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CN116041502A - 一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN116041502A CN202211153892.XA CN202211153892A CN116041502A CN 116041502 A CN116041502 A CN 116041502A CN 202211153892 A CN202211153892 A CN 202211153892A CN 116041502 A CN116041502 A CN 116041502A
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沈晨光
蒋宇珊
董晓宁
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Tianjin Hongyutai Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请涉及免疫学的技术领域，具体公开了一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体及其应用，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR1、SEQ ID No.2所示的CDR2和SEQ ID No.3所示的CDR3；所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR1、SEQ ID No.5所示的CDR2和SEQ ID No.6所示的CDR3。上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体仅特异性识别并结合第181位苏氨酸发生了磷酸化的Tau蛋白，不与未磷酸化的蛋白结合，灵敏度高，结果准确。

Description

一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体及其应用
技术领域
本申请涉及免疫学的技术领域，更具体地说，涉及一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体及其应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)是一种以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性疾病，多出现在老年时期。其特有的病理改变为神经元内病理性Tau蛋白纤维形成神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及细胞外β-淀粉样多肽(β-amyloid peptide，Aβ)沉积形成的神经炎性斑块，临床上表现为进行性认知功能障碍和记忆力衰退、性格和行为改变、判断力下降、社交障碍以及生活自理能力丧失等。目前的研究认为，临床上认知功能的下降主要与NFTs的数量密切。NFTs主要由成对螺旋纤丝(pairedhelical filament，PHF)构成，其主要成分是过度磷酸化的Tau蛋白(微管相关蛋白Tau)的各种异构体。
许多研究表明，在阿尔茨海默症及其他Tau蛋白引起的病理过程中，Tau蛋白的过度磷酸化可能发生在最早期。其中，Tau蛋白的181位苏氨酸(T181)磷酸化是最常见的磷酸化形式之一，也是阿尔茨海默症所特有的磷酸化位点。因此，如果能快速检测出发生了pT181磷酸化的Tau蛋白，就能在早期诊断出阿尔茨海默症，这对于预防和治疗阿尔茨海默症具有重要的意义。
目前，检测Tau蛋白pT181磷酸化的试剂盒多采用ELISA检测法，需要配合特异性识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。但市面上此类单抗的数量少、灵敏度低、特异性差，给相关的检测带来了一定的障碍。
发明内容
为了对Tau蛋白第181位苏氨酸是否发生了磷酸化进行高特异性、高灵敏度检测，本申请提供一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体及其应用。
本申请提供的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体仅特异性识别并结合第181位苏氨酸发生了磷酸化的Tau蛋白，不与未发生磷酸化的Tau蛋白结合，特异性好，灵敏度高，结果准确，可用于实际的临床检测中。
第一方面，本申请提供一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，采用如下技术方案：
一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR1、SEQ ID No.2所示的CDR2和SEQ IDNo.3所示的CDR3；
所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR1、SEQ ID No.5所示的CDR2和SEQ IDNo.6所示的CDR3。
本申请中，互补决定区(complementarity-determining regions，CDR)位于抗体的可变区内，通过重链CDR与轻链CDR的相互配合，形成与抗原决定簇三维结构互补的表面，进而与抗原决定簇互补结合。抗体CDR的氨基酸序列决定了抗体对抗原的特异性和亲和性。具备本申请上述CDR序列的抗体可以特异性识别并结合第181位苏氨酸发生了磷酸化的Tau蛋白，而不与未磷酸化的Tau蛋白结合，从而实现对Tau蛋白pT181磷酸化的高效检测，灵敏度高，结果准确。
优选地，所述重链可变区包括SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。
优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。
优选地，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区。
优选地，所述重链恒定区包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。
优选地，所述轻链恒定区包括SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。
优选地，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。
优选地，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的轻链包括SEQ ID No.12所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供一种核酸分子，采用如下技术方案：
一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
第三方面，本申请提供一种重组载体，采用如下技术方案：
一种重组载体，所述重组载体表达第一方面所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
优选地，所述重组载体中含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本申请提供一种重组细胞，采用如下技术方案：
一种重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
优选地，所述重组细胞中含有至少一个拷贝的第三方面所述的重组载体。
第五方面，本申请提供上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法，采用如下技术方案：
一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法包括：
构建重组载体，将所述重组载体导入细胞中，蛋白表达后进行纯化，得到所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
第六方面，本申请提供第一方面所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体和/或第四方面所述的重组细胞在制备Tau蛋白pT181磷酸化检测产品中的应用。
第七方面，本申请提供一种Tau蛋白pT181磷酸化检测试剂盒，采用如下技术方案：
一种Tau蛋白pT181磷酸化检测试剂盒，所述Tau蛋白pT181磷酸化检测试剂盒包括第一方面所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
本申请中，上述Tau蛋白pT181磷酸化检测试剂盒可以对临床样本中的Tau蛋白的第181位苏氨酸是否发生了磷酸化进行高效检测，结果准确，灵敏度高，使用方便。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体仅特异性识别并结合发生了pT181磷酸化的Tau蛋白，不与未发生pT181磷酸化的Tau蛋白结合，从而保证了检测结果的准确性，可以对Tau蛋白第181位苏氨酸是否发生了磷酸化进行高效率、高准确性检测。
2.本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体具有更高的灵敏度，与抗原的亲和力也更强，检测限低至50pg/mL，对发生了pT181磷酸化的Tau多肽的ELISA检测的OD450数值可达3.658，并且无明显的糖基化、磷酸化以及乙酰化修饰，可以对实际样本进行检测，且具有良好的准确性。
3.本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法简单高效，生产成本低，抗体纯度高，具有工厂化生产的潜能，并且可以与其他试剂进一步组合制成相应的试剂盒，使用方便，检测成本低，应用前景广阔。
附图说明
图1为实施例1中BSA-多肽和BSA的ELISA检测的结果图片。
图2为实施例2中7株杂交瘤细胞株分泌的抗体与pT181磷酸化的多肽以及未磷酸化的多肽的亲和性的检测结果图片。
具体实施方式
本申请提供一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区。
其中，所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR1、SEQ ID No.2所示的CDR2和SEQ ID No.3所示的CDR3。
所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR1、SEQ ID No.5所示的CDR2和SEQ IDNo.6所示的CDR3。
进一步地，所述重链可变区包括SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。
所述轻链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。
具体地，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区。
其中，所述重链恒定区包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。
所述轻链恒定区包括SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。
进一步地，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。
所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的轻链包括SEQ ID No.12所示的氨基酸序列。
本申请还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
本申请还提供了一种重组载体，所述重组载体表达上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
具体地，所述重组载体中含有至少一个拷贝的上述核酸分子。
本申请还提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
具体地，所述重组细胞中含有至少一个拷贝的上述重组载体。
本申请还提供了上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法包括：
构建重组载体，将所述重组载体导入细胞中，蛋白表达后进行纯化，得到所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
本申请还提供了一种Tau蛋白pT181磷酸化检测试剂盒，所述Tau蛋白pT181磷酸化检测试剂盒包括上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
以下结合实施例1～9以及附图1～2对本申请的技术方案作进一步说明。
实施例1
本实施例提供了一种免疫原。
该免疫原为包含Tau蛋白的181位苏氨酸磷酸化(pT181)的多肽与BSA(牛血清白蛋白)偶联的免疫复合物，并使用商品化抗体验证其免疫效果。Tau蛋白的多肽氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
制备上述免疫原的步骤如下：
合成SEQ ID No.13所示的多肽，并对相应位点的苏氨酸进行磷酸化修饰，合成时在C端增加一个半胱氨酸用于与BSA连接。再通过SPDP偶联法将合成的多肽与载体蛋白BSA偶联，获得BSA-多肽，即为免疫原，具体的操作委托合肥国肽生物科技有限公司完成。
通过ELISA验证上述BSA-多肽的免疫原性。
使用100μL浓度为5μg/mL的BSA-多肽包被ELISA检测板，加入100μL浓度为1μg/mL的商品化抗体(Phospho-Tau(Thr181)Monoclonal Antibody(AT270)，品牌：Thermofisher，货号MN1050)，每孔再加入100μL按1:5000稀释后的HRP-山羊抗鼠IgG二抗(Thermofisher)，最后测定其在450nm处的OD值。使用BSA作为对照，结果如图1所示。
图1为BSA-多肽和BSA的ELISA检测的结果图片。由图1可以看出，单独的BSA几乎不与商品化抗体结合，而BSA-多肽与商品化抗体具有良好的结合能力，OD450数值高，表明抗原多肽BSA-多肽具有良好的免疫原性，可用于后续的动物免疫中。
实施例2
本实施例提供了一种杂交瘤细胞的制备方法。
上述制备方法使用实施例1制备的BSA-多肽(免疫原)对动物进行免疫，制备杂交瘤细胞并进行筛选，步骤如下：
(1)动物免疫。
使用BSA-多肽免疫4～6周龄的雌性Balb/c小鼠(江苏集萃药康生物技术股份有限公司)，免疫前眼眶采血20μL，离心后获得血清，后续用作阴性对照。
首次免疫时，每只小鼠注射BSA-多肽60μg，使用生理盐水稀释至体积为200μL，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后腹部皮下多点注射。
每14天皮下加强免疫1次，剂量为每只小鼠注射BSA-多肽30μg，使用生理盐水稀释至体积为200μL，与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后注射。
第3次加强免疫7天后眼眶取血，通过ELISA检测血清抗体效价，对达到要求的小鼠进行冲击免疫，剂量为每只小鼠腹腔注射BSA-多肽60μg，注射时用生理盐水稀释至体积为100μL，获得免疫小鼠。免疫后，对免疫小鼠眼眶采血20μL，离心后获得血清，后续用作阳性对照。3天后进行细胞融合。
(2)细胞融合。
将新鲜摘下的免疫小鼠脾脏置于细胞筛上碾碎过滤，与SP2/0细胞(骨髓瘤细胞)按数量比为3:1混合，1000rpm室温离心5min，弃上清。
将装有离心后的细胞的离心管放入37℃温水浴中，边搅动细胞边缓慢加入1mL聚乙二醇溶液(Sigma，P7181-5×5mL)。在水浴中静置1min，缓慢加入10mL无血清的DMEM培养基(Hyclone，SH30243.01B)，1000rpm离心5min，弃上清。
加入含血清的DMEM培养基，并将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔接种150μL，使细胞密度为1×105个/孔，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。24h后加入50μL含HAT(Gibco，21060017)的培养基。此后每3～5天进行换液。
(3)细胞筛选。
待细胞密度达到约50％时，收集细胞上清，通过间接ELISA法筛选能够分泌特异性识别并结合Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，步骤如下：
通过SPDP偶联法将pT181磷酸化的SEQ ID No.13所示的多肽与KLH偶联，得到KLH-pT181磷酸化多肽，具体的操作委托合肥国肽生物科技有限公司完成。用100μL浓度为0.5μg/mL的KLH-pT181磷酸化多肽包被ELISA检测板，37℃静置1h。用PBST清洗4次，取100μL杂交瘤细胞的培养基上清加入包被KLH-多肽的ELISA检测孔中，同时，用动物免疫后的免疫小鼠血清(按1:10000稀释)作为阳性对照，用动物免疫前的小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h。
用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL按1:5000稀释后的HRP-山羊抗鼠IgG二抗(Thermo fisher)，37℃孵育1h。
用PBST洗涤4次后，加入TMB(Solarbio，PR1210-2×250mL)显色，测定450nm处的OD值。OD450数值大于0.5的，判定为阳性克隆株。
对所得阳性克隆株，采用有限稀释法筛选亚克隆。
(4)杂交瘤细胞株的建立。
经过3次亚克隆和间接ELISA筛选后，共获得7株分泌特异性识别Tau蛋白pT181磷酸化的抗体的杂交瘤细胞株，克隆编号依次命名为P-1、P-2、P-3、P-4、P-5、P-6和P-7。
分别通过间接ELISA法检测上述7株杂交瘤细胞株分泌的抗体与pT181磷酸化的多肽以及未磷酸化的多肽的亲和性，步骤如下：
通过SPDP偶联法将未磷酸化的SEQ ID No.13所示的多肽与KLH偶联，得到KLH-未磷酸化多肽，具体的操作委托合肥国肽生物科技有限公司完成。
使用100μL浓度为0.5μg/mL的KLH-pT181磷酸化多肽与KLH-未磷酸化多肽分别包被ELISA检测板，37℃静置1h。用PBST清洗4次，分别取100μL杂交瘤细胞的培养基上清加入相对应的ELISA检测孔中，37℃孵育1h。
用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL按1:5000稀释后的HRP-山羊抗鼠IgG二抗(Thermo fisher)，37℃孵育1h。
用PBST洗涤4次后，加入TMB(Solarbio，PR1210-2×250mL)显色，测定450nm处的OD值，结果如图2所示。
图2为7株杂交瘤细胞株分泌的抗体与pT181磷酸化的多肽以及未磷酸化的多肽的亲和性的检测结果。由图2可以看出，虽然杂交瘤细胞株P-7分泌的抗体与pT181磷酸化的多肽的亲和力并不是最强的，但其与未磷酸化的多肽的亲和力最弱，因此选择P-7分泌的抗体作为识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，从而保证了抗体仅特异性识别并结合发生了pT181磷酸化的Tau蛋白，而不结合未磷酸化的Tau蛋白，进而保证了后续检测结果的准确性。
实施例3
本实施例提供了杂交瘤细胞株P-7分泌的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的氨基酸序列。
其中，测定识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的氨基酸序列的步骤如下：
将实施例2筛选出的杂交瘤细胞株P-7送交南京泰德生物工程有限公司进行抗体序列的测定及分析。经过序列的测定及分析，确定本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
经过分析，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2和SEQ ID No.3所示，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
实施例4
本实施例提供了一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法。上述制备方法包括单克隆抗体的制备、纯化以及亚型碱性。
上述制备方法具体包括以下步骤：
将编码上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体重链和轻链的核苷酸序列分别克隆至表达载体pCDNA 3.4(Thermo fisher)中，构建重组载体，再在293T细胞中瞬时共表达，48h后收集细胞上清，通过ELISA对蛋白的表达情况进行验证，实验结果证实蛋白成功表达。
将含有重组载体的甘油菌接种于LB培养基中，在37℃、200rpm下震荡培养16h，抽提质粒并进行测序验证。
测序验证序列正确后，将质粒瞬时共转染至ExpiCHO-S细胞(Thermo fisher，A29127)内，在37℃、5％CO2的培养箱中培养96h，收集细胞培养物，10000rpm离心30min，用0.45μm一次性无菌滤器过滤上清液后，使用Hi Trap rProtein G FF(GE Healthcare，17061802)亲和层析填料及AKTA蛋白纯化仪，参照说明书上的说明纯化过滤后的上清液中的单克隆抗体。
纯化后的单克隆抗体使用SDS-PAGE验证抗体的纯度。结果显示，识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体成功表达，纯化后的单克隆抗体的SDS-PAGE的条带大小也与预期相符，抗体纯度在95％以上，可用于后续的实验中。
使用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(proteintech)，参照产品说明书上的说明，对纯化后的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的亚型进行鉴定。
鉴定结果显示，本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的重链为IgG1型，轻链为κ型。
实施例5
本实施例检测了本申请提供的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的结合能力和灵敏度。
具体的，所用的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体为实施例4纯化后获得的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。同时，以商品化抗体(Phospho-Tau(Thr181)Monoclonal Antibody(AT270)，品牌：Thermo fisher，货号MN1050)作为对照，检测其结合能力和灵敏度。
一、结合能力检测
(1)结合对象
结合对象为pT181磷酸化的多肽以及未磷酸化的多肽。
通过ELISA法，
(2)检测方法
检测方法为ELISA法。具体如下：
使用100μL浓度为0.5μg/mL的KLH-pT181磷酸化多肽与KLH-未磷酸化多肽分别包被ELISA检测板，37℃静置1h。用PBST清洗4次，再用5％BSA封闭ELISA检测板，37℃静置1h，用PBST洗涤4次，制得KLH-pT181磷酸化多肽包被的ELISA检测板、KLH-未磷酸化多肽包被的ELISA检测板。其中，KLH-pT181磷酸化多肽和KLH-未磷酸化多肽的制备方法参考实施例2。
分别用1％BSA稀释本申请提供的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体以及商品化抗体(Phospho-Tau(Thr181)Monoclonal Antibody(AT270)，品牌：Thermo fisher，货号MN1050)至终浓度均为0.5μg/mL，分别取100μL稀释后的抗体加入到KLH-pT181磷酸化多肽包被的ELISA检测板、KLH-未磷酸化多肽包被的ELISA检测板的检测孔中，以1％BSA作为阴性对照，37℃静置1h。
用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL HRP山羊抗鼠IgG抗体(使用1％BSA按1:5000稀释)，37℃孵育1h，用PBST洗涤4次后，加入TMB进行显色，测定450nm处的OD值。
(3)检测结果
本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体以及商品化抗体(Phospho-Tau(Thr181)Monoclonal Antibody(AT270)，品牌：Thermo fisher，货号MN1050)的结合能力检测结果如表1所示。
表1两种单克隆抗体的结合能力检测结果
Figure BDA0003857559120000091
Figure BDA0003857559120000101
由表1可以看出，本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体对pT181磷酸化的多肽具有良好的结合能力，结合后的OD450数值可达3.658，结合能力略优于商品化抗体。本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体与未磷酸化的多肽几乎不结合，与未磷酸化的多肽结合后的OD450数值低于商品化抗体。上述结果表明本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体对pT181磷酸化的多肽的亲和性更强，且具有更优的特异性，与未磷酸化的多肽几乎不结合，检测的准确性更高，实际应用的价值也更高。
二、灵敏度检测
(1)结合对象
结合对象为KLH-pT181磷酸化多肽。
(2)检测方法
将KLH-pT181磷酸化多肽稀释至终浓度依次为100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、500pg/mL、100pg/mL、50pg/mL和10pg/mL，使用100μL上述不同浓度的KLH-pT181磷酸化多肽稀释液对ELISA检测板进行包被，再进行ELISA检测，具体的操作步骤参见上文。
(3)检测结果
本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体以及商品化抗体(Phospho-Tau(Thr181)Monoclonal Antibody(AT270)，品牌：Thermo fisher，货号MN1050)的灵敏度检测结果如表2所示。
表2两种单克隆抗体的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857559120000102
由表2可以看出，本申请中的纯化后的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体具有极高的灵敏度，可以有效检出样本中浓度低至50pg/mL的发生了pT181磷酸化的Tau蛋白，灵敏度高于商品化抗体(最低检测限可达100pg/mL)。
实施例6
本实施例检测了本申请提供的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的抗原决定簇。
具体的，所用的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体为实施例4纯化后获得的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
检测方法为ELISA法，步骤如下：
合成一组6种短肽，各条短肽具有8个氨基酸重叠和2个氨基酸间隙，从而产生一组6种不同的短肽，覆盖了SEQ ID No.13所示的发生了pT181磷酸化的多肽。
将上述短肽分别固定在链霉亲和素涂布过的微量滴定板上，静置1h后，用含1％BSA和0.1％Tween20的PBS溶液洗涤微量滴定板3次。
每孔加入100μL 0.5μg/mL纯化后的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，37℃孵育1h，随后洗涤3次。再每孔加入100μL HRP山羊抗鼠IgG抗体(使用1％BSA按1:5000稀释)，37℃孵育1h，再洗涤6次。最后加入100μL TMB显色，测定450nm处的OD值。
不同短肽的序列及OD450数值的测定结果如表3所示。
表3不同短肽的序列及OD450数值的测定结果
短肽序列 OD450数值
RIPAKTPPAP(SEQ ID No.14) 0.029
PAKTPPAPKT(SEQ ID No.15) 0.106
KTPPAPKTPP(SEQ ID No.16) 0.127
PPAPKTPPSS(SEQ ID No.17) 3.628
APKTPPSSGE(SEQ ID No.18) 0.114
KTPPSSGEPP(SEQ ID No.19) 0.062
由表3可以看出，本申请中的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体与SEQ IDNo.17所示的短肽具有良好的结合能力，因此，PPAPKTPPSS(SEQ ID No.17)为上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体最可能结合的抗原决定簇的氨基酸序列。
实施例7
本实施例检测了本申请提供的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体是否发生了糖基化修饰、磷酸化修饰以及乙酰化修饰进行检测。
具体的，所用的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体为实施例4纯化后获得的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
具体如下：
糖基化修饰检测
使用100mmol/L、pH 5.5的柠檬酸钠缓冲液制备浓度为1mg/mL的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体样品。
使用10mU/mL的内切糖苷酶H(Endo H，NEB，P0702S)在37℃消化单克隆抗体样品过夜。
将酶切后的单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳，同时使用未酶切的单克隆抗体作为对照进行SDS-PAGE电泳。
电泳结果显示，Endo H酶切后的单克隆抗体的条带大小相比于未酶切的单克隆抗体的条带大小无明显的变化，表明本申请提供的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体未发生明显的糖基化修饰。
磷酸化修饰检测
对识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳，将重链和轻链的条带分别切下，使用0.5％的胰酶消化，再通过LC-MS分析蛋白序列以及磷酸化修饰情况。
结果显示，本申请制备的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体未发生磷酸化修饰。
乙酰化修饰检测
通过Western Blot检测上述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的乙酰化情况。
对识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳，转NC膜后，使用10％脱脂奶粉在室温下封闭1h，使用TBST清洗3次后，使用泛-乙酰化赖氨酸抗体(Immunechem，ICP0380)作为一抗，在4℃下孵育过夜，TBST清洗3次后，使用山羊抗兔IgG(HRP)(Abcom，ab205718)作为二抗，室温孵育1h后，TBST清洗3次。
使用化学发光底物试剂盒(Thermo fisher，A38554)参照说明书上的指示进行显色操作，使用成像系统曝光，并对结果进行观察。
结果显示，NC膜上无条带，表明本申请制备的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体未发生乙酰化修饰。
实施例8
本实施例提供一种Tau蛋白pT181磷酸化的ELISA检测试剂盒，上述Tau蛋白pT181磷酸化的ELISA检测试剂盒包括实施例4中的纯化后的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体、HRP山羊抗鼠IgG抗体、TMB以及清洗试剂。
实施例9
本实施例使用实施例8中的Tau蛋白pT181磷酸化的ELISA检测试剂盒对20例已知第181位苏氨酸是否发生了磷酸化的临床样本进行检测，同时使用商品化抗体作为对照。
对样本进行裂解，取样本裂解液对ELISA检测板进行包被，再分别使用实施例8中的Tau蛋白pT181磷酸化的ELISA检测试剂盒和商品化抗体(Phospho-Tau(Thr181)Monoclonal Antibody(AT270)，品牌：Thermo fisher，货号MN1050)进行ELISA检测，检测的具体操作参照实施例5，结果如表4所示。
表4临床样本的Tau蛋白pT181磷酸化的检测结果
Figure BDA0003857559120000131
Figure BDA0003857559120000141
由表4可以看出，针对上述20例临床样本，使用实施例8中的Tau蛋白pT181磷酸化的ELISA检测试剂盒与商品化抗体的检测结果完全一致，并且与样本的符合率为100％，表明其具有良好的准确性与特异性，可应用于实际的临床检测中。
综上，本申请构建的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体仅识别并结合发生了pT181磷酸化的Tau蛋白，具有与市售抗体相近的特异性与准确性，但对抗原的结合能力更强，检出限低至50pg/mL，并且无明显的翻译后修饰，对实际样本的检测结果十分准确，可用于相关的理论研究及实际的临床检测中。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，其特征在于，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID No.1所示的CDR1、SEQ ID No.2所示的CDR2和SEQ IDNo.3所示的CDR3；
所述轻链可变区包括SEQ ID No.4所示的CDR1、SEQ ID No.5所示的CDR2和SEQ IDNo.6所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区包括SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；
优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，其特征在于，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；
优选地，所述轻链恒定区包括SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1~3任一项所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体，其特征在于，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的重链包括SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；
优选地，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的轻链包括SEQ ID No.12所示的氨基酸序列。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1~4任一项所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体表达权利要求1~4任一项所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体；
优选地，所述重组载体中含有至少一个拷贝的权利要求5所述的核酸分子。
7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1~4任一项所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体；
优选地，所述重组细胞中含有至少一个拷贝的权利要求6所述的重组载体。
8.一种权利要求1-4任一项所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体的制备方法包括：
构建重组载体，将所述重组载体导入细胞中，蛋白表达后进行纯化，得到所述识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
9.权利要求1-4任一项所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体和/或权利要求7所述的重组细胞在制备Tau蛋白pT181磷酸化检测产品中的应用。
10.一种Tau蛋白pT181磷酸化检测试剂盒，其特征在于，所述Tau蛋白pT181磷酸化检测试剂盒包括权利要求1~4任一项所述的识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体。
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