KR101022032B1 - 중간엽 줄기세포를 이용하여 모유두 조직을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모낭(hair follicle)의 형성을 유도하는 능력이 있는 모유두 조직의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 제조방법은 모낭의 진피성분인 모유두(dermal papilla)와 결직초(dermal sheath)를 구성하는 세포와 세포의 특성이 유사한 중간엽 줄기세포를 다양한 조직으로부터 분리하여 특정한 배지에 배양함으로써 모유두 조직으로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면 모낭의 형성을 유도하는 능력을 가진 모유두 조직을 생체 외에서 충분한 양으로 제조할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 세포 이식을 통한 대머리 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

모유두, 모낭, 중간엽 줄기세포

Description

중간엽 줄기세포를 이용하여 모유두 조직을 제조하는 방법{METHOD FOR THE PREPARATION OF DERMAL PAPILLA TISSUE EMPLOYING MESENCHYMAL STEM CELLS}

본 발명은 모낭(hair follicle)의 형성을 유도하는 능력이 있는 모유두 조직의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 제조방법은 모낭의 진피성분인 모유두(dermal papilla)와 결직초(dermal sheath)를 구성하는 세포와 세포의 특성이 유사한 중간엽 줄기세포를 다양한 조직으로부터 분리하여 특정한 배지에 배양함으로써 모유두 조직으로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

상피와 진피의 상호작용을 통해 많은 조직과 기관들이 형성 및 유지되는데, 모낭도 이 상호작용을 통하여 형성되고 유지된다. 코헨(Cohen J., J Embryol Exp Morphol . 9:117-27, 1961)과 올리버(Oliver RF., J Embryol Exp Morphol . 15(3):331-47, 1966 및 Oliver RF., J Embryol Exp Morphol . 18(1):43-51, 1967)는 쥐의 감각모(vibrissa)를 이용한 미세한 분리 조작과 동물이식 실험을 통하여 모낭의 진피세포로 구성된 모유두가 모낭유지에 아주 중요하게 작용한다는 것을 증명하였다. 즉, 모낭을 구성하고 있는 모유두는 모낭의 상피 세포인 외측모근초 세포와 상호작용하여 모발의 형성 및 성장을 유도하고 성장기, 퇴화기, 휴지기로 이루어진 모주기를 유지하게 된다. 그런데, 유전, 남성호르몬, 스트레스 등이 원인이 되는 탈모가 진행되면 이러한 모유두가 점차 퇴화되면서 종모가 연모로 변하게 되고, 결국 모발이 자라지 않게 되며 모낭이 퇴화되는 것이다.

탈모의 종류에는 남성형, 여성형, 원형 탈모 등 여러 가지가 있다. 이에 적절한 대처방법으로 과거에는 인조 모발을 이식하는 방법이 사용되었으나 심한 부작용으로 이용이 금지되었고, 현재는 약물과 천연물을 이용한 치료방법과 후두부의 모낭을 탈모가 일어난 부위에 이식하는 모발 이식법 등이 이용되고 있다. 그러나, 약물이나 천연물을 이용한 치료의 경우에는 영구적인 치료가 아니고 탈모 진행 단계를 지연시키거나 현 모발의 상태유지를 돕는 것으로서 약물의 투여를 중단하게 되면 곧 탈모가 다시 진행되는 단점이 있다. 또한, 모발이식의 경우에는 탈모가 이루어지지 않는 부위인 후두부의 모발을 사용하기 때문에 이식된 모발이 영구모가 되는 치료방법이기는 하지만 후두부 모발의 수가 한정되어 있기 때문에 1회에 약 2,000개 정도의 모발을 이식할 경우 보통 3회를 초과해서 수술할 수 없게 된다. 이처럼 현재 탈모 치료방법에는 몇 가지 한계점과 단점이 있으며, 이것을 극복하기 위하여 모낭을 구성하는 세포들을 생체 외에서 대량으로 배양하고 이 세포를 체내에 이식하여 모낭을 재생하려는 연구들이 시도되고 있다.

한편, 모낭의 모유두를 분리하여 그 세포를 배양하면 피부의 섬유모세포와 유사한 형태의 모유두 세포를 관찰할 수 있다. 이 세포는 모낭을 유도하는 능력을 갖고 있으며, 이것은 세포배양에서 응집체를 형성함으로써 표현된다. 즉, 세포배양 초기의 모유두 세포는 피부의 섬유모세포와는 다르게 배양용기에 포화되기 전에 세포들이 서로 응집하게 된다. 하지만, 세포의 응집현상으로 나타나는 모유두 세포의 모낭유도 특성은 영구히 유지되는 것이 아니라 아주 짧은 기간만 유지되게 되는데, 이와 관련하여 레이놀즈 등(Reynolds AJ et al., Development . 122 (10):3085-94, 1996)은 생체 외에서 모유두 세포를 분리하여 배양하면 약 3-4 세대 이후에는 모유두 세포가 가지고 있던 고유한 특징인 모낭 유도 능력을 점점 상실하여 응집성향이 사라진다고 보고한 바 있으며, 야호다(Jahoda CA., Development . 115(4):1103-9, 1992)와 레이놀즈(Reynolds AJ. et al., Development . 115(2):587-93, 1992)는 쥐 감각모 모유두를 분리하여 배양한 후 3세대 이하의 세포들을 쥐의 귀 상처부위 및 등에 이식하여 이식부위에 감각모 형태의 털이 형성된다고 보고한 바 있다. 따라서 모낭의 모유두에서 분리한 세포를 체외에서 배양하여 이식 가능한 충분한 양의 세포를 확보하기 위해서는 체외에서 배양할 수 있는 짧은 기간 동안 세포 일차배양에 필요한 모유두를 보다 많이 확보해야 하며, 이는 곧 세포배양을 위한 모낭의 수가 많아야 한다는 것을 의미한다.

한편, 조직 및 장기가 노화되면 이를 구성하고 있는 세포 역시 노화로 인해 생체 외에서 일차배양 수율이 감소하고 세포배양 중에도 이용되는 여러 가지 성장인자들에 대한 감응성이 저하되어 계대수가 짧아지고 증식이 잘 되지 않는다. 따라서 노화된 개체에서 얻어진 모낭의 세포일 경우에는 원하는 양의 세포수를 확보하기 어렵고, 이식 후 세포의 생체 내 적응력도 현저히 떨어져 이식세포를 이용해 원하는 치료효과를 얻기는 힘들다.

따라서 최근에는 완성된 조직 및 장기를 구성하는 분화된 세포를 이용하는 방법 대신에 성체 및 배아줄기세포를 이용하여 기존 세포를 대체하고자 하는 줄기세포치료에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 모낭의 재생에도 줄기세포를 이용하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 이러한 예로, 가타오카 등(Kataoka K., et al. Am J Pathol. 163(4):1227-31, 2003)은 마우스의 골수유래 중간엽 줄기세포와 태아 피부의 상피 및 진피세포를 혼합하여 부유된 상태의 세포를 이식한 결과 이식부위에 피부의 재생과 함께 모발이 형성됨을 확인하였는데, 이식한 중간엽 줄기세포의 표지자가 모낭에서도 발견되어 중간엽 줄기세포가 모낭재생에도 영향을 줄 것이라는 것을 보고하였다. 또한, 리차드슨 등(Richardson GD., J Invest Dermatol. 124(5): 1091-1, 2005)은 모낭 진피(hair follicle dermis) 세포가 지방 및 골분화가 가능하다는 것을 보고하였고, 마틴 등(Martin J., Stem Cell Dev. 15:49-60, 2006)은 골수유래 중간엽 줄기세포와 모낭 진피성 줄기세포(hair follicle dermal stem cell)가 모두 골, 연골, 지방 그리고 근육으로 분화된다는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 모낭의 모유두와 결직초를 구성하는 세포와 골수, 지방조직 및 탯줄의 중간엽 줄기세포들이 세포의 특성이 유사한 것에 착안하여 중간엽 줄기세포를 골수, 지방 조직 및 탯줄에서 분리하고 배양한 중간엽 줄기세포를 특정한 방법으로 배양한 결과 중간엽 줄기세포가 모낭형성을 유도할 수 있는 모유두 조직으로 분화됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 모낭형성을 유도할 수 있는 모유두 조직을 생체 외에서 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 중간엽 줄기세포를 아미노산이 600 내지 1,900 ㎎/ℓ의 양으로, 비타민이 12 내지 36 ㎎/ℓ의 양으로 각각 포함된 세포 배양용 배지에서 배양하는 단계,

2) 단계 1)에서 배양된 세포를, 아미노산이 2,000 내지 3,000 ㎎/ℓ의 양으로, 비타민이 40 내지 60 ㎎/ℓ의 양으로 각각 포함된 무혈청 배지에 성장인자를 첨가한 배지에서 배양하는 단계,

3) 단계 2)에서 얻어진 배양물에 트립신(trypsin) 또는 콜라게나제(collagenase)를 처리하여 배양 용기에 부착된 세포 덩어리를 탈착시켜 세포를 자가 응집시킴으로써 모유두 조직을 형성하는 단계, 및

4) 단계 3)에서 형성된 모유두 조직을 회수한 후, 성장인자가 포함된 단계 2)의 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 모유두 조직의 제조방법을 제공한다.

이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 방법은 골수, 지방조직 및 탯줄로부터 분리해낸 중간엽 줄기세포를 아미노산이 600 내지 1,900 ㎎/ℓ의 양으로, 비타민이 12 내지 36 ㎎/ℓ의 양으로 각각 포함된 기존의 세포 배양용 배지에서 1차 배양한 후(단계 1), 아미노산이 2,000 내지 3,000 ㎎/ℓ의 양으로, 비타민이 40 내지 60 ㎎/ℓ의 양으로 각각 포함된 세포 배양용 무혈청 배지(“고농도 배양배지”)에 모낭의 성장 및 유지에 필요한 성장인자를 첨가한 배지에서 2차 배양(단계 2)하는 것을 특징으로 한다.

상기 단계 1에서는 골수, 지방조직 및 탯줄로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 일반적으로 사용되는 세포 배양 배지에서 공지된 방법으로 1차 배양한다. 상기 1차 배양에서 배지로는 저농도 글루코스의 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM/F-12, F-12, McCoy's 5A, RPMI1640, 윌리엄 배지 E (Williams' medium E) 또는 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Modification)을 사용할 수 있다. 이때, 상기 1차 배지에서의 1차 배양 및 연속 배양을 통하여 중간엽 줄기세포를 1 내지 20 세대까지 배양할 수 있다.

상기 단계 2에서는, 1차 배양된 세포를 특별한 지지체나 기질 없이 일반 배지에 비해 2 내지 5배의 아미노산과 비타민이 함유된 고농도 배양배지에 성장인자를 첨가한 배지로 옮겨 약 3주간 배양함으로써 세포 분화를 유도하는 전-처리를 한다. 이때, 상기 성장인자로는 HGF (hepatocyte growth factor), EGF (epidermal growth factor) 또는 NGF (nerve growth factor)를 사용할 수 있고, 성장인자의 첨가량은 1 내지 1000 ng/㎖의 범위일 수 있다.

상기 단계 3에서는, 상기 단계 2에서 얻어진 배양물에 트립신(trypsin) 또는 콜라게나제(collagenase)를 처리하여 배양 용기에 부착된 세포를 탈착시킴으로써 세포에 유동성을 주어 세포의 자가 응집을 유도하고 모유두 조직이 형성되는 기간을 단축시킨다. 상기 단계 3에서 효소(트립신, 콜라게나제)를 처리하면, 약 72 시간 이내에 세포의 약 90％가 자가 응집체를 형성하여 모낭의 모유두와 유사한 모유두 조직을 체외에서 재현할 수 있다. 예를 들어, 25 ㎠ 배양용기에 1×10⁶ 개의 세포를 접종했을 경우, 약 100 내지 200 개의 자가 응집체가 형성된다.

상기 단계 4에서는, 형성된 모유두 조직의 상태를 유지하며 최종적으로 모유두 조직을 형성하는 단계로 예를 들어, 원심분리를 통해 회수한 후, 고농도 배양 배지에 성장인자가 첨가된 배지에서 3 내지 5일 동안 배양하여 세포를 후-처리한다. 이러한 처리를 통해 모유두 조직이 최종적으로 형성되고, 형성된 모유두 조직을 유지시킬 수 있다.

본 발명을 통하여 제조된 모유두 조직은 모유두가 없는 모낭과의 상호작용을 통하여 모낭구조를 형성할 수 있으며, 누드마우스의 진피 내로 이식을 하였을 경우 이식부위에 모주기를 갖는 모낭을 형성시키거나 기존 모낭의 모발성장을 촉진할 수 있다.

본 발명에서 단계 2 내지 4에서 사용된 고농도 배양 배지는 일반 세포 배양용 배지에 비해 2 내지 5배의 고농도 아미노산과 비타민을 함유하고 있기 때문에 중간엽 줄기세포의 배양시 발생되는 영양분 부족 및 산소 결핍을 극복하고 세포의 분화 특성을 향상시킴으로써 모유두 조직의 형성을 도울 수 있다.

본 발명의 고농도 배지는 아미노산으로서 필수 아미노산 중 L-아르기닌, L-아스파라진, L-아스파르트산, L-시스틴ㆍ2HCl, L-이소루이신, L-루이신, 및 L-리신ㆍHCl은 각각 30 내지 200 ㎎/ℓ을, 필수 아미노산 중 방향족 아미노산인 L-페닐알라닌, L-트립토판, 및 L-티로신은 각각 30 내지 210 ㎎/ℓ을, 필수 아미노산 중 나머지는 각각 50 내지 600 ㎎/ℓ을 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 비타민으로서 수용성 비타민 B군인 바이오틴, D-Ca 판토테네이트, 및 리보플라빈은 각각 0.02 내지 1 ㎎/ℓ을, 콜린 클로라이드, 엽산, 니아신 아마이드, 피리독신ㆍHCl, 및 티아민ㆍHCl은 각각 3 내지 16 ㎎/ℓ을, i-이노시톨은 10 내지 15 ㎎/ℓ을, 비타민 B₁₂는 0.02 내지 0.03 ㎎/ℓ을 함유하는 것이 바람직하다. 아울러, 본 발명의 배지는 글루타치온을 0.03 내지 0.07 ㎎/ℓ, 글루타민을 400 내지 600 ㎎/ℓ, D-글루코스를 1,500 내지 3,000 ㎎/ℓ 농도로 함유하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, pH 완충효과를 지니는 중탄산나트륨 (NaHCO₃) 3,000 내지 3,500 ㎎/ℓ, 및 헤피스 (HEPES, N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 2,000 내지 2,500 ㎎/ℓ, 세포-세포간 부착에 중요한 미네랄 성분인 Ca 및 Mg를 각각 1.0 내지 2.0 mM 및 0.5 내지 1.0 mM의 농도로, 세포 대사활동에 중요하게 작용하는 다른 미네랄 성분인 Cu, Fe, Mn, 및 Zn을 각각 0.25 내지 0.7 nM의 농도로 함유하고, 삼투압을 280 내지 310 mOsm/㎏으로 맞추기 위하여 염화나트륨을 4,000 내지 5,000 ㎎/ℓ의 농도로 포함시키는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 배지는 모낭의 배양기간을 더욱 연장시키기 위해 하이드로코티손 (hydrocortisone; HC), 인슐린 (insulin; I), 트랜스페린 (transferrin; T), 및 소듐셀레나이트 (sodium selenite; S)를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 하이드로코티손은 10 내지 100 ㎍/ℓ, 인슐린은 5 내지 20 ㎎/ℓ, 트렌스페린은 5 내지 20 ㎎/ℓ, 및 소듐 셀레나이트는 0.005 내지 0.02 ㎎/ℓ의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

특히, 본 발명에서는 CaCl₂ 165 ㎎/ℓ, CuSO₄5H₂O 0.0001 ㎎/ℓ, Fe(NO₃)9H₂O 0.0001 ㎎/ℓ, KCl 330 ㎎/ℓ, KNO₃ 0.076 ㎎/ℓ, MgSO₄ 98㎎/ℓ, MnCl₂4H₂O 0.0001 ㎎/ℓ, NaCl 4,800 ㎎/ℓ, NaHCO₃ 3,360 ㎎/ℓ, Na₂HPO₄ 111 ㎎/ℓ, ZnSO₄7H₂O 0.0002 ㎎/ℓ, D-글루코스 2,000 ㎎/ℓ, 소듐 피루베이트 110 ㎎/ℓ, HEPES 2,383 ㎎/ℓ, 페놀 레드 15 ㎎/ℓ, L-알라닌 50 ㎎/ℓ, L-아르기닌 100㎎/ℓ, L-아스파라진 50 ㎎/ℓ, L-아스파르트산 60 ㎎/ℓ, L-시스틴2HCl 182.4 ㎎/ℓ, L-글루탐산 150 ㎎/ℓ, L-글루타민 584 ㎎/ℓ, L-글리신 60 ㎎/ℓ, L-히스티딘 62.1 ㎎/ℓ, L-이소루이신 210 ㎎/ℓ, L-루이신 210 ㎎/ℓ, L-리신HCl 292 ㎎/ℓ, L-메티오닌 60 ㎎/ℓ, L-페닐알라닌 132 ㎎/ℓ, L-프롤린 80 ㎎/ℓ, L-세린 84 ㎎/ℓ, L-트레오닌 190 ㎎/ℓ, L-트립토판 32 ㎎/ℓ, L-티로신 208 ㎎/ℓ, L-발린 188 ㎎/ℓ, 바이오틴 0.026 ㎎/ℓ, D-Ca 판토테네이트 0.026 ㎎/ℓ, 콜린 클로라이드 8 ㎎/ℓ, 엽산 16 ㎎/ℓ, i-이노시톨 14.40 ㎎/ℓ, 니아신 아마이드 8 ㎎/ℓ, 피리독신 HCl 8 ㎎/ℓ, 리보플라빈 0.8 ㎎/ℓ, 티아민 HCl 3 ㎎/ℓ, 및 비타민 B₁₂ 0.026 ㎎/ℓ로 이루어진 배지가 바람직하다.

본 발명에서 사용된 바람직한 고농도 배지는 일반 배지에 비해 세포의 대사 작용을 위한 에너지를 공급하고 세포 활성을 유지시키는, 아미노산과 비타민이 2배 증가되었으며, 젖산으로 대사되기 때문에 생체에서 에너지원으로서의 역할이 적은 D-글루코스의 함유량은 2,000 ㎎/ 로 감소되어 있으며, 아미노산 중 ATP 합성량에 영향을 미치는 L-글루타민의 농도는 4 mM로 고정되어 있다. 또한, 미량 원소를 아연 0.7 nM, 철 0.25 nM, 구리 0.4 nM, 및 망간 0.5 nM 의 농도로 포함하며, pH 완충효과를 지니는 중탄산나트륨과 HEPES를 각각 40 mM과 10 mM의 농도로 함유한다. 세포간의 부착에 필수적인 미네랄인 칼슘과 마그네슘의 최종 농도는 각각 1.5 mM과 0.8 mM이며, 삼투압을 280 내지 310 mOsm/㎏으로 맞추기 위하여 염화나트륨을 4,500 ㎎/ℓ농도로 함유한다.

아울러, 철 공급원으로서 트랜스페린 10 ㎎/ℓ을 넣고, 무기 염류로서 소듐 셀레나이트 0.01 ㎎/ℓ, 호르몬으로서 하이드로코티손 10 ㎍/ℓ 및 인슐린 10 ㎎/ℓ, 알부민 0.2 중량％, 그리고 성장인자로서 HGF (Hepatocyte growth factor) 20 ng/㎖ 를 추가로 포함한다.

또한, 세포 배양에 있어서 중요한 pH는 중탄산염과 최종대사 산물들 간의 완충효과에 의해 일정하게 유지된다. 즉, 본 발명의 배지는 아미노산의 농도가 높아 대사산물인 암모니아에 의해 pH 상승이 우려될 수 있으나, 중탄산염 완충제 첨가로 인해 pH가 7.2 내지 7.5 사이에서 잘 유지된다.

본 발명의 모낭 배양용 배지에 포함된 황산구리는 모낭 내 존재하는 구리 의존 효소이자 항산화제인 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(Superoxide dismutase; SOD)를 통하여 라디칼 이온에 의한 세포사(apoptosis)를 억제시키며, 이밖에도 다른 구리 의존 효소들을 통해 모낭 내 5α-환원효소-1과 -2를 모두 억제시켜 천연 성장인자합성을 촉진하고 세포외 기질의 합성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 아연의 경우는 징크 핑거 (zinc finger) 전사인자(transcription factor)에 필수적인 미네랄 성분으로 알려져 있다.

본 발명에 따라 제조된 모유두 조직은 중간엽 줄기세포로부터 분화된 세포가 응집된 형태로 구성되어 있으며, 세포 응집체의 크기는 약 100 내지 200 ㎛로 실제의 모유두와 유사하고 자연스러운 세포 접촉을 이용했기 때문에 직접적인 세포 상호작용이 강하다. 또한, 헤마톡실린/에오신 염색을 통해 그 접촉 단면을 살펴보면 세포들이 정밀하게 응집되어 있다. 또한, 제조된 모유두 조직에서는 실제 모유두의 기질성분인 제 4형 콜라젠과 라미닌, 및 모낭유도능력을 간접적으로 확인할 수 있는 마커인 버시칸이 발현된다. 본 발명에 따라 제조된 모유두 조직은 외부의 자극이나 세포 부착 및 증식을 위한 어떠한 지지체도 필요로 하지 않으며, 대량생산이 가능하고 모낭 유도 능력을 충분히 갖추고 있어 향후 세포 이식을 통한 대머리 치료 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 모유두 조직의 제조 방법을 이용하면 중간엽 줄기세포로부터 모낭 유도 능력을 가진 모유두 조직을 생체 외에서 충분한 양으로 제조할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 생체 외 중간엽 줄기세포의 모낭 연구에의 적용 및 세포 이식을 통한 대머리 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 인큐베이터 내에서 광학현미경으로 탯줄의 왓튼 젤리층으로부터 중간엽 줄기세포가 흘러나오는 모습 및 이들 세포의 형태를 확인한 사진이고,

도 1b는 탯줄과 골수로부터 유래한 중간엽 줄기세포의 유세포 분석(FACScan) 결과를 나타낸 결과이고,

도 1c는 탯줄로부터 유래한 중간엽 줄기세포가 골세포 및 지방세포로 분화하는 것을 확인한 결과이고,

도 2는 골수, 지방조직 및 탯줄로부터 유래한 중간엽 줄기세포가 체외에서 모유두 조직을 형성하는 과정 및 형성된 모유두 조직의 형태를 보여주는 사진이고,

도 3은 본 발명을 통해 만들어진 모유두 조직이 실제 모낭의 모유두와 그 구성성분이 유사하고 모낭 유도 능력을 갖고 있음을 보여주는 사진이며,

도 4는 시험예 2에서 사용된 모유두가 없는 모낭과 모유두 조직간의 상호작용을 관찰하기 위한 실험의 모식도이고,

도 5는 본 발명을 통해 만들어진 모유두 조직과 모유두가 없는 실제 모낭을 혼합 배양한 후, 생체 외에서 새로운 모구를 형성하는 과정을 보여주는 사진이고,

도 6은 본 발명을 통해 만들어진 모유두 조직과 외측모근초 세포를 누드마우스의 등의 진피 내로 이식한 후, 이식부위에 모발성장이 일어난 것을 보여주는 사진이다.

이하 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 내용이 실시예에 의해한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 고농도 배지의 제조

하기 표 1에 나타낸 조성에 따라, 기존의 배지에 비해 아미노산 및 비타민 함량이 증가된 배지를 1ℓ 제조하고, 이 배지에 인슐린 10 ㎎/ℓ, 트랜스페린 10 ㎎/ℓ, 소듐 셀레나이트 0.01 ㎎/ℓ, 하이드로코티손 10 ㎍/ℓ, 및 알부민 0.2 중량％ (2 g/ℓ)를 첨가하였다.

< 실시예 1> 중간엽 줄기세포의 입수

분만시 배출된 인간의 탯줄(제대)을 인산완충용액으로 3회 세척하고 혈관주변 평활근 부위와 상피층을 제거한 후 남은 왓튼 젤리(Wharton jelly) 층을 약 3 mm× 3 mm로 작게 자른 다음, 배양 용기에 놓고 4시간 정도 37℃의 인큐베이터에 방치하여 조직을 용기 바닥에 잘 부착시킨다. 상기 배양용기에 우태아혈청(FBS)이 10% 포함된 DMEM (Dulbecco's Modificaion of Eagle's Medium)배지를 넣어 1주간 배양하면 탯줄의 왓튼 젤리로부터 세포가 흘러나오기 시작하며, 세포가 배양용기 바닥에 80%이상 증식하면 계대배양을 실시하였다(도 1a). 세포가 배양용기 표면의 70% 정도 증식이 되었을 때, 0.05% 트립신/0.02% EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후, 5×10⁵ 세포/㎖ 의 농도로 맞추어 줄기세포 마커인 CD73, CD90 및 CD105의 항체와 20분간 반응시켰다. 세포 용액을 2배 부피의 PBS로 세척한 다음 순환 완충액(flow buffer; 1% 파라포름알데하이드, 0.1% 소디움 아자이드 및 0.5% BSA를 포함하는 PBS 용액)으로 고정시킨 후, 유세포 측정기(FACScan; BD science) 및 셀퀘스트 소프트웨어(CELLQUEST software; BD science)로 세포를 분석한 결과 상기 세포가 CD73, CD90 및 CD105를 갖고 있음을 확인하였다(도 1b).

또한, 세포의 분화능을 확인하기 위하여, 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 저농도 글루코스를 포함하는 DMEM에 10% 혈청을 첨가하여 배양한 후 세포가 배양용기 면적의 70%까지 증식되었을 때 골세포 및 지방세포 분화용 배지로 각각 교체하여 배양하였다. 이때, 골세포로의 분화용 배지는 DMEM에 100 nM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산 2-포스페이트, 10 mM β-글리세로포스페이트, 10^-8 M 비타민 D₃ 및 10% FBS를 첨가한 것을 사용하였으며, 3일 간격으로 배지를 교체하며 3주간 배양하였다. 본 코사 염색법(von Cossa stain)을 통해 배양한 세포가 줄기세포임을 확인하였다(도 1c). 지방세포로의 분화용 배지는 DMEM에 1 uM 덱사메타손, 0.05 mM 메틸-이소부틸잔타인(IBMX), 10 ㎍/㎖ 인슐린, 100 mM 이도메타신, 10% FBS를 첨가한 것을 사용하였다. 3일간 배양 후 세포를 유지시키기 위해 DMEM에 10 ㎍/㎖ 인슐린 및 10% FBS가 첨가된 배지로 교체하여 다시 1일간 배양하였으며, 3일 간격으로 배지를 교체하면서 3주간 배양하였다. 오일 레드 O 염색법(oil red O stain)을 통해 배양한 세포가 줄기세포임을 확인하였다(도 1c)

골수유래 중간엽 줄기세포 및 지방조직유래 중간엽 줄기세포는 Cell Applications Inc.(USA)로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 구입한 골수 유래 중간엽 줄기세포는 쉴링(Schilling et al., Mol and Cell Endocrinol., 271(1-2), 1-17, 2007)의 방법에 따라 줄기세포임을 확인하였으며, 지방조직유래 중간엽 줄기세포는 컨(Kern S et al,, Stem Cells, 24(5) 1294-301, 2006)의 방법에 따라 줄기세포임을 확인하였다.

< 실시예 2> 모유두 조직의 제조

실시예 1에서 얻은 골수, 지방조직 및 탯줄 유래의 중간엽 줄기세포를 각각 10％ 우태아 혈청을 포함한 DMEM에 넣고 세포가 배양용기의 약 80％ 정도가 될 때까지 단층배양을 실시하였다. 그 다음, 배양배지를 상기 제조예 1에서 제조한 배지로 바꾸어 주고, 성장인자인 HGF (hepatocyte growth factor(rhHGF), R&D system)를 20 ng/ml의 농도로 넣어주었다. 배지는 약 3일에 한번씩 교체하여 주었으며, 약 3주 후에 트립신 또는 콜라게나제를 20 내지 40 ㎕/㎠의 양으로 처리하여 배양용기에 부착된 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포를 혈청 배지로 희석하여 원심분리 한 후 분화배지로 배양시킨 결과 24시간 만에 세포 응집현상이 나타나기 시작하였으며, 응집이 완료된 세포 덩어리는 배양 용기로부터 떨어져 배지로 부유되었다.

세포 응집체가 부유되는 시점부터는 배지 교체시 폐배지를 수거하여 500 rpm으로 3 분 동안 원심 분리하여 세포 응집체를 회수하였다. 바로 실험에 사용하지 않는 경우에는 제조예 1에서 제조한 새 배지에 다시 부유시킨 후 배양용기에 넣어 배양 상태를 유지해 주었다. 상기와 같은 방법에 따라, 골수, 지방조직 및 탯줄 유래의 중간엽 줄기세포가 체외에서 모유두 조직을 형성하는 과정 및 형성된 모유두 조직의 형태를 도 2에 표시하였다.

< 시험예 1> 모유두 조직의 검사

상기 실시예 2의 방법으로 제조된 모유두 조직을 공지의 헤마톡실린/에오신 조직염색법을 이용하여 염색하고 크기 및 그 접촉 단면을 관찰하였다. 그 결과, 도 3에 표시된 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의해 제조된 모유두 조직은 크기가 약 100-200 ㎛로 실제의 모유두와 유사하였으며, 세포들이 정밀하게 응집되어 있어 외부 자극에도 쉽게 부서지지 않는 견고함을 가진다는 것을 알 수 있었다.

또한, 상기 실시예 2의 방법으로 제조된 모유두 조직에서 실제 모유두의 기저막 성분인 제 4형 콜라겐과 라미닌, 및 모낭 유도 능력을 간접적으로 확인할 수 있는 마커인 버시칸이 발현되는지를 공지의 방법(Katsuoka 등, Arch Dermtol Res, 280(3), 140-144, 1988; Bratka-Robia 등, Vet Dermatol, 12(1), 1-6, 2002; Soma 등, J Dermatol Sci . 39(3), 147-54, 2005)으로 확인해 본 결과, 도 3에 표시한 바와 같이 이들 성분이 모두 본 발명의 모유두 조직에서 발현됨을 확인하였다.

< 시험예 2> 제조된 모유두 조직에 의한 모낭 형성

실시예 2에서 제조된 모유두 조직이 실제로 모낭을 유도할 수 있는지를 살펴보기 위해, 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다.

먼저, 콜라젠 젤을 24-웰 플레이트의 웰에 약 700 ㎕ 정도 채우고 37℃ 배양기에 1시간 정도 넣어두어 젤화시켰다. 이 위에 실시예 2에서 제조된 모유두 조직과 모유두가 제거된 모낭을 약 300 ㎛의 거리를 두어 젤 표면에 놓고 약 5-10분간 배양하여 젤 표면에 부착시킨 후 콜라겐 용액을 다시 약 700 ㎕ 정도 덮어준 다음 젤화시키고, 배양배지인 K-SFM (Gibco BRL, N.Y., U.S.A.)을 첨가하여 주었다. 상기 실험의 모식도를 도 4에 표시하였다.

그 결과, 도 5 표시한 바와 같이, 실제 모유두 조직의 경우와 마찬가지로 약 1주일 뒤에 외측모근초 세포가 유도되어 모유두를 감싸는 모습이 나타났고 약 15일 후에는 유도된 세포가 많아 그 모양이 좀 더 확연해지고 모구 구조를 형성하였으며, 약 21일 후에는 새로운 모구가 형성되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 분리된 인체 모낭의 모유두와 모유두가 제거된 모낭을 생체 외에서 함께 배양함으로써 새로운 모구 유사구조 형성이 관찰되었음을 보고한 종래의 연구 결과(Arase 등, Skin Pharmacol, 7(1-2), 12-15, 1994)와도 동일한 것이며, 따라서 본 발명에 따라 제조된 모유두 조직이 실제로 모낭 형성을 유도할 수 있는 능력을 갖고 있음을 알 수 있다.

< 시험예 3> 제조된 모유두 조직의 체내 모낭 형성 유도

실시예 2에서 제조한 모유두 조직(100 내지 150 개) 및 모낭의 외측모근초세포(HORSC; Cell Application Inc.)(약 3×10⁶개)를 생리식염수 100 ㎕에 균일하게 분산시키고, 이 분산액 약 50 ㎕를 누드마우스의 등쪽 피부의 진피 내로 주입한 후, 이식부위를 잉크를 이용하여 표시하였다.

그 결과, 이식 약 45일 후에 표시한 부위에서 모발성장이 관찰되었다(도 6. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따라 제조된 모유두 조직이 체내에 이식된 상태에서도 모발성장을 하는 모낭 형성을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 모유두 조직의 제조 방법을 이용하면 중간엽 줄기세포로부터 모낭 유도 능력을 가진 모유두 조직을 생체 외에서 충분한 양으로 제조할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 생체 외 중간엽 줄기세포의 모낭 연구에의 적용 및 세포 이식을 통한 대머리 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 모낭 형성을 유도할 수 있는 모유두 조직을 생체 외에서 대량으로 제조하는 방법을 제공함으로써, 세포 이식을 통한 대머리 치료 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (10)

1) 중간엽 줄기세포를 아미노산이 600 내지 1,900 ㎎/ℓ의 양으로, 비타민이 12 내지 36 ㎎/ℓ의 양으로 각각 포함된 세포 배양용 배지에서 배양하는 단계,

2) 단계 1)에서 배양된 세포를, 아미노산이 2,000 내지 3,000 ㎎/ℓ의 양으로, 비타민이 40 내지 60 ㎎/ℓ의 양으로 각각 포함된 세포 배양용 무혈청 배지로 옮기고, HGF를 첨가하여 배양함으로써 세포 분화를 유도하는 전 처리 단계,

3) 단계 2)에서 얻어진 배양물에 트립신 또는 콜라게나제를 처리하여 배양 용기에 부착된 세포 덩어리를 탈착시켜 세포를 자가 응집시킴으로써 모유두 조직을 형성하는 단계, 및

4) 단계 3)에서 형성된 모유두 조직을 회수한 후, HGF가 포함된 단계 2)의 세포 배양용 무혈청 배지에서 모유두 조직을 배양하는 후 처리 단계를 포함하는, 모유두 조직의 제조방법.

제1항에 있어서, 단계 1에서 상기 중간엽 줄기세포가 골수, 지방조직 또는 탯줄에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 모유두 조직의 제조 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)의 세포 배양용 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지, DMEM/F-12, F-12, McCoy's 5A, RPMI 1640 배지, 윌리엄 배지 E (Williams' medium E) 또는 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Modification) 배지인 것을 특징으로 하는, 모유두 조직의 제조방법.

제1항에 있어서, 단계 1)에서 중간엽 줄기세포를 1 내지 20 세대까지 배양하는 것을 특징으로 하는, 모유두 조직의 제조방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 HGF의 첨가량은 1 내지 1000 ng/㎖의 범위인 것을 특징으로 하는, 모유두 조직의 제조방법.

제1항에 있어서, 단계 2)의 세포 배양용 무혈청 배지가 아미노산으로서 L-아르기닌, L-아스파라진, L-아스파르트산, L-시스틴ㆍ2HCl, L-이소루이신, L-루이신, 및 L-리신ㆍHCl을 각각 30 내지 200 ㎎/ℓ로, L-페닐알라닌, L-트립토판, 및 L-티로신을 각각 30 내지 210 ㎎/ℓ로, 그리고 L-알라닌, L-글루탐산, L-글리신, L-히스티딘, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, 및 L-발린을 각각 50 내지 600 ㎎/ℓ로 포함하고; 비타민으로서 바이오틴, D-Ca 판토테네이트, 및 리보플라빈을 각각 0.01 내지 2 ㎎/ℓ로, 콜린 클로라이드, 엽산, 니아신 아마이드, 피리독신ㆍHCl, 및 티아민ㆍHCl을 각각 3 내지 16 ㎎/ℓ로, i-이노시톨을 10 내지 15 ㎎/ℓ로, 비타민 B₁₂를 0.02 내지 0.03 ㎎/ℓ로 포함하고; 글루타민 400 내지 600 ㎎/ℓ, D-글루코스 1,500 내지 3,000 ㎎/ℓ, 중탄산나트륨 (NaHCO₃) 3,000 내지 3,500 ㎎/ℓ, 및 헤피스 (HEPES, N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 2,000 내지 2,500 ㎎/ℓ, Ca 1.0 내지 2.0 mM, Mg 0.5 내지 1.0 mM, Cu, Fe, Mn, Zn을 각각 0.25 내지 0.7 nM, 및 염화나트륨 4,000 내지 5,000 ㎎/ℓ을 포함하는 것을 특징으로 하는, 모유두 조직의 제조방법.

제1항에 있어서, 단계 2)의 세포 배양용 무혈청 배지가 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레나이트, 하이드로코티손, 및 알부민을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 모유두 조직의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 모유두 조직이 중간엽 줄기세포로부터 분화된 세포들로 구성된 세포 응집체임을 특징으로 하는, 모유두 조직의 제조방법.

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