Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

EA016577B1 - Конъюгаты антитело-лекарство и их применение - Google Patents

Конъюгаты антитело-лекарство и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA016577B1
EA016577B1 EA200800952A EA200800952A EA016577B1 EA 016577 B1 EA016577 B1 EA 016577B1 EA 200800952 A EA200800952 A EA 200800952A EA 200800952 A EA200800952 A EA 200800952A EA 016577 B1 EA016577 B1 EA 016577B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
substituted
unsubstituted
compound
drug conjugate
Prior art date
Application number
EA200800952A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800952A1 (ru
Inventor
Шарон Элейн Бойд
Лян Чэнь
Санджив Гангвар
Винсен Герлавэ
Килиан Хорган
Билал Суфи
Хайчунь Хуан
Дэвид Джон Кинг
Чинь Пань
Жозефин М. Кардарелли
Original Assignee
Медарекс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Медарекс, Инк. filed Critical Медарекс, Инк.
Publication of EA200800952A1 publication Critical patent/EA200800952A1/ru
Publication of EA016577B1 publication Critical patent/EA016577B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6805—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a vinca alkaloid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к являющимся мощными цитотоксинами конъюгатам антитело-лекарство, в которых лекарство связано с антителом через линкер. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим конъюгаты антитело-лекарство, и к способам лечения с их применением.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки
По заявке на данный патент согласно 35 и.8.С. 119(е) испрашивается приоритет по более ранней дате подачи предварительной заявки на выдачу патента США 60/720499, поданной 26 сентября 2005 г., и полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к конъюгатам антитело-лекарство, которые расщепляются ίη νίνο. Конъюгаты антитело-лекарство могут образовывать пролекарства и конъюгаты цитотоксинов.
Предпосылки создания изобретения
Многие терапевтические средства, в частности те, которые особенно эффективны при химиотерапии рака, обычно обладают острой токсичностью ίη νίνο, в особенности токсичностью в отношении костного мозга и слизистых оболочек, а также хронической кардиотоксичностью и нейротоксичностью. Такая высокая токсичность может ограничивать их применение. Для более эффективной борьбы с раковыми клетками и уменьшения числа и тяжести побочных эффектов указанных продуктов (токсичность, разрушение нераковых клеток и т.д.) желательна разработка более многочисленных и безопасных терапевтических средств, в частности противоопухолевых средств. Другой проблемой некоторых существующих терапевтических средств является их менее чем оптимальная стабильность в плазме крови. Введение функциональных групп для стабилизации указанных соединений приводит к значительному снижению активности. Следовательно, является желательным определение путей стабилизации соединений при сохранении приемлемого уровня терапевтической активности.
Поиск более избирательных цитотоксических средств очень активно проводился в течение десятилетий, причем лимитируемая дозой токсичность (т.е. нежелательная активность цитотоксинов на нормальные ткани) являлась одной из главных причин неудач при терапии рака. Например, известно, что СС-1065 и дуокармицины являются чрезвычайно мощными цитотоксинами.
СС-1065 был впервые выделен из 81герЮтусек хе1ег1к1к в 1981 г. υρ)ο1ιη Сотрапу (Напка е1 а1., к ΑηΙίόίοΙ. 31: 1211 (1978); Майш е! а1., I. Αηίίΐπο!. 33: 902 (1980); Майш е! а1., I. Αηίίΐποί. 34: 1119 (1981)) и было показано, что он обладает мощной противоопухолевой и противомикробной активностью как ίη νίΙΐΌ. так и на экспериментальных животных (Ь1 е1 а1., Самсет Век. 42: 999 (1982)). СС-1065 связывается в двухцепочечной В-ДНК в пределах малой бороздки (8^ηκοη е1 а1., Саисет Век. 42: 2821 (1982)) с предпочтением последовательности 5'-6(Α/6ΝΤΤΑ)-3' и 5'-6(ΑΑΑΑΑ)-3' и алкилирует Ы3-положение 3'аденина при помощи своего СР1 1еП-11аг1б ηηίί, содержащегося в молекуле (Ниг1еу е1 а1., 8с1ег1се 226: 843 (1984)). Несмотря на свою мощную и широкую противоопухолевую активность, СС-1065 не может применяться людьми, поскольку он вызывает у экспериментальных животных отсроченную смерть.
В данной области техники известны многие аналоги и производные СС-1065 и дуокармицинов. Был сделан обзор исследования структуры, синтеза и свойств многих из соединений (см., например, Βο^Γ е1 а1., Лг1де\\·. Сйет. Ιηΐ. Еб. Εη§1. 35: 1438 (1996); и Βο^Γ е! а1., Сйет. Веν. 97: 787 (1997)).
Группой из Ι<ΛΌ\νη Ηη1<1<ο Κοβ\Γΐ СЪ., Мб. был получен ряд производных СС-1065 (см., например, патенты США № 5101038; 5641780; 5187186; 5070092; 5703080; 5070092; 5641780; 5101038 и 5084468; опубликованную заявку согласно РСТ XVО 96/10405; опубликованную заявку на выдачу европейского патента 0537575 А1).
Активность при получении производных СС-1065 также была проявлена υρίοΐιη ^тращ (Рйагташа ирщйи) (см., например, патенты США № 5739350; 4978757; 5332837 и 4912227).
Исследования были также сконцентрированы на разработке новых терапевтических средств в форме пролекарств, т.е. соединений, которые способны преобразовываться ίη νίνο в лекарства (активные терапевтические соединения) путем определенных химических или ферментативных модификаций их структуры. С целью снижения токсичности такое преобразование предпочтительно ограничивается местом приложения действия или являющейся мишенью тканью, а не кровеносной системой или не являющейся мишенью тканью. Тем не менее даже использование пролекарств является проблематичным, поскольку многие из них характеризуются низкой стабильностью в крови и в сыворотке крови вследствие содержания ферментов, разрушающих или активирующих пролекарства до того, как пролекарства достигают требуемого места в организме больного.
Компанией ВпкЮЕМуегк 8с.|шЬЬ были описаны расщепляемые лизосомальными ферментами конъюгаты противоопухолевого лекарства (см., например, патент США № 6214345). Этот патент относится к аминобензилоксикарбонилу.
Компанией 8еай1е Сег1еОск были опубликованы заявка на выдачу патента США 2003/0096743 и заявка на выдачу патента США 2003/0130189, в которых описаны парааминобензиловые эфиры в средствах для доставки лекарственных средств. Описанные в этих заявках линкеры ограничиваются аминобензилэфирными композициями.
Другие группы также содержат описанные линкеры (см., например, бе ΟτοοΙ е! а1., 1 Меб. Сйет. 42, 5277 (1999); бе Οτοοΐ е! а1. I. Огд. Сйет. 43, 3093 (2000); бе Οτοοΐ е! а1., I. Меб. Сйет. 66, 8815, (2001); νθ 02/083180; Саг1 е! а1., I. Меб. Сйет. Ьей. 24, 479, (1981); Οι.ιόο\\Ό1ιί1< е! а1., Βίοοτ§ & Меб. Сйет. Ьей. 8, 3347 (1998)). Такие линкеры включают аминобензилэфирный спейсер, системы с удлиненным каскадом электронов и спейсером циклизации, спейсеры предотвращения циклизации, такие как
- 1 016577 ν-аминоаминокарбонилы, и парааминобензилоксикарбонильный линкер.
Стабильность цитотоксических лекарств, включая стабильность ΐη νΐνο, по-прежнему представляет собой важный аспект, который следует рассматривать. Кроме того, токсичность многих соединений делает их менее пригодными, поэтому требуются композиции, применение которых может снижать токсичность лекарства, например, путем образования расщепляемого пролекарства. Поэтому, несмотря на успехи в данной области техники, по-прежнему сохраняется потребность в разработке усовершенствованных терапевтических средств для лечения млекопитающих, и в частности людей, а более конкретно цитотоксинов, которые обладают высокой специфичностью действия, сниженной токсичностью и улучшенной стабильностью в крови по сравнению с известными соединениями сходной структуры. Настоящее изобретение относится к этим целям.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к конъюгатам антитело-лекарство, где лекарство и антитело связаны посредством линкера, такого как петидильный, гидразиновый или дисульфидный линкер. Указанные конъюгаты являются мощными цитотоксинами, которые могут избирательно доставляться в интересующее место приложения действия в активной форме, а затем расщепляться с высвобождением активного лекарства. Ножки линкера по настоящему изобретению могут быть отщеплены от цитотоксичных лекарств ΐη νΐνο, например, путем ферментативного расщепления или восстановления, с высвобождением фрагмента активного лекарства и пролекарственного производного.
Один пример осуществления представляет собой конъюгат антитело-лекарство, который содержит антитело, обладающее специфичностью по крайней мере к одному типу опухолей; лекарство и линкер, соединяющий антитело и лекарство. Линкер является расщепляемым в присутствии опухоли. Конъюгат антитело-лекарство замедляет или блокирует рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозе, равной 1 мкмоль/кг или меньшей. Предпочтительно конъюгат антитело-лекарство замедляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозе, равной 1 мкмоль/кг или меньшей (имеется в виду молей лекарства), в течение по крайней мере 5 суток. По крайней мере, в некоторых примерах осуществления опухоль представляет собой свойственная человеку опухоль у мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СГО-мыши). В качестве примера 8СГО-мышью может являться СВ17.8СГО-мышь (доступная для приобретения от Тасошс, Стегтаикчеи, ΝΥ).
Настоящее изобретение также относится к группам, пригодным для стабилизации терапевтических средств и маркеров. Стабилизирующие группы выбирают, например, для ограничения выведения и метаболизма терапевтического средства или маркера ферментами, которые могут присутствовать в крови и не являющейся мишенью ткани. Стабилизирующие группы могут служить блокаторами разрушения средства или маркера, а также могут наделять средство или маркер другими физическими свойствами, например повышать растворимость соединения или снижать способность соединения к агрегации. Стабилизирующая группа может улучшать стабильность средства или маркера при хранении как в композиции смеси, так и отдельно.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к цитотоксичному соединению лекарстволиганд, имеющему строение в соответствии с любой из формул (1)-(3):
Х4-^-(-14)р-Р—(+¾)-0 (1)
ϋ (3) где символ I) представляет собой фрагмент лекарства, содержащий в качестве боковой цепи химически реакционноспособную функциональную группу, причем упомянутую функциональную группу выбирают из группы, состоящей из первичного или вторичного амина, гидроксила, сульфгидрила, карбоксила, альдегида и кетона;
символ Ь1 представляет собой саморазрушающийся спейсер;
т представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
символ X4 представляет собой элемент конструкции, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, детектируемых меток и средств направленного действия;
символ Ь4 представляет собой элемент конструкции линкера;
р равно 0 или 1.
Ь4 представляет собой фрагмент, который наделяет конъюгаты повышенной растворимостью или сниженной способностью к агрегации. Примеры фрагментов Ь4 включают замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, каждый из которых может представлять собой неразветвленный, разветвленный или циклический, положительно или отрицательно заряженный, аминокислотный полимер, такой как полилизин или
- 2 016577 полиаргинин, или другие полимеры, такие как полиэтиленгликоль.
Символы Г, Н и I. представляют собой линкеры, описанные далее в этом документе.
В одном примере осуществления настоящее изобретение относится к содержащему пептидный линкер конъюгату строения
Χ4-|—(1-4)р-т-<1)гп—о где Ώ представляет собой фрагмент лекарства, содержащий в качестве боковой цепи химически реакционноспособную функциональную группу, причем упомянутую функциональную группу выбирают из группы, состоящей из первичного или вторичного амина, гидроксила, тиола, карбоксила, альдегида и кетона;
Ь1 представляет собой саморазрушающийся линкер;
т представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
Г представляет собой линкер, содержащий структуру
или
где АА1 представляет собой один или несколько элементов конструкции, независимо выбранных из группы, состоящей из природных аминокислот и неприродных α-аминокислот;
с равно целому числу от 1 до 20;
Ь2 представляет собой саморазрушающийся линкер;
Ь3 представляет собой спейсерную группу, содержащую первичный или вторичный амин или карбоксильную функциональную группу;
где т равно 0 при наличии Ь3 и либо амин группы Ь3 образует амидную связь с боковой карбоксильной функциональной группой группы Ώ, либо карбоксил группы Ь3 образует амидную связь с боковой аминогруппой группы Ώ;
о равно 0 или 1;
Ь4 представляет собой элемент конструкции линкера, где Ь4 не содержит карбоксильную ацильную группу, присоединенную непосредственно к Ν-концу группы (АА1)с;
р равно 0 или 1;
X4 представляет собой элемент конструкции, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, детектируемых меток и средств направленного действия.
В одном примере осуществления содержащий пептидный линкер конъюгат содержит следующую структуру:
О хМкМАА’У^к2^!!:^1^ \ /р \ /с \ /0 \ / щ
В другом примере осуществления содержащий пептидный линкер конъюгат содержит следующую структуру:
Х4_^к4^АА Ν—
В предпочтительном примере осуществления Ь3 содержит ароматическую группу. Например, Ь3 может содержать группу бензойной кислоты, анилиновую группу или индольную группу. Неограничивающие примеры -Ε3-ΝΗ- включают структуры, выбранные из следующей группы:
- 3 016577
где Ζ представляет собой элемент конструкции, выбранный из О, 8 и ΝΚ23;
К23 представляет собой радикал, выбранный из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.
В предпочтительных примерах осуществления пептидного линкера (АА1)с представляет собой пептидную последовательность, расщепляемую экспрессируемой в опухолевой ткани протеазой. Предпочтительной протеазой является лизосомальная протеаза. В предпочтительных примерах осуществления с равно целому числу от 2 до 6 или с равно 2, 3 или 4. В определенных примерах осуществления аминокислоту, расположенную в группе (АА1)с ближе всего к фрагменту лекарства, выбирают из группы, состоящей из А1а, А§п, Азр, Сй, Суδ, Θίη, О1и, О1у, 11е, Ьеи, йуз, Мей РЬе, Рго, 8ег, ТНг, Тгр, Туг и Уа1. В предпочтительных примерах осуществления (АА1)с представляет собой пептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Уа1-Сй, Уа1-йуз, РЬе-йуз, йуз-йуз, А1а-йуз, РЬе-Сй, йеи-Сй, 11е-С11, Тгр, СИ, РЬе-А1а, РКе-№9-тозил-Лгд, РКе-№9-нитро-Лгд, Рйе-РЙе-Ьуз, Ό-РЬе-Рйе-Еуз, О1у-Рйе-Ьуз, Ьеи-А1аЬеи, 11е-А1а-Ьеи, Уа1-А1а-Уа1, А1а-Ьеи-А1а-Ьеи (8Ер ΙΌ N0: 1), в-А1а-Ееи-А1а-Ьеи (8Ер ΙΌ N0: 2) и О1уРЬе-Ееи-О1у (8Ер ΙΌ N0: 3). В особенно предпочтительных примерах осуществления (АА1)с представляет собой Уа1-Сй или Уа1-Еуз.
В некоторых предпочтительных примерах осуществления пептидный линкер Е содержит структуру
где К24 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила;
каждый К представляет собой элемент конструкции, независимо выбранный из группы, состоящей из замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, Ν02, ΝΚ21Κ22, ИК21С0К22, (ΧΤ)ΝΙ<21Ι<22, 0С0К21 и 0К21, где К21 и К22 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила;
а представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3 или 4.
В других предпочтительных примерах осуществления -Е-(Е1)т- содержит структуру
где каждый К24 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к содержащим гидразиновый линкер конъюгатам строения
X4----(|-4)р-н—(ь’)т—о где Ό представляет собой фрагмент лекарства, содержащий в качестве боковой цепи химически ре
- 4 016577 акционноспособную функциональную группу, причем упомянутую функциональную группу выбирают из группы, состоящей из первичного или вторичного амина, гидроксила, тиола, карбоксила, альдегида и кетона;
Ь1 представляет собой саморазрушающийся линкер;
т представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
X4 представляет собой элемент конструкции, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, детектируемых меток и средств направленного действия;
Ь4 представляет собой элемент конструкции линкера;
р равно 0 или 1;
Н представляет собой линкер, содержащий структуру
где п1 равно целому числу от 1 до 10;
п2 равно 0, 1 или 2;
каждый К24 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила;
где п3 равно 0 или 1 при условии, что если п3 равно 0, то п2 не равно 0; и п4 равно 1, 2 или 3,
где К представляет собой Ме или СН2-СН2-ХМе2.
В некоторых предпочтительных примерах осуществления замещение фенильного кольца представляет собой замещение в пара-положении. В некоторых предпочтительных примерах осуществления щ равно 2, 3 или 4 или п1 равно 3 либо п2 равно 1.
В определенных примерах осуществления I представляет собой связь. В других примерах осуществления п3 равно 0 и п4 равно 2.
В различных аспектах настоящее изобретение относится к гидразиновым линкерам Н, которые при расщеплении могут образовывать 6-членный саморазрушающийся линкер, или два 5-членных саморазрушающихся линкера, или один 5-членный саморазрушающийся линкер, или один 7-членный саморазрушающийся линкер, или 5-членный саморазрушающийся линкер и 6-членный саморазрушающийся линкер.
В предпочтительном примере осуществления Н содержит геминальные диметильные заместители.
В предпочтительном примере осуществления Н содержит структуру
Предпочтительно щ равно 2, 3 или 4, более предпочтительно щ равно 3. Предпочтительно каждый К24 независимо выбирают из СН3 и Н. В определенных предпочтительных примерах осуществления каждый К24 представляет собой Н. В другом предпочтительном примере осуществления Н содержит струк туру
- 5 016577
Предпочтительно щ равно 3. Предпочтительно каждый К24 независимо выбирают из СН3 и Н. В еще одних предпочтительных примерах осуществления Н содержит структуру
Предпочтительно каждый К24 независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к содержащим гидразиновый линкер конъюга там строения где I) представляет собой фрагмент лекарства, содержащий в качестве боковой цепи химически реакционноспособную функциональную группу, причем упомянутую функциональную группу выбирают из группы, состоящей из первичного или вторичного амина, гидроксила, тиола, карбоксила, альдегида и кетона;
Ь1 представляет собой саморазрушающийся линкер;
т равно целому числу, выбранному из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
X4 представляет собой элемент конструкции, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, детектируемых меток и средств направленного действия;
Ь4 представляет собой элемент конструкции линкера;
где ς равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
каждый К24 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к содержащему дисульфидный линкер конъюгату строения х4-^—(ΐ.4)ρ-Λ-(ΐ-1)πφθ где I) представляет собой фрагмент лекарства, содержащий в качестве боковой цепи химически реакционноспособную функциональную группу, причем упомянутую функциональную группу выбирают из группы, состоящей из первичного или вторичного амина, гидроксила, тиола, карбоксила, альдегида и кетона;
Ь1 представляет собой саморазрушающийся линкер;
т равно целому числу, выбранному из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
X4 представляет собой элемент конструкции, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, детектируемых меток и средств направленного действия;
Ь4 представляет собой элемент конструкции линкера;
р равно 0 или 1;
I представляет собой линкер, содержащий структуру
- 6 016577
где каждый К24 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила;
каждый К представляет собой элемент конструкции, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенный гетероциклоалкила, галогена, ΝΟ2, ΝΚ К , ΝΚ СОК , ΟεΟΝΚ^Κ22, ОСОК21 и ОК21, где К21 и К22 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенный гетероциклоалкила;
а представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3 или 4;
ά представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В различных примерах осуществления I может содержать одну или несколько из следующих структур:
О
Ка
О
где ά равно 1 или 2;
или
Во всех упомянутых выше содержащих линкер конъюгатах Ό предпочтительно представляет собой цитотоксическое лекарство. В предпочтительных примерах осуществления Ό содержит химически реакционноспособную функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из первичного или вторичного амина, гидроксила, сульфгидрила и карбоксила.
В предпочтительном примере осуществления Ό представляет собой лекарство, имеющее строение
- 7 016577
где X представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΚ23;
Ζ представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΚ23;
К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил, или незамещенный С1-С6гетероалкил, или циано, или алкокси; и
К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил, или незамещенный С1-С6гетероалкил;
К23 представляет собой радикал, выбранный из Н и замещенного или незамещенного С1-С10-алкила; К3 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из (=0) и ОК11, где К11 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного или незамещенного С1-Сю-алкила, С(О)К12, С(О)ОК12, С(О)т12К13 и С(О)СНК12К13, где К12 и К13 представляют собой радикалы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила, замещенного или незамещенного С1-С10-гетероалкила, содержащего по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, где К12 и К13 необязательно образуют вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, содержащую от 4 до 6 атомов и необязательно содержащую два или несколько гетероатомов;
К4 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного С1-С10-алкила, незамещенного С1-С10-алкила, ΝΗ^5, Ν^0)^5, С(О)К15, ОК15 и О(СН2)^(СН3)2, где η равно целому числу от 1 до 20;
К15 выбирают из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила и замещенного или незамещенного пептидила;
К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и при ее наличии К6 и К7 образуют вместе циклопропильное кольцо; и
К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, объединенные в упомянутом циклопропильном кольце с К6, где X1 представляет собой галоген.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к цитотоксичному соединению лекарстволиганд, имеющему строение следующей формулы:
где символ Ь1 представляет собой саморазрушающийся спейсер, где т представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Символ Х4 представляет собой элемент конструкции, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, детектируемых меток и средств направленного действия.
Символ Ь4 представляет собой элемент конструкции линкера и р равно 0 или 1. Ь4 представляет собой фрагмент, который наделяет конъюгаты повышенной растворимостью или сниженной способностью к агрегации. Примеры фрагментов Ь4 включают замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, любой из которых может представлять собой неразветвленный, разветвленный или циклический, положительно или отрицательно заряженный, аминокислотный полимер, такой как полилизин или полиаргинин, или другие полимеры, такие как полиэтиленгликоль.
Символ Р представляет собой любой расщепляемый линкер, включая без ограничения любой из описанных в этом документе пептидильных, гидрозоновых и дисульфидных линкеров.
Расщепляемые линкеры включают линкеры, которые могут быть избирательно расщеплены в ходе химического или биологического процесса и отделяют при расщеплении лекарство □ ' от X4.
Символ □ ' представляет собой лекарство следующей формулы:
- 8 016577
где X представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΒ23;
Ζ представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и КК23;
К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил, или незамещенный С1-С6гетероалкил, или циано, или алкокси; и
К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил, или незамещенный С1-С6гетероалкил;
К23 представляет собой радикал, выбранный из Н и замещенного или незамещенного С1-С10-алкила;
К3 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из (=О) и ОК11, где К11 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного или незамещенного С1-Сю-алкила, С(О)К12, С(О)ОК12, С(О)КК12К13 и С(О)СНК12К13, в которых
К12 и К13 представляют собой радикалы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила, замещенного или незамещенного С1-С10-гетероалкила, содержащего по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, где К12 и К13 необязательно образуют вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, содержащую от 4 до 6 атомов и необязательно содержащую два или несколько гетероатомов;
К4 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного С1-С10-алкила, незамещенного С1-С10-алкила, КНК15, КС(О)К15, С(О)К15, ОК15 и О(СН2)пК(СН3)2, где п равно целому числу от 1 до 20;
К15 выбирают из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила и замещенного или незамещенного пептидила;
К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и при ее наличии К6 и К7 образуют вместе циклопропильное кольцо; и
К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, объединенные в упомянутом циклопропильном кольце с К 6 , где X1 представляет собой галоген.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям. Такие композиции обычно содержат конъюгат по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способам применения конъюгатов по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение относится к способу лизиса клетки, где конъюгат по настоящему изобретению вводят в клетку в количестве, достаточном для лизиса клетки. В предпочтительном примере осуществления клетка представляет собой опухолевую клетку. В другом примере осуществления настоящее изобретение относится к способу замедления или блокировки роста опухоли у млекопитающего, где конъюгат по настоящему изобретению вводят млекопитающему в количестве, достаточном для замедления или блокировки роста опухоли.
Другие аспекты, преимущества и цели настоящего изобретения станут очевидны из обзора представленного ниже подробного описания изобретения.
Краткое описание фигур
Неограничивающие и неисчерпывающие примеры осуществления настоящего изобретения описаны со ссылкой на следующие фигуры. Для лучшего понимания настоящего изобретения приводится ссылка на последующее подробное описание изобретения, которое следует рассматривать совместно с прилагаемыми фигурами, где фиг. 1 представляет собой график изменений во времени объема опухоли у мышей, которым вводили дозу конъюгата изотипическое контрольное антитело-лекарство, конъюгата αΡ8ΜΑ антителолекарство или лишь буфер для конъюгации (растворитель);
фиг. 2 - график изменений во времени объема опухоли у мышей, которым вводили различные количества конъюгата αΡ8ΜΑ антитело-лекарство или лишь буфер для конъюгации (растворитель);
фиг. 3 - график изменений во времени объема опухоли у мышей, которым вводили различные коли
- 9 016577 чества конъюгата изотипическое контрольное антитело-лекарство или лишь буфер для конъюгации (растворитель);
фиг. 4 - график изменений во времени массы тела мышей, которым вводили различные количества конъюгата изотипическое контрольное антитело-лекарство или лишь буфер для конъюгации (растворитель);
фиг. 5 - график изменений во времени массы тела мышей, которым вводили различные количества конъюгата изотипическое контрольное антитело-лекарство или лишь буфер для конъюгации (растворитель);
фиг. 6 - график изменений во времени объема опухоли, начальный средний размер которых составлял 240 мм3, у мышей, которым вводили дозу конъюгата изотипическое контрольное антителолекарство, конъюгата αΡδΜΆ антитело-лекарство или лишь буфер для конъюгации (растворитель);
фиг. 7 - график изменений во времени объема опухоли, начальный средний размер которых составлял 430 мм3, у мышей, которым вводили дозу конъюгата αΡδΜΆ антитело-лекарство или лишь буфер для конъюгации (растворитель);
фиг. 8 - график изменений во времени объема опухоли у мышей, которым вводили дозу конъюгатов изотипическое контрольное антитело и токсин-антитело;
фиг. 9 - график изменений во времени массы тела мышей, которым вводили дозу конъюгатов изотипическое контрольное антитело и токсин-антитело.
Подробное описание изобретения
Сокращения.
Используемое в этом документе сокращение А1а относится к аланину.
Сокращение Вос относится к трет-бутилоксикарбонилу.
Сокращение СР1 относится к циклопропанпирролоиндолу.
Сокращение СЬх означает карбобензокси.
Используемое в этом документе сокращение ИСМ относится к дихлорметану.
Сокращение ΌΌΟ относится к 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинону.
Сокращение ΌΙΡΕΑ означает диизопропилэтиламин.
Сокращение ΌΜΌΑ означает Ν,Ν'-диметилэтилендиамин.
Сокращение КВР означает круглодонную колбу.
Сокращение ΌΜΡ означает Х,В-диметилформамид.
Сокращение НАТИ означает Ν-оксид гексафторфосфата №[[(диметиламино)-1Н-1,2,3триазоло [4,5-Ь] пиридин-1 -ил] метилен |-Ν -метилметанаминия.
Используемый в этом документе символ Е означает ферментативно расщепляемую группу.
Сокращение ЕИС1 означает 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид.
Используемое в этом документе сокращение РМОС относится к 9флуоренилметилоксикарбонилу.
Сокращение РМОС относится к 9-флуоренилметилоксикарбонилу.
Сокращение НОА1 означает 7-аза-1-гидроксибензотриазол.
Сокращение Ьеи означает лейцин.
Сокращение РАВА относится к парааминобензойной кислоте.
Сокращение РЕС относится к полиэтиленгликолю.
Сокращение РМВ относится к параметоксибензилу.
Сокращение ТВАР относится к фториду тетрабутиламмония.
Сокращение ТВ8О относится к трет-бутилдиметилсилиловому эфиру.
Используемое в этом документе сокращение ТЕА относится к триэтиламину.
Сокращение ТРА относится к трифторуксусной кислоте.
Символ О относится к терапевтическому средству, диагностическому средству или детектируемой метке.
Определения.
Если иное не определено особо, все используемые в этом документе технические и научные термины имеют, как правило, то же самое значение, что и обычно понимаемое средним специалистом в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. В общем используемая в этом документе номенклатура и описанные ниже методики лабораторных исследований в области клеточных культур, молекулярной генетики, органической химии и химии и гибридизации нуклеиновых кислот хорошо известны и традиционно используются в данной области техники. Для синтеза нуклеиновых кислот и белков используют стандартные методики. В общем ферментативные реакции и стадии очистки проводят в соответствии с инструкциями производителя. Методики и процедуры, как правило, выполняют в соответствии со способами, традиционным в данной области техники, и различными общими ссылками (в общем, см. ЗатЬгоок е! а1. МОЕЕСЕЕАК СЕОХ1ХС: А ЬАВОКАТОКУ МАХЕАЕ, 2с1 е4. (1989) Со14 8рг1пд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, СоИ 8ргтд НагЬог, Ν.Υ., включенный в этот документ посредством ссылки), которые повсеместно приводятся в этом документе. Используемая в этом документе номенклатура и
- 10 016577 методики проведения лабораторных исследований в области аналитической химии, и описанный ниже органический синтез, хорошо известны и традиционно используются в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа используют стандартные методики или их модификации.
Подразумевается, что термин терапевтическое средство означает соединение, которое в терапевтически эффективном количестве вызывает желаемый терапевтический эффект у млекопитающего. Для лечения злокачественных опухолей желательно, чтобы терапевтическое средство было способно проникать в клетку-мишень.
Подразумевается, что термин цитотоксин означает терапевтическое средство, обладающее желаемым цитотоксичным эффектом в отношении раковых клеток. Термин цитоксичный означает, что средство блокирует рост или убивает клетки. Типичные цитотоксины включают в качестве примера, но не ограничения, комбретастатины, дуокармицины, противоопухолевые антибиотики на основе СС-1065, антрациклины и родственные соединения. Другие цитотоксины включают микотоксины, рицин и его аналоги, калихеамицины, доксирубицин и майтансиноиды.
Термин пролекарство и термин конъюгат лекарства используются в этом документе взаимозаменяемо. Оба термина относятся к соединению, которое, будучи в конъюгированной форме, сравнительно безопасно для клеток, но избирательно разрушается с образованием фармакологически активной формы в определенных условиях, например, ферментами, расположенными внутри клеток-мишеней или в непосредственной близости от них.
Подразумевается, что термин маркер означает соединение, пригодное для определения характеристик опухолей и другого заболевания, например, для диагностики, контроля развития опухоли и анализа факторов, секретируемых опухолевыми клетками. Маркеры составляют подкласс диагностических средств.
Используемый применительно к ферментативному расщеплению термин избирательный означает, что скорость расщепления линкерного фрагмента больше скорости расщепления пептида со случайной последовательностью аминокислот.
Подразумевается, что термины группа направленного действия и агент направленного действия означают фрагмент, который (1) способен направлять активное вещество, к которому он присоединен (например, терапевтическое средство или маркер), на клетку-мишень, например на специфический тип опухолевых клеток, или (2) предпочтительно активируется в ткани-мишени, например в опухоли. Группа направленного действия или агент направленного действия могут представлять собой малую молекулу, которая, как подразумевается, включает как непептиды, так и пептиды. Группа направленного действия может также представлять собой макромолекулу, которая включает сахариды, лектины, рецепторы, лиганды рецепторов, белки, такие как БСА, антитела и т.д. В предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения группа направленного действия представляет собой антитело или фрагмент антитела, более предпочтительно моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела.
Термин саморазрушающийся спейсер относится к бифункциональному химическому фрагменту, который способен ковалентно связывать два химических фрагмента с образованием стабильной в обычных условиях молекулы, состоящей из трех частей. Саморазрушающийся спейсер способен спонтанно отделяться от второго фрагмента после расщепления связи с первым фрагментом.
Подразумевается, что термин детектируемая метка означает фрагмент, обладающий детектируемым физическим или химическим свойством.
Подразумевается, что термин расщепляемая группа означает фрагмент, который не стабилен ίη νίνο. Предпочтительно расщепляемая группа предусматривает активацию маркера или терапевтического средства путем отщепления маркера или средства от оставшейся части конъюгата. Функционально определенный линкер предпочтительно расщепляется ίη νίνο своим биологическим микроокружением. Расщепление может происходить в результате любого без ограничения процесса, например ферментативного, восстановительного, при определенном значении рН и т.д. Предпочтительно расщепляемую группу выбирают таким образом, что активация происходит в желаемом месте приложения действия, которое может находиться внутри или близ клеток-мишеней (например, клеток злокачественной опухоли) или тканей, например, в месте приложения терапевтического действия или активности маркера. Такое расщепление может быть ферментативным и примеры ферментативно расщепляемых групп включают природные аминокислоты или пептидные последовательности, которые заканчиваются природной аминокислотой и присоединены своим карбоксилсодержащим концом к линкеру. Хотя степень ускорения скорости расщепления не является критичной для целей настоящего изобретения, предпочтительными примерами расщепляемых линкеров являются такие, в которых по крайней мере приблизительно 10% расщепляемых групп расщепляются в кровотоке в течение 24 ч после введения, наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 35%.
Термин лиганд означает любую молекулу, которая специфически связывается или образует ассоциаты или комплексы с рецептором, субстратом, антигенной детерминантой или другим участком связывания на клетке-мишени или в ткани-мишени. Примеры лигандов включают антитела и их фрагменты (например, моноклональное антитело или его фрагмент), ферменты (например, фибринолитические ферменты), модификаторы биологического ответа (например, интерлейкины, интерфероны, эритропоэтин
- 11 016577 или колониестимулирующие факторы), пептидные гормоны и их антигенсвязывающие фрагменты.
Термины гидразиновый линкер и самоциклизующийся гидразиновый линкер используются в этом документе взаимозаменяемо. Эти термины относятся к линкерному фрагменту, который при изменении условий, таких как сдвиг значения рН, может вступать в реакцию циклизации и образовывать одно или несколько колец. При присоединении гидразиновый фрагмент преобразуется в гидразон. Такое присоединение может протекать, например, путем осуществления взаимодействия с кетоновой группой фрагмента Ь4. Поэтому вследствие преобразования в гидразон при присоединении для описания линкера по настоящему изобретению также может использоваться термин гидразоновый линкер.
Термин 5-членный гидразиновый линкер относится к содержащим гидразин фрагментам молекул, которые при изменении условий, таких как сдвиг значения рН, могут вступать в реакцию циклизации и образовывать одно или несколько 5-членных колец. В качестве альтернативы, такой 5-членный линкер может быть сходным образом описан как 5-членный гидразоновый линкер.
Термин 6-членный гидразиновый линкер относится к содержащим гидразин фрагментам молекул, которые при изменении условий, таких как сдвиг значения рН, могут вступать в реакцию циклизации и образовывать одно или несколько 6-членных колец. В качестве альтернативы, такой 6-членный линкер может быть сходным образом описан как 6-членный гидразоновый линкер.
Термин реакция циклизации применительно к циклизации пептида, гидразина или дисульфидного линкера указывает на циклизацию такого линкера и инициирует разделение комплекса лиганд-лекарство. Скорость реакции может быть измерена ех 8Йи и реакция завершается после образования по крайней мере 90, 95 или 100% продукта.
Термины полипептид, пептид и белок используются в этом документе взаимозаменяемо и относятся к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков. Термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к встречающимся в природе аминокислотным полимерам и к не встречающимся в природе аминокислотным полимерам. Эти термины также охватывают термин антитело.
Термин аминокислота относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые действуют тем же путем, что и встречающиеся в природе аминокислоты. Встречающимися в природе аминокислотами являются аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также аминокислоты, которые были позже модифицированы, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот относится к соединениям, которые имеют то же основное химическое строение, что и встречающаяся в природе аминокислота, т.е. α-атом углерода, с которым связан атом водорода, карбоксильная группа, аминогруппа, и Я-группа, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги содержат модифицированные Я-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют то же основное химическое строение, что и встречающаяся в природе аминокислота. Одной аминокислотой, которая, в частности, может использоваться, является цитруллин, который является предшественником аргинина и участвует в образовании мочевины в печени. Аминокислотные миметики относятся к химическим соединениям, которые имеют строение, отличное от общего химического строения аминокислоты, но функционирует сходным путем со встречающейся в природе аминокислотой. Термин неприродная аминокислота призван обозначать Ό-стереохимическую форму двадцати описанных выше встречающихся в природе аминокислот. Дополнительно следует понимать, что термин неприродная аминокислота включает гомологи натуральных аминокислот и синтетически модифицированные формы природных аминокислот. Синтетически модифицированные формы включают без ограничения аминокислоты, содержащие алкиленовые цепи, укороченные или удлиненные на 1-2 атома углерода, аминокислоты, содержащие необязательно замещенные арильные группы, и аминокислоты, содержащие галогенированные группы, предпочтительно галогенированные алкильные и арильные группы. При присоединении к линкеру или конъюгату по настоящему изобретению аминокислота находится в форме аминокислотной боковой цепи, где карбоксильная группа аминокислоты была замещена кето-группой (С(О)). Так, например, аланиновая боковая цепь представляет собой -С(О)СН(ЫН2)-СН3 и т.д.
Аминокислоты и пептиды могут быть защищены блокирующими группами. Блокирующая группа представляет собой атом или химический фрагмент, который защищает Ν-конец аминокислоты или пептида от нежелательных взаимодействий и может использоваться в процессе синтеза конъюгата лекарство-лиганд. Она может оставаться присоединенной к Ν-концу в процессе синтеза, и может быть удалена после завершения синтеза конъюгата лекарства химическим путем или в других условиях, в которых избирательно происходит ее удаление. Блокирующие группы, подходящие для защиты Ν-конца, хорошо известны в области химии пептидов. Примеры блокирующих групп включают без ограничения водород, Ό-аминокислоту и карбобензокси (СЬх) хлорид.
Термин нуклеиновая кислота относится к дезоксирибонуклеотидам и рибонуклеотидам и их полимерам в одноцепочечной или двуцепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, со
- 12 016577 держащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или сцепления каркаса, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые обладают сходными со сравниваемой нуклеиновой кислотой свойствами и которые метаболизируются сходным со сравниваемыми нуклеотидами путем. Примеры таких аналогов включают без ограничения фосфортиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-Ометилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (ΡΝΑκ).
Если иное не указано особо, то конкретная аминокислотная последовательность также полностью охватывает ее стабильно модифицированные варианты (например, замещения с получением вырожденных кодонов) и комплиментарные последовательности, а также полностью указанную последовательность. Конкретно, замещения с получением вырожденных кодонов могут быть осуществлены путем получения последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов замещено т1хеб-Ьа8е и/или дезоксиинозиновыми остатками (Ва1хсг с1 а1., Νιιοίοίο Λοίά Кек. 19:5081 (1991); ОФкика с1 а1., 1. Вю1. Скет. 260: 2605-2608 (1985); КоккоПш с1 а1., Мо1. Се11. РгоЬек 8: 9198 (1994)). Термин нуклеиновая кислота используется взаимозаменяемо с терминами ген, кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид.
Символ —'—, используемый в качестве связи или отображаемый перпендикулярно связи, указывает точку, в которой отображаемый фрагмент присоединен с оставшейся частью молекулы, твердой подложкой и т. д.
Термин алкил, отдельно или как часть другого заместителя, означает, если иное не указано особо, неразветвленный или разветвленный или циклический углеводородный радикал или их комбинацию, который может быть полностью насыщенным, моно- или полиненасыщенным и может содержать диили поливалентные радикалы, содержащий указанное число атомов углерода (т.е. С1-Сю означает от 1 до 10 атомов углерода). Примеры насыщенных углеводородных радикалов включают без ограничения группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил, гомологи и изомеры, например, н-пентила, н-гексила, нгептила, н-октила и т. п. Ненасыщенная алкильная группа представляет собой группу, содержащую одну или несколько двойных связей или тройных связей. Примеры ненасыщенных алкильных групп включают без ограничения винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил и высшие гомологи и полимеры. Также понимают, что если иное не отмечено особо, то термин алкил включает производные алкила, более подробно описанные ниже, такие как гетероалкил. Алкильные группы, которые ограничены углеводородными группами, также называют гомоалкилом.
Термин алкилен, отдельно или как часть другого заместителя, означает полученный из алкана двухвалентный радикал, например без ограничения -СН2СН2СН2СН2-, и дополнительно включает группы, описанные ниже как гетероалкилены. Обычно, алкильная (или алкиленовая) группа содержат от 1 до 24 атомов углерода, причем группы, содержащие 10 или менее атомов углерода, являются предпочтительными для настоящего изобретения. Низший алкил или низший алкилен представляют собой алкильную или алкиленовую группу с более короткой цепью, содержащей, как правило, 8 или менее атомов углерода.
Термин гетероалкил, отдельно или в сочетании с другим термином, означает, если иное не указано особо, стабильный неразветвленный или разветвленный или циклический углеводородный радикал, или их сочетание, состоящий из определенного числа атомов углерода и по крайней мере одного гетероатома, выбранного из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, где атомы азота, углерода и серы могут быть необязательно окислены, а атом азота может быть необязательно кватернизован. Гетероатом (гетероатомы) О, Ν, 8 и 81 может находиться в любом положении внутри гетероалкильной группы или в положении, в котором алкильная группа соединена с оставшейся частью молекулы. Примеры включают без ограничения -СН2-СН2-О-СН3, -СН-СН.-ХН-С!С -СЩ-СЩ-^ОДО-СНз, -СН2-8-СН2-СН3, -СН2-СН2, -8(О)-СН3, -СН2-СН2-8(О)2-СН3, -СН=СН-О-СН3, -81(СН3)3, -СН2-СН=N-ΟСН3 и -СН=СН-Ы(СН3) -СН3. До двух гетероатомов могут располагаться последовательно, как, например, -СН2-NН-ΟСН3 и -СН2-О81(СН3)3. Сходным образом, термин гетероалкилен, отдельно или как часть другого заместителя, означает двухвалентный радикал, полученный из гетероалкила, как, например, без ограничения -СН2-СН2-8СН2-СН2- и -СН2-8-СН2-СН2-NН-СН2-. В гетероалкиленовых группах гетероатомы могут также занимать любой из двух концов цепи или оба вместе (например, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино и т.п.). Термины гетероалкил и гетероалкилен охватывает полиэтиленгликоль и его производные (например, см. 8йеаггеа1ег Ро1утегк Са1а1од. 2001). Кроме того, в алкиленовых и гетероалкиленовых линкерных группах ориентация линкерной группы не предусматривает какого-либо определенного направления, в котором следует читать формулу линкерной группы. Например, формула -С(О)2К'- представляет собой и -С(О)2К' и -К'С(О)2-.
Термин низший в сочетании с терминами алкил или гетероалкил относится к фрагменту, содержащему от 1 до 6 атомов углерода.
Термины алкокси, алкиламино, алкилсульфонил и алкилтио (или тиоалкокси) используются в их традиционном понимании и относятся к алкильным группам, присоединенным к оставшейся
- 13 016577 части молекулы через атом кислорода, аминогруппу, БО2-группу или атом серы соответственно. Термин арилсульфонил относится к арильной группе, присоединенной к оставшейся части молекулы через БО2-группы, а термин сульфгидрил относится к БН-группе.
В целом, ацильный заместитель также выбирают из группы, представленной выше. Используемый в этом документе термин ацильный заместитель относится к группам, к которым он присоединен, и имеет валентность карбонильного атома углерода, который напрямую или опосредованно присоединен к полициклическому ядру соединений по настоящему изобретению.
Термины циклоалкил и гетероциклоалкил, отдельно или в сочетании с другими терминами, представляют собой, если иное не указано особо, циклические варианты замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила соответственно. Кроме того, в случае гетероциклоалкила гетероатом может занимать положение, по которому гетероцикл присоединен к оставшейся части молекулы. Примеры циклоалкила включают без ограничения циклопентил, циклогексил, 1циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и т.п. Примеры гетероциклоалкила включают без ограничения 1-(1,2,5,6-тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил и т.п. Гетероатомы и атомы углерода в циклических структурах являются необязательно окисленными.
Термины галоген или галоген, отдельно или как часть другого заместителя, означают, если иное не указано особо, атом фтора, хлора, брома или йода. Кроме того, это означает, что термины, такие как галогеналкил, включают моногалогеналкил и полигалогеналкил. Например, это означает, что термин галоген(С1-С4)алкил включает без ограничения трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3бромпропил и т. п.
Термин арил означает, если иное не указано особо, замещенный или незамещенный полиненасыщенный, ароматический углеводородный заместитель, который может представлять собой одно кольцо или несколько колец (предпочтительно от 1 до 3 колец), которые конденсированы вместе или соединены ковалентно. Термин гетероарил относится к арильным группам (или кольцам), которые содержат от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из Ν, О и Б, где атомы азота, углерода и серы необязательно окислены, а атом (атомы) азота необязательно кватернизованы. Гетероарильная группа может быть присоединена к оставшейся части молекулы через гетероатом. Неограничивающие примеры арильных и гетероарильных групп включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-биденил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3пиразолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5оксазолил, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5-изоксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5бензотиазолил, пуринил, 2-бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5хиноксалинил, 3-хинолинил и 6-хинолинил. Заместители для каждой из приведенных выше арильных и гетероарильных кольцевых систем выбирают из группы подходящих заместителей, описанных ниже. Термины арил и гетероарил также охватывают кольцевые системы, в которых одна или несколько кольцевых систем конденсированы или иначе связаны с арильной или гетероарильной системой.
Для краткости, термин арил, используемый в сочетании с другими терминами (например, арилокси, арилтиокси, арилалкил), включает и арильные, и гетероарильные кольца, описанные выше. Так, это означает, что термин арилалкил включает те радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (например, бензил, фенэтил, пиридилметил и т. п.), включая алкильные группы, в которых атом углерода (например, метиленовая группа) был заменен, например, атомом кислорода (например, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.п.).
Каждый из представленных выше терминов (например, алкил, гетероалкил, арил и гетероарил) включает и замещенные и незамещенные формы указанного радикала. Предпочтительные заместители для каждого типа радикала представлены ниже.
Заместители для алкильных и гетероалкильных радикалов (включая группы, обычно называемые алкиленом, алкенилом, гетероалкиленом, гетероалкенилом, алкинилом, циклоалкилом, гетероциклоалкилом, циклоалкенилом и гетероциклоалкенилом) в общем называют алкильными заместителями и гетероалкильными заместителями соответственно и они могут представлять собой одну или несколько из целого ряда групп, выбранных без ограничения из -ОК', =О, =ΝΚ', =Ν-ΟΚ', -ΝΚ'Κ, -БК', галоген, -Б1К'КК', -ОС(О)К', -С(О)К', -СО2К', -СОХК'К''. -ОС(О)МК'К, -МКС(О)К', -МК'-С(О)1ЧКК', -№С(О)2К', ^К-С(МК'КК')=МК, -МК-С(МК'К)=МК', -Б(О)К', -Б(О)2К', -Б(О)2МК'К, -1\1КБО2К', <Ν и -№О2 в количестве от 0 до (2т'+1), где т' равно общему числу атомов углерода в каждом радикале. Каждый К', К'', К''' и К предпочтительно независимо относится к водороду, замещенному или незамещенному гетероалкилу, замещенному или незамещенному арилу, например, замещенному 1-3 галогенами арилу, замещенным или незамещенным алкильным, алкокси или тиоалкоксигруппам или арилалкильным группам. Если соединение по настоящему изобретению содержит более одной К-группы, например, то каждую из К-групп выбирают независимо, как и случае с каждой из К', К'', К''' и К групп, если содержится более одной из указанных групп. Если К' и К'' присоединены к одному и тому же атому азота, то они могут объединяться с атомом азота с образованием 5-, 6- или 7-членнного кольца. Например, это
- 14 016577 означает, что -ΝΚ'Κ'' включает без ограничения 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Из представленного выше описания заместителей специалист в данной области техники должен понимать, что термин алкил включает группы, содержащие атомы углерода, связанные с отличными от водорода группами, такими как галогеналкил (например, -СГ3 и -СН2СГ3) и ацил (например, -С(О)СН3, -С(О)СГ3, -С(О)СН2ОСН3 и т.п.).
По аналогии с заместителями, описанными для алкильного радикала, арильные заместители и гетероарильные заместители в общем называют арильными заместителями и гетероарильными заместителями соответственно и выбирают, например, из галогена, -ОК', =О, =ΝΚ', =Ν-ΟΚ', -ΝΚ'Κ, -8К', -галоген, -81К'КК', -ОС(О)К', -С(О)К', -СО2К', -СОЫК'К, -ОС(О)ЫК'К, -№С(О)К’, -МК'-С(О)ЫКК', -Ν^'Ό^Ε', -ЫК-С(ЫК'К)=ЫК', -8(О)К', -8(О)2К', -8(О)2Ж'К, -ЫК8О2К', -ΟΝ и -\О, -К', -Ν3, -СН(Р11)2, фтор(С1-С4)алкокси и фтор(С1-С4)алкила, в количестве от 0 до общего числа незаполненных валентностей в ароматической кольцевой системе; и где К', К'', К''' и К'''' предпочтительно независимо выбирают из водорода, (С1-С8)алкила и гетероалкила, незамещенного арила и гетероарила, (незамещенный арил)-(С1-С4)алкила и (незамещенный арил)окси(С1-С4)алкила. Если соединение по настоящему изобретению содержит более одной К-группы, например, то каждую из К-групп выбирают независимо, как и в случае с каждой из К', К'', К''' и К групп, если содержится более одной из указанных групп.
Два арильных заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены заместителем формулы -Т-С(О)-(СКК')Ч-Ц-, в которой Т и и независимо представляют собой -ΝΗ-, -О-, -СКК'- или одинарную связь и с] равно целому числу от 0 до 3. В качестве альтернативы, два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены заместителем формулы -А-(СН2)ГВ-, в которой А и В независимо представляют собой -СКК'-, -О-, -ИК-, -8-, -8(О)-, -8(О)2-, -8(О)^К'- или одинарную связь и г равно целому числу от 1 до 4. Одна из одинарных связей полученного таким образом нового кольца может быть заменена двойной связью. В качестве альтернативы, два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены заместителем формулы -(СКК')3-Х-(СК''К')а-, в которой § и ά независимо представляют собой целое число от 0 до 3 и X представляет собой -О-, -ΝΚ-, -8-, -8(О)-, -8(О)2- или 8(О)2ХК'-. Заместители К, К', К'' и К''' предпочтительно независимо выбирают из водорода или замещенного или незамещенного (С1-С6)алкила.
Используемый в этом документе термин дифосфат включает без ограничения сложный эфир фосфорной кислоты, содержащий две фосфатные группы. Термин трифосфат включает без ограничения сложный эфир фосфорной кислоты, содержащий три фосфатные группы. Например, конкретные лекарства, содержащие дифосфат или трифосфат, включают
Используемый в этом документе термин гетероатом включает атом кислорода (О), азота (Ν), серы (8) или кремния (81).
Символ К является общим сокращением, которое представляет собой заместитель, который выбирают из замещенных или незамещенных алкильных, замещенных или незамещенных гетероалкильных, замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклильных групп.
Используемый в этом документе термин фармацевтически приемлемый носитель означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или основу, такие как жидкий или твердый заполнитель, разбавитель, наполнитель, растворитель или герметизирующий материал, используемые для переноса или транспорта химического агента. Фармацевтически приемлемые носители включают фармацевтически приемлемые соли, где термин фармацевтически приемлемые соли включает соли активных соединений, которые получают с относительно нетоксичными кислотами или основаниями, в зависимо
- 15 016577 сти от наличия конкретных заместителей у соединений, описанных в этом документе. Если соединения по настоящему изобретению содержат относительно кислотные функциональные группы, то соли добавления основания могут быть получены путем осуществления взаимодействия нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством желаемого основания, либо неразбавленного либо в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых солей добавления основания включают соль натрия, калия, кальция, аммония, органической аминогруппы или магния, или сходную соль. Если соединения по настоящему из обретению содержат относительно основные функциональные группы, то соли добавления кислоты могут быть получены путем осуществления взаимодействия нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством желаемой кислоты, либо неразбавленной либо в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых солей добавления кислоты включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как соляная, бромисто-водородная, азотная, угольная, топойубгодепсагЬошс, фосфорная, топоНубгодепрНо^рНопс. ШНубгодепрНохрНопс. серная, топоНубгодепмбГипс. йодисто-водородная или фосфорная кислота и т.п., а также соли, полученные из сравнительно нетоксичных органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, изомасляная, малеиновая, малоновая, бензойная, янтарная, субериновая, фумаровая, молочная, миндальная, фталевая, бензолсульфоновая, паратолилсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и т.п. Также включены соли аминокислот, такие как аргинат и т.п., и соли органических кислота, таких как глюкуроновая или галактуроновая кислота, и т.п. (например, см. Вегде е! а1., Рйагтасеи11са1 8а1к, 1оита1 оГ Рйагтасеи11са1 8с1епсе, 1977, 66, 1-19). Некоторые конкретные соединения по настоящему изобретению содержат и основные и кислотные функциональные группы, что позволяет преобразовывать соединения в соли добавления либо основания, либо кислоты.
Нейтральные формы соединений предпочтительно восстанавливают путем приведения в контакт соединения с основанием или кислотой и выделения исходного соединения стандартным способом. Исходная форма соединения отличается от различных солей по некоторым своим свойствам, таким как растворимость в полярных растворителях, но в остальном соли эквивалентны исходной форме соединения для целей настоящего изобретения.
В дополнение к солевым формам настоящее изобретение относится к соединениям, которые находятся в форме пролекарства. Пролекарства описанных в этом документе соединений представляют собой соединения, которые легко претерпевают химические изменения в физиологических условиях с получением соединений по настоящему изобретению. Кроме того, пролекарства могут превращаться ех νί\Ό в соединения по настоящему изобретению химическими и биохимическими способами. Например, пролекарства могут медленно превращаться в соединения по настоящему изобретению, будучи помещенными в резервуар трансдермального пластыря вместе с подходящим ферментом или химическим реагентом.
Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в несольватированных формах, а также в сольватированных формах, включая гидратированные формы. В общем сольватированные формы являются эквивалентом несольватированных форм и подпадают под объем настоящего изобретения. Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в форме множественных кристаллов или в аморфной форме. В целом все физические формы являются эквивалентными для применений, предусмотренных настоящим изобретением, и считаются подпадающими под объем настоящего изобретения.
Некоторые соединения по настоящему изобретению содержат асимметрические атомы углерода (оптические центры) или двойные связи; рацематы, диастереоизомеры, геометрические изомеры и отдельные изомеры подпадают под объем настоящего изобретения.
Соединения по настоящему изобретению могут также содержать необычные соотношения изотопов одного или нескольких из атомов, образующих такие соединения. Например, соединения могут быть помечены радиоактивными изотопами, такими как, например, тритий (3Н), йод-125 (1251) или углерод-14 (14С). Все варианты изотопов соединений по настоящему изобретению, радиоактивные или нет, считаются подпадающими под объем настоящего изобретения.
Термин фрагмент прикрепления или фрагмент для прикрепления группы направленного действия относится к фрагменту, который делает возможным присоединение группы направленного действия к линкеру. Обычные группы прикрепления включают, в качестве пояснения, но не ограничения, алкил, аминоалкил, аминокарбонилалкил, карбоксиалкил, гидроксиалкил, алкилмалеимид, алкил-Νгидроксилсукцинимид, полиэтиленгликоль-малеимид и полиэтиленгликоль-№гидроксилсукцинимид, каждая из которых может быть дополнительно замещена. Для фактического присоединения к группе направленного действия линкер может также содержать фрагмент прикрепления.
Используемый в этом документе термин уходящая группа относится к части субстрата, которая отщепляется от субстрата в реакции.
Используемый в этом документе термин антитело включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающую часть) или их отдельные цепи. Термин антитело относится к гликопротеину, содержащему по крайней мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанных между собой дисульфидными связями, или к их антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (Ун) и константной области тяжелой цепи. Кон
- 16 016577 стантная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, Сщ, СН2 и СН3, и может иметь μ, δ, γ, α или ε изотип. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (Уь) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, Сь, который может иметь к или λ изотип. Области УН и У|, могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные области, называемые гипервариабельными участками (СОК), которые чередуются с более консервативными участками, называемыми скелетной областью (ЕК). Каждая УН и У|, состоит из трех СОК и четырех ЕК, расположенных от Ν-конца до С-конца в следующем порядке: ЕК1, СЭК1. ЕК2, СЭК2. ЕК3, СЭК3. ЕК4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (СЧс|) классической системы комплемента.
Используемые в этом документе термины фрагмент антитела или антигенсвязывающая часть антитела (или просто часть антитела) относятся к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами целой молекулы антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином фрагмент антитела или антигенсвязывающая часть антитела включают (ί) фрагмент ЕаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из Уъ, УН, С|. и Сш доменов; (ίί) фрагмент Е(аЬ')2, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов ЕаЬ, связанных дисульфидным мостиком в области талии; (ш) фрагмент Еб, состоящий из УН и СН1 доменов; (ίν) фрагмент Εν, состоящий из У|. и УН доменов одного плеча антитела, (ν) фрагмент бАЬ (^агб е1 а1., (1989) №Ииге 341:544-546), который состоит из УН домена; и (νί) и выделенный гипервариабельный участок (СЭК). Кроме того, хотя два домена фрагмента Εν, Уъ и УН кодируются различными генами, они могут быть объединены рекомбинантными методами при помощи синтетического линкера, который делает возможным образование ими единой белковой цепи, в которой области Уъ и УН соединяются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Εν (зсЕу) (например, см. В1гб е1 а1. (1988) 8аепсе 2А2:А23-426; и Низ1оп е1 а1. (1988), Ргос. №111. Асаб. 8с1 И8А 85:5879-5883)). Такие одноцепочечные антитела считаются подпадающими под значение термина антигенсвязывающая часть антитела. Указанные фрагменты антител получают с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной техники, а скрининг на из пригодность проводят тем же путем, что и для интактных антител.
Используемый в этом документе термин моноклональное антитело относится к препарату молекул антител одного молекулярного строения. Моноклональное антитело обладает специфичностью связывания и сродством к конкретному эпитопу.
Для получения моноклональных или поликлональных антител может использоваться любая известная методика (например, см. КоЬ1ег & М1Ыеш, ΝπΙιιιό 256:495-497 (1975); КохЬог е1 а1., 1ттипо1оду Тобау 4:72 (1983); Со1е е1 а1., р. 77-96 в МОNОС^ОNЛ^ /\\Т1В01)1Е8 САМЕК ТНЕКАРУ, А1ап К. Ь188, 1пс. (1985)).
Способы получения поликлональных антител известны специалистам в данной области техники. Инбредную линию мышей (например, мышей ВАЬВ/С) или кроликов иммунизируют белком с использованием стандартного адъюванта, такого как адъювант Фрейнда, и стандартного протокола иммунизации. Проводят мониторинг ответа иммунной системы животного на препарат иммуногена путем отбора образцов крови и определения титра реактивности в отношении β-субъединиц. После получения достаточно высоких титров антител к иммуногену у животного отбирают кровь и получают антисыворотку. Затем по желанию может проводиться фракционирование антисыворотки для обогащения антителами, реактивными в отношении белка.
Моноклональные антитела могут быть получены различными методиками, известными специалистам в данной области техники. Вкратце, клетки селезенки иммунизированного желаемым антигеном животного иммортализуют, обычно путем слияния с клетками миеломы (см. КоЬ1ег & МИз(е1п, Еиг. 1. 1ттипо1. 6:511-519 (1976)). Альтернативные способы иммортализации включают трансформацию с вирусом Эпштейна-Барра, онкогенами или ретровирусами, или другие способы, известные в данной области техники.
В предпочтительном примере осуществления антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело. Химерные или гуманизированные антитела по настоящему изобретению могут быть получены на основе последовательности мышиного моноклонального антитела. ДНК, кодирующая тяжелую и легкую цепь иммуноглобулинов, может быть получена из представляющей интерес мышиной гибридомы и сконструирована с использованием стандартных методик молекулярной биологии так, чтобы содержать немышиные последовательности иммуноглобулина (например, человека). Например, для создания химерного антитела вариабельные области иммуноглобулина мыши связывают с константными областями иммуноглобулина человека с использованием способов, известных в данной области техники (например, см. патент США № 4816567, выданный СаЬШу е1 а1.). Для создания гуманизированного антитела СЭК области мышей могут быть вставлены в рамку считывания человека с использованием способов, известных в данной области техники (например, см. патент США № 5225539, выданный ^М1п(ег, и
- 17 016577 патенты США № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Онееп е! а1.).
В другом предпочтительном примере осуществления антитело представляет собой человеческое антитело. Такие человеческие антитела могут быть получены путем иммунизации трансгенных или трансхромосомных мышей, в которых эндогенные гены мышиных иммуноглобулинов были инактивированы и были введены экзогенные гены человеческих иммуноглобулинов. Такие мыши известны в данной области техники (например, см. патенты США № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все выданные РопЬещ и Кау; патенты США № 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, выданные Кисйег1араб е! а1.; и заявку согласно РСТ \УО 02/43478, поданную Е1иба е! а1.) Человеческие антитела могут быть также получены с использованием методов фагового дисплея для скрининга библиотек генов, кодирующих человеческие иммуноглобулины. Такие методы фагового дисплея для выделения человеческих антител также хорошо известны в данной области техники (например, см. патенты США № 5223409; 5403484; и 5571698, выданные Ьабпег е! а1.; патенты США № 5427908 и 5580717, выданные Оо\\сг е! а1.; патенты США № 5969108 и 6172197, выданные МсСайебу е! а1.; и патенты США № 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, выданные СпГГййк е! а1.).
Используемый в этом документе термин твердая подложка относится к материалу, который является, по существу, нерастворимым в выбранной системе растворителей или который может легко разделяться (например, путем выпадения в осадок) из выбранной системы растворителей, в которой он растворен. Твердые подложки, пригодные для применения в практике настоящего изобретения, могут включать группы, которые активированы или способны к активации для возможности связывания выбранных веществ с твердой подложкой. Твердая подложка может также представлять собой субстрат, например чип, слоистую пластину или лунку, к которым может быть прикреплено одно или несколько соединений по настоящему изобретению.
Используемый в этом документе термин реакционноспособная функциональная группа относится к группам, включая без ограничения олефины, ацетилены, спирты, фенолы, простые эфиры, оксиды, галогениды, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, цианаты, изоцианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, амины, гидразины, гидразоны, гидразиды, диазо, диазоний, нитро, нитрилы, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, сульфоксиды, сульфоны, сульфоные кислоты, сульфиновые кислоты, ацетали, кетали, ангидриды, сульфаты, сульфеновые кислоты, изонитрилы, амидины, имиды, имидаты, нитроны, гидроксиламины, оксимы, гидроксамовые кислоты, тиогидроксамовые кислоты, аллены, орто-эфиры, сульфиты, енамины, инамины, мочевины, псевдомочевины, семикарбазиды, карбодиимиды, карбаматы, имины, азида, азосоединения, азоксисоединения и нитрозосоединения. Реакционноспособные функциональные группы также включают группы, используемые для приготовления биоконъюгатов, например, сложные Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, малеимиды и т.п. (например, см. Негтапкоп, ВЮСОИШСАТЕ ΊΈ6ΗΝΐρυΕ8, Лсабепис ргекк, 8ап О|едо. 1996). Способы получения каждой из указанных групп хорошо известны в данной области техники и их применение или модификация для конкретных целей находятся в рамках навыков специалиста в данной области техники (например, см. 8апб1ег апб Каго, ебк. ОВСЛХ1С 1Т'\СТЮ\Л1. СВОиР ΡΡΕΡΑΒΑΤΙΟΝ8, Асабешю Ргекк, 8ап П1едо, 1989).
Реакционноспособные функциональные группы могут быть защищенными или незащищенными.
Соединения по настоящему изобретению получают в виде отдельного изомера (например, энантиомера, цис-транс изомера, позиционного изомера, диастереоизомера) или в виде смеси изомеров. В предпочтительном примере осуществления соединения получают, по существу, в виде отдельного изомера. Способы получения, по существу, чистых изомеров соединений известны в данной области техники. Например, обогащенные энантиомерами смеси и энантиомерно чистые соединения могут быть получены с использованием промежуточных продуктов синтеза, которые являются энантиомерно чистыми, в сочетании с реакциями, которые либо не затрагивают стереохимию хирального центра, либо приводят к его полной инверсии. В качестве альтернативы, конечный продукт или промежуточные продукты в процессе синтеза может быть преобразован с отдельный стереоизомер. Методики инвертирования или сохранения неизменным конкретного стереоцентра и преобразования смеси стереоизомеров хорошо известны в данной области техники и находятся в рамках навыков специалиста в данной области техники по выбору подходящего способа в конкретной ситуации (в общем см. Ецгшкк е! а1. (ебк.), УОСЕБ'к ΕNСΥС^ΟΡΕΌΙΑ ОЕ РВЛСТ1СЛЕ ОВСЛХ1С СНЕМ18ТВУ 5ТН ΕΌ., Ропщпап Заепййс апб Т ес1ииса1 Ыб., Еккех, 1991, р. 809-816; и Не11ег, Лсе. Сйеш. Век. 23: 128 (1990)).
Линкеры.
Настоящее изобретение относится к конъюгатам лекарство-лиганд, где лекарство соединено с лигандом посредством химического линкера, включая без ограничения линкеры, раскрытые в заявке на выдачу патента США № 11/134826 и в предварительных заявках на выдачу патента США № 60/572667 и 60/661174, каждая из которых включена в этом документ посредством ссылки. Такой линкер представляет собой пептидильный, гидразиновый или дисульфиный линкер, описываемые в этом документе как Ю^-Е-Ю'к, (Б^-Н-Ю'к, (И4)р-1-(С|)т соответственно. В дополнение к линкерам для присоединения к лекарству настоящее изобретение также относится к расщепляемой линкерной ножке, которая подхо
- 18 016577 дит для присоединения практически к любым молекулярным частицам. Примеры линкерных ножек по настоящему изобретению представлены в этом документе посредством ссылки к их присоединению к терапевтическому фрагменту. Однако для специалиста в данной области техники совершенно ясно, что линкеры могут быть присоединены к различным частицам, включая без ограничения диагностические средства, аналитические агенты, биомолекулы, агенты направленного действия, детектируемые метки и т.п.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к линкерам, которые пригодны для присоединения групп направленного действия к терапевтическим агентам и маркерам. В другом аспекте настоящее изобретение относится к линкерам, которые наделяют соединения стабильностью, снижают их токсичность ίη νίνο или иным образом благоприятно влияют на их фармакокинетику, биологическую доступность и/или фармакодинамику. В таких примерах осуществления, как правило, предпочтительно, чтобы линкер расщеплялся, высвобождая активное лекарство, как только лекарство будет доставлено в место приложения его действия. Так, в одном примере осуществления изобретения линкеры по настоящему изобретению не оставляют следов, так как после отделения от терапевтического средства или маркера (как, например, в процессе активации) не остается следов присутствия линкера. В другом примере осуществления изобретения линкеры характеризуются своей способностью к расщеплению внутри или близ клетки-мишени, как, например, в месте приложения терапевтического действия или активности маркера. Такое расщепление может быть ферментативным по своей природе. Это свойство способствует снижению системной активации терапевтического средства или маркера, снижению токсичности и системных побочных эффектов. Предпочтительные расщепляемые ферментами группы включают пептидные связи, сложноэфирные связи и дисульфидные связи. В других примерах осуществления линкеры чувствительны к рН и расщепляются при изменении значения рН.
Важным аспектом настоящего изобретения является возможность регуляции скорости, с которой расщепляется линкер. Например, описанные в этом документе гидразиновые линкеры являются особенно применимыми, поскольку в зависимости от конкретного строения применяемого линкера можно варьировать скоростью, с которой линкер циклизуется и тем самым отщепляет лекарство от лиганда. В \УО 02/096910 представлено несколько специфичных комплексов лиганд-лекарство, содержащих гидразиновый линкер. Однако не существует никакой возможности настраивать линкерную композицию в зависимости от требуемой скорости циклизации, и конкретно описанные соединения отщепляют лиганд от лекарства со скоростью меньшей, чем это было бы предпочтительно для многих конъюгатов лекарство-линкер. В отличие от этого гидразиновые линкеры по настоящему изобретению обеспечивают широкий спектр скоростей циклизации, от очень быстрых до очень медленных, давая возможность выбрать конкретный гидразиновый линкер в зависимости от требуемой скорости циклизации. Например, очень быстрая циклизация может быть достигнута с гидразиновыми линкерами, которые при расщеплении дают одно 5-членное кольцо. Предпочтительные значения скорости циклизации для направленной доставки цитотоксического агента в клетки достигают путем использования гидразиновых линкеров, которые при расщеплении дают либо два 5-членных кольца, либо одно 6-членное кольцо, в результате расщепления линкера, содержащего два присоединенных к одному и тому атому (геминальных) метила. Было показано, что эффект двух присоединенных к одному и тому атому метилов (дет-диметил-эффект) увеличивает скорость реакции циклизации по сравнению с одним 6-членным кольцом без двух геминальных метилов. Этот эффект является результатом ослабления напряжения в кольце. Однако иногда вместо того, чтобы ускорять реакцию, заместители могут замедлять ее. Обычно причина замедления сводится к стерическому затруднению. Как представлено в примере 2.4, дет-диметил-замещение способствует более быстрому протеканию реакции циклизации по сравнению со случаем, когда геминальный атом углерода представляет собой СН2.
Однако важно отметить, что в некоторых примерах осуществления предпочтительным может оказаться линкер, который расщепляется более медленно. Например, в композиции с замедленным высвобождением или в композиции, содержащей компоненты и с быстрым и с медленным высвобождением, может быть полезным использование линкера, который расщепляется более медленно. В определенных примерах осуществления медленная скорость циклизации достигается путем использования гидразинового линкера, который при расщеплении дает либо одно 6-кольцо без дет-диметил-замещения, либо одно 7-членное кольцо.
Линкеры могут также служить для придания устойчивости терапевтическому средству или маркеру к разрушению в процессе кровообращения. Это качество обеспечивает значительный положительный эффект, поскольку такая стабилизация приводит к увеличению продолжительности времени полужизни в кровотоке присоединенного средства или маркера. Линкер также служит для смягчения активности присоединенного средства или маркера таким образом, что конъюгат обладает в кровотоке сравнительно мягким действием, и оказывает желаемое действие (например, токсическое) после активации в желаемом месте приложения действия. В случае конъюгатов терапевтических средств это качество линкера служит для увеличения значения терапевтического индекса средства.
Стабилизирующие группы предпочтительно выбирают для замедления выведения и метаболизма терапевтического средства или маркера ферментами, которые могут присутствовать в крови или не в не
- 19 016577 являющихся мишенью тканях, и, кроме того, выбирают для ограничения транспорта средства или маркера в клетки. Стабилизирующие группы служат для блокировки разрушения средства или маркера, а также могут наделять средство или маркер другими физическими характеристиками. Стабилизирующая группа может также улучшать стабильность средства или маркера в процессе их хранения в композиции лекарственной формулы или отдельно.
В идеале, стабилизирующую группу используют для стабилизации терапевтического средства или маркера, если она защищает средство или маркер от разрушения при тестовом хранении средства или маркера в крови человека при 37°С в течение 2 ч, и приводит к расщеплению менее чем 20%, предпочтительно менее чем 10%, более предпочтительно менее чем 5% и еще более предпочтительно менее чем 2%, средства или маркера ферментами, присутствующими в крови человека в данных условиях проведения теста.
Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, содержащим такие линкеры. Более конкретно, настоящее изобретение относится к пролекарствам, которые могут быть использованы для лечения заболевания, в особенности для химиотерапии рака. В конкретном плане, применение описанных в этом документе линкеров дает пролекарства, которые обладают высокой специфичностью действия, сниженной токсичностью и улучшенной стабильностью в кровотоке по сравнению с пролекарствами сходного строения.
Линкеры по настоящему изобретению, такие как описанные в этом документе, могут находиться в любом положении структуры цитотоксичного конъюгата.
Таким образом, предложен линкер, который может содержать любую из целого ряда групп как часть своей цепи и расщепляться ίη νίνο, например, в кровотоке, со скоростью, повышенной по сравнению с таковой для конструктов, не содержащих такие группы. Также предложены конъюгаты линкерных ножек с терапевтическими и диагностическими средствами. Линкеры применимы для получения пролекарственных аналогов терапевтических средств и для обратимого связывания терапевтического или диагностического средства с агентом направленного действия, детектируемой меткой или твердой подложкой. Линкеры могут входить в композицию комплексов, которые содержат цитотоксины по настоящему изобретению.
В дополнение к расщепляемой пептидной, гидразиновой или дисульфидной группе, между цитотоксином и агентом направленного действия необязательно вводят одну или несколько саморазрушающихся линкерных групп Ь1. Такие линкерные группы могут также описываться как спейсерные группы и содержать по крайней мере две реакционноспособные функциональные группы. Обычно, одна из химических функциональных групп спейсерной группы связана с химической функциональной группой терапевтического средства, например цитотоксина, тогда как другая химическая функциональная группа спейсерной группы используется для связи с химической функциональной группой агента направленного действия или расщепляемого линкера. Примеры химических функциональных групп спейсерной группы включают гидрокси, меркапто, карбонильную, карбокси, амино, кетоновую и меркапто группы.
Представленные Ь1 саморазрушающиеся линкерные группы, как правило, представляют собой замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, или замещенный или незамещенный гетероалкил. В одном примере осуществления алкильные или арильные группы могут содержать от 1 до 20 атомов углерода. Они также могут содержать фрагмент полиэтиленгликоля.
Примеры спейсерных групп включают, например, 6-аминогексанол, 6-меркаптогексанол, 10гидроксидекановую кислоту, глицин и другие аминокислоты, 1,6-гександиол, β-аланин, 2-аминоэтанол, цистеамин (2-аминоэтантиол), 5-аминопентановую кислоту, 6-аминогексановую кислоту, 3малеимидобензойную кислоту, фталид, α-замещенные фталиды, карбонильную группу, сложные аминалевые эфиры, нуклеиновые кислоты, пептиды и т.п.
Спейсер может служить для добавления комплексу цитотоксин-агент направленного действия дополнительной молекулярной массы и введения химической функциональной группы. Дополнительная масса и функциональная группа, как правило, изменяет значение времени полужизни в сыворотке крови и другие свойства комплекса. Таким образом, путем тщательного подбора спейсерных групп могут быть получены комплексы цитотоксина с целым диапазоном значений времени полужизни в сыворотке крови.
Спейсер (спейсеры), располагающиеся непосредственно рядом с фрагментом лекарства, также обозначают как (Ь1)т, где т равно целому числу, выбранному из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. При наличии нескольких спейсеров Ь1 могут использоваться одинаковые или различные спейсеры. Ь1 может представлять собой любую саморазрушающуюся группу. В одном примере осуществления Ь1 предпочтительно представляет собой замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил, незамещенный гетероциклоалкил и замещенный гетероциклоалкил. Если конъюгат лекарство-лиганд содержит гидразиновый линкер, то Ь1 не содержит дисульфидную связь.
Ь4 представляет собой фрагмент линкера, который придает содержащим такой фрагмент конъюгатам свойства повышенной растворимости и сниженной способности к агрегации. Линкер Ь4 не должен быть саморазрушающимся. В одном примере осуществления фрагмент Ь4 представляет собой замещен
- 20 016577 ный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, каждый из которых может быть неразветвленным, разветвленным или циклическим. Заместители могут представлять собой, например, низший (С1-С6)алкил, алкокси, алкилтио, алкиламино или диалкиламино. В определенных примерах осуществления Ь4 содержит нециклический фрагмент. В другом примере осуществления Ь4 содержит любой положительно или отрицательно заря4 женный аминокислотный полимер, такой как полилизин или полиаргинин. Б может содержать полимер, такой как фрагмент полиэтиленгликоля. Кроме того, линкер Б4 содержит, например, и полимерный компонент, и небольшой химический фрагмент.
В предпочтительном примере осуществления Б4 содержит фрагмент полиэтиленгликоля (РЕО). Фрагмент РБО в композиции Б4 может быть длиной от 1 до 50 звеньев. Предпочтительно фрагмент РБО имеет 1-12 повторяющихся звеньев, более предпочтительно 3-12 повторяющихся звеньев, более предпочтительно 2-6 повторяющихся звеньев, еще более предпочтительно 3-5 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно 4 повторяющихся звена. Б4 может состоять лишь из фрагмента РЕО или он может дополнительно содержать замещенный или незамещенный алкил или гетероалкил. Объединение РЕО как части фрагмента Б4 полезно для улучшения растворимости комплекса в воде. Кроме того, фрагмент РЕО снижает способность к агрегации, которая может происходить во время конъюгации лекарства и антитела.
(1) Пептидный линкер (Р).
Как рассматривалось выше, пептидильные линкеры по настоящему изобретению могут быть представлены общей формулой (Б4)р-Р-(Б1)т, где Р представляет собой часть линкера, содержащую пептидильный фрагмент. В одном примере осуществления часть Р содержит необязательный дополнительный саморазрушающийся линкер (линкеры) Б2 и карбонильную группу. В другом примере осуществления часть Р содержит аминогруппу и необязательную спейсерную группу (группы) Б3.
Соответственно в одном примере осуществления конъюгат содержит пептидильный линкер, содержащий структуру формулы (4)
О ' А> \ Л ' ' о ' ' т , (4)
В этом примере осуществления Б1 представляет собой описанный выше саморазрушающийся линкер и Б4 представляет собой фрагмент, который наделяет свойствами повышенной растворимости и сниженной способности к агрегации, как описано выше. Б2 представляет собой саморазрушающийся линкер (линкеры), т равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; о и р независимо равны 0 или 1. В одном примере осуществления т равно 3, 4, 5 или 6. АА1 представляет собой одну или несколько природных аминокислот и/или неприродных α-аминокислот; с равно целому числу от 1 до 20.
В пептидных линкерах по настоящему изобретению представленной выше формулы 4 АА1 связана своим Ν-концом либо непосредственно с Б4, либо, если Б4 отсутствует, непосредственно с группой X (т.е. с агентом направленного действия, детектируемой меткой, защищенной реакционноспособной функциональной группой или незащищенной реакционноспособной функциональной группой). В некоторых примерах осуществления, при наличии Б4, Б4 не содержит карбоксильную ацильную группу, непосредственно связанную с Ν-концом (АА1)с. Таким образом, в указанных примерах осуществления нет необходимости в наличии карбоксильного ацильного звена непосредственно между Б4 или X4 и АА1, как это необходимо в пептидных линкерах в соответствии с патентом США № 6214345.
В другом примере осуществления конъюгат содержит пептидильный линкер, содержащий структуру формулы (5)
В этом примере осуществления Б4 представляет собой фрагмент, который наделяет свойствами повышенной растворимости и сниженной способности к агрегации, как описано выше; Б3 представляет собой спейсерную группу, содержащую первичный или вторичный амин или карбоксильную функциональную группу, и либо амин группы Б3 образует амидную связь с боковой карбоксильной функциональной группой группы Ό, либо карбоксил группы Б3 образует амидную связь с боковой аминогруппой группы Ό; и о и р независимо равны 0 или 1. АА1 представляет собой одну или несколько природных аминокислот и/или неприродных α-аминокислот; с равно целому числу от 1 до 20. В этом примере осуществления Б1 отсутствует (т.е. в общей формуле т равно 0).
В пептидных линкерах по настоящему изобретению представленной выше формулы (5) АА1 связана своим Ν-концом либо непосредственно с Б4, либо, если Б4 отсутствует, непосредственно с группой X (т.е. с агентом направленного действия, детектируемой меткой, защищенной реакционноспособной функциональной группой или незащищенной реакционноспособной функциональной группой). В неко
- 21 016577 торых примерах осуществления, при наличии Ь4, Ь4 не содержит карбоксильную ацильную группу, непосредственно связанную с Ν-концом (АА1)с. Таким образом, в указанных примерах осуществления нет необходимости в наличии карбоксильного ацильного звена непосредственно между Ь4 или X4 и АА1, как этот необходимо в пептидных линкера в соответствии с патентом США № 6214345.
Саморазрушающийся линкер Ь2.
Саморазрушающийся линкер Ь2 представляет собой бифункциональный химический фрагмент, способный ковалентно связывать вместе два отстоящих химических фрагмента в стабильную в обычных условиях состоящую из трех частей молекулу, высвобождающий один из упомянутых отстоящих химических фрагментов из состоящей из трех частей молекулы посредством ферментативного расщепления, а другой из упомянутых отстоящих химических фрагментов - вследствие спонтанного отщепления от оставшейся части молекулы после упомянутого ферментативного расщепления. В соответствии с настоящим изобретением саморазрушающийся спейсер ковалентно связан одним из своих концов с пептидным фрагментом и ковалентно связан другим своим концом с химически реакционноспособным участком фрагмента лекарства, чья дериватизация ингибирует фармакологическую активность, с тем, чтобы разнести и ковалентно связать вместе пептидный фрагмент и фрагмент лекарства в состоящую из трех частей молекулу, которая стабильна и фармакологически неактивна в отсутствие определенного фермента, но расщепляема определенным ферментом по связи, ковалентно связывающей спейсерный фрагмент и пептидный фрагмент, с высвобождением тем самым пептидного фрагмента из состоящей из трех частей молекулы. Такое ферментативное расщепление, в свою очередь, активирует саморазрушающийся характер спейсерного фрагмента и инициирует спонтанное расщепление связи, ковалентно связывающей спейсерный фрагмент с фрагментов лекарства, с высвобождением тем самым лекарства в фармакологически активной форме.
Саморазрушающийся линкер Ь2 может представлять собой саморазрушающуюся группу. Предпочтительно Ь2 представляет собой замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, незамещенный гетероциклоалкил, замещенный гетероциклоалкил, замещенный и незамещенный арил и замещенный и незамещенный гетероарил.
Один особенно предпочтительный саморазрушающийся спейсер Ь2 может быть представлен формулой (6):
Ароматическое кольцо аминобензильной группы может быть замещено одной или несколькими группами К. Группа К представляет собой заместитель ароматического кольца, который замещает атом водорода, иным способом присоединенный к одному из четырех незамещенных атомов углерода, которые являются частью структуры кольца. Группа К может представлять собой одиночный атом, такой как галоген, или может представлять собой многоатомную группу, такую как алкил, гетероалкил, амино, нитро, гидрокси, алкокси, галогеналкил и циано. Каждый К независимо выбирают из группы, состоящей из замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NО2, НК.21К22, ИК^СОК22, ОСОНК.21К22, ОСОК21 и ОК21, где К21 и К22 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила и незамещенного гетероциклоалкила. Примеры заместителей К включают без ограничения Г, С1, Вг, I, NО2, ОН, ОСН3, ХНСОСН3, Ν^Η3)2, ХНСОСГ3 и метил. Для Ка а представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3 или 4. В одном предпочтительном примере осуществления а равно 0.
Атом кислорода эфирной группы в представленной выше структуре соединен с карбонильной группой. Линия, проведенная от функциональной группы ΝΗ24 к ароматическому кольцу, указывает на то, что аминогруппа может быть связана с любым из пяти атомов углерода, которые образуют кольцо и которые не замещены -СН2-О-группой. Предпочтительно функциональная группа ΝΗ24 группы X ковалентно связана с ароматическим кольцом в параположении относительно -СН2-О-группы. К24 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. В конкретном примере осуществления К24 представляет собой водород.
В предпочтительном примере осуществления настоящее изобретение относится к представленному выше пептидному линкеру формулы (4), где Г содержит структуру
- 22 016577
в которой К24 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила;
К представляет собой элемент конструкции, независимо выбранный из группы, состоящей из замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещен21 22 21 22 ного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ΝΟ2, ΝΚ К , ΝΚ СОК , ΟΟΟΝΚ21Κ22, ОСОК21 и ОК21, где К21 и К22 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила;
а представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3 или 4.
В другом примере осуществления пептидный линкер представленной выше формулы (4) содержит
в которой каждый К2 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила.
Спейсерная группа Б3.
Спейсерная группа Б3 характеризуется тем, что содержит первичный или вторичный амин или карбоксильную функциональную группу, и либо амин группы Б3 образует амидную связь с боковой карбоксильной функциональной группой группы I), либо карбоксил группы Б3 образует амидную связь с боковой аминогруппой группы Ώ. Группа Б3 может быть выбрана из группы, состоящей из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, или замещенного или незамещенного гетероциклоалкила. В предпочтительном примере осуществления Б3 содержит ароматическую группу. Более предпочтительно Б3 содержит группу бензойной кислоты, анилиновую группу или индольную группу. Неограничивающими примерами структур, которые могут служить в качестве спейсера -Б3-№Н-, включают следующие структуры:
в которых Ζ представляет собой элемент конструкции, выбранный из О, 8 и Ν^3, где К23 представляет собой радикал, выбранный из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.
При расщеплении линкера по настоящему изобретению, содержащего Б3, фрагмент Б3 остается присоединенным к лекарству I). Соответственно фрагмент Б3 выбирают таким образом, что его присое
- 23 016577 динение к Ό значительно не меняет активность Ό. В другом примере осуществления часть лекарства Ό сама по себе выступает в качестве спейсера Ь3. Например, в одном примере осуществления лекарство Ό представляет собой производное дуокармицина, в котором часть лекарства выступает в качестве спейсера Ь3. Неограничивающие примеры таких примеров осуществления включают те из них, в которых ΝΗ2(Ь3)-0 имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из
где Ζ представляет собой элемент конструкции, выбранный из О, 8 и ΝΒ23, где В23 представляет собой радикал, выбранный из Н, замещенного или незамещенного алкила, за мещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
группа ΝΗ2 на каждой структуре взаимодействует с (АА1)с с образованием -(ΛΛΙ)^-ΝΗ-.
Пептидная последовательность АА1.
Группа АА1 представляет собой отдельную аминокислоту или несколько аминокислот, которые объединены вместе пептидными связями. Аминокислоты могут быть природными аминокислотами и/или неприродными α-аминокислотами.
Пептидная последовательность (АА1)с функционально представляет собой продукт амидирования отдельной аминокислоты (если с=1) или нескольких кислот, объединенных вместе пептидными связями. Пептид по настоящему изобретению выбирают для управления катализируемым ферментом расщеплением пептида ферментом в представляющем интерес месте биологической системе. Например, для конъюгатов, которые были направлены к клетке с использованием агента направленного действия, а затем были поглощены клеткой, выбирают такой пептид, который расщепляется одной или несколькими лизосомальными протеазами, что пептид расщепляется внутриклеточно внутри лизосомы. Число аминокислот в пептиде может варьировать от 1 до 20; но более предпочтительно составляет 2-8 аминокислоты, 2-6 аминокислоты или 2, 3 или 4 аминокислоты, содержащие (АА1)с. Пептидные последовательности, которые подвержены расщеплению определенными ферментами или классами ферментов, хорошо известны в данной области техники.
В данной области техники известно множество пептидов, которые расщепляются ферментами в плазме крови, печени, кишечнике и т.д. Пример пептидной последовательности по настоящему изобретению включает пептидную последовательность, которая расщепляется протеазой. Акцент на последующее обсуждение применения чувствительной к действию протеазы последовательности сделан для ясности иллюстрации и не служит для ограничения объема настоящего изобретения.
Когда расщепляющим пептид ферментом является протеаза, то линкер, как правило, включает пептид, содержащий последовательность для распознавания и расщепления протеазой. Последовательность для распознавания и расщепления протеазой представляет собой специфичную аминокислотную последовательность, распознаваемую протеазой во время протеолитического расщепления. В данной области техники известно множество сайтов расщепления протеазами, и эти и другие сайты расщепления могут
- 24 016577 быть включены в линкерный фрагмент (например, см. Ма!ауокЫ е! а1. 8с1епсе 247:954 (1990); Эипп е! а1. Ме!й. Епхуто1. 241:254 (1994); 8еИай е! а1. Ме!й. ЕпхутоЕ 244:175 (1994); ТйогпЬеггу, Ме!й. Епхуто1. 244:615 (1994); АеЬег е! а1. Ме!й. Епгуто! 244:595 (1994); 8тйй е! а1. Ме!й Еп/уто1. 244:412 (1994); Воиу1ег е! а1. Ме111 ЕпгутоТ 248:614 (1995), НагНу е! а1., в ΑΜΥ^ОI^ РКОТЕ1Х РИЕСЕИ8ОИ ΙΝ ЭЕУЕЬОРМЕКТ, АСШС, А\1) АЕ/НЕ1МЕИ'8 Э18ЕА8Е, ед. Мак!егк е! а1. р. 190-198 (1994)).
Аминокислоты пептидной последовательности (АА')с выбирают на основе их пригодности для избирательного ферментативного расщепления конкретными молекулами, такими как ассоциированная с опухолью протеаза. Используемые аминокислоты могут быть природными или неприродными аминокислотами. Они могут находиться в Ь- или в Ό-конфигурации. В одном примере осуществления используют по крайней мере три различных аминокислоты. В другом примере осуществления используют только две аминокислоты.
В предпочтительном примере осуществления пептидную последовательность (АА')с выбирают на основе ее способности быть расщепленной лизосомальными протеазами, неограничивающие примеры которых включают катепсины В, С, Ό, Н, Ь и 8. Предпочтительно пептидная последовательность (АА')с способна быть расщепленной катепсином В ш У11го, что может быть протестировано ш νίΙΐΌ с использованием известных в данной области техники методов анализа расщепления протеазами.
В другом примере осуществления пептидную последовательность (АА')с выбирают на основе ее способности быть расщепленной ассоциированной с опухолью протеазой, такой как протеаза, обнаруженная внеклеточно вблизи раковых клеток, неограничивающие примеры которой включают тиметолигопептидазу (ТОР) и СЭ10. Способность пептиды быть расщепленным ТОР или СЭ10 может быть протестирована т ν 1(го с использованием известных в данной области техники методов анализа расщепления протеазами.
Подходящие, но неограничивающие, примеры пептидных последовательностей, подходящих для использования в конъюгатах по настоящему изобретению, включают Уа1-С1!, Уа1-Ьук, Рйе-Ьук, Ьук-Ьук, А1а-Ьук, Рйе-Сй, Ьеи-Сй, Пе-Сй, Тгр, Сй, Рйе-А1а, Рйе-№-тозил-Агд, Рйе-№-нитро-Агд, Рйе-Рйе-Ьук, ΌРНе-РНе-Ру^ 61у-Рйе-Ьук, Ьеи-АИ-Ьеи, 11е-А1а-Ьеи, Уа1-А1а-Уа1, А1а-Теи-А1а-Ьеи (8ЕЦ ΙΌ NО: 1), в-А1аТеи-А1а-Ьеи (8ЕЦ ΙΌ NО: 2) и С1у-РНе-Реи-С1у (8ЕЦ ΙΌ NО: 3). Предпочтительными пептидными последовательностями являются Уа1-С1! и Уа1-Ьук.
В другом примере осуществления аминокислоту, расположенную наиболее близко к фрагменту лекарства, выбирают из группы, состоящей из А1а, Акп, Акр, Сй, Сук, С1п, С1и, С1у, Не, Ьеи, Ьук, Ме!, Рйе, Рго, 8ег, Тйг, Тгр, Туг и Уа1. В еще одном примере осуществления аминокислоту, расположенную наиболее близко в фрагменту лекарства, выбирают из группы, состоящей из А1а, Акп, Акр, Сук, С1п, С1и, С1у, Не, Ьеи, Ме!, Рйе, Рго, 8ег, Тйг, Тгр, Туг и Уа1.
Протеазы вовлечены в метастазирование рака. Повышенный синтез протеазы урокиназы коррелирует с повышенной способностью к метастазированию у многих видов рака. Урокиназа активирует плазмин из плазминогена, который расположен повсеместно во внеклеточном пространстве, и его активация может вызывать разрушение белков внеклеточного матрикса, посредством чего распространяются метастазирующие раковые клетки. Плазмин может также активировать коллагеназы, усиливая тем самым разрушение коллагена в базальной мембране, окружающей капилляры и лимфатическую систему, позволяя тем самым раковым клеткам распространяться в ткани-мишени (Эапо, е! а1. Ай\г. Сапсег. Кек., 44:139 (1985)). Таким образом, в объем настоящего изобретения входит использование в качестве линкера пептидной последовательности, которая расщепляется урокиназой.
Настоящее изобретение также относится к использованию пептидных последовательностей, которые чувствительны к расщеплению триптазами. Тучные клетки человека экспрессируют по крайней мере четыре различных триптазы, обозначаемых α, βΙ, βΙΙ и βΙΙΙ. Эти ферменты не регулируются ингибиторами протеинах плазмы крови и расщепляют 1п \йго лишь несколько физиологических субстратов. Триптазное семейство сериновых протеаз участвуют в целом ряде аллергических и воспалительных заболеваний с вовлечением тучных клеток, вследствие повышенного содержания триптаз, обнаруженного в биологических жидкостях у больных с указанными нарушениями. Однако истинная роль триптазы в патофизиологии заболеваний остается лишь описанной в общих чертах. Объем биологических функций и соответствующие физиологические последствия деятельности триптаз по существу определяются ее субстратной специфичностью.
Триптаза является мощным активатором проурокиназного активатора плазминогена (иРА), проферментной формой протеазы, ассоциированной с метастазированием и инвазией опухолей. Запуск каскада активации плазминогена, приводящего к разрушению внеклеточного матрикса для просачивания и миграции клеток, может служить показателем активации триптазой проурокиназного активатора плазминогена в Р4-Р1 последовательности Рго-Агд-Рйе-Ьук (8ЕЦ ΙΌ NО: 4) (8!аск е! а1., 1оигпа1 о£ Вю1ощса1 Сйетййу 269 (13): 9416-9419 (1994)). Вазоактивный пептид кишечника, нейропептид, вовлеченный в регуляцию сосудистой проницаемости, также расщепляется триптазой, главным образом по последовательности Тйг-Агд-Ьеи-Агд (8ЕЦ ΙΌ NО: 5) (Тагп е! а1., Ат. 1. Кекрй. Се11 Мо1. Вю1. 3:27-32 (1990)). Связанный с С-белком рецептор РАК-2 может расщепляться и активироваться триптазой по последователь
- 25 016577 ности 8ег-Ьу8-О1у-Лгд (8ЕР ΙΌ ΝΟ: 6) с индукцией пролиферации фибробластов, тогда как активируемый тромбином рецептор РАЯ-1 инактивируется расщеплением триптазой по последовательности РгоАзп-Азр-Ьуз (8ЕР ΙΌ ΝΟ: 7) (МоЕпо е! а1., 1оигпа1 оГ Вю1одюа1 СЬет1§!гу 272(7):4043-4049 (1997)). В своей совокупности эти доказательства наводят на мысль о центральной роли триптазы в перестройке тканей как следствии болезни. Это согласуется с кардинальными изменениями, наблюдаемыми при некоторых опосредуемых тучными клетками заболеваниях. Одним отличительным признаком хронической астмы и других продолжительных респираторных заболеваний является фиброз и утолщение подлегающих тканей, что может являться результатом активации триптазы в этих физиологических мишенях. Аналогичным образом, в целом ряде сообщений было показано, что ангиогенез ассоциирован с плотностью тучных клеток, активностью триптазы и неутешительным прогнозом для целого ряда злокачественных опухолей (Сошзепз е! а1., Оепез апб Оеуе1ортеп! 13 (11):1382-97 (1999); Такапаш1 е! а1., Сапсег 88 (12):2686-92 (2000); То!Ь-1ака!1с§ е! а1., Нитап Ра!ко1оду 31(8):955-960 (2000); Я1ЬаШ е! а1., 1п!егпа!юпа1 1оита1 оГ Сапсег 85(2):171-5 (2000)).
В данной области техники известны способы оценки, расщепляет ли конкретная протеаза выбранную пептидную последовательность. Например, использование меченного 7-амино-4-метилкумарином (АМС) флуорогенного пептидного субстрата является хорошо обоснованным способом определения специфичности протеаз (/пптегтап М. е! а1. (1977), Апа1у!1са1 ВюсЬет1§!гу 78:47-51). Специфичное расщепление анилидной связи высвобождает уходящую группу флуорогенного АМС, позволяя проводить простое определение степени расщепления для конкретных субстратов. Совсем недавно для быстрого скрининга Ν-концевой специфичности протеаз путем исследования широкого ряда субстратов в одном эксперименте были разработаны матрицы Щее Ό., е! а1. (1999), Вюогдашс апб МеШста1 СЬет1§!гу Ее!!ег§ 9:1667-72) и позиционно-сканирующие библиотеки (Яапо Т.А., е! а1. (1997), СЬет1§!гу апб Вю1оду 4:14955) меченных АМС пептидных последовательностей. Таким образом, специалист в данной области техники может легко оценить матрицу пептидных последовательностей для определения их пригодности для целей настоящего изобретения, не прибегая к проведению чрезмерных экспериментов.
(2) Гидразиновые линкеры (Н).
Во втором примере осуществления конъюгат по настоящему изобретению содержит гидразиновый саморазрушающийся линкер, где конъюгат имеет строение
X4----(1_4)р-н—(Ь’)т---ϋ где значения Б, Ь1, Ь4 и X4 определены выше и описаны далее в этом документе и Н представляет собой линкер, содержащий структуру
С(К24)3
где п1 равно целому числу от 1 до 10;
п2 равно 0, 1 или 2;
каждый Я2 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила; и
I представляет собой либо связь (т.е. связь между атомом углерода каркаса молекулы и смежного атома азота), или:
где п3 равно 0 или 1 при условии, что если п3 равно 0, то п2 не равно 0; и п4 равно 1, 2 или 3,
В одном примере осуществления замещение в фенольном кольце является паразамещением. В предпочтительных примерах осуществления п1 равно 2, 3 или 4 либо т равно 3. В предпочтительных
- 26 016577 примерах осуществления η2 равно 1. В предпочтительных примерах осуществления I представляет собой связь (т.е. связь между атомом углерода каркаса молекулы и смежного атома азота). В одном аспекте гидразиновый линкер Н может образовывать при расщеплении 6-членный саморазрушающийся линкер, например, если η3 равно 0, и η4 равно 2. В другом аспекте гидразиновый линкер Н может образовывать при расщеплении два 5-членных саморазрушающихся линкера. В еще одних аспектах Н образует при расщеплении 5-членный саморазрушающийся линкер, Н образует 7-членный саморазрушающийся линкер, или Н образует 5-членный саморазрушающийся линкер и 6-членный саморазрушающийся линкер. На скорость расщепления влияет размер образующегося при расщеплении кольца. Таким образом, в зависимости от желаемой скорости расщепления может быть выбрано кольцо подходящего размера, которое должно образовываться при расщеплении.
5-Членные гидразиновые линкеры.
В одном примере осуществления гидразиновый линкер содержит 5-членный гидразиновый линкер, где Н содержит структуру
В предпочтительном примере осуществления η1 равно 2, 3 или 4. В другом предпочтительном примере осуществления η1 равно 3. В представленной выше структуре каждый К24 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. В одном примере осуществления каждый К24 независимо представляет собой Н или С1-С6-алкил. В другом примере осуществления каждый К24 независимо представляет собой Н или С1-С3-алкил, более предпочтительно Н или СН3. В другом примере осуществления по крайней мере один К24 представляет собой метильную группу. В другом примере осуществления каждый К24 представляет собой Н. Каждый К24 выбирают для проектирования соединений с заданными стерическими эффектами и для изменения растворимости.
5-Членные гидразиновые линкеры могут претерпевать одну или несколько реакций циклизации, которые отделяют лекарство от линкера и могут быть описаны, например, схемой
Пример пути синтеза для получения 5-членного линкера по настоящему изобретению представляет собой
Для получения СЬ7-ВМВЛ-2,2-димтеилмалоновой кислоты с в растворе с тионилхлоридом осуществляют взаимодействие Ск-защищенного ΌΜΌΆ Ь с 2,2-диметилмалоновой кислотой а. Для получения Βοο-Ν-метилгидразина ВМПЛ-2,2-диметилмалоновой кислоты е в присутствии водорода осуществляют
- 27 016577 взаимодействие соединения с с Вос-К-метилгидразином ά.
6-Членные гидразиновые линкеры.
В другом примере осуществления гидразиновый линкер содержит 6-членный гидразиновый линкер, где Н содержит структуру
В предпочтительном примере осуществления п1 равно 3. В представленной выше структуре каждый К24 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. В одном примере осуществления каждый К24 независимо представляет собой Н или С1-С6-алкил. В другом примере осуществления каждый К24 независимо представляет собой Н или С1-С3-алкил, более предпочтительно Н или СН3. В другом примере осуществления по крайней мере один К24 представляет собой метильную группу. В другом примере осуществления каждый К24 представляет собой Н. Каждый К24 выбирают для проектирования соединений с заданными стерическими эффектами и для изменения растворимости. В предпочтительном примере осуществления Н содержит структуру
В одном примере осуществления Н содержит геминальное диметил-замещение. В одном примере осуществления представленной выше структуры каждый К24 независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил.
6-Членные гидразиновые линкеры могут претерпевать одну или несколько реакций циклизации, которые отделяют лекарство от линкера, и могут быть описаны схемой
Пример пути синтеза для получения 6-членного линкера по настоящему изобретению представляет собой
Для получения СЬ/-защищенного диметилаланингидразина Ь в растворе с дихлорметаном осуществляют взаимодействие СЬх-защищенного диметилаланина а с НОА1 и СР1. Путем обработки метанолом с гидразина Ь удаляют защитную группу с получением соединения с.
Другие гидразиновые линкеры.
Предполагается, что настоящее изобретение включает линкер, содержащий семь звеньев. Этот линкер, по всей видимости, не может циклизоваться так же быстро, как и 5- или 6-членные линкеры, но это может быть предпочтительно для получения некоторых конъюгатов лекарство-лиганд. По аналогии, гидразиновый линкер может содержать два 6-членных кольца, или гидразиновый линкер может содержать один 6-членный и один 5-членный продукт циклизации. Также рассматривается 5- и 7-членный линкер, а также 6- и 7-членный линкер.
Другая гидразиновая структура Н имеет формулу
- 28 016577 где ц равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
каждый К24 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. Эта гидразиновая структура, может также образовывать 5-, 6- или 7-членные кольца, а для образования нескольких колец могут быть добавлены дополнительные компоненты.
(3) Дисульфидные линкеры (1).
В еще одном примере осуществления линкер содержит ферментативно расщепляемую дисульфидную группу. В одном примере осуществления настоящее изобретение относится к цитотоксичному комплексу лекарство-лиганд, имеющему строение согласно формуле (3) (3) где значения I), Ь1, Ь4 и X4 определены выше или описаны далее в этом документе, 1. представляет собой дисульфидный линкер, содержащий группу, имеющую следующее строение:
где каждый К24 представляет собой радикал, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила;
каждый К представляет собой элемент конструкции, независимо выбранный из группы, состоящей из замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NО2, \К21К22, Ν^^^2, ОСО\К21К::, ОСОК21 и ОК21, где К21 и К22 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила и незамещенного гетероциклоалкила;
а представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3 или 4;
ά представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Ароматическое кольцо дисульфидного линкера может быть замещено одной или несколькими группами К. Группа К представляет собой заместитель ароматического кольца, который замещает атом водорода, иным способом присоединенный к одному из четырех незамещенных атомов углерода, которые являются частью структуры кольца. Группа К может представлять собой одиночный атом, такой как галоген, или может представлять собой многоатомную группу, такую как алкил, гетероалкил, амино, нитро, гидрокси, алкокси, галогеналкил и циано. Примеры заместителей К независимо включают без ограничения Г, С1, Вг, I, NО2, ОН, ОСН3, NΗСОСΗ3, Ν(ΟΗ3)2, ХНСОСГ3 и метил. Для Ка а представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3 или 4. В одном предпочтительном примере осуществления а равно 0.
В предпочтительном примере осуществления линкер содержит ферментативно расщепляемую дисульфидную группу следующей формулы:
Х‘
Ка
В этом примере осуществления значения Ь4, X4, р и К24 определены выше, ά равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В конкретном примере осуществления о равно 1 или 2.
- 29 016577
Более конкретный дисульфидный линкер представлен ниже формулой
О
Ка
Конкретный пример этого примера осуществления представляет собой
О
Предпочтительно б равно 1 или 2.
Другой дисульфидный линкер представлен ниже формулой
Конкретный пример этого примера осуществления представляет собой
Предпочтительно б равно 1 или 2.
В различных примерах осуществления дисульфиды находятся в орто-положении к амину. В другом конкретном примере осуществления а равно 0. В предпочтительных примерах осуществления К24 независимо выбирают из Н и СН3.
Примером пути синтеза для получения дисульфидного линкера по настоящему изобретению является следующий:
Для получения йодида 3-метилбензотиазолия Ь осуществляли взаимодействие раствора 3меркаптопропионовой кислоты а с алдритиолом-2. Для получения соединения б осуществляли взаимодействие йодида 3-метилбензотиазолия с с гидроксидом натрия. Для получения соединения е осуществляли дополнительное взаимодействие раствора соединения б и метанола с соединением Ь. Путем воздействия ацетилхлоридом и метанолом удаляли защитные группы с соединения е с получением соединения £.
- 30 016577
Конъюгат лекарство-лиганд по настоящему изобретению может необязательно содержать два или несколько линкеров. Эти линкеры могут быть одинаковыми или разными. Например, пептидильный линкер может использоваться для соединения лекарства и лиганда, а второй пептидильный линкер может присоединять к комплексу диагностическое средство. В качестве альтернативы, любой пептидильный, гидразиновый и дисульфидный линкер может соединять лекарство и лиганд, и любой пептидильный, гидразиновый и дисульфидный линкер может присоединять к комплексу диагностическое средство. Другие применения дополнительных линкеров включают присоединение к комплексу лекарство-лиганд аналитических средств, биомолекул, средств направленного действия и детектируемых меток.
Под объем настоящего изобретения также подпадают соединения по настоящему изобретению, которые представляют собой поли- или мультивалентные частицы, включая, например, такие частицы, как димеры, триммеры, тетрамеры и более высокие гомологи соединений по настоящему изобретению или их реакционноспособные аналоги. Поли- и мультивалентные частицы могут собираться из одного вида частиц или более чем из одного вида частиц по настоящему изобретению. Например, димерный конструкт может быть гомодимерным или гетеродимерным. Более того, под объем настоящего изобретения подпадают поли- или мультивалентные конструкты, в которых соединение по настоящему изобретению или его реакционноспособный аналог присоединены к олигомерному или полимерному каркасу (например, полилизину, декстрану, гидроксиэтилкрахмалу и т.п.). Каркас предпочтительно является полифункциональным (т.е. содержит матрицу реакционноспособных участков для присоединения соединений по настоящему изобретению). Более того, каркас может быть дериватизован одним видом частиц или более чем одним видом частиц по настоящему изобретению.
Более того, настоящее изобретение включает соединения, которые функционализированы для получения соединений, обладающих растворимостью в воде, улучшенной по сравнению с аналогичными соединениями, которые не были аналогично функционализированы. Таким образом, любой из описанных в этом документе заместителей может быть заменен аналогичными радикалами, которые улучшают растворимость в воде. Например, под объем настоящего изобретения подпадает, например, замена гидроксильной группы диолом или амина четвертичными амином, гидроксиамином или сходным более растворимым в воде фрагментом. В предпочтительном примере осуществления улучшение растворимости в воде достигается замещением в участке, не обязательном для проявления активности рассмотренных в этом документе соединений в отношении ионных каналов, фрагментом, который улучшает растворимость в воде исходных соединений. Способы улучшения растворимости в воде органических соединений известны в данной области техники. Такие способы включают без ограничения функционализацию органического ядра постоянно заряженным фрагментом, например четвертичным аммонием, или группой, которая является заряженной при физиологически значимых значениях рН, например карбоновой кислотой, амином. Другие способы включают присоединение к органическому ядру гидроксил- или аминосодержащих групп, например спиртов, полиолов, полиэфиров и т.п. Характерные примеры включают без ограничения полилизин, полиэтиленимин, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль. Подходящие описания химии и стратегии функционализации для данных соединений известны в данной области техники (например, см. Όπηη В.Ь., е! а1., Ебк. РОЬУМЕВ1С ΌΒυ08 ΑΝΏ ΌΒυΟ ЭЕЫУЕВУ 8У8ТЕМ8, ΑС8 8утрοκ^ит 8епек, νο1. 469, Лтепсаг1 Сйетка1 8οс^еΐу, VаκЫηдιοη, О.С. 1991).
Лекарства.
Лекарства, обозначенные в этом документе как Ό, представлены в настоящем изобретении как часть конъюгата лекарство-лиганд, где лекарство соединено с лигандом посредством пептидильного, гидразинового или дисульфидного линкера. Лекарство должно обладать желаемой биологической активностью и содержать реакционноспособную функциональную группу для связывания с лигандом. Желаемая биологическая активность включает диагностику, излечение, смягчение, лечение или профилактику заболевания у животного, такого как человек. Таким образом, при условии, что лекарство содержит необходимую реакционноспособную функциональную группу, термин лекарство относится к химическим веществам, которые признается лекарством в официальной Фармакопее США, официальной Гомеопатической Фармакопее США или официальном Национальном Формуляре, или в любом приложении к ним. Примеры лекарств представлены в Р11ук1с1аг1'к Эекк ВеГегег1се (РОВ) и в Оранжевой книге, поддерживаемой Управлением по контролю качества продовольствия и медикаментов (ΕΌΑ). Новые лекарства постоянно обнаруживаются и разрабатываются и настоящее изобретение предусматривает, что такие лекарства могут быть включены в композицию комплекса лекарство-лигад по настоящему изобретению.
Предпочтительные функциональные группы включают первичные и вторичные амины, гидроксилы, сульфгидрилы, карбоксилы, альдегиды и кетоны. Более предпочтительные функциональные группы включают гидроксилы, первичные и вторичные амины, сульфгидрилы и функциональные группы карбоновых кислот. Еще более предпочтительные функциональные группы включают гидроксилы, первичные и вторичные амины и функциональные группы карбоновых кислот. Лекарство должно содержать по крайней мере одну, но может содержать 2, 3, 4, 5, 6 или более реакционноспособных функциональных групп. Кроме того, между реакционноспособной функциональной группой лекарства и пептидным, гидразиновым или дисульфидным линкером может быть вставлен саморазрушающийся спейсер Ь1.
- 31 016577
Конъюгат лекарство-лиганд эффективен для обычных целей, для которых эффективны соответствующие лекарства, но более эффективен вследствие способности, заложенной в природе лиганда, транспортировать лекарство к желаемой клетке, где оно действует особенно выигрышно.
Примеры лекарств включают белки, протеины и низкомолекулярные лекарства, содержащие функциональную группу для связывания с лигандом. Более конкретно, эти лекарства включают, например, ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы дигидрофолатредуктазы и ингибиторы тимидилатсинтетазы, интеркаляторы ДНК, расщепители ДНК, ингибиторы топоизомеразы, антрациклиновое семейство лекарств, лекарства на основе алкалоидов барвинка, митомицины, блеомицины, цитотоксические нуклеозиды, птеридиновое семейство лекарств, диинены, подофиллотоксины, индукторы дифференцировки и таксолы.
Предпочтительные лекарства по настоящему изобретению включают цитотоксические лекарства, пригодные для терапии рака, и другие небольшие молекулы, протеины и полипептиды с желаемой биологической активностью, такие как токсин. Лекарство может подбираться таким образом, чтобы активироваться в раковых клетках при конъюгации со специфическим лигандом опухоли. Опухолеспецифичность указанных опухолеспецифических конъюгатов лекарство-лиганд определяется специфичностью лиганда. Примерами этого являются конъюгаты лекарство-лиганд, которые представляют собой высоко специфичными субстратами для опухолеспецифических ферментов, где указанные ферменты содержатся вблизи опухоли в количестве, достаточном для генерации цитотоксичных количеств свободного лекарства в непосредственной близости от опухоли. Одно преимущество указанных опухолеспецифических конъюгатов лекарство-лиганд заключается в том, что они стабильны в плане действия на них протеаз сыворотки крови. Другое преимущество комплексов лекарство-лиганд заключается в том, что они менее токсичны, чем соответствующее лекарство; кроме того, специфичность комплекса может позволить применение меньших суммарных концентраций по сравнению со свободным лекарством, поскольку повышенная специфичность приводит к более высокому процентному содержанию комплекса в участке опухоли.
Цитотоксины.
Цитотоксические лекарства, пригодные для целей настоящего изобретения, имеют строение согласно формуле лекарство, имеющее строение
где X представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΚ23;
Ζ представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΚ23;
К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил, или незамещенный С1-С6гетероалкил, или циано, или алкокси; и
К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил, или незамещенный С1-С6гетероалкил;
К23 представляет собой радикал, выбранный из Н и замещенного или незамещенного С1-С10-алкила; К3 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из (=0) и ОК11, где К11 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного или незамещенного СгС10-алкила, С(О)К12, С(О)ОК12, С(О)Ж12К13 и С(О)СНК12К13, в которых К12 и К13 представляют собой радикалы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила, замещенного или незамещенного С1-С10-гетероалкила, содержащего по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, где К12 и К13 необязательно образуют вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, содержащую от 4 до 6 атомов и необязательно содержащую два или несколько гетероатомов;
К4 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного С1-С10-алкила, незамещенного С1-С10-алкила, ΝΗ^5, Ν^0)^5, С(О)К15, ОК15 и О(СН2)^(СН3)2, где п равно целому числу от 1 до 20;
К15 выбирают из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила, и замещенного или незамещенного пептидила;
К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и при ее наличии
- 32 016577
К6 и К7 образуют вместе циклопропильное кольцо;
К7 представляет собой С112-Х' или -СН2-, объединенные в упомянутом циклопропильном кольце с К6, где X1 представляет собой галоген.
В одном примере осуществления настоящее изобретение относится к цитотоксичному комплексу лекарство-лиганд, содержащему структуру следующей формулы:
где символ Ь1 представляет собой саморазрушающийся слейсер, где т представляет собой целое число, равное 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Символ X4 представляет собой элемент конструкции, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, детектируемых меток и агентов направленного действия.
Символ Ь4 представляет собой звено линкера и р равно 0 или 1. Ь4 представляет собой фрагмент, который наделяет конъюгаты повышенной растворимостью и сниженной способностью к агрегации. Примеры фрагментов Ь4 включают замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, каждый из которых может быть неразветвленным, разветвленным или циклическим, положительно или отрицательно заряженным аминокислотным полимером, таким как полилизин или полиаргинин, или другими полимерами, такими как полиэтиленгликоль.
Символ Р представляет собой расщепляемый линкер, включая без ограничения любой их описанных в этом документе пептидильных, гидрозоновых и дисульфидных линкеров. Другие подходящие линкеры включают без ограничения линкеры, описанные в патенте США № 6214345; в заявках на выдачу патента США № 2003/0096743, 2003/0130189 и 2004/121940; в заявках на выдачу патента согласно РСТ № Ш') 03/026577 и Ш') 04/043493; и в заявках на выдачу Европейского патента № ЕР1243276 и ЕР 1370298, которые все включены в этот документ посредством ссылки. Расщепляемые линкеры включают линкеры, которые могут избирательно расщепляться в ходе химического или биологического процесса, и при расщеплении отделяют лекарство □ ' от X4. Расщепление может происходить в любом месте по всей длине линкера или на любом конце линкера.
Символ □ ' представляет собой лекарство следующей формулы:
где X представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΙ<23;
Ζ представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΙ<23;
К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил, или незамещенный С1-С6гетероалкил, или циано, или алкокси; и
К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил или незамещенный С1-С6гетероалкил;
К23 представляет собой радикал, выбранный из Н и замещенного или незамещенного С1-С10-алкила;
К3 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из (=О) и ОК11, где К11 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила, С(О)К12, С(О)ОК12, С^ЯК^К13 и С(О)СНК12К13, в которых
К12 и К13 представляют собой радикалы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила, замещенного или незамещенного С1-С10-гетероалкила, содержащего по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, где К12 и К13 необязательно образуют вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, содержащую от 4 до 6 атомов и необязательно содержащую два или несколько гетероатомов;
К4 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного С1-С10-алкила, незамещенного С1-С10-алкила, \Н1\ 5 NС(Ο)К15, С(О)К15, ОК15 и О(СН2)пМСН3)2, где п равно целому числу от 1 до 20;
К15 выбирают из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила и замещенного или незамещен
- 33 016577 ного пептидила;
К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и при ее наличии К6 и К7 образуют вместе циклопропильное кольцо; и
К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, объединенные в упомянутом циклопропильном кольце с К6, 1 где X1 представляет собой галоген.
Предпочтительные конъюгаты.
А. Конъюгаты с пептидным линкером.
В предпочтительном примере осуществления настоящее изобретение относится к содержащему пептидный линкер конъюгату, имеющему строение
или
где X1 представляет собой галоген;
X представляет собой элемент конструкции, выбранный из О, Б и \1К23;
К23 представляет собой радикал, выбранный из Н, замещенного или незамещенного алкила, заме щенного или незамещенного гетероалкила и ацила; и
К4, К4', К5 и К5' представляют собой радикалы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, Ш2, №15К16, Ж(О)К15, ОС(О)Ж15К16, ОС(О)ОК15, С(О)К15, ОК15 и О(СН2)пМСНэ)2, где η равно целому числу от 1 до 20;
К15 и К16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или не замещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного, где К15 и К16 необязательно объединены вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей 4-6 атомов и необязательно содержащей два или несколько гетероатомов.
Неограничивающие примеры таких конъюгатов включают следующие структуры:
- 34 016577
где X1 представляет собой С1 или Вг;
АЬ представляет собой антитело или его фрагмент.
В другом предпочтительном примере осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, имеющему строение:
- 35 016577
где X1 представляет собой уходящую группу;
Ζ и X представляют собой элементы конструкции, выбранные из О, 8 и \1К23, где К23 представляет собой радикал, выбранный из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила; и
К3 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NΟ2, NК15К16, NС(Ο)К15, О^О^К^К16, ОС(О)ОК15, С(О)К15, ОК15 и О^НДд^СНз^, где η равно целому числу от 1 до 20;
К15 и К16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного, где К15 и К16 необязательно объединены вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей 4-6 атомов и необязательно содержащей два или несколько гетероатомов.
Неограничивающие примеры таких конъюгатов включают следующие структуры:
- 36 016577
каждый Ь независимо представляет собой целое число от 0 до 20,
АЬ представляет собой антитело или его фрагмент.
В еще одних предпочтительных примерах осуществления настоящее изобретение относится к содержащему пептидный линкер конъюгату, выбранному из следующих структур:
- 37 016577
где X1 представляет собой С1 или Вг,
АЬ представляет собой антитело или его фрагмент.
В еще одних примерах осуществления настоящее изобретение относится к содержащему пептид-
- 38 016577
И
где X1 представляет собой С1 или Вг,
ЛЬ представляет собой антитело или его фрагмент.
В еще одних примерах осуществления настоящее изобретение относится к содержащему пептидный линкер конъюгату, имеющему следующую структуру:
где X1 представляет собой С1 или Вг,
АЬ представляет собой антитело или его фрагмент.
Другие соединения включают следующие, которые могут быть конъюгированы, например, с антителом и с его фрагментом
- 39 016577
- 40 016577
где г представляет собой целое число от 0 до 24.
В одном примере осуществления г равно 4.
В. Конъюгаты с гидразиновым линкером.
В предпочтительном примере осуществления настоящее изобретение относится к содержащему гидразиновый линкер конъюгату, имеющему следующую структуру:
В другом предпочтительном примере осуществления настоящее изобретение относится к содержащему гидразиновый линкер конъюгату, имеющему следующую структуру:
- 41 016577
В еще одних предпочтительных примерах осуществления настоящее изобретение относится к содержащему гидразиновый линкер конъюгату, имеющему структуру, выбранную из
где РЕС представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля,
X1 представляет собой С1 или Вг.
В еще одних предпочтительных примерах осуществления настоящее изобретение относится к содержащему гидразиновый линкер конъюгату, выбранному из следующих структур:
- 42 016577
и
где X1 представляет собой С1 или Вг,
ЛЬ представляет собой антитело или его фрагмент.
В еще одном предпочтительном примере осуществления существует содержащий гидразиновый линкер конъюгат, выбранный из следующих структур:
и
- 43 016577
С. Конъюгаты с дисульфидным линкером
В предпочтительном примере осуществления настоящее изобретение относится к содержащему дисульфидный линкер конъюгату, имеющему следующую структуру:
Ка
Неограничивающие примеры таких структур включают следующие:
- 44 016577 0 I
где X1 представляет собой С1 или Вг,
АЪ представляет собой антитело или его фрагмент.
Лиганды.
Лиганды по настоящему изобретению описываются как X4. В настоящем изобретении X представляет собой элемент конструкции, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноепоеобных функциональных групп, детектируемых меток и агентов направленного действия. Предпочтительными лигандами являются агенты направленного действия, такие как антитела и их фрагменты.
В предпочтительном примере осуществления группа X4 может быть описана как элемент конструкции, выб)ранный из К , СООК , С(О^К и (^ΝΝβ , где К представляет собой радикал, выбранный из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного гетероарила. В еще одном типичном примере осуществления К29 представляет собой радикал, выбранный из Н; ОН; ΝΗΝΗ2;
где К30 представляет собой замещенный или незамещенный алкил, оканчивающийся реакционноспособной функциональной группой, замещенный или незамещенный гетероарил, оканчивающийся функциональной группой. Предсгавленные выше структуры действуют в качестве реакционноспособных защитных групп, которые могут взаимодействовать, например, с боковой цепью аминокислоты агента направленного действия, такого как антитело, связывая тем самым агент направленного действия с фрагментом линкер-лекарство.
Агенты направленного действия.
Линкерные ножки и цитотоксины по настоящему изобретению могут быть присоединены к агентам направленного действия, которые избирательно доставляют полезную нагрузку к клетке, органу или участку тела. Типичные агенты направленного действия, такие как антитела (например, химерные, гуманизированные или человеческие), лиганды для рецепторов, лектины, сахариды, антитела и т.п. известны в данной области техники и без ограничения применимы при практическом использовании настоящего изобретения. Другие агенты направленного действия включают класс соединений, которые не содержат специфических фрагментов молекулярного распознавания, включают макромолекулы, такие как полиэтиленгликоль, полисахарид, полиаминокислоты и т.п., которые добавляют цитотоксину молекулярную массу. Дополнительная молекулярная масса изменяет фармакокинетику цитотоксина, например время полужизни в плазме крови.
В типичном примере осуществления настоящее изобретение относится к цитотоксину, линкеру или конъюгату цитотоксин-линкер с агентом направленного действия, который представляет собой биомолекулу, например антитело, рецептор, пептид, лектин, сахарид, нуклеиновую кислоту или их сочетание. Пути получения типичных конъюгатов по настоящему изобретению представлены в приведенных выше схемах.
- 45 016577
Биомолекулы, пригодные для практического применения настоящего изобретения, могут быть получены любым путем. Биомолекулы могут быть выделены из природных источников или могут быть получены синтетическими методами. Белки могут являться природными белками или мутантными белками. Мутации могут быть произведены путем химического мутагенеза, сайт-специфического мутагенеза или другими способами индукции мутаций, известных специалистам в данной области техники. Белки, пригодные для практического применения настоящего изобретения, включают, например, ферменты, антигены, антитела и рецепторы. Антитела могут быть либо поликлональными, либо моноклональными, но наиболее предпочтительно моноклональными. Пептиды и нуклеиновые кислоты могут быть выделены из природных источников или могут быть полностью или частично синтетическими по своей природе.
В предпочтительном примере осуществления агент направленного действия представляет собой антитело или фрагмент антитела, которое выбирают на основании его специфичности к антигену, экспрессируемому на представляющей интерес клетке-мишени или участке-мишени. Был определен широкий ряд опухолеспецифических и специфических в отношении других заболеваний антигенов, и антитела к этим антигенам использовались или рассматривались для применения при лечении указанных опухолей или других заболеваний. Известные в данной области техники антитела могут быть использованы в конъюгатах по настоящему изобретению, в частности для лечения заболевания, с которым ассоциирован антиген-мишень. Неограничивающие примеры антигенов-мишеней (и ассоциированных с ними заболеваний), на которые может быть направлен конъюгат антитело-линкер-лекарство по настоящему изобретению, включает: Нег2 (рак молочной железы), СЭ20 (лимфомы), ЕСЕК, (солидные опухоли), СО22 (лимфомы, включая неходжкинскую лимфому), СО52 (хронический лимфолейкоз), СО33 (острый миелобластный лейкоз), СЭ4 (лимфомы, аутоиммунные заболевания, включая ревматоидный артрит), СЭ30 (лимфомы, включая неходжкинскую лимфому), Мис18 (меланома), интегрины (солидные опухоли), Р8МА (рак предстательной железы, доброкачественная гиперплазия предстательной железы), СЕА (рак ободочной и прямой кишки), СЭ11а (псориаз), СИ80 (псориаз), СИ23 (бронхиальная астма), СО40Ь (иммунная тромбоцитопеническая пурпура), СТЬА4 (Т-клеточные лимфомы) и ВЬук (аутоиммунные заболевания, включая системную красную волчанку).
В тех примерах осуществления, когда фрагмент распознавания представляет собой белок или антитело, белок может быть прикреплен к поверхности компонента самоорганизованного монослоя (8АМ) или соединен через спейсерную ножку любой реакционноспособной пептидной группой, доступной на поверхности белка. В предпочтительных примерах осуществления реакционноспособные группы представляют собой амины или карбоксилаты. В особенно предпочтительных примерах осуществления реакционноспособные группы представляют собой ε-аминогруппы лизиновых остатков. Кроме того, указанные молекулы могут быть адсорбированы на поверхности субстрата или 8АМ в результате неспецифических взаимодействий (например, химическая адсорбция, физическая адсорбция).
Фрагменты распознавания, которые представляют собой антитела, могут использоваться для распознавания анализируемых веществ, которые представляют собой белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, сахариды и малые молекулы, такие как лекарства, гербициды, пестициды, промышленные химикаты и боевые химические агенты. Способы индукции образования антител к специфически молекулам хорошо известны специалистам в данной области техники (см. патенты США № 5/147786, выданный Еепд е! а1. 15 сентября 1992 г.; № 5/334528, выданный 81апкет е! а1. 2 августа 1994 г.; № 5/686237, выданный А1ВауаИ, М.А.8. 11 ноября 1997 г.; и № 5/573922, выданный Ноекк е! а1. 12 ноября 1996 г.). Способы присоединения антител к поверхностям также являются хорошо известными (см. Ое1ашагс11е е! а1. Ьапдтшг 12:1944-1946 (1996)).
Агенты направленного действия могут быть присоединены к линкерам по настоящему изобретению через любую доступную реакционноспособную группу. Например, пептиды могут быть присоединены через амино, карбоксильную, сульфгидрильную или гидроксильную группу. Такая группа может располагаться на конце пептида или на участке, внутреннем по отношению к пептидной цепи. Нуклеиновые кислоты могут быть присоединены через реакционноспособную группу на основании (например, экзоциклический амин) или на доступной гидроксильной группе сахарного остатка (например, 3'- или 5'гидроксил). Пептидные цепи или цепи нуклеиновых кислот могут быть дополнительно дериватизованы в одном или в нескольких участках для обеспечения возможности присоединения к цепи подходящих реакционноспособных групп (см. Сйпкеу е! а1. Ыис1е1с Ас1бк Кек. 24:3031-3039 (1996)).
Если пептид или нуклеиновая кислота представляет собой полностью или частично синтетическую молекулу, то в процессе синтеза может быть включена в композицию реакционноспособная группа или защищенная реакционноспособная группа. Специалистам в данной области техники известны многие дериватизованные мономеры, подходящие для введения реакционноспособной группы и пептидам, и нуклеиновым кислотам (например, см. ТНЕ РЕРТШЕ8: АЫАЕ¥§1§, 8ΥΝΤΗΕ8Ι8, ВЮЬОСУ, νο1. 2: 8рес1а1 Ме!йобк ίη Рерйбе 8уп!йек1к, Сгокк, Е. апб Ме1епйо£ет, 1., Ебк., Асабетю Ргекк, Ыете ΥοιΊ< (1980)). Многие пригодные мономеры являются коммерчески доступными (Васйет, 81дта, е!с.). После синтеза с такой защищенной группы может быть снята защита, после чего она становится доступной для взаимодействия с компонентом соединения по настоящему изобретению.
Типичные агенты направленного действия в отношении нуклеиновых кислот включают аптамеры,
- 46 016577 антисмысловые соединения и нуклеиновые кислоты, которые образуют тройные спирали. Обычно для связывания агента направленного действия на основе нуклеотида к цитотоксину в качестве необходимой функциональной группы используют гидроксильную группу сахарного остатка, аминогруппу остатка основания или остаток фосфата основания. Однако специалисту в данной области техники следует понимать, что другие неприродные реакционноспособные группы могут быть присоединены к нуклеиновой кислоте с использованием традиционных методик. Например, гидроксильная группа сахарного остатка может быть преобразована в меркаптогруппу или аминогруппу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники.
Аптамеры (или антитела к нуклеиновым кислотам) представляют собой одноцепочечные или двухцепочечные молекулы ДНК или одноцепочечные молекулы РНК, которые связываются со специфическими молекулярными мишенями. Как правило, аптамеры действуют путем ингибирования работы молекулярной мишени, например белков, путем связывания с пулом мишеней, циркулирующих в крови. Аптамеры содержат химические реакционноспособные группы, а потому могут ковалентно связываться с описанными в этом документе цитотоксинами. Хотя широкий ряд молекулярных мишеней способен образовывать нековалентные но специфические взаимодействия с аптамерами, включая низкомолекулярные лекарства, метаболиты, кофакторы, токсины, лекарства на основе сахаридов, лекарства на основе нуклеотидов, гликопротеины и т.п., молекулярная мишень, как правило, содержит белок или пептид, включая сывороточные белки, кинины, эйкозаноиды, молекулы клеточной поверхности и т.п. Примеры аптамеров включают ингибитор антитромбина С8 522 производства Сбеаб и его производные (СПеаб 8с1еисе, Ро§!ег Сйу, Са11Р.; см. также Масауа е! а1. Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8сг И8А 90:3745-9 (1993); Воск е! а1. №1иге (Ьоибои) 355:564-566 (1992) и Уину е! а1. ВюсЬет. 32:1899-904 (1993)).
Аптамеры, специфичные к данной биомолекуле, могут быть идентифицированы при помощи методик, известных в данной области техники (например, см. Тоо1е е! а1. (1992), публикация согласно РСТ № УО 92/14843; Тиегк аиб Оо1б (1991), публикация согласно РСТ № УО 91/19813; УетйаиЬ аиб Ни!сЫикои (1992), публикация согласно РСТ № 92/05285; и ЕШидЮи аиб 8хо51ак. №11иге 346:818 (1990)). Вкратце, в указанных методиках обычно используется получение комплексов молекулярной мишени со случайной смесью олигонуклеотидов. Комплекс аптамер-молекулярная мишень отделяют от не участвующих в комплексах олигонуклеотидов. Аптамер восстанавливают из выделенного комплекса и амплифицируют. Этот цикл повторяют для идентификации последовательностей аптамера, которые обладают наивысшим сродством к молекулярной мишени.
Для заболеваний, являющихся результатом ненормальной экспрессии генов, специфическое предупреждение или снижение экспрессии таких генов представляет собой идеальную терапию. В принципе, образование продукта конкретного гена может ингибироваться, снижаться и подавляться путем гибридизации одноцепочечного дезоксинуклеотида или рибодезоксинуклеотида, комплиментарного доступной последовательности в мРНК или последовательности внутри траскрипта, которая необходима для процессинга пре-мРНК, или последовательности внутри самого гена. Эта система воззрений на генетический контроль часто называют антисмысловым или антигенным ингибированием.
Дополнительная эффективность обеспечивается путем конъюгации нуклеиновой кислоты с алкилирующим агентом, таким как по настоящему изобретению.
Антисмысловые соединения представляют собой нуклеиновые кислоты, которые предназначены для связывания или предупреждения продукции мРНК, ответственной за производство определенного белка. Антисмысловые соединения включают одноцепочечные или двухцепочечные антисмысловые РНК и ДНК, олигонуклеотиды или их аналоги, которые могут специфически гибридизоваться с отдельными фрагментами мРНК и предупреждать транскрипцию и/или РНК-процессинг фрагментов мРНК и/или трансляцию кодируемого полипептида и тем самым снижать содержание соответствующего кодируемого белка (СЫид е! а1. Ргос. №!1. Асаб. 8сЬ И.8.А. 86:10006-10010 (1989); Вгос1ег е! а1. Аии. 1и!. Меб. 113:604-618 (1990); Ьогеаи е! а1. РЕВ8 Ьейегк 274:53-56 (1990); Но1сеиЬег§ е! а1., УО 91/11535; УО 91/09865; УО 91/04753; УО 90/13641; УО 91/13080, УО 91/06629 и ЕР 386563). Вследствие своей чрезвычайной чувствительности и избирательности в отношении мишени антисмысловые олигонуклеотиды применимы для доставки терапевтических средств, таких как цитотоксины по настоящему изобретению, к желаемой молекулярной мишени.
Другими авторами сообщалось, что нуклеиновые кислоты могут связываться с двухцепочечной ДНК путем образования тройной спирали и ингибировать транскрипцию и/или синтез ДНК. Трехцепочечные соединения (также называемые трехцепочечными лекарствами) представляют собой олигонуклеотиды, которые связываются с последовательностями двухцепочечной ДНК и, как это понимается, избирательно ингибируют транскрипцию вызывающих заболевание генов, таких как вирусные гены, например ВИЧ и вируса простого герпеса, и онкогенов, т.е. они останавливают продукцию белка в клеточном ядре. Указанные лекарства связываются непосредственно с двухцепочечной ДНК в клеточном геноме с образованием тройной спирали и предупреждают производство клеткой белка-мишени (например, см. публикации согласно РСТ № УО 92/10590, УО 92/09705, УО 91/06626 и патент США № 5176996). Таким образом, цитотоксины по настоящему изобретению также конъюгируют с последовательностями нуклеиновых кислот, которые образуют тройные спирали.
- 47 016577
Сайт-специфичность нуклеиновых кислот (например, антисмысловых соединений и трехцепочечных лекарств) существенно не нарушаются путем модификации фосфодиэфирной связи или путем химической модификации олигонуклеотидного конца. Следовательно, такие нуклеиновые кислоты могут быть химически модифицированы, улучшая общую стабильность связывания, увеличивая устойчивость к химическому разрушению, увеличивая скорость, с которой олигонуклеотиды транспортируются в клетку, и делая молекулы реакционноспособными. Общий обзор подходов к конструированию различных нуклеиновых кислот, применимых при антисмысловой терапии, был дан бег Кго1 е! а1., Вю1ес11пк.|иек 6:958-976 (1988) и 8!ет е! а1. Сапсег Кек. 48:2659-2668 (1988). Поэтому в типичном примере осуществления цитотоксины по настоящему изобретению конъюгированы с нуклеиновыми кислотами путем модификации фосфодиэфирной связи.
Более того, аптамеры, антисмысловые соединения и трецепочечные лекарства, несущие цитотоксины по настоящему изобретению, могут также включать нуклеотидные замещения, добавления, делеции или транспозиции, поскольку специфическая гибридизация с соответствующей последовательностьюмишенью, или ассоциация с ней, представляет собой закрепленной функциональной особенностью олигонуклеотида. Например, в некоторых примерах осуществления могут использоваться аналоги фосфортиоата, которые более устойчивы к разрушению нуклеазами, чем их встречающиеся в природе фосфатдиэфирные аналоги, а потому, как предполагается, обладают более высокой персистенцией ίη νίνο и большей мощностью (например, см. СатрЬе11 е! а1., 1. Вюсйет. Вюрйук. Ме!1обк 20:259-267(1990)). Также известно, что фосфорамидатные производные олигонуклеотидов связываются с комплиментарными полинуклеотидами и обладают дополнительной способностью размещать ковалентно связанные фрагменты лиганда и могут быть пригодны для способов по настоящему изобретению (например, см. ЕгоеЫег е! а1., Кис1ею Аабз Кек. 16(11):4831 (1988)).
В некоторых примерах осуществления аптамеры, антисмысловые соединения и трехцепочечные лекарства могут содержать О-метилрибонуклеотиды (публикация европейского патента № 360609). Также могут использоваться химерные олигонуклеотиды (Юад1е е! а1., Кис1ею Ас1бк Кек. 18:4751 (1990)). Для целей некоторых применений антисмысловые олигонуклеотиды и трехцепочечные лекарства могут содержать полиамидные нуклеиновые кислоты (№е1кеп е! а1., 8с1епсе 254:1497 (1991) и публикация согласно РСТ № \УО 90/15065) и другие катионные производные (Ье!ктдег е! а1., 1. Ат. Сйегп. 8ос. 110:44704471 (1988)). В других применениях могут использоваться нуклеотиды, в которых одна или несколько из фосфодиэфирных связей замещена изостерической группой, такой как 2-4-атомная внутринуклеозидная связь, такая как описана в публикациях согласно РСТ № \УО 92/05186 и 91/06556, или формацетальная группа (Майеисс1 е! а1., 1. Ат. С1ет. 8ос. 113:7767-7768 (1991)), или амидная группа (№е1кеп е! а1., 8аепсе 254:1497-1500 (1991)).
Кроме того, в настоящем изобретении могут использоваться аналоги нуклеотидов, например, в которых химически модифицированы сахар или основание. Аналогичные формы пуринов и пиримидинов, как правило, известны в данной области техники, многие из которых используются в качестве химиотерапевтических средств. Типичный, но не исчерпывающий, перечень включает 4-ацетилцитозин, 5(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, К6-изопентениладенин, 1метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, К6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, β-Ο-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-К6-изопентиладенин, сложный метиловый эфир урацил-5оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота (ν), вибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, сложный метиловый эфир К-урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота (ν), псевдоурацил, квеуозин, 2тиоцитозин и 2,6-диаминопурин. Кроме того, обычные основания заменяют галогенированными основаниями. Кроме того, основание может быть замещено незаряженной объемной группой по 2'-фуранозе. Примеры незаряженных объемных групп включают разветвленные алкилы, сахара и разветвленные сахара.
Модификация концов также представляет собой пригодную методику конъюгирования цитотоксинов с нуклеиновыми кислотами, модификации клеточной специфичности, фармакокинетики, ядерной проницаемости и абсолютной скорости поглощения клеткой олигонуклеотидных фармацевтических средств. Например, известна матрица заместителей по 5'- и 3'-концам для получения реакционноспособных групп, которая позволяет ковалентно связывать цитотоксины (например, см. ОЬЮООЕОХУКиСЬЕОТ1ЭЕ8: АКП8ЕК8Е ПКН1В1ТОК8 ОЕ СЕКЕ ЕХРКЕ881ОК. (1989) Сойеп, Еб., СКС Ргекк; РКО8РЕСТ8 ЕОК АКП8ЕК8Е КИСЬЕ1С АСЮ ТНЕКАРЕИТ1С8 ЕОК САКСЕК АКО АГО8, (1991), \\'1сккйот. Еб., \\'11е\-1.1кк; СЕКЕ КЕСиЬАТЮК: ВЮЬОСУ ОЕ АКП8ЕК8Е ККА АКО ОКА, (1992) Епсккоп апб Пап!, Ебк., Кагеп Ргекк; и АКТ18ЕК8Е ККА АКО ОКА, (1992), Миггау, Еб., ХУбеу-Елкк). Ссылки на общие методы, касающиеся антисмысловых соединений, см. АКТ18ЕК8Е ККА АКО ОКА, (1988), О.А. Ме1!оп, Еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог, К.У.
- 48 016577
Детектируемые метки.
Конкретная метка или детектируемая группа, используемая во взаимодействии с соединениями и способами по настоящему изобретению, как правило, не является критическим аспектом по настоящему изобретению, поскольку она значимо не влияет на активность или пригодность соединения по настоящему изобретению. Детектируемая группа может представлять собой любое вещество, которое обладает свойством, детектируемым физическим или химическим путем. Такие детектируемые метки были успешно разработаны в области иммунологических методов анализа и в общем почти любая метка, применимая в этих методах, может применяться для целей настоящего изобретения. Таким образом, метка представляет собой любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Метки, применимые для целей настоящего изобретения, включают магнитные гранулы (например, ΌΥΝΑΒΕΑΌ8™), флуоресцентные красители (например, флуоресцеина изотиоцианат, техасовый красный, ро3 125 35 14 32 дамин и т.п.), радиоактивные метки (например, Н, I, 8, С или Р), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, обычно используемые в ЕЬ18А) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото и гранулы из цветного стекла или пластика (например, полистироловые, полипропиленовые, латексные и т.д.).
Метка может быть прямо или опосредованно связана с соединением по настоящему изобретению в соответствии с хорошо известными в данной области техники способами. Как указано выше, может использоваться широкий ряд меток, выбор которых определяется требуемой чувствительностью, простотой конъюгирования с соединением, требованиями к обеспечению стабильности, доступностью аппаратуры и снабжением расходными материалами.
Если соединение по настоящему изобретению конъюгировано с детектируемой меткой, то метка предпочтительно представляет собой элемент конструкции, выбираемый из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, флуоресцентных веществ, предшественников флуоресцентных веществ, хромофоров, ферментов и их сочетаний. Способы конъюгирования различных групп с антителами хорошо известны в данной области техники. Например, детектируемой меткой, которую часто конъюгируют с антителом, является фермент, такой как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза и глюкозооксидаза.
Нерадиоактивные метки часто присоединяют опосредованно. В общем, молекулу лиганда (например, биотина) ковалентно связывают с компонентом конъюгата. Затем лиганд связывают с другими молекулами (например, со стрептовидином), которые либо являются детектируемыми по своей природе, либо ковалентно связаны с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флуоресцентное соединение или хемилюминесцентное соединение.
Компоненты конъюгатов по настоящему изобретению могут быть также конъюгированы непосредственно с генерирующими сигнал соединениями, например, путем конъюгирования с ферментом или флуорофором. Ферменты, представляющие интерес в качестве меток, главным образом могут представлять собой гидролазы, в частности фосфатазы, эстеразы и гликозидазы, или оксидазы, в частности пероксидазы. Флуоресцентные соединения включают флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон и т.д. Хемилюминесцентные соединения включают люциферин и 2,3дигидрофталазиндионы, например люминол. Для обзора различных способов мечения или генерирующих сигнал систем, возможных к использованию, см. патент США № 4391904.
Средства детекции меток хорошо известны специалистам в данной области техники. Так, например, если метка представляет собой радиоактивную метку, то средства детекции включают сцинтилляционный счетчик или фотографическую пленку, как в случае авторадиографии. Если метка представляет собой флуоресцентную метку, то она может детектироваться путем возбуждения флуорохрома светом с соответствующей длиной волны и детекции возникающей флуоресценции. Флуоресценция может детектироваться визуально при помощи фотографической пленки с использованием электронных детекторов, таких как приборы с зарядовой связью (ί,'ί'Όδ), или фотоумножителей, и т.п. По аналогии, ферментативные метки могут детектироваться путем снабжения фермента соответствующим субстратом и детекции полученного продукта реакции. И, наконец, простые колориметрические метки могут детектироваться просто путем наблюдения процесса образования цвета, ассоциированного с меткой. Так, в различных измерительных методах анализа конъюгированное золото обычно становится розовым, тогда как различные конъюгированные гранулы принимают цвет гранул.
Флуоресцентные метки являются предпочтительными по настоящему изобретению, поскольку они преимущественно требуют незначительных мер предосторожности при обращении с ними и пригодны для высокопроизводительных методик визуализации (оптический анализ, включая оцифровку изображения для анализа на интегрированной системе с использованием компьютера). Предпочтительные метки обычно характеризуются одной или нескольким из следующих характеристик: высокой чувствительностью, высокой стабильностью, низким фоновым сигналом, низкой чувствительностью к воздействию окружающей среды и высокой специфичностью мечения. Многие флуоресцентные красители являются доступными для приобретения у химических компаний 8ЮМА (8аш1 Бонк, МО), Мо1еси1аг РгоЬек
- 49 016577 (Еидепе, ОК), К&Э кук!етк (М1ппеаройк, ΜΝ), РНагтааа ЬКВ Вю!есйпо1оду (Р1кса!аиау, Ν1), ί.ΈΌΝТЕСН ЬаЬога!ог1ек, 1пс. (Ра1о А1!о, СА), СНет Сепек Согр., Л1бпс11 Сйет1са1 Сотрапу (Мйиаикее, ^1), С1еп Кекеагсй, 1пс., С1ВСО ВКЬ ЫГе Тескпо1од1ек, 1пс. (СаййегкЬигд, ΜΌ), Ника СНетка - ВюсНеиика Апа1уИка (Г1ика СНетк АС, ВисНк, 8\\йхег1апб) и Аррйеб В|окук1етк (Гок!ег Сйу, СА), а также из многих других коммерчески доступных источников, известных специалисту в данной области техники. Кроме того, специалисты в данной области техники должен понимать, как выбрать подходящий флуорофор для конкретного применения и, если он не является коммерчески легкодоступным, должен быть способен синтезировать необходимый флуорофор бе поуо или синтетически модифицировать коммерчески доступные флуоресцентные соединения для получения желаемой флуоресцентной метки. В дополнение к низкомолекулярным флуорофорам, для целей настоящего изобретения также применимы встречающиеся в природе флуоресцентные белки и сконструированные аналоги таких белков. Такие белки включают, например, зеленые флуоресцентные белки книдарий (\Уагб е! а1., РНо1осНет. Р1ю1оЬю1 35:803-808 (1982); Ьеу1пе е! а1., Сотр. ВюсНет. РНукюР 72В:77-85 (1982)), желтый флуоресцентный белок из культуры VIЬпо ПксНеп (Ва1б\\1п е! а1., ВюсйетЩгу 29:5509-15 (1990)), перидинин-хлорофилл из динофлагеллятов 8утЬюб1шит кр. (Мотк е! а1., Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду 24:673:77 (1994)), фикобилипротеины из морских цианобактерий, таких как 8упесйососсик, например фикоэритрин и фикоцианин (АУбЬапкк е! а1., 1. Вю1. СНет. 268:1226-35 (1993)), и т.п.
Как правило, перед образованием связи между цитотоксином и агентом направленного (или иного) действия и необязательной спейсерной группой по крайней мере одна из химических функциональных групп должна быть активирована. Специалисту в данной области техники следует понимать, что с использованием целого ряда стандартных методов и условий может быть активирован целый ряд функциональных групп, включая гидрокси, амино и карбоксигруппы. Например, гидроксильная группа цитотоксина или агента направленного действия может быть активирована посредством обработки фосгеном с образованием соответствующего хлороформиата или паранитрофенилхлорофомиатом с образованием соответствующего карбоната.
В типичном примере осуществления для целей настоящего изобретения используют агент направленного действия, который содержит карбоксильную функциональную группу. Карбоксильные группы могут быть активированы, например, путем преобразования в соответствующий ацилгалогенид или активный сложный эфир. Эта реакция может проводиться в целом ряде условий, проиллюстрированных в Магсй, см. выше, р. 388-89. В типичном примере осуществления ацилгалогенид получают путем осуществления взаимодействия карбоксилсодержащей группы с оксалилхлоридом. Активированный агент взаимодействует с цитотоксином или сочетанием цитотоксин-линкерная ножка с получением конъюгата по настоящему изобретению. Специалистам в данной области техники следует понимать, что карбоксилсодержащие агенты направленного действия представлены лишь с целью пояснения и что агенты, содержащие многие другие функциональные группы, могут быть конъюгированы с линкерами по настоящему изобретению.
Реакционноспособные функциональные группы.
Для ясности изложения в последующем изложении делается акцент на конъюгацию цитотоксина по настоящему изобретению с агентом направленного действия. Акцент делается на один типичный пример по настоящему изобретению, из которого специалист в данной области техники легко делает вывод об остальных примерах. Акцент на обсуждение отдельного примера осуществления не означает ограничения настоящего изобретения.
Типичные соединения по настоящему изобретению содержат реакционноспособную функциональную группу, которая, как правило, расположена на замещенном или незамещенном алкиле или гетероалкиле, делая возможным легкое присоединение к ним других частиц. Удобным расположением для реакционноспособной группы является концевое расположение в цепи. Реакционноспособные группы и классы реакций, пригодные для применения на практике настоящего изобретения, как правило, являются хорошо известными в области химии биоконъюгатов. Реакционноспособная функциональная группа может быть защищенной или незащищенной и характер защиты группы может быть изменен в соответствии со способами, известными в области органического синтеза. Выигрышными для целей настоящего изобретения классами реакций, возможными для реакционноспособных аналогов цитотоксинов, являются те, которые протекают в относительно мягких условиях. Такие классы реакции включают без ограничения нуклеофильные замещения (например, взаимодействия аминов и спиртов с ацилгалогенидами, сложными эфирами), электрофильные замещения (например, реакции енаминов) и присоединения по углерод-углеродным и углерод-гетероатомным кратным связям (например, реакция Михаэля, присоединение по Дильсу-Альдеру). Эти и другие применимые реакции обсуждаются, например, в Магсй, АЭ\А\СР1) ОКСАМС СНЕМ18ТКУ, 3гб Еб., .1оНп №11еу & 8опк, Хеи Уогк, 1985; Негтапкоп, ВЮСОКГиСАТЕ ТЕСН№риЕ8, Асабетк Ргекк, 8ап Пкдо, 1996; и Геепеу е! а1., ΜО^IГIСАТЮN ОГ РКОТЕГЫ8; Абуапсек ш Сйеткйу 8егкк, уо1. 198, Атегкап Сйетка1 8ос1е1у, ^акЫпд!оп, Э.С., 1982.
Типичные типы реакций включают взаимодействие карбоксильных групп и их различных производных, включая без ограничения сложные Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, сложные Νгидроксибензотриазоловые эфиры, галогенангидриды, ацилимидазолы, тиоэфиры, сложные паранитро
- 50 016577 фениловые эфиры, сложные алкильные, алкенильные, алкинильные и ароматические эфиры. Гидроксильные группы могут быть преобразованы в сложные эфиры, простые эфиры, альдегиды и т.д. Галогеналкильные группы преобразуют в новые группы путем осуществления взаимодействия, например, с амином, карбоксилат-анионом, тиол-анионом, карбанионом или алкоксид-ионом. Диенофильные (например, малеимидная) группы принимают участие в реакциях Дильса-Альдера. Альдегидные и кетоновые группы могут быть преобразованы в имины, гидразоны, семигидразоны или оксимы, путем таких механизмов, как присоединение по Гриньяру или присоединение алкиллития. Сульфонилгалогениды легко взаимодействуют с аминами с получением, например, сульфонамидов. Амино или сульфгидрильные группы являются, например, ацилированными, алкилированными или окисленными. Алканы могут быть преобразованы во множество новых частиц с использованием реакций циклоприсоединения, ацилирования, присоединения по Михаэлю, и т.д. Эпоксиды легко взаимодействуют с аминами и гидроксилсодержащими соединениями.
Специалист в данной области техники должен ясно понимать, что многие из указанных связей могут быть получены целым рядом путей и с использованием целого ряда условий (для получения сложных эфиров см., например, МагсЬ, выше, р. 1157; для получения тиоэфиров см. МагсЬ, выше, р. 362-363, 491, 720-722, 829, 941 и 1172; для получения карбонатов см. МагсЬ, выше, р. 346-347; для получения карбаматов см. МагсЬ, выше, р. 1156-57; для получения амидов см. МагсЬ, выше, р. 1152; для получения мочевин и тиомочевин см. МагсЬ, выше, р. 1174; для получения ацеталей и кеталей см. Сгеепе е1 а1., выше, р. 178210 и МагсЬ, выше, р. 1146; для получения ацилоксиалкильных производных см. РК0ПКИС8: Т0Р1САЬ АНО 0СиЬАК ОКИС ПЕЫУЕКУ, К. В. 81оап, еб., Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, 1992; для получения сложных эфиров фенолов см. МагсЬ, выше, р. 1160; для получения Ν-сульфонилимидатов см., Випбдаагб е1 а1., I. Меб. СЬет., 31:2066 (1988); для получения ангидридов см. МагсЬ, выше, р. 355-56, 636-37, 990-91 и 1154; для получения Ν-ациламидов см. МагсЬ, выше, р. 379; для получения оснований Манниха см. МагсЬ, выше, р. 800-02 и 828; для получения сложных гидроксиметилкетоновых эфиров см. Ре1гасек е1 а1. Аппа1з ΝΥ Асаб. 8ск, 507:353-54 (1987); для получения дисульфидов см. МагсЬ, выше, р. 1160 и для получения сложных эфиров фосфоновой кислоты и фосфоамидатов.
Реакционноспособные функциональные группы могут быть незащищенными и могут быть выбраны таким образом, что они не принимают участие в реакциях или препятствуют им. В качестве альтернативы реакционноспособная функциональная группа может быть защищена от участия в реакции путем введения защитной группы. Специалисты в данной области техники должны понимать, как вводить конкретную защитную функциональную группу во избежание препятствования протеканию реакций в выбранных условиях проведения реакций. Примеры подходящих защитных групп см. в Сгеепе е1 а1., РК0ТЕСТ1УЕ СК0ИР8 ΙΝ 0КСАМС 8ΥΝΊΉΕ8Ι8, .1о1ш №11еу & 8опз, Αν УоТ, 1991.
Агент направленного действия обычно ковалентно связан с цитотоксинов с использованием стандартных химических методик посредством их соответствующих химических функциональных групп. Линкер или агент необязательно связан с агентом посредством одной или нескольких спейсерных групп. Спейсерные группы могут быть одинаковыми или разными, если используются в сочетании.
Как правило, перед образованием связи между цитотоксином и реакционноспособной функциональной группой, и необязательно спейсерной группой, по крайней мере одна из химических функциональных групп должна быть активирована. Специалист в данной области техники должен понимать, что с использованием целого ряда стандартных методов и условий может быть активирован целый ряд химических функциональных групп, включая гидроксигруппы, аминогруппы и карбоксигруппы. В типичном примере осуществления соединение по настоящему изобретению содержит карбоксильную функциональную группу в качестве реакционноспособной функциональной группы. Карбоксильные группы могут быть активированы, как описано выше в этом документе.
Фармацевтические композиции и введение
В другом предпочтительном примере осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Описанные в этом документе соединения, включая фармацевтически приемлемые носители, такие как их соли добавления и гидраты, могут доставляться пациенту с использованием широкого ряда путей или способов введения. Подходящие пути введения включают без ограничения ингаляционное, чрескожное, пероральное, ректальное, чресслизистое, кишечное и парентеральное введение, включая внутримышечные, подкожные и внутривенные инъекции. Конъюгаты по настоящему изобретению, содержащие антитело или фрагмент антитела в качестве агента направленного действия, предпочтительно вводят парентерально, более предпочтительно внутривенно.
Используемые в этом документе термин введение призван охватывать все способы прямой и опосредованной доставки соединения в заданный участок его действия.
Описанные в этом документе соединения или их фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты могут вводиться отдельно, в сочетании с другими соединениями по настоящему изобретению и/или в смесях с другими терапевтическими средствами. Вне всякого сомнения, выбор терапевтических средств, которые могут вводиться совместно с соединениями по настоящему изобретению, зависят, отчасти, от
- 51 016577 подвергаемого лечению состояния.
Например, при введении пациентам, страдающим от вызванного микроорганизмом болезненного состояния, основанного на действии аутоиндуктора, соединения по настоящему изобретению могут вводиться в смесях, содержащих агенты, используемые для лечения боли, инфекции и других симптомов и побочных эффектов, обычно ассоциированных с заболеванием. Такие средства включают, например, анальгетики, антибиотики и т.д.
При введении больному, проходящему лечение рака, соединения могут вводиться в смесях, содержащих противоопухолевые средства и/или дополнительные усиливающие действие средства. Соединения могут также вводиться в смесях, содержащих средства для лечения побочных эффектов лучевой терапии, такие как противорвотные средства, радиопротекторы и т.д.
Дополнительные усиливающие действие средства, которые могут вводиться совместно с соединениями по настоящему изобретению, включают, например, трициклические антидепрессанты (например, имипрамин, дезипрамин, амитриптилин, кломипрамин, тримипрамин, доксепин, нортриптилин, протриптилин, амоксапин и мапротилин); нетрициклические антидепрессанты (например, сертралин, тразодон и циталопран); антагонисты Са+2 (например, верапамил, нифедипин, нитерндипин и карлверин); амфотерицин; аналоги трипаранола (например, тамоксифен); антиаритмические лекарства (например, хинидин); антигипертензивные лекарства (например, резерпин); разрушители тиолов (например, бутионин и сульфоксимин) и лейковорин кальция.
Активное соединение (соединения) по настоящему изобретению вводят как есть или в форме фармацевтической композиции, в которой активное соединение (соединения) находится в смеси с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или разбавителями. Фармацевтические композиции для использования в соответствии с настоящим изобретением обычно составляют традиционным путем с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, содержащих наполнители и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных соединении в препараты, которые могут использоваться в фармацевтике. Точная композиция зависит от выбранного пути введения. Для чресслизистого введения в композиции используют пенетранты для преодоления через барьер слизистой. Такие пенетранты в общем хорошо известны в данной области техники.
Для перорального введения соединения могут быть легко включены в композицию путем объединения активного соединения (соединений) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области техники. Такие носители делают возможным включение соединений по настоящему изобретению в композицию таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т. п., для перорального приема подвергаемым лечению больным. Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены путем добавления твердого наполнителя, необязательного доизмельчения полученной смеси и переработки смеси гранул после добавления, по желанию, подходящих вспомогательных веществ с получением таблеток или драже с покрытием. Подходящие наполнители включают собой, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, манит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовую камедь, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия и/или поливинилпирролидон (РУР). При желании могут быть добавлены разрыхлители, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар либо альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.
Драже с покрытием поставляются с подходящим покрытием. Для этой цели могут использоваться концентрированные растворы сахара, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, карбопол-гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, глазировочные растворы и подходящие органические растворители и смеси растворителей. В покрытия таблеток или драже могут добавляться красители или пигменты для идентификации или характеристики различных сочетаний доз активного соединения.
Фармацевтические препараты, которые могут использоваться перорально, включают желатиновые капсулы в блистерных упаковках, а также мягкие герметичные капсулы, сделанные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Желатиновые капсулы в блистерных упаковках могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, такими как крахмалы, и/или смазками, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все композиции для перорального введения должны быть в дозированных формах, подходящих для такого введения.
Для трансбуккального введения композиции могут принимать форму таблеток или пастилок, полученных стандартным путем.
Для ингаляционного введения соединения для использования по настоящему изобретению удобно вводят путем распыления аэрозольной струи из находящихся под давлением упаковок, или аэрозольного аппарата с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторме
- 52 016577 тана, дихлортетрафторэтана, углекислого газа или другого подходящего газа. В случае находящегося под давлением аэрозоля дозировка может быть отмерена путем установки клапана для раздачи отмеренного количества. Капсулы и резервуары, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть включены в композицию, содержащую порошковую смесь соединения и подходящего порошкового основания, такого как лактоза или крахмал.
Соединения могут быть включены в композицию для парентерального введения путем инъекции, например путем болюсной инъекции или непрерывного вливания. Инъекция представляет собой предпочтительный способ введения композиций по настоящему изобретению. Композиции для инъекций могут быть представлены в виде однократных дозированных форм, например, в ампулах, или в емкостях для многократного дозированного введения с добавлением консерванта. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных растворителях и могут содержать образующие композицию средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота, или ее соль, такая как альгинат натрия.
Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в растворимой в воде форме. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть получены в виде подходящих для инъекции суспензий на масляной основе. Подходящие липофильные растворители и носители включают жирные кислоты, такие как кунжутное масло или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, или триглицериды, или липосомы. Водные инъецируемые суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Суспензия может также необязательно содержать подходящие стабилизаторы и средства, увеличивающие растворимость соединений, для возможности получения высококонцентрированных растворов. Для инъекции агенты по настоящему изобретению могут быть включены в композицию водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферных растворов, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой раствор.
В качестве альтернативы, активный ингредиент может находиться в порошковой форме для восстановления перед применением в подходящем носителе, например, в стерильной апирогенной воде.
Соединения могут быть также включены в композицию ректальных композиций, таких суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие традиционно используемые основания для суппозиториев, такие как какао-масло или другие триглицериды.
В дополнение к композициям, описанным выше, соединения могут быть также включены в композицию препарата пролонгированного действия. Такие композиции пролонгированного действия могут вводиться путем имплантации или чрескожного введения (например, подкожно или внутримышечно), внутримышечной инъекции или трансдермального пластыря. Так, например, соединения могут быть включены в композицию с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в подходящем масле) или ионообменными смолами или в виде умеренно растворимых производных, например в виде умеренно растворимой соли.
Фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердые или гелевые носители или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают без ограничения карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.
Предпочтительная фармацевтическая композиция представляет собой композицию, составленную для инъекции, такой как внутривенная инъекция, и содержит приблизительно от 0,01% приблизительно до 100 мас.% конъюгата лекарство-лиганд, исходя из 100% массы всей фармацевтической композиции. Конъюгат лекарство-лиганд может представлять собой конъюгат антитело-цитотоксин, где антитело было выбрано направленного действия в отношении определенного рака.
Библиотеки
Под объем настоящего изобретения также подпадают библиотеки цитотоксинов, конъюгатов цитотоксин-линкер и агент-линкер цитотоксинов и линкеров по настоящему изобретению. Типичные библиотеки включают по крайней мере 10 соединений, более предпочтительно по крайней мере 100 соединений, еще более предпочтительно по крайней мере 1000 соединений и еще более предпочтительно по крайней мере 100000 соединений. Библиотеки находятся в форме, которая позволяет легко проводить поиск конкретного свойства, например цитотоксичности, расщепления линкера ферментом или другим расщепляющим реактивом. Типичные формы включает форматы чипов, микромассивы и т.п.
Параллельный (или комбинаторный) синтез ставит своей главной целью получение библиотеки различных молекул, которые все обладают общей чертой, называемой на всем протяжении этого описания каркасом. Путем замещения различных фрагментов на каждой из меняющихся частей молекулыкаркаса в библиотеке растет количество пространства, доступного для изучения. Теоретические знания и современная медицинская химия отстаивают концепцию занятого пространства как решающего фактора при определении эффективности данного соединения в отношении данной биологической мишени. Путем создания многообразной библиотеки молекул, которые зондируют большую часть целенаправленно исследуемого пространства, вероятность разработки высокоэффективного соединения-прототипа
- 53 016577 резко возрастает.
Параллельный синтез, как правило, проводят на твердофазной подложке, такой как полимерная смола. Каркас или другой подходящий промежуточный продукт связывают со смолой способным к расщеплению химическим линкером. Проводят реакции для модификации каркаса, в то же время связанного с частицей. Перемена реагентов и/или условий реакции дает структурное разнообразие, которое является отличительным признаком каждой библиотеки.
До 1990 года попытки параллельного синтеза малых молекул (не являющихся олигомерами, с молекулярной массой 200-1000) предпринимались редко (например, см. Сатрк, е! а1., Лппа1к бе Рштюа, 70:848 (1990)). Недавно Эллманном был раскрыт параллельный (также называемый комбинаторным) синтез на твердофазной подложке одиннадцати аналогов бензодиазепина наряду с несколькими простагландинами и миметики с Ье1а-вращением. Это раскрытие было представлено в патенте США № 5288514. Другое значимое изложение параллельного синтеза малых молекул может быть найдено в патенте США № 5324483. В этом патенте раскрыт параллельный синтез от 4 до 40 соединений на основе каждого из 16 различных каркасов. Сйеп е! а1. также применили стратегию органического синтеза для разработки непептидных библиотек, синтезированных с использованием многостадийных процессов на полимерной подложке (С1еп е! а1., I. Лт. С1еш. 8ос., 116:2661-2662 (1994)).
После получения библиотеки уникальных соединений с использованием библиотеки автоиндукторов в качестве исходных соединений и с использованием способов, описанных в этом документе, может быть получена библиотека иммуноконъюгатов или антител.
Наборы
В другом аспекте настоящее изобретение относится к наборам, включающим одно или несколько соединений или композиций по настоящему изобретению и инструкции по эксплуатации соединения или композиции. В типичном примере осуществления настоящее изобретение относится к набору для конъюгации линкерной ножки по настоящему изобретению с другой молекулой. Набор включает линкер и инструкции по присоединению линкера к конкретной функциональной группе. Набор может также включать одно или несколько цитотоксических лекарств, агент направленного действия, детектируемую метку, фармацевтически приемлемые соли и буферные растворы. Набор может также включать емкость и, необязательно, один или несколько флаконов, пробирок, колб, бутылей или шприцов. Другие форматы наборов очевидны специалистам в данной области техники и подпадают под объем настоящего изобретения.
Очистка
В другом типичном примере осуществления настоящее изобретение относится к способу выделения молекулярной мишени для конъюгата лиганд-цитотоксин по настоящему изобретению, которая связывается с лигандом X4. Способ предпочтительно включает приведение в контакт клеточного препарата, который содержит мишень, с иммобилизованным соединением с получением тем самым комплекса между рецептором и иммобилизованным соединением.
Цитотоксин по настоящему изобретению может быть иммобилизован на аффинной подложке при помощи известных в данной области техники средств. В качестве альтернативы, цитотоксин может быть иммобилизован с использованием одного или нескольких линкеров по настоящему изобретению. В еще одном типичном примере осуществления настоящее изобретение относится к матрице для аффинной очистки, которая содержит линкер по настоящему изобретению.
В способе по настоящему изобретению для выделения мишени обычно используют одну или несколько методик аффинной хроматографии. Аффинная хроматография позволяет эффективно выделять частицы, такие как биологические молекулы или биополимеры, путем использования их участков распознавания закрепленных на подложке определенных химических структур с высокой степенью избирательности. Литература изобилует статьями, монографиями и книгами по аффинной хроматографии, включая такие темы, как подложки для аффинной хроматографии, сшивающие вещества, лиганды и их получение и применение. Образцы этих ссылок включают Ок!тоуе, Ме!1обк Епхушо1. 182:357-71 (1990); Еегтеп!, Вюепд. 70:199-209 (1990). Ниапд е! а1., I. СЬтота!одг. 492:431-69 (1989); РипДса!юп оГ епхутек Ьу 11ерапп-8ер11агоке аГПпйу сЬгота!одгарЬу, I. СЬтота!одг., 184:335-45 (1980); Еагоос.|т Епхуше Епд., 4:441-2 (1978); МкЫкауа, С1ет. ТесЬпо1, 5(9):564-71 (1975); Сш1Гогб е! а1., в РВЛСТ. Н1СН РЕВЕОВМ. Б1О. СНВОМЛТОСВ., 81шркоп (еб.), 193-206 (1976); ЮкЫкауа, Ргос. 1п!. \Уогкк1юр Тес1по1. Рто!ет 8ер. 1тртоу. В1ооб Р1акта Егасбопабоп, ЗапбЬетд (еб.), 422-35 (1977); ЛГПпйу сЬтота!одгарку оГ еп/утек, ЛГйиДу СЬгота!одт., Ргос. 1п!. 8утр. 25-38, (1977) (РиЬ. 1978); ЛЕЕЮТТУ СНВОМЛТОСВЛРНΥ: Л РВЛСПСЛЬ ЛРРВОЛСН, Эеап е! а1. (еб.), 1ВЬ Ргекк ^^т^!еб, ОхГогб, ЕпДапб (1985). Специалисты в данной области техники обладают подробными инструкциями для разработки конкретных способов аффинной хроматографии с использованием материалов по настоящему изобретению.
В способе по настоящему изобретению в качестве подложек могут быть использованы среды для проведения аффинной хроматографии с различным химическим строением. Например, в качестве материала для подложки могут быть использованы агарозные гели и поперечно-сшитые агарозные гели, поскольку их гидрофильность делает их относительно независимыми от неспецифического связывания. Другие применимые подложки включают, например, гранулы из стекла с контролируемым размером пор
- 54 016577 (СРС), частицы целлюлозы, гранулы полиакриламидного геля и гранулы Сефадекса™, полученные из декстрана и эпихлоргидрина.
Способы применения конъюгата лекарство-лиганд
В дополнение к описанным выше композициям и конструктам настоящее изобретение также относится к целому ряду способов, которые могут применяться на практике с использованием соединений и конъюгатов по настоящему изобретению. Способы использования конъюгата лекарство-лиганд по настоящему изобретению включают лизис или ингибирование роста или репликации клетки опухоли или раковой клетки, лечение рака, лечение предракового состояния, лизис или ингибирование роста или репликации экспрессирующей аутоиммунные антитела клетки, лечение аутоиммунного заболевания, лечение инфекционного заболевания, профилактика размножения клетки опухоли или раковой клетки, профилактика рака, профилактика размножения экспрессирующей аутоиммунные антитела клетки, профилактика аутоиммунного заболевания и профилактика инфекционного заболевания. Указанные способы использования включают введение нуждающемуся в этом животному, такому как млекопитающее или человек, эффективного количества конъюгата лекарство-лиганд. Предпочтительные лиганды для многих из описанных в этом документе способов использования включают антитела и фрагменты антител, которые направлены на конкретные опухолевые клетки, раковые клетки или другую зону-мишень. Комплекс лекарство-лиганд по настоящему изобретению применим для лечения у животного рака, аутоиммунного заболевания и инфекционного заболевания. Предложены композиции и способы лечения опухолей путем введения больному фармацевтически приемлемой композиции с фармацевтически эффективным количеством композиции по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение особенно применимо для лечения рака или для ингибирования у животного размножения опухолевых клеток или раковых клеток. Рак или предраковое состояние включает без ограничения опухоль, метастаз или любое заболевание или состояние, которое характеризуется неконтролируемым ростом клеток, может лечиться или предупреждаться путем введения комплекса лекарстволиганд по настоящему изобретению. Комплекс доставляет лекарство в опухолевую клетку или раковую клетку. В одном примере осуществления лиганд специфично связывается или ассоциирует с антигеном, ассоциированным с опухолевой клеткой или раковой клеткой. Вследствие своей близости с лигандом лекарство может поглощаться опухолевой клеткой или раковой клеткой, например, посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза. Антиген может быть присоединен к опухолевой клетке или раковой клетке или может представлять собой белок внеклеточного матрикса, ассоциированный с опухолевой клеткой или раковой клеткой. Попав внутрь клетки, линкер гидролитически расщепляется ассоциированными с опухолевой клеткой или раковой клеткой протеазами, высвобождая тем самым лекарство.
Высвобожденное лекарство свободно диффундирует и осуществляет цитотоксичное действие. В альтернативном примере осуществления лекарство отщепляется от комплекса лекарство-лиганд вне опухолевой клетки или раковой клетки, а затем лекарство проникает в клетку.
Лиганд может связываться, например, с опухолевой клеткой или раковой клеткой, с антигеном опухолевой клетки или раковой клетки, который находится на поверхности опухолевой клетки или раковой клетки, или с антигеном опухолевой клетки или раковой клетки, который представляет собой белок внеклеточного матрикса, ассоциированный с опухолевой клеткой или раковой клеткой. Для конкретного типа опухолевой клетки или раковой клетки может быть специально сконструирован лиганд. Поэтому тип опухолей и рака, который может подергаться эффективному лечению, может изменяться путем выбора лиганда.
Характерные примеры предраковых состояний, на которые возможно направленное воздействие конъюгатом лекарство-лиганд, включают без ограничения метаплазию, гиперплазию, дисплазию, полипы ободочной и прямой кишки, старческий кератоз, актинический хейлит, вирусы папилломы человека, лейкоплакия, плоский лишай и чечевицеобразный дискоидный кератоз.
Характерные примеры рака или опухолей, на которые возможно направленное воздействие конъюгатом лекарство-лиганд, включают без ограничения рак легких, рак толстой кишки, рак предстательной железы, лимфому, меланому, рак молочной железы, рак яичников, рак яичек, рак ЦНС, почечный рак, рак почки, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак полости рта, назальный рак, рак матки и лейкозы. Специалисту в данной области техники совершенно очевидно, что конкретно используемый в конъюгате лиганд направленного действия может быть выбран таким образом, что он направляет лекарство к подвергаемой лечению лекарством опухолевой ткани (т. е. выбирают агент направленного действия, специфичный в отношении опухолеспецифического антигена). Примеры таких лигандов направленного действия хорошо известны в данной области техники, неограничивающие примеры которых включают антиНег2 для лечения рака молочной железы, анти-СЭ20 для лечения лимфомы, анти-Р8МА для лечения рака предстательной железы и анти-СЭ30 для лечения лимфом, включая неходжкинскую лимфому.
В одном примере осуществления настоящее изобретение относится к способу лизиса клеток. Способ включает введение в клетку некоторого количества соединения по настоящему изобретению, достаточного для лизиса упомянутой клетки. В типичном примере осуществления соединение вводят больному-носителю упомянутой клетки. В дополнительном примере осуществления введение служит для замедления или прекращения роста опухоли-носителя упомянутой клетки (например, клетка может пред
- 55 016577 ставлять собой опухолевую клетку). Для введения с целью замедления роста скорость роста клетки должна быть по крайней мере на 10% меньше скорости роста до введения. Предпочтительно скорость роста может замедляться по крайней мере на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или рост полностью прекращается.
Эффективные дозировки.
Фармацевтические композиции, пригодные для использования в целях настоящего изобретения, включают композиции, в которых активный ингредиент содержится в терапевтически эффективном количестве, т. е. в количестве, эффективном для достижения намеченной цели. Точное количество, эффективное при конкретном применении, зависит, среди прочего, от подвергаемого лечению состояния. Определение эффективного количества находится в рамках возможностей специалистов в данной области техники, особенно в свете представленного в этом документе подробного описания. Терапевтически эффективное количество для любого описанного в этом документе соединения может быть первоначально определено в исследованиях на клеточных культурах. Расчетными концентрациями в плазме будут концентрации активного соединения (соединений), которые способны ингибировать рост и деление клеток. В предпочтительных примерах осуществления активность клеток ингибируется по крайней мере на 25%. Расчетные концентрации в плазме активного соединения (соединений), которые способны индуцировать ингибирование клеточной активности, по крайней мере приблизительно на 50, 75% или даже 90% или более, являются предпочтительными по настоящему изобретению. Для оценки адекватности достигнутой концентрации лекарства в плазме крови у пациента может проводиться мониторинг выраженного в процентах ингибирования клеточной активности и для достижения желаемого процентного значения ингибирования дозировка может быть скорректирована в сторону увеличения или уменьшения.
Как хорошо известно в данной области техники, терапевтически эффективные количества для использования людьми также могут быть определены в моделях на животных. Например, для достижения циркулирующей концентрации, которая была обнаружена как эффективная на животных, может быть составлена дозировка для людей. Дозировка для людей может быть скорректирована путем проведения мониторинга ингибирования клеток и корректировки дозировки в сторону увеличения или уменьшения, как описано выше.
Терапевтически эффективная доза для соединений, которые известны как ингибиторы сходной фармакологической активности, может быть также определена из клинических данных. Вводимая доза может быть скорректирована на основании относительной биологической доступности и мощности вводимого соединения по сравнению с известным соединением.
Корректировка дозы для достижения максимальной эффективности у людей на основании описанных выше способов и других способов, хорошо известных в данной области техники, по плечу среднему специалисту в данной области техники. В случае местного введения системная циркулирующая концентрация введенного соединения не является особенно важной. В таких случаях соединение вводят таким образом, чтобы местная концентрация была эффективной для достижения намеченного результата.
Для использования при профилактике и/или лечении заболеваний, связанных с аномальной пролиферацией клеток, предпочтительной является циркулирующая концентрация введенного соединения приблизительно от 0,001 до 20 мкМ, причем предпочтительно от 0,01 до 5 мкМ.
Дозы для перорального приема пациентами описанных в этом документе соединений обычно варьируют приблизительно от 1 приблизительно до 10000 мг/сутки, более типично приблизительно от 10 приблизительно до 1000 мг/сутки и наиболее типично приблизительно от 50 приблизительно до 500 мг/сутки. Выраженные в пересчете на массу тела пациента обычные дозировки варьируют приблизительно от 0,01 приблизительно до 150 мг/кг/сутки, более типично приблизительно от 0,1 приблизительно до 15 мг/кг/сутки и наиболее типично приблизительно от 1 приблизительно до 10 мг/кг/сутки, например 5 или 3 мг/кг/сутки.
По крайней мере, в некоторых примерах осуществления принимаемые пациентом дозы, которые замедляют или подавляют рост опухоли, могут составлять 1 мкмоль/кг/сутки или менее. Например, принимаемые пациентом дозы могут составлять 0,9, 0,6, 0,5, 0,45, 0,3, 0,2, 0,15 или 0,1 мкмоль/кг/сутки или менее (относительно моль лекарства). Предпочтительно конъюгат антитело-лекарство замедляет рост опухоли при введении в однократной суточной дозе в течение по крайней мере 5 суток. По крайней мере, в некоторых примерах осуществления опухоль представляет собой свойственную человеку опухоль у 8СГО-мыши. В качестве примера 8СГО-мышь может представлять собой 8СШ-мышь линии СВ 17 (производства Та^шс, бетит^т ΝΥ). Для других способов введения размер и интервал и дозировки могут корректироваться индивидуально для получения в плазме крови содержания введенного соединения, эффективного в отношении определенного клинического показателя, подвергаемого лечению. Например, в одном примере осуществления соединение по настоящему изобретению может вводиться в сравнительно высоких концентрациях несколько раз в сутки. В качестве альтернативы, может быть более желательным введение соединения по настоящему изобретению в минимальных эффективных концентрациях и использование менее частого режима введения. Это позволит обеспечить схему лечения, которая соразмерна тяжести заболевания пациента.
С использованием представленных в этом документе материалов может быть спланирована эффек
- 56 016577 тивная терапевтическая схема лечения, которая не вызывает значимой токсичности, но все еще вполне эффективна для лечения клинических симптомов у конкретного пациента. Такое планирование должно предусматривать тщательный выбор активного соединения с учетом таких факторов, как мощность соединения, относительная биодоступность, масса тела пациента, наличие и тяжесть нежелательных побочных эффектов, предпочтительный способ введения и профиль токсичности выбранного агента. Соединения, композиции и способы по настоящему изобретению дополнительно проиллюстрированы последующими примерами. Указанные примеры представлены с целью иллюстрации, но не ограничения заявленного изобретения.
Примеры
Материалы и методы.
Если иное не оговорено особо, в приведенных ниже примерах температуры указаны в градусах Цельсия (°С); операции проводили при комнатной температуре или температуре окружающей среды (как правило, в диапазоне около 18-25°С; выпаривание растворителя проводили с использованием роторного испарителя в условиях пониженного давления (как правило, 4,5-30 мм рт.ст.) при температуре бани до 60°С; за ходом реакций, как правило, следили с использованием ТСХ, и значения времени реакции приведены лишь в иллюстративных целях; точки плавления не корректировались; продукты характеризовались удовлетворительными параметрами 1Н ЯМР и/или микроанализа; значения выхода приведены лишь в иллюстративных целях; использовали следующие стандартные сокращения: т.пл. - точка плавления; л - литр; мл - миллилитр; ммоль - миллимоль; г - грамм; мг - миллиграмм; мин - минута; ЖХ-МС - жидкостная хроматография-масс-спектрометрия; ч - часы.
1Н ЯМР спектры регистрировали на спектрометре Уапап Мегсигу 300 МГц и результаты соответствовали заданным структурам. Химические сдвиги выражали в миллионных долях (м.д.) в сторону слабого поля от тетраметилсилана. Масс-спектры с ионизацией электрораспылением регистрировали на массспектрометре Регкш Е1тег 8с1ех ΑΡΙ 365. Элементные анализы проводились в ЕоЬеПзоп М1сго1й ЕаЬога1опез, Маб18оп, N.1. Силикагель для флэш-хроматографии относился к классу Е Мегск (230-400 меш). Аналитическую ВЭЖХ в обращенной фазой проводили с использованием либо прибора НР 1100, либо прибора Уапап Рго81аг 210 с колонкой Рйепотепех Еипа 5 мкм С-18(2) 150 ммх4,6 мм или колонкой Уаг1ап МюгозогЬ-МУ 0,1 мкм С-18 150 ммх4,6 мм. Элюцию проводили со скоростью 1 мл/мин либо градиентом 0-50% буфера В в течение 15 мин, либо 10-100% буфера В в течение 10 мин с УФ-детекцией при 254 нм. Буфер А, 20 мМ формиат аммония+20% ацетонитрил или 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле; буфер В, 20 мМ формиат аммония+80% ацетонитрил или 0,1% водная трифторуксусная кислота. Препаративную ВЭЖХ с обращенной фазой проводили на приборе Уапап Рго81аг 215 с колонкой Аа1ег5 Эе11а Рак 15 мкм С-18 300 ммх7,8 мм.
Пример 1. Синтез содержащих пептидный линкер конъюгатов.
1.1 а. Методика синтеза.
- 57 016577
Схема 2
ΝΗΒοο
ΟΡΝΡ
ΕηιοοΗΝ
ΟΡΝΡ
ΡΝΡΟΟΟΟΙ
ТНР/СН2С12 РУ
Ν8200β ϋΜΕ
Схема 3
- 58 016577
Схема 4
13Ь: К, = ΟΗ2ΟΗ2Ν(ΟΗ3)2; X = С1 13с: ГЦ = СН2СН2Г1(СН3)2; X = Вг
1) ΡΝΡΟΟΟΟΙ, Εί3Ν,ΟΗ2Ο12
2) ΒοοΝ(ΟΗ3)ΟΗ2ΟΗ2ΝΗΟΗ3
14Ь: Κ-ι = СНгСНгМССНзЬ; К2 = Вос; X = С1 14с: К, = ΟΗ2ΟΗ2Ν(ΟΗ3)2; К2 = Вос; X = Вг
16а:К1 = Ме;К2=Н;Х = С1
15Ь: Κ-ι = ΟΗ2ΟΗ2Ν(ΟΗ3)2; К2 = Η; X = С1 15с: ГЦ = ΟΗ2ΟΗζΝ(ΟΗ3)2; К2 = Η; X = Вг
18Ь: ГЦ = СН2СН2Я(СН3)2; X = С1 18с: ГЦ = СН2СН2Ы(СН3)2; X = Вг
16Ь: К, = СН2СН2И(СН3)2; Н3 = Ртос; X - С1 16с: К, = ΟΗ2ΟΗ2Ν{ΟΗ3)2; Кэ = Ртос; X = Вг
17а: ГЦ = Ме; ГЦ = Η; X = С1
17Ь: ГЦ = ΟΗ2ΟΗ2Ν(ΟΗ3)2; ГЦ = Η; X = С1
17с: К, = СН2СН2ЩСН3)2; К3 =
- 59 016577
Схема 5
24Ь: Κι = СНгСНгЩСНзк; Кб = Вос
1) ТРА/СН2С1г
2) №2СО3
25а: Κι = Ме; К5 = Н
25Ь: Я| = ΟΗ2ΟΗ2Ν(ΟΗ3)2; Кб = Н
26а: Κι = Ме
26Ь: К·] = СНгСНгЖСНзЬ
- 60 016577
Схема 6
1) ΡΝΡΟΟΟΟΙ, Ε13Ν, СН2С12
2) ΒοοΝ(ΟΗ3)ΟΗ2ΟΗ2ΝΗΟΗ3
1.1Ь. Синтез соединения 1. Сложный трет-бутиловый эфир N-[2'-(N'-трет-бутоксикарбониламино)этил]валина.
К раствору 2-(N-трет-бутоксикарбониламино)этилбромида (1 г, 4,5 ммоль) и трет-бутилового эфира валина (0,936 г, 4,5 ммоль) в ЭМР (10 мл) добавляли карбонат калия (1,85 г, 13,5 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при 100°С в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием этилацетата/гексанов (3/7) в качестве элюента с получением указанного в заголовке соединения в виде масла (0,16 г, 12%).
'Н ЯМР (СОС13) δ 0,94 (й, 6Н), 1,44 (с, 9Н), 1,473, 1,475 (2с, 9Н), 1,88 (м, 1Н), 2,51 (м, 1Н), 2,78 (м, 2Н), 3,11 (м, 1Н), 3,22 (м, 1Н), 3,39, 4,13 (2Ь!, 1Н), 5,00 (ушир.с, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 205 (М+Н+-112), 261 (М+Н+-Ви), 317 (М+Н+).
1.1с. Синтез соединения 2. N-(2-аминоэтил)валин.
Соединение 1 (137 мг, 0,43 ммоль) растворяли в растворе ТРА/дихлорметане (2 мл, 1/1) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь концентрировали досуха с получением указанного в заголовке соединения в виде масла (0,18 г, 95%).
'Н ЯМР (СО3ОО) δ 1,07, 1,16 (2д, 6Н), 2,35 (м, 1Н), 3,2 (м, 1Н), 3,38 (м, 4Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 217 (М+Н+).
1.М. Синтез соединения 3.
К раствору сложного малеимид-άРΕΟ4-NН8 эфира (61 мг, 0,16 ммоль) в дихлорметане (2 мл) по каплям добавляли соединение 2 (80,7 мг, 0,16 ммоль) и диизопропилэтиламин (55,5 мкл, 0,32 ммоль) в дихлорметане (1 мл). Полученную таким образом смесь перемешивали в течение ночи. Растворитель удаляли на роторном испарителе и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента дихлорметана, затем 5% метанола в дихлорметане, а затем 100% метанола с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (87 мг, 97%).
- 61 016577 1Н ЯМР (СПС13) δ 1,08 (дд, 6Н), 2,25 (м, 1Н), 2,49 (т, 2Н), 2,52 (т, 2Н), 3,10-3,79 (м, 25Н), 6,82 (с, 2Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 559 (М+Н+).
1.1е. Синтез соединения 4. Ртос-СИ-РЛВОН.
К раствору Ртос-СИ-ОН (1,0 г, 2,52 ммоль) и 4-аминобензилового спирта (341 мг, 2,77 ммоль) в дихлорметане (10 мл) и метаноле (5 мл) одной порцией добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2дигидрохинолин |ЕЕЭО| (1,24 г, 5,04 ммоль). Смесь перемешивали в темноте в течение 16 ч. Растворители удаляли на роторном испарителе и растирали белое твердое вещество с эфиром (100 мл). Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин, а затем отстаивали в течение 30 мин. Белое твердое вещество собирали путем фильтрации, промывали эфиром и сушили в вакууме (1,23 г, 97%).
1Н ЯМР (ДМСО) δ 1,32-1,52 (м, 2Н), 1,52-1,74 (дм, 2Н), 2,86-3,06 (дм, 2Н), 4,1 (М, 1Н), 4,42 (д, 2Н), 5,07 (т, 1Н), 5,40 (ушир.с, 2Н), 5,97 (т, 1Н), 7,19-7,95 (м, 12Н), 8,10 (д, 1Н), 9,97 (с, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 503,1 (М+Н+).
1.1Е. Синтез соединения 5. Етос-СЦ-РАВС-ΡΝΡ.
К раствору соединения 4 (309 мг, 0,62 ммоль) и паранитрофенилхлороформиата (372 мг, 1,85 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл) и 1-метил-2-пирролидине (1 мл) одной порцией добавляли пиридин (100 мкл, 1,23 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворители удаляли на роторном испарителе и очищали остаток по методу флэшхроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента дихлорметана, затем 3% метанола в дихлорметане, а затем 10% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества. (97,9 мг, 70%).
ЖХ-МС (ИЭР) 668 (М+Н+).
1.1д. Синтез соединения 6. Етос-Ьу8(Вос)-РАВОН.
Соединение 6 получали, как описано ранее для соединения 4, с выходом 98%.
Ί1 ЯМР (ДМСО) δ 1,40 (с, 9Н), 1,38 (м, 2Н), 1,50-1,74 (дм, 2Н), 3,04 (т, 2Н), 3,30 (кв, 3Н), 4,19-4,31 (м, 2Н), 4,41 (д, 2Н), 4,55 (с, 2Н), 7,28-7,68 (м, 12Н), 8,00 (д, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 574 (М+Н+).
1.16. Синтез соединения 7. Етос-^У5(Вос)-РАВС-Р\Р.
Соединение 7 получали, как описано ранее для соединения 5, с выходом 70%.
Ί1 ЯМР (СО3С1) δ 1,44 (с, 9Н), 1,49-1,60 (м, 6Н), 1,73 (м, 1Н), 2,00 (м, 1Н), 3,11 (м, 1Н), 3,20 (ушир.с, 1Н), 4,23 (м, 2Н), 4,46 (ушир.с, 2Н), 4,67 (ушир.с, 1Н), 5,56 (ушир.с, 1Н), 7,28 (м, 2Н), 7,36-7,41 (м, 6Н), 7,59 (м, 4Н), 7,76 (д, 2Н), 8,26 (дд, 2Н), 8,45 (ушир.с, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 639 (М+Н+-Вос), 684 (М+Н+-Ви), 739 (М+Н+), 778 (М+К+).
1.11. Синтез соединения 8.
Вос-Уа1-С11-ОН.
К раствору цитруллина (2,54 г, 14,50 ммоль) и бикарбоната натрия (1,28 г) в воде (40 мл) добавляли Вос-Уа1-О8и (4,34 г, 13,81 ммоль), растворенный в диметоксиэтане (ΌΜΕ). Для улучшения растворимости смеси добавляли тетрагидрофуран (10 мл). Полученную таким образом смесь оставляли перемешиваться в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли водную лимонную кислоту (15%, 75 мл) и смесь экстрагировали 10% 2-пропанолом/этилацетатом (2x100 мл). Органический слой промывали солевым раствором (2x150 мл) и удаляли растворители на роторном испарителе. Полученное белое твердое вещество сушили в вакууме в течение 5 ч, а затем обрабатывали эфиром (100 мл). После непродолжительной обработки ультразвуком и растирания продукт в виде белого твердого вещества собирали путем фильтрации (1,39 г, 27%).
Ί1 ЯМР (СШОН) δ 0,91 (дд, 3Н), 0,98 (дд, 3Н), 1,44 (с, 9Н), 1,70 (м, 2Н), 1,87 (м, 2Н), 2,02 (м, 2Н), 3,11 (т, 2Н), 3,89 (т, 1Н), 4,39 (кв, 1Н), 8,22 (д, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 375 (М+Н+).
1.Е). Синтез соединения 9. Вос-Уа1-С11-РАВОН.
Соединение 9 получали, как описано ранее для соединения 4, с выходом 71%.
Ί1 ЯМР (С123О12) δ 0,93, 0,97 (2д, 6Н), 1,44 (с, 9Н), 1,58 (м, 2Н), 1,75 (м, 1Н), 1,90 (м, 1Н), 2,05 (м, 1Н), 3,10 (м, 1Н), 3,19 (м, 1Н), 3,91 (д, 1Н), 4,52 (м, 1Н), 5,25 (с, 2Н), 7,40 (д, 2Н), 7,45 (дд, 2Н), 7,64 (д, 4Н), 8,29 (дд, 2Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 480 (М+Н+).
1.1к. Синтез соединения 10. Вос-Vа1-С^ΐ-РАВС-Р\Р.
Раствор Вос-Уа1-С11-РАВОН (178 мг, 0,370 ммоль) в ТНЕ (8 мл) и СН2С12 (4 мл) перемешивали при комнатной температуре с ΡΝΡ хлороформиатом (160 мг, 0,80 ммоль) и пиридином (65 мкл, 0,80 ммоль) в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат (100 мл) и 10% водную лимонную кислоту (50 мл), органический слой промывали солевым раствором, сушили и концентрировали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 5% метанола с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (165 мг, 70%).
Ί1 ЯМР (СШОН) δ 0,93 (дд, 3Н), 0,97 (дд, 3Н), 1,44 (с, 9Н), 1,58 (м, 2Н), 1,75 (м, 1Н), 1,89 (м, 1Н),
- 62 016577
2,05 (м, 1Н), 3,10 (м, 1Н), 3,20 (м, 1Н), 3,90 (д, 1Н), 4,51 (м, 1Н), 4,55 (с, 2Н), 7,29 (д, 2Н), 7,55 (д, 2Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 545 (М+Н+-Вос), 645 (М+Н+), 667 (Μ+Να+), 683 (М+К+).
1.11. Синтез соединения 12а.
К суспензии соединения 11 (20 мг, 0,078 ммоль) в этилацетате (5 мл) барботировали газообразным НС1 в течение 20 мин (со временем суспензия становилась прозрачным раствором). Реакционную смесь дополнительно перемешивали в течение 5 мин, затем смесь концентрировали досуха с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (26 мг, 100%), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
ЖХ-МС (ИЭР) 260 (М+Н+-С1), 295 (М+Н+).
1.1т. Синтез соединения 12Ь.
Суспензию соединения 11 (20 мг, 0,078 ммоль) в этилацетате (5 мл) барботировали газообразным НВг в течение 20 мин (со временем суспензия становилась прозрачным раствором).
Реакционную смесь дополнительно перемешивали в течение 5 мин, затем смесь концентрировали досуха с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (33 мг, 100%), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
ЖХ-МС (ИЭР) 260 (М+Н+-Вг), 339 (М+Н+), 341 (М+Н++2).
1.1η. Синтез соединения 13Ь.
К раствору соединения 12а (26 мг, 0,078 ммоль) в ΌΜΕ (2 мл) добавляли 5-(2диметиламинометокси)бензофуран-2-карбоновую кислоту (44 мг, 0,155 ммоль) и ЕЭС (30 мг, 0,155 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь концентрировали, остаток растворяли в Н2О/СН3С№ТЕА (4/1,5/0,5, 6 мл) и помещали в морозильник на 3 ч. Желтое твердое вещество собирали путем фильтрации (35 мг, 85%).
Ή ЯМР (С1);О1)) δ 2,67 (с, 3Н), 3,01 (с, 6Н), 3,34 (м, 2Н), 3,63 (фт, 1Н), 3,89 (с, 3Н), 3,91 (м, 1Н), 4,41 (м, 3Н), 4,54 (м, 1Н), 4,65 (м, 1Н), 7,20 (дд, 1Н), 7,36 (д, 1Н), 7,54 (с, 1Н), 7,59 (д, 1Н), 7,73 (ушир.с, 1Н), 11,75 (с, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 490 (М+Н+-С1), 526 (М+Н+).
1.1ο. Синтез соединения 13с.
К раствору соединения 12Ь (19 мг, 0,0387) в ΌΜΕ (2 мл) добавляли НВг соль 5-(2диметиламинометокси)бензофуран-2-карбоновой кислоты (25 мг, 0,0775 ммоль) и Р8-карбодиимид (82 мг, ммоль/г: 0,94, 0,0775 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. После фильтрации фильтрат концентрировали, остаток растворяли в Н2Ο/СН3СN/ТΕΑ (2/0,75/0,25,3 мл) и помещали в морозильник на 3 ч. Желтое твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили с получением указанного в заголовке соединения (18 мг, 82%).
ЖХ-МС (ИЭР) 490 (М+Н+-Вг), 570 (М+Н+), 572 (М+Н++2).
1.1р. Синтез соединения 14а.
К суспензии соединения 13а (48 мг, 0,10 ммоль) в дихлорметане (4 мл) при -78°С добавляли паранитрофенилхлороформиат (80 мг, 0,40 ммоль) и триэтиламин (56 мкл, 0,40 ммоль). Смесь медленно нагревали до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение дополнительных 30 мин. К реакционной смеси добавляли №Вос-И,№-диметилэтилендиамин (166 мг, 0,80 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 1,25% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (71 мг, 100%).
Ή ЯМР δ 1,45-1,47 (м, 9Н), 2,69 (с, 3Н), 2,97 (с, 3Н), 3,14-3,34 (м, 4Н), 3,81-3,92 (м, 8Н), 4,38-4,47 (м, 3Н), 4,70 (д, 1Н), 7,05 (дд, 1Н), 7,11 (д, 1Н), 7,45 (с, 1Н), 7,48 (д, 1Н), 7,99 (с, 1Н), 10,43 (с, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 710 (М-Н+).
1.1ц. Синтез соединения 14Ь.
К суспензии соединения 13Ь (48 мг, 0,075 ммоль) в дихлорметане (2 мл) при 0°С добавляли 4нитрофенилхлороформиат (80 мг, 0,4 ммоль) и триэтиламин (40 мг, 0,4 ммоль, 56 мкл). Смесь нагревали до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение дополнительных 6 ч. Растворитель выпаривали и промывали остаток эфиром с получением промежуточного продукта. Промежуточный продукт растворяли в дихлорметане (2 мл) и добавляли к реакционному раствору №Вос-И,№диметилэтилендиамин (44 мг, 0,2 ммоль) и триэтиламин (20 мг, 0,2 ммоль, 28 мкл). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь концентрировали и очищали остаток по методу ВЭЖХ на С-18 колонке с использованием в качестве элюента формиата аммония (20 мМ, рН 7,0) и ацетонитрила с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (31 мг, 54%).
ЖХ-МС (ИЭР) 755 (М+Н+).
- 63 016577
1.1г. Синтез соединения 14с.
К суспензии соединения 13с (24 мг, 0,04 ммоль) в СН2С12 (2 мл) при 0°С добавляли паранитрофенилхлороформиат (64 мг, 0,32 ммоль) и триэтиламин (22 мкл, 0,16 ммоль). Полученную таким образом реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. К реакционной смеси добавляли №Вос-И,№-диметилэтилендиамин (94 мг, 0,50 ммоль) и продолжали перемешивание в течение дополнительных 50 мин. Реакционную смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэшхроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 5% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (28 мг, 83%).
ЖХ-МС (ИЭР) 490, 570, 684 (М+Н+-Вос), 784 (М+Н+), 805 (М-ХаА 722 (М+К+).
1.18. Синтез соединения 15а.
Соединение 14а (70 мг, 0,10 ммоль) растворяли в трифторуксусной кислоте (5 мл), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, концентрировали досуха и использовали продукт (72 мг, 100%) на следующей стадии без дополнительной очистки. По методу ВЭЖХ показана чистота >95%.
1Н ЯМР δ 2,64 (с, 3Н), 2,93 (с, 3Н), 3,19 (с, 3Н), 3,30 (т, 1Н), 3,79 (с, 3Н), 3,85 (с, 3Н), 3,81-3,85 (м, 1Н), 4,27-4,49 (м, 3Н), 4,59 (д, 1Н), 4,68 (д, 1Н), 6,97 (дд, 1Н), 7,03 (д, 1Н), 7,38 (с, 1Н), 7,41 (д, 1Н), 8,00 (ушир.с, 1Н), 10,61 (ушир.с, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 612 (М+Н+), 634 (М+№+).
1.11. Синтез соединения 15Ь.
Соединение 15Ь получали, как описано ранее для соединения 15а, с выходом 100%.
1Н ЯМР (СО3ОЭ) δ 2,69 (с, 3Н), 2,76 (с, 3Н), 2,83 (ушир.с, 1Н), 3,01 (с, 6Н), 3,08 (ушир.с, 1Н), 3,24 (ушир.с, 2Н), 3,42 (м, 2Н), 3,63 (ушир.с, 3Н), 3,74 (ушир.с, 1Н), 3,91 (с, 3Н), 3,92 (м, 1Н), 4,40 (ушир.с, 2Н), 4,57 (ушир.с, 2Н), 4,71 (ушир.с, 1Н), 7,22 (ушир.д, 1Н), 7,36 (с, 1Н), 7,56 (с, 1Н), 7,59 (д, 1Н), 8,04 (ушир. с, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 490, 526, 640 (М+Н+), 678 (М+К+).
1.1и. Синтез соединения 15с.
Соединение 15с получали, как описано ранее для соединения 15а, с выходом 100%.
ЖХ-МС (ИЭР) 490, 570, 684 (М+Н+), 722 (М+К+).
1.1ν. Синтез соединения 16а.
К раствору соединения 5 (12,5 мг, 0,019 ммоль) и соединения 15а (10 мг, 0,014) в диметилформамиде (200 мкл) добавляли триэтидамин (6 мкл, 0,044 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. К смеси добавляли эфир (5 мл) и из раствора выпадало в осадок белое твердое вещество. Твердое вещество фильтровали и очищали по методу флэшхроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента дихлорметана, затем 1% метанола в дихлорметане, 2% метанола в дихлорметане, 3% метанола в дихлорметане, а затем 4% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (8,7 мг, 56%).
ЖХ-МС (ИЭР) 470, 1112 (М+Н+), 1134 ^+^+), 1150 (М+К+).
1.Гет. Синтез соединения 16Ь.
К раствору соединения 15Ь (5 мг, 0,0056 ммоль) в ΌΜΕ (0,35 мл) добавляли соединение 5 (3,8 мг, 0,0056 ммоль) и ΌΙΕΆ (2 мкл, 0,011 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэшхроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 10% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества (3 мг, 45%).
ЖХ-МС (ИЭР) 490, 526, 1169 (М+Н+), 1208 (М+К+).
1.1х. Синтез соединения 16с.
Соединение 16с получали, как описано ранее для соединения 16Ь, с выходом 50%.
ЖХ-МС (ИЭР) 490, 570, 1212 (М+Н+), 1250 (М+К+).
1.1у. Синтез соединения 17а.
К раствору соединения 16а (8,7 мг, 0,008 ммоль) в диметилформамиде (500 мкл) одной порцией добавляли пиперидин (100 мкл). Полученную таким образом смесь перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Растворитель удаляли на роторном испарителе и помещали в высокий вакуум на 1,5 ч. Остаток поглощали минимальным количеством дихлорметана (100 мкл), к раствору добавляли гексан (3 мл) и извлекали из раствора белое твердое вещество, которое отфильтровывали и сушили (6,7 мг, 96,7%).
МС (Ε8) 470, 890,1 (М+Н+), 912 ^+^+), 928 (М+К+).
1.1ζ. Синтез соединения 17Ь.
Соединение 17Ь получали, как описано ранее для соединения 17а, с выходом 95%.
ЖХ-МС (ИЭР) 947 (М+Н+).
1.1аа. Синтез соединения 17с.
Соединение 17с получали, как описано ранее для соединения 17а, с выходом 95%.
- 64 016577
ЖХ-МС (ИЭР) 1015 (М+Н+).
1.1ЬЬ. Синтез соединения 18а.
К раствору соединения 17а (4,2 мг, 0,005 ммоль) и соединения 3 (2,64 мг, 0,005 ммоль) в дихлорметане (1 мл) одной порцией добавляли РуВОР (3,7 мг, 0,007 ммоль), а затем диизопропилэтиламин (1 мкл). Полученную таким образом смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Растворители удаляли на роторном испарителе. Остаток очищали по методу препаративной ВЭЖХ с получением бежевого твердого вещества (2,6 мг, 38,7%).
МС (ЕБ) 470, 1431 (М+Н+), 1453 (Μ+Να+), 1469 (М+К+).
1.1сс. Синтез соединения 18Ь.
К раствору соединения 17Ь (2,2 мг, 0,0025 ммоль) и соединения 3 в 5% метанола в дихлорметане (400 мкл) добавляли НВТи (9 мг, 0,0046 ммоль) и ΌΙΕΆ (1,4 мкл, 0,0046 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с использованием в качестве элюента 10 мМ формиата аммония и ацетонитрила с получением указанного в заголовке соединения в виде масла (1,1 мг, 30%).
ЖХ-МС (ИЭР) 490, 526, 1488 (М+Н+), 1527(М+К+).
1.166. Синтез соединения 18с.
К раствору соединения 17с (6,5 мг, 0,0065 ммоль) и соединения 3 (5,5 мг, 0,0097 ммоль) в 5% метанола в дихлорметане (0,5 мл) добавляли НВТИ (3,7 мг, 0,0097 ммоль) и ΌΙΕΆ (3,4 мкл, 0,0194 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 30% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде масла (4 мг, 30%).
ЖХ-МС (ИЭР) 1532 (М+Н+), 1554 (Μ+Να+), 1570 (М+К+).
1.2. Методика синтеза содержащего дуокармицин пептидного линкера без саморазрушающегося спейсера.
1-2а. Реакция А.
Через суспензию 7 мг алкилирующего агента в 2 мл этилацетата медленным потоком пропускали сухой газообразный НВг до момента образования прозрачного раствора, что занимало приблизительно 15 мин. Реакционную смесь концентрировали и сушили в течение ночи в высоком вакууме.
- 65 016577
1.2Ь. Реакция В.
К суспензии полученного на стадии А бромметил секо-соединения в ОМР добавляли РОС (10 мг, 0,054 ммоль) и 5-нитробензофуранкарбоновую кислоту (12 мг, 0,054 ммоль) и оставляли перемешиваться в течение 6 ч. Затем к этой реакционной смеси добавляли этилацетат и солевой раствор. Объединенные органические слои концентрировали после трех экстракций этилацетатом и фильтровали через силикагель с использованием МеОН/ОСМ с возрастающим количеством МеОН. Получение продукта было подтверждено по методу масс-спектрометрии, М+1=530.
1.2с. Реакция С.
Группу 4'-ОН защищали с использованием метилпиперазинкарбонилхлорида (11 мг, 0,054 ммоль) в 2 мл ОСМ, 200 мкл аллилового спирта и пиридина (21 мкл) в течение 2 ч. Продукт очищали по методу колоночной хроматографии на силикагеле и идентифицировали при помощи масс-спектрометрии, М8+1=654.
1.2д. Реакция I).
Проводили восстановление нитрогруппы путем гидрирования над Рд/С в 1)С’\1\1еО11 (2/1) при давлении водорода 40 фунтов/кв.дюйм в течение 45 мин. Продукт фильтровали, фильтрат концентрировали и сушили в высоком вакууме. Получение продукта подтверждали по методу масс-спектрометрии (М8+1) и использовали продукт на следующей стадии без дополнительной очистки.
1.2е. Реакция Е.
К раствору полученного выше соединения (18 мг, 0,024 ммоль) в МеОН/ОСМ (2:1, 3 мл) добавляли Ртос-Уа1-цитруллин (29 мг, 0,06 ммоль) и перемешивали полученную смесь в течение 10 мин до растворения всей кислоты. Добавляли ЕЕ1)0 (15 мг, 0,06 моль) и перемешивали реакционную смесь в темноте в течение ночи. Затем реакционную смесь концентрировали, промывали диэтиловым эфиром и очищали остаток по методу препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой с получением продукта, которое идентифицировали по методу масс-спектрометрии, М+1=1103.
1.2Г. Реакция Р.
Проводили снятие Ртос-защитной группы с использованием 5% пиперидина в 1 мл ОМЕ в течение 10 мин. Реакционную смесь концентрировали, а затем промывали твердый остаток диэтиловым эфиром. Получение продукта подтверждали по методу масс-спектрометрии, М8+1=880 и М+К=919.
1.2д. Реакция С.
К раствору полученного на стадии Р свободного амина в ОМЕ (1,5 мл) добавляли сложный Ма1(РЕС)4-ХН8 эфир (20 мг) и перемешивали реакционную смесь в течение 1 ч. Смесь концентрировали, а затем очищали по методу препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой с получением 2,8 мг (общий выход 11%, начиная с алкилирующего агента) продукта, получение которого подтверждали по методу массспектроскопии: М8+1=2178, М+№=1300 и М+К=1316.
1. 3 Синтез пептидного линкера, конъюгированного с тубулизином А.
Лиганд может быть связан с РЕС и пептидным линкером путем представленного синтеза.
- 66 016577
Синтез промежуточных продуктов и содержащего пептидный линкер конъюгата лиганд-лекарство, где лекарство представляет собой тубулизин А, представлен выше в этом документе. Этот основной метод может быть использован применительно к другим лекарствам.
- 67 016577
1.4а. Синтез содержащего пептидный линкер конъюгата 111.
У
111
пиперидин/ 'ршоо пиперидин/ г
1.4Ь. Синтез содержащего пептидный линкер конъюгата 112.
7-Амино-1 Н-индол-2-карбоновая о Ν КИСЛОта/ЕОС/ТЕА (-''чАо
2. ТРА
- 68 016577
1.4с. Синтез содержащего пептидный линкер конъюгата 113.
Пример 2. Синтез содержащих 6-членный гидразиновый линкер конгьюгатов.
2.1. Синтез 6-членного дет-диметил гидразинового линкера, конъюгированного с цитотоксичным производным дуокармицина.
2.1а. Схема синтеза для соединения 109.
αζ'^ΟΗ СРЬН°А·! сьАХЧ-Й-Вос ХХм-й-Воо
Ν’- метил | |
Вос гидразин
109
2.1Ь. Синтез соединения 110.
К суспензии СЬ/-диметилаланина (1 г, 3,98 ммоль) в 30 мл ЛСМ при температуре бани со льдом добавляли НОАТ (каталитическое количество, 0,25 эквивалентов), Э1РЕЛ (2,8 мл, 16 ммоль), а затем гексафторфосфат 2-хлор-1,3-диметилимидазолидиния (С1Р) (1,2 г, 4,4 ммоль). Затем к этой реакционной смеси добавляли ΒοС-NN(Ме) (643 мг, 4,4 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в те
- 69 016577 чение ночи при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли 10% раствор лимонной кислоты (100 мл) и экстрагировали ЭСМ. Органическую фазу промывали водой, а затем насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, а затем снова водой. Затем органическую фазу концентрировали и очи щали на колонке с силикагелем с увеличением полярности этилацетата в гексанах с получением соединения 107 (860 мг, выход 57%), которое идентифицировали по методу масс-спектрометрии: М+1=380 и МН-ЫН4 +=397.
СЬх-защитную группу удаляли путем каталитического гидрирования с использованием Рб/С в МеОН с получением соединения 108, получение которого подтверждали по методу масс-спектрометрии.
К раствору РЫРС-1918 (10 мг, 0,1 ммоль) в 2 мл ЭСМ по каплям добавляли раствор соединения 108 (60 мг, 0,25 ммоль) в 8 мл ЭСМ и оставляли реакционную смесь перемешиваться в течение 2 суток до момента исчезновения исходного материала. Реакционную смесь фильтровали через тонкий слой силикагеля, а затем концентрировали и очищали по методу препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой с получением 4,2 мг соединения 109. Получение этого соединения подтверждали по методу массспектрометрии: М+1=740. Проводили снятие Вос-защитной группы с соединения 109 с использованием чистого ТЕА в течение 20 мин с получением соединения 110. Продукт идентифицировали по методу масс-спектрометрии, М+1=640.
О 110
111
2.1с. Синтез соединения 111.
Ма1-РЕС4-ацетофенон и соединение 110 (3 мг, 0,005 ммоль) объединяли, концентрировали и сушили в течение ночи в высоком вакууме. К этой смеси днем раньше добавляли 1 мл 5% раствора уксусной кислоты и сушили над молекулярными ситами. Образование гидразона завершалось менее чем за 1 ч. После этого реакционную смесь концентрировали и очищали по методу препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (формиат аммония, рН 7) с получением 2,8 мг соединения 111 (выход 60%). Продукт идентифицировали по методу масс-спектрометрии, М8+1=1129, М+ЫН4=1146 и М+К=1168.
- 70 016577
ВосНМ
2.2. Синтез дет-диметилзамещенного 6-членного гидразинового линкера, конъюгированного с цитотоксином тубулизином
1. ΡΝΡ-ΟΟΟΟΙ
Εί3Ν, СН2С12
ноос
2. 10% АсОН/СН2С12 молекулярные сита
Методика, сходная с представленной в примере 2.1, может применяться для синтеза геминального диметилзамещенного 6-членного гидразинового линкера, конъюгированного с лекарством, таким как тубулизин А.
2.3. Синтез гидразинового линкера, конъюгированного с аналогом дуокармицина.
К раствору бромметилзамещенного секо-соединения (0,074 ммоль) в 3 мл ЭМЕ добавляли 5ацетилиндол-2-карбоксилат (30 мг, 0,15 ммоль) и ЕЭС (28 мг, 0,15 ммоль) и перемешивали полученную смесь в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали по методу хроматографии на силикагеле с использованием 5% МеОН в ЭСМ Τΐ с получением 29 мг (выход 74%) продукта, получение которого подтверждали по методу масс-спектроскопии, М+1=523.
К раствору соединения, синтезированного на стадии С, в 5 мл ЭСМ и 300 мкл аллилового спирта
- 71 016577 добавляли метилпиперазинкарбонилхлорид (22 мг, 0,11 ммоль) и 44 мкл пиридина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Смесь концентрировали, а затем очищали по методу хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 5% МеОН/ЭС'М с получением 48 мг требуемого продукта (выход 73%). Получение продукта подтверждали по методу массспектрометрии, М+1=650.
Раствор полученного выше соединения (8,2 мг, 0,012 ммоль) и Ма1-РЕО4-гидразина в 5% уксусной кислоте в безводном ЭСМ перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, затем выпаривали растворители и по методу препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием ацетонитрила и забуференной формиатом аммония водной фазы получали 2,5 мг желаемого конечного продукта, получение которого подтверждали по методу масс-спектрометрии, М+1=1063.
2.4а. Скорость циклизации диметилзамещенного 6-членного гидразинового линкера.
Аналог дуокармицина, конъюгированный с диметилзамещенным 6-членным гидразиновым линкером, инкубировали в буфере (рН 7,4) в течение 24 ч и оценивали во времени образование циклизованного продукта в результате циклизации гидразинового линкера, с высвобождением. тем самым свободного аналога дуокармицина.
Через 24 часа при рН 7,4 определялись минимальные количества циклизованного продукта, что указывает на то, что эта форма 6-членного гидразинового линкера обладает относительно низкой скоростью циклизации.
2.4Ь. Скорость циклизации дет-диметилзамещенного 6-членного гидразинового линкера.
Аналог дуокармицина, конъюгированный с дет-диметилзамещенным 6-членным гидразиновым линкером, инкубировали в буфере (рН 7,4) в течение 24 ч и оценивали во времени образование циклизованного продукта в результате циклизации гидразинового линкера, с высвобождением тем самым свободного аналога дуокармицина.
С дет-диметилзамещенным 6-членным линкером реакция циклизации протекала очень быстро, полностью завершаясь через несколько минут. Таким образом, скорость циклизации для детдиметилзамещенного 6-членного гидразинового линкера значительно превышает скорость циклизации 6линкера, не содержащего дет-диметильный фрагмент.
- 72 016577
Пример 3. Синтез содержащих 5-членный гидразиновый линкер конъюгатов.
3.1. Методика синтеза для соединения 4.
О
О О нагревание о обратным холодильником 2 ч -------► НО
нагревание с обратным холодильником
С'.^-ОМОА-2,2-диметилмалоновая кислота (1).
К раствору 2,2-диметилмалоновой кислоты (2,0 г, 0,0151 моль), тионилхлорида (1,35 мл, 0,0182 моль) в ТНР (15 мл) в колбе емкостью 25 мл, оснащенной мешалкой, датчиком температуры и обратным холодильником, добавляли каплю ЭМЕ, реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Эту реакционную смесь переносили по каплям к раствору ΡΈζ-ΟΜΩΑ (4 г, 0,0182 моль) и триэтиламина (4 мл, 0,0287 моль) в ТНР (5 мл) при 0°С и перемешивали в течение 30 мин при этой температуре. Растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 1н. НС1 (50 мл) и экстрагировали ЭСМ (2x25 мл). Объединенные органические слои экстрагировали 1н. №ОН (2x25 мл), объединенный водный слой подкисляли (рН<1) конц. НС1, экстрагировали ЕЮАс (2x25 мл), сушили над МдБО4, фильтровали и концентрировали в вакууме до не совсем белого вязкого твердого вещества (3,44 г, выход 68%). Получение соединения 1 подтверждали по методу масс-спектрометрии: т/ζ 337,0 [М+1]+.
Время удерживания по ВЭЖХ: 3,77 мин (масс-спектрометрия).
С^-ВМВА-2,2-диметилмалоновый-Вос-№-метилгидразин (2).
К раствору соединения 1 (3,0 г, 0,0089 моль), тионилхлориду (0,78 мл, 0,0107 моль) в ТНР (25 мл) в КВР емкостью 50 мл, оснащенной мешалкой, датчиком температуры и обратным холодильником, добавляли каплю ЭМЕ и нагревали реакционную смесь с обратным холодильником в течение 2 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Затем эту реакционную смесь добавляли по каплям к раствору ВосΝ-метилгидразина (1,33 г, 0,091 моль) и триэтиламина (3 мл, 0,0215 моль) в ТНР (25 мл) при 0°С и перемешивали в течение 30 мин. Растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в ЕЮАс (50 мл), сушили над МдБО4, фильтровали и концентрировали в вакууме до коричневого мала. Масло растворяли в ЕЮАс и очищали по методу колоночной хроматографии (100% ЕЮАс) с получением прозрачного масла (3,45 г, выход 83%). Получение соединения 2 подтверждали по методу масс-спектрометрии: т/ζ 465,2 [М+1].
Время удерживания по ВЭЖХ: 3,97 мин (масс-спектрометрия).
ВМВА-2,2-диметилмалоновый-Вос-№-метилгидразин (3).
К раствору соединения 2 (0,5 г, 0,0011 моль) в МеОН (30 мл) добавляли 10% Р6/С (15 мг) и помещали реакционную смесь в гидрогенизатор Парра на 30 мин. Катализатор отфильтровывали и концентрировали фильтрат в вакууме до прозрачного масла с получением соединения 3 (0,38 г). Получение продукта подтверждали по методу ЯМР.
1Н ЯМР (СОС13) δ 1,45 (с, 15Н) 2,45 (с, 3Н) 2,85 (с, 6Н), 3,16 (с, 3Н) 4,64 (м, 1Н) 10,6 (ушир.с, 1Н);
ЯМР (13С, СОС13) δ 24,1, 28,57, 35,15, 35,58, 36, 66, 47,01, 48,51, 81,11, 155,17, 173,56, 176,24.
Синтез соединения 4.
В КВР емкостью 15 мл, оснащенную мешалкой, объединяли соединение 3 (50 мг, 0,1513 ммоль), ΡΝΡΟ-1918 (20 мг, 0,0315 ммоль) и РСМ (5 мл). Раствор перемешивали в течение 30 мин, затем добавля
- 73 016577 ли триэтиламин (25 мкл, 0,1794 ммоль) и перемешивали ярко-желтый раствор в течение 1 ч. Раствор концентрировали в вакууме до желтого масла и очищали по методу колоночной хроматографии (от 100% ЭСМ до 1/1 ЕЮАс/ОСМ) с получением соединения 4 в виде не совсем белого твердого вещества (22 мг, 84%). Получение продукта подтверждали по методу масс-спектрометрии: т/ζ 825,7 [М+1]+.
Время удерживания по ВЭЖХ: 7,65 мин (масс-спектрометрия).
3.2. Синтез конъюгата антитело-лекарство, содержащего 5-членный гидразиновый линкер.
На этой схеме представлена конъюгация антитела с комплексом линкер-лекарство. Указанные методики хорошо известны в области фармацевтики. Примеры других реакционноспособных сайтов включают малеимиды, галогенацетамиды с тиолами на лиганде, тиолы, которые реагируют с дисульфидами на лиганде, гидразиды, которые реагируют с альдегидами или кетонами на лиганде и гидроксисукцинимиды, изоцианаты, изотиоцианаты и ангидриды, которые реагируют с аминогруппой на лиганде. конъюгатов.
Пример 4. Синтез содержащих дисульфидный линк
Схема 1
холодильником
- 74 016577
Схема 2
МеО
а1бп№ю1-2 МеОН
2Ν ΝθΟΗ нагревание с обратным холодильником
- 75 016577
Схема 3
1) СОС12, Ε13Ν, СН2С12
2) 10, Ε13Ν, ΩΜΑΡ, СН2С12
Ν-ГИДРОКСИСУКЦИНИМИД, СН2С12
Р8- карбодиимид , Р5-0МАР
4.1а. Синтез соединения 1.
В колбу с РЕС4 (3,88 г, 20 ммоль) добавляли тритон В (40% раствор в метаноле, 1,08 мл, 0,25 ммоль) и через 15 мин трет-бутилакрилат (3,62 мл, 24 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь концентрировали в вакууме и очищали остаток по методу флэшхроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 1% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (2,35 г, 36%).
1Н ЯМР δ 1,45 (с, 9Н), 2,5 (т, 2Н), 3,65 (м, 18Н).
4.1Ь. Синтез соединения 2.
К раствору соединения 1 (1,17 г, 3,6 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляли триэтиламин (532 мкл, 4 ммоль) и метансульфонилхлорид (309 мкл, 4 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 1% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (1,3 г, 89%).
1Н ЯМР δ 1,43 (с, 9Н), 2,48 (т, 2Н), 3,07 (с, 3Н), 3,62-3,70 (м, 14Н), 3,76 (м, 2Н), 4,37 (м, 2Н).
4.1с. Синтез соединения 3.
К раствору соединения 2 (1,3 г, 3,25 ммоль) в этаноле (10 мл) добавляли азид натрия (423 мг, 6,5 ммоль). Полученную таким образом смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 1% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (1,01 г, 90%).
1Н ЯМР δ 1,45 (с, 9Н), 2,50 (т, 2Н), 3,40 (т, 2Н), 3,62-3,73 (м, 16Н).
- 76 016577
4.1б. Синтез соединения 4.
К раствору соединения 3 (470 мг, 1,35 ммоль) в эфире (5 мл), содержащем Н2О (25 мкл), добавляли трифенилфосфин (391 мг, 1,48 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэшхроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 1% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (325 мг, 75%).
Ή ЯМР δ 1,45 (с, 9Н), 2,24 (ушир.с, 2Н), 2,51 (т, 2Н), 2,91 (т, 2Н), 3,56 (м, 2Н), 3,63-3,66 (м, 12Н), 3,72 (м, 2Н).
4.1е. Синтез соединения 5.
К раствору 3-меркаптопропионовой кислоты (1,22 г, 11,5 ммоль) в метаноле (10 мл) добавляли алдритиол-2 (3,78 г, 17,25 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 30% этилацетата в гексанах с получением указанного в заголовке соединения в виде масла (2,44 г, 98%).
Ή ЯМР δ 2,8 (т, 2Н), 3,05 (т, 2Н), 7,14 (м, 1Н), 7,67 (м, 2Н), 8,48 (м, 1Н).
Соединение 5Ь.
Ή ЯМР δ 1,43 (д, 3Н), 2,61 (м, 1Н), 2,76 (м, 1Н), 3,40 (м, 1Н), 7,17 (м, 1Н), 7,66 (м, 2Н), 8,45 (м, 1Н).
4.1Г. Синтез соединения 6.
Йодид 3-метилбензотиазолия (1 г, 3,6 ммоль) растворяли в 2н. водном растворе гидроксида натрия (10 мл), смесь перемешивали в течение 6 ч при 100°С, затем подкисляли до рН 4 6н. водным раствором соляной кислоты и экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой сушили над №28О4, упаривали в вакууме на роторном растворителе, растворяли остаток в метаноле (10 мл) и добавляли соединение 5а (776 мг, 3,6 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь концентрировали досуха и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 1% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (482 мг, 55%).
Ή ЯМР δ 2,85 (м, 2Н), 2,95 (м, 5Н), 6,64 (м, 2Н), 7,3 (м, 1Н), 7,4 (дд, 1Н).
МС (Е8) 244 (М+Н+), 487 (2М+Н+).
Соединение 6Ь.
Ή ЯМР δ 1,35 (д, 3Н), 2,48 (м, 1Н), 2,92 (с, 3Н), 3,02 (м, 1Н), 3,34 (м, 1Н), 6,62 (м, 2Н), 7,28 (м, 1Н), 7,44 (м, 1Н).
МС (Е8) 258 (М+Н+).
Соединение 6с.
Ή ЯМР δ 1,45 (с, 6Н), 2,70 (с, 2Н), 2,93 (с, 3Н), 6,62 (м, 2Н), 7,24 (м, 1Н), 7,51 (м, 1Н).
МС (Е8) 272 (М+Н+), 294 (М+№+), 310 (М+К+).
4.1д. Синтез соединения 7.
К раствору соединения 6а (28 мг, 0,115 ммоль) в безводном метаноле (1 мл) добавляли ацетилхлорид (13 мкл, 0,173 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 10% этилацетата в гексанах с получением указанного в заголовке соединения в виде масла (24 мг, 83%).
Ή ЯМР δ 2,08 (м, 2Н), 2,93 (с, 3Н), 2,95 (м, 2Н), 3,70 (с, 3Н), 6,63 (м, 2Н), 7,28 (м, 2Н), 7,40 (м, 2Н).
МС (Е8) 258 (М+Н+), 280 (М+№+), 296 (М+К+).
Соединение 7Ь.
Ή ЯМР δ 1,32 (д, 3Н), 2,45 (м, 1Н), 2,92 (с, 3Н), 2,93 (м, 1Н), 3,35 (м, 1Н), 3,67 (с, 3Н), 6,62 (м, 2Н), 7,26 (м, 1Н), 7,44 (м, 1Н).
МС (Е8) 272 (М+Н+).
Соединение 7с.
Ή ЯМР δ 1,42 (с, 6Н), 2,66 (с, 2Н), 2,93 (с, 3Н), 3,62 (с, 3Н), 6,62 (м, 2Н), 7,24 (м, 1Н), 7,51 (м, 1Н).
МС (Е8) 286 (М+Н+), 308 (М+№+), 324 (М+К+).
4.1Ь. Синтез соединения 8.
К раствору соединения 7а (24 мг, 0,093 ммоль) в дихлорметане (1 мл) при 0°С добавляли трифосген (28 мг, 0,093 ммоль) и триэтиламин (37 мкл, 0,28 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1 ч. Смесь концентрировали досуха и использовали остаток на следующей стадии без дополнительной очистки.
Неочищенный материал растворяли в дихлорметане (1 мл) и добавляли соединение 8а (35 мг, 0,074 ммоль) и ОМАР (23 мг, 0,190 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием, в качестве элюента 1% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (53 мг, 76%).
Ή ЯМР δ 2,70 (с, 3Н), 2,74 (м, 2Н), 3,06 (м, 2Н), 3,34 (м, 1Н), 3,35, 3,36 (2с, 3Н), 3,63, 3,64 (2с, 3Н), 3,86 (м, 1Н), 3,88 (с, 3Н), 3,93, 3,94 (2с, 3Н), 4,48 (м, 1Н), 4,55 (м, 1Н), 4,79 (м, 1Н), 7,05 (м, 1Н), 7,11 (м,
- 77 016577
1Н), 7,26-7,52 (м, 5Н), 7,85 (д, 1Н), 8,1 (ушир.с, 1Н), 8,98, 9,08 (2с, 1Н).
МС (Ε8) 753 (М+Н+).
Соединение 8Ь.
Ή ЯМР δ 1,38 (м, 3Н), 2,52 (м, 1Н), 2,69 (м, 3Н), 2,79 (м, 1Н), 3,33 (м, 1Н), 3,37 (2с, 3Н), 3,64 (м, 3Н), 3,88 (с, 3Н), 3,84-3,90 (м, 1Н), 3,93 (2с, 3Н), 4,48 (м, 1Н), 4,57 (м, 1Н), 4,78 (м, 1Н), 7,06 (м, 1Н), 7,12 (м, 1Н), 7,26-7,43 (м, 3Н), 7,50 (м, 2Н), 7,86 (м, 1Н), 8,1 (ушир.с, 1Н), 8,99, 9,08, 9,13, 9,22 (4с, 1Н).
МС (Ε8) 767 (М+Н+).
Соединение 8с.
Ή ЯМР δ 1,44 (м, 6Н), 2,63 (д, 2Н), 2,70 (с, 3Н), 3,35 (м, 1Н), 3,38, 3,39 (2с, 3Н), 3,63, 3,64 (2с, 3Н), 3,87 (м, 1Н), 3,88 (с, 3Н), 3,93, 3,94 (2с, 3Н), 4,48 (м, 1Н), 4,55 (м, 1Н), 4,79 (м, 1Н), 7,05 (м, 1Н), 7,12 (м, 1Н), 7,31-7,39 (м, 3Н), 7,49 (м, 2Н), 7,89 (д, 1Н), 8,1 (ушир.с, 1Н), 9,12, 9,23 (2с, 1Н).
МС (Ε8) 781 (М+Н+).
4.11. Синтез соединений 9 и 10.
К раствору соединения 8а (0,1 мг) в фосфатном буферном растворе (рН 7, 2)/метаноле (300 мкл, 2/1) добавляли 20 мМ раствор ΌΤΤ (100 мкл, 15 экв.) и отслеживали развитие реакции по методу ВЭЖХ. Реакция проходила слишком быстро, чтобы ее отследить и через несколько секунд реакция полностью завершалась с получением продукта, соединения 10 (количественный выход). Промежуточный продукт реакции, соединение 9, не обнаруживали.
4.1). Синтез соединения 11.
К раствору соединения 6а (66 мг, 0,2 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляли ОСС (47 мг, 0,22 ммоль), НОВ! (31 мг, 0,22 ммоль) и соединение 4 (50 мг, 0,2 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 1% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (70 мг, 62%).
Ή ЯМР δ 1,44 (с, 9Н), 2,51 (т, 1Н), 2,63 (т, 2Н), 2,93 (д, 3Н), 3,01 (т, 2Н), 3,45 (м, 2Н), 3,55 (м, 2Н), 3,64 (м, 12Н), 3,71 (т, 2Н), 5,01 (ушир.с, 1Н), 6,38 (Ь!, 1Н), 6,62 (м, 2Н), 7,27 (м, 1Н), 7,43 (дд, 1Н).
МС (Ε8) 491 (М-56+Н+), 513 (М-56+№+), 547 (М+Н+), 569 (М+№+).
Соединение 11Ь.
Ή ЯМР δ 1,34 (д, 3Н), 1,45 (с, 9Н), 2,30 (м, 1Н), 2,5 (т, 2Н), 2,69 (м, 1Н), 2,93 (д, 3Н), 3,37-3,55 (м, 5Н), 3,63 (м, 12Н), 3,71 (т, 2Н), 4,99 (ушир.с, 1Н), 6,13 (ушир.т, 1Н), 6,62 (м, 2Н), 7,25 (м, 1Н), 7,48 (дд, 1Н).
МС (Ε8) 505 (М-56+Н+), 527 (М-56+№+), 543 (М-56+К+), 561 (М+Н+), 583 (М+№+).
Соединение 11с.
Ή ЯМР δ 1,43 (с, 3Н), 1,45 (с, 9Н), 2,46 (с, 2Н), 2,5 (т, 2Н), 2,92, 2,94 (2с, 3Н), 3,33 (м, 2Н), 3,47 (т, 2Н), 3,63 (м, 12Н), 3,70 (т, 2Н), 6,06 (ушир.т, 1Н), 6,63 (м, 2Н), 7,25 (м, 1Н), 7,54 (д, 1Н).
МС (Ε8) 519 (М-56+Н+), 541 (М-56+№+), 575 (М+Н+), 597 (М+№+).
4.1к. Синтез соединения 12.
К суспензии соединения 11а (20 мг, 0,037 ммоль) в дихлорметане (1 мл) при 0°С добавляли триэтиламин (15 мкл, 0,11 ммоль) и раствор 2н. фосгена в толуоле (55 мкл, 0,11 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь концентрировали, остаток, растворяли в дихлорметане (1 мл) и добавляли соединение 10 (14 мг, 0,030 ммоль) и ОМАР (9 мг, 0,076 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента 1% метанола в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (23 мг, 74%).
Ή ЯМР δ 1,44 (с, 9Н), 2,49 (т, 2Н), 2,67 (м, 2Н), 2,65, 2,67 (2с, 3Н), 3,07 (м, 2Н), 3,33 (с, 3Н), 3,40 (м, 3Н), 3,51 (м, 2Н), 3,60 (м, 12Н), 3,69 (м, 2Н), 3,87 (с, 3Н), 3,92 (с, 3Н), 3,93 (м, 1Н), 4,52 (м, 2Н), 4,78 (м, 1Н), 6,65, 6,74, 6,97 (3Ь!, 1Н), 7,06 (д, 1Н), 7,12 (с, 1Н), 7,29-7,42 (м, 3Н), 7,50 (м, 2Н), 7,87 (д, 1Н), 8,10, 8,15 (2 ушир.с, 1Н), 9,79, 9,58 (2с, 1Н).
МС (Ε8) 986 (М+Н+-56), 1042 (М+Н+).
Соединение 12Ь.
Ή ЯМР δ 1,32 (м, 3Н), 1,44 (с, 9Н), 2,39 (м, 1Н), 2,48 (м, 2Н), 2,60 (м, 1Н), 2,67, 2,69 (2с, 3Н), 3,32, 3,35 (2с, 3Н), 3,38-3,72 (м, 20Н), 3,88 (с, 3Н), 3,93 (с, 3Н), 3,94 (м, 1Н), 4,52 (м, 2Н), 4,77 (м, 1Н), 6,53, 6,67, 6,72 (3ушир.т, 1Н), 7,06 (д, 1Н), 7,12 (с, 1Н), 7,29-7,39 (м, 3Н), 7,49 (м, 2Н), 7,88 (д, 1Н), 8,12, 8,25 (2ушир.с, 1Н), 9,13, 9,36, 10,08, 10,21 (4с, 1Н).
МС (Ε8) 1000 (М+Н+-56), 1056 (М+Н+), 1078 ^+^+), 1084 (М+К+).
Соединение 12с.
Ή ЯМР δ 1,30-1,42 (м, 3Н), 1,44 (с, 9Н), 2,45-2,52 (м, 4Н), 2,69, 2,72 (2с, 3Н), 3,34, 3,35 (2с, 3Н), 3,39-3,72 (м, 19Н), 3,88 (с, 3Н), 3,925, 3,93 (2с, 3Н), 3,94 (м, 1Н), 4,53 (м, 2Н), 4,80 (м, 1Н), 6,63 (м, 1Н), 7,06 (дд, 1Н), 7,13 (д, 1Н), 7,25-7,39 (м, 3Н), 7,50 (м, 2Н), 7,89 (д, 1Н), 8,10, 8,27 (2ушир.с, 1Н), 9,99, 10,191 (2с, 1Н).
- 78 016577
МС (Е8) 1014 (М+Н+-56), 1070 (М+Н+), 1108 (М+К+).
4.11. Синтез соединения 13.
Соединение 12а (23 мг, 0,022 ммоль) растворяли в растворе трифторуксусной кислоты и дихлорметана (1 мл, 1/1), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и концентрировали с получением продукта (21 мг, 100%).
1Н ЯМР δ 2,60 (т, 2Н), 2,67, 2,68 (2с, 3Н), 2,75 (м, 2Н), 3,07 (м, 2Н), 3,34 (с, 3Н), 3,38-3,64 (м, 21Н), 3,76 (т, 2Н), 3,88 (с, 3Н), 3,92 (с, 3Н), 3,93 (м, 1Н), 4,53 (м, 2Н), 4,78 (м, 1Н), 7,06 (д, 1Н), 7,13 (с, 1Н), 7,31-7,43 (м, 3Н), 7,49 (м, 2Н), 7,87 (д, 1Н), 8,10, 8,15 (2ушир.с, 1Н), 9,44, 9,65 (2с, 1Н).
МС (Е8) 986 (М+Н+), 1008 (Μ+Να+), 1024 (М+К+).
Соединение 13Ь.
1Н ЯМР δ 1,34 (м, 3Н), 2,56 (м, 1Н), 2,62 (м, 2Н), 2,68 (м, 3Н), 2,8 (м, 1Н), 3,35-3,36 (2с, 3Н), 3,403,70 (м, 18Н), 3,77 (т, 2Н), 3,88 (с, 3Н), 3,93, 3,95 (2с, 3Н), 3,94 (м, 1Н), 4,54 (м, 2Н), 4,79 (м, 1Н), 7,07 (д, 2Н), 7,13 (с, 1Н), 7,30-7,42 (м, 3Н), 7,49 (м, 2Н), 7,88 (д, 1Н), 8,11, 8,25 (2ушир.с, 1Н), 9,22, 9,37, 9,80 и 9,92 (4с, 1Н).
МС (Е8) 1000 (М+Н+), 1022 (Μ+Να+), 1038 (М+К+).
Соединение 13с.
1Н ЯМР δ 1,30-1,45 (м, 6Н), 2,54 (м, 2Н), 2,61 (м, 2Н), 2,68, 2,69 (2с, 3Н), 3,35-3,36 (2с, 3Н), 3,40-3,70 (м, 17Н), 3,77 (т, 2Н), 3,88 (с, 3Н), 3,92, 3,93 (2с, 3Н), 3,94 (м, 1Н), 4,50 (м, 2Н), 4,80 (м, 1Н), 7,08 (м, 2Н), 7,12 (д, 1Н), 7,29-7,39 (м, 3Н), 7,49 (м, 2Н), 7,89 (м, 1Н), 8,10, 8,25 (2ушир.с, 1н), 9,88, 10,04 (2с, 1Н).
МС (Е8) 1014 (М+Н+), 1036 (Μ+Να+), 1054 (М+К+).
4.1т. Синтез соединения 14а.
К раствору соединения 13а (5,4 мг, 0,0054 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляли Р8карбодиимид (11,5 мг, 0,94 ммоль/г, 0,0108 ммоль) и Р8-^ΜΑР (7,2 мг, 1,49 ммоль/г, 0,0108 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, фильтровали и концентрировали с получением продукта.
МС (Е8) 1082 (М+Н+).
4.2. Синтез дисульфидного линкера, конъюгированного с тубулизином А.
нагревание с обратным холодильником
-|)тубулизин Α, Ε13Ν, ОМАР, СН2С12
2) ТРА / СН2С12
Лекарство тубулизин А может быть конъюгировано с дисульфидным линкером по настоящему изо
- 79 016577 бретению с использованием механизма, представленного выше в этом документе. Другие лекарства и другие линкеры по настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием сходных реакционных схем.
4.3. Скорость циклизации дисульфидного линкера.
К раствору соединения 8а (0,1 мг) в фосфатном буферном растворе (рН 7,2)/метаноле (300 мкл, 2/1) добавляли 20 мМ раствор ОТТ (100 мкл, 15 экв.) и отслеживали развитие реакции по методу ВЭЖХ. Реакция циклизации проходила очень быстро и через несколько секунд реакция полностью завершалась с получением продукта, соединения 10 (количественный выход). Промежуточный продукт реакции, соединение 9, не обнаруживали.
Пример 5.
- 80 016577
ΡΙΕΑ, СН2С12
ΟΙΕΑ, ΡΜΡ /
соединение
Синтез соединения 32.
Раствор соединения 30 (120 мг, 0,28 ммоль) в этилацетате (10 мл) барботировали газообразным НС1 в течение 5 мин. Реакционную смесь перемешивали при к.т. в течение дополнительных 30 мин, а затем концентрировали смесь. К реакционной смеси добавляли эфир и собирали белый осадок на фильтрворонке. Твердое вещество сушили в течение ночи в вакууме с получением 100 мг требуемого продукта, получение которого подтверждали по методу ЖХ-МС (ИЭР): 324 (М+Н+) и использовали продукт на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору этого соединения (100 мг, 0,24 ммоль) в ЭМЕ (5 мл) добавляли соединение 31 (65 мг, 0,26 ммоль), НАТи (100 мг, 0,26 ммоль) и ТЕА (91 мкл, 0,52 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с использованием в качестве элюента 0,1% ТЕА в воде и ацетонитрила с получением соединения 32 в виде масла (110 мг, 80%). Получение требуемого продукта подтверждали по методу ЖХ-МС (ИЭР): 555 (М+Н+).
Синтез соединения 33.
Раствор соединения 32 (110 мг, 0,2 ммоль) и палладированного угля (20 мг) в ЭСМ (10 мл) и метаноле (5 мл) перемешивали в атмосфере водорода при атмосферном давлении при комнатной температуре в течение 12 ч. Катализатор отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с использованием в качестве элюента 0,1% ТЕА в воде и ацетонитрила с получением желаемого соединения в виде масла (80 мг, 78%): ЖХ-МС (ИЭР) 465 (М+Н+). К раствору остатка (80 мг, 0,17 ммоль) в дихлорметане (10 мл) и ТНЕ (5 мл) при 0°С добавляли РКРС1 (4нитрофенилхлороформиат) (137 мг, 0,68 ммоль) и триэтиламин (144 мкл, 1,02 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°С, а затем при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и осаждали остаток с использованием этилового эфира (100 мл) с получением соединения 33 в виде желтого твердого вещества (90 мг, 82%), которое сушили в вакууме и подтверждали его получение по методу ЖХ-МС (ИЭР): 631 (М+Н+).
Синтез соединения 34.
К раствору 2-бромэтиламинбромида (5 г, 24,4 ммоль) в ЭМЕ (50 мл) добавляли диизопропилэтиламин (8,5 мл, 48,8 ммоль) и бензилхлороформиат (3,48 мл, 24,4 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента этилацетата/гексанов (3/7) с получением желаемого соединения 34 в виде масла (4 г, 64%).
'Н ЯМР (СОС13) δ 3,54 (ушир.с, 2Н), 3,61 (ушир.с, 2Н), 5,12 (с, 2Н), 7,36 (м, 5Н).
Синтез соединения 35.
К раствору соединения 34 (3,34 г, 12,99 ммоль) и сложного трет-бутилового эфира валина (3,27 г,
15,59 ммоль) в ЭМЕ (50 мл) добавляли карбонат калия (5,39 г, 38,97 ммоль) и йодид калия (2,59 г,
15,59 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при 100°С в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использова
- 81 016577 нием в качестве элюента этилацетата/гексанов (2/8) с получением желаемого соединения 35 в виде масла (3,12 г, 69%).
1Н ЯМР (ϋϋα3) δ 0,92 (м, 6Н), 1,46 (с, 9Н), 1,86 (м, 1Н), 2,53 (м, 1Н), 2,80 (м, 2Н), 3,18 (м, 1Н), 3,31 (м, 1Н), 5,10 (с, 2Н), 5,25 (ушир.с, 1Н), 7,36 (м, 5Н).
ЖХ-МС (ИЭР) 296 (М+Н-1 бутил+), 352 (М+Н+).
Синтез соединения 36.
Раствор соединения 35 (3,4 г, 9,72 ммоль) и палладированного угля (200 мг) в метаноле (30 мл) помещали в атмосферу водорода при атмосферном давлении при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Катализатор отфильтровывали и концентрировали реакционную смесь досуха с получением желаемого соединения 36 в виде масла (2,1 г, 98%).
Синтез соединения 37.
К раствору соединения 36 (2,1 г, 9,72 ммоль) в дихлорметане (30 мл) при 0°С добавляли Ртос-О8и (сложный эфир 9-фторфенилметоксикарбонил-И-гидроксисукцинимида) (3,28 г, 9,72 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали в течение 2 ч при 0°С. Растворитель удаляли на роторном испарителе и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента дихлорметана, затем 0,5% метанола в дихлорметане, а затем 1% метанола в дихлорметане с получением желаемого соединения 37 в виде бесцветного масла (2,55 г, 60%).
1Н ЯМР (СВС13) δ 0,95 (й, 6Н), 1,48 (с, 9Н), 1,90 (м, 1Н), 2,55 (м, 1Н), 2,82 (м, 2Н), 3,18 (м, 1Н), 3,32 (м, 1Н), 4,24 (м, 1Н), 4,37 (м, 2Н), 5,40 (ушир.с, 1Н), 7,30 (м, 2Н), 7,39 (м, 2Н), 7,60 (д, 2Н), 7,75 (д, 2Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 383 (М+Н-1 бутил+), 440 (М+Н+), 462 (М+№+), 478 (М+К+).
Синтез соединения 38.
Раствор соединения 37 (177 мг, 0,4 ммоль) в тетрагидрофуране/воде (3/1, 8 мл) барботировали газообразным НС1 в течение 5 мин. Реакционную смесь перемешивали при 37°С в течение ночи, а затем концентрировали смесь досуха с получением желаемого соединения 38 в виде твердого вещества (168 мг, 98%), получение которого подтверждали по методу ЖХ-МС (ИЭР): 383 (М+Н+), 405 (М+Νη') и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
ЖХ-МС (ИЭР): 383 (М+Н+), 405 (М+№+).
Синтез соединения 39.
К раствору соединения 5 (525 мг, 0,79 ммоль) в ЭМР (5 мл) добавляли ^Вос-И^'диметилэтилендиамин (177 мг, 0,94 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворитель удаляли и очищали остаток по методу флэшхроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента дихлорметана, затем 2% метанола в дихлорметане, а затем 5% метанола в дихлорметане с получением желаемого соединения 39 в виде бесцветного масла (364 мг, 65%).
1Н ЯМР (С1+О1)) δ 1,39 (с, 9Н), 1,56 (м, 2Н), 1,70 (м, 1Н), 1,82 (м, 1Н), 2,70, 2,82 (2с, 3Н), 2,90 (с, 3Н), 3,09 (м, 1Н), 3,17 (м, 1Н), 3,30-3,37 (м, 4Н), 4,16 (т, 1Н), 4,27 (м, 1Н), 4,33 (д, 2Н), 5,02 (ушир.с, 2Н), 7,24-7,36 (м, 6Н), 7,51-7,65 (м, 4Н), 7,74 (д, 2Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 618 (М+Н-Вос+), 662 (М+Н-1 бутил+), 718 (М+Н+), 740 (М+№+), 1435 (2М+Н+).
Синтез соединения 40.
Соединение 40 получали, как описано ранее для соединения 17а, с выходом 98%.
ЖХ-МС (ИЭР) 396 (М+Н-Вос+), 496 (М+Н+), 517 (М+№+), 535 (М+К+), 992 (2М+Н+).
Синтез соединения 41.
К раствору соединения 40 (138 мг, 0,28 ммоль) в ЭМЕ (4 мл) добавляли соединение 38 (110 мг, 0,28 ммоль), НОВ! (36 мг, 0,28 ммоль) и ЕЭС (1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид) (50 мг, 0,28 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с использованием в качестве элюента 0,1% ТРА в воде и ацетонитрила с получением желаемого соединения 41 в виде масла (178 мг, 70%).
1Н ЯМР (С1+О1)) δ 1,04, 1,11 (2д, 6Н), 1,40 (с, 9Н), 1,58 (м, 2Н), 1,77 (м, 1Н), 1,88 (м, 1Н), 2,24 (м, 1Н), 2,72, 2,84 (2с, 3Н), 2,92 (с, 3Н), 3,10-3,18 (м, 4Н), 3,35-3,46 (м, 6Н), 3,82 (д, 1Н), 4,22 (т, 1Н), 4,41 (м, 2Н), 4,59 (м, 1Н), 5,04 (ушир.с, 2Н), 7,28-7,40 (м, 6Н), 7,55 (м, 2Н), 7,63 (м, 2Н), 7,78 (д, 2Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 760 (М+Н-Вос+), 804 (М+Н-1 бутил+), 860 (М+Н+), 882 (М+№+), 899 (М+К+).
Синтез соединения 42.
Соединение 42 получали, как описано ранее для соединения 17а, с выходом 98%.
ЖХ-МС (ИЭР) 538 (М+Н-Вос+), 582 (М+Н-1 бутил+), 638 (М+Н+), 660 (\Е\+).
Синтез соединения 43.
К раствору соединения 42 (23 мг, 0,036 ммоль) в дихлорметане (1 мл) при 0°С добавляли СМВ8 (сложный эфир N-(малеимидобутирилокси)сукцинимида) (14 мг, 0,05 ммоль) и диизопропилэтиламин (8,4 мкл, 0,05 ммоль). Смесь медленно нагревали до комнатной температуры и продолжали перемешива
- 82 016577 ние в течение дополнительных 30 мин. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с использованием в качестве элюента 0,1% ΤΡΑ в воде и ацетонитрила с получением желаемого соединения 43 в виде масла (26 мг, 79%).
1Н ЯМР 02Ό3ΟΌ) δ 1,06, 1,12 (2д, 6Н), 1,41 (с, 9Н), 1,59 (м, 2Н), 1,78 (м, 1Н), 1,86-1,93 (м, 3Н), 2,24 (м, 3Н), 2,74, 2,84 (2с, 3Н), 2,93 (ушир.с, 3Н), 3,13-3,22 (м, 4Н), 3,40-3,60 (м, 8Н), 3,82 (д, 1Н), 4,60 (м, 1Н), 5,05 (ушир.с, 2Н), 6,80 (с, 2Н), 7,32 (м, 2Н), 7,57 (д, 2Н), 8,78 (д, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 703 (М+Н-Вос+), 747 (М+Н-ΐ бутил+), 803 (М+Н+), 825 (М+Ж+), 841 (М+К+).
Синтез соединения 44.
Соединение 44 получали, как описано ранее для соединения 15а, с выходом 98%.
ЖХ-МС (ИЭР) 703 (М+Н+), 725 (М+Ж+).
Синтез соединения 45.
К раствору соединения 44 (15 мг, 0,016 ммоль) и соединения 33 (10 мг, 0,016 ммоль) в (0,8 мл) при комнатной температуре добавляли диизопропилэтиламин (5,5 мкл, 0,032 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с использованием в качестве элюента 0,1% ΤΡΑ в воде и ацетонитрила с получением желаемого соединения 45 в виде масла (10 мг, 45%).
1Н ЯМР 0ΡΌ3ΟΌ) δ 1,02-1,13 (м, 6Н), 1,55 (м, 2Н), 1,74 (м, 1Н), 1,84-1,92 (м, 3Н), 2,20-2,27 (м, 3Н), 2,95-3,14 (м, 16Н), 3,47-3,84 (м, 12Н), 3,98 (м, 1Н), 4,2-4,34 (м, 3Н), 4,57 (м, 1Н), 4,69 (м, 2Н), 5,07-5,17 (м, 2Н), 6,78 (с, 2Н), 7,16-7,23 (м, 3Н), 7,30 (м, 1Н), 7,38-7,47 (м, 3Н), 7,52-7,58 (м, 3Н), 7,81-7,92 (м, 2Н), 8,25 (ушир.с, 1Н) ч./млн.
ЖХ-МС (ИЭР) 1194 (М+Н+), 1215 (МА'а), 1233 (М+К+).
Пример 6.
Синтез соединения (2).
Раствор соединения 1 (100 мг, 0,24 ммоль) и 10% Рс1-С (35 мг) в МеОН/СН2С12 (1/2, 10 мл) дегазировали в вакууме в течение 40 с. Полученную смесь помещали в атмосферу водорода и перемешивали при 25°С в течение 7 ч. Реакционную смесь фильтровали через целит (промывая СН2С12). Растворитель удаляли в вакууме. По методу хроматографии на силикагеле, элюируя ЕЮАс/гексанами (2/8), получали соединение 2 (77 мг, 98%).
1Н ЯМР (ДМСО-ф,) δ 10,36 (с, 1Н), 8,04 (д, 1Н, 1=8,2 Гц), 7,72 (д, 1Н, 1=8,2 Гц), 7,61 (ушир.с, 1Н), 7,45 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,261 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 4,06 (м, 4Н), 3,73 (м, 1Н), 1,52 (с, 9Н).
Синтез соединения (4).
Раствор соединения 2 (35 мг, 0,1 ммоль) в 4 М НС1-ЕЮАс (5 мл) перемешивали при 25°С в атмосфере аргона в течение 30 мин. Растворитель удаляли в вакууме. К остатку добавляли 5-ацетилиндон-2карбоновую кислоту (24,4 мг, 0,12 ммоль). Добавляли раствор РОС (22,9 мг, 0,12 ммоль) в (3 мл) и перемешивали реакционную смесь при 25°С в течение 5 ч. Растворитель удаляли. Неочищенный продукт подвергали хроматографии на силикагеле, элюируя 10% МеОН в СН2С12, с получением соединения 4 (40,7 мг, 93%).
1Н ЯМР (ДМСО-ф,) δ 12,13 (с, 1Н), 10,47 (с, 1Н), 8,45 (с, 1Н), 8,10 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,96 (ушир.с, 1Н), 7,85 (д, 2Н, 1=8,4 Гц), 7,54 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,51 (т, 1Н, 1=8,2 Гц), 7,36 (т, 1Н, 1=7,6), 7,35 (с, 1Н), 4,81 (т, 1Н, 11,2 Гц), 4,54 (дд, 1Н, 8,8 Гц), 4,23 (м, 1Н), 4,01 (дд, 1Н, 1=10,2 Гц), 3,86 (дд, 1Н, 1=10,7 Гц), 2,61 (с, 3Н).
Синтез соединения (5).
4-Метил-1-пиперазинкарбонилхлорид (19,9 мг, 0,1 ммоль) добавляли к раствору соединения 4 (20 мг, 0,05 ммоль) и безводного пиридина (25 мкл, 0,3 ммоль) в 3% аллиловом спирте в безводном хлористом метилене (4 мл) и перемешивали смесь в течение 16 ч. Путем очистки неочищенного продукта на силикагеле получали соединение 5 (23,6 мг, 91%).
1Н ЯМР (ДМСО-ф,) δ 12,03 (с, 1Н), 8,41 (с, 1Н), 8,21 (с, 1Н), 8,01 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,88 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,82 (дд, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,58 (т, 1Н, 1=8,1 Гц), 7,51 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,46 (т, 1Н, 1=7,6 Гц), 7,37 (с, 1Н), 4,86 (т, 1Н, 1=10,8 Гц), 4,57 (дд, 1Н, 1=10,8 Гц), 4,38 (м, 1н), 4,06 (дд, 1Н, 1=10,8 Гц), 3,86 (дд, 1Н, Э=11 Гц), 3,41 (ушир., 4Н), 3,29 (ушир., 4Н), 2,82 (с, 3Н), 2,57 (с, 3Н).
Синтез соединения (7).
Раствор соединения 5 (13 мг, 24 мкмоль) и линкера 6 (16,9 мг, 31 мкмоль) в 5% уксусной кислоте в безводном хлористом метилене (1 мл) перемешивали в течение 30 мин при 25°С. Растворитель полностью удаляли в вакууме и очищали по методу ВЭЖХ (колонка 8утте1гуРгер С18, 7 мкм, 19x150 мм) с получением соединения 7 (18,5 мг, 81%). МС: вычисленное С48Н57СШ80ц (М+Н) т/ζ 958,38, найденное 958,10.
- 83 016577
Пример 7.
г идти, цмр, аминобензоат
ΕϋΟ, ΗΟΒί,
1)10% пиперидин
2) ΜΑί-ΡΕΟ,-ΝΗ сложный
1) НВг, этилацетат
2) НАТи, 25,
Синтез соединения 1.
К раствору 2-бромэтиламинбромида (5 г, 24,4 ммоль) в ЭМЕ (50 мл) добавляли диизопропилэтиламин (8,5 мл, 48,8 ммоль) и бензилхлороформиат (3,48 мл, 24,4 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве градиента этилацетата/гексанов (3/7) с получением соединения 1 в виде масла (4 г, 64%).
- 84 016577 !Н ЯМР (СОС13) δ 3,54 (ушир.с, 2Н), 3,61 (ушир.с, 2Н), 5,12 (с, 2Н), 7,36 (м, 5Н).
Синтез соединения 2.
К раствору соединения 1 (3,34 г, 12,99 ммоль) и сложного трет-бутилового эфира валина (3,27 г,
15,59 ммоль) в ОМЕ (50 мл) добавляли карбонат калия (5,39 г, 38,97 ммоль) и йодид калия (2,59 г, 15,59 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при 100°С в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве градиента этилацетата/гексанов (2/8) с получением соединения 2 в виде масла (3,12 г, 69%).
!Н ЯМР (СПС13) δ 0,92 (м, 6Н), 1,46 (с, 9Н), 1,86 (м, 1Н), 2,53 (м, 1Н), 2,80 (м, 2Н), 3,18 (м, 1Н), 3,31 (м, 1Н), 5,10 (с, 2Н), 5,25 (ушир.с, 1Н), 7,36 (м, 5Н)/
ЖХ-МС (ИЭР) 296 (М+Н-! бутил+), 352 (М+Н+).
Синтез соединения 3.
Раствор соединения 2 (3,4 г, 9,72 ммоль) и палладированного угля (200 мг) в метаноле (30 мл) помещали в атмосферу водорода при атмосферном давлении при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Катализатор отфильтровывали и концентрировали реакционную смесь досуха с получением соединения 3 в виде масла (2,1 г, 98%).
!Н ЯМР (С1);О1)) δ 0,94 (м, 6Н), 1,47 (с, 9Н), 1,63 (ушир.с, 2Н), 1,90 (м, 1Н), 2,47 (м, 1Н), 2,73 (м, 2Н).
Синтез соединения 4.
К раствору соединения 3 (2,1 г, 9,72 ммоль) в дихлорметане (30 мл) при 0°С добавляли Етοс-О8и (№(9-флуоренилметоксикарбонилокси)сукцинимид) (3,28 г, 9,72 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали в течение 2 ч при 0°С. Смесь концентрировали досуха, а затем очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве градиента 100% дихлорметана, затем 0,5% метанола в дихлорметане, а затем 1% метанола в дихлорметане с получением соединения 4 в виде бесцветного масла (2,55 г, 60%).
!Н ЯМР (СПС13) δ 1,03 (д, 3Н), 1,14 (д, 3Н), 1,52 (с, 9Н), 2,28 (м, 1Н), 3,14 (м, 2Н), 3,46 (м, 2Н), 3,89 (д, 1Н), 4,24 (м, 1Н), 4,44 (м, 2Н), 7,29 (м, 2Н), 7,40 (м, 2Н), 7,64 (м, 2Н), 7,80 (д, 2Н).
ЖХ-МС (ИЭР) 383 (М+Н-! бутил+), 440 (М+Н+), 462 (М+№+), 478 (М+К+).
Синтез соединения 5.
Раствор соединения 4 (177 мг, 0,4 ммоль) в тетрагидрофуране/воде (3/1, 8 мл) барботировали газообразным НС1 в течение 5 мин. Реакционную смесь перемешивали при 37°С в течение ночи, а затем концентрировали смесь досуха с получением соединения 5 в виде твердого вещества (168 мг, 98%), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
!Н ЯМР (СПС13) δ 1,04 (д, 3Н), 1,14 (д, 3Н), 2,32 (м, 1Н), 3,18 (м, 2Н), 3,46 (м, 2Н), 3,95 (д, 1Н), 4,22 (м, 1Н), 4,42 (м, 2Н), 7,29 (м, 2Н), 7,39 (м, 2Н), 7,64 (м, 2Н), 7,79 (д, 2Н).
ЖХ-МС (ИЭР) 383 (М+Н+), 405 (М+№+).
Синтез соединения 23.
Раствор этил-5-нитроиндол-2-карбоксилата (2 г, 8,5 ммоль) и палладированного угля (200 мг) в 50% метаноле в дихлорметане (100 мл) помещали в атмосферу водорода при атмосферном давлении при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч.
Катализатор отфильтровывали и концентрировали реакционную смесь досуха с получением соединения 23 в виде бесцветного масла (1,68 г, 97%).
!Н ЯМР (С1);О1)) δ 1,38 (т, 3Н), 4,34 (кв, 2Н), 6,86 (дд, 1Н), 6,95 (д, 1Н), 6,98 (д, 1Н), 7,25 (д, 1Н).
Синтез соединения 24.
К раствору соединения 23 (300 мг, 1,47 ммоль) в дихлорметане (5 мл) добавляли ВоС2О (385 мг, 1,76 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали и очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве градиента 10% этилацетата в гексанах с получением соединения 24 в виде белого твердого вещества (272 мг, 61%).
!Н ЯМР (С1);О1)) δ 1,39 (т, 3Н), 1,52 (с, 9Н), 4,37 (кв, 2Н), 7,07 (с, 1Н), 7,23 (дд, 1Н), 7,34 (д, 1Н), 7,68 (ушир.с, 1Н).
Синтез соединения 25.
К раствору соединения 24 (100 мг, 0,33 ммоль) в этаноле (3 мл) добавляли раствор ЫОН (12 мг, 0,49 ммоль) в воде (1 мл). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч при 50°С. Реакционную смесь концентрировали досуха с получением масла. Остаток растворяли в воде и подкисляли до рН 3 добавлением 10% НС1, а затем экстрагировали Ε!ОΑс. Органический раствор сушили над №28О4, фильтровали и концентрировали досуха с получением соединения 25 в виде бесцветного масла (85 мг, 92%).
!Н ЯМР (С1);О1)) δ 1,51 (с, 9Н), 7,07 (д, 1Н), 7,23 (дд, 1Н), 7,33 (д, 1Н), 7,68 (ушир.с, 1Н).
- 85 016577
Синтез соединения 26.
К раствору Етос-Сй-ОН (206 мг, 0,52 ммоль) в растворе 30% ОМЕ в дихлорметане (3 мл) при комнатной температуре добавляли ЕЭС (120 мг, 0,62 ммоль), НОВ! (84 мг, 0,62 ммоль) и трет-бутил-4аминобензоат (120 мг, 0,62 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали в течение 10 мин, а затем добавляли к смеси хлорид меди(1) (84 мг, 0,62 ммоль). Смесь перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали досуха, а затем очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве градиента 5% метанола в дихлорметане с получением соединения 26 в виде бесцветного масла (184 мг, 62%).
Ή ЯМР (СО3ОЭ) δ 1,53-1,58 (м, 2Н), 1,57 (с, 9Н), 1,71 (м, 1Н), 1,82 (м, 1Н), 3,08 (м, 1Н), 3,19 (м, 1Н), 4,21 (м, 1Н), 4,28 (м, 1Н), 4,38 (м, 2Н), 7,28-7,39 (м, 3Н), 7,49 (м, 2Н), 7,56-7,86 (м, 5Н), 7,89 (м, 2Н).
ЖХ-МС (ИЭР), 573 (М+Н+), 595 (М-Ха'), 611 (М+К+).
Синтез соединения 27.
К раствору соединения 26 (1 г, 1,75 ммоль) в ОМЕ (18 мл) при комнатной температуре добавляли пиперидин (2 мл). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь концентрировали досуха, а затем очищали остаток по методу флэш-хроматографии с использованием в качестве градиента 100% дихлорметана, затем 5% метанола в дихлорметане, а затем 20% метанола в дихлорметане с получением бесцветного масла (561 мг, 92%).
К раствору масла (561 мг, 1,6 ммоль) в ОМЕ (10 мл) при комнатной температуре добавляли диизопропилэтиламин (679 мкл, 3,9 ммоль), соединение 5 (509 мг, 1,3 ммоль) (для получения см. 1) и НЛТи (494 мг, 1,3 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь концентрировали досуха, а затем очищали остаток по методу флэш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве градиента 5% метанола в дихлорметане с получением соединения 27 в виде бесцветного масла (691 мг, 65%).
Ή ЯМР (С1);О1)) δ 1,36 (дд, 6Н), 1,58-1,62 (м, 2Н), 1,6 (с, 9Н), 1,71 (м, 1Н), 1,82 (м, 1Н), 2,00 (м, 1Н), 2,65 (м, 2Н), 3,2-3,3 (м, 4Н), 3,70 (м, 1Н), 4,21 (м, 1Н), 4,28 (м, 2Н), 4,38 (м, 2Н), 4,60 (м, 1Н), 7,287,39 (м, 4Н), 7,60-7,70 (м, 4Н), 7,8 (д, 2Н), 7,89 (д, 2Н).
ЖХ-МС (ИЭР), 716 (М+Н+), 737 (М+Ха+), 753 (М+К+).
Синтез соединения 28.
К раствору соединения 27 (300 мг, 0,45 ммоль) в ОМЕ (9 мл) при комнатной температуре добавляли пиперидин (1 мл). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем смесь концентрировали досуха с получением масла, которое извлекали эфиром (20 мл). Материал фильтровали с получением белого твердого вещества (186 мг, 84%).
К раствору свободного амина (32 мг, 0,065 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляли сложный МЛЬРЕС4-ХН эфир (50 мг, 0,097 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 28 в виде масла (47 мг, 95%).
Ή ЯМР (С1);О1)) δ 1,10, 1,15 (2д, 6Н), 1,58-1,62 (м, 2Н), 1,6 (с, 9Н), 1,75 (м, 1Н), 1,90 (м, 1Н), 2,25 (м, 1Н), 2,45 (т, 2Н), 2,5 (т, 2Н), 3,10-3,25 (м, 4Н), 3,30 (м, 2Н), 3,45-3,65 (м, 16Н), 3,75 (м, 4Н), 3,85 (д, 1Н), 4,65 (м, 1Н), 6,80 (с, 2Н), 7,67 (д, 2Н), 7,90 (д, 2Н), 8,80 (д, 1Н), 10,20 (с, 1Н).
ЖХ-МС (ИЭР), 891 (М+Н+), 913 (М+Ха+), 929 (М+К+).
Синтез соединения 29.
К раствору соединения 28 (47 мг, 0,062 ммоль) в дихлорметане (0,5 мл) при комнатной температуре добавляли трифторуксусную кислоту (0,5 мл). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем смесь концентрировали досуха с получением соединения 29 в виде масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (40 мг, 92%).
Ή ЯМР (СО;ОО) δ 1,10, 1,15 (2д, 6Н), 1,60 (м, 2Н), 1,80 (м, 1Н), 1,90 (м, 1Н), 2,25 (м, 1Н), 2,45 (т,
2Н), 2,5 (т, 2Н), 3,10-3,25 (м, 4Н), 3,30 (м, 2Н), 3,45-3,65 (м, 16Н), 3,75 (м, 4Н), 3,85 (д, 1Н), 4,65 (м, 1Н),
6,80 (с, 2Н), 7,67 (д, 2Н), 7,95 (д, 2Н), 8,80 (д, 1Н).
ЖХ-МС (ИЭР), 836 (М+Н+), 858 (М+Ха+), 874 (М+К+).
Синтез соединения 31.
К раствору соединения 30 (100 мг, 0,2 ммоль) в Е!ОЛс (2 мл) при комнатной температуре добавляли концентрированный раствор НВг в Е!ОЛс (3 мл). Спустя 1 ч проводили снятие Вос-защиты. Выпавший в осадок материал фильтровали (количественный выход). Затем ТРЛ-соль амина растворяли в ОМЕ (3 мл). К этому раствору добавляли соединение 25 (55 мг, 0,2 ммоль), диизопропилэтиламин (173 мкл, 1 ммоль) и НЛТи (79 мг, 0,2 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 31 в виде белого твердого вещества (86 мг, 57%).
Ή ЯМР (СО;ОО) δ 1,54 (с, 9Н), 2,91 (с, 3Н), 3,10-3,60 (м, 8Н), 3,72 (м, 1Н), 3,97 (м, 1Н), 4,30-4,60 (м, 3Н), 6,94 (ушир.с, 1Н), 7,05 (м, 1Н), 7,12 (д, 1Н), 7,45 (м, 2Н), 7,68 (д, 1Н), 7,75 (ушир.с, 1Н), 7,86 (д, 1Н), 8,23 (ушир.с, 1Н).
ЖХ-МС (ИЭР), 562 (М+Н-100+), 606 (М+Н-56+), 662 (М+Н+), 685 (М+Ха+), 701 (М+К+).
- 86 016577
Синтез соединения 32.
К раствору соединения 31 (30 мг, 0,039 ммоль) в дихлорметане (0,5 мл) при комнатной температуре добавляли анизол (100 мкл) и трифторуксусную кислоту (0,4 мл). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем смесь концентрировали досуха с получением масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору масла в ЭМЕ (1 мл) добавляли соединение 29 (36 мг, 0,039 ммоль), диизопропилэтиламин (40 мкл, 0,23 ммоль) и НАТи (15 мг, 0,039 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель выпаривали и очищали остаток по методу полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 32 в виде масла (36 мг, 60%).
1Н ЯМР (СОзОО) δ 1,09, 1,15 (2д, 6Н), 1,62 (м, 2Н), 1,81 (м, 1Н), 1,93 (м, 1Н), 2,27 (м, 1Н), 2,45 (т, 2Н), 2,51 (т, 2Н), 2,98 (с, 3Н), 3,13-3,25 (м, 4Н), 3,47-3,62 (м, 24Н), 3,76 (м, 4Н), 3,82 (м, 1Н), 3,85 (д, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,55-4,70 (м, 4Н), 6,79 (с, 2Н), 7,06 (с, 1Н), 7,36 (ушир.с, 1Н), 7,43-7,54 (м, 2Н), 7,72-7,81 (м, 3Н), 7,91 (м, 3Н), 8,05 (с, 1Н), 8,25 (ушир.с, 1Н), 8,82 (д, 1Н), 10,25 (с, 1Н).
ЖХ-МС (ИЭР), 691 (М+2Н+)/2, 1381 (М+Н+), 1419 (М+К+).
Пример 8. Анализ пролиферации.
Биологическая активность цитотоксичных соединений по настоящему изобретению может быть проанализирована в соответствии с общепринятым методом анализа пролиферации с использованием 3Нтимидина. Это удобный метод для количественной оценки клеточной пролиферации, поскольку позволяет провести оценку синтеза ДНК путем измерения включения экзогенного радиоактивно меченного 3Нтимидина. Этот метод анализ надежно воспроизводим и может быть применен к большому количеству соединений.
Для проведения анализа клетки промиелоцитарного лейкоза НЬ-60 культивировали в среде КРМЕ содержавшей 10% инактивированной нагреванием телячьей фетальной сыворотки (РС8). В день проведения исследования клетки собирали, промывали и повторно суспендировали до концентрации 0,5x10 клеток/мл в КРМЕ содержавшей 10% РС8. В 96-луночные планшеты вносили 100 мкл клеточной суспензии. Приготавливали серийные разведения (с 3-кратным увеличением концентрации) доксорубицина (в качестве положительного контроля) или тестируемых соединений и в каждую лунку вносили 100 мкл растворов соединений. Наконец, в каждую лунку добавляли 10 мкл 100 мкКи/мл 3Н-тимидина и инкубировали планшеты в течение 24 ч. Клетки на планшетах собирали с помощью харвестера для 96луночных планшетов (Раскагд ШйгитеШк) и подсчитывали с помощью счетчика Раскагд Тор Соип!. Для определения значений Κ'.'50 при помощи программного обеспечения Рпкт строили четырехпараметрические логистические кривые для включения 3Н-тимидина как функции молярной концентрации лекарственного средства.
В указанном выше методе анализа соединения по настоящему изобретению, как правило, характеризуются значением Юо, составляющим приблизительно от 1 пМ приблизительно до 100 нМ, предпочтительно приблизительно от 10 пМ приблизительно до 10 нМ.
Пример 9. Конъюгирование молекул лекарство-линкер с антителами.
В этом примере описаны условия и методики проведения конъюгации молекулы лекарство-линкер по настоящему изобретению (необязательно содержащей другие группы, такие как спейсеры, реакционноспособные функциональные группы и т.п.) с антителом в качестве агента направленного действия X4. Подразумевается, что условия и методики являются лишь типичными и неограничивающими. Другие подходы к конъюгации молекул лекарство-линкер с антителами известны в данной области техники.
Раскрытый в этом документе способ конъюгации основан на введении свободных тиольных групп в антитело посредством осуществления взаимодействия лизинов антитела с 2-иминотиоланом с последующей реакцией молекулы лекарство-линкер с активной малеимидной группой. Сначала проводили замену буфера для подлежащего конъюгации антитела на 0,1 М фосфатный буфер рН 8,0, содержащий 50 мМ №1С1 и 2 мМ ЭТРА (рН 8,0) и концентрировали до 5-10 мг/мл. Тиолирование проводили путем добавления к антителу 2-иминотиолана. Количество подлежащего добавлению 2-иминотиолана определяли в ходе предварительных экспериментов и варьировали в зависимости от конкретного антитела. В ходе предварительных экспериментов к антителу добавляли титрованием возрастающие количества 2иминотиолана, затем инкубировали с антителом в течение одного часа при комнатной температуре, обессоливали антитело введением в 50 мМ НЕРЕ8-буфер рН 6,0 с помощью колонки 8ерйадех С-25 и быстро определяли количество введенных тиольных групп путем реакции с дитиодипиридином (ВТОР). Реакция тиольных групп с ВТОР приводила к высвобождению тиопиридина, который определяли при 324 нм. Использовали образцы с концентрацией белка 0,5-1,0 мг/мл. Для точного определения концентрации белка в образцах использовали поглощение при 280 нм, а затем инкубировали аликвоту каждого образца (0,9 мл) с 0, 1 мл ВТОР (5 мМ маточный раствор в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Параллельно также инкубировали пустые образцы одного буфера с ВТОР. Через 10 мин измеряли поглощение при 324 нм и определяли количество тиолов на основании коэффициента поглощения для тиопиридина, равного 19800 М-1.
Как правило, желаемым является уровень тиолирования, составляющий три тиольные группы на
- 87 016577 антитело. Например, для одного конкретного антитела это было достигнуто посредством добавления 2иминотиолана в 15-кратном мольном избытке с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Таким образом, подлежащее конъюгации антитело инкубировали с 2-иминотиоланом при желаемом мольном отношении, а затем обессоливали введением в буфер для конъюгации (50 мМ буфер НЕРЕ8 рН 6,0, содержащий 5 мМ глицин, 3% глицерин и 2 мМ ΏΤΡΆ). В процессе определения количества введенных тиолов, как описано выше, тиолированное вещество выдерживали на льду.
После определения количества введенных тиолов добавляли молекулу лекарство-линкер, содержащую активную малеимидную группу, в 3-кратном мольном избытке по отношению к количеству тиольных групп. Реакцию конъюгации проводили в буфере для конъюгации, также содержавшем диметиловый эфир этиленгликоля в конечной концентрации 5% (или подходящий альтернативный растворитель). Как правило, маточный раствор молекул лекарство-линкер растворяли в 90% диметиловом эфире этиленгликоля + 10% диметилсульфоксиде. Для добавления к антителу маточный раствор может быть добавлен непосредственно к тиолированному антителу, содержащему достаточно добавленного диметилового эфира этиленгликоля для доведения конечной концентрации до 5%, или предварительно разведен в буфере для конъюгации, содержащем диметиловый эфир этиленгликоля в конечной концентрации 10%, с последующим добавлением равного объема тиолированного антитела.
Конъюгационную реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании. После инкубации реакционную смесь центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 мин и корректировали значение рН до 7,2 в том случае, если очистку не проводили немедленно. Очистку конъюгата проводили путем хроматографии с использованием ряда методов. Конъюгат может быть очищен по методу эксклюзионной хроматографии с использованием колонки 8ерЕасгу1 8200, предварительно уравновешенной 50 мМ буфером НЕРЕ8 рН 7,2, содержащим 5 мМ глицин, 50 мМ №С1 и 3% глицерина. Хроматографию проводили при линейной скорости элюции 28 см/ч. Содержавшие конъюгат фракции собирали, объединяли и концентрировали. В качестве альтернативы, очистка может быть проведена по методу ионообменной хроматографии. Условия варьируют в зависимости от конкретного антитела и требуют оптимизации в каждом отдельном случае. Например, реакционную смесь конъюгата антитело-лекарство наносили на колонку с 8Р-сефарозой, предварительно уравновешенную 50 мМ НЕРЕ8, 5 мМ глицин, 3% глицерин, рН 6,0. Конъюгат антитела элюировали градиентом 0-1 М ΝίΚΊ в уравновешивающем буфере. Содержавшие конъюгат фракции объединяли, корректировали значение рН до 7,2 и концентрировали образец по необходимости.
Пример 10. Исследования ш у1уо.
А. Лечение при ксенотрансплантации опухолей ш у1уо.
Буфер для каждого из анти-Р8МА (2А10, см. заявку на выдачу патента США № 60/654125 того же заявителя, поданную 18 февраля 2005 года, включенную в этот документ посредством ссылки) и антитела изотипического контроля (анти-СЭ70 1д01 клон 2Н5, (см. заявку на выдачу патента США № 60/720600 того же заявителя, включенную в этот документ посредством ссылки) заменяли на 0,1 М фосфатный буфер рН 8,0, содержащий 50 мМ №С1 и 2 мМ ОТРА и концентрировали до 6 мг/мл. Затем оба антитела тиолировали путем инкубации с 2-иминотиолана в 25-кратном мольном избытке в течение одного часа при комнатной температуре с последующим обессоливанием введением в 0,1 М фосфатный буфер (рН 6,0), содержащий 50 мМ №С1 и 2 мМ буфер ОТРА, с использованием колонки 8ер11ас1ех 0-25. В процессе определения количества введенных тиолов тиолированное антитело выдерживали на льду. Это достигали путем осуществления взаимодействия образца тиолированного антитела с дитиодипиридином (ОТОР). Для определения концентрации белка в образцах измеряли поглощение при 280 нм, а затем инкубировали аликвоту каждого образца (0,9 мл) с 0,1 мл ОТОР (5 мМ маточный раствор в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Параллельно инкубировали пустые образцы одного буфера с ЭТЭР. Измеряли поглощение при 324 нм и определяли количество тиолов на антитело на основании коэффициента поглощения для тиопиридина, равного 19800 М-1. В случае анти-Р8МА было введено 5,3 тиола на антитело, а в случае изотипического контроля - 6,0.
Затем тиолированные антитела инкубировали с соединением А, взятым в 3-кратном мольном избытке по отношению к молярной концентрации тиольных групп.
Соединение А
К тиолированным антителам добавляли 5 мМ маточный раствор соединения А в ОМ8О вместе с
- 88 016577
ВМ8О в количестве, достаточным для доведения конечной концентрации ИМ8О до 10 об.%. После инкубации при комнатной температуре в течение 3 ч увеличивали значение рН инкубационной смеси до 7,0 с использованием триэтаноламина. Затем очищали конъюгаты антитело-соединение А по методу эксклюзионной хроматографии на колонке 8ерйасгу1 8200, предварительно уравновешенной 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,2), содержащим 50 мМ №01 и 5 об.% ИМ8О. Содержавшие мономерный конъюгат фракции собирали и объединяли. Затем полученные очищенные конъюгаты концентрировали в перемешиваемой ячейке в атмосфере азота с использованием мембраны с отсечкой на уровне 10 кДа. Концентрации и отношения замещения (количество молекул лекарства, присоединенных к одной молекуле антитела) конъюгатов определяли по поглощению при 280 нм и 340 нм, относительно ранее измеренных при каждой длине волны коэффициентов поглощения как антитела, так и соединения А.
Противоопухолевую эффективность анти-Р8МА (клон 2А10), конъюгированного с соединением А, испытывали на клетках линии ЕЖз-аР, которая представляла собой ксенотрансплантаты карциномы предстательной железы человека, выращенные в самцах мышей СВ17.8СГО (доступных для приобретения у Тасошс, СеппаШоуп, ΝΥ). Клетки злокачественной опухоли предстательной железы Г^СаР, экспрессирующие высокие уровни Р8МА, получали из АТСС (кат.№ СКЬ-1740) и размножали ΐη νΐΐΐΌ в соответствии с инструкцией АТСС. Самцам мышей СВ17.8СГО в возрасте 8 недель от Тасошс подкожно в правый бок имплантировали 2,5х106 клеток Г^СаР в 0,2 мл РВ8/Ма1пде1 (1/1) на мышь. Мышей взвешивали и измеряли опухоль дважды в неделю в трех измерениях с помощью электронного штангенциркуля, начиная через три недели после имплантации. Объем отдельных опухолей рассчитывали как высотахширинахдлина. Мышей с васкуляризованными опухолями (что определяли по виду опухолей) подходящих размеров распределяли случайным образом на группы лечения и в день 0 вводили лекарство в расчете на индивидуальную массу тела. В течение приблизительно 60 суток после введения наблюдали рост опухоли у мышей, которых забивали в конце исследования. Мышей подвергали эвтаназии, когда опухоли достигали предельного объема (1500 мм3).
Таблица 1
Результаты исследования на ксенотрансплантатах ^СаР
Лечение Доза цитотоксических веществ (мкмоль/кг) N в группе Путь введения Средний объем опухоли в день 1 (мм3)
Носитель - 3 в/б 100
Конъюгат изотипическое ΆΤсоединение А 0,3 3 в/б 100
Конъюгат 2А10- соединение А 0, 3 3 в/б 100
Как показано на фиг. 1, 0,3 мкмоль/кг (относительно количества молей цитотоксина соединения А) конъюгата 2А 10-соединения А вызывали полную регрессию всех трех прижившихся мелких опухолей ЕЖз-аР.
В. Исследование дозовой зависимости эффекта.
Буфер анти-Р8МА (2А10) заменяли на 0,1 М фосфатный буфер рН 8,0, содержавший 50 мМ №£1 и 2 мМ ИТР А, и концентрировали до 5,6 мг/мл. Затем антитело тиолировали путем инкубации с 2иминотиоланом в 7,5-кратном мольном избытке в течение одного часа при комнатной температуре с последующим обессоливанием добавлением в 50 мМ буфер НЕРЕ8 (рН 6,0), содержавший 5 мМ глицин, 2 мМ ВТРА и 3 об.% глицерина, с использованием колонки Зерйабех С-25. В процессе определения количества введенных тиолов тиолированное антитело выдерживали на льду. Это проводили путем осуществления взаимодействия образца тиолированного антитела с дитиодипиридином (ВТОР). Для определения концентрации белка в образцах измеряли поглощение при 280 нм, а затем инкубировали аликвоту каждого образца (0,9 мл) с 0,1 мл ВТОР (5 мМ маточный раствор в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Параллельно инкубировали пустые образцы одного буфера с ВТВР. Измеряли поглощение при 324 нм и определяли количество тиолов на антитело на основании коэффициента поглощения для тиопиридина, равного 19800 М-1.
Затем тиолированное антитело инкубировали с соединением А, взятым в 2-кратном мольном избытке по отношению к молярной концентрации тиольных групп. К тиолированному антителу добавляли соединение А, 5 мМ маточный раствор в 10 об.% ВМ8О/90 об.% диметилового эфира этиленгликоля, параллельно с добавлением диметилового эфира этиленгликоля в количестве, достаточном для доведения конечной концентрации до 5 об.%. После инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч конъюгат антитело-соединение А очищали по методу ионообменной хроматографии. Реакционную смесь наносили на колонку с 8Р-сефарозой, предварительно уравновешенную буфером А (50 мМ НЕРЕ8, 5 мМ глицин, 3 об.% глицерин, рН 6,0). Колонку элюировали буфером А, затем 95% буфером А, 5% буфером В (50 мМ НЕРЕ8, 1 М МН, 5 мМ глицин, 3 об.% глицерин, рН 7,2), а затем снимали конъюгат антитело
- 89 016577 соединение А 10% буфера В + 90% буфера А. Содержавшие мономерный конъюгат фракции собирали и объединяли и корректировали значение рН до 7,2 добавлением моноэтаноламина. Затем полученные очищенные конъюгаты диализовали в 50 мМ НЕРЕ8 (рН 7,2), содержащем 100 мМ ХаС1, 5 мМ глицин, 3 об.% глицерин, концентрировали в перемешиваемой ячейке в атмосфере азота с использованием мембраны с отсечкой на уровне 10 кДа. Концентрации и отношения замещения (количество молекул лекарства, присоединенных к одной молекуле антитела) конъюгатов определяли по поглощению при 280 нм и 340 нм относительно ранее измеренных при каждой длине волны коэффициентов поглощения как антитела, так и соединения А. Конъюгат изотипического контроля (анти-СЭ70 2Н5) получали в соответствии с той же методикой, за исключением того, что снятие конъюгата с ионообменной колонки проводили 15% буфера В +85% буфера А.
Эффективность и избирательность конъюгатов определяли на ксенотрансплантатах карциномы предстательной железы человека ГХСаР, выращенных, как описано выше, в самцах мышей СВ17.8СГО. Постановка этого исследования на ксенотрансплантатах обобщена в табл. 2.
Таблица 2
Обобщение исследования на ксенотрансплантатах РХСаР
Лечение Доза цитотоксичес- ких веществ (мкмоль/кг) N в группе Путь введения Средний объем опухоли в день 1 (мм3)
Носитель - 9 в/б 160
Конъюгат изотипическое АТсоединение А 0,05, 0,15, 0,30, 0, 45, 0, 60, 0, 90 9 в/б 160
Конъюгат 2А10- соединение А 0,05, 0,15, 0,30, 0,45, 0,60, 0,90 9 в/б 160
Как показано в табл. 2 и на фиг. 2, 3, конъюгат анти-Р8МА-соединение А (0,15 мкмоль/кг; фиг. 2) характеризовался более высокой противоопухолевой эффективностью, чем конъюгат изотипический контроль-соединение А (0,90 мкмоль/кг), что свидетельствует, по крайней мере, о его более чем 6кратной избирательности (фиг. 3). Конъюгат анти-РЭМА-соединение А (0,90 мкмоль/кг) характеризовались лишь транзиторной токсичностью (фиг. 5) и не достигал максимальной переносимой дозы. Таким образом, у несущих опухоль ^NСаР мышей для конъюгата анти-Р8МА-соединение А был выявлен более чем 6-кратный терапевтический индекс.
С. Эффективность в отношении крупных опухолей.
Буфер анти-Р8МА (2А10) меняли на 0,1 М фосфатный буфер рН 8,0, содержавший 50 мМ Νί^Ί и 2 мМ ЭТРА и концентрировали до 5,6 мг/мл. Затем антитело тиолировали путем инкубации с 2иминотиоланом в 9-кратном мольном избытке в течение одного часа при комнатной температуре с последующим обессоливанием в 50 мМ буфере НЕРЕ8 (рН 6,0), содержавшем 5 мМ глицин, 2 мМ ЭТРА и 3 об.% глицерина, с использованием колонки 8ерЬабех С-25. В процессе определения количества введенных тиолов тиолированное антитело выдерживали на льду. Это проводили путем осуществления взаимодействия образца тиолированного антитела с дитиодипиридином (1)Т1)Р). Для определения концентрации белка в образцах измеряли поглощение при 280 нм, а затем инкубировали аликвоту каждого образца (0,9 мл) с 0,1 мл 1)Т1)Р (5 мМ маточный раствор в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Параллельно инкубировали пустые образцы одного буфера с 1)Т1)Р. Измеряли поглощение при 324 нм и определяли количество тиолов на антитело на основании коэффициента поглощения для тиопиридина, равного 19800 М-1.
Затем тиолированное антитело инкубировали с соединением А, взятым в 2-кратном мольном избытке по отношению к молярной концентрации тиольных групп. К тиолированному антителу добавляли соединение А, 5 мМ маточный раствор в 10 об.% ЭМ80/90 об.% диметилового эфира этиленгликоля, параллельно с добавлением диметилового эфира этиленгликоля в количестве, достаточном для доведения конечной концентрации до 5 об.%. После инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч конъюгат антитело-соединение А очищали по методу ионообменной хроматографии. Реакционную смесь наносили на колонку с 8Р-сефарозой, предварительно уравновешенную 50 мМ НЕРЕ8, 5 мМ глицин, 3 об.% глицерин, рН 6,0 (буфером А). Колонку элюировали буфером А, затем 95% буфером А, 5% буфером В (50 мМ НЕРЕ8, 1 М ΝιΟ, 5 мМ глицин, 3 об.% глицерин, рН 7,2), а затем снимали конъюгат антитело-соединение А 10% буфера В + 90% буфера А. Содержавшие мономерный конъюгат фракции собирали и объединяли и корректировали значение рН до 7,2 добавлением моноэтаноламина. Затем полученные очищенные конъюгаты диализовали в 50 мМ НЕРЕ8 (рН 7,2), содержащем 100 мМ ΝίΚΊ, 5 мМ глицин, 3 об.% глицерина, концентрировали в перемешиваемой ячейке в атмосфере азота с использованием мембраны с отсечкой на уровне 10 кДа. Концентрации и отношения замещения (количество молекул лекарства, присоединенных к одной молекуле антитела) конъюгатов определяли по поглощению при 280 нм и 340 нм относительно ранее измеренных при каждой длине волны коэффициентов поглощения как
- 90 016577 антитела, так и соединения А. Конъюгат изотипического контроля (анти-СЭ70 2Н5) получали в соответствии с той же методикой, за исключением того, что снятие конъюгата с ионообменной колонки проводили 15% буфера В + 85% буфера А.
Эффективность и избирательность конъюгатов определяли на ксенотрансплантатах карциномы предстательной железы человека ГХСаР, выращенных, как описано выше, в самцах мышей СВ17.БСП). Постановка этого исследования на ксенотрансплантатах обобщена в табл. 3 и 4.
Таблица 3
Обобщение исследования на ксенотрансплантатах 1 ХСаР
Лечение Доза цитотоксических веществ (мкмоль/кг) N в группе Путь введения Средний объем опухоли в день 1 (мм3)
Носитель - 8 в/в 240
Конъюгат изотипическое АТ-соединение А 0, 15 8 в/в 240
Конъюгат 2А10- соединение А 0, 15 8 в/в 240
Как показано в табл. 3 и на фиг. 6, единичная низкая доза (0,15 мкмоль/кг) конъюгата анти-РБМАсоединение А сильно ингибировала рост прижившихся крупных опухолей РХСаР, средний размер которых составлял 240 мм3. Напротив, 0,15 мкмоль/кг конъюгата изотипический контроль-соединение А характеризовались минимальной противоопухолевой эффективностью. Как показано в табл. 4 и на фиг. 7, единичная доза (0,30 мкмоль/кг) конъюгата анти-РБМА-соединение А вызывала регрессию и ингибировала рост весьма крупных опухолей РХСаР, средний размер которых составлял 430 мм3.
Таблица 4
Обобщение исследования на ксенотрансплантатах ΡΝίΧΡ
Лечение Доза цитотоксических веществ (мкмоль/кг) N в группе Путь введения Средний объем опухоли в день 1 (мм3)
Носитель - 6 в/б 430
Конъюгат 2А10- соединение А 0,15, 0,30, 0,45 6 в/б 430
Пример 11. Испытания ΐη νίνο.
В основном в соответствии с приведенными выше примерами получали следующие образцы.
Группа
Испытуемые вещества
Изотипический контроль 1дС1
Анти-СЭ70 антитело (С070.1)
Дефукозилированное анти-СО70 антитело (СЭ70.1 й£)
Конъюгированное с токсином 1 анти-СЭ70 антитело (С070.1Конц.
5,00
5,00
5,30
3,00
Отношение замещения
1,7
Хранение
4°С
4°С
4°С
-80°С токсин 1)
Конъюгированное с токсином 1 дефукозилированное анти-СО70
2,98
1,7
-80°С антитело (СБ70.1 с1£-токсин 1)
Конъюгированное с токсином 2 анти-СО70 антитело (СО70.12,50
-80°С токсин 2)
- 91 016577
Токсин 1
^γ-ΝΗ2 о
Токсин 2
От здоровых доноров-добровольцев получали пять (5) свежесобранных образцов светлого слоя кровяного сгустка. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) очищали центрифугированием в градиенте в соответствии с методикой Р1со11-Рацие® р1ик (Ке£ 07907, 8!етСе11 ТесРпо1од1ек, Меу1ап, Егапсе). Перед проведением РАС8-анализа, а также перед инъекцией т νινί), оценивали жизнеспособность РВМС-клеток по высвобождению 0,25% трипанового синего. Анализировали пять указанных в следующей таблице СЭ-маркеров.
Антиген Основная экспрессия антигена
СЭЗ Т-лимфоциты
СЭ14 Моноциты, макрофаги, клетки Лангерганса
СМбЬ Только нейтрофильные гранулоциты
СЭ20 Субпопуляция предшественников В-лимфоцитов, Влимфоциты
СО56 ΝΚ-клетки, субпопуляция Т-лимфоцитов
Использовали два различных образца РВМС, первый для групп 1-3 (исследование голых антител), а второй для групп 4-6 (исследование конъюгированных с токсинами антител). Критериями отбора являлись общее количество клеток, наивысший процент СО56 и жизнеспособность клеток.
Опухоли индуцировали путем подкожной инъекции 5х10б клеток 786-О в 200 мкл КРМ1 1640 в правый бок 78 мышей \О1)-8СП). Методом РАС8 с использованием того же антитела, что и используемое в этих экспериментах т νινί), было показано, что эти клетки 786-О экспрессируют антиген-мишень СП70. Лечение начинали, когда средний объем опухолей достигал 80 мм3 (около 15 суток). Перед началом лечения 48 несущих опухоль мышей из 78 привитых делили случайным образом на 6 групп по 8 животных. Средний объем опухолей в каждой группе был аналогичным и статистически значимо не отличался от других групп (по данным дисперсионного анализа). Разделенные случайным образом 48 мышей получали единичную в/б инъекцию образца РВМС человека в количестве 3,6х107 клеток на мышь (что соответствовало 4,81х106 СЭ56-положительных клеток на мышь) для групп 1-3 и 4,5х107 клеток на мышь (что соответствовало 4,79х106 СЭ56-положительных клеток на мышь) для групп 4-6.
- 92 016577
Схема лечения представляла собой следующее.
Группа Число мышей Лечение Дозировка (мг/кг /ин) Объем дозы (мл) (мышь 25 г) Путь введения Схема лечения
1 8 Изотипический контроль 1дС1 15 0,250 в/б φ4Ωχ
2 8 Анти-СО70 антитело 15 0,250 в/б φ4ϋχ
3 8 Дефукозилированное анти-СЭ70 антитело 15 0,250 в/б <24βχ
4 8 СО70.1-токсин 1 0, 3 0,226 в/в ζ)14βχ2
5 8 СО70.1 бГ-токсин 1 0,3 0,424 в/в ςΐ4ϋχ2
6 8 С070.1-токсин 2 0, 3 0, 085 в/в единич.
Мыши из группы 1 получали неоднократные в/б инъекции изотипического контроля 1дС1 в дозировке 15 мг/кг/ин. в соответствии со схемой Ρ4Όχ.
Мыши из группы 2 получали неоднократные в/б инъекции анти-СЭ70 антитела в дозировке 15 мг/кг/ин. в соответствии со схемой Ρ4Όχ.
Мыши из группы 3 получали неоднократные в/б инъекции дефукозилированного анти-СЭ70 антитела в дозировке 15 мг/кг/ин. в соответствии со схемой Ρ4Όχ.
Мыши из группы 4 получали неоднократные в/в инъекции конъюгированного с токсином 1 антиСЭ70 антитела в соответствии со схемой Ρ14ϋχ2.
Мыши из группы 5 получали неоднократные в/в инъекции конъюгированного с токсином 1 дефукозилированного анти-СЭ70 антитела в соответствии со схемой Ρ14ϋχ2.
Мыши из группы 6 получали единичную в/в инъекцию конъюгированного с токсином 2 анти-СЭ70 антитела.
На фиг. 8 проиллюстрировано изменение размера опухоли по ходу испытания. Каждый конъюгированный с антителом токсин приводил к уменьшению размера опухоли, особенно по сравнению с ростом в отсутствии какого-либо токсина. На фиг. 9 проиллюстрировано изменение массы тела по ходу испытания.
Каждые из заявок на выдачу патента, патентов, публикаций и других опубликованных документов, упомянутых или ставших предметом ссылки в этом документе, включены в него посредством ссылки во всей своей полноте в такой же степени, как если бы каждая отдельная заявка на выдачу патента, патент, публикация и другой опубликованный документ были особо и отдельно указаны для включения посредством ссылки.
Хотя настоящее изобретение было раскрыто со ссылкой на свои конкретные примеры осуществления, специалистам в данной области техники очевидно, что различные изменения могут быть внесены, а различные эквиваленты могут быть использованы в качестве замены, без выхода за пределы истинной сущности и объема изобретения и прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, для приспособления к конкретным ситуации, веществу, композиции вещества, способу, стадии или стадиям способа, к цели, сущности и объему настоящего изобретения могут быть внесены многие модификации. Подразумевается, что все такие модификации подпадают под объем прилагаемой к настоящему описанию формулы изобретения.
- 93 016577
Список последовательностей <110> Мебагех, 1пс.
Воус1, ЗИагоп ΕΙθίηβ
Спел, Шапд
Оапдм/аг, Загцееу
Оиег1ауа13, νίηοβηί
Ногдап, КИПап
Зий, ВИа!
<120> КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВО И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ <130> 2203448-/Λ/Ο0 <150> 60/720,499 <151 >2005-09-26 <160>7 <170> Ра!еп11п уег. 3.3 <210> 1 <211> 4 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид) <400> 1
А1а 1_еи А1а 1_еи <210> 2 <211> 4 <212> РПТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид) <220>
<221 > ΜΟϋ_ΗΕ5 <222> (1) <223> Ве1а-А1а <400> 2
А1а Ьеи А1а 1_еи <210> 3 <211>4 <212> РПТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид) <400> 3
О1у РЬе !_еи С1у
- 94 016577 <210 4 <211> 4 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид) <400> 4
Рго Агд РКе 1_у5 <210>5 <211> 4 <212> ΡΒΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид) <400 5
Тпг Агд 1_еи Агд <210>6 <211> 4 <212> ΡΒΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид) <400> б
5ег 1_уз 61у Агд <210>7 <211> 4 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид) <400 7
Рго Азп Азр Ьуз

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат антитело-лекарство, содержащий антитело, обладающее специфичностью в отношении по крайней мере одного типа опухолей;
    где X представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΚ23;
    Ζ представляет собой элемент конструкции, выбранный из О и ΝΚ23;
    К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
    К1 представляет собой Н или замещенный или незамещенный С1-С6-алкил;
    К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил, или незамещенный С1-С6гетероалкил, или циано, или алкокси;
    К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенный С1-С6-алкил или незамещенный С1-С6гетероалкил;
    К23 представляет собой радикал, выбранный из Н и замещенного или незамещенного С1-С10-алкила;
    К3 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из (=О) и ОК11, где К11 представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила, С(О)К12, С(О)ОК12, С(ОЖ12К13 и С(О)СНК12К13, где К12 и К13 представляют собой радикалы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила, замещенного или незамещенного С1-С10-гетероалкила, содержащего по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, Ν, 8ί и 8; К12 и К13 необязательно образуют вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, содержащую от 4 до 6 атомов и необязательно содержащую два или несколько гетероатомов;
    К4 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного С1-С10-алкила, незамещенного С1-С10-алкила, ΝΗ^5, Ν^Θ)^5, С(О)К15, ОК15 и О(СН2ШСНэ)2, и равно целому числу от 1 до 20;
    К15 выбирают из Н, замещенного или незамещенного С1-С10-алкила и замещенного или незамещенного пептидила;
    К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и при ее наличии К6 и К7 образуют вместе циклопропильное кольцо и
    К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, объединенные в упомянутом циклопропильном кольце с К6; 1
    X1 представляет собой галоген;
    линкер, связывающий лекарство и антитело, где линкер является расщепляемым в присутствии опухоли;
    по крайней мере один из К11, К12, К13 или К15 связан с линкером или лекарство представляет собой его фармацевтически приемлемую соль;
    где конъюгат антитело-лекарство замедляет или подавляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 1 мкмоль/кг или менее.
  2. 2. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство замедляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 1 мкмоль/кг или менее, в течение по крайней мере пяти суток.
  3. 3. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где опухоль представляет собой свойственную человеку опухоль у 8СГО-мыши.
  4. 4. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство замедляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 0,6 мкмоль/кг или менее, в течение по крайней мере пяти суток.
  5. 5. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство замедляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 0,3 мкмоль/кг или менее, в течение по крайней мере пяти суток.
  6. 6. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство замедляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 0,15 мкмоль/кг или менее, в течение
    - 96 016577 по крайней мере пяти суток.
  7. 7. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство подавляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 1 мкмоль/кг или менее, в течение по крайней мере пяти суток.
  8. 8. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство подавляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 0,6 мкмоль/кг или менее, в течение по крайней мере пяти суток.
  9. 9. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство подавляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 0,3 мкмоль/кг или менее, в течение по крайней мере пяти суток.
  10. 10. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство подавляет рост опухоли при введении в количестве, соответствующем суточной дозировке 0,15 мкмоль/кг или менее, в течение по крайней мере пяти суток.
  11. 11. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где линкер содержит гидразиновый фрагмент, расщепляемый в присутствии опухоли.
  12. 12. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где линкер содержит полипептид, расщепляемый в присутствии опухоли.
  13. 13. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где опухоль представляет собой карциному.
  14. 14. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где опухоль представляет собой карциному предстательной железы.
  15. 15. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство выбирают из
    - 97 016577 где ЛЬ представляет собой антитело;
    X1 представляет собой С1 или Вг;
    РЕО представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля.
  16. 16. Конъюгат антитело-лекарство по п.1, где конъюгат антитело-лекарство выбирают из
    - 98 016577 где ЛЬ представляет собой антитело.
  17. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитело-лекарство по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
  18. 18. Способ лизиса опухолевой клетки, включающий введение в указанную опухолевую клетку количества конъюгата антитело-лекарство по п.1, достаточного для лизиса упомянутой клетки.
  19. 19. Способ замедления или подавления роста опухоли у млекопитающего, включающий введение упомянутому млекопитающему количества конъюгата антитело-лекарство по п.1, достаточного для замедления или подавления роста.
  20. 20. Соединение, выбранное из
    - 99 016577
    - 100 016577 где г представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 24.
EA200800952A 2005-09-26 2006-09-26 Конъюгаты антитело-лекарство и их применение EA016577B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72049905P 2005-09-26 2005-09-26
PCT/US2006/037793 WO2007038658A2 (en) 2005-09-26 2006-09-26 Antibody-drug conjugates and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800952A1 EA200800952A1 (ru) 2009-02-27
EA016577B1 true EA016577B1 (ru) 2012-06-29

Family

ID=37900452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800952A EA016577B1 (ru) 2005-09-26 2006-09-26 Конъюгаты антитело-лекарство и их применение

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20080279868A1 (ru)
EP (2) EP2354163A3 (ru)
JP (1) JP5290756B2 (ru)
KR (1) KR101377373B1 (ru)
CN (1) CN101312748A (ru)
AU (1) AU2006294554B2 (ru)
BR (1) BRPI0617546A2 (ru)
CA (1) CA2623652C (ru)
EA (1) EA016577B1 (ru)
ES (1) ES2416136T3 (ru)
HK (1) HK1117410A1 (ru)
IL (1) IL190187A (ru)
NO (1) NO20081974L (ru)
NZ (1) NZ566982A (ru)
WO (1) WO2007038658A2 (ru)
ZA (1) ZA200803153B (ru)

Families Citing this family (141)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002092771A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US20050215472A1 (en) 2001-10-23 2005-09-29 Psma Development Company, Llc PSMA formulations and uses thereof
ES2559002T3 (es) 2001-10-23 2016-02-10 Psma Development Company, L.L.C. Anticuerpos contra PSMA
US8877901B2 (en) * 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
EA013327B1 (ru) 2005-08-24 2010-04-30 Иммуноджен, Инк. Способ приготовления очищенных конъюгатов лекарственных средств
KR20080056167A (ko) 2005-09-26 2008-06-20 메다렉스, 인코포레이티드 씨디70에 대한 인간 모노크로날 항체
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2007067991A2 (en) 2005-12-08 2007-06-14 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to o8e
SI1957539T1 (sl) 2005-12-08 2013-05-31 Medarex, Inc. Humana monoklonska protitelesa proti protein tirozin kinazi 7 (PTK7) in njihova uporaba
CA2672468A1 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd70 and uses thereof
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
MX338185B (es) 2007-01-25 2016-04-05 Dana Farber Cancer Inst Inc Uso de anticuerpos anti-egfr en el tratamiento de enfermedad mediada por egfr mutante.
CA2678514A1 (en) 2007-02-21 2008-08-28 Medarex, Inc. Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
CA2680854C (en) 2007-03-15 2017-02-14 Ludwig Institute For Cancer Research Treatment method using egfr antibodies and src inhibitors and related formulations
US20110045007A1 (en) * 2007-05-31 2011-02-24 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
US9901567B2 (en) 2007-08-01 2018-02-27 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
MX2010001757A (es) 2007-08-14 2010-09-14 Ludwig Inst Cancer Res Anticuerpo monoclonal 175 que activa el receptor egf y derivados y usos del mismo.
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
BRPI0816014A8 (pt) 2007-10-01 2018-06-19 Bristol Myers Squibb Co anticorpo humano monoclonal isolado, composição, conjugado anticorpo-molécula parceiro, mólecula isolada de ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, método para preparar um anticorpo anti-mesotelina, método de inibição do crescimento de uma célula tumoral expressando a mesotelina, método de tratamento do câncer em um indivíduo, anticorpo anti-mesotelina isolado, e método de inibir o crescimento de uma célula expressando a mesotelina
AU2008334063A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Anti-B7H4 monoclonal antibody-drug conjugate and methods of use
WO2009073546A2 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 Medarex, Inc. Monoclonal antibody partner molecule conjugates directed to protein tyrosine kinase 7 (ptk7)
KR20100101122A (ko) * 2007-11-30 2010-09-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-ｒｇ-１ 항체의 접합체
US20090148535A1 (en) * 2007-12-06 2009-06-11 Minerva Biotechnologies Corporation Method for treating cancer using interference rna
CA2721169A1 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Proscan Rx Pharma Inc. Prostate specific membrane antigen antibodies and antigen binding fragments
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
PT2326350E (pt) 2008-09-08 2013-12-10 Psma Dev Company L L C Compostos para matar células cancerosas resistentes a taxano, que expressam psma
JP5677970B2 (ja) * 2008-11-03 2015-02-25 シンタルガ・ビーブイ 新規ｃｃ−１０６５類似体およびその複合体
WO2010055950A1 (ja) * 2008-11-17 2010-05-20 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 癌間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性化合物との複合体による新規の癌ターゲティング治療
HUE060624T2 (hu) 2009-02-13 2023-04-28 Immunomedics Inc Sejten belüli hasítható kötést tartalmazó immunkonjugátumok
PT2403878T (pt) 2009-03-05 2017-09-01 Squibb & Sons Llc Anticorpos completamente humanos específicos a cadm1
CN102448500A (zh) 2009-06-03 2012-05-09 免疫基因公司 轭合方法
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
NZ598962A (en) 2009-09-16 2014-12-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
UA112291C2 (uk) 2010-04-21 2016-08-25 Синтарґа Б.В. Кон'югати аналогів cc-1065 і біфункціональні лінкери
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
CA2813411C (en) 2010-11-05 2016-08-02 Rinat Neuroscience Corporation Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
DK2668210T3 (da) 2011-01-26 2020-08-24 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antistoffer og anvendelser deraf
EP2691155B1 (en) 2011-03-29 2018-11-14 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
EP3539982B1 (en) 2011-12-23 2025-02-19 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
CA2861124A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
PE20141791A1 (es) 2012-02-13 2014-11-19 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de enediino, conjugados de los mismos y sus usos y metodos
ES2887208T3 (es) * 2012-05-15 2021-12-22 Concortis Biosystems Corp Conjugados de fármacos y usos de los mismos
KR102557309B1 (ko) 2012-05-15 2023-07-20 씨젠 인크. 자가-안정화 링커 접합체
US9504756B2 (en) 2012-05-15 2016-11-29 Seattle Genetics, Inc. Self-stabilizing linker conjugates
EP2867255B1 (en) 2012-06-27 2017-07-19 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the selection and production of tailor-made, selective and multi-specific therapeutic molecules comprising at least two different targeting entities and uses thereof
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
KR20150023889A (ko) 2012-06-27 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도
UY34887A (es) 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
CN102742580B (zh) * 2012-07-16 2014-04-02 广东省农业科学院植物保护研究所 醌霉素a制剂及其制备方法与应用
NZ630363A (en) 2012-07-25 2018-09-28 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
SG10201702737TA (en) 2012-10-04 2017-05-30 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
CA2884299A1 (en) * 2012-10-24 2014-05-01 Polytherics Limited Novel drug-protein conjugates
NO2789793T3 (ru) * 2012-10-24 2018-01-27
CN105121421B (zh) * 2012-11-05 2020-10-02 辉瑞公司 司普力西欧他汀类似物
CA2893977C (en) * 2012-12-21 2024-02-13 Seattle Genetics, Inc. Anti-ntb-a antibodies and related compositions and methods
BR112015019432A2 (pt) 2013-02-14 2017-08-22 Bristol Myers Squibb Co Compostos de tubulisina, métodos de produção e uso
PL2968440T3 (pl) 2013-03-15 2019-12-31 Zymeworks Inc. Związki cytotoksyczne i antymitotyczne oraz sposoby ich stosowania
EP2976362B1 (en) 2013-03-19 2019-10-23 Beijing Shenogen Pharma Group Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
CA2919583C (en) 2013-07-31 2018-09-11 Rinat Neuroscience Corp. Engineered polypeptide conjugates
CA2935077C (en) 2013-12-27 2022-03-15 Geoffrey C. Winters Sulfonamide-containing linkage systems for drug conjugates
KR20220045075A (ko) 2014-01-10 2022-04-12 비온디스 비.브이. 자궁내막암의 치료에서 사용하기 위한 듀오카르마이신 adc
US10266606B2 (en) 2014-01-10 2019-04-23 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Method for purifying Cys-linked antibody-drug conjugates
MX368396B (es) 2014-01-10 2019-10-01 Synthon Biopharmaceuticals Bv Conjugados de anticuerpo-farmaco (adc) de duocarmicina que muestran actividad antitumoral in vivo mejorada.
CN114671954A (zh) * 2014-01-10 2022-06-28 博笛生物科技有限公司 靶向her2阳性肿瘤的化合物和组合物
HUE043427T2 (hu) 2014-01-27 2019-08-28 Pfizer Bifunkciós citotoxikus szerek
EA201691589A1 (ru) 2014-03-20 2017-02-28 Бристол-Маерс Сквибб Компани Стабилизированные основанные на фибронектине каркасные молекулы
TN2016000472A1 (en) 2014-04-25 2018-04-04 Pf Medicament Igf-1r antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer.
ES2764110T3 (es) 2014-04-25 2020-06-02 Pf Medicament Conjugado anticuerpo-fármaco y su utilización para el tratamiento del cáncer
PT3134127T (pt) 2014-04-25 2020-04-09 Rinat Neuroscience Corp Conjugados de anticorpo-fármaco com alta carga de fármaco
DK3151865T3 (da) * 2014-05-22 2021-10-25 Byondis Bv Stedsspecifik konjugation af linker medicin til antistof og resulterende adcs
PT3151921T (pt) 2014-06-06 2019-11-21 Bristol Myers Squibb Co Anticorpos contra recetor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticoide e utilizações dos mesmos
KR102062025B1 (ko) 2014-06-30 2020-01-03 타베다 세라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화된 콘주게이트 및 입자 및 그것의 제형
PT3191502T (pt) 2014-09-11 2021-08-26 Seagen Inc Entrega direcionada de fármacos contendo uma amina terciária
CA2960899C (en) 2014-09-17 2021-08-17 Zymeworks Inc. Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
ES2807182T3 (es) 2014-11-21 2021-02-22 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos frente a CD73 y sus usos
CN107250157B (zh) 2014-11-21 2021-06-29 百时美施贵宝公司 包含修饰的重链恒定区的抗体
WO2016086036A2 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods and compositions for 18f-radiolabeling of biologics
ES2981335T3 (es) 2014-11-25 2024-10-08 Bristol Myers Squibb Co Novedosos polipéptidos de unión a PD-L1 para obtención de imágenes
JP6752204B2 (ja) 2014-12-03 2020-09-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド 四級アミン化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
PL3233912T3 (pl) 2014-12-19 2021-12-27 Regenesance B.V. Przeciwciała, które wiążą ludzkie c6 oraz ich zastosowania
EP3245207B1 (en) 2015-01-14 2019-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Heteroarylene-bridged benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
JP6782250B2 (ja) 2015-03-20 2020-11-11 ファイザー・インク Ｃｔｉファーマコフォアを含有する二官能性細胞毒性剤
JP7573262B2 (ja) * 2015-07-12 2024-10-25 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ． 細胞結合分子の共役のための架橋連結体
JP6772199B2 (ja) * 2015-08-11 2020-10-21 コヒレント バイオファーマ 多リガンド−薬物複合体及びその使用
EP3733698A1 (en) 2015-09-23 2020-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Glypican-3 binding fibronectin based scafflold molecules
KR101704379B1 (ko) * 2015-10-27 2017-02-08 (주)알테오젠 항체-약물 접합체 및 그 제조방법
WO2017075495A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Tarveda Therapeutics, Inc. Sstr-targeted conjugates and particles and formulations thereof
SG11201803817PA (en) 2015-11-19 2018-06-28 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
TWI726942B (zh) 2015-11-30 2021-05-11 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
SG10202010590UA (en) 2015-12-04 2020-12-30 Seattle Genetics Inc Conjugates of quaternized tubulysin compounds
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
MX2018010473A (es) 2016-03-04 2018-09-28 Squibb Bristol Myers Co Terapia de combinacion con anticuerpos anti cumulo de diferenciacion 73 (cd73).
JP7016323B2 (ja) 2016-06-01 2022-02-21 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｐｄ－ｌ１結合ポリペプチドを用いるｐｅｔ造影
US10994033B2 (en) 2016-06-01 2021-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18F-radiolabeled biologics
CA3030765A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against tim3 and uses thereof
EA201990470A1 (ru) 2016-08-09 2019-09-30 Сиэтл Дженетикс, Инк. Конъюгаты лекарственного средства с самостабилизирующимися линкерами, имеющие улучшенные физико-химические свойства
EP3500574B1 (en) 2016-08-19 2021-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of making and use
WO2018075600A1 (en) 2016-10-18 2018-04-26 Seattle Genetics, Inc. Targeted delivery of nicotinamide adenine dinucleotide salvage pathway inhibitors
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
WO2018151821A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
MX2019012017A (es) 2017-04-07 2020-02-12 Juno Therapeutics Inc Celulas modificadas que expresan antigeno de membrana especifico de prostata (psma) o una forma modificada del mismo y metodos relacionados.
JP7425606B2 (ja) 2017-04-27 2024-01-31 シージェン インコーポレイテッド 四級化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドサルベージ経路阻害剤コンジュゲート
US11339218B2 (en) 2017-05-10 2022-05-24 Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies against LAG3 and uses thereof
US20200299400A1 (en) 2017-05-25 2020-09-24 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US11364303B2 (en) 2017-09-29 2022-06-21 Pfizer Inc. Cysteine engineered antibody drug conjugates
US11230601B2 (en) 2017-10-10 2022-01-25 Tilos Therapeutics, Inc. Methods of using anti-lap antibodies
KR20200108870A (ko) 2018-01-12 2020-09-21 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tim3에 대한 항체 및 그의 용도
AU2019236865A1 (en) 2018-03-23 2020-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
CR20200450A (es) 2018-04-02 2021-02-11 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-trem-l y usos de los mismos
US11485741B2 (en) 2018-04-24 2022-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (TLR7) agonists
EP3841124A4 (en) 2018-06-29 2022-03-23 ApitBio, Inc. ANTI-L1CAM ANTIBODIES AND THEIR USES
US11857638B2 (en) 2018-07-27 2024-01-02 Promega Corporation Quinone-containing conjugates
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
US11130802B2 (en) 2018-10-10 2021-09-28 Tilos Therapeutics, Inc. Anti-lap antibody variants
CN113348177A (zh) 2018-11-28 2021-09-03 百时美施贵宝公司 包含经修饰的重链恒定区的抗体
WO2020117627A1 (en) 2018-12-03 2020-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ido antibody and uses thereof
CN109762067B (zh) 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
KR20230128134A (ko) 2019-01-22 2023-09-01 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-7r 알파 서브유닛에 대한 항체 및 이의 용도
CN114174536A (zh) 2019-07-15 2022-03-11 百时美施贵宝公司 抗trem-1抗体及其用途
CN118546253A (zh) 2019-07-15 2024-08-27 百时美施贵宝公司 针对人trem-1的抗体及其用途
KR20220150274A (ko) 2020-01-13 2022-11-10 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Il-7 단백질과 이중특이적 항체의 조합물을 사용한 종양의 치료 방법
WO2021170020A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Antibodies binding il4r and uses thereof
EP4132971A1 (en) 2020-04-09 2023-02-15 Merck Sharp & Dohme LLC Affinity matured anti-lap antibodies and uses thereof
CN112608364B (zh) * 2020-12-09 2023-08-29 四川瀛瑞医药科技有限公司 一种果胶-阿霉素轭合物及其中间体的制备方法
CN114685669A (zh) 2020-12-30 2022-07-01 和铂医药(苏州)有限公司 结合trop2的抗体及其用途
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
AU2022364888A1 (en) 2021-10-14 2024-05-30 Latticon (Suzhou) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Novel antibody-cytokine fusion protein, preparation method therefor and use thereof
WO2023173393A1 (zh) 2022-03-18 2023-09-21 北京天广实生物技术股份有限公司 结合b7-h3的抗体及其用途
TW202434311A (zh) 2023-02-09 2024-09-01 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 自穩定連接子軛合物
TW202438114A (zh) 2023-03-23 2024-10-01 瑞士商百濟神州瑞士有限責任公司 生物活性結合物、其製備方法及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004032828A2 (en) * 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
US6759509B1 (en) * 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
WO2005112919A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Medarex, Inc. Self-immolative linkers and drug conjugates

Family Cites Families (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4169888A (en) * 1977-10-17 1979-10-02 The Upjohn Company Composition of matter and process
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4978757A (en) 1984-02-21 1990-12-18 The Upjohn Company 1,2,8,8a-tetrahydrocyclopropa (C) pyrrolo [3,2-e)]-indol-4(5H)-ones and related compounds
US4912227A (en) * 1984-02-21 1990-03-27 The Upjohn Company 1,2,8,8A-tetrahydrocyclopropa(c)pyrrolo(3,2-e)-indol-4-(5H)-ones and related compounds
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0271581B1 (en) * 1986-04-17 1993-01-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel compounds dc-88a and dc-89a1 and process for their preparation
US5332837A (en) * 1986-12-19 1994-07-26 The Upjohn Company CC-1065 analogs
US4975278A (en) * 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US4952394A (en) * 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
US4994578A (en) * 1987-11-27 1991-02-19 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Certain anti-tumor duocarmycin antibiotics from streptomyces
US5147786A (en) * 1988-04-22 1992-09-15 Monsanto Company Immunoassay for the detection of α-haloacetamides
JP2642165B2 (ja) * 1988-07-22 1997-08-20 協和醗酵工業株式会社 新規ｄｃ−８９化合物およびその製造法
US5084468A (en) * 1988-08-11 1992-01-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-88a derivatives
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
DE3837648A1 (de) 1988-11-05 1990-05-10 Basf Ag Vorrichtung zur auswaschung von photopolymeren druckplatten mittels loesungsmitteln, trocknung der druckplatten und rueckgewinnung der loesungsmittel
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JP2598116B2 (ja) 1988-12-28 1997-04-09 協和醗酵工業株式会社 新規物質ｄｃ１１３
DE3907562A1 (de) 1989-03-09 1990-09-13 Bayer Ag Antisense-oligonukleotide zur inhibierung der transaktivatorzielsequenz (tar) und der synthese des transaktivatorproteins (tat) aus hiv-1 und deren verwendung
JPH04505261A (ja) 1989-05-10 1992-09-17 スローン―ケツテリング・インステイテユート・フオー・キヤンサー・リサーチ ポルｉｉｉプロモーターの制御下の転写可能な外来ｄｎａを含む安定的に形質転換された真核細胞
JPH05500799A (ja) 1989-06-05 1993-02-18 ギリアド　サイエンシス，インコーポレイテッド エキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドおよびその調製方法
US5187186A (en) * 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
DE69027443T2 (de) 1989-10-24 1998-03-19 Gilead Sciences, Inc., Foster City, Calif. Oligonukleotidanaloga mit neuartigen bindungen
CA2071510C (en) 1989-10-24 2004-07-06 Chris A. Buhr 2' modified oligonucleotides
US5495009A (en) * 1989-10-24 1996-02-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs containing thioformacetal linkages
US5334528A (en) 1989-10-30 1994-08-02 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies to cyclodiene insecticides and method for detecting the same
US5180819A (en) 1989-12-22 1993-01-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Purified myeloblastin, nucleic acid molecule encoding same, and uses thereof
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991011535A1 (en) 1990-01-30 1991-08-08 Childrens Hospital Of Los Angeles Inhibition of transcription by double-stranded oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
AU648313B2 (en) 1990-04-25 1994-04-21 Pharmacia & Upjohn Company Novel CC-1065 analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5137877B1 (en) * 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
EP0786469B1 (en) 1990-06-11 2006-03-01 Gilead Sciences, Inc. Methods of use of nucleic acid ligands
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DE69121334T2 (de) * 1990-07-26 1997-03-20 Kyowa Hakko Kogyo Kk DC-89-Derivate als Antitumor-Wirkstoffe
GB9017024D0 (en) * 1990-08-03 1990-09-19 Erba Carlo Spa New linker for bioactive agents
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
AU8547691A (en) 1990-09-21 1992-04-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Protein sequence-specific oligonucleotide sequences
WO1992009705A1 (en) 1990-11-23 1992-06-11 Gilead Sciences, Inc. Triplex-forming oligomers containing modified bases
AU9146591A (en) 1990-12-10 1992-07-08 Gilead Sciences, Inc. Inhibition of transcription by formation of triple helixes
CA2104698A1 (en) 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
JPH0597853A (ja) 1991-10-07 1993-04-20 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｄｃ−８９誘導体の臭化水素酸塩
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5622929A (en) * 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
GB9314960D0 (en) * 1992-07-23 1993-09-01 Zeneca Ltd Chemical compounds
JP3514490B2 (ja) * 1992-08-21 2004-03-31 杏林製薬株式会社 トリフルオロメチルピロロインドールカルボン酸エステル誘導体及びその製造方法
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5324483B1 (en) 1992-10-08 1996-09-24 Warner Lambert Co Apparatus for multiple simultaneous synthesis
DE4314091A1 (de) 1993-04-29 1994-11-03 Boehringer Mannheim Gmbh Immunologisches Nachweisverfahren für Triazine
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
AU685939B2 (en) 1994-04-22 1998-01-29 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. DC-89 derivative
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
WO1996005863A1 (fr) * 1994-08-19 1996-02-29 La Region Wallonne Composes, composition pharmaceutique et dispositif de diagnostic les comprenant et leur utilisation
AU3532895A (en) 1994-09-30 1996-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Antitumor agent
WO1996035451A1 (fr) * 1995-05-10 1996-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau complexe de toxines
US5686237A (en) * 1995-06-05 1997-11-11 Al-Bayati; Mohammed A. S. Use of biomarkers in saliva to evaluate the toxicity of agents and the function of tissues in both biomedical and environmental applications
WO1997012862A1 (en) * 1995-10-03 1997-04-10 The Scripps Research Institute Cbi analogs of cc-1065 and the duocarmycins
CA2187969C (en) * 1995-10-17 2006-05-30 Dale L. Boger A template for solution phase synthesis of combinatorial libraries
DE69626849T2 (de) * 1995-12-22 2003-12-24 Bristol-Myers Squibb Co., Princeton Verzweigte hydrazongruppen enthaltende kuppler
US6143901A (en) * 1996-07-31 2000-11-07 Genesoft, Inc. Complex formation between dsDNA and pyrrole imidazole polyamides
US6130237A (en) * 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
JPH1087666A (ja) * 1996-09-18 1998-04-07 Kyorin Pharmaceut Co Ltd デュオカルマイシンｓａ及びその誘導体の製造中間体と製造方法
AU7274898A (en) * 1997-05-07 1998-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Recombinant antibody-enzyme fusion proteins
EP0983248B1 (en) * 1997-05-22 2004-07-14 The Scripps Research Institute Analogs of duocarmycin and cc-1065
JP2001519412A (ja) * 1997-10-14 2001-10-23 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５およびデュオカルマイシンのイソ−ｃｂｉおよびイソ−ｃｉ類似体
IL136489A0 (en) * 1997-12-08 2001-06-14 Scripps Research Inst Synthesis of cc-1065/duocarmycin analogs
JP3045706B1 (ja) * 1998-09-14 2000-05-29 科学技術振興事業団 Ｄｎａの特定塩基配列をアルキル化する化合物及びその合成法
US7425541B2 (en) * 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
DE60031793T2 (de) * 1999-12-29 2007-08-23 Immunogen Inc., Cambridge Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung
KR20030043785A (ko) * 2000-03-16 2003-06-02 젠소프트, 인크. 핵산 결합 부위를 포함하는 하전된 화합물 및 이의 용도
JP4061819B2 (ja) * 2000-05-12 2008-03-19 独立行政法人科学技術振興機構 インターストランドクロスリンク剤の合成方法
CA2413149A1 (en) * 2000-06-14 2001-12-20 Medarex, Inc. Prodrug compounds with isoleucine
AU7552501A (en) * 2000-06-14 2002-01-08 Corixa Corp Tripeptide prodrug compounds
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
EP1243276A1 (en) * 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US20030083263A1 (en) * 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7256257B2 (en) * 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6884869B2 (en) * 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
MXPA03010961A (es) * 2001-05-31 2004-02-27 Vertex Pharma Compuestos de tiazol utiles como inhibidores de proteinas cinasas.
NZ529788A (en) * 2001-05-31 2003-12-19 Medarex Inc Cytotoxins, prodrugs, linkers and stabilizers useful therefor
IL158969A0 (en) * 2001-06-01 2004-05-12 Cornell Res Foundation Inc Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US7514078B2 (en) * 2001-06-01 2009-04-07 Cornell Research Foundation, Inc. Methods of treating prostate cancer with anti-prostate specific membrane antigen antibodies
WO2002100353A2 (en) * 2001-06-11 2002-12-19 Medarex, Inc. Cd10-activated prodrug compounds
JP2005502703A (ja) * 2001-09-07 2005-01-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５およびデュオカルマイシンのｃｂｉ類似体
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US6534660B1 (en) * 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) * 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US7816377B2 (en) * 2002-07-09 2010-10-19 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysin analogues
US7776814B2 (en) * 2002-07-09 2010-08-17 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysin conjugates
EP1560599A1 (en) 2002-11-14 2005-08-10 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
DE602004027888D1 (de) * 2003-02-20 2010-08-12 Seattle Genetics Inc Anti-cd70 antikörper-arzneimittelkonjugate und ihr
US20050026987A1 (en) * 2003-05-13 2005-02-03 The Scripps Research Institute CBI analogues of the duocarmycins and CC-1065
AU2004316290C1 (en) * 2003-11-06 2012-02-02 Seagen Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005094882A1 (en) * 2004-03-03 2005-10-13 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
NZ560414A (en) * 2005-02-18 2011-04-29 Medarex Inc Monoclonal antibodies against prostate specific membrane antigen (PSMA) lacking in fucosyl residues

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6759509B1 (en) * 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
WO2004032828A2 (en) * 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
WO2005112919A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Medarex, Inc. Self-immolative linkers and drug conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
NO20081974L (no) 2008-06-09
CA2623652A1 (en) 2007-04-05
EA200800952A1 (ru) 2009-02-27
EP1940470B1 (en) 2013-04-17
WO2007038658A2 (en) 2007-04-05
IL190187A0 (en) 2008-11-03
EP2354163A3 (en) 2013-04-24
CA2623652C (en) 2013-11-26
EP1940470A2 (en) 2008-07-09
EP2354163A2 (en) 2011-08-10
JP5290756B2 (ja) 2013-09-18
KR20080057310A (ko) 2008-06-24
HK1117410A1 (en) 2009-01-16
JP2009509977A (ja) 2009-03-12
KR101377373B1 (ko) 2014-03-21
WO2007038658A3 (en) 2007-10-18
US20080279868A1 (en) 2008-11-13
BRPI0617546A2 (pt) 2011-07-26
AU2006294554B2 (en) 2013-03-21
AU2006294554A1 (en) 2007-04-05
CN101312748A (zh) 2008-11-26
NZ566982A (en) 2011-06-30
ZA200803153B (en) 2009-02-25
ES2416136T3 (es) 2013-07-30
IL190187A (en) 2015-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016577B1 (ru) Конъюгаты антитело-лекарство и их применение
US7968586B2 (en) Cytotoxic compounds and conjugates
US7714016B2 (en) Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
US7517903B2 (en) Cytotoxic compounds and conjugates
RU2402548C2 (ru) Химические линкеры и их конъюгаты
EP1940789B1 (en) Methods and compounds for preparing cc-1065 analogs
EP2121667B1 (en) Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
EA019962B1 (ru) Конъюгаты цитотоксинов
AU2006315252A1 (en) Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU