pro Ser Leu 245 250 255 Gln Trp Leu Phe Glu Asp Glu Thr Pro Ile Thr Asn Arg Ser Arg Pro 260 265 270 Pro His Leu Arg Arg Ala Thr Val Phe Ala Asn Gly Ser Leu Leu Leu 275 280 285 Thr Gln Val Arg Pro Arg Asn Ala Gly Ile Tyr Arg Cys Ile Gly Gln 290 295 300 Gly Gln Arg Gly Pro Pro Ile Ile Leu Glu Ala Thr Leu His Leu Ala 305 310 315 320 Glu Ile Glu Asp Met Pro Leu Phe Glu Pro Arg Val Phe Thr Ala Gly 325 330 335 Ser Glu Glu Arg Val Thr Cys Leu Pro Pro Lys Gly Leu Pro Glu Pro 340 345 350 Ser Val Trp Trp Glu His Ala Gly Val Arg Leu Pro Thr His Gly Arg 355 360 365 Val Tyr Gln Lys Gly His Glu Leu Val Leu Ala Asn Ile Ala Glu Ser 370 375 380 Asp Ala Gly Val Tyr Thr Cys His Ala Ala Asn Leu Ala Gly Gln Arg 385 390 395 400 Arg Gln Asp Val Asn Ile Thr Val Ala Thr Val Pro Ser Trp Leu Lys 405 410 415 Lys Pro Gln Asp Ser Gln Leu Glu Glu Gly Lys Pro Gly Tyr Leu Asp 420 425 430 Cys Leu Thr Gln Ala Thr Pro Lys Pro Thr Val Val Trp Tyr Arg Asn 435 440 445 Gln Met Leu Ile Ser Glu Asp Ser Arg Phe Glu Val Phe Lys Asn Gly 450 455 460 Thr Leu Arg Ile Asn Ser Val Glu Val Tyr Asp Gly Thr Trp Tyr Arg 465 470 475 480 Cys Met Ser Ser Thr Pro Ala Gly Ser Ile Glu Ala Gln Ala Arg Val 485 490 495 Gln Val Leu Glu Lys Leu Lys Phe Thr Pro Pro Pro Gln Pro Gln Gln 500 505 510 Cys Met Glu Phe Asp Lys Glu Ala Thr Val Pro Cys Ser Ala Thr Gly 515 520 525 Arg Glu Lys Pro Thr Ile Lys Trp Glu Arg Ala Asp Gly Ser Ser Leu 530 535 540 Pro Glu Trp Val Thr Asp Asn Ala Gly Thr Leu His Phe Ala Arg Val 545 550 555 560 Thr Arg Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Ala Ser Asn Gly Pro 565 570 575 Gln Gly Gln Ile Arg Ala His Val Gln Leu Thr Val Ala Val Phe Ile 580 585 590 Thr Phe Lys Val Glu Pro Glu Arg Thr Thr Val Tyr Gln Gly His Thr 595 600 605 Ala Leu Leu Gln Cys Glu Ala Gln Gly Asp Pro Lys Pro Leu Ile Gln 610 615 620 Trp Lys Gly Lys Asp Arg Ile Leu Asp Pro Thr Lys Leu Gly Pro Arg 625 630 635 640 Met His Ile Phe Gln Asn Gly Ser Leu Val Ile His Asp Val Ala Pro 645 650 655 Glu Asp Ser Gly Arg Tyr Thr Cys Ile Ala Gly Asn Ser Cys Asn Ile 660 665 670 Lys His Thr Glu Ala Pro Leu Tyr Val Val Asp Lys Pro Val Pro Glu 675 680 685 Glu Ser Glu Gly Pro Gly Ser Pro Pro Pro Tyr Lys Met Ile Gln Thr 690 695 700 Ile Gly Leu Ser Val Gly Ala Ala Val Ala Tyr Ile Ile Ala Val Leu 705 710 715 720 Gly Leu Met Phe Tyr Cys Lys Lys Arg Cys Lys Ala Lys Arg Leu Gln 725 730 735 Lys Gln Pro Glu Gly Glu Glu Pro Glu Met Glu Cys Leu Asn Gly Gly 740 745 750 Pro Leu Gln Asn Gly Gln Pro Ser Ala Glu Ile Gln Glu Glu Val Ala 755 760 765 Leu Thr Ser Leu Gly Ser Gly Pro Ala Ala Thr Asn Lys Arg His Ser 770 775 780 Thr Ser Asp Lys Met His Phe Pro Arg Ser Ser Leu Gln Pro Ile Thr 785 790 795 800 Thr Leu Gly Lys Ser Glu Phe Gly Glu Val Phe Leu Ala Lys Ala Gln 805 810 815 Gly Leu Glu Glu Gly Val Ala Glu Thr Leu Val Leu Val Lys Ser Leu 820 825 830 Gln Ser Lys Asp Glu Gln Gln Gln Leu Asp Phe Arg Arg Glu Leu Glu 835 840 845 Met Phe Gly Lys Leu Asn His Ala Asn Val Val Arg Leu Leu Gly Leu 850 855 860 Cys Arg Glu Ala Glu Pro His Tyr Met Val Leu Glu Tyr Val Asp Leu 865 870 875 880 Gly Asp Leu Lys Gln Phe Leu Arg Ile Ser Lys Ser Lys Asp Glu Lys 885 890 895 Leu Lys Ser Gln Pro Leu Ser Thr Lys Gln Lys Val Ala Leu Cys Thr 900 905 910 Gln Val Ala Leu Gly Met Glu His Leu Ser Asn Asn Arg Phe Val His 915 920 925 Lys Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Ser Ala Gln Arg Gln Val 930 935 940 Lys Val Ser Ala Leu Gly Leu Ser Lys Asp Val Tyr Asn Ser Glu Tyr 945 950 955 960 Tyr His Phe Arg Gln Ala Trp Val Pro Leu Arg Trp Met Ser Pro Glu 965 970 975 Ala Ile Leu Glu Gly Asp Phe Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe 980 985 990 Gly Val Leu Met Trp Glu Val Phe Thr His Gly Glu Met Pro His Gly 995 1000 1005 Gly Gln Ala Asp Asp Glu Val Leu Ala Asp Leu Gln Ala Gly Lys Ala 1010 1015 1020 Arg Leu Pro Gln Pro Glu Gly Cys Pro Ser Lys Leu Tyr Arg Leu Met 1025 1030 1035 1040 Gln Arg Cys Trp Ala Leu Ser Pro Lys Asp Arg Pro Ser Phe Ser Glu 1045 1050 1055 Ile Ala Ser Ala Leu Gly Asp Ser Thr Val Asp Ser Lys Pro 1060 1065 1070 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 61 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala 35 40 45 Asn Ala Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 62 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 1 5 10 15 Ser Ser <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10

Claims

(a) 인간 PTK7에 특이적으로 결합하고;

(b) 1×10⁵개 세포를 출발 농도 30 ㎍/ml의 항체와 인큐베이션하고 그 항체를 1:10의 희석률로 계열 희석하는 것을 포함하는 검정법에서, 4.0 nM 이하의 EC₅₀으로 빌름스 종양(Wilms' tumor) 세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-1441)에 결합하며;

(c) (i) 서열 번호 2에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는

(ii) 서열 번호 3에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는

(iii) 서열 번호 4에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 10에 기재된 경쇄 가변 영역

을 포함하는 기준 항체와 동일한, 인간 PTK7 상의 에피토프에 결합하는, 단리된 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부.
제1항에 있어서, IgG1 또는 IgG4 이소타입의 전장 항체인 항체.
제1항에 있어서,

a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

b) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 것인 항체.
제1항에 있어서,

(a) 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는

b) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3

을 포함하는 것인 항체.
(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(b) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(c) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(d) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(e) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(f) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부.
(a) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 29를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;

(b) 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 30을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;

(c) 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;

(e) 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 27을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는

(f) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3

을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부.
치료제에 결합된 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 면역접합체.
서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 또는 서열 번호 10을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합부의 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
제8항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제9항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제10항의 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 단계 및 숙주 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는 항-PTK7 항체의 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함하는, PTK7을 발현하는 종양 세포의 성장을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
제12항에 있어서, 질환이 결장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 신장암, 방광암, 난소암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택되는 암인 약학 조성물.
인간 PTK7과의 결합에 대해 제5항 또는 제6항의 기준 항체와 경쟁하는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합부.
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