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KR100637867B1 - 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 조성물 - Google Patents

오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 조성물 Download PDF

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KR100637867B1
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김호경
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전원경
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한국 한의학 연구원
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Abstract

본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 오미자 추출물은 3T3-L1 지방세포에서 인슐린의 작용을 향상시켜 세포막의 GLUT 4 양을 증가시키고 포도당의 흡수를 증가시키므로, 혈당강하효과가 우수하다.
따라서, 본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 인슐린 비의존형 당뇨병(제 2형 당뇨병)에 대하여 치료효과가 뛰어나다.

Description

오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 조성물{Composition comprising Schizandrae Fructus extract for treatment of diabetes}
도 1은 3T3-L1 지방세포에서 인슐린 농도에 따른 포도당 흡수 정도를 나타낸 도이다.
도 2는 3T3-L1 지방세포에서 본 발명의 오미자 추출 분획 0.3㎍/㎖와 인슐린 1ng/㎖를 함께 처리하였을때, 포도당 흡수 정도를 나타낸 도이다.
도 3은 3T3-L1 지방세포에서 본 발명의 오미자 추출 분획 3㎍/㎖와 인슐린 1ng/㎖를 함께 처리하였을때, 포도당 흡수 정도를 나타낸 도이다.
도 4는 3T3-L1 지방세포에서 본 발명의 오미자 추출 분획을 처리하였을때 세포막의 GLUT4 양을 나타낸 도이다.
본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 비전염성 만성질환으로, 췌장의 β세포에서 분비되는 인슐린이 부족하거나 그 기능을 제대로 발휘하지 못하여 체내에서 포도당이 에너지원으로 이용되지 못하고 혈액내에 고농도로 남아 있다가 소변으로 배설되는 질환이다.
당뇨병은 그 발병원인 및 증상의 치료방법에 따라 크게 인슐린 의존형 당뇨병(Insulin dependent diabetes mellitus, IDDM, 제 1형 당뇨병)과 인슐린 비의존형 당뇨병(Non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM, 제 2형 당뇨병)으로 분류된다.
제 1형 당뇨병은 유전적 원인, 바이러스 감염 등에 의해 췌장 β세포의 기능이 저하되어 인슐린이 거의 분비되지 않은 상태로서, 주로 10~20대에 갑자기 발병하며, 소아형 당뇨병이라고도 한다.
제 2형 당뇨병은 가족력, 비만, 스트레스, 식사의 잘못 또는 인슐린과 길항(拮抗)하는 약물 등에 의해 발병되는 것으로, 40대 이후에 잘 나타나며, 성인형 당뇨병이라고도 한다. 췌장에서의 인슐린 분비는 충분하지만 인슐린 저항성과 포도당 이용율이 정상인과 달라서 고인슐린혈증임에도 불구하고 혈당이 정상화 되지 않는다.
우리나라의 경우 당뇨병 환자의 90~95% 이상이 제 2형 당뇨병 환자이다.
당뇨병의 증상은 다양하지만 대표적인 것으로 다뇨(多尿), 다음(多飮), 다식 (多食)을 들 수 있는데, 높은 혈당치 때문에 포도당 및 과량의 수분이 삼투압에 의해 소변으로 배설되어 다뇨현상이 나타나고, 따라서 탈수증상으로 심한 갈증을 느껴 다음하게 되며, 또한 공복감을 느껴 음식을 많이 먹게 된다. 당뇨병 환자의 경 우에는 포도당이 에너지원으로 이용되지 못하므로 이미 저장된 단백질과 지방을 에너지원으로 소모하게 되고, 이러한 현상들의 악순환으로 인해 체중감소를 초래하게 된다. 그러나 이러한 현상들은 당뇨병 발병 초기에 나타나는 급성증상에 불과하다.
당뇨병을 동양의학적으로 분류하면 삼소(三消)라고 하여, 상소(上消), 중소(中消), 하소(下消)로 나뉘며, 그 원인은 폐열(肺熱), 위열(胃熱), 신열(腎熱)로 크게 분류된다.
상소는 단순히 소갈(小渴)이라고도 하며, 심허(心虛)하여 사화(邪火)가 폐로 옮겨져 흉중이 번조(煩燥)하고 혀가 붉고 입술이 마르고 번갈(煩渴)하여 결과적으로 다음(多飮)하게 된다.
중소는 다뇨 및 다식을 주증상으로 하는데, 다뇨와 다식의 악순환으로 체중감소와 변비를 초래한다.
하소는 신소(腎消)라고도 하며, 구갈은 상소보다 덜하고, 소변량은 많으며 맥이 약하다.
갈증이 심한 상소는 잘 낫는 편이나 중소, 하소로 가면 치료가 어렵다. 갈증이 덜해지고 체중 감소가 급격히 나타나면 하소로 진행된 상태이다.
당뇨병은 조기에 발견하면 완치가 가능하며, 조기 치료함으로써 합병증을 미리 예방할 수 있다.
당뇨병 조기 발견은 당불내성 상태를 찾아내는 것이다. 당불내성이란 정상인과 당뇨환자의 중간단계로, 당뇨가 본격적으로 시작되기 전의 상태이다. 즉 혈당을 조절하고 인슐린을 분비하는 췌장 베타세포의 기능이 저하되거나 인슐린 저항성이 있어 포도당을 세포로 운반하는 능력이 저하되는 것을 말한다.
만약, 당뇨병의 치료가 늦어져서 만성이 되면 합병증으로 만성 혈관성질환을 유발하게 되는데, 당뇨병성 망막증(시력장애, 실명, 망막출혈), 당뇨병성 신증, 당뇨병성 말초 신경증으로 인해 인체의 전반적인 대사기능 및 감각기능이 저하된다.
현재 사용되고 있는 당뇨병 치료제는 경구용 혈당강하제와 인슐린 주사제로 크게 구분된다. 일반적으로, 체내에서 인슐린 분비가 없는 인슐린 의존형 당뇨병 환자나 임신성 당뇨병 환자, 경구용 혈당강하제로 혈당조절이 제대로 안되는 인슐린 비의존형 당뇨병 환자에게는 인슐린 주사를 투여하고, 식사용법과 운동요법을 병행함에도 불구하고 적절한 혈당조절이 되지 않는 인슐린 비의존형 당뇨병 환자는 경구용 혈당강하제를 복용하게 하는 것이 통설이다.
일반적으로 이용되는 경구용 혈당강하제는 설포닐우레아계(sulfonylureas) 약물과 비구아니드계(biguanides) 약물 및 티아졸리딘디온계(thiazolidinedione) 약물 등이 있다.
설포닐우레아계 약물로는 글리피자이드, 글리클라자이드, 글리퀴돈, 글리벤클라마이드, 클로르프로파마이드 등이 있으며, 췌장에서 인슐린 분비를 촉진하는 작용을 나타낸다. 그러므로, 이들은 췌장에서 인슐린 분비가 전혀 없는 인슐린 의존형 당뇨병 환자, 췌장에서 인슐린 분비능력이 상대적으로 감소된 인슐린 비의존형 당뇨병 환자, 가임기 여성에게는 사용할 수 없는 문제점이 있다. 또한, 이들 약물은 과용량을 투여하거나, 공복시에 투여하는 경우에는 저혈당을 초래하며 피부발진, 황달, 식욕부진, 오심(구역), 설사 등의 부작용도 나타난다. 특히 클로르프로 파마이드 등의 반감기가 긴 약물(12~36시간)은 체내에 축적되어 저혈당을 일으킬 위험이 매우 높다. 또한, 대부분의 설포닐우레아계 약물은 간에서 대사되어 신장으로 배설되므로 간기능 및 신기능장해 환자에게는 주의하여 사용하여야 한다.
비구아니드계 약물로는 메트포르민 등이 있으며, 작용기전은 정확하진 않지만 췌장에서 인슐린 분비를 증가시키는 작용은 없는 것으로 밝혀졌으며, 간에서의 포도당 신생합성을 감소시킨다. 비구아니드계 약물은 설포닐우레아계 약물보다 혈당강하효과가 약한 반면에, 저혈당을 일으킬 가능성도 낮다. 그러나 소화기계 부작용의 발생빈도가 높아 치료초기에 오심, 구토, 설사, 발진 등이 나타나며, 락트산혈증(lactic acidosis)을 유발하여 생명을 위협하는 치명적인 부작용을 일으키므로, 현재 미국에서는 실험용 약제로만 사용하고 있다.
티아졸리딘디온계 약물은 최근에 개발된 것으로 인슐린 저항성을 개선시키는 효과가 있다.
그외에도 탄수화물 섭취 후 탄수화물의 소화를 방해하여 혈당의 상승을 방해하는 아카보스(acarbose) 계통의 약물이 있다. 아카보스 약물은 알파-글루코아밀라제 억제제로 가역적으로 알파-D-글리코시다제 활성을 억제시키며, 주로 소장 세포의 점막에 존재하는 말타제의 활성을 억제시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 실제로 아카보스는 말토즈 분해를 억제시키는 효과는 약하고 오히려 설탕의 분해를 강력하게 억제하는 것으로 알려져 있다.
한편, 현재 사용되고 있는 한방제제는 당뇨병의 삼소에 따라 각각 다르게 처방되어 지고 있다. 폐장에 열이 있어서 혀가 붉고 갈증이 심한 상소에는 폐장의 열 을 내려주고(淸肺熱), 비장을 습(濕)하지 않고 자윤(滋潤)시키는 인삼백호탕(석고, 지모, 인삼, 감초), 전씨백출탕(건갈근, 인삼, 백출, 백복령, 목향, 곽향, 감초) 및 강심탕(降心湯) 등을 처방한다.
위에 열이 있어서 소화가 안되고 대변이 굳어 소변을 자주 보지만 시원하지 않은 중소에는 조위승기탕(대황, 망초, 감초), 동의보감에 수재된 생진감로음(석고, 황백, 황기, 지모, 서홍화, 시호 등) 및 순기산(順氣散)을 처방한다.
신에 열이 있어서 신수(腎水)가 부족하고 진액(津液)이 마르며 갈증은 덜하지만 하초(下焦)가 냉해지는 하소에는 육미지황환(숙지황, 산약, 백복령, 오미자, 택사), 신기환 등을 처방한다.
그러나, 당뇨병의 발병시에는 상소, 중소, 하소가 각각 따로 발병할 수도 있으나, 대부분의 당뇨병 환자의 경우에는 이들 삼소가 한꺼번에 발병한다. 따라서, 통상적으로 사용되고 있는 상기와 같은 한방제제로는 삼소가 한꺼번에 발병한 당뇨병 환자를 효과적으로 치료할 수 없는 경우가 대부분이다.
또한, 인슐린 저항성을 감소시키고, 인슐린 분비를 증가시키며 탄수화물의 소화를 방해하면 당뇨병을 호전시킬 수 있고, 엄격하게 혈당조절을 하면 당뇨병성 합병증의 발생을 예방하거나 지연시킬 수 있다고 알려져 있으나, 제 2형 당뇨병의 치료에 효과적인 약제들은 엄격한 혈당조절이나 당뇨병의 합병증을 예방하는데 부족한 점이 많아 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 오미자(五味子, Schizandrae Fructus)는 낙엽 활엽 덩굴나무로 잎은 어긋나고 난형(卵形) 또는 도란형(倒卵形)이며 끝은 급히 뾰족하고 톱니가 있으며 뒷면 맥상에 다소 털이 있다. 꽃은 홍백색으로 6~7월에 피며 자웅이주이다. 과실은 식용으로 쓰이고 가지 끝에 이삭모양으로 늘어지며 8~9월에 붉게 익는다. 과실을 오미자(오매자), 북오미자(Schizandrae Fructus)라고 한다. 과실에는 시잔드롤 (Schizandrol), 시잔드린(Schizandrin) A, B, C, 안질로일고미신 (angeloylgomisin) O, P, 에피고미신(epigomisin), 프레고모이신(pregomoisin), 데옥시시잔드린(Deoxyschizandrin) 등을 함유한다. 오미자는 오래전부터 수렴, 자양, 강장, 진해약, 해주독, 목마름, 수렴고삽, 익기생진, 보신염심 등의 약효를 가져 생약원료로 한방에서 사용해오던 재료이다.
이에 본 발명자들은 생약재에서 인슐린 분비를 증가시키는 물질을 연구하던 중, 오미자 추출물에서 인슐린 작용을 향상시키는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 및 치료에 유용한 의약품 및 건강식품을 포함한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 오미자 추출물의 제조방법은 다음과 같다.
오미자는 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘에서 건조한다. 건조한 오미자를 70% 에탄올에 넣고 2시간 동안 2회 반복 추출한다. 상기 에탄올 추출액을 여과하고 2000rpm으로 원심분리하여 상등액을 회전진공 농축기에서 감압농축한 후 동결건조하여 추출 분말 시료를 만든다.
상기 추출 분말 시료를 물에 현탁시킨 후, 메탄올을 가하여 증량시키고 용출액의 극성을 변화시키면서 앰버라이트 XAD-4 겔(Amberlite XAD-4 gel)을 충진한 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 물분획(Fr.1), 20% 메탄올 분획(Fr.2), 40% 메탄올 분획(Fr.3), 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5) 및 100% 메탄올 분획 (Fr.6)으로 분리한 후, 각각의 분획을 저온에서 감압농축한 후 동결건조한다.
본 발명의 오미자 추출 분획은 3T3-L1 지방세포에서 인슐린의 작용을 향상시켜 포도당의 흡수를 증가시킨다. 즉, 0.3㎍/㎖의 오미자 추출 분획을 1ng/㎖의 인슐린과 함께 처리하였을 경우, 60% 메탄올 분획(Fr.4) 및 80% 메탄올 분획(Fr.5)은 포도당 흡수를 증가시킨다. 특히 80% 메탄올 분획(Fr.5)의 경우 인슐린을 50ng/㎖으로 처리하였을 때보다 포도당 흡수를 더 많이 증가시켜 인슐린만을 처리한 대조군의 값에 비해 통계적으로 유의성 있게 높다.
또한, 오미자 추출 분획의 양을 3㎍/㎖로 증가시켜 1ng/㎖의 인슐린과 함께 처리하였을 경우, 20% 메탄올 분획(Fr.2), 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분 획(Fr.5) 및 100% 메탄올 분획(Fr.6)에서 포도당 흡수를 증가시키며, 특히 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5)은 인슐린을 50ng/㎖으로 처리하였을 때보다 포도당 흡수를 더 많이 증가시켜 인슐린만을 처리한 대조군의 값에 비해 통계적으로 유의성 있게 높다.
또한, 본 발명의 오미자 추출 분획 중 60% 메탄올 분획(Fr.4) 및 80% 메탄올 분획(Fr.5)은 인슐린 신호 전달 체계를 향상시켜 인슐린 작용을 증진하여 세포막에 존재하는 GLUT 4의 양이 가장 높게 나타나며, 인슐린을 50ng/㎖를 처리한 정도까지 증가시킨다. 세포막의 GLUT 4의 증가는 포도당 흡수를 증가시키는 것과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 오미자 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 오미자 추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 오미자 추출물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 오미자 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로 스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 오미자 추출물의 유효용량은 50~300㎎/㎏이고, 바람직하기로는 70~150mg/kg이며, 하루 1~6회 투여될 수 있다.
본 발명의 오미자 추출물을 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 1g/kg 이상인 안전한 물질로 판단된다.
본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당뇨병에 기인하는 질환의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 오미자 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 오미자 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 오미자 추출물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스 트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
오미자는 서울 경동시장에서 구입하여 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘에서 건조하였다. 건조한 오미자 1㎏을 70% 에탄올 10ℓ에 넣고 2시간 동안 2회 반복 추출 하였다. 상기 에탄올 추출액을 꺼즈로 여과하고 2000rpm으로 원심분리하여 상등액을 회전진공 농축기에서 감압농축한 후 동결건조하여 추출 분말 시료를 만들었다.
상기 추출 분말 시료를 물에 현탁시킨 후, 메탄올을 가하여 증량시키고 용출액의 극성을 변화시키면서 앰버라이트 XAD-4 겔(Amberlite XAD-4 gel)을 충진한 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 물분획(Fr.1), 20% 메탄올 분획(Fr.2), 40% 메탄올 분획(Fr.3), 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5) 및 100% 메탄올 분획 (Fr.6)으로 분리한 후, 각각의 분획을 저온에서 감압농축한 후 동결건조하였다.
각각의 분획은 DMSO에 1㎎/㎖로 녹여 사용하였다.
실험예 1 : 본 발명의 오미자 추출물이 지방세포내로의 포도당 흡수에 미치는 영향
본 발명의 오미자 추출물이 지방세포내로의 포도당 흡수에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 세포 배양
실험에 사용한 3T3-L1 세포는 미국세포주은행에서 구입하였고, 1% FBS(fetal bovine serum), 젠타마이신(gentamycine, 100 units/㎖), 스트렙토마이신 (streptomycin, 100 ㎍/㎖) 등을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다.
3T3-L1 섬유아세포는 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 인산염 완충용액으 로 씻어준 후 50㎖ 플라스크당 1㎖의 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 실온에서 1분간 처리한 다음 트립신 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착하여 계대배양하였다. 탈착된 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 10㎖에 부유시킨 다음 새로운 배양용기(50㎖ culture flask)에 옮겨 1:20의 분리 비율(split ratio)로 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
2. 지방세포내로의 포도당 흡수 실험
3T3-L1 섬유아세포를 상기 계대배양과 동일한 방법으로 완전히 채워질 (confluent) 때까지 배양하였다. 배양용기 바닥을 완전히 채운 지 2일 후에 유도분화물질인 덱사메타손(dexamethasone) 0.25μM을 넣어 3일 동안 배양한 후 2일에 한번씩 고농도 포도당 DMEM 용액으로 새로 바꾸어 주어 지방세포로 완전히 전환된 10~15일 사이에 포도당 흡수 실험을 하였다.
배양용기에 있는 지방세포의 수를 세어 12 웰 플레이트의 웰을 빈 공간없이 완전히 채울 수 있도록 분주하였다. 웰 플레이트에 옮긴 지방세포를 PBS로 세척한 후 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 함유하고 있는 저농도의 포도당을 함유한 DMEM에서 12시간 이상 지난 후에 HEPES 용액에서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 1 μCi/㎖의 [14C]2-데옥시글루코스와 1mM 포도당을 첨가하고 22℃에서 30분 동안 배양하여 포도당의 세포내로의 흡수 정도를 14C이 세포내로 이동한 양으로 측정하였다.
비특이적인 포도당 흡수를 배제하기 위해서 글루코스 트랜스포터 4(glucose transporter 4; GLUT4)의 작용을 억제하는 사이토 B(cyto B)와 함께 배양하였을 때의 포도당 이동량을 빼고 세포내로 이동한 포도당의 양을 측정하였다.
세포는 10mM 포도당이 함유된 PBS로 세척하고 0.5N NaOH로 세포를 분해하였다. 분해된 세포를 초산으로 중화시키고 함유된 14C의 함량을 베타 카운터(Tri-Carb 2100TR, Packard Bioscince, IL)로 측정하였다.
3. 본 발명의 오미자 추출 분획이 포도당 흡수에 미치는 영향
오미자의 각 분획에 인슐린 민감성 제제가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위하여, 상기 실시예에서 제조한 오미자 추출 분획을 DMSO에 1㎎/㎖로 녹인 후 이것을 PBS에 0.3 및 3㎍/㎖로 희석시켜 두 가지 농도에서 포도당 흡수를 측정하였다.
3T3-L1 지방세포에 인슐린 1ng/㎖와 함께 각 분획을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 흡수 정도를 인슐린 50ng/㎖에서의 결과와 비교하였다.
대조군으로 인슐린 0(기저), 1, 3, 5, 10, 25, 50, 75ng/㎖을 사용하였다.
모든 실험은 3번 반복하였고, 실험결과는 인슐린과 오미자 추출 분획을 모두 처리하지 않은 것의 값에 대한 비로 나타내었다.
또한, 오미자 추출 분획의 포도당 흡수 증가 효과가 특이적으로 인슐린의 작용을 향상시켜서 나타내는 현상인지, 아니면 세포에 용제(detergent)로 비특정적으 로 작용하여 포도당을 세포내로 이동하는 것인지를 조사하기 위하여 인슐린을 첨가하지 않고 오미자 추출 분획만을 넣은 상태에서 포도당을 흡수하는 정도를 측정하였다.
오미자 추출 분획이 인슐린의 작용에 관계없이 용제로 작용하여 세포막을 파괴시켜 포도당 흡수를 증가시키는 것을 배제하기 위해서 인슐린이 0 ng/㎖ 에서 오미자 추출 분획과 함께 포도당 흡수를 측정하였을 때, 이 값이 기저(basal) 값보다 높은 것은 포도당 흡수를 증가시킨다고 해도 인슐린 민감성 제제로서의 작용이 없는 것으로 간주하였다.
결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 3T3-L1 지방세포에서 오미자 추출 분획의 대조군에 비해 포도당 흡수가 증가하는 정도는, 인슐린 1 ng/㎖만을 넣고 측정한 값과 인슐린 1 ng/㎖와 오미자 추출분획을 함께 넣고 측정한 값을 two sample t-test 방법으로 통계적 유의성을 검증하였다. 모든 통계 처리의 유의성 검증은 α= 0.05로 정하였다.
3T3-L1 지방세포에 인슐린 농도에 따른 포도당 흡수 정도를 측정한 것은 도 1에 나타내었다.
3T3-L1 지방세포에 인슐린 1ng/㎖와 본 발명의 오미자 추출 분획 0.3㎍/㎖를 함께 처리하였을때, 포도당 흡수 정도를 측정한 것은 도 2에 나타내었다.
3T3-L1 지방세포에 인슐린 1ng/㎖와 본 발명의 오미자 추출 분획 3㎍/㎖를 함께 처리하였을때, 포도당 흡수 정도를 측정한 것은 도 3에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 인슐린의 농도가 25ng/㎖까지는 인슐린 농도가 증가함에 따라 포도당 흡수가 증가하였으나, 25ng/㎖보다 높은 인슐린 농도에서는 세포내로의 포도당 흡수가 인슐린 농도에 따른 차이가 없었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 0.3㎍/㎖ 오미자 추출 분획을 1ng/㎖의 인슐린과 함께 처리하였을 경우, 60% 메탄올 분획(Fr.4) 및 80% 메탄올 분획(Fr.5)은 포도당 흡수를 증가시켰다. 특히 80% 메탄올 분획(Fr.5)의 경우 인슐린을 50ng/㎖으로 처리하였을 때보다 포도당 흡수가 더 많이 증가하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 오미자 추출 분획의 양을 3㎍/㎖로 증가시켜 1ng/㎖의 인슐린과 함께 처리하였을 경우, 20% 메탄올 분획(Fr.2), 60% 메탄올 분획 (Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5) 및 100% 메탄올 분획(Fr.6)에서 포도당 흡수를 증가시켰다. 특히 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5)은 인슐린을 50ng/㎖으로 처리하였을 때보다 포도당 흡수가 더 많이 증가하였다.
따라서, 오미자의 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5)에서 인슐린 작용이 매우 향상된 것을 알 수 있다.
이때 오미자 추출 분획만 넣은 상태에서의 포도당 흡수값은 기저값과 유사하거나 오히려 낮아 분획물이 용제로 작용하여 비특이적으로 포도당의 흡수를 증가시키는 것은 아니라는 것을 알 수 있다.
4. 세포막에 존재하는 GLUT 4 양의 변화
10㎠ 플레이트에 3T3-L1 지방세포를 옮긴 다음 날 3T3-L1 지방세포는 혈장 대신 3% 소혈청알부민을 첨가한 고농도 포도당 DMEM에서 12시간동안 배양한 후에 3 ㎍/㎖의 오미자 추출 분획을 첨가하고 5시간동안 배양한 후 0, 1 또는 50 ng/㎖의 인슐린을 5분동안 처리하였다. 지방세포는 차가운 PBS로 반응을 중단시키고 바로 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 1% NP40, 10% 글리세롤 및 12 mM 알파-글리세롤 포스페이트와 프로테아제 저해제를 포함하는 20 mM 트리스(pH 7.4)로 구성된 용해완충액 (lysis buffer)으로 세포를 용출시켰다. 이 세포 용출액은 30분동안 얼음 속에 방치시킨 후 Kotani 등의 방법으로 세포막을 분리하였다. 분리한 세포막의 단백질 함량을 Lowry 방법으로 측정한 후 동량의 세포막 단백질에 함유된 글루코스 트랜스포터 4(glucose transporter 4; GLUT 4) 함량을 안티-GLUT 4 항체(Chemicon, Temecula, CA)를 사용하여 immunoblotting 방법으로 측정하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 3 ㎍/㎖의 오미자의 60% 메탄올 분획(Fr.4) 및 80% 메탄올 분획(Fr.5)을 1 ng/㎖의 인슐린과 함께 처리하였을때, 세포막에 존재하는 GLUT 4의 양이 가장 높게 나타났으며, 인슐린 50 ng/㎖를 처리한 정도까지 증가하였다. 이는 오미자의 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5)이 인슐린 신호 전달 체계를 향상시켜 인슐린 작용을 증진하여 세포막에 GLUT 4의 양이 증가한 것이다.
따라서, 세포막의 GLUT 4의 증가는 포도당 흡수를 증가시키는 것과 밀접한 관련이 있음 알 수 있다.
실험예 2 : 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험
본 발명의 조성물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.
실험동물로 6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 조성물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1g/㎏/㎖의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명의 조성물은 모두 랫트에서 1g/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소치사량(LD50)은 적어도 1g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
오미자 추출물 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
오미자 추출물 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
오미자 추출물 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐 에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 2 : 식품의 제조
본 발명의 오미자 추출물를 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 오미자 추출물 20~95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
2. 토마토 케찹 및 소스의 제조
본 발명의 오미자 추출물 0.2~1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.
3. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 오미자 추출물 0.5~5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 오미자 추출물 0.1~5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 오미자 추출물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
6. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 오미자 추출물 5~10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
7. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 오미자 추출물을 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 오미자 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%),
종실류(들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%),
오미자 추출물의 건조분말(3 중량%),
영지(0.5중량%),
지황(0.5중량%)
제제예 3 : 음료의 제조
1. 탄산음료의 제조
설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여 본 발명의 오미자 추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.
2. 건강음료의 제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 오미자 추출물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
3. 야채쥬스의 제조
본 발명의 오미자 추출물 5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
4. 과일쥬스의 제조
본 발명의 오미자 추출물 1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
본 발명의 오미자 추출물은 3T3-L1 지방세포에서 인슐린의 작용을 향상시켜 세포막의 GLUT 4 양을 증가시키고 포도당의 흡수를 증가시키므로, 혈당강하효과가 우수하다.
따라서, 본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 인슐린 비의존형 당뇨병(제 2형 당뇨병)에 대하여 치료효과가 뛰어나다.

Claims (6)

  1. 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 오미자 추출물은 70% 에탄올로 추출한 후, 0~100% 메탄올 수용액으로 농도구배하여 얻어진 분획인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 오미자 추출 분획은 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5)인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  4. 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 예방 및 개선용 건강식품.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 오미자 추출물은 70% 에탄올로 추출한 후, 0~100% 메탄올 수용액으로 농도구배하여 얻어진 분획인 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 개선용 건강식품.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 오미자 추출 분획은 60% 메탄올 분획(Fr.4), 80% 메탄올 분획(Fr.5)인 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 개선용 건강식품.
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