KR100619543B1 - 말론디알데히드에 의해 산화된 저밀도 지질단백질에특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 및 그의항원결합 단편 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말론디알데히드(malondialdehyde: MDA)에 의해 산화된 저밀도 지질단백질(LDL)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 및 그의 항원결합 단편에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 조합 항체 라이브러리(combinatorial antibody library) 및 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여, 동맥경화 환자의 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte: PBL)에서 분리한, MDA에 의해 산화된 LDL(MDA-LDL)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 P2-8과 P3-190 및 그의 항원결합 단편에 관한 것이다.

본 발명에 따른 자가항체 및 그의 항원결합 단편은 동맥경화 환자의 PBL에서 분리한 것으로, MDA-LDL에 특이적인 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하므로, 동맥경화를 비롯한 자가면역 질환의 치료, 예방, 및 진단에 있어 유용하다.

MDA-LDL, oxLDL, 항체, 동맥경화

Description

말론디알데히드에 의해 산화된 저밀도 지질단백질에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 및 그의 항원결합 단편{A Human Monoclonal Autoantibody Specifically Binding to Malondialdehyde-Oxidized Low-Density Lipoprotein and An Antigen-Binding Fragment Thereof}

도 1은 클론 P2-8 및 P3-190에서 분리한 Fab를 면역블러팅한 결과이다. 정상적인 IgG를 파파인으로 처리하여 수득한 Fab를 양성대조군으로 사용하였다.

도 2은 항-MDA-LDL 단일클론 자가항체에 사용된 중쇄 가변영역(VH) 유전자의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 각 클러스터에서, 상단 서열은 비교를 위해 주어진 것으로, 발현된 유전자에 대하여 높은 유사성을 나타내는 GL(germline) 유전자의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. GL 유전자와 비교하여, 동일한 아미노산 서열은 대쉬(-)로 표시하고, 돌연변이에 의해 치환된 아미노산은 이탤릭체로 표시하였다.

도 3는 항-MDA-LDL 단일클론 자가항체에 사용된 경쇄 가변영역(VL) 유전자의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 각 클러스터에서, 상단 서열은 비교를 위해 주어진 것으로, 발현된 유전자에 대하여 높은 유사성을 나타내는 GL 유전자의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. GL 유전자와 비교하여, 동일한 아미노산 서열은 대쉬(-)로 표시하고, 돌연변이에 의해 치환된 아미노산은 이탤릭체로 표시하였다.

도 4는 MDA-LDL에 대한 P3-190의 결합을 나타내는 sensorgram이다.

도 5는 고유의 LDL에 대한 P3-190의 결합을 나타내는 sensorgram이다.

도 6은 MDA-LDL에 대한 P2-8의 결합을 나타내는 sensorgram이다.

도 7은 고유의 LDL에 대한 P2-8의 결합을 나타내는 sensorgram이다.

본 발명은 말론디알데히드에 의해 산화된 저밀도 지질단백질(LDL)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 및 그의 항원결합 단편에 관한 것으로, 보다 상세하게는 조합 항체 라이브러리(combinatorial antibody library) 및 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여, 동맥경화 환자의 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte: PBL)에서 분리한, MDA(malondialdehyde)에 의해 산화된 LDL(MDA-LDL)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 P2-8와 P3-190 및 그의 항원결합 단편에 관한 것이다.

동맥혈관은 원래 탄력성이 많고 내면이 매끈하여 피의 흐름이 효과적으로 이루어지도록 되어 있지만, 혈관 내벽에 콜레스테롤, 인지질 등을 함유한 지방성 물질(plaque)이나 칼슘이 축적되면 혈관이 딱딱해지게 된다. 지방성 물질의 축적이 증 가할수록 동맥은 탄력성을 잃을 뿐 아니라, 동맥내경이 좁아져서 혈액의 원활한 흐름을 방해한다.

동맥내경이 좁아지더라도 어느 정도까지는 불편한 증상이 나타나지 않다가, 어느 한계이상 좁아지면 비로소 그 말초에 빈혈현상이 일어나서 증상을 나타내게 된다. 동맥벽이 전반적으로 탄력성을 잃는 현상을 협의의 동맥경화증이라 말하고, 비교적 큰 동맥내면에 국소적으로 지방분이 축적되고 병적인 이상조직이 증식하는 현상을 죽상경화증이라 한다. 상기 기술한 두 가지 동맥의 퇴행성 변화를 통틀어 동맥경화(atherosclerosis)라 한다.

동맥경화란 구체적인 병명이 아니라 동맥의 병적변화를 지칭하는 용어로서, 동맥경화로 인하여 병을 일으키는 장기에 따라 구체적인 병명을 붙이게 된다. 뇌동맥경화에 의한 뇌경색, 관상동맥경화에 의한 심근경색 등을 예로 들 수 있다.

동맥경화는 복잡한 조직병리학적 과정(histopathological process)으로, 여러 가지 복합적인 위험요인으로 발생하게 된다(Ross, R., Nature, 362:801, 1993). 죽종(atheroma)의 형성은 동맥벽(arterial wall)에서 발생하는 염증과정(inflammatory process)으로 알려져 있고(Ross, R., New Engl. J. Med., 340:115, 1999; Rajavashisth, T.B, et al., Nature, 344:254, 1990), 자가면역 인자(autoimmune factor)가 동맥경화 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Wick, G., et al., Am. Heart J., 138:S444, 1999; Caligiuri, G., et al., Lab. Invest., 83:939, 2003; Sherer,Y., and Shoenfeld, Y., Autoimmun. Rev., 1:21, 2002).

LDL(low-density lipoprotein)은 말초에 존재하는 세포까지 콜레스테롤(cholesterol)을 전달하는 중요한 역할을 담당하고 있는 단백질이고, 이의 산화된 형태인 oxLDL은 동맥경화 과정에 관여할 것으로 추측되는 자가항원(autoantigen)중의 하나로, 면역원성(immunogenicity)을 가지고 있어서 자가항체를 형성시키는 자가면역 반응(autoimmune response)을 유발할 수 있다(Harats, D., et al., Q. J. Med., 92:57, 1999; Vaarala, O., J. Intern. Med., 247:381, 2000; Frostegard, J., Autoimmun. Rev., 1:233, 2002; Boyd, H.C., et al., Am. J. Pathol., 135:815, 1989; Salonen, J.T., et al., Lancet, 339:883, 1992; Witztum, J. L. and Steinberg D. J., Clin. Invest., 88:1785, 1991; Scherer, Y., et al., Cardiology, 95:20, 2001).

말론디알데하이드에 의해 화학적으로 변형된 LDL(MDA-LDL)은 LDL의 산화에 의해 생성되는 산물중 대표적인 것으로, MDA-LDL은 산화된 LDL(oxLDL)과 비슷한 특징을 가지고 있다(Steinbrecher, N. Engl. J. Med., 349:2399, 1987). 자가면역 질환인 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus: SLE)에서 심혈관질환이 발생할 위험성이 높아지며, SLE를 가진 환자에게서 심혈관질환 중 하나인 동맥경화가 발생되었다고 알려졌다 (Frostegard, J., Autoimmun. Rev., 1:233, 2002; Roman, M. J., et al., N. Engl. J. Med., 349:2399, 2003). MDA-LDL에 대한 항체의 농도는 apoE- 또는 LDL-수용체-결핍 마우스(apoE- or LDL-receptor-deficient mice)의 혈장에서 높고, 동맥경화의 진행과 관련이 있다(Palinski, W., et al., Arterioscle.r Thromb., 14:605, 1994; Palinski, W., et al., J. Clin. Invest., 98:800, 1996).

항-oxLDL 항체는 LDL의 산화, 혈관내피세포 손상(endothelial dysfunction) 및 동맥의 염증(arterial inflammation)과 같은 산소에 의한 스트레스(oxidative stress)를 알려주는 생물학적 마커이자, 동맥경화의 마커로서 알려져 있다. oxLDL에 대한 자가항체는 모든 연령대의 치료대상에게서 발견되는 것이지만(Lopes-Virella, et al., Arterioscler. Thromb., 11:1356, 1991; Mironova, M., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 16:222, 1996), 그 중에서도 특히, 동맥경화 및 관상동맥심질환(coronary heart disease) 환자에서 급격하게 증가하는 것으로 밝혀졌다(Vaarala, O., J.Intern. Med., 247:381, 2000; Salonen, J.T., et al., Lancet, 339:883, 1992; Scherer, Y., et al., Cardiology, 95:20, 2001). 변형된 LDL과 염증성(inflammatory property)을 가진 자가항체간에 면역 복합체(immune complex)가 형성될 수 있다(Lopes-Virella, et al., Arterioscler. Thromb., 11:1356, 1991; Mironova, M., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 16:222, 1996).

또한, 최근의 연구결과에 의하면, 항-oxLDL 항체는 동맥경화의 발병기전, 촉진(promotion) 및 진행(progression)에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Palinski, W., et al., J. Clin. Invest., 98:800, 1996; Shih, D. M., et al., J. Biol. Chem., 275:17527, 2000; Freigang, S., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18:1972, 1998).

OxLDL에 특이적인 여러가지의 자가항체의 생성은 자가면역 질환인 동맥경화의 기본 메카니즘을 이해하는데 있어 중요한 의미를 가질 뿐 아니라, 의약분야에 있어서 잠 재적인 제제를 개발함에 있어서 유용하지만, 현재까지 오직 몇 개의 항-oxLDL 단일클론 항체만이 인간이 아닌 마우스에서 제조되어 연구되고 있다(Palinski, W., et al., J. Clin. Invest., 98:800, 1996; Shaw, P.X., et al., J. Clin. Invest., 105:1731, 2000; Choi K., et al., Exp. & Mol Med., 30:41, 1998). ApoE-결핍 마우스에서 유래한 항-포스포릴콜린 마우스 단일클론 항체(anti-phosphorylcholine mouse monoclonal antibody)는 oxLDL을 포함하여 동맥경화와 관련된 새로운 자가항원을 강하게 인지하였다(Shaw, P. X., et al., J. Immunol., 170:6151, 2003).

oxLDL 또는 산화스트레스에 의한 동맥경화의 발병 가설은 이를 뒷받침하는 수많은 연구들로 이루어진 강력한 배경이 있음에도 불구하고, 동맥경화의 조절 및 예방을 위한 치료적인 측면에서 만족스런 결과들이 발견되고 있지 않다.

이에 본 발명자들은 MDA-LDL에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체를 분리하고자 노력한 결과, 조합 항체 라이브러리(combinatorial antibody library) 및 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여, 동맥경화 환자의 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte: PBL)에서 MDA(malondialdehyde)에 의해 산화된 LDL(MDA-LDL)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 P2-8 및 P3-190을 분리하고 그의 특징을 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 MDA(malondialdehyde)에 의해 산화된 LDL(MDA-LDL)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 P2-8와 P3-190 및 그 의 항원결합 단편을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 함유하는 MDA-LDL 특이적 항체의 중쇄 CDR 및/또는 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 함유하는 MDA-LDL 특이적 항체의 경쇄 CDR을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 중쇄 CDR을 함유하는 중쇄 가변영역을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 경쇄 CDR을 함유하는 경쇄 가변영역을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 중쇄 CDR 및 상기 경쇄 CDR을 함유하는 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 중쇄 가변영역 및 상기 경쇄 가변영역을 함유하는 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 각각 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 인간항체 또는 그의 항원결합 단편은 1× 10^-10M 이하의 K_D를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 인간항체를 암호화하는 DNA 서열을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 함유하는 MDA-LDL 특이적 항체의 중쇄 CDR 및/또는 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 함유하는 MDA-LDL 특이적 항체의 경쇄 CDR을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 중쇄 CDR을 함유하는 중쇄 가변영역을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 경쇄 CDR을 함유하는 경쇄 가변영역을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 중쇄 CDR 및 상기 경쇄 CDR을 함유하는 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 중쇄 가변영역 및 상기 경쇄 가변영역을 함유하는 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 각각 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 인간항체 또는 그의 항원결합 단편은 2× 10^-7M 이하의 K_D를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 인간항체를 암호화하는 DNA 서열을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 파지 디스플레이 기술을 이용한 MDA-LDL 특이적 항체 분리

1-1: PBL 분리

동맥경화 진단을 받은 20명의 환자로부터 혈액 샘플을 채취하였다(아주대학교 의료원). 혈액 채취시, 환자들은 동맥경화를 치료하기 위한 어떠한 약도 먹지 않았다. MDA-LDL ELISA를 수행한 결과, 동맥경화 환자들의 혈청은 20명의 건강한 일반인들보다 높은 항-MDA-LDL 항체의 수치를 나타내었다. 항-MDA-LDL 항체를 클로닝하기 위하여, 20명의 환자들 중에서 항-MDA-LDL 항체의 수치가 가장 높게 나타난 두 명의 환자를 PBL의 제공자(donor)로 선정하고, 이들로부터 PBL을 분리하였다.

1-2: MDA-LDL의 수득

LDL은 MDA를 사용하여 Choi 등의 방법으로 변형시켰다(Choi K., et al., Exp. & Mol Med. 30:41, 1998). MDA는 사용할 때마다 MDA 비스-디메틸아세탈(MDA bis-dimethylacetal)을 산 가수분해(acid hydrolysis)시켜 새롭게 제조하여 사용하였 다. 80㎕의 MDA 비스-디메틸아세탈에 12㎕의 4N HCl 및 400㎕의 물을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 다음, 1N NaOH를 첨가하여 pH를 7.4로 적정함으로써 반응을 정지시키고, 물을 첨가하여 전체 부피를 1㎖로 맞추어 0.5M MDA를 준비하였다.

상기 수득한 0.5M MDA(100μg LDL/1㎖ MDA)를 LDL와 혼합하여 37℃에서 3시간동안 반응시켜 MDA-LDL을 준비하였다. MDA와 LDL을 접합(conjugation)시킨 다음, MDA에 의해 변형된 oxLDL을 PBS(phosphate buffered saline)로 투석(dialysis)하여 접합되지 않은 MDA를 제거하였다.

1-3: Fab(항원결합 단편)의 PCR 증폭 및 라이브러리 제조

Histopaque-1077(Sigma)를 사용하여 헤파린을 처리한 혈액에서 PBL을 수득하였다. RNAsol(Gibco/BRL)을 사용하여 PBL에서 전체 RNA(30μg)를 분리하고, first-stranded cDNA synthesis kit(Pharmacia)를 사용하여 first-stranded cDNA를 제조하였다. 세 단계의 PCR을 수행하여 인간 Fab 분절(human Fab segment)을 준비하였다. V_H, V_L, C_H1 및 C_κ 유전자 각각을 PCR 첫 번째 단계에서 증폭하고, 두 번째 단계인 오버래핑 PCR (overlapping PCR)에서 상기 각각의 유전자를 조합하여 Fd(V_H/C_H1) 및 경쇄(V_L/C_κ 또는 V_L/C_λ)를 제조하였다. 그리고, PCR의 세 번째 단계를 통해 오버래핑 확장(overlapping extension)을 진행시킴으로써 전체 길이를 가진 Fab 산물을 제조하였다.

각각의 V_H 및 V_L,유전자 패밀리에 대한 5' 프라이머 및 IgG, k 또는 λ에 대한 3' 불변영역(constant region) 프라이머는 Barbas 등의 방법으로 합성하였다(Barbas, C.F., et al., Antibody Libraries. In Phage Display: A Laboratory Manual, 1st Ed. T. Kuhlman, D. deBruin, and P. Barker, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001; Andris-Widhopf, J., et al., J. Immunol. Methods., 242:159, 2000). 전체 길이를 가진 Fab PCR 산물은 5'말단 및 3'말단에 비대칭성 SfiI 제한효소 자리를 가지고 있고, 이 자리를 통해 파지미드 벡터(phagemid vector)인 pComb3X(GenBank Accession No.: AF268281)로 클로닝하였다.

pComb3X는 두 개의 리보좀 결합부위(ribosome-binding site)와 신호 펩타이드(signal peptide)를 가지고 있다. 각각의 Fd 및 경쇄는 원형질막공간(periplasm)으로 이동하여 어셈블리(assembly)된 다음, 파지 입자(phage particle) 표면에 나열된다.

Fab를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pComb3X를 사용하여 E. coli(XL-1/Blue(Stratagene))를 형질전환시켰다. 재조합 벡터로 연결된 Fab 라이브러리(ligated Fab library)는 6X10⁷개의 형질전환체(transformant)를 가지고 있다. 파지미드를 가지고 있는 XL-1/Blue를 VCSM16 헬퍼 파지(Stratagene)로 감염시킨 다음, Fab를 암호화하는 DNA를 운반하는 파지를 제조하였다.

1-4: Fab 클론의 선별(패닝(panning)) 및 선별된 클론의 특성 규명

MDA-LDL에 특이적으로 결합하는 클론의 선별은 하기 기술한 방법대로 수행하였다. 먼저, BBS 버퍼(20μM BHT, 0.27mM EDTA, PBS)에 녹인 MDA-LDL(2㎍/㎖)로 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate, Costar)를 코팅하고, 4℃에서 하룻밤동안 방치한 다음 PBS로 한번 세척하였다. 그리고, PBS(phosphate buffered saline)에 희석한 5% BSA(bovine serum albumin)를 4℃에서 하룻밤동안 처리하여 코팅한 플레이트를 블러킹(blocking)한 다음, 실험 때마다 새롭게 준비한 파지 입자 40㎕ (1× 10¹¹), 10% BSA 5㎕ 및 10X PBS를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트의 각 웰(well)은 0.5% Tween 20이 녹아있는 PBS(PBST)로 6번 세척하였다. 결합한 파지 입자는 0.5M HCl/glycine (pH 2.3) 50㎕를 사용하여 실온에서 5분동안 배양함으로써 용출(elution)하였고, 상기 용출은 두 번 수행하였다.

상기 용출액에 1M Tris/HCl (pH 8.0) 150㎕를 첨가하여 파지 입자를 중화(neutralization)시켰다. 활발하게 성장하고 있는 3㎖의 XL-1 Blue 세포에 중화시킨 파지 입자 250㎕를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양한 다음, 카베니실린(carbenicillin, 50㎍/㎖) 및 테트라사이클린(10㎍/㎖)을 첨가하고 37℃에서 2시간동안 배양한 후, VCSM13(Stratagene) 100㎕를 첨가하였다. 최종부피가 100㎖이 되도록 카베니실린 및 테트라사이클린을 함유하는 배양액(broth)을 첨가하고 37℃에서 2시간동안 배양한 후, 카나마이신(kanamycin, 50㎍/㎖)을 첨가하고 37℃에서 하룻밤동안(overnight) 배양하였다.

상기 배양액을 4℃에서 15분동안 스핀다운(spin down)시켜 파지 입자를 모으고, 상 등액(supernatant)을 다시 스핀다운시켜 수득한 상등액은 두 번째 패닝에서 사용하였다. 네 번째 패닝 후에, 파지 상등액 및 파지미드 DNA(phagemid DNA)를 수득하였다.

MDA-LDL에 대한 4번의 패닝이 완료된 다음, 파지 ELISA에서 양성반응을 나타낸 클론을 H/κ 및 H/λ라이브러리에서 분리하였다. MDA-LDL에서 나타난 ELISA 시그널(ELISA signal)은 패닝이 진행되는 동안 증가한 반면, BSA에서 나타난 시그널은 패닝동안 낮게 나타났다. 벡터에 삽입된 약1,500bp의 DNA를 함유하는 클론은 SfiⅠ 제한효소 분석법을 수행하여 확인하였다.

1-5: 파지 ELISA

파지 상등액은 항원(antigen)에 대한 항체-결합 특이성(antibody-binding specificity)에 근거하여 선별하였다. BBS에 녹인 MDA-LDL(2㎍/㎖)을 마이크로타이터 플레이트에 넣고, 4℃에서 하룻밤동안(overnight) 방치하여 플레이트를 미리 코팅하였다. PBS에 희석한 5% BSA로 상기 플레이트를 블러킹(blocking)한 다음, 파지 상등액을 각 웰에 첨가하여 실온에서 2시간동안 배양하고, PBST로 4번 세척한 후, AP가 결합되어 있으면서 Fab 특이적인 항-인간 IgG 항체(alkaline phosphate(AP)-conjugated anti-human IgG (Fab specific) antibody, Sigma)를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. PBST로 플레이트를 세 번 세척한 후, AP의 기질(substrate)인 ρ-나이트로페닐 포스페이트(ρ-nitrophenyl phosphate) 50㎕를 첨가하고, 적정 시간동안 반응시킨 다음 ELISA reader ELX 808 IU (BIO-TEK)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

1-6: Fab V 영역을 암호화하는 유전자의 시퀀싱

자동화된 염기서열 분석기(automatic sequencer, Biocore Technology, Korea)를 사용하여, 파지 ELISA에서 양성반응을 보이고 SfiI 제한효소 분석법으로 삽입 유전자가 확인된 클론(positive clone)에서 추출한 파지미드 DNA를 분석하였다. 하기 서열번호 17및 서열번호 18로 표시된 프라이머를 사용하여 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 시퀸싱하였다:

서열번호 17: 5' - TAT TGC CTA CGG CAG CCG - 3'

서열번호 18: 5'- ATT GCA GTG GCA CTG GCT - 3'.

시퀀싱 자료는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 및 DNAPLOT(V BASE)를 사용하여 수집하고 분석하였다.

1-7: 가용성 Fab 제조 및 분리

일렉트로컴피턴트 TOP10F' 세포(electrocompetent TOP10F' cell, Invitrogen)는 억제자를 생산하지 않는 계통(non-repressor strain)으로, 파지의 코트 단백질인 pⅢ가 없는 가용성 Fab 단백질을 생산할 수 있도록 종결코돈(stop codon)인 앰버코돈(amber codon)을 인지한다.

재조합 파지 Fab를 함유하는 파지미드로 상기 TOP10F'세포를 형질전환(transformation)시키고, 각각의 클론을 분리하기 위하여 플레이팅(plating)하였 다. 각각의 세포는 37℃에서 5시간동안 카베니실린, 테트라사이클린 및 20mM MgCl₂를 함유하는 SB 배지에서 배양하였다. Fab 단백질의 발현을 유도하기 위하여, 세포에 1mM IPTG(isopropyl thiogalactopyranoside)를 처리하고, 25~30℃에서 2~16시간동안 배양하였다.

상기 배양액을 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 분리하였다. 차가운 TES 버퍼(0.2M Tris-HCl, pH 8.0, 0.5mM EDTA, 0.5M 수크로즈) 10㎖을 희석시킨 배양액 1ℓ에 분리한 펠렛을 재현탁한 다음, 희석한 차가운 TES 버퍼(증류수에 1:3의 비율로 희석)를 첨가하고 30분동안 얼음속에 방치하였다. 반응이 끝난 후, 상기 혼합물(mixture)을 15000g에서 10분동안 원심분리하여 부유물(suspension)을 수득함으로써, 가용성 원형질막공간 추출물(soluble periplasm extract)을 수득하였다.

Fab를 분리(purification)하기 위하여, Fab의 발현이 유도된 세포 배양액의 상등액과 가용성 원형질막공간 추출물을 혼합하고, 울트라필트레이션 세포 유닛(ultrafiltration cell unit, Amicon, U.S.A.) 및 울트라필트레이션 멤브레인(ultrafiltration membrane, NMWL: 10,000, Millipore, U.S.A.)을 사용하여 5번 농축한 다음, 세정버퍼(washing buffer: 50mM NaH₂PO₄, pH 8.0, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸(imidazole))로 세척하였다. 농축된 혼합물은 15,000g로 20분동안 원심분리한 후, 0.22㎛ 필터(Millipore, U.S.A.)를 사용하여 여과하였다.

농축된 혼합물에서 Fab 단백질을 추출하기 위하여, 세정버퍼로 세척한 Ni-NTA 컬럼(Qiagen, Germany)을 사용하였다. 택일적으로, 농축된 혼합물을 컬럼에 넣기 전에, Ni-NTA 아가로즈에 첨가하고 4℃에서 1시간동안 섞어줄 수 있다. 단백질은 10㎖의 용출버퍼(elution buffer: 50mM NaH₂PO₄, pH 8.0, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸)를 사용하여 두 부분(fraction)으로 용출하였다. 용출된 샘플은 센트리프렙(centriprep, YM-10, Millipore)을 사용하여 최종 부피가 1.5㎖이 되도록 농축하고, PBS로 세척하였다.

1-8: 가용성 Fab의 면역블러팅(immunoblotting)

단백질 레벨에서 항-MDA-LDL 단일클론 항체의 특징을 규명하기 위하여, 상기 기술한 바와 같이 가용성 Fab의 발현을 유도한 다음, 배양액의 상등액 및 원형질막공간 추출물에서 수득하였다. 수득한 Fab는 비환원성 조건(non-reducing condition)하에서 SDS-PAGE를 수행하여 분리하고, NC 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 3% BSA/PBS로 실온에서 2시간동안 블러킹한 다음, 여기에 AP가 결합되어 있으면서 Fab에 특이적인 항-인간 IgG 항체를 첨가하고 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 PBS/Tween-20으로 멤브레인을 세 번 세척하고, ECM 시스템(enhanced cheiluminescence system)인 WEST-zol plus(Intron, Korea)를 사용하여 단백질의 존재를 확인하였다(도 1).

정상적인 인간의 IgG를 파파인(papain)으로 처리한 후, 단백질 G 친화력 컬럼(protein G affinity column)으로 분리하여, 수득한 인간의 Fab는 면역블러팅에서 양성대조군(positive control)으로 사용하였다. 상기 Fab는 Fab에 특이적인 항- 인간 IgG 항체와 반응한다.

실시예 2: 항-MDA-LDL 단일클론 항체의 서열분석

상기 패닝 및 SfiⅠ 제한효소 분석법으로 2개의 Fab를 선별하고, 이들을 각각 P2-8 및 P3-190이라 명명하였다.

표 1은 본 발명에 따른 P2-8 및 P3-190의 유전자서열을 분석하여, GL(germline)에 대한 유사성, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 유전자의 사용도(utilization) 및 CDR3-VH의 길이를 정리한 것이다. 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같은 EMBL/GenBank Accession No.를 가진다: P2-8-VH: AY206989; P2-8-VL: AY560603; P3-190-VH : AY560604; 및 P3-190-VL: AY512967.

클론의 중쇄 가변영역(VH)은 인간의 유전자 패밀리(gene family)중에서 가장 큰 VH3 패밀리(표 1)에 속하고, 경쇄 가변영역(VL)은 VL2 패밀리에 속한다. 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 CDR(complementarity-determining region)3-VH의 길이는 각각 5a.a 및 11a.a이다. 단일클론 항체와 이들의 GL 상대물(germline counterpart)을 사용하여 유전자 분절(gene segment)을 비교한 결과, 단일클론 항체는 가변부위에서 광범위한 돌연변이가 발생하였음을 알 수 있다(표 1). GL 유전자와 비교하여 P2-8 및 P3-190의 중쇄 가변영역은 각각 94% 및 92%의 유사성을 가지고 있고, 경쇄 가변영역은 각각 92% 및 95%의 유사성을 가지고 있다.

Fab clones	Identity To GL (%)	V gene or segment usage			CDR3-VH length (a.a)
		V gene family	D gene family	J gene family
P2-8-VH	94%	3-72	3-16	4b	5
P2-8-VL	92%	L2		K1
P3-190-VH	92%	3-49	5-24	4	11
P3-190-VL	95%	L2		L3b

도 2는 항-MDA-LDL 단일클론 자가항체에 사용된 중쇄 가변영역(VH) 유전자의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸 것이고, 도 3은 항-MDA-LDL 단일클론 자가항체에 사용된 경쇄 가변영역(VL) 유전자의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에서 양전하를 띈 아미노산(positively charged amino acid)인 아르기닌(arginine) 또는 라이신(lysine)으로의 치환(substitution)이 빈번하게 발생함을 확인하였다.

실시예 3: 항-MDA-LDL Fab의 항원 결합력 분석

본 발명에 따른 항-MDA-LDL Fab의 항원 결합력을 측정하기 위하여, BIAcore2000(BIACORE AB, Sweden)을 사용하여 SPR(surface plasmon resonance) 측정을 수행하였다. Fab의 고정화 및 SPR 분석을 위하여, 히스티딘 택을 포함하는 분자에 결합하도록 고안된 NTA 센서칩(NTA sensor chip, Pharmacia, Sweden)을 사용하였다.

두개의 펌프(pump)를 가진 BIAcore2000은 용출버퍼(10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 50 μM EDTA, 0.005% Tween-20, pH 7.4)와 주입버퍼(dispensor buffer: 10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Tween 20, pH 7.4)를 분리하여 사용하되 왼쪽 펌프와 연결되어 있는 B 튜브에 용출버퍼, 오른쪽 펌프와 연결되어 있는 A 튜브에 주입버퍼를 장착하였다.

상기 센서칩의 채널은 하기 과정에 따라 사용되었다. 잔존하는 니켈(nickel)을 제거하기 위하여, 상기 NTA 센서칩의 4개 채널을 재생버퍼(regeneration buffer: 0.15M NaCl, 0.35M EDTA, 10mM HEPES, 0.005% Tween 20, pH 8.3)로 10㎕/min 속도로 1분간 세척하고 포화(saturation)시켰다.

기준값(baseline)에서 RU 값이 40 이상 증가되도록 낮은 유속(10㎕/min)의 니켈 용액(500μM NiCl₂ in eluent buffer)을 채널 2에 주입하고, 순수 분리한 Fab를 5㎕/min 속도에서 200nM의 농도로 약 15분간 주입하여 고정시켰다. 같은 방법으로 분석할 다른 종류의 Fab를 채널 3에 주입하여 고정하였다. 일정 범위에서 연속적으로 희석(serial dilution)하여 적어도 5개 이상의 농도로 가지는 항원 희석액을 준비하였다. 이때 희석을 위하여 용출 버퍼를 사용하였다.

회합(association)과 해리(dissociation)가 각각 30㎕/min의 속도에서 2분으로 진행되도록 설정하고, 4개의 채널에 항원을 주입하여 흘려보냈다. 해리가 완료된 후 RU 값이 기준값보다 높을 경우에는, 1M NaCl/50mM NaOH 용액을 5~10㎕/min 속도로 1분간 주입하여 결합된 Fab와 항원을 인위적으로 완전히 분리한 후, 다른 농도의 항원을 30㎕/min의 유속으로 주입하였다. 모든 농도의 항원 주입이 끝나면 재생버퍼(regeneration buffer: 0.15M NaCl, 0.35M EDTA, 10mM HEPES, 0.005% Tween 20, pH 8.3)를 사용해 센서칩을 재생하였다. 5개 이상의 농도별로 다르게 얻어진 sensorgram을 BIAevaluation 소프트웨어 3.1에서 분석하여 Ka,Kd 및 KD 값을 구하였으며, 데이터의 신뢰도는 chi2와 T 값 즉, T(Ka), T(Kd), T(KD)로 판단하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 클론 P3-190은 다양한 농도의 MDA-LDL(125nM, 250nM, 500nM 및 750nM)에 결합하였지만, 다른 자가항원인 dsDNA(100μg/㎖), β2-당단백질-1(1μM) 또는 카디오리핀(cardiolipin, 1μM) 및 MDA(500μM)와는 결합하지 않았다. 도 5는 클론 P3-190과 고유의 LDL(56.25nM, 112.5nM, 225nM, 450nM 및 900nM)간의 결합을 나타내는 sensorgram이다.

도 6에 나타난 바와 같이, 클론 P2-8는 다양한 농도의 MDA-LDL(31.25nM, 62.5nM, 125nM, 250nM 및 500nM)에 결합하였다. 도 7은 P2-8과 고유의 LDL(28.125nM, 56.25nM, 112.5nM, 225nM, 450nM 및 900nM)간의 결합을 나타내는 sensorgram이다.

본 발명에 따라 수득한 항-oxLDL Fab에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 결합력을 조사한 결과, MDA-LDL에 대한 P2-8의 결합력(9.87× 10^-9)은 LDL(1.36× 10^-7)에 대한 결합력보다 14배 이상 크고, MDA-LDL에 대한 P3-190의 결합력(1.98× 10^-7)은 LDL(7.84× 10^-5) 에 대한 결합력보다 400배 이상 큰 것으로 나타났다(표 2). 이로써, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원결합 단편은 LDL보다 MDA-LDL에 더 강한 결합력을 가진다는 것을 확인하였다.

클론	KD (M)
	MDA-LDL	LDL
P2-8	9.87 × 10-9	1.36 × 10-7
P3-190	1.98 × 10-7	7.84 × 10-5

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 MDA(malondialdehyde)에 의해 산화된 LDL(MDA-LDL)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 자가항체 P2-8와 P3-190 및 그의 항원결합 단편을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 자가항체 및 그의 항원결합 단편은 동맥경화 환자의 PBL에서 유래된 MDA-LDL에 특이적인 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하므로, 동맥경화를 비롯한 자가면역 질환의 치료, 예방 및 진단에 있어 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (22)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR을 함유하는 중쇄 가변영역과 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR을 함유하는 경쇄 가변영역을 포함하고, K_D는 1×10^-10M 이하인 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab).
9. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 각각 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 하는 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab).
10. 삭제
11. 제8항의 인간항체를 암호화하는 DNA 서열.
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 중쇄 CDR을 함유하는 중쇄 가변영역과 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 경쇄 CDR을 함유하는 경쇄 가변영역을 포함하고, K_D는 2×10^-7M 이하인 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab).
20. 제19항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 각각 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 것을 특징으로 하는 MDA-LDL 특이적 인간항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab).
21. 삭제
22. 제19항의 인간항체를 암호화하는 DNA 서열.

Images