KR100616372B1 - 식물병들과 옥수수 근벌레를 억제하기 위한 신규한Ｂａｃｉｌｌｕｓ 균주 - Google Patents
식물병들과 옥수수 근벌레를 억제하기 위한 신규한Ｂａｃｉｌｌｕｓ 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 살충, 항진균 그리고 항세균 활성을 나타내며 항생물질과 대사물질을 생산하는, 신규한 Bacillus Subtilis 균주에 관한 것이다. 이 신규한 균주의 상징액은 유효한 살충, 항진균 및고 항세균 작용제를 포함한다. 또한 본 발명은 상징액에서 생산한 추출성 용매이며, 저분자량(〈10,000달톤)이고 옥수수 근벌레에 활성인 대사물질을 포함한다. 또한 본 발명은 식물에 항생물질/대사물질을 생산하는 신규한 Bacillus Subtilis 균주, 신규한 Bacillus Subtilis에 의해 생산된 항생물질/대사물질, 또는 선택적으로 다른 항생물질 생산 균주 및/또는 화학적 살충제를 더 포함하는 그것의 조합물을 적용시키는 단계로 이루어지는 진균류 및 세균 감염 그리고 옥수수 근벌레 만연으로부터 식물을 보호하거나 처리하는 방법들을 포함한다. 본 발명은 신규한 Bacillus Subtilis 균주의 배양물로부터 얻은 전체육즙배양물 또는 상징액을, 단독 또는 화학적 살충제 및/또는 다른 생물학적 작용제로 조합해서 사용하여 진균류 및 세균의 감염을 보호하거나 처리하는 방법들을 또한 포함한다. 본 발명은 아그라스타틴으로 지칭된 신규한 항진균이고 항세균적인 화합물들과 A-형 이튜린, 플리파스타틴, 설펙틴 그리고 아그라스타틴으로 이루어지는 신규한 조합물을 또한 포함한다. 신규한 아그라스타틴과 A-형 이튜린, 플리파스타틴, 설펙틴 그리고 아그라스타틴으로 이루어진 신규한 조합물을 투여하는 것으로 이루어진, 진균류 및 세균 감연 그리고 옥수수 근벌레 만연으로부터 식물을 처리하거나 보호하는 방법들을 제공한다.
식물병, 옥수수 근벌레, 바이오농약, 살충제, 살선충제, 살균제
Description
본 발명은 바이오농약 분야이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 신규한 Bacillus Subtilis 균주, AQ713가 넓은 범위의 진균류와 세균의 식물병들을 저해할 수 있고, 또한 옥수수 근벌레에 대하여 활성을 갖는다는 발견에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 신규한 Bacillus 균주로 이루어지는 살진균제, 살세균제, 살충제 조성물과 항생물질과, 이 균주 단독이거나 다른 화학적 및 생물학적인 살충제들과 조합하여 제조된 항생제 및 대사물질에 관한 것이다.
관련출원의 참조
본 출원은 1997. 5. 9에 출원된 일련번호 No. 08/853,753의 일부계속출원이다.
다년간, 여러가지 미생물들이 식물병들을 억제하는데 유용하도록 하는 생물학적 활성을 나타낸다는 것이 알려져 왔다. 비록 농경적 및 원예적으로 중요한 여러가지 식물병들을 억제하기 위하여, 생물학적 살충제의 확인과 개발분야에서 진보가 있었으나, 사용중인 대부분의 살충제들은 여전히 합성화합물이다. 이들 화학적 살진균제들 대다수가 EPA로부터 발암제로 분류되며, 야생생물 그리고 다른 불특정 종들에게 독성이다. 게다가, 병원균은 화학적 살충제에 대해 내성이 발달할 수 있다(예를 들면, Schwinn et al., p. 244, ADVANCES IN PLANT PATHOLOGY: PHYTOPHTHORA INFESTANTS, THE CAUSE OF LATE BRIGHT OF POTATO (Academic Press, San Diego 1991) 참조).
매년 2억 5천-3억 달러의 화학적 살충제가 옥수수 근벌레 만연을 억제하기 위하여 사용된다. 이들 화학적 살충제들 다수가 인간과 야생생물 그리고 다른 불특정 종들에게 독성이다. 또한 어떤 것은 지하수에서 발견되고 있다. 새로운 화학적 살충제를 개발하는데 1억 달러가 든다.
생물학적 방제는 합성화학적 살진균제에 대해 매력적인 대안으로 제공된다. 바이오농약(살아있는 유기체와 이들 유기체에 의해 자연적으로 생산된 화합물)은 보다 안전할 수 있고, 더 생분해성이고 개발하는데도 적은 비용이 든다.
스크리닝 프로그램은 항진균활성을 나타내는 어떤 Bacillus spp.(Bacillus spp.는 B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis를 포함한다)균주를 동정하였다(예를 들면, Stabb et al.(1990) Applied Environ. Microbiol.
60: 4404-4412 참조). 이들 균주들은 Phytophthora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum 또는 Sclerotinia minor(Stabb et al., 상기 참조)에서 기인하는 토양매개 입고병에 대하여, 효과가 있는 두가지 항생제들인 즈비터마이신-A 및/또는 카노사민(Milner et al.(1996)Appl. Environ. Microb.
62: 3061-3066)을 생산하는 것으로 나타났다. 즈비터마이신-A는 수용성이며, 산안정성인 선형 아미노폴리올 분자이다(He et al, (1994) Tetra. Lett.
35(16) 2499-2502 참조).
Handelsman et al.의 미국 특허 No. 5,049,379는 어떻게 즈비터마이신-A가 자주개자리와 콩에서 입고병을 일으키는지를 설명한다. 종자를 B. cereus ATCC53522로 코팅했을 때 뿌리썩음병 진균의 병원균 활성이 저해되었다. 유사하게 어떤 B. cereus 균주의 포자-기재의 조제물을 콩종자 또는 종자를 둘러싼 토양에 적용은 들판 현장에서 콩 수확량을 향상시키는 것으로 나타났다(Osburne et al. (1995) Am. Phytopathol. Soc. 79 (6): 551-556 참조). 바이오농약의 적용방법들은 당분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, 적당한 배양물로부터 항생물질의 분획의 수화성분말, 건조유동물, 유효한 작용제의 미세캡슐화, 액체 또는 고체 조제물을 포함한다(예를 들면, Rossall의 미국 특허 No. 5,061,495 또는 Handelsman의 미국 특허 No. 5,049,379 참조).
삭제
Smith et al.(1993) Plant Disease 77(2)139-142는 솜같은 오이 누출물을 일으키는 원인인, 토양 매개 진균인, Pythium aphanidermatum의 활성을 즈비터마이신 생산 B.cereus 균주 UW85를 사용하여 억제할 수 있다고 보고했다. Leifert et al. (1995) J.Appl. Bacteriol. 78:97-108에서 두가지 Bacillus 균주, B. subtilis CL27과 B. pumilis CL45에 의한 항Botrytis와 항Alternaria 항생물질의 생산을 보고했다. 전체육즙과 무세포 여과액은 시험관 내 시험에서는 Botrytis와 Alternaria에 대하여 활성이었고, Astilbe에 대한 작은 식물의 생체내 시험에서는 Botrytis에 대하여 활성이었다. Leifert et al.(1997) 미국 특허 No. 5,597,565에서 수확후 병 유발 진균을 저해하는데 특히 효과적인 B. subtilis, B. pumilis, 그리고 B. Polymyxa를 개시한다. 그것들은 무세포 배양물 여과액에서 생산한 항생물질의 존재와 다른 pH값들에서의 그것들의 활성을 또한 개시하나, 그것들은 이들 화합물들을 확인하지 않는다.
Rossall (1994) 미국 특허 No. 5,344,647는 폭넓은 항진균활성을 가진 Bacillus subtilis 균주를 개시한다. Sholberg et al.(1995) Can. J. Microbiol.
41: 247-252, Swinburne et al.(1975)Trans. Brit. Mycol. Soc.
65: 211-217, Singh와 Deverall (1984)Trans. Br. Mycol. Soc.
83: 487-490과 Ferreira, et al.(1991) Phytopathology
81: 283-287, Baker et al. (1983) Phytopathology
73: 1148-1152는 진균류 식물병원균의 생물학적 방제제로서 Bacillus spp. 및 Bacillus subtilis의 사용을 개시한다. Baker et al. (1983) Phytopathology
73: 1148-1152는 식물병원균에 사용하기 위하여 항진균인 Bacillus Subtilis를 또한 보고하였다. Pusey et al. (1988) Plant Dis.
72: 622-626, Pusey와 Robins(미국 특허 No.5,047,239)와 McKeen et al. (1986) Phytopathology
76: 136-139는 B. subtilis를 사용하여 수확후 과일부패병의 억제를 개시한다. McKeen et al. (상기 참조)는 저분자량 이튜린 사이클릭 폴리펩티드와 유사한 항생물질이 B. subtilis의 이 살진균활성에 기여함을 보여주었다.
Liu et al.(1995) 미국 특허 No.5,403,583은 Bacillus megaterium, ATCC 55000과 진균류 식물병원체, Rhizoctonia solani의 억제방법을 개시한다. Islam과 Nandi(1985) Journal of Plant Diseases and Protection,
92(3): 241-246은 벼 갈색반점의 원인물질인, Drechslera oryzae에 대한 길항작용을 갖는 Bacillus megaterium을 개시한다. 같은 저자들인, Islam과 Nandi(1985)의 Journal of Plant Diseases and Protection
92(3) 233-240은 Drechslera oryzae, Alternaria alternata와 Fusarium roseum에 대하여 B.megaterium의 시험관내 길항작용을 또한 개시한다. 그들은 배양물 여과액안의 세가지 성분들을 논의한다. 가장 활성인 항생물질은 255㎚에서 UV 피크와 260㎚에서 숄더를 가지며 물과 메탄올에서 크게 용해성이었으며, 그것은 폴리옥신-유사 리포펩티드로 판명되었다. Cook((1987) Proceedings Beltwide Cotton Production-Mechanization Research Conference, Cotton Council, Memphis, p.43-45)는 목화 뿌리썩음병의 원인인, Phymatotrichum omnivorum에 의해 죽는 목화나무의 수를 줄이기 위하여, Bacillus megaterium의 현탁액의 사용을 개시한다.
B. megaterium 항생물질생산은, 안사미토신-PDM-O, 바시메트린, 메가신, 펜타펩티드, 호모펩티드와 같은 하등 포유류에게 독성인 펩티드 항생물질의 생산을 보고한 Berdy(CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vols.Ⅰ-ⅩⅣ, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL 1980-87)에 의해 기록되어 있다.
Bacilli는 항진균성이고 항세균성인 이차대사물질을 생산하는 것으로 알려져 있다(Korzybski et al.(1978)). 위스콘신과 코넬대학의 연구원들은 Bacillus sp.에 의해 생산된, 신규의 살진균 화합물, 즈비터마이신 A를 확인하였다(He et al. (1994) Tetra. Lett.
35 (16): 2499-2502). 같은 균주에 의해 생산된 이차 살진균 대사물질은 공지의 아미노당인 카노사민으로서 최근에 확인되었다(Milner et al. (1996) Appl. Environ. Microb.
62: 3061-3065).
상기한 Bacillus 대사물질의 다른 군은 이튜린 부류의 사이클릭 리포펩티드들이고 그것들의 일부는 효능있는 살진균제이다. 이들 살진균제들은 7개의 α-아미노산과 지방족 곁사슬을 갖는 한개의 β-아미노산을 가진 사이클릭 옥타펩티드로 구성된다. 아미노산배열의 순서와 내용이 다른 이튜린의 몇개의 군들이 있다. 이것들은 아래의 표 1에 나타내었다. 일반적으로, 한 세트의 관련된 분자들이 지방족 아미노산 잔기의 길이와 분지형성의 차이를 가지고 생산된다. Saccharomyces cereversiae에 대하여 시험했을 때, 미코서브틸린이 가장 활성인 작용제(LC50=10㎍/㎖)로 발견되었고, 다음으로 이튜린-A와 bacillomycin L(양자 모두 LC50=30㎍/㎖)이었다(Beeson et al.(1979) J. Antibiotics
32 (8): 828-833). 이들 사이클릭 리포펩티드의 작용방식은 생명 유지에 필요한(vital) 이온의 방출을 허용하는 트랜스멤브레인 통로들을 만드는 진균막들과의 상호작용 때문인 것으로 보고되었다(Latoud et al.(1986) Biochem. Biophys.
Acta
856:526-635). 이튜린-C는 Penicillium Chrysogenum을 포함한 진균류에 대해 비활성이다(Peypoux et al.(1978) Tetrahedron 34:1147-1152).
USDA에 있는 한 연구진에서는 아미노산 사슬길이가 다른, 다수의 유사체 합성에 의한 이튜린들의 구조/활성 관계를 연구하였다. 연구자들은 이소〉노르말〉앤티이소의 순서로 지방산 곁사슬의 길이와 말단 분지형성에 따라 이튜린의 활성이 증가한 것으로 보고했다(Bland et al. (1995) Proc. Plant Growth Regulation Soc. Am.
22nd:105-107). 그들은 Bacilius 균주를 생산하는 다수의 이튜린을 가지고 한 그들의 연구에 근거하여 "자연적인 생산으로부터 얻은 이튜린의 양은 상업적으로 이용하는데 부적절하다" 고 또한 진술하였다.
B. cereus로부터 분리된 사이클릭 리포펩티드의 다른 군들은 플리파스타틴이다. 이들 화합물들은 아실화된 데카펩티드의 부류인데, 그 구조를 도 1(Nishikiori et al. (1986) J.Antibiotics 39(6):755-761)에 나타내었다. 이들 화합물들은 원래 돼지 췌장 포스포리파제 A2의 저해제로서 분리되었으나(Umezawa et al. (1986) J.Antibiotics 39(6):737-744), Botrytis, Pyricularia 및 Alternaria (Yamada et al.(1990) Nippon Noyaku Gakkaishi 15(1):95-96)를 포함하는 일부 식물병원균인 진균류를 저해한다는 것은 후에 발견되었다. Yamada는 같은 B. subtilis 균주에 의해 둘다 생산된, 이튜린과 플리파스타틴 사이에서 관찰된 상승효과를 또한 보고하였다.
B. cereus로부터 분리된 사이클릭 리포펩티드의 다른 군들은 플리파스타틴이다. 이들 화합물들은 아실화된 데카펩티드의 부류인데, 그 구조를 도 1(Nishikiori et al. (1986) J.Antibiotics 39(6):755-761)에 나타내었다. 이들 화합물들은 원래 돼지 췌장 포스포리파제 A2의 저해제로서 분리되었으나(Umezawa et al. (1986) J.Antibiotics 39(6):737-744), Botrytis, Pyricularia 및 Alternaria (Yamada et al.(1990) Nippon Noyaku Gakkaishi 15(1):95-96)를 포함하는 일부 식물병원균인 진균류를 저해한다는 것은 후에 발견되었다. Yamada는 같은 B. subtilis 균주에 의해 둘다 생산된, 이튜린과 플리파스타틴 사이에서 관찰된 상승효과를 또한 보고하였다.
발효개선에 대한 연구가 액체(Phae and Shoda (1991) J. Ferment.
Bioeng.
71:118-121);Ohno et al. (1993) J.Ferment. Bioeng.
75:463-465)와 고체상의 발효(Ohno et al.(1992) Biotech.Lett.
14(9):817-822;Ohno et al. (1995) J. Ferment.
Bioeng.
5:517-519) 둘다에서 이튜린의 생산을 증가시키기 위해 행해졌다. 자체는 비활성인, 밀접하게 관련된 설펙틴과 같은 B. subtilis 균주에 의해 생산된 이튜린간의 상승작용의 보고가 있다(Hiraoka et al. (1992) J. Gen. Appl. Microbiol.
38:635-640). 이튜린 A와 설펙틴의 생합성을 상호조절하는 유전자의 뉴클레오티드 배열이 발표되었다(Huang et al.(1993) J. Ferment. Bioeng. 76(6): 445-450). 이튜린 생산 균주들에 관한 현장연구는 Rhizoctonia의 억제를 위한 토양처리에 집중되었고(Asaka and Shoda (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:4081-4085), 이튜린의 잎의 현장 적용은 보고되지 않았다.
B. Subtilis에 의해 생산된 다른 사이클릭 리포펩티드 화합물은 예외적으로 계면활성제 활성을 가지는 설펙틴이다(Kaninuma et al. (1969) Agric. Biol. Chem. 33:973-976). 설팩틴은 LLDLLDL 배열을 가진 헵타펩티드 부분에 락톤고리에 의해 연결된 C14 또는 C15 β-히드록시 지방산을 함유한다(Arima et al. (1968) Biochem. Biophys. Res. Commun. 31:488-494). Sandrin et al. ((1990) Biotechnol. Appl. Biochem. 12:370-375)은 설펙틴과 이튜린 A 둘다를 생산한 B. subtilis 균주인 바실로마이신 F와 L 그리고 미코서브틸린을 발견하였다.
본 발명자들에 의해 발견된 신규한 미생물 AQ713은, 이전에는 Bacillus megaterium의 한 균주로 생각되었고, 현재는 Bacillus subtilis의 균주로 확인된 것인데, 이튜린 A, 플리파스타틴 및 설펙틴을 생산한다. 미생물에 의한 이 리포펩티드 조합의 생산은 이전에 보고되지 않았다. 게다가, 본 발명자들은 AQ713이 또한 "아그라스타틴"으로 지칭된, 새로이 기술된 화합물 군을 또한 생산한다는 것을 발견하였다. 신규한 아그라스타틴과 함께 상기 공지의 세가지 화합물들 모두의 조합은 또한 신규하다.
한가지 통상 사용되는 바이오농약은 그람양성세균인 Bacillus thuringiensis이다. 살충제인 B. thuringiensis 균주들은 포자형성 동안에, 어떤 목과 종의 곤충들과 선충류들에게 특정적으로 독성인 결정단백질을 생산하는 것으로 알려져 있다(예를 들면, 미국 특허 No. 4,992,192 및 5,208,017 참조). B. thuringiensis에 의해 생산된 단백질성 내독소는 또한 옥수수 근벌레와 다른 딱정벌레에 대하여 살충제로서 역활을 한다(예들 들면, 미국 특허 No. 5,187,091;Johnson,T.J. et al.(1993), J. Economic Entomology
86:330-333). B. thuringiensis 내독소는 정제된 결정들로서, 세척된 세포펠렛으로서 그리고 발현된 단백질로서 효과적인 것으로 나타났다. Warren et al.(WO 96/10083)은 Bacillus cereus와 B. thuringiensis의 성장단계동안에 생산된 비내독소 단백질을 개시한다. Vip1 및 Vip2로 불리는 이들 성장단백질들은 옥수수 근벌레(북부와 서부)에 대하여 효능있는 활성을 갖는다(Estruch et al. (1997), Nature Biotechnology
15:137-141과 Mullins et al. (1997), Appl Environ. Microbiol.
63,(출판중)).
베타-외독소로 불리는 한가지 B. thuringiensis 열안정성 대사물질은 살충제 성질을 가지는 것으로 또한 나타났다. Burgjeron과 Biache(1979), Entomophaga
11: 279-284는 콜로라도 감자 벌레(Leptinotarsa decemlineata)에 대하여 활성인 베타 내독소를 보고한다. 게다가, 공지의 B. thuringiensis 베타 외독소는 선충류뿐만 아니라, 파리, 행렬구더기, 진드기, 그리고 옥수수 근벌레도 죽이는 비특이적 살충제 활성을 나타낸다. 시그마 외독소는 베타 외독소와 비슷한 구조를 가지고, 콜로라도 감자 벌레(Argauer et al. (1991). J. Entomol. Sci.
26:206-213)에 대하여 활성이다. 알파 외독소는 Musca domestica의 애벌레에 대하여 독성이다(Cluthy (1980) FEMS Microbiol. Lett.
8:1-7). 감마 외독소들은 여러가지의 단백질 가수분해 효소, 키틴아제 그리고 프로테아제들이다. 감마 외독소의 독성 효과는 베타-외독소 또는 델타-외독소와의 조합하여야만 발현된다. Forsberg et al.(1976) "Bacillus thuringiensis:Its effects in Environmental Quality," National Research Council of Canada. Stonard et al.(1994) ACS Symposium Series
551:25는 Bacillus cereus 균주의 상징액에서 옥수수 근벌레에 대하여 활성인 수용성의 이차 대사물질 활성을 보고했다.
살진균제이고 옥수수 근벌레 활성을 모두 갖는 Bacillus 균주들은 기록되어 있지 않다. 10,000이하의 분자량이고 비극성용매에서 추출한 Bacillus subtilis에 의해 생산된 대사물질은 알려진 것이 없다.
폭넓은 살진균력 및 살균활성 그리고 또한 옥수수 근벌레 활성을 나타내는 Bacillus megaterium으로 이미 동정되어있는 Bacillus subtilis의 신규한 항생물질과 대사물질 생산 균주를 제공한다. 옥수수 근벌레에 대한 활성을 갖는 신규한 B. subtilis로부터의 신규한 대사물질을 또한 제공한다. 유효량의 항생물질생산 Bacillus subtilis 를 적용시키는 단계로 이루어지는 진균류 및 세균 감염으로부터 식물을 처리하거나 보호하는 방법을 또한 제공한다. 항생물질 생산 Bacillus subtilis는 전체육즙배양물내의 현탁액으로 또는 항생물질 생산 Bacillus 균주의 전체육즙배양물로부터 얻은 항생물질 함유 상징액으로 제공될 수 있다. 신규한 대사물질 생산 Bacillus subtilis의 유효량을 적용하는 단계로 이루어지는 옥수수 근벌레 감염으로부터 식물뿌리를 처리하거나 보호하는 방법도 또한 제공한다. 신규한 대사물질 생산 Bacillus subtilis는 전체육즙배양물내의 현탁액으로 또는 미생물의 전체육즙배양물로부터 얻은 대사 산물 함유 상징액 또는 정제된 대사물질로서 제공될 수 있다. 또한 신규한 균주 AQ713에 의해 생산된 신규한 화합물인 아그라스타틴 그리고 이튜린 A, 플리파스타틴, 설펙틴 및 아그라스타틴으로 이루어진 화합물의 신규한 조합물도 또한 제공한다.
삭제
도 1는 플리파스타틴 항생물질의 구조를 나타낸다.
도 2는 AQ713 대사물질의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
본 발명의 수행 방법
본 발명의 수행 방법
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본 발명은 폭넓은 항진균 및 항세균 활성과 항진균 및 항옥수수 근벌레 활성의 신규한 조합을 갖는 Bacillus megaterium으로서 이미 동정되어 있는 Bacillus subtilis의 신규한 균주, AQ713 또는 그것의 변종을 제공하는 것이다. 이 신규한 균주는 AQ713으로 지칭되고, 특허절차상의 미생물의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약의 규정하에 기탁번호 B21661로 1997년 3월 7일에 NRRL에 기탁되었다. 본 발명은 그러한 세균 균주들 또는 항생물질 함유 상징액들 또는 그러한 세균 균주로부터 얻은 순수항생물질을 사용하여, 식물에서 진균 및 세균병들의 보호과 처리의 방법도 또한 포함한다. 본 발명은 AQ713의 세균현탁액 또는 AQ713 배양액의 대사물질 함유 상징액 또는 AQ713 균주로부터 정제된 대사물질을 가지고 옥수수 근벌레의 애벌레를 억제하기 위하여, 식물 뿌리 또는 토양을 처리하는 방법도 또한 포함한다. 본 발명은 10,000 달톤 미만의 분자량을 가지고 옥수수 근벌레에 대한 활성을 갖는 용매 추출성 대사물질을 또한 포함한다. 본 발명은 신규한 미생물에 의해 생산된, 신규한 화합물인 아그라스타틴을 더 포함한다. A 형 이튜린, 플리파스타틴, 설펙틴 그리고 아그라스타틴으로 이루어진 신규한 조합물을 또한 포함한다.
정의
여기에 사용된 "생물학적 억제(biological control)"는 이차 유기체의 사용에 의한 병원균 또는 곤충의 억제로 정의된다. 알려진 생물학적 억제의 메커니즘들은 뿌리 표면 상의 공간에서 진균류를 탈-경쟁시킴으로써 뿌리썩음병을 억제하는 장세균을 포함한다. 항생물질들과 같은 세균독소들은 병원균들의 억제를 위해 사용되어 왔다. 독소는 분리시켜 식물에 직접 적용할 수도 있고 또는 세균종들을 원위치에서 독소를 생산하도록 접종할 수도 있다.
용어 "진균" 또는 "진균류"는 엽록소가 결여된 핵이 있는 포자를 지니는 크게 다양한 유기체를 포함한다. 진균류의 예들로 효모, 사상균, 곰팡이, 녹병균 그리고 버섯들을 포함한다.
용어 "진균" 또는 "진균류"는 엽록소가 결여된 핵이 있는 포자를 지니는 크게 다양한 유기체를 포함한다. 진균류의 예들로 효모, 사상균, 곰팡이, 녹병균 그리고 버섯들을 포함한다.
용어 "세균"은 뚜렷한 세포핵을 가지지 않는 여느 원핵생물을 포함한다.
"살진균"은 진균류의 사멸율을 증가시키거나 생장율을 저해시키는 물질의 능력을 의미한다.
"항생물질"은 미생물을 죽이거나 저해할 수 있는 여느 물질을 포함한다. 항생물질은 미생물에 의해 또는 합성의 방법 또는 반합성의 방법에 의해 생산될 수 있다. 그러므로, 용어는 예를 들면, 즈비터마이신 A 또는 카노사민 같은 진균류를 저해하거나 죽이는 물질을 포함한다.
"항진균"은 진균류를 죽이거나 생장을 저해할 수 있는 여느 물질을 포함한다.
용어 "배양"은 여러가지 종류의 배지 위 또는 안에서의 유기체들의 증식을 가리킨다. "전체육즙배양물"은 세포와 배지 모두를 함유한 액체배양물을 가리킨다. "상징액"은 육즙내에서 성장한 세포를 원심분리, 여과, 침전, 또는 당업자가 잘 알고 있는 다른 수단에 의해 제거될때 남은 액체 육즙을 가리킨다.
"유효량"은 유익하거나 바라는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 치료와 보호의 관점에서, "유효량"은 진균류 또는 세균으로 인한 병상태의 진행을 호전시키거나, 안정시키거나, 역전시키거나, 늦추거나 또는 지연시키는데 충분한 양이다.
여기서 사용된, 용어 "곤충"은 곤충류(Insecta)"의 강(class)내의 모든 유기체들을 포함한다. "미성숙" 곤충은 예를 들면, 알, 애벌레 그리고 어린벌레를 포함하는 성충단계전의 유기체의 여느 형태를 가리킨다. "살충(insecticidal)"은 곤충의 사멸율을 증가시키거나 또는 생장을 저해하는 물질의 능력을 가리킨다. "살선충"은 선충류의 사멸율을 증가시키거나 또는 생장율을 저해하는 물질의 능력을 가리킨다. "살충(pesticidal)"는 곤충류, 선충류 그리고 진드기의 사멸율을 높이거나 또는 생장율을 저해시키는 물질의 능력을 가리킨다.
"양성 대조구"는 살충력을 가진 것으로 알려진 화합물을 의미한다. "양성 대조구"는 상업적으로 이용할 수 있는 화학적인 살충제를 포함하나 이것들에 제한되지 않는다. 용어 "음성 대조구"는 살충력을 갖지 않는 것으로 알려진 화합물을 의미한다. 음성 대조구의 예들로는 물 또는 에틸아세테이트이다.
용어 "용매"는 용액안에 다른 물질을 함유하는 여느 액체를 포함한다. "용매추출성"은 용매에 녹고, 그 뒤 그 용매로부터 분리시킬 수 있는 여느 화합물을 가리킨다. 용매의 예들로는 에틸아세테이트와 같은 유기용매들을 포함하나 이것들에 제한되지 않는다.
용어 "대사물질"은 살충활성을 갖는 미생물의 발효에 의한 어떤 화합물, 물 질 또는 부산물을 일컫는다. 상기에서 정의된 항생물질은 미생물에 대하여 특이적으로 활성인 대사물질이다.
용어 "아그라스타틴"은 다음 구조를 갖는 신규한 화합물의 군이다.
상기식에서,
R1는 C8-C20의 분지 또는 직쇄 지방족 곁사슬이고;
X는 Ala이거나 Val이며;
R2는 아세테이트 또는 에스테르 유도체이고;
Glx는 Gln 또는 Glu이다.
이들 화합물들은 항옥수수 근벌레 활성뿐만 아니라 항세균 및 항진균 활성을 가진다.
본 발명자들은 폭넓은 항진균 및 항세균 활성을 갖고 또한 옥수수 근벌레의 애벌레를 죽이거나 발육을 저지하는, 이미 Bacillus megaterium으로서 동정된 Bacillus subtilis의 신규한 대사물질과 항생물질 생산 균주를 기술한다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명내에서 Bacillus subtilis의 전체육즙배양물로부터 얻은 유효량의 상징액을 적용하는 것으로 이루어지는 진균류 및 세균 감염으로부터 식물을 치료하거나 보호하는 방법을 제공한다. 상징액은 원심분리, 여과, 침전 등을 포함한 당 업계에 잘 알려진 방법에 의해 얻을 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 신규한 Bacillus subtilis 균주의 유효량의 전체육즙을 적용하는 것으로 이루어지는 균진류 및 세균 감염으로부터 식물을 치료하거나 보호하는 방법을 포함한다.
더 나아간 양태에서, 본 발명은 신규한 Bacillus subtilis 균주에 의해 생산된 항생물질 유효량을 적용하는 것으로 이루어지는 진균류 및 세균 병으로부터 식물을 치료하거나 보호하는 방법을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명내에서 Bacillus subtilis AQ713의 전체육즙배양물로부터 얻은 상징액의 유효량을 적용하는 것으로 이루어지는 옥수수 근벌레의 만연으로부터 식물뿌리를 치료하거나 보호하는 방법을 제공한다. 상징액은 원심분리, 여과, 침전 등을 포함한 당업계에서 잘 알려진 방법에 의해 얻을 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 신규한 Bacillus subtilis 균주의 전체육즙의 유효량을 적용하는 것으로 이루어지는 옥수수 근벌레의 만연으로부터 식물을 치료하거나 보호하는 방법을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 신규한 Bacillus subtilis 균주에 의해 생산된 대사물질의 유효량을 적용하는 것으로 이루어지는 옥수수 근벌레의 만연으로부터 식물뿌리를 치료하거나 보호하는 방법을 포함한다.
본 발명내의 조성물의 양호한 분산 및 부착을 달성하기 위하여, 분산과 부착을 촉진하는 성분들과 함께 전체육즙배양물, 상징액 및/또는 대사산물/항생물질을 조제하는 것이 유리할 수 있다. 적당한 제형들은 당업자들에게 잘 알려져 있다.
본 발명내에서 조성물들은 수화성 분말, 과립등으로 제형될 수 있고, 또는 적당한 배지등에서 미세캡슐에 넣을 수 있다. 다른 제형의 예들로는, 가용성 분말, 수화성 과립, 건조 유동물, 수성 유동물, 수화성 분산성 과립, 유화 농축액 그리고 수성 현탁액을 포함하나 이것들에 제한되지는 않는다. 다른 적당한 제형들은 당업자들에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 나아간 양태에서, "아그라스타틴"으로 지정된 신규한 화합물군을 제공한다. 이들 화합물들은 항옥수수 근벌레 활성에 더하여 항세균 및 항진균 활성을 나타낸다.
더 나아간 본 발명의 양태에서, A-형 이튜린, 플리파스타틴, 설펙틴 그리고 아그라스타틴으로 이루어진 신규한 조합물이 제공된다.
본 발명의 또다른 양태에서, A-형 이튜린, 플리파스타틴, 설펙틴 그리고 아그라스타틴으로 이루어진 화합물의 신규한 조합물 유효량을 적용시키는 것으로 이루어지는 진균 및 세균병으로부터 식물을 치료 또는 보호하는 방법이 제공된다.
여기서 인용된 모든 특허들과 출판물들은 그들 전체가 참고로 여기에 포함된다.
다음의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위하여 제공되었다. 이들 실시예들은 여기에 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1
AQ713 균주의 특성화
분리물은 Bochner(1989) Nature
339:157-158에 기술된 대로 바이오로그 마이크로플레이트 패널(Biolog, Inc., Hayward, CA)을 이용하여 확인하였다. 바이오로그 마이크로플레이트는 그람 양성세균과 그람 음성세균에 이용할 수 있는, 95개의 다른 탄소 기질들을 가진 사전충전 및 건조된 패널 웰들로 구성된다. 분리물은 28℃의 액체배지에서 성장되었고, 24시간 후에 세척된 세포 현탁액(0.85% 살린)을 GP 마이크로플레이트(Biolog,Inc.)의 각 패널 웰에 접종시켰다. 28℃에서 24시간후에, 탄소이용 반응을 평가하였다. 다음에 기질이용프로필들을 바이오로그 그람 양성데이타 베이스(릴리스 3.50)와 비교하였고 가장 가깝게 유사한 종들에서 분리하였다. 바이오로그 결과들은 Bacillus megaterium에 대해 0.883의 유사성 지수를 주었다.
AQ713의 더 광범위한 특성화는 American Type Culture Collection, Rockville, Md.에 의해 행해졌다.
제공된 분리물: 미지; AQ713 균주
동정된 분리물: 이용할 수 있는 생리학 및 생화학적 데이타를 사용하여, 이 균주는 Bacillus subtilis을 가장 밀접하게 닮았다.
세포의 형태 : 운동성 세포들은 중앙 또는 끝 가까운 부위에서 형성된 하나의 내성포자를 가지며, 각기 발견되었다. 세포들은 균일하게 그람 양성으로 염색 되었다.
콜로니의 형태 : 콜로니들은 불록한 융기부, 거칠고, 무딘 표면과 고르지 않은 가장자리를 가지며, 불투명하고 불규칙하다.
코멘트 : 이용할 수 있는 생리학 및 생화학적 데이타를 사용하여, 이 균주는 Bacillus subtilis를 가장 밀접하게 닮았다.
실시예 2
옥수수 근벌레에 대한 AQ713의 활성
Bacillus의 샘플들은 Bacillus 배양물배지에서 성장하였다. 배지 2는 5% 펩톤, 5% 포도당, 3% 효모정제, 3% 맥아정제, 1.5% 프로플로(proflo) 목화종자 정제 (59% 단백질, 4.26% 지방, 6.73% 회, 3.19% 섬유 그리고 미세함량의 고시풀 ; 나머지는 물이다), 10% 콩가루, 그리고 0.5% MgSO4x7H2O를 함유하였다. 배지 3은 20% 펩톤, 3.4% KH2PO4 그리고 4.3% K2HPO4인 것을 제외하고, 같은 성분들을 함유한다. 하루 지난 획선 배양물들을 250㎖ 배플진탕플라스크들에 접종하는데 사용하였다. 플라스크들을 200rpm, 29℃에서 5일간 진탕시켰다. 살충 활성을 분석하기 위해, 35㎖ 배양물 육즙을 5,200rpm에서 20분동안 원심분리하였고, 그 상징액을 하기의 미세분석에 사용하였다.
분석은 96-웰 마이크로플레이트에서 수행하였다. 각 웰은 고체한천기질 (solid agar substrate), 시험유기체 그리고 양성 대조구, 음성 대조구이거나 또는 실시예 1에 기술된 신규한 Bacillus 균주로부터 얻은 상징액을 함유한다.
살충 활성을 분석하기 위해, 한천기질이 Marrone et al.(1985), J.Econ Entomol.
78:290-293에 따라 마이크로플레이트의 웰들을 위하여 제조되었다. 살선충 활성을 분석하기 위해, 보통의 한천(1.5%)을 웰들에 대신 사용하였다.
1ppm 용액의 Avid®(avermectin)는 양성 대조구로서 사용되었다. 탈이온수는 음성 대조구로서 사용되었다. 시험샘플 또는 대조구의 두 복제물은 각 분석에 사용하였다. 40㎕ 상징액 샘플 또는 배지 1,2 또는 3에서 성장한 전체 육즙들을 각 샘플웰에 분배하였다. 다음에 플레이트들을 한천용액이 건조될 때까지 약 2 내지 3시간동안 흄후드에 배치하였다.
시험 유기체들은 미성숙 옥수수 근벌레들(Diabrotica undecimpunctata), 미성숙 독일 바퀴벌레들(Blatella germanica), 미성숙 사탕무 행렬구더기들 (Spodoptera exigua), 미성숙 파리들(Drosophila melanogaster) 또는 선충류 Caenorhabditis elegans의 N2 균주였다. 시험 유기체들은 각 웰에 분배된 25㎕ 한천 당 약 5 유기체의 농도가 되도록 0.1% 한천에 희석시켰다. 마이크로플레이트는 Mylar®과 같은 밀폐 물질로 밀폐하였고, 각 웰은 핀프레스로 환기구멍을 내었다. 플레이트들을 7일이 될 때까지 27℃에서 배양하였다.
배양후에, 웰들은 신생아 사멸율 또는 애벌레의 발육도에 주의하여 점수를 주었다. 모두 죽거나 발육이 멎은 애벌레를 함유한 샘플 웰들은 1점을, 일부는 죽고 다른 것은 심하게 왜소한 애벌레를 함유한 웰들은 2점을, 살아있으나 발육이 멎은 애벌레는 3점을, 아무것도 죽지 않은 애벌레를 함유한 샘플 웰들에는 4점의 점수가 주어졌다. 점수들은 각 샘플내의 복제물 사이에서 평균하였다. 결과를 표 2와 3에 요약하였다.
이들 시험은 AQ713이 전체육즙 배양물로서 두 배지에서 활성이었고 최고활성은 배지 2에서였음을 나타낸다. 상징액은 단지 AQ713이 배지 2 에서 성장했을때만 활성이었다.
실시예 3
옥수수 근벌레에 대한 AQ713 대사물질 활성의 화학적 특성
50㎖ AQ713은 배지 2에서 성장하였다. 각 배양물에 50㎖ 에틸아세테이트를 첨가시키고 그 혼합물을 2분동안 분별깔대기에서 진탕시켰다. 수성층을 제거하였고 유기층은 황산마그네슘을 함유한 병에 수집하였다. 다음에 유기 여과액은 둥근 바닥 플라스크 안으로 여과시켰고 그 용매는 로토벱(rotovap)에서 제거하였다.
생물분석 (bioassay)을 위해서, 건조된 유기 추출물을 2.5㎖ 아세트에 재용해하였다. 40㎕ 분액을 제거하였고, 70% 아세트/물로 800㎕가 되도록 희석시켰다. 이것은 유기 추출물의 10X 농도이다. 연속적인 희석을 수행하여 옥수수 근벌레에 대해 7일 후의 신생 애벌레(상기에서 준비한 마이크로티터(microtiter) 플레이트에 웰 당 한개)의 사멸율을 기록한 백분율을 갖는 샘플들을 얻었다. 그 결과를 표 4에 기록하였다.
이 결과는 AQ713이 옥수수 근벌레들을 죽이는 용매 추출가능한 대사물질을 생산한다는 것을 나타낸다.
활성대사물질의 분자량 범위를 결정하기 위해 50㎖ AQ713의 배양물을 배지 2에서 성장시켰다. 1㎖는 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)에 배치하고 12,000rpm에서 15분동안 회전시켰다. 그 상징액을 제거시켰다. 500㎕ 상징액을 10,000 달톤 분자량의 센트리콘 필터(centricon filter)의 상부에 배치하였다. 이것들은 제조업자의 지시에 따라 원심분리하였다(35분간 12,000rpm). 여과액을 수집하고, 그 투과유물은 원심분리와 여과기의 세척에 의해 회수하였다. 상징액, 여과액 및 투과유물을 옥수수 근벌레의 신생 애벌레에 대하여 시험하였다(96 well-plate insect diet, Marrone et al., 상기 참조; 웰 당 40㎕ 샘플과 각 샘플에 8 웰, 1애벌레/웰). 시험결과를 표 5에 나타내었다.
결과는 상징액과 여과액이 활성이었고, 이와 같이 그 대사물질의 분자량은 10,000 달톤 이하임을 나타낸다.
실시예 4
식물 병원균에 대한 AQ713 대사물질의 화학적 특성
50㎖ AQ713은 배지 2에서 성장하였다. 각 배양물에 50㎖ 에틸아세테이트를 첨가시키고 그 혼합물을 2분동안 분별깔대기에서 진탕시켰다. 수성층을 제거하였고 유기층은 황산마그네슘을 함유한 병에 수집하였다. 다음에 유기 여과액은 둥근 바닥 플라스크 안으로 여과시켰고 용매는 로토벱에서 제거하였다.
생물분석을 위해서, 건조된 유기 추출물을 2.5㎖ 아세트에 재용해하였다. 40㎕ 분액을 제거하였고, 70% 아세트/물로 800㎕ 되도록 희석시켰다. 이것은 유기 추출물의 10X 농도이다. 유기 추출물의 활성도를 결정하기 위하여 Pythuim ultimum과 Botrytis cinerea를 가지고 96-웰 플레이트분석(하기에서 기술) 식물병원균 분석을 수행하였다. 전체육즙은 100% 억제하였으나(1점), 10X 유기추출물은 두 식물 병원균을 억제하지 못하였다(4점). 이것은 AQ713에 의해 생산된 옥수수 근벌레 활성 대사물질과 다르게, 활성인 항생물질들은 에틸아세티이트와 같은 유기 용매에 추출되지 않는다는 것을 나타낸다.
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더 나아간 시험은 신규한 화합물 아그라스타틴 A의 분리물을 제공한다. 부탄올 추출물은 먼저 같은 부피의 에틸아세테이트를 가진 육즙에서 두번씩 추출하고 그 층들을 분리한 발효 육즙으로 만들어졌다. 다음에 수성분획을 같은 부피의 부탄올로 2번씩 추출하였다. 부탄올 추출물들을 결합시켰고, 용매는 회전증발기로 제거하였다. 분말은 결과된 추출물을 동결건조시켜서 얻었다.
분말을 80% 아세토니트릴/물에 용해시켰고 초음파 처리하였다. 메탄올로 활성화시키고 80% 아세토니트릴/물로 평형시킨 C-18 고체상 추출물(SPE) 카트리지에 그 용액을 적용하였다. SPE 카트리지를 80% ACN/물로 용리하였고, 이 용리액을 수집하여, 용매들을 제거하였다. 용리액은 HPLC로 더 정제하였다. C-18 HPLC 컬럼(1㎝ × 25㎝)은 다음의 용매구배로: 0-20분,33% ACN;20-30분,40% ACN;30-45분,45-55% ACN; 및 45-63분,55%ACN, 아세토니트릴 + 0.05% TFA/물 + 0.05% TFA를 가지고 사용하였다.
AQ713의 HPLC 크로마토그램은 이튜린, 이튜린유사 화합물들(플리파스타틴 및 아그라스타틴) 및 설펙틴의 존재를 보여준다, 도 1참조. 이튜린 A2, A3, A4, A7 및 A6는 NMR 데이타와 LC 질량분석기 데이타의 조합과 문헌값과의 비교에 의해 동정하였다. 설펙틴들은 HPLC와 LC 질량분석기에 의해 획득된 설펙틴 표준들을 비교하여 동정하였다.
이튜린 유사 화합물들은 아미노산 분석과 LC 질량분석의 조합에 의해 플리파스타틴과 신규한 아그라스타틴의 혼합물로 확인되었다. 광범위한 NMR 데이타를 아그라스타틴 A로 지칭된 신규한 화합물(HPLC 피크 20)의 한가지를 위하여 또한 수집하였다. 아그라스타틴 A는 다음의 아미노산: Thr;3 Glu;Pro;Ala;Val;2Tyr;및 Orn을 함유하는 것으로 알려져 있다. 이 구조는 Val의 존재와 Ile의 손실에 의해 플리파스타틴 A와는 다르다. 아그라스타틴 A의 분자량은 다음 구조에 해당되는 1448로 확인되었다.
지방산 부분의 직쇄 성질은 1H NMR로 확인하였다. 사이클릭 펩티드내의 아미노산들의 위치는 TOCSY와 ROESY 데이타세트의 상세분석에 의하여 확인하였다.
아그라스타틴 B(HPLC 피크 26)의 질량분석과 아미노산 분석은 그것의 구조가 Ala 잔류물과 Val을 치환한 플리파스타틴 B2와 유사하다는 것을 암시한다. 구조는 아래에 나타난다.
실시예 5
시험관내 배양물에서의 식물병원균에 대한 AQ713의 활성 (96-웰 플레이트)
AQ713이 진균류인, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Alternaria solani에 대하여 효과적인지를 결정하기 위하여, 다음 시험들을 수행하였다. 96-웰 플레이트 (편평-하단부, 웰 당 400㎕, Nunc 브랜드)들은 한천배지 (감자 포도당 한천) (PDA, Difco)로 채워졌다. Phytophthora infestans 배양물들을 액체 YPG-1 배지(0.4g 효모균, 0.1% KH2PO, 0.5% MgSO4 X 7H2O, 1.5% 포도당)에서 3일동안 성장하였다. 다른 진균류에 대해서는, 포자들을 페트리 플레이트의 표면으로부터 수집하여, 0.1-0.2㎖ 탈이온수의 분액과 병원균의 포자 현탁액(약 2 × 106 포자/㎖의 농도)을 한천 위에 도말하였다.
AQ713은 실시예 2에서 기술한 대로 배지 2 또는 3에서 72시간 동안 성장하였다. 상징액을 얻기 위하여, 전체육즙배양물을 5,200rpm에서 20분동안 원심분리하였다. 진균류의 식물병원균들을 96-웰 플레이트에 피펫하였다 (8웰/병원균). 진균류 성장의 존재 또는 부재는 8개의 웰 각각에서 기록하였다. 약 40㎕ AQ713 상징액 또는 20㎕ 전체육즙을 각 웰에 첨가하였다. 점수 "1"은 진균류 성장의 완전한 저해를 의미하고, 점수 "4"는 진균류 성장의 무저해를 의미한다. 결과는 표 6에 나타내었다.
결과는 AQ713이 시험관내에서 넓은 살진균 스펙트럼을 가지며, 그것도 전체육즙과 상징액 둘 모두에서 높은 활성임을 나타낸다. 상징액은 배지 3에 있는 Rhizoctonia solani에는 활성이었으나 배지 2에서는 그렇치 않았다.
실시예 6
시험관내 배양물에서의 식물병원균에 대한 AQ713의 활성 (띠 검정)
한천확산(띠)검정에서 AQ713의 활성을 결정하기 위하여, 식물병원균 포자들을 10㎝ 페트리 플레이트 안의 감자 포도당 한천의 표면에 퍼뜨렸다. 7.0㎜ 웰들을 한천에서 제거하였고, 배지 2에서 성장한 AQ713의 상징액 100㎕ 샘플을 웰에 배치하였다. 상징액을 4200rpm에서 40분간 회전시켜 제조하였다. 다음에 상징액을 다시 4200rpm에서 40분간 더 회전시켰다. 전형적인 결과물은 웰 둘레에 병원균의 무성장 및/또는 성장이 감소된 띠로 이루어졌다. 띠 크기는 밀리미터 단위로 측정하고 기록하였다. 결과는 표 7에 나타내었다.
실시예 7
세균 식물 병원균에 대한 AQ713의 활성
표준한천확산검정은 실시예 6에서 제공하였다. 각 세포 병원균의 론(lawn)을 페트리 플레이트의 표면에 분산시켰다. 배지 2에서 성장한 100㎕의 AQ713 전체육즙을 각 웰에 배치하였다. 띠 크기는 밀리미터 단위로 측정하였다.
실시예 8
식물 시험에 있어서 식물병원균에 대한 AQ713의 활성
AQ713의 활성은 콩과 양아욱의 잎에서의 회색 사상균인 Botrytis cinerea, 토마토 묘목들위의 Alternaria solani, 그리고 상추의 노병균의 원인인, Bremia lactucae에 대하여 시험하였다.
6 팩안에 2-3개 잎단계에 있는 A. Solani, 토마토 묘목들에 대하여, AQ713 전체육즙(배지 2)을 흘러내리도록 분무하였다. 분무후에, 묘목들을 건조시켰다(약 1.5시간). 다음에 묘목들을 5.0×104포자/㎖로 분무하였다. 묘목들은 플라스틱 돔으로 덮었고, 퍼시벌 인큐베이터 안에서 28℃로 유지하였다. AQ713이 없는 물 중 병원균의 포자가 있는 것과 없는 것을 음성 대조구과 양성 대조구로써 사용하였다. 4일후에 시험이 해석되었다. A.Solani로 억제한 물 위에서는, 모든 잎에 걸쳐 일정한 병변이 있었고 떡잎은 떨어졌고 심하게 감염되었다(5 등급=완전감염, 무억제). AQ713으로 처리한 식물들은 참잎들에 약간의 가벼운 병변을 산발적으로 가졌다. 떡잎은 떨어졌으나 몇몇의 조그만 감염만 가졌다. 음성 대조구는 감염이 안되었다.
두번째 시험은 돔 아래로 물을 채운 마손자 (Marson jar)에 배치된 분리한 토마토 묘목들을 이용하여 시작하였고 상기와 같이 보관하였다. 상기와 같이 식물에 분무하였고 A.Solani의 징후는 4일후에 기록하였다. 음성 대조구에서는 아무 징후가 없었다. 양성 대조구에서는, 묘목들 전반에 걸쳐 일정한 병변이 있었다. AQ713 처리는 1등급이었다(거의 없거나 무병변). 2일후에, 양성 대조구에 있는 식물은 죽었으나, AQ713으로 처리된 묘목들은 사실상 깨끗하였고, 음성 대조구(물로 분무한 식물)과 같게 보였다.
Botrytis cinerea에 대한 시험에서는, 콩나무의 첫번째 참잎을 각 잎들 위에 13×100 배지물 튜브의 입구로 압착하여 상처를 입혔다. 각 잎은 잎 당 2개의 상처를 입혔다. 잎들을 AQ713 전체육즙 (배지 2) 또는 물 단독 또는 병원균 단독으로 분무하였다. 건조시, B. cinerea 포자로(0.8 × 106 포자/㎖) 다시 분무하였다. 잎들을 플라스틱 돔으로 덮어 평평하게 배치하였고 퍼시벌 인큐베이터 안에서 18-20℃로 보관하였다. 5일후에, 양성 대조구(병원균 단독)는 지름으로 약 25mm인 면적이 썩었다. 음성 대조구(물 단독)는 썩음이 없었다. AQ713은 잎들이 상처받았던 곳인 8범위 중 7 범위에서 감염이 없슴을 나타내었다. 감염되었던 하나는 그 범위 주변의 2 지점에서 가벼운 감염을 가졌다.
Bremia에 대한 시험에서는, 상추종자들을 높이와 폭이 약 8㎝인 소형이고, 투명한 플라스틱 식물 콘도미니엄 안에 토탄, 펄라이트, 그리고 질석을 함유한 살균된 포팅 믹스의 층에 심었다. 상추가 발아한 후에(일주일), 상추 묘목들을 AQ713 육즙 또는 상징액 샘플로 분무하였다. 식물을 건조시켰고 다음에 감염된 상추 묘목들로부터 온 노균병 포자 현탁액을 상추 묘목들위에 분무하였다. 플라스틱 덮개를 식물 전체에 걸쳐 놓았고 퍼시벌 인큐베이터 안에서 18-20℃로 배양하였다. 일주일 후에 시험을 분석하였다. AQ713은 상추묘목위의 Bremia로부터 온 노균병을 막지 못하였다.
실시예 9
식물병들에 대한 AQ713의 효능(온실시험)
포도녹병균
AQ713은 48시간동안 400ℓ발효조안의 콩-기반 배지에서 성장하였다. 포도식물들 (샤르도네이 품종)을 0.5X 내지 0.25X가 되도록 살균한 물로 희석시킨 400ℓ 발효물로부터 온 전체육즙을 가지고 수동 분무기로 흘러내리도록 분무하였다. 군엽의 건조시, 식물들을 이차 분무하였다. 건조후에 식물들은 포도 녹병균의 원인인 병원균, Plasmopara viticola로 접종하였다. 세 식물들을 각 용량대로 처리하였다. 각 식물은 0 내지 100% 억제의 비율을 기준으로 병억제의 퍼센트로 추정하여 분석하였다. 100% 억제는 명백한 병변이 없는 식물이다. 화학적 살진균제인 메탈락실은 비교를 위하여 사용되었다. 결과는 다음과 같다.
AQ 713 0.5X 전체육즙 97.7% 억제
AQ 713 0.25X 전체육즙 100% 억제
메탈락실 30 ppm 100% 억제
메탈락실 10 ppm 98.3% 억제
메탈락실 1 ppm 80% 억제
결과는 AQ713은 화학적 살진균제로뿐만 아니라 포도 녹병균의 억제에도 유효함을 나타낸다.
실시예 10
스쿼시 백분병에 대한 AQ713의 효능
AQ713은 48시간동안 400ℓ 발효조안의 콩-기재 배지에서 성장하였다. 400ℓ 발효조안의 스쿼시식물(크록넥과 도토리)은 400ℓ 발효물로부터 온 전체육즙을 가지고 흘러내리도록 수동 분무기로 분무하였고, 샘플은 0.5X 농도가 되도록 살균한 물로 희석하였다. 건조후에, 식물들은 스쿼시 백분병 병원체인, Sphaerotheca fuliginea로 접종하였다. 두 식물들을 각 용량대로 처리하였다. 전체 육즙의 분무건조된 분말 또한 시험하였다. 400ℓ 발효 육즙은 물을 제거하기 위하여 분무 건조하였다. 10%와 2.5%의 분무건조된 분말 용액들은 상기와 같이 흘러 내리도록 식물 위에 분무하였다. 백분병의 발병률은 0 내지 5의 점수로 평가하였다. 5등급은 100% 병변인데 반하여 0등급은 병변이 없다. 결과는 아래의 표 9에 나타내었다.
AQ713의 전체 육즙과 분무건조된 분말은 스쿼시 백분병(squash powdery mildew)에서 거의 완전한 억제를 제공하였다.
실시예 11
온실내에서의 역병, 회색 곰팡이병, 포도 백분병, 곡식 백분병, 잎집무늬마름병 및 벼도열병에서의 AQ713의 효능
AQ713은 72시간동안 250㎖ 진탕플라스크안의 콩-기재 배지에서 성장하였다. 병의 원인이 되는 병원균과 숙주를 아래 표 10에 나타내었다. 이 전체육즙배양물을 아래 표 11에서 나타낸 것처럼 식물들위에 시험하였다.
각 육즙을 수동 분무기로 시험식물 위에서 1X 농도에서 흘러 내리도록 분무하였고, 건조시킨 다음에 두번째로 분무하였다. 세 식물은 각각의 병과 처리를 위하여 처리하였다. 건조후에 식물들을 그 병원체로 접종시켰다. 각 식물은 0 내지 100% 억제 비율에 근거하여 병 억제 퍼센트를 어림잡아 분석하였다. 100% 억제는 명백한 병변이 없는 식물을 가리킨다. 화학적 살충제는 비교를 위하여 사용되었다. 병지수는 미처리된 억제에 대한 병에 대한 심한 정도이다.
AQ713은 모든 시험된 병원체에 대한 화학적 살진균제에 상응하는 활성도를 나타낸다.
실시예 12
Brassica 노균병에 대한 AQ713의 효능
Bacillus 균주 AQ713은 48시간동안 콩-기재 배지의 10ℓ 발효조안에서 성장하였다. 1X 농도의 전체육즙배양물을 완전 떡잎단계에서 3주된 꽃양배추와 브뤼셀 싹양배위에 압축공기로 힘을 받는 미술가용 에어 브러시를 가지고 분무하였다. 15-25 묘목들/화분의 세 복제물들을 처리때마다 분무하였다. 제네카(Zeneaca)의 아족시스트로빈 살진균제인, QuardrisTM를 250ppm 내지 125ppm의 비율로 식물 위에 (처리당 3개) 또한 분무하었다. 백분병, Peronospora parasitica의 포자현탁액을 1.5×104 포자/㎖에서 AQ713과 Quardris에 분무하여 건조한 후 Brassica 식물위에 분무하였다. 식물은 감염을 위해 24시간동안 15-17℃로 유지하였으며, 다음에 묘목들을 6일동안 20-24℃에서 배양하였다. 포트들은 시험이 점수 매겨질 때까지 병원체의 포자형성을 시키기 위하여 밤새 15-17℃로 돌려놓았다. 각 식물은 0 내지 100% 억제 비율에 근거하여 병 억제 퍼센트를 어림잡아 분석하였다. 100% 억제는 포자형성의 병변이 없는 식물이다. 복제 포트들을 교차 평균한 결과를 아래 표 12에 나타내었다.
AQ713은 3주의 기간동안 효과적으로 녹병균을 억제하였다.
실시예 13
AQ713과 상업적인 살진균제의 상승작용
AQ713은 72시간동안 콩-기재 배지의 10ℓ 발효조에서 성장하였다. 세균배양물은 0.5X 내지 0.25X의 농도가 되도록 살균한 물로 희석하였다. 1X, 0.5X 그리고 0.25X 농도 배양물은 3주 지난 후추 식물위에 압축공기로부터 힘을 받는 미술가용 에어브러시를 가지고 분무하였다. 세 식물은 처리 때마다 분무하였다. Zeneca의 아족시스트로빈 살진균제인, QuardrisTM를 500ppm, 250ppm 그리고 125ppm의 농도에서 식물위에 또한 분무시켰다. 게다가 AQ713의 전체육즙배양물에 Quardris를 1:1의 비율로 더한 화합물을 후추식물위에 분무하였다(처리당 3개). Quardris를 가지고 처리를 한 것과 아닌 것들을 아래 표 13으로 나타내었다. 회색 곰팡이병, Botrytis Cinerea인 회색 곰팡이균을 1×106 포자/㎖에서 AQ713과 Quardris에 분무 하여 건조한 후 후추 식물위에 분무하였다. 식물은 시험이 평가될때까지 3일동안 20-22℃에서 유지하였다. 회색 곰팡이병의 발병률은 0 내지 5의 점수로 평가하였다. 5등급은 100% 병인 반면에 0 등급은 병이 없슴을 나타낸다. 결과는 아래 표 13에 나타낸다.
결과는 Quardris와 AQ713의 화합물이 Quardris 또는 AQ713 단독인 것보다 회색 곰팡이병의 억제가 상당히 좋다는 것을 나타낸다.
Claims (39)
- Bacillus subtilis 균주 AQ713, NRRL 기탁번호 B-21661의 생물학적으로 순수한 배양물.
- 삭제
- 옥수수 근벌레에 대항하는 항진균 및 항세균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 Bacillus subtilis 균주 AQ713의 배양물로부터 얻은 상징액.
- 제 1 항에 기재된 Bacillus subtilis 균주 AQ713의 전체육즙배양물과 아족시스트로빈 살진균제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
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- 삭제
- 제 3 항에 기재된 상징액과 아족시스트로빈 살진균제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 기재된 Bacillus subtilis의 유효량을 적용하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 진균류 및 세균 감염 그리고 옥수수 근벌레 만연으로부터 식물과 과일을 보호하거나 처리하는 방법.
- 삭제
- 제 3 항에 기재된 상징액의 유효량을 적용하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 진균류 및 세균 감염 그리고 옥수수 근벌레 만연으로부터 식물과 과일을 보호하거나 처리하는 방법.
- 제 4 항 또는 제 10 항에 기재된 조성물의 유효량을 적용하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 진균류와 세균감염 그리고 옥수수 근벌레로부터 식물과 과일을 보호하거나 처리하는 방법.
- 제 13 항 또는 제 15 항에 있어서, 감염이 Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria solani, Colletotrichum cocodes, Alternaria brassisicola, Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola, Venturia pyrina, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense, Plasmopara viticola, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator, 및 Peronospora parasitica로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 미생물이 원인이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 감염이 Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria solani, Colletotrichum cocodes, Alternaria brassisicocola, Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola, Venturia pyrina, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense, Plasmopara viticola, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator, 그리고 Peronospora parasitica로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 미생물이 원인이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, Bacillus subtilis 균주 AQ713을 전체육즙배양물로서 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, Bacillus subtilis 균주 AQ713을 상징액으로서 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, Bacillus subtilis 균주 AQ713을 가용성 분말, 과립, 유동물, 미세캡슐로서 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, Bacillus subtilis 균주 AQ713을 가용성 분말, 과립, 유동물, 미세캡슐로서 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항 또는 제 15 항에 있어서, 식물의 뿌리 또는 뿌리 주변의 토양을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 식물의 뿌리 또는 뿌리 주변의 토양을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- A-형 이튜린, 플리파스타틴, 그리고 설펙틴으로 이루어지는, 제 1 항의 균주로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 살충제 조성물.
- 제 25 항에 있어서, 아그라스타틴을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 살충제 조성물.
- 삭제
- 다음식을 갖는 화합물의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진균 및 세균 감염 및 옥수수 근벌레 만연으로부터 식물 및 과일을 보호 또는 처리하는 방법.(화학식 1)상기식에서,R1은 C8-C20의 분지 또는 직쇄 지방족 곁사슬이고;R2는 아세테이트 또는 에스테르 유도체이고;X는 Ala이거나 Val이고;GLx는 Gln 또는 Glu이다.
- 다음식을 갖는 화합물의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진균 및 세균 감염 및 옥수수 근벌레 만연으로부터 식물 및 과일을 보호 또는 처리하는 방법.(화학식 2)
- A-형 이튜린, 플리파스타틴, 그리고 설펙틴으로 이루어지는, 제 1 항의 균주로부터 얻어지는 조성물의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 진균 및 세균 감염 및 옥수수 근벌레 만연으로부터 식물 및 열매를 보호 또는 처리하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 아그라스타틴의 유효량을 적용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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- 삭제
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- 삭제
- 다음식을 갖는 화합물.상기식에서,R1는 C8-C20의 분지 또는 직쇄 지방족 곁사슬이고;R2는 아세테이트 또는 에스테르 유도체이고;GLx는 Gln 또는 Glu이다.
- 다음식을 갖는 화합물.(화학식 2)
- 제 1 항의 배양물을 키우는 단계 및 배양물로부터 상징액을 분리하는 단계를 포함하는, 살충 활성을 갖는 상징액을 분리하는 방법.
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