JPS63216493A - 高純度イソマルト−スの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「技術分野」 本発明は、デキストランを原料として高純度のイソマル
トースを製造する方法に間する。

「従来技術およびその問題点」 従来、特に高純度のイソマルトースは、高価なものであ
り、研究用試薬として少量生産されているにすぎなかっ
た。ところが、近年、インマルトースが抗う触性を有す
ること（特開昭５８−７６０６３号参照）、およびヒト
の腸内有用細菌であるビヒダス薗の増殖効果を有するこ
と（特開昭６１−２２７７７号参照）などが報告され、
イソマルトースの利用分野が拡大され始めている。実際
に、インマルトース８２０％（ｗ／ｗ）程度含有する水
飴が一部市販されでいる。

現在、インマルトースの製造方法としては、マルトース
またはマルトース水飴などを原料としてカビの生産する
α−グルコシダーゼの一種であるマルトーストランスグ
ルコシダーゼを作用させる方法（Ｊ、Ｈ，Ｐａｚｕｒ　
ａｎｄ　Ｔ、Ａｎｄｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣａｒ
ｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ、　Ｖｏｌ
Ｉ　、　ｐ、３１９〜３２０゜および特開昭６１−２１
９３４５号参照）、または、６０％（Ｗ／Ｗ）以上の高
濃度のグルコース溶液にアスペルギルス・ニガーＡｓ　
ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ）起源のグルコアミラー
ゼを作用古せて調製する方法（特開昭６１−２１９３９
２１９３９２号参照用されている。

しかしながら、これらの方法では、主成された槽液中に
おけるインマルトースの含量は、せいぜい２５〜２８％
（Ｗ／Ｗ）程度であり、イソマルトースの純度を上げる
ためには、各種のクロマト分離、例えばゲルろ過りＯマ
ドグラフィー、カーボンヵラムクロマトグラフィー、ま
たは、強酸性カチオン交換相ｉｔ用いたカラムクロマト
グラフィーによる精製が必要とされた。また、上記の方
法では、インマルトースと同重合度を有するマルトース
も大量生成するため、各種のクロマト分Ｍを適用しでも
マルトースの混入がさけられず、高純度イソマルトース
の調製は困難であった。

また、デキストランを原料としで、これを酸分解した復
、カーボン・セライト力ラムクロマトグラフィーヲ用い
で精製する方法（Ｗ、Ｊｉｈｅｌａｎ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ＶｏｌＩ　。

ρ、３２１〜３２４参照）も提案されている。

しかしながら、この方法によって得られるイソマルトー
スの収率は、原料あたり２０％（Ｗ／Ｗ）程度でしかな
く、生産コストが高くなるという問題点があった。

このように、イソマルトースを高純度で、しかも高収率
で製造する方法は、未だ見出されておらず、このことが
、イソマルトースの広範囲の利用を妨げる要因となって
いた。

「発明の目的」 本発明の目的は、イソマルトースを高純度かつ高収率で
製造できるようにした高純度イソマルトースの製造方法
を提供することにある。

「発明の構成」 本発明による高純度イソマルトースの製造方法は、デキ
ストランを酸処理する工程と、この酸処理液にイソマル
トデキストラナーゼを作用させて酵素反応を行なう工程
と、この酵素反応液を分画用膜に透過させる工程とを含
むことを特徴とする。

本発明においで、原料として用いられるデキストランは
、グルコースが主にα−１，６グルコシド結合で連結し
た冬場であるが、その分子中には、α−１，２−、α−
１，３−およびα−１，４−グルコシド結合も一部存在
することが明らかにされでいる（Ｒ，Ｌ、　　Ｓｉｄｅ
ｂｏｐｈａｍ、、　Ａｄｖ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｃｈ
ｅｍ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３０３７１（１９７４）参照）、シ
たがって、デキストランにイソマルトデキストラナーゼ
を直接作用させた場合には、α−１，６−グルコシド結
合以外のところで反応が停止し、せいぜい３０〜４０％
のイソマルトースしか得られない。

すなわち、第３図には、０．１％濃度および０．２％濃
度の各デキストラン水溶液にイソマルトデキストラナー
ゼを直接作用させた場合における反応時間と分解率の関
係が示されでいる０図中、Ａは０．１％濃度のデキスト
ラン水溶液を用いた結果であり、８は０．２％濃度のデ
キストラン水溶液を用いた結果である。このように、デ
キストランにイソマルトデキストラナーゼｔｉｉＷｉ作
用させた場合には、その分解率が３０〜４０％で止まっ
てしまうことがわかる。

そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、まず、デキ
ストラン中のα−１，６−グルコシド以外の結合、すな
わち、α−１，２−、α−１，３−およびα−１，４−
グルコシド結合を選択的に酸処理により分解した竣、イ
ソマルトデキストラナーゼを作用させることにより、イ
ソマルトースを高収率で生成できることを見出し、また
、こうして生成されたイソマルトースを分画用膜に透過
させて選択的に取出すことにより、イソマルトースが高
純度で得られることを見出し、これらの事実に基づいて
本発明を完成するに至ったのである。

本発明の原料であるデキストランは、例えば「デキスト
ランＴ２Ｏ００Ｊ　　（商品名、ファルマシア■製）な
どの市販のものを使用することができる。また、デキス
トラン生合成菌であるロイコノストック・メセンテロイ
デスＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ甑…紅肛虹伽Ωなどを用い
て、下記文献記載の方法により、シュークロースを炭素
源として培養することによって調製することも可能であ
る（Ｅ、Ｊ。

Ｈｅｈｒｅ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、、　９３．２３７（
１９４１）、、　Ｅ、Ｊ、Ｈｅｈｒｅａｎｄ　Ｊ、Ｙ、
５ｕ９９．、　Ｊ、Ｅｘｐｔｌ、ｍｅｄ、、　７５．３
３９（１９４２）、。

＾、Ｊｅａｎｅｓ　ｅｔ、ａｌ、　Ｊ、８ｉｏ１．　Ｃ
ｈｅｍ、、１７６、６０３（１９４８）９照）。

本発明においでは、上記デキストランを酸処理するので
あるが、この場合、酸としでは塩酸、硫酸など各種のも
のを使用できる。また、酸の濃度は、基質濃度０．１〜
０．２％（ｗ／ｗ）の場合、０．０４〜０．５Ｎが好ま
しく、さらには０．０５〜０．３Ｎが好ましい、なお、
基質濃度を高くする場合には、それに対応して酸の濃度
を高くすればよい、ざらに、処理温度は、９０〜１００
℃が好ましく、９５〜１００℃がより好ましい、処理時
間は、１〜１０時間程度が好ましく、２〜７時間かより
好ましい、したがって、酸処理は、所定の規定濃度の酸
に、一定濃度にデキストランを溶解し、上記のような条
件で処理することにより行なうことができる。なお、本
発明者らの検討した結果によれば、０．ＩＮ　ＨＣＩ。

９９．５±０．１℃で処理した場合、それぞれの結合の
酸分解における速度を擬−次反応の速度定数にで比較す
ると、第１表のようになった（Ｍ、Ｌ。

Ｗｏｌｆｒｏｍ　ｅｔ、　ａｌ、、Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈ
ｅｍ、、　４０．８２（１９６３）。

千葉ら、澱粉科学２５，１目（＋９７８）より引用）、
このように、酸処理により、α−１，２−、α−１，３
−およびα−１，４−グルコシド結合が、α−１，６−
グルコシド結合に先立つて選択的に分解されることがわ
かる。

（以下、余白） 第１表 次に、上記のようにして酸処理したデキストラン溶液を
等規定のアルカリ溶液で中和した後、イソマルトデキス
トラナーゼ（ｉｓｏｍａｌｔｏｄｅｘｔｒａｎａｓｅ。

別名１．６−ａ−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ　ｉｓｏｍａｌｔｏ
ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、、　Ｅ　Ｃ３，２，１，９４）に
よる酵素反応を行なう。

本発明で使用するイソマルトデキストラナーゼは、例え
ばアルスロバクタ−・グロヒホルミスＡｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ　　ｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓに属するイソマルト
デキストラナーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取
することができる。かかるイソマルトデキストラナーゼ
生産菌としては、例えばアルスロバクタ−・グロビホル
ミスエ６株組７ｊｉ７０ｂａｃｔｅｒｌ旦如ユ虹エロー
■６株）が知られいる。この菌株は、東京大学応用微生
物研究所（東京都文京区弥生１−１−１）に寄託番号Ｉ
ＡＭ＋２＋０３として寄託されており、また、Ｎｏｔｈ
ｅｒｎ　Ｒｅ９ｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎ
ｔｅｒ。

Ｐｅｏｒ’ｉａ、　ＩＩｌ、、　Ｕ、Ｓ、＾、に寄託番
号ＮＲＲＬ　Ｂ−４４２５として寄託されでおり、誰で
も容易に入手できる微生物である。

この菌株を用いたイソマルトデキストラナーゼの製造は
、例えば次のようして行なうことができる。まず、ジャ
ーファーメンタ−を用い、１％デキストラン、０．２％
ＮＨ４８０３，０，１％にＨ２ＰＯ４，０，０５％Ｍ９
Ｓ０４・７Ｈ２０，０，０２％ＣａＣｌ２”２Ｈ２０お
よび１％ポリペプトンを含む３βの液体培地に上記菌株
を殖菌し、６Ｉ２／ｍｌｎの通気、攪拌をしながら、２
５℃で４８時間培養する０次に、この培養液を連続遠心
機（１０，０ＯＯＸ　ｇｌにかけて菌体を除去し、得ら
れる上清液に２倍量の蒸留水を加え、ＩＮ　ＨＣＩでｐ
Ｈ４，５とする。そして、０．０２５　ｍｏｌ　Ｍｃｌ
ｌｖａｉｎｅ　Ｗ衝液（ｐＨ４，５）で予め平衡化され
でいるＣＭ−セルロースに、イソマルトデキストラナー
ゼを選択的に吸着させてカラムに流し込み、０．７　ｍ
ｏｌ　ＮａＣ１含有の上記緩衝液で溶出することにより
、高純度のイソマルトデキストラナーゼを高収率で得る
ことができる。なお、本発明においては、アルスロバク
タ−・グロどホルミスＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　　Ｉ
ｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　５！以外の微生物によって製造さ
れたイソマルトデキストラナーゼを使用することもでき
る。

イソマルトデキストラナーゼの反応条件についで述べる
と、反応液のｐＨは、４．５〜６．０が好ましく、５．
０〜５．５がざらに好ましい、このため、上記のような
ｐａｌとなるように、所定濃度の緩衝液を用いることが
好ましい。また、反応温度は、３０〜７０℃が好ましく
、３５〜６５℃がざらに好ましい、さらに、イソマルト
デキストラナーゼの基質に対する添加量は、反応速度に
間係するのみであり、特に限定する必要はないが、通常
、基質１ｇ当り５単位以上、好ましくは１０単位以上添
加するのが適当である。なお、本発明において、イソマ
ルトデキストラナーゼの酵素活性は、デキストランを基
質としで、ｐＨ５，３，３０℃の条件下で酵素反応を行
ない、１分間に１はｍｏｌのグルコシド結合を切断する
酵素ｊ１を１単位としている。また、反応液中に、安定
剤として牛血清アルブミン等を添加することにより、イ
ソマルトデキストラナーゼ活性を有効に保ちつつ反応を
行なうことができる。

次に、本発明では、上記のようにイソマルトデキストラ
ナーぜを作用させで得られた酵素反応液を分画用膜に透
過させで、生成されたイソマルトースを高純度で採取す
るようにする。この場合、分画用膜としては、種々の逆
浸透膜や、分子［１０，０００〜２０．０００以下の分
子のみを透過させる限外ろ過膜などが有効に用いられる
。この場合、酵素反応および膜処理は、酵素反応が終了
した復に、反応液を取出して膜処理を行なうバッチ反応
式で行なってもよく、あるいは、酵素反応を行ないなが
ら順次反応液を取出して膜処理を行なう連続反応式で行
なってもよい。

第１図には、連続反応式による製造装置の一例が示され
でいる。すなわち、この装置は、リザーバー１１、反応
装置１２、貯槽１３からなっており、リザーバー１１お
よび反応袋Ｍ１２は、恒温槽１４中に浸漬されでいる。

リザーバー１１には、窒素ガスＧなどの気体導入管１５
と、基質溶液供給管１６とが接続されでいる。そして、
リザーバー１１には、基質２液１７が入れられ、気体導
入管１５がら窒素ガスＧなどを導入することにより、そ
の圧力で基質溶液１７が徐々に基質溶液供給管１６がら
押出されるようになっている０反応装置１２は、反応容
器１８、分画用１１１９、スクーラー２０で構成されで
おり、前記基質溶液供給管１６は、反応容器１８に接続
されている。

また、分画用膜１９を透過した反応液は、取出し管２１
１！通って貯槽１３に貯留されるようになっている。

したがって、この装置では、リザーバー１１内にデキス
トランを酸処理しでなる基質溶液を貯留しておき、反応
装置！１＋２の反応容器１８内にイソマルトデキストラ
ナーゼおよび必要に応じて牛血清アルブミン等の安定剤
を含有する溶液を貯留しでおく、この状態で、気体導入
管１５から窒素ガスＧを徐々に導入しつつ、スターク−
２０により反応容器１８中の基質溶液を攪拌して酵素反
応させる。窒素ガスＧの圧力により、リザーバー１１中
の基質溶液１７が徐々に反応客器１８中に導入されるの
で、反応容器１８中の反応液は、徐々に分画用膜１９を
透過し、取出し管２１を通って貯槽１３中に貯留される
ようになっている。このようにして、基質溶液１７を連
続的に反応容器１８に供給し、反応客器１８内で酵素反
応を行ないつつ、生成したイソマルトースを選択的に分
画用膜１９から透過させて、高純度のイソマルトース含
有液を採取することができる。

「発明の実施例」 実施例１ 「デキストランＴ２Ｏ００Ｊ　　（商品名、ファルマシ
ア■製）　０．５９を０．５　Ｎ　ｔ！Ａ１１００　ｍ
ｌに溶解した俊、温水湯浴（９５℃）で４時間処理し、
デキストランの加水分解を行なった０次いで、等規定の
水酸化ナトリウム溶液１００　ｍｌを用いて中和した稜
、ざらに０．０５Ｍ酢酸ｍ衡漬（ｐＨ５，０）　３００
ｍ１を添加して基質溶液とした。

そして、第１図に示したような製造袋Ｍを用いて酵素反
応を行なった。すなわち、上記基質溶液１７ヲリザーバ
ー１１に入れ、イソマルトデキストラナーゼ１３．８単
位および牛血清アルブミン（５００μｇ／ｍｌ）を含有
する水溶液１０ｍ１を反応容器１８中に入れ、分画用膜
１９として「ダイアフロＰＭＩＯＪ　　（商品名、アミ
コン社製、分子量カット１０．０００）　！用い、リザ
ーバー１１に０．１〜０．３気圧／ｃｒｔ４の窒素ガス
を送りながら、３７℃で３２時間連続的に反応および分
画を行なった。

次に、分画用膜１９を透過したう液を減圧濃縮機により
濃縮し、得られたインマルトースの純度をｒ８ｉｏ−Ｇ
ｅｔ　Ｐ−２Ｊ　　（商品名、バイオ・ラド社製）によ
るゲルろ過クロマトグラフィーによって検定した。なお
、溶出液は蒸留水、溶出速度は４２ｍ１／ｈｒとした。

この結果を第２図に示す０図中、Ｃはイソマルトースの
ピーク、Ｏはグルコースのピークである。このように、
グルコースのゎずがなピークが認められるものの、大部
分はイソマルトースであった。この結果、インマルトー
スの純度は９６％以上であり、回収率は固形分当り約６
５％であった。

実施例２ 「デキストランＴ２Ｏ００Ｊ　　（商品名、ファルマシ
ア■製）　０．５９　ヲ０．２　Ｎ塩酸１００　ｍｌに
溶解し、実施例１と同様に酸処理した後、同様に３７℃
で３２時間酵素反応および膜分画を行なった。その結果
を第２表に示す。

実施例３ 「デキストランＴ２Ｏ００Ｊ　　（商品名、ファルマシ
ア■製）　ＬＯ９８０，２Ｎ塩酸１００　ｍｌに溶解し
、実施例１と同様に酸処理した後、同様に３７℃で３２
時間酵素反応および膜分画を行なった。その結果を第２
表に示す。

（以下、余白） 第２表（実施例２および３の結果） 注）加水分解における塩酸濃度、　０．２　Ｎ酵素反応
および膜処理時間；３２時間 膜処理における富素圧力；　０．　ｌ　　ａｔｍ／ｃ％
膜透過液流速：　＋４．１　ｍｌ／ｈｒ以上、実施例１
．２．３の結果より、イソマルトースの純度は約８２〜
９６％（Ｗ／Ｗ）であり、その回収率も約６５〜７１％
と高いことがわかる。

「発明の効果」 以上説明したように、本発明によれば、デキストランを
酸処理し、この処理液にイソマルトデキストラナーゼを
作用させ、生成されたイソマルトースを分画用膜を透過
させて採取するよう（こしたので、イソマルトースを高
純度かつ高収率で得ることができる。また、クロマト分
離なとの精製工程を必要とせずに、極めて簡単な工程で
高純度のイソマルトースを製造できるので、産業上、極
めて有効な方法と考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にあける酵素処理および膜処理に用いら
れる装置の一例を示す概略図、第２図は本発明の実施例
で得られた透過液のゲルろ過クロマトグラフィーの溶出
パターンを示す図、第３図は０．１％および０．２％の
デキストラン水溶液を基質としてイソマルトデキストラ
ナーゼを作用させた場合の分解率の経時変化を示す図で
ある。 図中、１１はリザーバー、１２は反応製画、１３は貯槽
、１４は恒温槽、１５は気体導入管、１６は基質溶液供
給管、１７は基質溶液、１８は反応容器、１９は分画用
膜、２０はスターラー、２１は取出し管である。 ツ メｒｊ　ｈ　　　Ｎｏ、　　（４，７ｍ１２／チー−づ
）第２図 叫　則　（Ｈｒ） 第３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. デキストランを酸処理する工程と、この酸処理液にイソ
   マルトデキストラナーゼを作用させて酵素反応を行なう
   工程と、この酵素反応液を分画用膜に透過させる工程と
   を含むことを特徴とする高純度イソマルトースの製造方
   法。