KR100682185B1

KR100682185B1 - 생물학적 활성분자의 제조

Info

Publication number: KR100682185B1
Application number: KR1020017012973A
Authority: KR
Inventors: 메나켐 루빈스테인; 비안링 리우; 다니엘라 노비크; 피에르 그라베르
Original assignee: 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2007-02-12
Also published as: EP1169460A2; US7098002B1; UA73940C2; MXPA01010487A; ATE326536T1; NO329525B1; DE60028022D1; KR20020007365A; IL145842A0; CN1324140C; WO2000061768A3; CA2368994C; CA2368994A1; AR023468A1; HK1044351A1; EA006825B1; EE05591B1; ZA200108364B; WO2000061768A2; DK1169460T3

Abstract

고유 절단위치를 임의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 위치로 돌연변이시키고 돌연변이된 분자를 절단하여 생물학적 활성분자를 산출하는 방법으로, 생물학적 불활성 전구물질로부터 생물학적 활성분자를 생산한다.

Description

생물학적 활성분자의 제조{PREPARATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULE}

본 발명의 배경기술

본 발명은 불활성 전구물질로 생성되고 프로테아제에 의해 생체내에서 절단되어 성숙한 생물학적 활성분자로 변하는 생물학적 활성분자의 생산에 관한다.

좀더 구체적으로, 본 발명은 상응하는 전구물질로부터 자가절단, 다른 카스파제에 의한 절단 또는 프로테아제 카스파제-1[인터루킨-1 전환효소(ICE)] 절단으로 생체내에서 만들어지는 카스파제와 사이토킨의 생산에 관한다. 이런 방식으로 생산되는 사이토킨의 예로는 인터루킨 1β와 인터루킨-18을 들 수 있다.

본 발명의 배경기술

카스파제는 Asp 잔기 이후의 표적 단백질을 절단하는 시스테인 프로테아제 과(科)이다. 공지된 7개의 카스파제 중에서 카스파제-1, 카스파제-2 및 카스파제-4, -5, -11이 친염증 사이토킨의 공정에 주로 관여하고, 다른 것들은 아폽토시스 또는 예정된 세포 사멸의 개시와 실행에 중요한 역할을 수행한다. 이들 카스파제는 인터도메인 링커에 존재하는 특정 내부 Asp 잔기 뒤에서 절단되어 활성화되는 촉매불활성 선구효소(zymogen)로 합성된다는 공통된 특징 및 Asp 잔기 이후에서 기질을 절단하는 능력을 공유한다. 따라서, 특정 성숙한 활성 카스파제, 특히 긴 프 로도메인 카스파제로부터 유래된 카스파제는 자신과 다른 불활성 카스파제 선구효소를 가공하고 활성화시킬 수 있다. 일차 구조에 기초하여, 친아팝토시스 카스파제는 2군, 다시 말하면 긴 아미노-말단 프로도메인을 보유하는 카스파제-2, -8, -9, -10을 포함하는 I군 및 프로도메인이 짧거나 없는 카스파제-3, -6, -7과 같은 II군으로 구분할 수 있다. 시험관내 절단 실험은 II군 카스파제가 단백분해 가공을 위해, 활성화된 I군 카스파제를 필요로 한다는 것을 시사한다(12).

카스파제는 절단위치의 특이성으로 달리 구분할 수 있다(13). 이에 따른 I군 카스파제는 공통서열 WEHD를 보유하고(카스파제-1, -4, -5), II군 카스파제는 공통서열 DExD를 보유하고(카스파제-2, -3, -7), III군 카스파제는 공통서열 (IVL)ExD를 보유한다(카스파제-6, -8, -9). 카스파제-8 최적위치는 LETD이다(14).

초기에 인터페론-

(IFN-

)-유도 인자로 알려졌던 인터루킨-18(IL-18)은 IL-1 단백질 과(科)와 구조적 특성을 공유하는 최근에 밝혀진 사이토킨이다(1-4). IL-18은 열-불활화된 여드름균(Propionbacterium acnes) 및 리포폴리사카라이드(LPS)로 처리한 생쥐의 간으로부터 초기에 정제되고, 이후 클론되었다(2, 5). 사람 IL-18의 클로닝은 최근에 기술되었다(3).

IL-12와 같이, IL-18은 간 쿠퍼 세포 및 다른 대식세포와 같은 활성화된 대식세포에 의해 생산된다(3). IL-18은 Th1 반응의 초기 유도물질로서, IFN-

, TNF-

, 과립백혈구-대식세포 콜로니-자극 인자, IL-2의 생산을 보조-촉진한다(6). 또한, 이것은 Fas 리간의 발현을 증폭하여, 안티-CD3-유도된 T-세포 증식을 강화하고 자연킬러세포 세포독성을 증가시킨다(6, 7).

IL-18과 IL-1β은 4-나선 다발 구조를 보이는 대부분의 다른 사이토킨과는 달리, β-시트 구조를 보유한다(7). IL-1β와 유사하게, IL-18은 신호 펩티드가 결핍된 생물학적 불활성 전구물질(프로IL-18)로 합성된다(3). IL-18과 IL-1β 전구물질은 P1위치에서 아스파르트산 잔기 뒤를 절단하는 카스파제 1(IL-1β-전환 효소 또는 ICE)에 의해 절단된다. 생성된 성숙 사이토킨은 세포로부터 용이하게 방출된다(8, 9). 카스파제-1-결핍된 생쥐를 이용한 연구에서, 성숙한 IL-18의 IFN-

과 Th1 반응의 유도물질로서의 주요 역할이 확인되었다. 이런 생쥐에 여드름균(P. acnes)과 LPS를 주사하면, 야생형 생쥐에 비하여 순환하는 IFN-

의 수준이 낮아졌다(8, 9). IL-18을 주사하면, 카스파제-1-결핍된 생쥐에서 LPS-유도된 IFN-

수준이 회복되는데(9), 이는 카스파제-1이 활성 IL-18의 생산에 관여한다는 개념을 더욱 뒷받침한다. 다른 카스파제 및 특히 아폽토시스와 관련된 세포내 단백질을 절단하는 카스파제는 카스파제-1보다 활성이 100배이상 낮다. IL-18 결핍된 생쥐를 이용한 유사한 연구에서, NK 세포활성 및 사이토킨 유도에서 이의 역할이 확인되었다(10).

대장균에서 발현된 재조합 IL-1β와 생쥐 IL-18은 다시 접혀(folding) 완전히 활성화된 사이토킨을 생산할 수도 있다. 대장균 또는 다른 숙주에서 성숙형태의 사람 IL-18을 발현하려는 시도에서, 완전히 활성화된 사이토킨은 산출되지 않았다. 악성종양, 또는 인터페론-

생산유도가 필요한 다른 임의의 질환에서 이의 잠재적 치료요법적 용도로 인해, 성숙한 생물학적 활성 사람IL-18의 생산을 위한 효 과적인 발현시스템을 확립하는 것이 바람직하다.

본 발명의 요약

본 발명은 고유 형성 과정동안 생물학적 불활성 전구물질로 만들어지고 전구물질의 절단이후에 활성화되는 분자의 생산을 가능하게 한다. 이는 시험관내에서 용이하게 달성할 수 없다.

따라서, 본 발명은 고유 절단위치를 통상의 프로테아제에 의한 절단에 취약한 위치로 돌연변이시키고, 돌연변이된 분자를 절단하여 생물학적 활성분자를 산출하는 생물학적 불활성 전구물질로부터 생물학적 활성분자를 생산하는 방법을 제공한다.

생물학적 활성분자는 바람직하게는 카스파제 또는 사이토킨이고, 좀더 바람직하게는 IL-1β와 IL-18이다.

이런 사이토킨에서, 적절한 고유 절단위치는 카스파제-1 절단위치다.

절단에 활용되는 통상의 프로테아제는 트롬빈, 엔테로키나제, 서브틸리신, 제네나제^TM(New England Biolabs, Beverly MA, USA), 사람 리노바이러스 3C 프로테아제, Xa인자 프로테아제에서 선택할 수 있다. 절단에 카스파제를 이용하는 경우, 카스파제-8이 바람직하다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 상기 방법은 절단위치에서 돌연변이된 생물학적 활성분자의 전구물질을 인코드하는 cDNA로 구성되는 벡터로 숙주를 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 숙주를 배양하고, 전구물질을 발현하고, 프로테아제 처리후 생물학적 활성분자를 분리하는 것으로 구성된다.

cDNA가 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 코딩서열 다음에 프레임 융합되고 발현된 융합단백질이 프로테아제 처리에 앞서 글루타티온 아가로즈 비드에 포획된다는 점에서, 이를 임으로 달성할 수 있다.

본 발명은 또한, 생물학적 활성분자의 돌연변이된 전구물질을 인코드하는 cDNA를 제공하는데, 이는 GST 코딩서열에 임으로 융합된다.

본 발명의 한 구체예에서, 재조합 하이브리드 폴리펩티드 또는 융합단백질을 생산 및/또는 정제하는 공정을 제공한다. 좀더 구체적으로, 단백질 분자를 코딩하는 DNA 단편은 카스파제에 의해 인식되고 절단되는 펩티드 서열을 코딩하는 DNA를 연쇄(linking) 서열로 이용하여, 결합단백질을 코딩하는 DNA 단편에 융합시킨다. 융합된 DNA는 클로닝 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 이용하여 적절한 숙주를 형질전환시킨다. 발현직후 하이브리드 폴리펩티드는 결합단백질이 특이적 친화성을 갖는 리간드 또는 기질과 접촉시켜, 예를 들면 친화성 크로마토그래피로 정제한다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 결합단백질은 GST이고, 절단위치는 카스파제-8 절단위치다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 생물학적 활성분자에 관한다.

대장균에서 성숙한 IL-18을 발현시키면, 생물학적 활성이 결핍된 단백질이 만들어진다. 대장균에서 발현된 IL-18의 IL-18 폴리펩티드 골격을 정확하게 다시 접으려는 시도는 지금까지 성공을 거두지 못했다. 사람 IL-18과 사람 IL-1β는 생체내에서 프로IL-18과 프로IL-1β 전구물질로 발현되는데, 이들은 카스파제-1에 의 해 절단되어 각각 성숙한 생물학적 활성 IL-18과 IL-1β를 산출한다. 하지만, 카스파제-1은 상업적 구매가 불가능하다. 본 발명은 대장균에서 생물학적 활성분자의 생산을 위한 간단한 공정을 제공한다. 이를 위해, 사람 프로IL-18을 인코드하는 cDNA를 작제하는데, 여기서 카스파제-1 절단위치는 상업적으로 구매가능한 프로테아제의 절단위치(예, Xa인자)로 돌연변이시킨다. 조작을 용이하게 하기 위해, 돌연변이된 프로IL-18 cDNA는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 코딩서열에 융합시킨다. Xa인자 절단위치를 갖는 생성된 GST-프로IL-18 융합단백질은 대장균에서 발현시키고 글루타티온 아가로즈 비드에 포획한다. 높은 생물학적 활성을 보이는 성숙한 사람 IL-18은 Xa인자로 절단하여 비드로부터 방출시킨다.

유사하게, 사람 IL-1β의 카스파제-1 절단위치를 코딩하는 DNA 서열은 Xa인자의 절단위치로 돌연변이시킨다. 조작을 용이하게 하기 위해, 돌연변이된 프로IL-1β cDNA는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 코딩서열에 프레임 융합시킨다. Xa인자 절단위치를 갖는 생성된 GST-프로IL-1β 융합단백질은 대장균에서 발현시키고 글루타티온 아가로즈 비드에 포획한다. 성숙한 사람 IL-1β는 Xa인자로 절단하여 비드로부터 방출시킨다.

절단에 카스파제-8을 이용하는 경우에 유사한 과정을 실시하는데, 단 사람 IL-18 또는 사람 IL-1β의 카스파제-1 절단위치를 카스파제-8의 절단위치로 돌연변이시키는 점은 예외로 한다. 이후, GST 코딩서열에 대한 융합 및 다른 추가적인 단계는 전술한 바와 같이 실시한다.

도면의 간단한 설명

도1은 사람 프로IL-18 변이체(프로IL-18_IEGR)를 인코드하는 cDNA의 클로닝을 설명한다. 상기 cDNA는 중복 프라이머 방법을 활용한 3단계 PCR로 클론한다. 레인은 다음과 같다: M, 왼쪽에 표시된 DNA 크기 마크; 1, 제 1 PCR로 생산된 498 bp DNA; 2, 제 2 PCR로 생산된 551bp DNA; 3, 제 3 PCR로 생산된 600bp DNA, 이는 프로IL-18_IEGR을 인코드한다.

도2는 발현 플라스미드 pGEX-프로IL-18_IEGR의 구조를 도시한다. (a) 사람 프로IL-18_IEGR을 인코드하는 600bp BamHI/EcoRI cDNA의 측면 핵산 서열. BamHI과 EcoRI에 대한 제한 위치 및 Xa인자에 대한 표적위치는 괄호로 표시한다. 열린 화살표는 Xa인자 절단위치를 표시한다. (b) pGEX-2TK의 개요도. 제한위치를 또한 도시한다. 닫힌 화살표는 삽입체의 BamHI/EcoRI 결찰위치를 표시한다.

도3은 GST-프로IL-18_IEGR 융합단백질을 발현하는 대장균의 비정제 단백질 추출물의 SDS-PAGE를 보여준다. 레인은 다음과 같다: 1, 유도없이 모 플라스미드 pGEX-2TK로 형질전환된 세포; 2, 모 플라스미드 pGEX-2TK로 형질전환되고 0.1mM 이소프로필티오 갈락토시드(IPTG)로 유도된 세포. 글루타티온 티오리덕타제(GST)의 26kD 예상 밴드는 왼쪽에 화살표로 표시한다. 레인 3-7은 플라스미드 pGEX-프로IL-8_IEGR로 형질전환되고, 유도되지 않은(레인 3) 또는 지정된 시간동안 IPTG로 유도된 세포를 도시한다. 오른쪽에 화살표로 표시한 43kD 밴드는 GST-프로IL-8_IEGR 융합단백질과 크기에서 상응한다.

도4는 글루타티온-아가로즈에서 정제한 이후, GST-프로IL-8_IEGR 융합단백질의 SDS-PAGE(10% 아크릴아마이드)를 도시한다. 박테리아 초음파파괴물질의 상층액(도3, 레인7)은 글루타티온 아가로즈에서 친화성-정제한다. 레인은 다음과 같다: 1, 분자량 마크(왼쪽에 kD로 표시); 2, 친화성-정제된 GST-프로IL-18_IEGR. 겔은 쿠마시 블루로 염색한다.

도5는 정제된 사람 IL-18의 SDS-PAGE(12% 아크릴아마이드)를 도시한다. 글루타티온 아가로즈 비드에 포획되고 1:50(w/w)의 프로테아제 대 기질 비율로 Xa인자와 함께 배양한 GST-프로IL-18_IEGR융합단백질 및 상층액은 6시간후에 분석한다. 레인1, 왼쪽에 kD로 표시한 분자량 마크; 레인2, 글루타티온-아가로즈 비드의 상층액상의 사람 IL-18. 겔은 쿠마시 블루로 염색한다.

도6은 사람 IL-18의 생물검정을 보여준다. 표시된 용량의 사람 IL-18은 콘카나발린(Concanavalin) A(0.125㎍/㎖)와 폴리믹신 B의 존재하에, 뮤린 플라스틱-비부착 비장세포의 배양액(5X106 세포/웰)에 첨가한다. 상층액은 ELISA로 뮤린 인터페론-감마에 대하여 분석한다. Con A의 부재하에 IL-18(100ng/㎖)로 유도된 인터페론-감마의 수준은 160pg/㎖이다.

도7은 카스파제-8를 이용하여 hIL-18을 정제하는 기본 과정을 구성도 형태로 도시한다.

도8은 GST-프로-hIL-18_LETD의 서열을 보여준다. 박스는 카스파제-8 절단위치를 표시한다. 밑줄 친 서열은 성숙한 hIL-18이다.

도9는 글루타티온-아가로즈에서 GST-프로IL-18_LETD 융합단백질의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE(10% 아크랄아마이드 겔)을 도시한다. GST-프로IL-18_LETD을 발현하는 재조합 대장균 JM109의 세포파괴 상층액은 글루타티온 아가로즈에서 친화성-정제하고, 고체상에서 카스파제-8로 절단한다. 절단후 상층액은 농축하고, 슈퍼덱스-75에서 분자량 사이징(sizing)을 적용한다. 레인은 다음과 같다: 1, 분자량 마크(왼쪽에 kD로 표시); 2, 세포파괴 상층액; 3, 친화성 정제된 GST-프로IL-18_LETD; 4, 글루타티온-아가로즈 수지 포스트 카스파제-8 고형상 4시간 분해물; 5, 카스파제-8 농축된 4시간 분해물; 6. 순수한 hIL-18의 슈퍼덱스-75 풀(pool).

본 발명의 상세한 설명

본 발명에 따라, 카스파제-1 절단위치가 Xa인자 위치로 돌연변이된 사람 IL-18을 인코드하는 cDNA를 제조한다. 다른 프로테아제에 적합한 절단위치를 유발하는 다른 돌연변이를 활용할 수도 있다.

가능한 절단위치와 적절한 프로테아제의 예는 다음과 같다:

Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:1), 프로테아제 트롬빈에 의해 아미노산 Arg와 Gly사이가 절단되는 서열.

Ile-Glu-Gly-Arg-(SEQ ID NO:2), 프로테아제 Xa인자에 의해 Arg 잔기 뒤에서 절단되는 서열.

Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO:3), 프로테아제 엔테로키나제에 의해 Lys 잔기 뒤에서 절단되는 서열.

His-Tyr-(SEQ ID NO:4), 프로테아제 서브틸리신 또는 이의 변이체 제네나제^TM(New England Biolabs)에 의해 Tyr 잔기 뒤에서 절단되는 서열.

Tyr-His-(SEQ ID NO:5), 프로테아제 서브틸리신 또는 이의 변이체 제네나제^TM(New England Biolabs)에 의해 Tyr 잔기 뒤에서 절단되는 서열.

Leu-Gln-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-(SEQ ID NO:6), 사람 리노바이러스 3C 프로테아제에 의해 Gln 잔기 뒤에서 절단되는 서열.

유사하게, 카스파제-1 절단위치가 인자Xa로 돌연변이된 사람 프로IL-1β를 인코드하는 cDNA를 제조한다. 다른 프로테아제에 적합한 절단위치를 유발하는 다른 돌연변이를 활용할 수도 있다.

가능한 절단위치와 적절한 프로테아제의 예는 다음과 같다:

Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO:3), 프로테아제 엔테로키나아제에 의해 Lys 잔기 뒤에서 절단되는 서열.

Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:6), 사람 리노바이러스 3C 프로테아제에 의해 Gln 잔기 뒤에서 절단되는 서열.

돌연변이의 선택은 다음의 변수에 달려있다: 돌연변이에 의해 만들어진 절단위치는 프로IL-18 또는 프로IL-1β의 폴리펩티드 골격내의 다른 위치가 절단되지 않도록 매우 특이적이어야 한다; 프로테아제는 상업적 공급원으로부터 얻기 쉬워야 한다; 돌연변이는 프로IL-18 또는 프로IL-1β의 2차 또는 3차 구조에 중대한 변형을 유발하지 않아야 한다. Xa인자, 엔테로키나제 또는 서브틸리신은 다른 프로테아제에 비하여 사용하기에 바람직한데, 그 이유는 생성된 IL-18 또는 IL-1β가 변형된 아미노산을 보유하지 않기 때문이다. Xa인자는 사용하기에 특히 바람직한데, 그 이유는 이것이 가장 보존된 돌연변이를 필요로 하고, 따라서 프로IL-18 또는 프로IL-1β의 2차 혹은 3차 구조의 변형 위험 및 절단이 일어나지 않을 위험을 감소시키기 때문이다. Xa인자 또는 엔테로키나제는 다른 프로테아제에 비하여 사용하기에 바람직한데, 그 이유는 생성된 IL-18 또는 IL-1β가 변형된 아미노산을 보유하지 않기 때문이다.

카스파제-1 절단위치를 Xa인자 절단위치로 돌연변이시킨 사람 프로IL-18 변이체(프로IL-18_IEGR)를 인코드하는 cDNA를 작제하기 위하여, 사람 프로IL-18 cDNA에 L33I; S35G; D36R 돌연변이를 도입한다. 이들 돌연변이는 Xa인자 인식서열 IEGR을 산출한다.

사람 프로IL-18_IEGR을 발현하는 벡터는 다음의 방식으로 작제하였다. 건강한 제공자의 말초혈 단핵구세포(PBMC)는 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극한다. 세포로부터 전체 RNA를 추출한다. 상기 RNA는 역전사하고, 생성된 cDNA는 중 합효소 연쇄반응(PCR)을 위한 주형으로 사용한다. 중복 프라이머를 이용한 3단계 PCR동안 서열에 돌연변이를 도입한다(도1). 돌연변이된 사람 프로IL-18을 코딩하는 생성된 600bp PCR 산물은 TA 클로닝 벡터(pGEM-T, Promega)로 클론하고, 이의 DNA 산물은 DNA 서열분석으로 확인한다. 생성된 pGEM-T-프로IL-18_IEGR 플라스미드는 EcoRI과 BamHI으로 절단하고, 사람 프로IL-18_IEGR을 인코드하는 600bp 단편은 GST 유전자서열을 보유하는 원핵 발현 벡터 pGEX-2TK(Pharmacia)에 서브클론한다. 생성된 발현벡터는 GST 유전자의 3'말단에 프레임 융합된 사람 프로IL-18_IEGR유전자 서열을 보유한다(도2).

이후, GST-프로IL-18_IEGR의 발현 및 정제를 실시한다. 플라스미드 pGEX-프로IL-18_IEGR로 형질전환된 대장균 JM109의 새로운 단일 콜로니는 0.6 OD₆₀₀ 밀도에 도달할 때까지, 37℃에서 교반하면서 성장시킨다. 그 다음, 이소프로필-티오갈락토시드(IPTG)로 단백질 발현을 유도하고, 37℃에서 추가로 3시간동안 배양한다. 전체 박테리아 단백질의 SDS-PAGE에서, GST-프로IL-18_IEGR과 크기에서 상응하는 43kD 단백질의 유도가 밝혀졌다(도3). GST-프로IL-18_IEGR 분리의 모든 하류 단계는 4℃에서 실시한다. 박테리아는 원심분리로 수거하고, 프로테아제 저해물질을 함유한 인산염 완충식염수(PBS)에서 재부유시킨다. 박테리아는 초음파처리로 용해하고 1%의 최종 농도로 트리톤 X-100을 첨가하고, 정화(淨化)된 용해질은 글루타티온-아가로즈 비드(Pharmacia)와 혼합한다. 비드는 세척하고, 비드의 부분용액은 SDS- PAGE로 분석한다. GST-프로IL-18_IEGR융합단백질에 상응하는 43kD 단일 밴드가 발견되었다(도4). 이후, 상기 비드는 Xa인자로 절단하고, 상층액은 수거한다. 상층액의 SDS-PAGE에서, 성숙한 사람 IL-18의 예상질량과 일치하는 18kD 정도의 밴드가 다수 나타난다. 또한, 19.5kD의 밴드가 추가적으로 관찰된다(도5). 18kD 밴드와 19.5kD 밴드의 단백질 서열분석에서 성숙한 사람 IL-18의 N-말단 예상서열이 산출되었다. GST-프로IL-18_IEGR 융합단백질에 상응하는 43kD 밴드는 절단이후에도 글루타티온-아가로즈 비드에 여전히 존재했는데, 이는 불완전한 절단을 시사한다.

재조합 사람 IL-18은 인터페론-감마의 발현유도 능력에 기초하여, 뮤린 항체생산세포에서 생물활성에 대하여 분석하였다. 생쥐 비-부착 비장세포를 사람 IL-18 단독과 함께 배양하면 IFN-감마 생산이 전혀 관찰되지 않는데, 이는 보조-자극물질의 필요성을 암시한다. 0.125㎍/㎖ Con A 단독은 유의성있는 수준의 IFN-

을 유도하지 않았다. 비-부착 항체생산세포를 Con A 및 본 발명에 따른 IL-18과 함께 배양하면, IFN-

의 약량-의존한 유도가 달성되었다(도6).

카스파제-1 절단위치를 Xa인자 절단위치로 돌연변이시킨 사람 프로IL-1β 변이체(프로IL-1β_IEGR)를 인코드하는 cDNA를 작제하기 위하여, 사람 프로IL-1β cDNA에 다음의 돌연변이를 도입한다: Y1131, V114E, H115G, D116R. 이들 돌연변이는 Xa인자 인식서열 IEGR을 산출한다.

사람 프로IL-1β_IEGR을 발현하는 벡터를 작제하기 위하여 다음의 단계를 취 한다. 건강한 제공자의 말초혈 단핵구세포(PBMC)는 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극한다. 세포로부터 전체 RNA를 추출한다. 상기 RNA는 역전사시키고, 생성된 cDNA는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 위한 주형으로 사용하는데, 여기서 프라이머는 사람 프로IL-1β의 코딩서열에 상응한다. 생성된 PCR 산물은 TA 클로닝 벡터(pGEM-T, Promega)로 클론하고, 이후 적당한 올리고뉴클레오티드로 특정위치 돌연변이를 유발시킨다. 돌연변이된 사람 프로IL-1β를 코딩하는 생성된 벡터서열은 서열분석으로 확인한다. 생성된 pGEM-T-프로IL-1β_IEGR 플라스미드는 적당한 제한효소로 절단하고, 사람 프로IL-1β_IEGR을 인코드하는 ~820bp 단편은 원핵 발현 벡터 pGEX-2TK(Pharmacia)에 서브클론한다. 생성된 발현벡터는 GST 유전자의 3'말단에 프레임 융합된 사람 프로IL-1β_IEGR유전자 서열을 보유한다.

GST-프로IL-1β_IEGR의 발현 및 정제는 유사하게 실시한다. 플라스미드 pGEX-프로IL-1β_IEGR로 형질전환된 대장균 JM109의 새로운 단일 콜로니는 0.6 OD₆₀₀ 밀도에 도달할 때까지, 37℃에서 교반하면서 성장시킨다. 그 다음, 이소프로필-티오갈락토시드(IPTG)로 단백질 발현을 유도하고, 37℃에서 추가로 3시간동안 배양한다. 전체 박테리아 단백질의 SDS-PAGE에서, GST-프로IL-1β_IEGR과 크기에서 상응하는 ~52kD 단백질의 유도가 밝혀졌다(도3). GST-프로IL-1β_IEGR 분리의 모든 하류 단계는 4℃에서 실시한다. 박테리아는 원심분리로 수거하고, 프로테아제 저해물질을 함유한 인산염 완충식염수(PBS)에서 재부유시킨다. 박테리아는 초음파처리로 용해 하고 1%의 최종 농도로 트리톤 X-100을 첨가하고, 정화된 용해질은 글루타티온-아가로즈 비드(Pharmacia)와 혼합한다. 비드는 세척하고, 비드의 부분용액은 ~52kD GST-IL-1β 융합단백질의 존재에 대하여 SDS-PAGE로 분석한다. 이후, 상기 비드는 Xa인자로 절단하고, 성숙한 사람 IL-1β를 함유하는 상층액을 수거한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 발현 및 정제는 카스파제에 대한 절단위치를 보유하는 융합단백질을 생산하여 달성한다. 관심있는 단백질에 융합된 결합펩티드를 발현하는 플라스미드는 카스파제 절단위치가 활성 폴리펩티드의 정제에 편리한 위치에 도입되도록 돌연변이시킬 수 있다.

카스파제 인식위치는 4개의 아미노산으로 구성되는데, 마지막 아미노산은 아스파르트산이다. 일반적으로, 카스파제는 통상적으로 사용되는 프로테아제에 비하여 상기 절단위치에 대하여 더 높고 상이한 특이성을 보이기 때문에, 융합펩티드를 절단하는데 유용한 것으로 이전에 공지되었던 프로테아제에 비하여 현저한 이점을 제공한다. 정제 과정은 도7에 예시한다.

각 카스파제에 대한 적절한 절단위치는 기존 문헌에서 규정한다(Ann Rev. Bioch 1999). 이들 모두 P1위치에 Asp 잔기를 공통적으로 보유한다.

전술한 플라스미드 pGEX-프로IL-18_IEGR을 변형하여, Xa인자 절단위치가 카스파제-8 절단위치로 돌연변이된 상이한 사람 프로IL-18 변이체(프로IL-18_LETD, 도8)를 수득한다.

카스파제를 이용할 때의 다른 장점은 절단수율과 절단시간 측면에서 높은 효 율이다. 표1에서 도시한 바와 같이, pGEX-프로IL-18_IEGR과 pGEX-프로IL-18_LETD에서 수득된 IL-18 단백질을 비교할 때, hIL-18 1mg을 수득하는데 필요한 효소와 시간의 양이 감소된다. 상기 과정은 예상 크기(도9)와 생체활성의 단백질 생산을 이끌어 낸다.

카스파제-8만이 유일하게 적합한 카스파제는 아니고, 정제하려는 단백질에서 특정 카스파제 절단위치 또는 임의 다른 기준의 존부에 따라 임의의 다른 카스파제의 절단위치에 상응하는 돌연변이를 활용할 수 있다.

카스파제는 표준 정제 방법, 예를 들면 겔 여과 또는 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 관심있는 단백질로부터 제거할 수 있다.

결론적으로, 이 글에서 밝힌 방법은 정제된 생물활성 사람 단백질, 예를 들면 대장균으로부터 IL-18과 IL-1β를 제공한다. 이들 사이토킨의 정확한 접힘은 먼저 전구물질로의 발현 및 이후 성숙 형태로의 절단을 필요로 하는 것으로 보인다.

사람 IL-18은 이런 측면에서, 숙주세포에서 성숙한 생물활성 사이토킨으로 발현될 수 있는 뮤린 IL-18과 차이가 난다.

본 발명은 다음의 무제한적 실시예로 상술한다.

실시예 1: Xa인자 위치를 갖는 사람 프로IL-18을 코딩하는 플라스미드의 작제

PBMC는 Ficoll-Pague PLUS(Pharmacia) 밀도구배 분리로, 건강한 지원자의 말초혈로부터 수득한다. PBMC는 2% FBS를 함유하는 얼음-냉각 PBS로 2번 세척하고, 우태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100U/㎖ 페니실린, 100U/㎖ 스트렙토마이신(RPMI-10)으로 보충한 RPMI-1640 배지에서 2.5x10⁶ 세포/㎖로 재부유시킨다. 배양액은 LPS(1㎍/㎖, 3시간, 37℃)로 자극한다. 전체 RNA는 TriPure^TM 분리 시약(Boehringer Mannheim)으로 세포에서 추출한다. 1㎍ 전체 RNA는 제조업자의 지시에 따라, 타이탄(Titan) 1 튜브 RT-PCR 키트(Boehringer Mannheim)를 활용한 RT-PCR에 사용한다.

프로IL-18_IEGR cDNA는 중복 프라이머 방법을 활용한 3단계 PCR로 작제한다. 다양한 프라이머는 사람 프로IL-18 cDNA(Genbank accession no. D49950, (3))를 기초하여 작제한다.

제 1 PCR에서 선행 프라이머는 5'-AACATCGAAGGTCGTTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3' (SEQ ID NO:7)이고, 후행 프라이머는 5'-CGCGAATTCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGT-3'(SEQ ID NO:8)이다. Eco RI 위치는 역행 프라이머에 포함되어 있다. 주형은 역전사되는 전체 세포 RNA인데, 이는 LPS-자극된 PBMC에서 분리된다. 열순환 조건은 다음과 같다: 94℃, 30초; 55℃, 30초; 68℃, 2분간 10회 및 이후 94℃, 30초; 55℃, 30초, 68℃, 125초간 25회. 생성된 498bp PCR 산물은 다음의 중복 선행 프라이머: 5'-TGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATGAAAACATCGAAGGTCG TTACTTTG-3'(SEQ ID NO:9) 및 이전 단계의 역행 프라이머를 이용한 제 2 PCR 단계 에서 증폭한다. 열순환 조건은 94℃, 30초; 56℃, 30초; 72℃, 1분간 30회이다. 생성된 551bp PCR 산물은 다음의 중복 선행 프라이머: 5'-CGTGGATCCATGGCTGCTGAACC AGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGCAATGAAATTTATTGAC-3'(SEQ ID NO:10) 및 이전 단계의 역행 프라이머를 이용한 제 3 PCR 단계에서 증폭한다. BamHI 위치는 선행 프라이머에 포함된다. 열순환 조건은 전술한 단계의 조건과 동일하다. 생성된 0.6kb PCR 산물(도1)은 High Pure^TM PCR 산물 정제 키트(Boehringer Mannheim)로 정제하고, pGEM-T Easy 벡터에 결찰시켜 플라스미드 pGEM-프로IL-18_IEGR을 산출한다. 결찰산물은 JM109 콤피던트 세포(Promega Corporation)로 형질전환시킨다. 전반적으로 표준 클로닝 프로토콜을 활용한다(11).

단일 콜로니로부터 플라스미드 pGEM-프로IL-18_IEGR은 제한효소 절단 및 DNA 서열분석으로 정확한 삽입체의 존재를 확인한다. 플라스미드는 BamHI과 EcoRI으로 절단한다. 사람 프로IL-18_IEGR을 인코드하는 생성된 BamHI/EcoRI DNA는 1.0% 아가로즈에서 전기영동으로 분해하고, 0.6kb 밴드는 QIAquick 겔 추출 키트(DIAGEN, Germany)로 겔로부터 분리한다. 상기 DNA는 BamHI와 EcoRI으로 선형화된 pGEX-2TK 발현 벡터(Pharmacia)에 결찰시킨다. 생성된 재조합 플라스미드 pGEX-프로IL-18_IEGR(도2)는 대장균 JM109 균주로 형질전환시키고, 생성된 벡터는 제한효소 절단 및 핵산 서열분석으로 확인한다.

실시예 2: GST-프로IL-18 _IEGR 융합단백질의 발현 및 정제

플라스미드 pGEX-프로IL-18_IEGR로 형질전환된 대장균 JM109의 새로운 단일 콜로니로부터 50㎖ 하룻밤 배양액은 100U/㎖ 앰피실린을 함유한 450㎖ LB 배지에서 희석하고, 0.6 OD₆₀₀ 밀도에 도달할 때까지 37℃에서 교반하면서 성장시킨다. 이후, 단백질 발현은 0.1mM 최종 농도로 IPTG를 첨가하고, 37℃에서 3시간동안 추가로 배양하여 유도한다. 박테리아는 원심분리(5,000xg, 5분, 4℃)로 수거하고, 프로테아제 저해물질(루펩틴 1㎍/㎖, 펩스타틴 A 1㎍/㎖, 아프로티닌 2㎍/㎖, PMSF 0.2mM, EDTA 5mM)을 함유하는 1:100 개시 용적의 얼음-냉각 인산염 완충식염수(PBS; 150mM NaCl, 16mM Na2HPO4, 4mM NaH2PO4, pH 7.3)에 재부유시킨다. 세포는 경도(mild) 초음파처리(4x15초 버스트)로 얼음에 용해시킨다. 1% 최종농도로 트리톤 X-100을 첨가하고, 혼합물은 5분동안 얼음에 유지시킨다. 정화된 용해질(14,000xg, 15분, 4℃)은 글루타티온-아가로즈 비드(2㎖, Pharmacia)의 50% 현탁액과 혼합하고, 혼합물은 4℃에서 경도 교반하면서 3시간동안 배양한다. 비드는 원심분리(500xg, 5분)하여 펠렛하고, 10용적의 세포용해액(1% 트리톤 X-100/PBS)으로 2번, 10용적의 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 2번, 10용적의 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)과 150mM NaCl로 2번, 10용적의 20mM 트리스-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl과 2.0mM CaCl2(절단 완충액)로 2번 세척한다. 모든 단계는 4℃에서 실시한다.

실시예 3: 융합단백질의 절단 및 성숙한 사람 IL-18의 정제

결합된 GST-프로IL-18_IEGR 융합단백질을 보유하는 글루타티온-아가로즈 비드 는 1:50(w/w)의 프로테아제 대 기질 비율로, 1㎖ 절단 완충액에 녹인 Xa인자(New England Biolabs)와 함께 회전기구에서 지속적으로 교반하면서 배양한다(6시간, 23℃). 상기 단계에서 성숙한 사람 IL-18이 방출된다. 비드는 4℃에서, 5분동안 500xg로 원심분리하여 펠렛하고, 2㎖ 얼음-냉각 PBS로 5번 세척한다. 상층액 및 모든 다른 세척액은 한데 모으고, 원심분리(14,000xg, 15분, 4℃)로 정화(淨化)하고, 한외여과(고속원심분리기-10, Amicon)로 농축시킨다. 절단전후에 비드 및 단백질 일부는 0.1% SDS-12% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 이후 쿠마시 블루 염색으로 분해한다. 성숙한 사람 IL-18의 예상 질량과 일치하는 18kD 정도의 다수 밴드를 상층액에서 수득한다. 약간의 19.5kD 밴드도 관찰된다(도5). 두 밴드의 N-말단 단백질 서열분석에서, 성숙한 사람 IL-18의 서열과 일치하는 YFGK 서열이 산출되었다. 정제된 단백질은 0.2μ필터를 통하여 멸균하고 -70℃로 저장한다.

실시예 4: 사람 IL-18의 생물검정

사람 IL-18 활성은 참고자료(2)에서 기술한 바와 같이 평가하였다. 간단히 말하면, 정상 C3H/HeJ 생쥐의 비장을 절개하고 세척하고 Gey 완충액(0.144M NH4Cl/0.017M 트리스-HCl pH 7.2)에 노출시켜, 적혈구를 파괴한다. 백혈구는 RPMI-5로 2번 세척하고, RPMI-10에 재부유시킨다. 플라스틱-비부착 세포를 제조하기 위해, 세포 현탁액은 100mm 플라스틱 평판(Becton Dickinson Ltd., UK)에 배양한다(60분, 37℃). 비부착 세포는 부드럽게 모으고 원심분리하고 RPMI-10에 재부유시킨다. 생존한 세포는 트립판 블루 염료 배제 테스트로 계수하고, 세포농도는 5x10⁶ 세포/㎖로 조정한다. 비-특이적 에스테라제-양성 세포 대부분은 이들 과정에 의해 제거된다. 플라스틱-비부착 세포의 현탁액(0.15㎖)은 96-웰 편평-바닥 미소역가 배양평판(NUNCLON^TM, Denmark)에 넣는다. 50㎕ RPMI-10에 녹인 다양한 농도의 IL-18, 폴리믹신(1㎍/㎖), Con A(0.125㎍/㎖)을 웰에 첨가한다. 평판은 5% CO2, 37℃에서 24시간 또는 48시간동안 배양한다. 배양후, 상층액은 수거하고, 뮤린 IFN-

역가는 ELISA로 측정한다. 생쥐 비부착 비장세포와 사람 IL-18 단독을 함께 배양하면 IFN-감마 생산이 전혀 관찰되지 않는데, 이는 보조-자극물질의 필요성을 암시한다. 0.125㎍/㎖ Con A 단독은 유의성있는 수준의 IFN-

의 약량-의존한 유도가 달성되었다(도6).

실시예 5: Xa 인자 위치를 보유하는 사람 프로 IL-1β를 코딩하는 플라스미드의 작제

PBMC는 Ficoll-Pague PLUS(Pharmacia) 밀도구배 분리로, 건강한 지원자의 말초혈로부터 수득한다. PBMC는 2% FBS를 함유하는 얼음-냉각 PBS로 2번 세척하고, 우태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100U/㎖ 페니실린, 100U/㎖ 스트렙토마이신(RPMI-10)으로 보충한 RPMI-1640 배지에서 2.5x10⁶ 세포/㎖로 재부유시킨다. 배양액은 LPS(1㎍/㎖, 3시간, 37℃)로 자극한다. 전체 RNA는 TriPure^TM 분리 시약(Boehringer Mannheim)으로 세포에서 추출한다. 1㎍ 전체 RNA는 제조업 자의 지시에 따라, 타이탄(Titan) 1 튜브 RT-PCR 키트(Boehringer Mannheim)를 활용한 RT-PCR에 사용한다.

프로IL-1β cDNA는 사람 프로IL-1β cDNA(Genebank accession no. M15330)를 기초하여 고안된 센스와 역행 프라이머로 PCR하여 클론한다. 센스 프라이머는 M15330 서열의 뉴클레오티드 87-107에 상응하는데, BamHI 절단위치가 이에 선행하여 위치한다. 역행 프라이머는 M15330 서열의 뉴클레오티드 896-876에 상응하는데, EcoRI 절단위치가 이에 선행하여 위치한다. 주형은 역전사되는 전체 세포 RNA인데, 이는 LPS-자극된 PBMC에서 분리된다. 열순환 조건은 다음과 같다: 94℃, 30초; 55℃, 30초; 68℃, 2분간 10회 및 이후 94℃, 30초; 55℃, 30초, 68℃, 125초간 25회. 생성된 830bP PCR 산물은 High Pure^TM PCR 산물 정제 키트(Boehringer Mannheim)로 정제하고, pGEM-T Easy 벡터로 결찰시켜 플라스미드 pGEM-프로IL-1β를 산출한다. 플라스미드는 사람 IL-1β mRNA의 뉴클레오티드 405-452에 상응하고 돌연변이 Y113I, V114E, H115G, D116R을 보유하는 올리고뉴클레오티드 ACATGGGATAAC GAGGCTATTGAAGGCCGGGCACCTGTACGA(SEQ ID NO:11)로 특정부위 돌연변이를 유발시킨다.

단일 콜로니로부터 생성된 플라스미드 pGEM-프로IL-1β_IEGR은 제한효소 절단 및 DNA 서열분석으로 정확한 삽입체의 존재를 확인한다. 플라스미드는 BamHI과 EcoRI으로 절단한다. 사람 프로IL-1β_IEGR을 인코드하는 생성된 BamHI/EcoRI DNA는 1.0% 아가로즈에서 전기영동으로 분해하고, 0.82kb 밴드는 QIAquick 겔 추출 키트(DIAGEN, Germany)로 겔로부터 분리한다. 상기 DNA는 BamHI와 EcoRI으로 선형화된 pGEX-2TK 발현 벡터(Pharmacia)에 결찰시킨다. 생성된 재조합 플라스미드 pGEX-프로IL-1β_IEGR은 대장균 JM109 균주로 형질전환시키고, 생성된 벡터는 제한효소 절단 및 핵산 서열분석으로 확인한다.

실시예 6: GST-프로IL-1β _IEGR 융합단백질의 발현 및 정제

플라스미드 pGEX-프로IL-1β_IEGR로 형질전환된 대장균 JM109의 새로운 단일 콜로니로부터 50㎖ 하룻밤 배양액은 100U/㎖ 앰피실린을 함유한 450㎖ LB 배지에서 희석하고, 0.6 OD₆₀₀ 밀도에 도달할 때까지 37℃에서 교반하면서 성장시킨다. 이후, 단백질 발현은 0.1mM 최종 농도로 IPTG를 첨가하고, 37℃에서 3시간동안 추가로 배양하여 유도한다. 박테리아는 원심분리(5,000xg, 5분, 4℃)로 수거하고, 프로테아제 저해물질(루펩틴 1㎍/㎖, 펩스타틴 A 1㎍/㎖, 아프로티닌 2㎍/㎖, PMSF 0.2mM, EDTA 5mM)을 함유하는 1:100 개시 용적의 얼음-냉각 인산염 완충식염수(PBS; 150mM NaCl, 16mM Na2HPO4, 4mM NaH2PO4, pH 7.3)에서 재부유시킨다. 세포는 경도(mild) 초음파처리(4x15초 버스트)로 얼음에 용해시킨다. 1% 최종농도로 트리톤 X-100을 첨가하고, 혼합물은 5분동안 얼음에 유지시킨다. 정화된 용해질(14,000xg, 15분, 4℃)은 글루타티온-아가로즈 비드(2㎖, Pharmacia)의 50% 현탁액과 혼합하고, 혼합물은 4℃에서 경도 교반하면서 3시간동안 배양하였다. 비드는 원심분리(500xg, 5분)하여 펠렛하고, 10용적의 세포용해액(1% 트리톤 X-100/PBS)으로 2번, 10용적의 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 2번, 10용적의 20mM 트 리스-HCl(pH 8.0)과 150mM NaCl로 2번, 10용적의 20mM 트리스-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl과 2.0mM CaCl2(절단 완충액)로 2번 세척한다. 모든 단계는 4℃에서 실시한다.

실시예 7: 융합단백질의 절단 및 성숙한 사람 IL-18의 정제

결합된 GST-프로IL-1β_IEGR 융합단백질을 보유하는 글루타티온-아가로즈 비드는 1:50(w/w)의 프로테아제 대 기질 비율로, 1㎖ 절단 완충액에 녹인 Xa인자(New England Biolabs)와 함께 회전기구에서 지속적으로 교반하면서 배양한다(6시간, 23℃). 상기 단계에서 성숙한 사람 IL-1β가 방출된다. 비드는 4℃에서, 5분동안 500xg로 원심분리하여 펠렛하고, 2㎖ 얼음-냉각 PBS로 5번 세척한다. 상층액 및 모든 다른 세척액은 한데 모으고, 원심분리(14,000xg, 15분, 4℃)로 정화(淨化)하고, 한외여과(고속원심분리기-10, Amicon)로 농축시킨다. 절단전후에 비드 및 단백질 일부를 0.1% SDS-12% 폴리아클리아마이드 겔 전기영동 및 이후 쿠마시 블루 염색으로 분해한다. 성숙한 사람 IL-1β의 예상 질량과 일치하는 17kD 정도의 다수 밴드를 상층액에서 수득한다. 정제된 단백질은 0.2μ 필터를 통하여 멸균하고 -70℃로 저장한다.

실시예 8: 카스파제-8 절단위치를 보유하는 사람 IL-18을 코딩하는 플라스미드의 작제

실시예 1의 재조합 플라스미드 pGEX-프로IL-18_IEGR은 카스파제-8 절단위치(LETD)를 갖는 PCR 증폭된 DNA 단편을 삽입하여 변형시킨다. 간단히 말하 면, pGEX-프로IL-18_IEGR은 951위치에서 제한효소 BAM HI 및 1074위치에서 제한효소 Hind III로 절단하여, 프로-도메인, Xa인자 절단위치(IEGR) 및 hIL-18의 N-말단으로부터 3개의 아미노산을 보유하는 DNA 단편을 잘라낸다.

동일 플라스미드는 하류 프라이머: atgcAAG CTT GCC AAA GTA GTC GGT TTC CAG GTT TTC ATC TTC AGC TAT AA(SEQ ID NO:12)에 돌연변이된 위치 LETD를 도입하여, PCR 증폭을 위한 주형으로 사용한다. PCR 단편은 High Pure^TM PCR 산물 정제 키트(Boehringer Mannheim)로 정제하고, 이후 BAM HI와 Hind III으로 유사하게 절단하여 123bp 삽입체를 산출한다. 열린 벡터와 삽입체는 아가로즈 겔에서 분리하고, 상업적인 키트 "Jet Sorb"(Genomed)를 이용하여 추출한다. 결찰은 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly MA, USA)를 이용하여 하룻밤동안 실시하고, 결찰산물은 대장균 DH5α콤피던트 세포로 형질전환시킨다. 수개의 콜로니를 분리하고 계대배양하고, 《Qiagen》키트로 미니프렙(miniprep)을 준비한다. 재조합 플라스미드의 필수 부분을 서열화하기 위하여, 모든 미니프렙에서 PCR 증폭(Perkin Elmer Gene Amp-AmpliTaq DNA 중합효소)을 실시한다. 최종 형질전환은 TSS 방법을 따라, 콤피던트 박테리아 대장균 JM109에서 실시한다(Chung, C.T. et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175).

실시예 9: GST-프로IL-18 _LETD 융합단백질의 발현 및 정제

GST-프로IL-18_LETD-hIL18 단백질 발현은 상기 실시예 8에 따라 작제된 플라스미드를 이용하여, 상기 실시예 2에서 전술한 바와 같이 교반 플라스크 및 5ℓ발효 기에서 달성한다.

실시예 10: 카스파제-8을 이용한 융합단백질의 절단 및 성숙한 사람 IL-18의 정제

결합된 GST-프로IL-18_LETD 융합단백질을 보유하는 글루타티온-아가로즈 비드는 1:1200(w/w)의 프로테아제 대 기질 비율로, 절단 완충액(실시예 6에서 정의)에 녹인 카스파제-8(Calbiochem)과 함께 회전기구 또는 롤러에서 지속적으로 교반하면서 배양한다(4시간, 23℃). 비드는 4℃에서, 5분동안 500xg로 원심분리하여 펠렛하고, 2㎖ 얼음-냉각 PBS로 5번 세척한다. 상층액 및 모든 다른 세척액은 한데 모으고, 원심분리(14,000xg, 15분, 4℃)로 정화(淨化)하고, 한외여과(고속원심분리기-10, Amicon)로 농축시킨다. 이후, 농축된 분해물은 고분자량 절단산물 및 잔류한 단백분해 효소(카스파제-8 이형이량체, 29kDa와 이형-삼량체, 58kDa)로부터 hIL-18(18 kDa)를 분리하기 위하여, 슈퍼덱스-75(Pharmacia)에서 분자량 사이징을 적용한다.

카스파제-8 분석키트 및 Ac-IETD-AMC 형광기질(BIOMOL)을 이용한 다양한 슈퍼덱스-75 분취물에서 카스파제-8 효소활성을 분석하면, 55kD 분자량(카스파제-8 이형삼량체에 해당)에 상응하는 분취물에서 관찰되는데, 이는 hIL-18(17kD)을 함유한 분취물로부터 잘 분리된다는 것을 보여준다.

매우 순수한 18 kDa hIL-18 겔 여과 분취물은 한데 모으고, 고속원심분리기-10(Amicon)에서 농축하고, 최종적으로 0.22㎛ 필터에서 멸균하고, -80℃로 보관한 다.

절단전후에 비드 및 단백질 일부는 0.1% SDS-12% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 이후 쿠마시 블루 염색으로 분해한다(도9). 성숙한 사람 IL-18의 예상 질량과 일치하는 18kD 정도의 다수 밴드가 상층액에서 관찰된다. 비드 분취물 분석은 절단이 불완전하다는 것을 보여주는데, 그 이유는 전구 단백질이 비드에 결합된 상태로 유지되기 때문이다. 게다가, IL-18 절단된 단백질의 일부가 비드 분취물에 남아있다.

실시예 11: 사람 IL-18의 생물검정

사람 IL-18 활성은 참고자료(10)에 기술된 바와 같이 평가하였다. 간단히 말하면, KG-1 세포는 20% FBS를 함유한 DMEM에 유지시킨다. IL-18 분석에서, KG-1 세포는 1.2x10⁶ 세포/㎖(250㎕/웰, 48웰 평판)에 부유시키고, 다양한 농도의 hIL-18(연속 희석, 80ng/㎖에서 시작)과 함께 mTNFα(Innogenetics)로 자극한다. 평판은 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양한다. 배양후, 상층액은 수거하고, 뮤린 IFN-

함량은 ELISA로 측정한다(R&D Systems로부터 hIFN-

과 안티-hIFN-

인수).

사람 IL-18은 Xa인자 절단위치 구성체로부터 수득된 hIL-18과 동일한 활성으로, IFN-

생산을 약량-의존방식으로 유도한다.

10> YEDA REEARCH AND DEVELOPMENT CO.LTD. <120> PREPARATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULE <150> PCT/IL00/00220 <151> 2000-04-13 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: translated from synthetic oligonucleotide <400> 1 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: translated from synthetic oligonucleotide <400> 2 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: translated from synthetic oligonucleotide <400> 3 Asp Asp Asp Lys 1 <210> 4 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: translated from synthetic oligonucleotide <400> 4 His Tyr 1 <210> 5 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: translated from synthetic oligonucleotide <400> 5 Tyr His 1 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: translated from synthetic oligonucleotide <400> 6 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aacatcgaag gtcgttactt tggcaagctt gaatc 35 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgcgaattcc tagtcttcgt tttgaacagt 30 <210> 9 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tggcaatgaa atttattgac aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacatcg 60 aaggtcgtta ctttg 75 <210> 10 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cgtggatcca tggctgctga accagtagaa gacaattgca tcaactttgt ggcaatgaaa 60 tttattgac 69 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 acatgggata acgaggctat tgaaggccgg gcacctgtac ga 42 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atgcaagctt gccaaagtag tcggtttcca ggttttcatc atcttcagct ataa 54 <210> 13 <211> 582 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60 aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aaaccgacta ctttggcaag 120 cttgaatcta aattatcagt cataagaaat ttgaatgacc aagttctctt cattgaccaa 180 ggaaatcggc ctctatttga agatatgact gattctgact gtagagataa tgcaccccgg 240 accatattta ttataagtat gtataaagat agccagccta gaggtatggc tgtaactatc 300 tctgtgaagt gtgagaaaat ttcaactctc tcctgtgaga acaaaattat ttcctttaag 360 gaaatgaatc ctcctgataa catcaaggat acaaaaagtg acatcatatt ctttcagaga 420 agtgtcccag gacatgataa taagatgcaa tttgaatctt catcatacga aggatacttt 480 ctagcttgtg aaaaagagag agaccttttt aaactcattt tgaaaaaaga ggatgaattg 540 ggggatagat ctataatgtt cactgttcaa aacgaagact ag 582 <210> 14 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met 1 5 10 15 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20 25 30 Leu Glu Thr Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile 35 40 45 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro 50 55 60 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 65 70 75 80 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 85 90 95 Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys 100 105 110 Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile 115 120 125 Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 130 135 140 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 145 150 155 160 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 180 185 190 Asp

Claims

생물학적 불활성 전구물질로부터 카스파제-1절단 부위를 가지는 사이토킨을 생산하는 방법에 있어서,

카스파제-1이 절단시키는 부위를 카스파제-1을 제외한 다른 프로테아제에 의해 절단될 수 있도록 돌연변이시키고, 이때 절단 부위는 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5 또는 6중에서 선택된 아미노산 서열로 돌연변이시키고,

카스파제-1를 제외한 다른 프로테아제에 돌연변이된 사이토킨을 접촉시켜, 돌연변이된 부위가 절단되도록 하고;

이 부위가 절단됨으로써 생물학적으로 활성을 가진 사이토킨이 생성되며; 이때 생성된 사이토킨은 IL-1β또는 IL-18이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 프로테아제는 트롬빈, 엔테로키나제, 서브틸리신, 서브틸리신 변이체, 사람 리노바이러스 3C 프로테아제, Xa인자 프로테아제 및 카스파제-8에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 프로테아제 절단 부위에서 돌연변이된 생물학적으로 활성 분자의 전구물질을 인코드하는 cDNA를 포함하는 벡터를 숙주에 형질도입시키고, 형질변환된 숙주를 배양하고, 프로테아제로 처리한 후에 사이토킨을 분리하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, cDNA는 GST 코딩 서열에 in frame으로 융합되고, 발현된 융합 분자는 글루타티온 아가로즈 비드상에 포집된 후 카스파제-1을 제외한 프로테아제로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
IL-1β또는 IL-18에서 선택된 사이토킨을 인코드하는 분리 정제된 DNA 서열에 있어서, 사이토킨 고유의 카스파제-1에 절단 부위를 인코드하는 서열은 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5 또는 6중에서 선택된 서열을 인코드하는 핵산 서열로 치환된 것을 특징으로 하는 분리 정제된 DNA 서열.
생물학적으로 활성을 가진 사람 IL-18을 생산하는 방법에 있어서,

a) IL-18 전구물질을 인코드하는 핵산으로 구성된 벡터로 숙주 세포를 형질변환시키고, 이때 핵산은 고유의 인코드된 카스파제-1 절단 부위에 돌연변이를 가지며, 돌연변이된 부위는 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5 또는 6중에서 선택된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 인코드하며;

b) IL-18 전구물질을 발현할 수 있는 조건하에서 형질변환된 숙주를 배양하고;

c) IL-18 전구물질에 카스파제-1을 제외한 전구물질을 절단할 수 있는 프로테아제로 접촉시키고;

d) 생물학적으로 활성인 사람 IL-18을 분리하는 단계로 구성된 생물학적으로 활성을 가진 사람 IL-18을 생산하는 방법.
제 6 항에 있어서, IL-18 전구물질을 인코드하는 핵산은 GST 결합 단백질 코딩 서열에 in frame으로 융합되어, 융합 단백질을 형성하고, 이때 융합 단백질은 프로테아제로 처리되기 전에 글루타티온으로 구성된 기질 또는 리간드와 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 리간드 또는 기질은 글루타티온 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 카스파제-1이외의 프로테아제는 트롬빈, 엔테로키나제, 서브틸리신, 서브틸리신 변이체, 사람 리노바이러스 3C 프로테아제, Xa인자 프로테아제 및 카스파제-8에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 숙주는 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
생물학적으로 활성을 가진 사람 IL-1β을 생산하는 방법에 있어서,

a) IL-1β 전구물질을 인코드하는 핵산으로 구성된 벡터로 숙주 세포를 형질변환시키고, 이때 핵산은 고유의 인코드된 카스파제-1 절단 부위에 돌연변이를 가지며, 돌연변이된 부위는 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5 또는 6중에서 선택된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 인코드하며;

b) IL-1β 전구물질을 발현할 수 있는 조건하에서 형질변환된 숙주를 배양하고;

c) IL-1β 전구물질에 카스파제-1을 제외한 전구물질을 절단할 수 있는 프로테아제로 접촉시키고;

d) 생물학적으로 활성인 사람 IL-1β을 분리하는 단계로 구성된 생물학적으로 활성을 가진 사람 IL-1β을 생산하는 방법.
제 11 항에 있어서, 카스파제-1이외의 프로테아제는 트롬빈, 엔테로키나제, 서브틸리신, 서브틸리신 변이체, 사람 리노바이러스 3C 프로테아제, Xa인자 프로테아제 및 카스파제-8에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, IL-1β 전구물질을 인코드하는 핵산은 GST 결합 단백질 코딩 서열에 in frame으로 융합되어, 융합 단백질을 형성하고, 이때 융합 단백질은 프로테아제로 처리되기 전에 글루타티온으로 구성된 기질 또는 리간드와 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 리간드 또는 기질은 글루타티온 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 숙주는 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.