KR100973453B1

KR100973453B1 - 인간 배아 줄기 세포에서 유래되는 연골세포 전구체

Info

Publication number: KR100973453B1
Application number: KR1020047008714A
Authority: KR
Inventors: 시스알스콧
Original assignee: 제론 코포레이션
Priority date: 2001-12-07
Filing date: 2002-12-06
Publication date: 2010-08-02
Also published as: EP1463800A2; AU2002366602A1; GB2399348A; GB0414956D0; CN1599793A; US20190024053A1; JP2005511083A; WO2003050250B1; US20140134721A1; KR20050044733A; EP1463800A4; AU2002366602B2; US20110129867A1; US8546101B2; US7906330B2; US20030109038A1; CA2468335A1; IL162132A0; WO2003050250A2; CA2468335C

Abstract

본 발명은 영장류 다능성 줄기 세포의 분화에 의해 연골세포 계통의 세포를 수득하기 위한 시스템을 제공한다. 상기 방법에는 목적 세포 유형의 성장을 촉진하는 분화제 칵테일 중에서 마이크로매스 또는 기타 응집물 형태로 세포를 배양하는 것이 관여된다. 자손들은 연골세포 계통의 특징인 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸 또는 기타 생성물을 합성할 수 있다. 본 개시에 따라 수득되는 연골세포 및 연골세포 전구 세포는 연구 및 임상 치료법 모두에서 사용하기에 적합하다.

다능성 줄기 세포, 연골세포

Description

인간 배아 줄기 세포에서 유래되는 연골세포 전구체 {CHONDROCYTE PRECURSORS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}

본 발명은 일반적으로 세포 생물학, 배아 줄기 세포 및 세포 분화 분야에 관한 것이다. 연골세포의 특징을 갖는 신규 공급원으로부터의 분화 세포가 개시된다.

관련 출원에 대한 참고

본 출원은 2001. 12. 7. 일자로 출원한 U. S. 가특허 출원 60/339,043 을 우선권으로 주장한다.

연골 분해는 퇴화성 상태인 골관절염 및 주로 염증에 의해 야기되는 류마티스성 관절염의 2 개 질환군의 특징이다. 상기 분해는 관절통, 및 상당히 불능화시킬 수 있는 정도의 운동성 손상을 야기한다.

최근 20 여년에 걸쳐, 질환 진행을 저해하는데 효과적인 소염제의 개발이 상당히 진전되어 왔다. 그러나 분해가 이미 일어난 경우, 관절 연골의 재생을 보조하는 신규 치료법이 필요하다.

재생 의약 분야의 최근 시도는 연골을 보수할 수 있는 세포군 개발에 대한 것이다. 국제 특허 공보 WO 96/18728 에는 구축된 관절 연골세포주가 보고되어 있다. WO 98/55594 에는 연골세포 성장 및 분화 방법이 보고되어 있다. WO 00/27996 에는 최소 필수 배지, 성장 인자, 지질 및 아미노산을 포함하는 연골세포 유사 세포용 무혈청 배지가 보고되어 있다. U. S. 특허 6,150,163 (Genzyme) 에는 연골세포 배지 조성, 및 탈분화된 인간 관절 연골세포를 TGFβ및 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자를 포함하는 배지 중에서 성장시키는 배양 절차가 개시되어 있다.

Jorgensen 등 (Ann. Rheum. Dis. 60: 305, 2001) 은 관절염에서 연골 및 골의 보수를 위한 줄기 세포에서의 최근 진전을 개관하고 있다. Jakob 등 (J. Cell. Biochem. 26: 81, 2001) 은 연골세포분화 및 연골 형성을 증강시키는 성인 인간 관절 연골세포의 증식 및 재분화에 관여하는 특정 성장 인자를 연구하고 있다. M. Brittberg (Clin. Orthop. 367 Suppl: S147, 1999) 는 순수한 연골세포 또는 기타 간엽 세포를 건강한 조직원으로부터 동종이식물로 또는 자가 수확하여, 시험관 내에서 증식시킨 후 결함 내로 고밀도로 이식하는 최근의 연골세포 이식 절차를 개관하고 있다.

상기 임상 방법의 초기 성공에도 불구하고, 최근의 연골세포원이 임상에서 스스로가 나타내는 연골 퇴화의 대부분의 경우를 치료하기에 부적절함이 분명하다.

Kramer 등 (Mech. Dev. 92: 193, 2000) 은 마우스 배아 줄기 세포가 골 형태형성 단백질 (BMP-2 및 BMP-4) 로 조절되어, 연골세포의 특징인 알시안 블루 (Alcian blue) 로 염색되고, 전사 인자 scleraxis 를 발현하는 세포를 생성할 수 있다고 보고하고 있다. 불행하게도, 배아 줄기 세포 발생의 마우스 모델은 그 자신의 독특한 경우이고, 다른 종에게 적용가능한 분화 전략을 제공하지는 않는다. 실제로, 다능성 줄기 세포가 재생가능하게 단리되는 다른 포유류 종은 매우 적다.

최근에서야 Thomson 등이 인간 포배로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다 (Science 282: 114, 1998). 동시적으로, Gearhart 및 공동 연구자들은 태아 성선 조직으로부터 인간 배아 생식 (hEG) 세포주를 유도하였다 (Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998). 단순히 백혈병 저해 인자 (LIF) 와의 배양으로 분화되지 않을 수 있는 마우스 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에 유지되어야 한다 (U. S. 특허 6,200,806; WO 99/20741; WO 01/51616).

따라서, 인간 다능성 세포를 완전한 기능적 분화 세포 유형으로 분화시키기 위해 전혀 새로운 파라다임의 개발이 필요하다.

개요

본 발명은 다능성 세포로부터 연골세포 계통의 세포로 분화된 영장류 세포의 효율적 생성 시스템을 제공한다. 연구 및 임상 치료법을 위해 모두 적합한 연골세포가 상당히 보강된 세포군이 기재된다.

본 발명의 하나의 구현예는 영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포를 분화시켜 수득되는, 연골세포를 포함하는 세포군이다. pPS 세포의 예는 인간 배아 줄기 세포이다. 연골세포 계통 세포는 내생 유전자로부터 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸을 합성하는 능력으로 확인될 수 있다. 바람직하게는, 상기 군에는 탄성 연 골, 섬유연골, 비후성 연골 또는 골을 합성하는 최소 비율의 세포가 포함된다.

본 발명의 또다른 구현예는 시험관 내 배양에서 증식하며, pPS 세포의 분화에 의해 수득되고, 성숙한 연골세포의 특징을 갖는 자손을 형성할 수 있는 연골세포 선조 (progenitor) 군이다. 연골세포 선조는 더 이상 다능성이 아니며, 연골세포 발생 기전으로 수임된다. 상기 군내의 미분화 다능성 세포의 비율은 바람직하게는 최소화되며, 임의의 잔여 미분화 세포는 추가 증식 시 연골세포를 형성하는데 관여하는 세포가 아니다. 임의로, 줄기 세포의 복제능은 텔로머라아제 활성을 증가시켜 개선될 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예는 pPS 세포를 분화시킨 후 (예컨대 배상체를 형성시켜), 연골세포 분화 인자의 혼합물과 분화 세포를 예컨대 마이크로매스 배양물로 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 세포군의 수득 방법이다. 적합한 인자는 본 개시물에 이후 보다 자세히 기재되며, 전환 성장 인자 (TGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 성장 및 분화 인자 (GDF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 헤지호그 (hedgehog) 단백질 (HH), L-아스코르브산, 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질 (PTHrP) 이 포함된다.

본 발명의 또다른 구현예는 연결 조직 단백질이 생성되는 조건 하에 본 발명의 세포군을 인큐베이션하여 연골을 생성하는 방법이다. 본 발명의 또다른 구현예는 본 발명의 세포군과 화합물을 배합하여 그 효과를 결정함으로써, 연골세포 성장, 분화, 또는 연골 성분의 합성을 조절하는 그 능력에 대해 화합물을 스크리닝하는 방법이다.

본 발명의 또다른 구현예는 생체 내에서 연골을 생성, 보수 또는 유지하기 위한, 본 발명의 세포군을 포함하는 약학 조성물, 및 예를 들어 성형 수술 또는 관절 외상, 관절염, 또는 골관절염의 치료에서 대상체의 연골을 재건하기 위한 상기 의약의 용도이다.

본 발명의 상기 및 기타 구현예는 하기 설명에서 더욱 자명할 것이다.

상세한 설명

본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 얼마나 효율적으로 인간 연골세포를 분화시키는지를 보임으로써, 대규모 인간 연골세포군 생성의 문제점을 해결한다.

다능성 줄기 (pPS) 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 (hES) 세포는 일차적으로 일반 분화를 개시한 후, 연골세포의 성장을 촉진하는 인자의 존재 하에 배양함으로써 분화 과정을 집중시켜, 연골세포 분화 기전을 따라 유도될 수 있다. 연골세포 계통 세포의 효율적 생성에 유용한 인자의 조합을 최적화하는 것을 돕는 전략이 개발되고 있다. 본 발명의 기법은 제 II 형 콜라겐 및 아그레칸과 같은 연결 조직 성분의 합성에 의해, 생체 내에서 연골 모델링이 가능한 세포가 보강된 세포군 생성을 위한 것이다.

hES 세포는 무한 증식시킬 수 있으므로, hES 세포로부터 연골세포를 효율적으로 생성하는 방법의 개발이 중요하다. 따라서, 본 발명은 제한되지 않는 양의 연골세포를 생성하는데 사용될 수 있는 시스템을 제공한다.

하기 개시는 본 발명의 연골세포를 어떻게 제조하는지에 대한 완전한 설명을 제공한다. 이는 어떻게 상기 세포가 연구 및 약학 개발에 사용될 수 있는지에 대해 광범위한 예시를 제공한다. 본 개시는 또한 관절 운동성의 복구를 위한 연골 재생 및 리모델링 및 미용 목적을 위해 pPS 유래 연골세포의 사용을 위한 약학 조성물, 장치 및 치료 방법을 제공한다.

정의

본 개시의 목적을 위해, 달리 명시되지 않는다면 용어 "연골세포" 는 연골세포 세포 기전 내의 임의 세포를 나타낸다. 여기에는 제 II 형 콜라겐 및 아그레칸의 합성에 의해 연골을 모델링할 수 있는 성숙한 세포가 포함된다. 여기에는 또한 성숙한 연골세포를 형성하도록 수임된 자가 재생가능한 선조 세포가 포함된다.

세포 발생론과 관련하여, 형용사 "분화된" 은 상대적 용어이다. "분화된 세포" 는 비교되는 세포보다 더 아래의 발생 기전으로 추가 진행된 세포이다.

본 개시에서 사용되는 "분화제" 는 본 발명의 배양 시스템에서 사용되어 연골세포 계통의 분화 세포 (전구 세포 및 말단 분화 세포 포함) 를 생성하는 화합물의 한 집단을 나타낸다. 화합물의 작용 방식에 관해서는 제한되지 않는다. 예를 들어, 제제는 표현형 변화를 유도 또는 보조하거나, 특정 표현형을 갖는 세포의 성장을 촉진하거나 다른 것의 성장을 지연시킴으로써 분화 과정을 보조할 수 있다. 이와는 달리, 원치않는 세포 유형으로 분화 기전을 아래로 진행시킬 배지 중에 존재하거나 세포군에 의해 합성되는 다른 인자에 대한 저해제로도 또한 작용할 수 있다.

원형 "영장류 다능성 줄기 세포" (pPS 세포) 는 수정 후 임의 시점에서 전배 아, 배아 또는 태아 조직으로부터 유래된 다능성 세포이며, 적합한 조건 하에서 표준 기술이 허용하는 시험, 예컨대 8-12 주령 SCID 마우스에서 기형종을 형성하는 능력에 따라 모든 3 가지 배엽층: 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 유도체인 여러 상이한 세포 유형의 자손을 생성할 수 있는 특징을 갖는다. 상기 용어에는 다양한 종류의 구축된 줄기 세포주, 및 기재된 방식으로 다능성인 일차 조직으로부터 수득되는 세포 모두가 포함된다.

pPS 세포의 정의에는 다양한 유형의 배아 세포가 포함되며, 인간 배아 줄기 (hES) 세포 [Thomson 등, Science 282:1145, 1998]; Rhesus 줄기 세포와 같은 다른 영장류로부터의 배아 줄기 세포 [Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995]; 마모셋 (marmoset) 줄기 세포 [Thomson 등, Biol. Reprod. 55: 254, 1996] 및 인간 배아 생식 (hEG) 세포 [Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998] 로 예시된다. 기타 유형의 다능성 세포도 또한 용어에 포함된다. 이들이 배아 조직, 태아 조직 또는 다른 공급원으로부터 유래되었는지 여부와 무관하게, 모든 3 가지 배엽층의 유도체인 자손을 생성할 수 있는 영장류 기원의 모든 세포가 포함된다. pPS 세포는 바람직하게는 해로운 공급원에서 유래되지 않는다. 세포가 핵형상으로 정상인 것이 바람직하다 (그러나 항상 필요한 것은 아님).

pPS 세포 배양물은 군내 줄기 세포 및 이들의 유도체의 상당 비율이 배아 또는 성인 기원의 분화된 세포로부터 이들을 뚜렷이 구별짓는 미분화된 세포의 형태학적 특징을 나타내는 경우 "미분화된" 것으로 불린다. 미분화된 pPS 세포는 당업자에게 용이하게 인식되며, 전형적으로 높은 핵/세포질 비 및 뚜렷한 인 (nucleoli) 을 갖는 세포 콜로니의 2 차원 현미경 시계를 나타낸다. 상기 군내 미분화된 세포의 콜로니는 종종 분화된 주변 세포에 의해 둘러싸일 것으로 이해된다.

"영양 세포 (feeder 세포 또는 feeder)" 란 제 2 유형의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하기 위해, 또다른 유형의 세포와 공동 배양되는 한 유형의 세포를 설명하는데 사용되는 용어이다. 특정 유형의 pPS 세포는 일차 마우스 배아 섬유아세포, 불멸화 마우스 배아 섬유아세포 또는 hES 세포로부터 분화된 인간 섬유아세포 유사 세포로 지지될 수 있다. pPS 세포군은 신선한 영양 세포가 pPS 세포의 성장을 지지하기 위해 첨가되지 않고 분할 후 1 회 이상 세포가 성장하는 경우, 영양 세포가 "본질적으로 없는" 것으로 불린다.

용어 "배상체" 는 pPS 세포가 단층 배양으로 성장하거나 현탁 배양 중에 유지되는 경우 나타나는 분화 및 미분화 세포의 응집물을 나타내는 "응집체" 와 동일어인 당분야의 용어이다. 배상체는 면역세포화학으로 검출가능한 형태학적 범주 및 세포 마커로 구별가능한, 전형적으로 여러 배엽층으로부터의 상이한 세포 유형의 혼합물이다.

"성장 환경" 은 관심 세포가 시험관 내에서 증식, 분화 또는 성숙할 환경이다. 환경의 특징에는 세포가 배양되는 배지, 존재할 수 있는 임의 성장 인자 또는 분화 유도 인자, 및 존재하는 경우 지지 구조 (예컨대 고형 표면 상의 기질) 가 포함된다.

세포는 폴리뉴클레오티드가 임의의 적합한 인공 조작 수단에 의해 세포 내로 전달되거나, 세포가 유전된 폴리뉴클레오티드를 갖는 본래 변형된 세포의 자손인 경우 "유전적으로 변형된", "트랜스펙션된", 또는 "유전적으로 형질전환된" 것으로 불린다. 폴리뉴클레오티드는 종종 세포가 상승된 수준으로 단백질을 발현할 수 있게 만드는, 관심 단백질을 코딩하는 전사가능한 서열을 포함할 것이다. 유전적 변형은, 변형된 세포의 자손이 동일한 변형을 갖는 경우 "유전가능한" 것으로 불린다.

일반 기법

분자 유전학 및 유전 공학의 일반적 방법은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos 편저; 및 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등 편저, Wiley & Sons] 의 최근판에 기재되어 있다. 세포 생물학, 단백질 화학 및 항체 기법은 [Current Protocols in Protein Science, J.E. Colligan 등 편저, Wiley & Sons; Current Protocols in Cell Biology, J.S. Bonifacino 등, Wiley & Sons 및 Current Protocols in Immunology, J.E. Colligan 등 편저, Wiley & Sons] 에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 언급되는 유전 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, ClonTech 및 Sigma-Aldrich Co. 와 같은 상업적 공급자에서 입수가능하다.

세포 배양 방법은 일반적으로 [Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R.I. Freshney 편저, Wiley & Sons; General Techniques of Cell Culture, M.A. Harrison & I.F. Rae, Cambridge Univ. Press, 및 Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols, K. Turksen 편저, Humana Press] 의 최근판에 기재되어 있다. 조직 배양 공급물 및 시약은 Gibco/BRL, Nalgene-Nunc International, Sigma Chemical Co., 및 ICN Biomedicals 와 같은 상업적 공급자에서 입수가능하다.

연골의 생물학 및 병리학, 및 관절 유지에 있어서 연골세포 역할의 일반적 측면은 하기 참고서에서 찾을 수 있다: [Mechanobiology: Cartilage and Chondrocyte, J.F. Stoltz 편저, IOS Press 2000; Biological Regulations of the Chondrocytes, M. Adolphe 편저, CRC Press 1992; Bone and Cartilage Allografts, G.E. Friedlaender 등 편저, Amer. Acad. Orthopaedic 1991; Joint Cartilage Degradation, J.F. Woessner & D.S. Howell 편저, Marcel Dekker 1992; Skeletal Tissue Mechanics, 2 판, R.B. Martin 등 편저, Springer Verlag 1998; Molecular and Developmental Biology of Cartilage, B. De Crombrugghe 등 편저, Ann. N. Y. Acad. Sci. Vol. 785: 1996; 및 Joint Structure and Function: A Comprehensive Analysis, 3 판, P.K. Levangie 등 편저, F A Davis, 2000].

줄기 세포 공급원

본 발명은 다양한 유형의 줄기 세포를 사용하여 실시될 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 줄기 세포 중에는 잉태 후 형성된 조직에서 유래된 영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포, 예컨대 포배, 또는 잉태 도중 임의 시점에서 취해진 태아 또는 배아 조직이 있다. 비제한적 예에는 후술되는 바와 같은 일차 배양물 또는 구축된 배아 줄기 세포 또는 배아 생식 세포주가 있다.

본 발명의 기법은 또한 일차적으로 미분화 세포주를 구축할 필요 없이 연골세포를 만들 잠재력을 갖는 일차 세포로부터 연골세포를 유도하여 일차 배아 또는 태아 조직으로 직접 실행될 수 있다.

배아 줄기 세포

배아 줄기 세포는 영장류 종 멤버의 포배로부터 단리될 수 있다 (U. S. 특허 5,843,780; Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 인간 배아 줄기 (hES) 세포는 Thomson 등 (미국 특허 6,200,806; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998) 및 Reubinoff 등 (Nature Biotech. 18: 399, 2000) 이 기재한 기법을 이용하여 인간 포배 세포로부터 제조될 수 있다. hES 세포와 동등한 세포 유형에는 이들의 다능성 유도체, 예컨대 WO 01/51610 (Bresagen) 에 개요된 바와 같은 원시 외배엽 유사 (EPL) 세포가 포함된다.

hES 세포는 인간 착상전 배아로부터 제조될 수 있다. 이와는 달리, 시험관 내 수정 (IVF) 배아를 사용하거나, 1 세포 인간 배아를 포배 단계로 증식시킬 수 있다 (Bongso 등, Hum Reprod 4:706, 1989). 배아를 G1.2 및 G2.2 배지 중에서 포배 단계까지 배양하였다 (Gardner 등, Fertil. Steril. 69:84, 1998). 발생한 포배로부터 프로나아제 (Sigma) 에 짧게 노출시켜 투명층을 제거하였다. 포배를 1:50 배 희석한 토끼 항-인간 비장 세포 항혈청 중에 30 분 동안 노출시킨 후, 5 분 동안 DMEM 중에서 3 회 세척하고, 1:5 배 희석한 기니아픽 보체 (Gibco) 에 3 분 동안 노출시켜, 내부 세포 덩어리를 면역수술로 단리하였다 (Solter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975). DMEM 중에서 2 회 더 세척한 후, 용해된 영양아층 (trophectoderm) 세포를 손상되지 않은 내부 세포 덩어리 (ICM) 로부터 부드러운 피펫팅으로 제거하고, mEF 영양세포층 상에 ICM 을 플레이팅하였다.

9 내지 15 일 후, 내부 세포 덩어리에서 유래된 성장물을 1 mM EDTA 가 들어있고 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수 (PBS) 에 노출시키거나, 디스파아제 또는 트립신에 노출시키거나 또는 마이크로피펫으로 기계적으로 분리시켜 응괴로 분리한 후, 신선한 배지 중에서 mEF 상에 재플레이팅하였다. 미분화된 형태를 갖는 성장 콜로니를 마이크로피펫으로 개별적으로 선택하여, 기계적으로 응괴로 분리하고 재플레이팅하였다. ES 유사 형태는 현저히 높은 핵 대 세포질비 및 뚜렷한 인을 갖는 밀집 콜로니를 특징으로 하였다. 이어서 생성 ES 세포를 짧은 트립신화, 둘베코 PBS (2 mM EDTA 포함) 로의 노출, 제 IV 형 콜라게나아제 (~200 U/mL; Gibco) 로의 노출, 또는 마이크로피펫에 의한 개별 콜로니의 선택에 의해 매 1-2 주 마다 통상적으로 분할하였다. 약 50 내지 100 개 세포의 응괴 크기가 최적이다.

배아 생식 세포

인간 배아 생식 (hEG) 세포는 최종 생리 기간의 약 8 - 11 주 후 채취한 인간 태아 물질 중에 존재하는 원시 생식 세포로부터 제조될 수 있다. 적합한 제조 방법은 [Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998] 및 U. S. 특허 6,090,622 에 기재되어 있다.

간단하게, 생식 융기를 등장성 완충액으로 헹군 후, 0.05% 트립신/0.53 mM 소듐 EDTA 용액 (BRL) 0.1 mL 중에 놓고 < 1㎣ 의 큰 덩어리로 절단하였다. 이어서, 조직을 100 ㎕ 팁을 통해 피펫팅하여 세포를 더욱 분리시켰다. 37℃ 에서 ~5 분 동안 인큐베이션 후, ~3.5 mL 의 EG 성장 배지를 첨가하였다. EG 성장 배지는 DMEM, 4500 mg/L D-글루코오스, 2200 mg/L mM NaHCO₃; 15% ES 검정된 소 태아 혈청 (BRL); 2 mM 글루타민 (BRL); 1mM 소듐 피루베이트 (BRL); 1000 - 2000 U/mL 인간 재조합 백혈병 저해 인자 (LIF, Genzyme); 1-2 ng/ml 인간 재조합 bFGF (Genzyme); 및 10μM 포스콜린 (10% DMSO 중) 이다. 대안적 접근법에서, EG 세포는 히알루로니다아제/콜라게나아제/DNAse 를 이용하여 단리되었다. 장간막을 갖는 생식 융기 또는 성선 안라겐 (anlagen) 을 태아 물질로부터 절단하고, 생식 융기를 PBS 중에 헹군 후, 0.1 ml HCD 소화 용액 (0.01 % 히알루로니다아제 제 V 형, 0.002% DNAse I, 0.1% 콜라게나아제 제 IV 형 (모두 EG 성장 배지 중에 제조된 Sigma 제품)) 중에 놓았다. 조직을 분쇄하고, 37℃ 에서 1 시간 또는 하룻밤 동안 인큐베이션하고, 1-3 mL 의 EG 성장 배지 중에 재현탁하고, 영양세포층 상에 플레이팅하였다.

LIF, bFGF 또는 포스콜린이 없는 변형된 EG 성장 배지 중에서 3 일 동안 배양한 후 5000 라드 γ선-조사로 불활성화된 서브콘플루언트한 영양 세포 (예컨대 STO 세포, ATCC No. CRL 1503) 층으로 96 웰 조직 배양 플레이트를 제조하였다. 일차 생식 세포 (PGC) 현탁액의 ~ 0.2 mL 을 각각의 웰에 첨가하였다. 각 웰을 조사된 STO 마우스 섬유아세포로 미리 제조된 24-웰 배양 디쉬의 1 웰로 옮기는 제 1 계대는 EG 성장 배지 중에서 7 - 10 일 후에 수행하였다. EG 세포와 일치하는 세포 형태가 관찰될 때까지, 전형적으로 7-30 일 또는 1-4 계대 후까지 세포를 매일 배지를 교체하며 배양하였다.

미분화 상태에서의 pPS 세포의 증식

pPS 세포는 분화를 촉진하지 않고 증식을 촉진하는 배양 조건을 이용하여, 배양 중에 연속 증식될 수 있다. 혈청 포함 ES 배지의 예는 80% DMEM (예컨대, 녹아웃 DMEM, Gibco), 20% 규명된 소태아 혈청 (FBS, Hyclone) 또는 혈청 대체물 (WO 98/30679), 1% 비필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-메르캅토에탄올로 제조되었다. 사용 직전에, 인간 bFGF 가 4 ng/mL 로 첨가되었다 (WO 99/20741, Geron Corp.).

전통적으로, ES 세포는 전형적으로 배아 또는 태아 조직 유래의 섬유아세포인 영양 세포층 상에서 배양되었다. 배아는 임신 13 일째 CF1 마우스에서 수확되며, 2 mL 트립신/EDTA 로 옮겨서 미세하게 절단하여, 37℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 10% FBS 를 첨가하고, 파편을 침전하도록 방치하고, 세포를 90% DMEM, 10% FBS 및 2mM 글루타민 중에 증식시켰다. 영양 세포층을 제조하기 위해, 증식을 저해하지만 ES 세포를 지지하는 인자의 합성은 허용하도록 세포를 조사하였다 (~4000 라드 γ선 조사). 배양 플레이트를 0.5% 젤라틴으로 하룻밤 동안 코팅하고, 웰 당 375,000 개의 조사된 mEF 를 플레이팅하여, 플레이팅 5 시간 내지 4 일 후 사용하였다. 배지는 pPS 세포를 접종하기 직전에 신선한 hES 배지로 교체하였다.

Geron 의 과학자들은 pPS 세포가 영양 세포 없이도 미분화 상태로 유지될 수 있음을 발견하였다. 무영양세포 배양 환경에는 적합한 배양 기질, 특히 세포외 매트릭스, 예컨대 매트리겔 (Matrigel

) 또는 라미닌이 포함되었다. pPS 세포는 > 15,000 개 세포/㎠ 로 플레이팅되었다 (최적으로 90,000 개/㎠ ~ 170,000 개/㎠). 전형적으로, 세포가 완전히 분산되기 전에 효소 분해를 중단하였다 (즉, 콜라게나아제 IV 로 ~5 분). 이어서, ~10 내지 2000 개 세포 응괴를 추가 분산 없이 직접 기질 상에 플레이팅하였다. 이와는 달리, 세포를 PBS 중 0.5 mM EDTA 용액 중에 ~5 분 동안 인큐베이션하여 플레이트가 컨플루언트해지기 전에 효소 없이 수확할 수 있었다. 배양 용기로부터 세척 후, 세포를 추가 분산 없이 새로운 배양물 내로 플레이팅하였다.

무영양세포 배양물은 분화 없이 세포의 증식을 지지하는 인자를 포함하는 영양 배지에 의해 지지되었다. 상기 인자는 상기 인자를 분비하는 세포, 예컨대 조사된 (~4,000 라드) 일차 마우스 배아 섬유아세포, 텔로머화 마우스 섬유아세포, 또는 pPS 세포에서 유래된 섬유아세포 유사 세포와 배지를 배양하여 배지 내로 도입될 수 있다. 배지는 4 ng/mL bFGF 및 20% 혈청 대체제가 보충된 무혈청 배지, 예컨대 KO DMEM 중에서 ~5-6 ×10⁴ cm^-2 의 밀도로 영양세포를 플레이팅하여 조건화될 수 있다. 1-2 일 동안 조건화된 배지는 추가 bFGF 로 보충되어 1-2 일 동안 pPS 세포 배양물을 지지하는데 사용되었다. 이와는 달리 또는 부가적으로, 분화 없이 증식을 지지하는 것을 돕는 다른 인자, 예컨대 FGF-2 또는 FGF-4 수용체에 대한 리간드, c-kit 에 대한 리간드 (예컨대 줄기 세포 인자), gp130 과 연합된 수용체에 대한 리간드, 인슐린, 트랜스페린, 지질, 콜레스테롤, 뉴클레오시드, 피루베이트 및 β-메르캅토에탄올과 같은 환원제가 첨가될 수 있다. 무영양세포 배양 방법의 특징은 추가로 국제 특허 공보 WO 01/51616; 및 [Xu 등, Nat. Biotechnol. 19: 971, 2001] 에 논의된다.

현미경 하에서, ES 세포는 높은 핵/세포질 비, 뚜렷한 인 및 구분하기 어려운 세포 연접을 갖는 밀집 콜로니 형성을 나타낸다. 영장류 ES 세포는 단계 특이적 배아 항원 (SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81 로 명명된 항체를 사용하여 측정가능한 마커 (Thomson 등, Science 282: 1145, 1998) 를 발현한다. 마우스 ES 세포는 SSEA-1 에 대한 양성 대조군으로서, 및 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 에 대한 음성 대조군으로서 사용될 수 있다. SSEA-4 는 인간 배아 암종 (hEC) 세포 상에 일관되게 존재한다. pPS 세포의 시험관 내 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현의 소실, 및 미분화 hEG 세포 상에서도 발견되는 SSEA-1 의 발현 증가를 가져온다.

다능성 세포의 연골세포로의 분화

본 발명의 연골세포는 목적하는 표현형을 갖는 세포를 보강시키는 특정 성장 환경 중에서 줄기 세포를 배양, 분화 또는 재프로그래밍하여 수득된다 (목적 세포의 성장 또는 다른 세포 유형의 저해 또는 사멸에 의해). 상기 방법은 선행 부 분에 기재된 영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포를 포함하는 여러 유형의 줄기 세포에 적용가능하다.

구축된 pPS 세포주로부터 유도되는 경우, 본 발명의 세포군 및 단리된 세포는 이들이 유래된 세포주와 동일한 게놈을 가질 것이다. 이는, 임의의 핵형 비정상을 초과하여, 염색체 DNA 가 pPS 세포 및 연골세포 간에 90% 초과 동일할 것임을 의미하며, 이는 연골 세포가 정상 유사 분열 과정을 통해 미분화주로부터 수득되는 경우 추정될 수 있다. 형질전환유전자 (transgene) 를 도입하거나 내생적 유전자를 녹아웃시키는 재조합 방법에 의해 처리된 연골세포는 여전히 모든 비조작 유전 요소가 보존되기 때문에, 이들이 유래된 세포주와 동일한 게놈을 갖는 것으로 간주된다.

분화 과정의 개시

본 발명의 가설은 pPS 세포로부터 연골세포의 유도를 수행하는 효율적 방식이 비특이적 방식으로 pPS 세포의 분화를 개시하고, 동시에 또는 이어서 개시된 세포와 연골세포 특이적 분화 인자를 조합하는 것이라는데 있다.

하나의 대안은 pPS 세포가, 예를 들어 배상체의 형성을 허용하는 낮은 접착성 기질을 갖는 배양 용기 중 현탁액으로서의 pPS 세포의 배양 또는 공여자 pPS 세포 배양물의 과성장에 의해 배상체 또는 응집물을 형성하도록 유도하는 것이다. 예시적 방법에 있어서, hES 세포의 컨플루언트 단층 배양물은 5-20 분 동안 1 mg/mL 콜라게나아제와 인큐베이션하고, 응괴로 분리시켜 수확되었다. 이어서, 이들을 80% 녹아웃 DMEM (Gibco) 및 20% 비 열불활성화 소태아 혈청 (Hyclone) 으 로 이루어지고 1% 비필수 아미노산, 1 mM 글루타민, 0.1 mM β-메르캅토에탄올이 보충된 배지 중에서 비부착 세포 배양 플레이트 (Costar) 에 플레이팅하였다. 배상체는 웰 당 2 mL 의 배지를 매 2 일 마다 첨가하여 영양을 공급하였다.

대안으로서, 분화 과정은 또한 비특이적 분화 파라다임으로, 예를 들어 레티노산 (RA) 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 를 배양 배지 중에 포함시켜 배양하여 개시될 수 있다. 분화를 개시하는 또다른 방법은 분화 과정을 자극하는 기질, 예컨대 폴리오르니틴 상에 미분화 pPS 세포를 플레이팅하는 것이다. 국제 특허 공보 WO 01/51616 참조.

연골세포로의 분화 유도

배양물을 연골세포 기전으로 유도하기 위해, 상기 마지막 부분에 기재된 바와 같이 개시된 pPS 세포를 연골세포 분화 인자 칵테일 중에 배양하였다. 단독으로 또는 조합으로, 각각의 인자는 세포를 연골세포 기전 아래로 분화시키거나, 연골세포 표현형을 갖는 세포를 성장시키거나, 다른 세포 유형의 성장을 저해하거나 또는 또다른 방식으로 연골세포를 보강시킬 수 있다: 본 발명을 실시하기 위해 연골세포를 보강시키는 기전을 이해할 필요는 없다.

연골세포 분화 혼합물의 후보 성분에는 전환 성장 인자 (특히 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3), 섬유아세포 성장 인자 (특히 염기성 섬유아세포 성장 인자, FGF-2), 성장 및 분화 인자 (특히 GDF-5, GDF-6 및 GDF-7), 골 형태형성 단백질 (특히 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 BMP-7), 헤지호그 단백질 (특히 인디안 헤지호그 IHH), L-아스코르브산, 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질 (PTHrP) 이 포함된 다. Gibco 는 염기성 FGF 의 바람직한 공급원이다. 대부분의 다른 화합물은 R & D Systems (Minneapolis MN) 에서 입수가능하다.

또한 본 발명의 가설은, 분화가 진행됨에 따라 신호전달 인자 및 이들의 수용체 프로파일이 변화하며, 생성 세포군도 또한 시간에 따라 변한다는 것이다. 잠재적 연골세포 분화 인자를 스크리닝하기 위해, pPS 세포를 0 내지 10 일의 다양한 시기에 걸쳐 응집체로서 배양하여, 프로토콜의 제 2 단계를 위한 광범위한 분화 단계를 포획할 수 있었다. 각각의 시점에서, 개시된 응집물은 탈응집되어, 후보 인자 혼합물을 포함하는 배지 중에 재플레이팅되었다.

또한 본 발명의 가설은 pPS 세포의 연골세포로의 분화는 세포가 응괴로 유지되는 경우 증강된다는 것이다. 응괴 중 세포 간의 상호작용이 탈분화로부터 세포를 유지하고, 목적 표현형으로의 기전을 따를 수 있게 하는데 중요할 수 있다.

따라서, 응집물 세포를 제한된 양의 프로테아제, 예컨대 트립신을 사용하여 또는 기계적 분쇄에 의해 부드럽게 분리하였다. 이어서, 이들을 마이크로매스 배양물로 공지된 고밀도 배양물로 재플레이팅하였다. 간단히, 세포 응괴를 ~10% 혈청을 포함하는 배지 중에 약 6 ×10⁷ 개 세포/mL 로 현탁하고, 적합한 매트릭스, 예컨대 젤라틴으로 예비코팅된 96 웰 플레이트 중에 50 ㎕/웰 (각 웰의 바닥 1/4^th 을 채움) 로 플레이팅하였다. 2 시간 후, 세포는 서로 부착하여, 세포 플러그를 형성할 것이다. 이 시점에서, 부가적 200 ㎕ 의 배지를 첨가하고, 고밀도로 인해 필요한 경우 배지를 매일 교환하며 세포를 배양하였다. 연골세포는 세포 응괴를 함께 접합시키는 풍부한 매트릭스를 합성하였다.

이어서, 목적 표현형의 선택 또는 성장을 야기하기 충분한 기간 동안 (아마 1 또는 2 주) 세포 응괴를 분화 인자 혼합물과 배양하였다. 예비 연구로서, 인자를 기능군에서 연구하며, 예를 들어 TGFβ, GDF, 및 BMP 의 혼합물을 제조하고, 다른 군인 IHH, PTHrP, bFGF, 및 아스코르브산과의 다양한 조합에서 연골세포 분화를 유도하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 초기 시험을 위한 농도 범위는 BMP, GDF 및 TGFβ에 대해서는 10-100 ng/mL; PTHrP 에 대해서는 10-100 nM, 및 IHH 에 대해서는 0.1 내지 1 mM 이었다. 다음 부분에 기재된 바와 같이 이들의 표현형 마커에 따른 세포 분석 후, 분화에 불필요한 군을 제거하고, 중요군을 이들의 개별 성분으로 분리하였다. 수회 반복 후, 목적 표현형을 생성하는 특정 인자 또는 2, 3 또는 그 이상의 인자의 칵테일을 포함하는 최소 성분 혼합물을 결정하였다.

동일한 수용체에 결합하는 다른 리간드 또는 항체는 본 개시에 언급된 임의의 수용체 리간드에 대한 동등물로 간주될 수 있다.

전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 는 배아 발생의 다양한 측면을 조절하며, 교감부신 (sympathoadrenal) 선조 세포 환경에서 발현된다 (Wall 등, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 517, 1994). 일부 시스템에 있어서, TGFβ는 부갑상선 호르몬 관련 단백질 (PTHrP) 의 발현을 조절한다 (Pateder 등, J. Cell Physiol. 188: 343, 2001). BMP 및 성장 및 분화 인자 (GDF) 는 관절 형성을 포함하는 골격형성 도중 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다 (Francis-West 등, Cell Tissue Res 1296: 111, 1999). 인디안 헤지호그 (IHH) 는 연골세포 증식을 자극하기 위한 작용원리 (mechanotransduction) 복합체 성분의 필수 성분이다 (Wu 등, J. Biol. Chem. 276: 35290, 2001). 연골내 골화 (endochondral ossification) 도중, 2 개의 분비되는 신호인 IHH 및 PTHrP 는 연골세포의 비후성 분화 개시를 조절하는 음성적 피드백 루프를 형성하는 것으로 여겨진다. 골 형태형성 단백질 (BMP) 은 골격 성분의 패턴화를 위한 신호전달 기전 및 연골과 골 형성의 유도를 위한 기작의 매개자로 여겨진다 (Hoffmann 등, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 11: 23, 2001). BMP 는 IHH/PTHrP 피드백 루프의 잠재적 상호작용자로서 시사되어 왔다 (Minina 등, Development 128: 4523, 2001). BMP 는 IHH 및 PTHrP 와 매우 잘 상호작용하여, 연골세포 증식 및 분화를 조정할 수 있다.

상기 전략에 따라 수득되는 pPS-유도 연골세포는 높은 비율의 선조 세포를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 세포는 부가적 기간 동안 연골세포 성숙 인자와의 배양에 의해, 추가로 분화 기전에서 아래로 유도될 수 있다. 성숙 인자의 효과적 칵테일의 후보에는 상기 열거된 분화 인자와 조합된 성장 인자, 예컨대 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 및 인슐린이 포함된다.

분화 세포의 특징

세포는 여러 표현형 범주에 따라 특징화될 수 있다. 상기 범주에는 형태적 특색의 현미경 관찰, 발현되는 세포 마커의 검출 또는 정량, 시험관 내 측정가능한 기능적 범주, 및 숙주 동물로의 주입 시 거동이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.

표현형 마커

본 발명의 세포는 이들이 연골세포에 특징적인 표현형 마커를 발현하는지 여부에 따라 특징화될 수 있다.

제 II 형 콜라겐 및 아그레칸은 관절 연골을 모델링하는 세포에 대한 특이적 마커로서 이용될 수 있었다. 배양물은 또한 각각 탄성 연골 및 섬유연골의 마커인 엘라스틴 및 제 I 형 콜라겐의 부재에 대해 스크리닝되었다. 배양물은 또한 연골내 골 형성의 진행 도중 생성되는 일시적 연골세포 표현형을 나타낼 수 있는, 각각 비후성 연골 및 골의 마커인 제 X 형 콜라겐 및 오스테오칼신의 부재에 대해서도 스크리닝될 수 있었다. 상기 인간 마커에 대한 시판 항체에 대한 표를 하기에 나타낸다.

조직 특이적 마커는 임의의 적합한 면역학적 기법, 예컨대 세포 표면 마커에 대한 유 (flow) 면역세포화학 또는 특히 세포내 또는 세포 표면 마커에 대한 면역조직화학 (예를 들어 고정 세포 또는 조직 절편 대상) 을 이용하여 검출될 수 있었다. 유세포측정 분석에 대한 상세한 방법은 [Gallacher 등, Blood 96: 1740, 2000] 에 제공된다. 유의미하게 검출가능한 양의 항체가 표준 면역세포화학 또는 유세포측정 분석에서 임의로 세포의 고정 후에, 및 임의로 표지를 증폭하기 위한 표지된 2 차 항체 또는 기타 콘쥬게이트를 이용하여 항원에 결합할 경우, 세포 표면 항원의 발현을 양성으로 정의하였다. 특이적 항체의 가능한 공급원을 표 1 에 나타낸다.

연결 조직 마커에 대한 항체의 시판 공급원
항체	공급원
제 I 형 콜라겐	Chemicon, cat. # AB758
제 II 형 콜라겐	Chemicon, cat. # AB761
제 X 형 콜라겐	RDI, cat # RDI-COLL10abr
엘라스틴	Chemicon, cat. # AB2043
오스테오칼신	Biomed. Tech. Inc., cat # BT593
아그레칸	BioTrend, cat # 0195-8050

조직 특이적 유전자 산물의 발현은 또한 노던 블롯 분석, 도트 블롯 혼성화 분석, 또는 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머를 사용하여 역전사효소로 개시되는 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR) 에 의해 mRNA 수준에서 검출될 수도 있다. 더욱 상세한 사항은 U. S. 특허 5,843,780 을 참조한다. 본 개시에 기재된 특정 마커에 대한 서열 데이타는 공개 데이타베이스, 예컨대 GenBank 에서 입수할 수 있다.

융합을 촉진하기 위해, 분화 인자 혼합물, 배양 조건 및 상기 마커의 타이밍 및 추적을 정련하여, 연골세포 또는 이들의 전구세포의 특징을 갖는 군 내 세포의 비율을 최대화시키는 것이 유익하다. 5% 이상의 세포가 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸, 또는 둘 다를 합성하는 군은 군 내 다른 세포가 불활성이거나 연결 조직에서 다른 역할을 담당하는 경우 (예컨대 섬유아세포 또는 간엽 세포), 잘 작용할 수 있다. 25% 이상의 세포가 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸을 합성하는 지점에서 보강된 군이 여러 상황에서 보다 유용할 것이다.

연골 재생에 연관된 치료적 적용을 위해, 통상 세포군의 탄성 연골, 섬유연골, 비후성 연골 및 골을 형성하는 능력을 최소화시키는 것이 바람직하다. 이는, 제 I 형 콜라겐, 제 X 형 콜라겐, 또는 오스테오칼신 (단독 또는 조합) 을 합성하는 세포의 비율이 가능한 적음을 의미하며, 바람직하게는 제 II 형 콜라겐 또 는 아그레칸에 대해 양성으로 염색되는 세포가 1/5^th 미만, 또는 1% 미만임을 의미한다. 또한, 낮은 잔여 미분화 pPS 세포의 비율을 갖는 군이 바람직하다. 바람직한 군은 1%, 또는 0.2% 미만으로 SSEA-4 +ve, Oct-4 +ve, 또는 내생적 텔로머라아제 역전사효소의 발현에 대해 양성이다.

동물 모델 실험

임상적 적용을 위한 연골세포 개발에 대한 상당한 관심의 대상은 세포군의 숙주 내에서 연골을 모델링하고 관절 기능을 복구하는 능력에 대한 것이다. 연골세포 기능의 재건은 여러 잘 구축된 동물 모델을 이용하여 시험할 수 있다.

6 mm 구멍을 토끼의 외이에 뚫고 접착성 피부를 온전히 놔둔 모델을 이용하여 예비 실험을 수행할 수 있었다. 이어서, 연골세포가 접종된 매트릭스를 이식하고, 구멍 폐쇄에 대해 동물을 모니터링하였다 (ten Koppel 등, Biomaterials 22: 1407, 2001).

이와는 달리, 토끼의 대퇴골의 중앙 대퇴골 돌기의 중량 지지 표면에 전체 두께의 결함을 생성할 수 있었다 (Grigolo 등, Biomaterials 22: 2417, 2001). 상처는 생체적합물질 (biomaterial) 에 접종된 연골세포를 이용하여 보수되거나, 마이크로매스 배양물로부터 다중세포성 응집물로서 풀링될 수 있었다. 골막 또는 근막 조각과 같은 막을 이용하여 이식물을 제자리에 폴딩하거나 매트릭스 이식물을 외과용 다트로 제자리에 유지할 수 있었다. 전체 두께 결함은 골수강으로부터 상기 부위 내로 혈액이 스며들도록 허용하여, 내생적 줄기 세포를 포함하는 응괴를 생성하였다. 중앙 돌기와는 달리, 상기 작업은 활차절흔 (trochlear groove) 내에 생성된 결함 내에서 수행될 수 있었다. 이는 비중량 지지 부위이며, 이식물은 중앙 돌기에서와 같이 용이하게 이동되지 않았다.

처리 부위로부터의 조직학적 표본을 이식 세포 및 연골 침적을 갖는 군에 대해 수술 1-6 달 후에 검사하였다. 여기에는 제 II 형 콜라겐 및 아그레칸에 대한 면역염색이 포함되었다. 이식물의 중요한 형태학적 특징에는 연골 두께, 평관절 표면 및 결함 가장자리에서 이식물 및 내생적 연골의 융합이 포함되었다. 이식물의 장기간 안정성은 12 개월 시점에서 확인될 수 있었다.

또다른 대안으로, 하부 골 또는 골수강을 침범하지 않는 부분적 두께의 결함이 생성될 수 있었다 (Hunziker 등, Clin. Orthop. 391 Supp:S171, 2001). 상기 유형의 결함은 골관절염에 대한 모델로 작용하였다. 골관절염에 대한 또다른 모델에는 난소절제된 토끼의 무릎 관절 내로 에스트라디올을 주사하여, 인간의 골관절염에서 관찰되는 결함과 유사한 돌기 표면 적합성의 손실을 유도하는 것이 관여되었다 (Tsai 등, Clin Orthoop. 291: 295, 1993).

분화 세포의 유전적 개질

본 발명의 여러 연골세포군은 실질적 증식능을 갖는다. 필요하다면, 내생적 유전자의 전사를 증가시키거나 형질전환유전자를 도입하여, 세포 내 텔로머라아제 역전사효소 (TERT) 의 수준을 증가시킴으로써, 복제능을 추가로 증강시킬 수 있었다. 국제 특허 출원 WO 98/14592 에 제공되는 인간 텔로머라아제 (hTERT) 의 촉매 성분이 특히 적합하였다. 인간 세포 내에서의 텔로머라아제의 트랜스 펙션 및 발현은 [Bodnar 등, Science 279: 349, 1998, 및 Jiang 등, Nat. Genet. 21: 111, 1999] 에 기재되어 있다. 유전적으로 변형된 세포는 표준 방법에 따라, RT-PCR 에 의한 hTERT 발현, 텔로머라아제 활성 (TRAP 분석), hTERT 에 대한 면역세포화학 염색, 또는 복제능에 대해 평가될 수 있었다. 세포 불멸화의 다른 방법, 예컨대 myc, SV40 거대 T 항원 또는 MOT-2 를 코딩하는 DNA 로의 세포 형질전환이 또한 고려되었다 (U. S. 특허 5,869,243, 국제 특허 출원 WO 97/32972 및 WO 01/23555).

필요하다면, 본 발명의 세포는 시험관 내 미분화 세포를 제거하거나, 생체 내 복귀돌연변이체에 대해 보호하기 위해 추가 처리되거나 제조될 수 있다. 군으로부터 미분화 줄기 세포를 제거하는 하나의 방안은 미분화 세포에서 우선적 발현을 유도하는 프로모터, 예컨대 TERT 프로모터 또는 OCT-4 프로모터의 조절 하에 효과기 유전자를 놓은 벡터로 군을 트랜스펙션하는 것이었다. 효과기 유전자는 세포 구분을 인도하는 리포터, 예컨대 녹색 형광 단백질일 수 있다. 효과기는, 예를 들어 독소를 코딩하여 세포를 직접 용해시키거나, 아폽토시스의 매개자, 예컨대 카스파아제일 수 있다 (Shinoura 등, Cancer Gene Ther. 7: 739, 2000). 효과기 유전자는 세포를 외부 제제, 예컨대 항체 또는 전구약물 독성효과에 대해 민감하게 만드는 효과를 가질 수 있다. 그 예는, 발현되는 세포를 갱시클로비어에 민감하게 만드는 단순 포진 (herpes simplex) 티미딘 키나아제 (tk) 유전자이다 (USSN 60/253,443). 이와는 달리, 효과기는 미분화 표현형으로 복귀된 임의 세포를 생체 내에서 천연 생성 항체에 민감하게 만드는 외래 결정자의 세포 표면 발현을 유도할 수 있다 (USSN 60/253,357).

연구 및 임상적 치료법에서의 연골세포의 용도

본 발명은 다양하고 중요한 연구, 개발 및 상업적 목적을 위한 많은 수의 연골세포 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 세포는 다른 계통의 세포에서 우선적으로 발현되는 cDNA 로 비교적 덜 오염된 cDNA 라이브러리를 제조하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 분화 세포는 또한 표준 방법에 따라, 연골세포 및 이들의 유도체의 마커에 대해 특이적인 모노클론성 또는 폴리클론성 항체를 제조하는데 이용될 수 있다.

약물 개발 및 임상적 치료법을 위한 본 발명의 조성물의 용도가 특히 관심의 대상이 된다.

약물 스크리닝

본 발명의 세포는 연골세포 전구세포 및 성숙한 연골세포 둘 다의 특징에 영향을 미치는 인자 (예컨대 용매, 소분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드) 또는 환경 조건 (예컨대 배양 조건 또는 조작) 에 대해 스크리닝하는데 이용될 수 있다.

하나의 예에 있어서, pPS 세포 (미분화 또는 분화 파라다임 내로 개시된 세포) 를 이용하여, 연골세포의 성숙을 촉진하거나, 장기 배양에서 연골세포의 유지 및 증식을 촉진하는 인자를 스크리닝하였다. 예를 들어, 후보 성숙 인자 또는 성장 인자는 이들을 상이한 웰 내 세포로 첨가한 후 추가 배양 및 세포 사용에 대해 바람직한 범주에 따라, 생성되는 임의의 표현형 변화를 결정하여 시험되었다. 이는 pPS 유래 연골세포 뿐만 아니라 연골에서 단리된 연골세포 및 이들의 선조에 대한 유도 및 배양 방법을 개선시킬 수 있었다.

또다른 예는 연골 형상화 또는 리모델링에서 이들의 역할에 대해 연골세포 활성에 영향을 미치는 잠재력을 갖는 소분자 약물의 효과를 측정하기 위한 연골세포의 사용이다. 상기 목적을 위해, 세포를 시험관 내에서 시험 화합물과 조합하여, 유전자 발현 또는 단백질 합성에 대한 화합물의 효과를 결정할 수 있었다. 스크리닝은 또한 생체 내에서, 동물 모델에서 세포의 거동에 대한 화합물의 효과를 측정하여 수행될 수 있었다.

본 발명의 또다른 스크리닝 방법은 연골세포 성장, 발생 또는 독성에 대한 잠재적 효과에 대한 약학 화합물의 시험에 관한 것이다. 상기 유형의 스크리닝은 화합물이 연골세포 자체에 대한 약리 효과를 갖도록 고안된 경우 뿐만 아니라, 일차 약리 효과 이외에 대해 고안된 화합물의 연골세포 관련 부작용을 시험하기 위해서도 적절하다.

독자는 일반적으로 표준 참고서 ["In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997], 및 U. S. 특허 5,030,015 를 참고한다. 후보 약학 화합물의 활성 평가에는 일반적으로 본 발명의 분화 세포와 후보 화합물을 단독으로 또는 다른 약물과 배합하여 조합하는 것이 관여되었다. 연구자는 화합물에 기인될 수 있는 세포의 형태, 마커 표현형 또는 기능적 활성에 있어서의 임의 변화를 (비처리 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 결정한 후, 관찰한 변화와 화합물의 효과를 연관시켰다.

세포 독성은 세포 생존력, 생존, 형태 및 특정 마커 및 수용체의 발현에 대 한 효과로 일차적으로 결정될 수 있었다. 염색체 DNA 에 대한 약물의 효과는 DNA 합성 또는 보수를 측정하여 결정될 수 있었다. 특히 세포 주기에서 계획되지 않은 시점에서, 또는 세포 복제에 필요한 수준을 초과하는 [³H]-티미딘 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치하였다. 원치않는 효과에는 또한 중기 (metaphase) 연장에 의해 결정되는, 비정상적인 속도의 딸 염색분체 (sister chromatid) 교환이 포함될 수 있다. 독자는 추가의 상세한 설명에 대해 [A. Vickers, pp375-410, "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997] 를 참고한다.

임상 치료법에 있어서의 연골세포

본 발명은 또한 상기 치료법을 필요로 하는 환자에서 연골 포함 근골격 구조를 유지 또는 복구하기 위한 연골세포 전구 세포 및 이들의 유도체의 사용이 제공된다. 관절 운동성의 손실을 야기하는 임의 상태가 고려될 수 있다. 충격 외상 및 운동 상해에 의해 야기되는 손상이 포함된다. 본 발명의 세포는 또한 퇴화를 야기하는 일차 병리학이 충분히 잘 조절되는 한, 소실된 기능을 복구하기 위한 퇴화성 상태, 예컨대 골관절염 및 류마티스성 관절염의 치료를 위해 고려될 수 있다. 또한, 코 수술을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 성형 수술을 위한 본 발명의 세포의 사용이 계획된다. 코의 미용적 재건은 [G.C. Burget & F.J. Menick, Mosby Year Book 1994; The Nose, Nikolay Gogol 등, David R. Godine publisher, 1993; 및 Yoo 등, J. Urol. 162: 1119, 1999] 를 참조한다.

본 발명에 따라 제조되는 연골세포는 생리적 상용성 부형제, 예를 들어 300 mL 중에 1.25 mL 겐토마이신 술페이트 (70 μmol/L), 2.0 mL 암포테리신 (2.2 μmol/L), 7.5 mL L-아스코르브산 (300 μmol/L), 25 mL 혈액 혈청 또는 그의 동등물 (10% vol/vol 으로) 을 포함하는 등장성 배지를 사용하여, 세포 현탁액 중에 (필요하다면 트립신 또는 콜라게나아제를 이용하여) 투여를 위해 제조될 수 있었다. 연골세포 이식 절차 도중, 손상된 연골은 기계적 또는 부착성 유지 수단, 예컨대 생체적합성 피브린 아교로 묶인 캡으로 덮였다. 이식 부형제 중에 배양된 연골세포 (약 10 ×10⁶ 개 연골세포를 포함하는 약 0.6 mL) 를 ~23 게이지 바늘을 이용하여 덮개 캡 아래로 주사하였다.

이와는 달리, 연골세포는 예를 들어 콜라겐 막을 사용하여 형성된 매트릭스 상에서 성장시켜 제조되었다 (시판 콜라겐 매트릭스 패드는 Ed. Geistlich Sohne, Switzerland 에서 입수가능하다). 이식 몇일 전에, 성장 배지를 이식 부형제로 교환하였다. 수술 도중, 연골세포가 로딩된 매트릭스를 생체적합성 접착제를 사용하여 손상된 연골 부위 내로 붙였다. 덮개 캡 또는 매트릭스는 연골 보수를 허용하기에 충분한 시기 동안 위치에서 유지된 후, 예를 들어 이식 2 내지 3 달 내에 신체에 의해 흡수 또는 재흡수되었다. 재흡수성 캡 및 매트릭스의 디자인 및 용도의 추가 상세한 사항은 국제 특허 공보 WO 01/08610 에서 찾을 수 있다.

평상시와 같이, 환자 선택, 투여 방식 및 지지 구조의 선택과 수술 선택사항에 대한 최종 책임은 담당 의사의 책임이다.

상업적 배포 목적을 위해, 본 발명의 연골세포는 전형적으로 인간 투여를 위해 충분한 멸균 조건 하에서 제조된 등장성 부형제를 포함하는 약학 조성물의 형태로 공급된다. 세포 조성물의 의약 제형에 대한 일반적 원칙에 대해서, 독자는 [Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan 편저, Cambridge University Press, 1996] 를 참고한다. 조성물은 또한 치료법을 따르는 최초 몇달 동안 연골세포를 제위치에 유지하기 위한 매트릭스를 포함할 수 있다. 흡수성 생체적합물질은 후속되는 수술적 제거의 필요성을 없앤다. WO 01/08610 에 기재된 콜라겐 매트릭스 패드 이외에도, 다른 가능한 매트릭스에는 생체재흡수성 중합체 털모양 매트릭스 (Rudert 등, Cells Tissues Organs 167: 95, 2000); 히알루로난 유도체 (Grigolo 등, Biomaterials 22: 2417, 2001); 폴리(L-락티드-엡실론-카프로락톤) 으로 제조되는 스폰지 (Honda 등, J. Oral Maxillofac. Surg. 58: 767, 2000), 및 콜라겐-피브린 매트릭스(Clin. Exp. Rheumatol. 18: 13, 2000) 가 포함된다.

본 발명에는 또한 이들의 제조, 배포 또는 사용 도중 임의 시점에서 존재하는 세포 및 기타 성분의 세트가 포함된다. 세포 세트에는 분화 pPS-유래 세포 (연골세포, 이들의 전구세포, 서브타입 등) 과 배합된, 때때로 동일한 게놈을 공유하는 미분화 pPS 세포 또는 기타 분화 세포 유형으로 예시되지만 이에 제한되는 것은 아닌, 본 개시에 기재된 임의 배합의 2 개 이상의 세포군이 포함된다. 세트 내 각각의 세포 유형은 함께, 또는 동일 장비 내, 또는 사업 상관관계를 공유하는 동일한 단위체 또는 상이한 단위체의 조절 하 상이한 위치에서 개별 용기에 포장될 수 있다. 본 발명의 산물은 임의로, 의도하는 목적, 예컨대 관절 연골의 재생 또는 성형 수술을 위해 기재된 설명서를 갖는 적합한 용기 또는 키트 내에 포장될 수 있다.

숙련된 독자는 본 발명이 본 발명의 요지 또는 첨부된 청구범위의 범위를 벗어나지 않고 일상적인 최적화에 의해 개질될 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명의 구현예는 하기를 포함하는 여러 종속 청구항을 허용하는 판단 하에 실행될 것이다.

1. 영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포의 분화에 의해 수득되는 세포군에 있어서, 5% 이상의 세포가 내생적 유전자로부터 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸을 합성하는 세포군.

2. 제 1 에 있어서, 1% 미만의 세포가 엘라스틴, 제 I 형 콜라겐, 제 X 형 콜라겐, 또는 오스테오칼신을 합성하는 세포군.

3. 영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포의 분화에 의해 수득되는 세포군에 있어서, [Koppel 등, Biomaterials 22: 1407, 2001] 에 기재된 동물 모델에서 2 달 이내에 6 mm 구멍을 폐쇄시키는 세포군.

4. 영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포의 분화에 의해 수득되며, 제 1-3 중 어느 하나의 세포의 특징을 갖는 자손을 형성할 수 있는, 시험관 내 배양에서 증식하는 연골세포 선조군.

5. 제 1-3 중 어느 하나에 있어서, 1% 미만의 미분화 pPS 세포를 포함하는 세포군.

6. 제 1-5 중 어느 하나에 있어서, 상승된 수준으로 텔로머라아제 역전사효소 (TERT) 를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 세포군.

7. 제 1-6 중 어느 하나에 있어서, 구축된 영장류 배아 줄기 세포주와 동일한 게놈을 갖는 세포군.

8. 제 1-7 중 어느 하나의 분화된 세포군 및 이것이 수득된 미분화 pPS 세포주를 포함하는 2 개 세포군.

9. 제 1-7 중 어느 하나의 세포군의 수득 방법에 있어서, pPS 세포를 분화시킨 후 분화 세포를 연골세포 분화 인자의 혼합물과 배양하는 것을 포함하는 방법.

10. 제 9 에 있어서, pPS 세포를 분화시켜 배상체 (embryoid bodies) 를 형성하는 것을 포함하는 방법.

11. 제 9-10 에 있어서, 연골세포 분화 인자의 혼합물에 전환 성장 인자 (TGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 성장 및 분화 인자 (GDF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 헤지호그 단백질 (HH), L-아스코르브산, 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질 (PTHrP) 로부터 선택되는 하나 이상의 인자가 포함되는 방법.

12. 연골 생성 방법에 있어서, 세포군이 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸을 합성하는 조건 하에서 제 1-7 중 어느 하나의 세포군을 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법.

13. 생체 내 연골의 생성, 보수 또는 유지를 위한 약학 조성물에 있어서, 생리적 상용성 부형제 중에 제 1-7 중 어느 하나의 세포군을 포함하는 조성물.

14. 제 13 에 있어서, 생체 내에서 재흡수되는 매트릭스를 추가로 포함하는 약학 조성물.

15. 연골세포 성장, 분화 또는 연골 성분의 합성을 조절하는 그 능력에 대한 화합물의 스크리닝 방법에 있어서, 화합물과 제 1-7 중 어느 하나의 세포군을 조합하고, 화합물과 조합되어 얻어지는 세포군에서의 임의의 표현형 또는 대사 변화를 결정하고, 화합물의 연골세포 성장, 분화 또는 연골 성분의 합성을 조절하는 능력을 상기 변화와 연관시키는 것을 포함하는 방법.

16. 대상체에서 연골의 재건 방법에 있어서, 제 1-7 중 어느 하나의 세포군을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.

17. 대상체에서 연골 재건을 위한 의약 제조에 있어서의 제 1-7 중 어느 하나의 세포군의 용도.

18. 관절 외상, 관절염, 또는 골관절염의 치료 또는 성형 수술에서의 사용을 위한 의약 제조에 있어서의 제 1-7 중 어느 하나의 세포군의 용도.

19. 제 1-18 중 어느 하나에 있어서, pPS 세포가 인간 포배에서 수득되는 세포의 자손인 세포군, 조성물, 방법 또는 용도.

20. 제 1-19 중 어느 하나에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기 세포인 세포군, 조성물, 방법 또는 용도.

Claims

분화된 세포군에 있어서, 5% 이상의 세포가 내생적 유전자로부터 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸을 합성하고, 상기 분화된 세포군이 영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포주의 시험관 내 (in vitro) 자손이고, 상기 분화된 세포군이 이들이 유래된 pPS 세포주와 동일한 게놈을 갖는 분화된 세포군.
제 1 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기 세포이거나 인간 포배에서 수득된 세포의 자손인 분화된 세포군.
제 1 항에 있어서, 1% 미만의 세포가 엘라스틴, 제 I 형 콜라겐, 제 X 형 콜라겐, 또는 오스테오칼신을 합성하는 분화된 세포군.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 분화된 세포군의 수득 방법에 있어서, pPS 세포를 응집물로 분화시키고, 분화된 세포를 연골세포 분화 인자의 혼합물과 배양하는 것을 포함하는 방법.
제 4 항에 있어서, 연골세포 분화 인자의 혼합물에 전환 성장 인자 (TGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 성장 및 분화 인자 (GDF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 헤지호그 단백질 (HH), L-아스코르브산, 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질 (PTHrP) 로부터 선택되는 하나 이상의 인자가 포함되는 방법.
연골 생성 방법에 있어서, 세포군이 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸을 합성하는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 분화된 세포군을 인큐베이션시키는 것을 포함하는 방법.
생체 내 연골의 생성, 보수 또는 유지를 위한 약학 조성물에 있어서, 생체 내에서 재흡수되는 매트릭스와 조합된 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 분화된 세포군을 포함하는 조성물.
관절 외상, 관절염, 또는 골관절염의 치료 또는 성형 수술에서의 사용을 위한 의약 제조에 있어서의 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 분화된 세포군의 이용 방법.
췌장 호르몬 분비 세포를 생성하기 위한 시스템에 있어서, 제 1 항의 분화된 세포군, 및 이들이 수득된 미분화 pPS 세포주를 포함하는 시스템.
삭제
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 분화된 세포군의 수득 방법에 있어서, pPS 세포를 분화시킨 후 분화 세포를 연골세포 분화 인자의 혼합물과 배양하는 것을 포함하는 방법.
제 9 항에 있어서, pPS 세포를 분화시켜 배상체 (embryoid bodies) 를 형성하는 것을 포함하는 방법.
제 9 항에 있어서, 연골세포 분화 인자의 혼합물에 전환 성장 인자 (TGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 성장 및 분화 인자 (GDF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 헤지호그 단백질 (HH), L-아스코르브산, 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질 (PTHrP) 로부터 선택되는 하나 이상의 인자가 포함되는 방법.
연골 생성 방법에 있어서, 세포군이 제 II 형 콜라겐 또는 아그레칸을 합성하는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 분화된 세포군을 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법.
생체 내 연골의 생성, 보수 또는 유지를 위한 약학 조성물에 있어서, 생리적 상용성 부형제 중에 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 분화된 세포군을 포함하는 조성물.
제 13 항에 있어서, 생체 내에서 재흡수되는 매트릭스를 추가로 포함하는 약학 조성물.
연골세포 성장, 분화 또는 연골 성분의 합성을 조절하는 그 능력에 대한 화합물의 스크리닝 방법에 있어서, 화합물과 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 분화된 세포군을 조합하고, 화합물과 조합되어 얻어지는 세포군에서의 임의의 표현형 또는 대사 변화를 결정하고, 화합물의 연골세포 성장, 분화 또는 연골 성분의 합성을 조절하는 능력을 상기 변화와 연관시키는 것을 포함하는 방법.
대상체에서 연골의 재건 방법에 있어서, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 분화된 세포군을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
대상체에서 연골 재건을 위한 의약 제조에 있어서의 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 분화된 세포군의 용도.
관절 외상, 관절염, 또는 골관절염의 치료 또는 성형 수술에서의 사용을 위한 의약 제조에 있어서의 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 분화된 세포군의 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배에서 수득되는 세포의 자손인 분화된 세포군.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기 세포인 분화된 세포군.
실질적으로 상기에 기재된 바와 같이 영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포로부터 수득되는 연골세포 및 연골세포 전구 세포.
실질적으로 상기에 기재된 바와 같이 pPS 세포로부터 연골세포 및 연골세포 전구 세포를 제조하는 방법.
실질적으로 상기에 기재된 바와 같은 약학 제제.