KR101131563B1

KR101131563B1 - 신균주인 바실러스 서브틸리스 에스원, 이로부터 정제한 신규 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101131563B1
Application number: KR1020060114038A
Authority: KR
Inventors: 함경수; 박윤경; 박성철
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2012-04-04
Also published as: KR20080044689A

Abstract

본 발명은 신규 분리, 동정한 바실러스 서브틸리스 에스원(Bacillus subtilis S1), 이로부터 분리한 신규 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 토양으로부터 분리, 동정한 신균주인 바실러스 서브틸리스 에스원(Bacillus subtilis S1), 이로부터 분리 정제한 항진균용 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19, S1-23 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19 및 S1-23은 항진균 활성이 우수하고 독성이 없으므로 항균제, 항진균제 뿐 아니라 생물농약, 기능성 화장품, 화장품 보존제, 식품 또는 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있다.

항생제, 농약, 기능성 화장품

Description

신균주인 바실러스 서브틸리스 에스원, 이로부터 정제한 신규 펩타이드 및 이의 용도{Novel bacterium Bacillus subtilis S1, novel peptides from it and use thereof}

도 1은 박테리아의 항진균 활성을 스크리닝한 결과를 나타낸 그림이고,

A : Aspergillus species vs S-10

B : Aspergillus fumigatus vs S-10

C : Aspergillus species vs D-2

D : Fusarium moniliforme var. subglutinans vs S-1, F : test fungi, S : screening bacteria.

도 2는 바실러스 섭틸리스와 S-1 콜로니의 염기서열을 정렬한 결과를 나타낸 그림이고,

도 3은 S-1으로부터 수득한 배양 상층액의 Fusarium moniliforme var. subglutinans 에 대한 항진균 활성을 나타낸 그림이고,

A: the supernatans (40 μg)

B: Mes buffer

C: Mes buffer+BSA.

도 4는 RP-HPLC(Reverse Phase-high performance liquid chromatography)를 1차로 실시하여 펩타이드들을 분리한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 5는 RP-HPLC(Reverse Phase-high performance liquid chromatography)를 2차로 실시하여, 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19, S1-23을 분리, 정제한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 6은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 분리, 정제한 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19 및 S1-23의 단백질전기영동 사진이고,

도 7a는 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19 및 S1-23을 첨가한 배지에 진균류인 콜렉토트리컨 코코드스(Colletotrichum coccodes)를 배양하여 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19, S1-23의 항진균 활성을 가시화한 그림이고,

도 7b는 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19 및 S1-23을 첨가한 배지에 진균류인 리족테니아 솔라니(Rhizoctonia solani)를 배양하여 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19, S1-23의 항진균 활성을 가시화한 그림이고,

도 8은 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19, S1-23에 대한 2차 구조 분석을 위하여 CD(Circular Dichroism) 분석을 한 결과를 나타낸 그림이고,

도 9는 S1-14의 구조분석 결과를 나타낸 그림이다.

본 발명은 신규 분리, 동정한 바실러스 서브틸리스 에스원(Bacillus subtilis S1), 이로부터 분리한 신규 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 토양으로부터 분리, 동정한 신균주인 바실러스 서브틸리스 에스원(Bacillus subtilis S1), 이로부터 분리 정제한 항진균용 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19, S1-23 및 이의 용도에 관한 것이다.

세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나이다. 1928년 푸른곰팡이에서 플레밍(fleming)이 페니실린(penicillin)을 처음 분리한 이래, 항생제 개발은 각종 감염증을 치료 및 사망률을 감소에 기여한 현대 의학의 최대 업적 중 하나로 꼽힌다.

항생제라는 용어는 토양의 시료로부터 미생물 분리작업을 거쳐 스트렙토마이신(streptomycin)을 발견한 미국의 selman a. waksman이 다른 미생물의 발육이나 대사를 저해하는 물질을 '항생제(antibiotics)'라고 부를 것을 미국 세균학회에 제안함으로써 탄생하였다. 일반적인 항생물질은 미생물이 생산하는 화학적 물질로서, 낮은 농도로도 다른 미생물의 생육을 저해하는 물질로 정의되나, 미생물로부터 분리한 것과 더불어 미생물의 생산물이 화학적으로 합성이 가능한 경우나 미생물 생산물로부터 화학적으로 유도체를 만드는 것이 가능한 경우까지 포함한다. 더 나아가 미생물의 발육이나 대사 뿐 아니라 암세포의 발육 또는 대사를 저해하는 경우도 포함한다.

한편, 질병치료에 사용되는 항생제의 경우에 지금까지 많은 종류의 항생물질이 발견ㆍ개발되어 널리 사용되고 있으나, 점차 항생제에 내성이 생긴 병원성 미생물이 출현하고 그 수가 증가하고 있는 실정이다. 즉, 사람, 동물 등의 질병 치료에 항생제가 사용되고 농?수산물 수확과 생산성 증가에까지 쓰이면서 이에 내성을 지닌 세균이 출현하게 되었다. 그 뿐 아니라, 세계 최강의 항생제인 반코마이신에 내성을 지닌 슈퍼박테리아까지 출현해 큰 충격을 주고 있다. 더욱 문제가 되는 것은 새로운 항생제를 개발하는 시간보다 세균들이 이미 개발된 항생제에 내성을 획득하는 시간이 비교할 수 없을 정도로 속도가 빠르다는 점이다.

항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상으로 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었다(Tomasz et al., Nature, 227; 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 죽지는 않는데 이는 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 세균 자체의 오토라이신(autolysin) 등과 같은 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문이다.

작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두 가지 경로로 이루어지는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며(Tuomanen E., Revs. Infect. Dis., 3; S279-S291, 1986), 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두 오토라이신 활성의 하부조절(down regulation)이 일어난다는 것이 공통점인데, 이러한 하부조절은 외형적인 내성의 경우에는 일시적이며, 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소에 결손이 일어나는 것이나, 임상적으로 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 발견된 적은 없으며, 오히려 오토라이신의 활성을 조절함으로써 내성을 가지는 예가 주로 보고되고 있다(Tuomanen et al., J. infect. Dis., 158; 36-43, 1988).

세균이 여러 가지 항생제에 대하여 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다(Handwerger and Tomasz, Rev. Infec. Dis., 7; 368-386, 1985). 아울러, 내성이 생기면 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기고 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 되므로 내성은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이 된다.

현재 페니실린(penicillin) 및 메티실린(methicillin)계 항생제 내성 균주 즉, MRSA(methicillin resistant staphylococcus), MRSE(MethicillinResistant Staphylococcus epidermidis) 등에 대한 강력한 항생제로서 반코마이신(VANCOMYCIN), 테이코플라닌(TEICOPLANIN)이 개발되어 그 사용이 계속 증가되어 왔다. 그러나 과도한 사용으로 인하여 최후의 항생제로 불리는 반코마이신마저 이에 내성을 지닌 병원성 세균인 엔테로코사이(enterococci)가 발견되고 있으며, 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 내성을 나타내고 있다(Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998). 따라서 항생제 내성 및 저항성을 가지는 세균을 사멸할 수 있는 신규한 항생제의 개발이 절실히 필요하다.

이에, 본 발명자들은 신규한 박테리아인 바실러스 서브틸리스 에스원(Bacillus subtilis S1)을 분리, 동정하고 상기 균주의 배양물에서 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19 및 S1-23을 분리, 정제하여 항진균 활성 여부를 알아본 결과, 강력한 항생 활성을 나타내는 것을 관찰하여 항균제, 항진균제 뿐 아니라 생물농약, 기능성 화장품, 화장품, 식품 또는 의약품의 보존제로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신균주인 바실러스 서브틸리스 에스원, 그로부터 분리된 항균 및 항진균 활성을 갖는 신규 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 신규 균주인 바실러스 서브틸리스 에스원을 제공한다.

또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스의 배양 및 정제에 의해 수득된 항균 및 항진균 활성을 나타내는 펩타이드 및 그 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물 을 제공한다.

또한, 상기 펩타이드를 유효성분으로 하는 생물농약을 제공한다.

아울러, 상기 펩타이드를 유효성분으로 하는 식품, 화장품 또는 의약품용 보존제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 먼저 토양으로부터 여러 종류의 균주를 수득한 후, 단일 콜로니 상태로 분리하여 이들 콜로니의 배양액과 병원성 곰팡이, 프사리움 모닐리포름 var 서브글루티난스(Fusarium moniliforme var. subglutinans)를 고체배지에서 공동으로 키워 이들의 항생 활성의 정도를 비교하여 활성이 강한 S1을 선별하였다. 그리고 16S rRNA 유전자 서열에 의해서 균주 동정을 한결과 100% 바실러스 섭틸리스임을 확인하였다. 그리고 이 균주에서 활성 펩타이드를 가장 많이 생산하는 조건을 동정하기 위해 각종 배양 배지[LB (Luria Broth), BHI (Brain Hart Infusion), NB (Nutrient broth), TSB (Trypticase Soy Broth) 배지]에서 활성을 측정한 결과 TSB 배지에서 배양하였을 때 가장 활성이 높은 것으로 나타났다.

상기 바실러스 서브틸리스 에스원은 2006년 1월 11일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 10888BP).

본 발명자들은 상기 바실러스 서브틸리스 에스원 균주를 배양한 뒤, 크로마토그래피를 실시하여 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 배양액으로부터 펩타이드를 분리하였다.

먼저, 바실러스 서브틸리스를 진탕 배양하고 상기 배양액을 여과지에 여과한 후, RP-HPLC(Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography)에 로딩하였다. 컬럼에 결합한 단백질을 용출시키기 위해 아세토니트릴 농도를 5에서 65%로 점차 증가시킨 용리액을 넣어가며 단백질을 분리시켰다. 이 중 최대 분획을 회수하고 이에 SDS-PAGE를 실시하여 세 가지 펩타이드를 수득하였다. 상기 분리한 세 가지 펩타이드들은 도 6에 나타난 바와 같이 약 2kDa 이하의 분자량을 갖고 있는 펩타이드로 확인되었다. 본 발명자들은 상기 신규 펩타이드를 ‘에스원-14, 에스원-19, 에스원-23(S1-14, S1-19, S1-23)'이라 명명하였다.

상기 펩타이드의 서열결정을 위하여 통상의 방법으로 서열분석을 시도하였으나 정확한 서열규명이 불가능하여 이를 Maldi-MS를 이용하여 이들 주어진 펩타이드의 분자 크기를 특정한 후, 분자크기와 비슷한 데이터베이스들을 중심으로 구조탐색과정을 수행하였다. 이들 펩타이드의 정확한 분자크기를 이용하여 전자데이타베이스 CCD(The Combinded Chemical Dictionary: Dictionary of Natural Products) 서치를 실시한 결과, S1-14의 경우 도 9에 나타난 구조를 갖는 펩타이드로 밝혀졌으며 나머지 S1-19과 S1-23의 구조도 S1-14, S1-19, S1-23의 경우 매스의 maldi MS/MS 데이터가 거의 비슷하므로 유사할 것으로 여겨진다.

본 발명자들은 에스원-14, 에스원-19, 에스원-23(S1-14, S1-19, S1-23)의 항진균 활성 측정을 위하여, 식물 병원성 진균인 리족테니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 콜렉토트리컨 코코드스(Colletotrichum coccodes)에 대한 항진균 테스트를 실시하였다. 그 결과 본 발명의 신규 펩타이드인 에스원-14, 에스원-19, 에스원-23 (S1-14, S1-19, S1-23)은 강력한 항진균 활성을 나타냄을 시각적으로 확인하였다(도 7a 및 b 참조).

본 발명자들은 본 발명의 신규 펩타이드인 에스원-14, 에스원-19, 에스원-23 (S1-14, S1-19, S1-23)이 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 에스원-14, 에스원-19, 에스원-23 (S1-14, S1-19, S1-23)의 사람의 적혈구 파괴능을 조사한 결과, 본 발명의 에스원-14, 에스원-19, 에스원-23 (S1-14, S1-19, S1-23)은 세포독성을 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다(표 2 참조).

상기의 결과로부터, 본 발명의 신규 펩타이드인 에스원-14, 에스원-19, 에스원-23 (S1-14, S1-19, S1-23)을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 탁월한 항진균 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항진균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 신규 펩타이드들인 에스원-14, 에스원-19, 에스원-23 (S1-14, S1- 19, S1-23)은 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 신규 펩타이드들은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 신규 펩타이드들의 유효 용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 펩타이드들의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투 여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 신규 펩타이드들의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정될 수 있을 것이다.

아울러, 본 발명은 상기 신규 펩타이드들을 유효성분으로 함유하는 생물 농약, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제를 제공한다.

식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 식품의 방부제 및 화장품, 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.

농작물의 병충해를 박멸하기 위한 농약 역시 해로운 미생물의 증식을 억제하고 인체에 무해하여야 사람이 농약을 살포한 농작물을 안전하게 섭취할 수 있다. 본 발명의 신규 펩타이드들은 <표 1> 및 <표 2>에 나타난 바와 같이 강력한 항생 활성을 나타내고 독성이 없으므로 생물 농약, 식품의 방부제, 화장품 및 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 생물농약은 펩타이드 성분 이외에 하나 이상의 다른 농약제를 첨 가할 수 있고 수화제, 유화 농축제, 수용성 분말, 분제, 과립제, 현탁 농축제 등의 농약에 일반적으로 사용되는 적당한 담체 및 또는 첨가제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 고체 담체로는 콩가루, 밀가루 등의 곡분, 규조토, 인회석, 석고, 활석, 벤토나이트, 점토 등의 광물질이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액체 담체로는 식물성 기름, 광물성 기름, 석유(예: 등유 및 나프타), 크실렌, 시클로 헥산, 시클로 헥사논, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 트리코로로에틸렌, 메틸이소부틸케톤 및 물이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 필요하다면, 균질 및 안정한 제재를 조성하기 위하여 계면 활성제를 첨가한다.

본 발명의 생물농약은 수화분말, 유화 농축제, 수용성 분말 및 현탁 농축제를 특정 농도가 되게 물로써 희석시켜 식물에 분무하기 위한 수성 현탁액 또는 수성 유제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 생물농약에서 상기 신규 펩타이드의 방제를 위한 유효 농도는 0.1μg/ml 내지 1mg/ml, 바람직하게는 1μg/ml 내지 100μg/ml이다.

본 발명의 생물농약은 들판, 산림, 조림지, 온실, 과수원 또는 포도원의 보호에, 재배작물 또는 삼림수, 예를들면 곡류(예, 옥수수, 밀, 쌀 또는 사탕수수), 목화, 담배, 채소류(예, 오이, 고추, 대두, 상치, 양파, 토마토 또는 후추), 밭농작물(예, 딸기, 감자, 사탕무우, 땅콩 또는 콩), 사탕수수, 목초지 또는 마초(예, 옥수수 또는 사탕수수), 재배작물(예, 차, 커피, 코코아, 바나, 팜유, 코코넛, 고무 또는 향료), 과수 또는 작은 나무밭(예, 감귤류, 키위, 아보카도, 망고, 올리브 또는 호도), 포도원, 장식용 식물, 꽃 또는 채소류 또는 풀밭, 정원 및 공원의 관 목 또는 숲의 삼림수(낙엽수 및 상록수), 재배장 또는 양수의 보호에 유용하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 균주 분리 및 동정

본 발명자들은 먼저 토양으로부터 여러 종류의 균주를 분리하여 단일 콜로니 상태로 분리한 후 이들 콜로니의 배양액과 병원성 곰팡이, 프사리움 모닐리포름 var 서브글루티난스(Fusarium moniliforme var. subglutinans)(KCTC 16909)를 고체배지에서 공동으로 키워 이들의 항생 활성의 정도를 비교하여 활성이 강한 S1을 선별하였다. 이를 생명공학연구소 바이오벤쳐센터 (주) 프로바이오닉에서 16S rRNA 유전자 서열에 의해서 균주 동정을 한 결과 100% 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)임을 확인하였다.

표 1: S-1 균주의 동정결과

균주	Blast 조사 결과 1
S-1	Bacillus subtilis (100%)

그리고 이 균주에서 활성 성분을 가장 많이 생산하는 조건을 동정하기 위해 각종 배양 배지, LB (Luria Broth), BHI (Brain Hart Infusion), NB (Nutrient broth), TSB (Trypticase Soy Broth) 배지에서 온도 30℃와 37℃로 배양하여 활성을 측정한 결과, TSB 배지에서 37℃에서 24시간 배양 하였을 때 가장 활성이 높은 것으로 나타났다.

표 2: 다양한 배지에서 수득한 S1 배양 상층액의 항진균 활성

배지	성장온도 (℃)	항진균활성
LB	30	－
LB	37	－
NB	30	－
NB	37	－
BHI	30	－
BHI	37	＋
TSB	30	＋＋
TSB	37	＋＋

<실시예 2> 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis )의 배지로부터 단백질 추출

본 발명자들은 RP(Revers Phase)-HPLC를 실시하여 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 배양액으로부터 단백질을 분리하였다.

우선 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 TSB(Trypticase Soy Broth) 액체 배지에서 24시간 배양하고 배양 온도를 37℃로 하여 진탕 배양한 배양액을 여과지(Whatman사, No.2)에 통과시켜 여과한 후 Shim-pack VP-ODS C18 컬럼(4.6 X 250 mm, particle; 12.0 ± 1.0 nm pore, Shimadzu사)이 장착된 RP(Reverse Phase)-HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에 로딩하였다. 0.1% 트리플로로아세트산(Trifluoroacetic Acid)이 포함된 아세토니트릴(Acetonitrile) 완충용액에서 아세토니트릴 농도를 5%에서 65%까지 분당 2%씩 30 분 동안 증가시켜(linear gradient) 컬럼에 결합된 단백질을 용출한 후, 최대 분획(peak fraction)을 회수하였다(도 4). 그 결과 첫 번째 RP(Reverse Phase)-HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서는 무수히 많은 수의 단백질 피크를 얻을 수 있었다. 이들을 좀더 세분화 하여 분리하기 위해 프랙션을 임의로 세부분 (0-30분, 31-60분, 61-90분)으로 나눈 뒤 다시 한번 RP(Reverse Phase)-HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 수행했고 첫 번째 테스트때와 마찬가지로 활성이 있는 부분을 선별하여 최종 세 개의 피크를 얻을 수 있었다 (도 5).

<실시예 3> 단백질 전기영동

본 발명자들은 16.5% 슬랩 젤(slab gel)을 제작하여 Laemmli(Laemmli et al. 1972)의 방법에 따라 <실시예 1>에서 얻은 분획으로 16.5% Tricine-SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 실시하였다.

<실시예 2>에서 얻은 단백질 시료와 표준 단백질을 16.5% 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)에 로딩(loading)하여 전기영동을 실시한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) R-250으로 젤을 염색하고, 탈색 완충용액(destaining buffer; MeOH: glacial acetic acid: distilled water = 30: 10: 60)으로 탈색하여 나타나는 단백질의 밴드를 확인하였다.

분자량 표준 단백질로는 Tricine 단백질 전기영동시에 표준 단백질의 범주에 속하는 26.6 kDa의 마우스의 근육으로부터 분리된 트라이오스포스페이트 아이소머레이즈(Triosephosphate Isomerase), 17 kDa의 미오글로빈(Horse Heart Myoglobin), 14.2 kDa의 알파-락트알부민(α-Lactaalbumin from bovine milk), 6.5 kDa의 아프로티닌(Aprotinin from bovine lung), 3.5 kDa의 인슐린 체인 B(Insulin Chain B), 1 kDa의 브라디키닌(Bradykinin)을 이용하여 단백질의 분자량을 측정하였다(도 6). 그 결과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 배양액에서 분리한 신규 펩타이드 분자량이 약 2kDa 이하인 것을 확인하였다.

<실시예 4> 신규 펩타이드의 분자량 확인

<실시예 2>에서 분리한 펩타이드를 6N-HCl에 녹인 후 22시간 동안 110℃에서 가수분해하여 건조시켜 질량 스펙트라(mass spectra)(Voyager DE RP instrument(Perseptive Biosystems, Framingham, MA)로 분자량을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 신규 펩타이드는 도 4 및 5에 나타난 바와 같이 SI-14: 1462.79, SI-19: 1490.81, SI-23: 1504.83의 분자량을 갖고 있는 세 가지 펩타이드로 확인되었다. 본 발명자들은 상기 펩타이드를 각각 S1-14, S1-19, S1-23이라 명명하였다.

<실시예 5> 항진균 활성 측정

<5-1> MTT assay 및 현미경 관찰

본 발명의 펩타이드의 항진균 활성 측정을 위하여, 식물 병원성 진균인 리족테니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 콜렉토트리컨 코코드스(Colletotrichum coccodes)(KACC, Korean Agricultural Culture Collection)에 S1-14, S1-19, S1-23 각각 첨가한 후, MTT assay를 수행하였다.

96-웰 마이크로 적정 플레이트(96-well microtiter plate)에 리족테니아 솔라니(Rhizoctonia solani)(KACC, Korean Agricultural Culture Collection)와 콜렉토트리컨 코코드스(Colletotrichum coccodes)(KACC, Korean Agricultural Culture Collection)를 각각 포함한 YPD 배지를 희석하여 웰당 100μl씩 분주하여 2 X 10³ cell/well이 되도록 하였다. 여기에 본 발명의 S1-14, S1-19, S1-23와 기존에 강력한 항진균 활성을 가지고 있는 것으로 알려진 멜리틴(Melittin) 펩타이드(애니젠 합성)를 여러 가지 농도로 각각 첨가하였다. 이를 30℃에서 하룻밤 방치한 후, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)로 620nm에서 흡광도를 측정하고 농도별 흡광도 그래프를 작성한 후, 최소성장억제농도(MIC; minimal inhibitory concentration, 흡광도가 나타나지 않는 농도)를 결정하였다.

그 결과, 표 3 및 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 S1-14, S1-19, S1-23은 최저성장억제농도(MIC: minimal inhibitory concentration)가 강력한 항진균 활성을 가진 멜리틴(3.13μM)과 같거나 2배까지 강력한 항진균 활성(1.56~3.13μM)을 나타내는 것을 확인하였다.

표 3: S1-14, S1-19, S1-23의 콜렉토트리컨 코코드스에 대한 항진균활성 측정

콜렉토트리컨 코코드스(Colletotrichum coccodes)
S1 14	S1 19	S1 23	멜리틴
3.13~1.56μM	3.13~1.56μM	1.56μM	3.13μM

표 4: S1-14, S1-19, S1-23의 콜렉토트리컨 코코드스에 대한 항진균활성 측정

리족테니아 솔라니(Rhizoctonia solani)
S1 14	S1 19	S1 23	멜리틴
3.13~1.56μM	3.13~1.56μM	3.13~1.56μM	3.13μM

<5-2> 현미경 관찰

상기 실시예 <5-1>에서 리족테니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 콜렉토트리컨 코코드스(Colletotrichum coccodes)에 아무것도 첨가하지 않은 웰, 본 발명의 S1-14, S1-19, S1-23을 각각 첨가한 웰 및 멜리틴(Melittin)을 첨가한 웰을 각각 음성대조군(negative control), 실험군 및 양성대조군(positive control)으로 설정하고 이를 현미경으로 관찰하여 가시화하였다.

그 결과, 도 7a 및 b에 나타난 바와 같이, 아무것도 첨가하지 않은 음성대조군에서는 리족테니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 콜렉토트리컨 코코드스(Colletotrichum coccodes)가 왕성하게 자라났고 본 발명의 S1-14, S1-19, S1-23을 각각 첨가한 실험군은 양성대조군과 유사하게 리족테니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 콜렉토트리컨 코코드스(Colletotrichum coccodes)가 거의 자라지 않았다. 이로써 본 발명의 S1-14, S1-19, S1-23의 강력한 항진균 활성을 나타냄을 시각적으로 확인하였다.

<실시예 6> S1-14, S1-19, S1-23의 세포 독성 측정

본 발명의 S1-14, S1-19, S1-23이 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 S1-14, S1-19, S1-23의 적혈구 파괴능을 각각 조사하였다.

사람의 혈액에 PBS 완충용액을 1:1 비율로 첨가하여 2000rpm에서 원심분리하는 방법을 세 번 반복하여 세척한 후 순수한 적혈구만을 수득하여 적혈구가 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 희석하였다. 여기에 본 발명의 S1-14, S1-19, S1-23을 12.5 μM/웰 부터 1/2의 농도로 연속적으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 조사하기 위하여 1% 트리톤 X-100을 사람의 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였고, 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하여 이를 각 항균 접합 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

상기 식에서, 흡광도 A는 414 nm 파장에서 S1-14, S1-19, S1-23 용액의 흡광도, 흡광도 B는 414 nm 파장에서 PBS의 흡광도 그리고 흡광도 C는 414 nm 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.

상기 식에 의한 적혈구 파괴능의 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

표 5: S1-14, S1-19, S1-23의 용혈활성 측정

	0.10(μM)	0.20	0.39	0.78	1.56	3.13	6.25	12.5
S1-14	0	0	0	0	0	0	0	0
S1-19	0	0	0	0	0	0	0	0
S1-23	0	0	0	0	0	0	0	0
멜리틴	0	0	34	100	100	100	100	100

그 결과, 본 발명의 S1-14, S1-19, S1-23은 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드는 세포독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있다.

<실시예 7> 펩타이드 서열 및 구조분석

<7-1> S1-14, S1-19, S1-23의 2차 구조 분석

S1-14, S1-19, S1-23의 CD 스펙트럼은 J 720 spectropolarimeter(Jasco, Japan)를 사용하여 측정하였다. 모든 S1-14, S1-19, S1-23 샘플은 분석하는 동안 25℃를 유지시켰다. 1mm의 pathlength cell을 사용하였으며, 샘플당 0.1 nm 간격으로 190?250 nm에서 연속적으로 4번 측정하였다. 세포막을 모방하는 조건에서 2차 구조를 측정하기 위하여 10 mM 인산염 완충용액(pH 7.0)을 포함한 50% TFE 및 30mM SDS에서 측정하였다. CD 스펙트럼의 측정을 위한 S1-14, S1-19, S1-23의 농도는 100 ㎍/㎖로 하였다. 평균잔기타원율(Mean residue ellipticity, θ)은 degㆍcm²ㆍdmol^-1로 나타내며, [θ] = [θ]_obs (MRW/10ℓc)로 나타낸다. [θ]_obs 는 밀리도(millidegree)로 측정되는 타원율을 의미하며, MRW는 S1-14, S1-19, S1-23의 평균잔기몰질량(mean residue molecular weight)을 의미한다. c 는 샘플의 농도(㎎/㎖)를 나타내고, ℓ 은 셀의 광학적 경로길이(optical pathlength, ㎝)를 나타낸다. S1-14, S1-19, S1-23의 % α-helicity는 다음식에 의하여 계산하였다.

% α-helicity = 100 ([θ]₂₂₂- [θ]⁰ ₂₂₂) / [θ]¹⁰⁰ ₂₂₂

([θ]₂₂₂= the observed mean residue ellipticity per residue at 222nm in degㆍcm²ㆍdmol^-1. [θ]⁰ ₂₂₂= -3,000 degㆍcm²ㆍdmol^-1(the estimated ellipticity corresponding to a random coil structure) [θ]¹⁰⁰ ₂₂₂= -33,000 degㆍcm²ㆍdmol^-1(the estimated ellipticity corresponding to 100% α-helical peptide)

2차 구조 분석 결과 S1-14, S1-19, S1-23의 구조는 α-HELIX 구조가 아닌 일직선 모양의 β-SHEET 구조로 예상되었다.

<7-2> S1-14의 3차 구조분석

본 발명자들은 상기 펩타이드의 구조분석을 위해 통상의 서열분석방법을 시도하였으나 정확한 서열규명이 불가능하여 이를 Maldi-MS(AXIMA-QIT., Shimadzu, Japan)를 이용하여 이들 주어진 펩타이드의 분자 크기를 특정한 후, 분자크기와 비슷한 데이터베이스들을 중심으로 구조탐색과정을 수행하였다. 이들 펩타이드의 정확한 분자크기를 이용하여 전자데이타베이스 CCD(The Combinded Chemical Dictionary: Dictionary of Natural Products) 서치를 실시하였고, 일단 매스(mass)가 거의 오차 범위 안에서 같으면 포함된 아미노산의 서열과 N-말단 블로킹이 단백질 서열분석 결과와도 일치된다(Harvey DJ et al., Rapid Commun Mass Spectrom. 2004;18(24):2997-3007.

S1-14, S1-19, S1-23의 경우 매스의 maldi MS/MS 데이터가 거의 비슷하므로 3개 분자량의 기본 구조는 거의 같고 매스 차이가 나는 일부분이 있음을 예측할 수 있었는데 실제로 기본 구조를 임의로 잘라서 MS/MS data와 비교해 볼 때 일부 일치함을 알 수 있었다. 따라서, S1-14의 경우 도 9에 나타난 구조를 갖는 펩타이드로 밝혀졌으며 나머지 S1-19과 S1-23의 구조도 유사할 것으로 여겨진다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규 펩타이드인 S1-14, S1-19, S1-23은 유해 곰팡이들과 세균에 있어서 탁월한 항생효과를 나타내므로 이를 이용한 항균, 항진균용 약학적 조성물 뿐 아니라 농약, 식품방부제, 화장품 보존제 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

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하기의 구조식(Ⅰ)으로 표시되는 SⅠ-14 펩타이드:

(Ⅰ)

.
제 4항에 있어서, 상기 펩타이드는

1) 수탁번호 KCTC 10888BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스 에스원(Bacillus subtilis S1)으로부터 분비되며,

2) 질량스펙트라로 측정시 분자량이 1.4 내지 1.6 KDa이고,

3) 리족테니아 솔라니와 콜렉토트리건 코코드스에 대해 항균활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 4항에 있어서, 상기 펩타이드는

1) 수탁번호 KCTC 10888BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스 에스원을 배양하는 단계;

2) 단계 1의 배양액을 여과한 후, RP-HPLC(Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography)에 로딩하는 단계;

3) 단계 2의 컬럼에 아세토니트릴 농도를 점차 증가시킨 용리액으로 단백질을 용출하는 단계; 및

4) 단계 3의 용리액 중 최대 분획(peak fraction)을 회수하고 이들의 항균활성을 조사하는 단계를 포함하는 방법으로 정제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 6항에 있어서, 단계 4에서 아세토니트릴 농도는 5%에서 65%까지 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 4항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물.
제 4항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 생물농약.
제 4항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 식품, 화장품 또는 의약품용 보존제.