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KR100527265B1 - 폴리뉴클레오티드 서열의 선형 등온 증폭을 위한 방법 및조성물 - Google Patents

폴리뉴클레오티드 서열의 선형 등온 증폭을 위한 방법 및조성물 Download PDF

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KR100527265B1
KR100527265B1 KR10-2002-7003284A KR20027003284A KR100527265B1 KR 100527265 B1 KR100527265 B1 KR 100527265B1 KR 20027003284 A KR20027003284 A KR 20027003284A KR 100527265 B1 KR100527265 B1 KR 100527265B1
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뉴젠 테크놀로지스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 신규의 등온 단일 프라이머 선형 핵산 증폭 방법을 제공한다. 복합 프라이머, 프라이머 확장, 가닥 치환, 및 선택적으로 종결 서열를 사용하여 상보성 DNA를 증폭하는 방법이 제공된다. 복합 프라이머, 프라이머 확장, 가닥 치환, 선택적으로 주형 스위치 프로프로모터 올리고뉴클레오티드 및 전사를 사용하여 센스 RNA를 증폭하는 방법이 제공된다. 더 이상으로, 본 발명은 상기 방법을 실행하기 위한 조성물 및 키트, 그리고 증폭 생성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

폴리뉴클레오티드 서열의 선형 등온 증폭을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR LINEAR ISOTHERMAL AMPLIFICATION OF POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES}
이 출원은 1999년 9월 13일자로 제출된 선행 특허 출원 미국 일련번호 60/15 3,604, 및 2000년 1월 12일자로 제출된 미국 일련번호 60/175,780의 우선권을 주장하며, 이것들 모두 본원에 참고자료로 포함된다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 증폭 분야에 관한 것이다. 더욱 특별하게, 본 발명은 단일 RNA/DNA 복합 프라이머를 사용하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위한(즉, 다중 카피를 만들기 위한) 방법, 조성물 및 키트를 제공하며, 이 증폭은 선택적으로 전사를 포함한다.
핵산 증폭 및 증폭 생성물의 검출을 위한 방법의 개발은 최근에 핵산 서열의 검출, 확인, 정량 및 서열 분석을 진전시키고 있다.
핵산 분석은 병원균의 검출 및 확인, 규정된 표현형을 가져오는 유전자 변경의 검출, 유전 질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단, 발달, 질환 및 규정된 자극에 대한 반응에서 유전자 발현의 평가, 그리고 다양한 게놈 프로젝트에 유용하다. 핵산 증폭 방법의 다른 적용은 희귀 세포의 검출, 병원균의 검출, 및 악성종양에서 변경된 유전자 발현의 검출 등이다. 핵산 증폭은 규정된 핵산 서열의 존재를 검출하는 것과 같은 정성 분석 및 규정된 유전자 서열의 정량 모두에 잠재적으로 유용하다. 후자는 정상 세포형에서 악성 세포형으로의 세포 형질전환에서 주로 발견되는 병원균 서열의 평가 및 정량 뿐만 아니라 유전자 증식 또는 결실의 측정에 유용하다.
핵산 서열에서 서열 변경의 검출은 유전적 분석에 관련된 돌연변이 유전자형의 검출, 약물 내성을 가져오는 돌연변이의 검출, 약물유전학 등에 중요하다. 특이적 돌연변이를 검출하기 위한 다양한 방법으로는 대립유전자 특이적 프라이머 확장, 대립유전자 특이적 프로브 리게이션, 및 차등 프로브 혼성화가 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,888,819; 6,004,744; 5,882,867; 5,710,028; 6,027,745; 및 WO US 88/02746 참조. 변경에 대한 구체적 지식 없이 규정된 핵산 서열에 있는 서열 변경의 존재를 검출하기 위한 방법이 또한 설명되었다. 이들 방법 중 일부는 시험 증폭 생성물과 기준 증폭 생성물의 혼성화에 의해 형성된 미스매치의 검출을 기초로 한다. 그러한 이형-듀플렉스에 있는 미스매치의 존재는 미스매치 특이적 결합 단백질을 사용하여, 또는 미스매치의 화학적 또는 효소적 절단에 의해 검출될 수 있다. 십자형 4-가닥 DNA 구조에서의 분지 이동 억제를 기초로 하는 서열 변경의 검출 방법이 최근 설명되었다. 예를 들어, Lishanski A. et al. Nucleic Acids Res. 28(9):E42 (2000) 참조. 다른 방법은 단일가닥 증폭 생성물의 특이적 입체구조의 검출을 기초로 한다. 단일가닥 DNA 또는 RNA의 2차 구조는 특이적 서열에 의존한다. 기준 서열에 상대적인 시험 핵산 표적의 서열 변경은 변경된 입체구조를 가져온다. 단일가닥 증폭 생성물의 변경된 입체구조는 기준 증폭 생성물의 전기영동도와 비교하여 시험 증폭 생성물의 전기영동도의 변화에 의해 검출될 수 있다. 단일가닥 입체구조 다형성(SSCP)이 서열 변경의 검출에 광범위하게 사용된다. 예를 들어, Orita M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(8):2766-70 (1989); Suzuki Y. et al. Oncogene 5(7):1037-43 (1990); 및 미국 특허 번호 5,871,697 참조. 이 방법은 또한 상이한 균주 또는 종들의 특이적 핵산 서열에 있는 규정된 변화를 기초로 하는 미생물 확인에 사용된다. SSCP 방법을 사용한 돌연변이 검출은 대부분 DNA 증폭 생성물을 사용하지만, RNA-SSCP 방법도 설명되고 있다. 단일가닥 RNA의 서열 의존성 입체구조는 문헌에 잘 기록되어 있으며, 규정된 전기영동도 패턴을 가져온다고 알려졌다. 예를 들어, Sarkar et al. Nucleic Acid Research 20 (4):871-878 (1992) 및 Gasparini et al. Hum. Genet. 97:492-495 (1996).
규정된 핵산 서열 존재의 검출 및 그것의 서열 분석은 프로브 혼성화에 의해 수행될 수 있지만, 일반적으로 이 방법은, 몇몇 분자와 같이 적은 양의 핵산 서열이 시험 샘플에 존재할 때는 민감성이 부족하다. 이 장애에 대한 한 해답은 규정된 핵산 서열의 다중 카피를 생성하는 방법의 개발이었으며, 이것은 더 이상의 분석에 적합하다. 특이적 핵산 서열의 다중 카피를 생성하는 방법은 일반적으로 표적 증폭 방법으로서 정의된다. 혼성화 분석의 검출 민감성을 증가시키기 위한 다른 방법은 혼성화된 프로브 또는 프로브들로부터 다중 생성물의 생성, 예를 들어 다중 생성물을 형성하기 위한 혼성화된 프로브의 절단, 또는 유일한 혼성화 의존성 생성물을 형성하기 위한 인접 프로브들의 리게이션을 기초로 한다. 유사하게, 혼성화 반응의 증가된 민감성은 혼성화 사건에 의해 발생된 신호를 증폭하는 방법, 예컨대 분지된 DNA 프로브의 혼성화를 기초로 하는 방법에 의해 달성되었다.
지수 증폭, 링크된 선형 증폭, 리게이션-기초 증폭, 및 전사-기초 증폭과 같은 많은 변형된 핵산 증폭이 있다. 지수 핵산 증폭 방법의 예는 많은 공보에 개시되어 있는 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다. 예를 들어, Mullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Mullis K. EP 201,184; Mullis et al. 미국 특허 번호 4,582,788; Erlich et al. EP 50,424, EP 84,796, EP 258,017, EP 237,362; 및 Saiki R. et al. 미국 특허 번호 6,027,923 참조. 리게이션-기초 증폭의 예는 Wu et al. in Genomics 4:560 (1989)에 개시된 리게이션 증폭 반응 (LAR) 및 유럽 출원 번호 0320308 B1에 개시된 리가제 연쇄 반응이다. 다양한 전사-기초 증폭 방법이 미국 특허 번호 5,766,849; 5,654,142; Kwoh et al. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:1173 (1989); 및 Ginergeras et al. WO 88/10315에 개시된다.
가장 통상적으로 사용되는 표적 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로서, 이것은 변성, 마주하고 있는 표적 가닥 각각에 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 혼성화, 및 표적 서열에 대한 다중 이중가닥 카피를 생성하기 위한 뉴클레오티드 중합효소에 의한 프라이머 확장의 수회의 사이클을 기초로 한다. 많은 변형된 PCR이 설명되었으며, 이 방법은 DNA 또는 RNA 핵산 서열의 증폭, 서열화, 돌연변이 분석 등에 사용되고 있다. 단일 프라이머를 사용하는 열순환-기초 방법이 또한 설명되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,508,178; 5,595,891; 5,683,879; 5,130,238; 및 5,679,512 참조. 프라이머는 미국 특허 번호 5,744,308에 개시된 바와 같은 DNA/RNA 키메라 프라이머일 수 있다. 열순환에 의존하는 다른 방법은 리가제 연쇄 반응(LCR) 및 관련된 수선 연쇄 반응(RCR)이다.
표적 핵산 증폭은 다양한 온도에서의 수회의 인큐베이션 사이클을 통해, 즉 열순환에 의해, 또는 한 온도(등온 과정)에서 수행될 수 있다. 열안정성 핵산 변형 효소의 발견이 핵산 증폭 기술의 빠른 진전에 기여하고 있다. Saiki et al. Science 239:478 (1988) 참조. DNA 및 RNA 중합효소, 리가제, 뉴클레아제 등과 같은 열안정성 핵산 변형 효소가 열순환 의존성 방법 및 등온 증폭 방법 모두에 사용된다. 가닥 치환 증폭(SDA)과 같은 등온 방법은 Fariser et al. 미국 특허 번호 5,648,211; Cleuziat et al. 미국 특허 번호 5,824,517; 및 Walker et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 (1992)에 개시된다. 다른 등온 표적 증폭 방법은 전사-기초 증폭 방법으로서, 여기에서는 RNA 중합효소 프로모터 서열이 증폭의 초기 단계에 프라이머 확장 생성물에 결합되고(WO 89/01050), 더 이상으로 표적 서열 또는 표적 상보성 서열이 전사 단계 및 DNA/RNA 혼성체 중간 생성물에 있는 RNA 가닥의 소화에 의해 증폭된다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,169,766 및 4,786,600 참조. 이들 방법으로는 전사 매개 증폭(TMA), 자가-지속 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기제 증폭(NASBA), 및 그것들의 변형이 있다. 예를 들어, Guatelli et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 (1990); 미국 특허 번호 5,766,849 (TMA); 및 5,654,142(NASBA) 참조. 다른 증폭 방법은 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO) 및 차단 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 키메라 DNA 프라이머가 이용되는 주형 스위치 증폭은 미국 특허 5,679,512 및 Patel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2969-2974 (1996)에 개시되고, 차단 올리고뉴클레오티드는 Laney et al. 미국 특허 번호 5,679,512에 개시된다.
등온 표적 증폭 방법은 열순환기가 필요하지 않으며, 따라서 통상의 기계 사용 기준에 맞추기가 더 쉽다. 그러나, 이전에 설명된 등온 표적 증폭 방법은 몇가지 단점을 가진다. SDA 방법에 따르는 증폭은 규정된 제한 효소를 위한 부위가 존재해야 하며, 이것은 그것의 응용성을 제한한다. 한편, NASBA 및 TMA와 같은 전사 -기초 증폭 방법은 프라이머에 의한 중합효소 프로모터 서열과 증폭 생성물의 결합에 대한 필요성에 의해 제한되며, 이 과정은 비-특이적 증폭을 가져오는 경향이 있다. 더욱이, 이들 전사-기초 증폭 방법에 의한 DNA 표적의 증폭 메카니즘은 잘 수립되어 있지 않다.
현재 증폭 방법의 또 다른 단점은 선행 증폭 반응의 증폭 생성물에 의한 시험 샘플의 잠재적 오염이며, 이것은 샘플에 비-표적 특이적 증폭을 가져온다. 이 단점은 잘 알려진 문제로서, 표적 증폭 기술의 파워, 및 증폭의 대상물인 증폭 생성물 형성의 결과이다. 증폭 반응의 마지막에, 또는 표적 증폭의 개시 전에 시험 샘플을 탈오염하는 다양한 수단이 설명되었다. 여기에 더하여, 물리적 수단에 의한 시험 용액의 오염 방법이 또한 설명되었다. 이들 용액은 모두 거추장스러우며 통상적인 연구 세팅에서의 핵산 시험에 복잡성을 더한다.
더욱이, 열순환 과정을 사용하는 증폭 방법은 각 사이클의 "표적" 온도에 도달하기 위해 열순환 블록을 필요로 한다는 긴 지연 기간의 불이익이 더해진다. 결과적으로, 열순환 과정을 사용하여 수행되는 증폭 반응은 완료될 때까지 의미 있는 양의 시간이 필요하다.
따라서, 이들 단점을 극복한 개선된 핵산 증폭 방법이 필요하다. 본원에 제공된 본 발명은 이런 필요를 실현시키고, 추가의 이점을 제공한다.
특허 출원 및 공보를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고자료는 그 전체가 참고자료로서 포함된다.
도 1a 내지 1c는 단일 복합 프라이머 등온 선형 증폭 방법의 도식적 표현이다.
도 2a 내지 2c는 주형 스위치 올리고뉴클레오티드를 사용하며 전사를 포함하는 증대된 단일 프라이머 등온 선형 핵산 증폭 방법의 도식적 표현이다.
도 3a 내지 3d는 차단인자 서열 성분을 사용하며 전사를 포함하는 증대된 단일 복합 프라이머 등온 선형 핵산 증폭 방법의 도식적 표현이다.
도 4는 단일 프라이머 등온 선형 증폭 방법을 사용한 주형 서열에서 돌연변이 검출의 도식적 표현이다. "X"는 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보하는 부위에서 표적 DNA상의 돌연변이를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 표적 핵산의 증폭은 돌연변이가 존재할 때 차단된다.
도 5는 합성 DNA 표적의 선형 등온 증폭 생성물에 대한 에티듐 브로마이드 염색된 PAGE 겔을 묘사한다.
도 6은 DNA 증폭 생성물과 특이적 프로브의 혼성화에 대한 PAGE 분석의 방사선 사진을 묘사한다.
도 7은 오버랩 확장으로부터 생성된 ssRNA 전사 생성물의 효율을 비교한 에티듐 브로마이드 염색된 PAGE 겔을 묘사한다.
도 8은 3'-차단 PTO가 있는, 그리고 이것이 없는 등온 선형 증폭에 대한 에티듐 브로마이드 염색된 PAGE 겔 비교를 묘사한다.
도 9는 E. coli 게놈 DNA로부터의 J 유전자 서열의 등온 선형 증폭에 의해 생성된 증폭 생성물에 혼성화된 프로브의 방사선 사진을 묘사한다.
도 10은 3개의 상이한 디자인의 복합 프라이머를 사용하여 생성된 선형 등온 증폭 RNA 생성물에 대한 에티듐 브로마이드 염색된 PAGE 겔을 묘사한다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 증폭 방법 및 조성물, 그리고 증폭 방법의 적용을 제공한다.
따라서, 한 양태로서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 상보하는 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하는 방법으로서, (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 DNA 주형과 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 혼성화하는 단계; (b) 주형과 복합 프라이머의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 혼성화하는 단계; (c) DNA 중합효소를 사용하여 복합 프라이머를 확장하는 단계; (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복할 수 있도록, RNA/ DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 사용하여 아닐된 복합 프라이머의 RNA 부분을 절단하여, 이로써 표적 서열의 상보성 서열의 다중 카피를 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하는 방법으로서, (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 DNA 주형과 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 혼성화하는 단계; (b) 주형과 복합 프라이머의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 단계; (c) DNA 중합효소를 사용하여 복합 프라이머를 확장하는 단계; (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복할 수 있도록, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 사용하여 아닐된 복합 프라이머의 RNA 부분을 절단하여, 치환된 프라이머 확장 생성물을 생성하는 단계; (e) 전사가 RNA 중합효소에 의해 일어나도록 허용하는 조건하에서, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼성화함으로써, 치환된 프라이머 확장 생성물에 상보하는 서열을 포함하는 RNA 전사체를 생성하여 표적 서열의 다중 카피를 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 사용되는 복합 프라이머의 다양한 구체예가 본원에 설명된다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 복합 프라이머의 RNA 부분은 3' DNA 부분에 관한 5'이다. 또 다른 구체예에서, 5' RNA 부분은 3' DNA 부분에 인접해 있다. 본원에 설명된 방법에 있어서, 1개 이상의 복합 프라이머가 사용될 수 있다.
종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 다양한 모범적인 구체예가 또한 본원에 설명된다. 어떤 구체예에서, 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)이며, 이것은 주형과의 결합을 강화시키기 위한 1개 이상의 변형을 함유할 수 있다(필수적인 것은 아니다). 따라서, 어떤 구체예에서, TSO는 주형에 혼성화하는 영역에 변형을 포함하며, 주어진 세트의 조건하에 TSO는 변형이 없는 TSO와 비교하여 이 영역에 더욱 단단히 결합한다. 적합한 변형의 예가 본원에 제공된다. 어떤 구체예에서, 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 차단 서열이며, 이것은 TSO처럼 주형과의 결합을 강화시키기 위한 1개 이상의 변형을 함유할 수 있다. 따라서, 어떤 구체예에서, 차단인자 서열은 주형에 혼성화하는 영역에 변형을 포함하며, 주어진 세트의 조건하에 차단인자는 변형이 없는 차단인자와 비교하여 이 영역에 더욱 단단히 결합한다. 적합한 변형의 예가 본원에 제공된다.
방법 및 조성물에 사용될 수 있는 효소가 본원에 설명된다. 예를 들어, RNA를 절단하는 효소는 RNaseH일 수 있다.
어떤 양태로서, TSO는 프로프로모터 기능을 제공하며, 또한 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역(이것은 프로모터에 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있다)을 포함한다. 다른 구체예에서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 3'-단부에 있는 영역을 포함하며, 이로써 치환된 확장 생성물의 DNA 중합효소 확장이 전사가 일어나는 이중가닥 프로모터를 생성한다. 어떤 구체예에서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 PTO이다.
이 방법은, 예를 들어 게놈 DNA 및 cDNA를 포함하여, 어떤 DNA 표적을 증폭하는데 적용할 수 있다. 1 단계 이상이 조합될 수 있으며, 및/또는 연속적으로 수행될 수 있다(필수 생성물(들)이 형성될 수 있는 한, 주로 어떤 순서로).
또한, 본 발명은, 서열화 및 서열 변경(들)의 검출과 같은, 본 발명의 증폭 방법의 생성물을 사용하는(보통, 분석하는) 방법을 제공한다.
따라서, 한 양태로서, 본 발명은 표적 뉴클레오티드 서열을 서열화하는 방법으로서, (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 DNA 주형과 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 혼성화하는 단계; (b) 주형과 복합 프라이머의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 혼성화하는 단계; (c) DNA 중합효소 및 dNTP와 dNTP 유사체 (이것은 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있다)의 혼합물을 사용하여 복합 프라이머를 확장함으로써, 프라이머 확장이 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있는 dNTP 유사체의 결합시 종결되는 단계; (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복할 수 있도록, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 사용하여 아닐된 복합 프라이머의 RNA 부분을 절단하여, 이로써 표적 서열의 상보성 서열의 다중 카피가 다양한 길이로 생성되는 단계; (e) (a)부터 (d) 단계의 생성물을 분석하여 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 표적 뉴클레오티드 서열을 서열화하는 방법으로서, (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 DNA 주형과 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 혼성화하는 단계; (b) 주형과 복합 프라이머의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에서 주형과 종결 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 단계; (c) DNA 중합효소를 사용하여 복합 프라이머를 확장하는 단계; (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복하여 치환된 프라이머 확장 생성물을 생성할 수 있도록, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 사용하여 아닐된 복합 프라이머의 RNA 부분을 절단하는 단계; (e) rNTP 및 rNTP 유사체(이것은 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있다)를 사용하고, RNA 중합효소에 의해 확장 생성물로부터 전사가 일어나도록 하는 조건하에서, 5'-단부에 있는 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼성화함으로써, 치환된 프라이머 확장 생성물에 상보하는 서열을 포함하는 RNA 전사체를 생성하고, 전사가 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있는 rNTP 유사체의 결합시 종결되어, 이로써 표적 서열의 다중 카피가 다양한 길이로 생성되는 단계; (f) (a)부터 (e) 단계의 생성물을 분석하여 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
어떤 양태로서, 본 발명은 표적 서열을 특성화하거나, 또는 분석하는 방법을 제공한다. 어떤 양태는 복합 프라이머의 RNA 부분을 기초로 하며, 따라서 그 결과는, 상보하거나 또는 충분히 상보성이라면, 복합 프라이머의 RNA 부분에 혼성화하는 표적의 상응하는 영역에 관한 정보를 반영한다. 기준 표적 서열에 대해 동일한 증폭 반응을 수행한 때의 생성물의 양과 비교한 생성물의 양이 어떤 서열의 존재 또는 부재를 나타내고, 이것은 차례로 야생형, 돌연변이 또는 대립유전자 변이체의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있다. 다양한 서열 결실의 구체예가 본원에 설명된다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 본원에 설명된 증폭 방법을 수행하는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 영역에 있는 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하며, 여기에서 표적 뉴클레오티드 서열의 영역은 복합 프라이머의 RNA 부분에 상응하고, 표적 뉴클레오티드에 있는 돌연변이는, 돌연변이를 포함하지 않는 복합 프라이머의 RNA 부분에 상응하는 영역을 포함하는 기준 주형으로부터 생성된 증폭 생성물의 양과 비교하여, 검출가능한 더 적은 증폭 생성물을 가져온다. 이들 구체예에서, 가닥 치환에 의한 증폭은 돌연변이를 함유하지 않는 복합 프라이머의 RNA 부분에 상응하는 영역을 포함하는 기준 주형으로부터의 생성과 비교하여 감소된다(복합 프라이머의 RNA 부분과 비교하여).
따라서, 본 발명은 표적 뉴클레오티드에 있는 관심의 서열을 특성화하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 증폭 방법을 수행하는 것을 포함하며, 여기에서 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열은 공지이고, (a) 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보하는 영역을 포함하는 기준 주형으로부터의 증폭 생성물의 양과 비교하여, 주형으로부터 검출가능한 더 적은 증폭 생성물의 생성은 표적 폴리뉴클레오티드가 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보하는 서열을 포함하지 않으며, 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보하는 서열에 관한 서열 변이체라는 것을 나타내거나; 또는 (b) 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보하는 영역을 포함하지 않는 기준 주형으로부터의 증폭 생성물의 양과 비교하여, 주형으로부터 검출가능한 더 많은 증폭 생성물의 생성은 표적 폴리뉴클레오티드가 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보하는 서열을 포함하며, 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보하는 서열에 관한 서열 변이체가 아니라는 것을 나타낸다. 한 구체예에서, 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열은 야생형 서열을 포함하고, 관심의 서열은 야생형 서열의 존재 또는 부재를 측정하면서 특성화된다. 다른 구체예에서, 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열은 돌연변이 서열을 포함하고, 관심의 서열은 돌연변이 서열의 존재 또는 부재를 측정하면서 특성화된다. 또 다른 구체예에서, 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열은 대립유전자 서열을 포함하고, 관심의 서열은 대립유전자 서열의 존재 또는 부재를 측정하면서 특성화된다.
다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본원에 설명된 증폭 방법을 수행하는 단계; 및 (b) 단일가닥 입체구조에 관한 증폭 방법의 증폭 생성물을 분석하는 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드에 있는 돌연변이를 검출하는(또는, 어떤 양태로서, 서열을 특성화하는) 방법을 제공하며, 여기에서 기준 단일가닥 폴리뉴클레오티드와 비교한 입체구조의 차이가 표적 폴리뉴클레오티드에 있는 돌연변이를 나타낸다. 다른 구체예에서, 본 발명은 단일가닥 입체구조에 대해 본원에 설명된 방법 중 어느 것의 증폭 생성물을 분석하는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드에 있는 돌연변이를 검출하는(또는, 어떤 양태로서, 서열을 특성화하는) 방법을 제공하며, 여기에서 기준 단일가닥 폴리뉴클레오티드와 비교한 입체구조의 차이가 표적 폴리뉴클레오티드에 있는 돌연변이를 나타낸다(또는, 어떤 양태로서, 표적 서열을 특성화한다).
다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본원에 설명된 증폭 방법을 수행하는 단계; 및 (b) 고체 기판위에 증폭 생성물을 부착하여 증폭 생성물의 마이크로어레이를 제작하는 단계를 포함하는, 마이크로어레이를 제조하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 마이크로어레이는 고체 기판위에 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 의한 증폭 생성물을 부착하여 증폭 생성물의 마이크로어레이를 제작함으로써 제조된다.
이들 적용 중 어느 것은 본원에 설명된 바와 같은 증폭 방법(여러가지 성분 및 이 성분들 중 어느 것의 다양한 구체예를 포함하는) 중 어느 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 사용되는 복합 프라이머는 5' RNA 부분을 가질 수 있고, 이것은 3' DNA 부분에 인접해 있을 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 설명된 증폭 방법에 사용되는 여러가지 성분(및 이 성분들의 다양한 조합)을 포함하는, 조성물, 키트, 복합체, 반응 혼합물 및 시스템을 제공한다. 한 양태로서, 예를 들어, 본 발명은 3' DNA 부분 및 5' RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 5' RNA 부분은 3' DNA 부분에 인접해 있다. 또 다른 구체예에서, 5' RNA 부분은 약 5 내지 약 20 뉴클레오티드이고, 3' DNA 부분은 약 5 내지 약 15 뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 TSO를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 TSO는 주형에 혼성화하는 영역에 변형을 포함하고, 주어진 세트의 조건하에 TSO는 변형이 없는 TSO와 비교하여 이 영역에 더욱 단단히 결합한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 설명된 어떤 복합 프라이머 및 TSO를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은, 주형과의 결합을 강화시키는 변형을 함유하는 것들을 포함하여, 본원에 설명된 복합 프라이머 중 어느 것 및 본원에 설명된 어떤 차단 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 설명된 복합 프라이머 중 어느 것 및 PTO를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 복합체(이것은 일반적으로 최종 증폭 생성물에 관한 중간체로서 고려된다) 중 어느 것을 포함하는 조성물을 제공한다 (이들 다양한 복합체를 도식적으로 묘사한 도면 참조). 예를 들어, 본 발명은 (a) 주형 가닥; 및 (b) 3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 복합체는 종결 서열(이것은, 예를 들어, TSO 또는 차단 서열일 수 있다)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 복합체는 PTO를 더 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 성분들의 다양한 조합을 함유하는 반응 혼합물(또는 반응 혼합물을 포함하는 조성물)을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 (a) 폴리뉴클레오티드 주형; (b) 3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머; 및 (c) DNA 중합효소를 포함하는 반응 혼합물을 제공한다. 본원에 설명된 바와 같이, 3' DNA 부분에 인접한 5' RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 포함하여, 복합 프라이머 중 어느 것(또는 복수의 복합 프라이머)이 반응 혼합물에 있을 수 있다. 또한, 반응 혼합물은 RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 RNaseH와 같은 효소를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 반응 혼합물은 본원에 설명된 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것, 그리고 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 RNA 중합효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 반응 혼합물은 또한 PTO를 포함할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 방법을 수행하는 키트를 제공한다. 적합한 패키지 상태이고 일반적으로(필수적인 것은 아니다) 적합한 지시사항을 함유하는 이들 키트는 증폭 방법에 사용되는 1개 이상의 성분을 함유한다. 예를 들어, 본 발명은 3' DNA 부분 및 RNA 부분(이것은 5'일 수 있으며, 더 이상으로 3' DNA 부분에 인접해 있을 수 있다)을 포함하는 복합 프라이머를 포함하는 키트를 제공한다. 키트에 있는 복합 프라이머는 본원에 설명된 어느 것일 수 있다. 키트는 (a) 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b) 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드; (c) RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소(예를 들어, RNaseH)와 같은, 본원에 설명된 효소 중 어느 것; 및 (d) 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것과 같은, 더 이상의 성분을 함유할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 증폭 방법을 행하는 시스템을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 (a) 3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머; (b) DNA 중합효소; 및 (c) RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소(예를 들어, RNaseH)를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그것의 보체를 증폭하는 시스템을 제공한다. 복합 프라이머는, 3' DNA 부분에 인접한 5' RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 포함하여, 본원에 설명된 어느 것(1개 이상) 일 수 있다.
(본 발명을 수행하는 방식)
본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 이 방법은 RNA/DNA 복합 프라이머, 선택적으로 종결 서열, 및 전사가 사용되는 구체예에 있어 프로프로모터 올리고뉴클레오티드 서열의 사용을 일반적으로 포함한다.
일반적 개요로서, 증폭 방법은 다음과 같이 행한다: 복합 RNA/DNA 프라이머가 표적 서열의 복제에 대한 베이스를 형성한다. 어떤 구체예에서, 종결 서열이 표적 가닥을 따르는 더 이상의 복제를 우회 또는 차단함으로써 복제의 종점에 대한 베이스를 제공한다. 하기 설명된 바와 같이, 어떤 구체예에서, 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)이며, 이것은 주형 가닥에 혼성화하기에는 상보성이 충분하지 않은 서열을 함유한다. DNA 중합효소가 프라이머로부터 표적 서열의 카피를 행한다. 다른 복합 프라이머에 의한 결합에 이용할 수 있는 주형 가닥상의 서열은 그대로 두면서, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소(예를 들어, RNaseH)가 혼성체로부터 RNA 서열을 절단(제거)한다. 다른 가닥이 DNA 중합효소에 의해 생성되고, 이것이 이전에 복제된 가닥을 치환하여, 치환된 확장 생성물을 가져온다. 선택적으로, 치환 확장 생성물의 3'-단부에 혼성화하기에 충분히 상보성인 서열을 함유하고, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드(이것은, 예를 들어, 주형 스위치 올리고뉴클레오티드 또는 프로프로모터 주형 올리고뉴클레오티드일 수 있다)가 치환된 프라이머 확장 생성물에 결합한다. 프로모터는 전사를 추진하여 (DNA-의존성 RNA 중합효소에 의하여) 센스 RNA 생성물을 생성한다.
따라서, 본 발명은 (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 표적 폴리뉴클레오티드; (b) RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머; (c) DNA 중합효소; (d) 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 적합한 유사체; 및 (e) RNA/DNA 듀플렉스로부터 RNA를 절단하는 RNaseH와 같은 효소; 및 (f) 일반적으로, 그러나 선택적으로, 주형 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 부분(또는 영역)을 포함하는 본원에 설명된 것들 중 어느 것과 같은 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 조합하고 반응시키는 것을 포함하는, 적어도 1개의 표적 폴리뉴클레오티드 서열 카피를 제조하는 방법(일반적으로, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하는 방법)을 제공한다. 종결 서열은 전사-기초 증폭(아래 참조)이 또한 사용되는 경우에 사용된다. 이 조합은 적합한 조건에 종속되며, 이로써 (a) 복합 프라이머(및, 선택적으로 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드)가 주형에 혼성화하고; (b) 프라이머 확장이 복합 프라이머로부터 일어나 듀플렉스를 형성하고; (c) RNaseH가 RNA/DNA 듀플렉스로부터 복합 프라이머의 RNA를 절단하고; (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고, 또 다른 라운드의 프라이머 확장(DNA 중합효소에 의해 매개된)이 일어나, 주형으로부터 이전에 카피된 가닥을 치환한다.
선택적으로, 적합한 조건하에서, (e) 프로프로모터 서열(이것은, 본원에 설명된 바와 같이, 다수의 형태 중 어느 것일 수 있다) 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (f) 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 적합한 유사체; 및 (g) RNA 중합효소가 증폭 반응에 또한 포함되며, 이로써 치환된 가닥의 전사가 일어날 수 있다. 본 발명의 방법의 여러가지 성분들에 관한 세부사항이 아래에 제공된다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 핵산(DNA 또는 RNA)을 서열화하는 방법을 제공한다. 서열화 방법에 있어서, 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있는 적합한 dNTP(또는, 전사-기초 증폭에 의지하는 구체예가 사용되는 경우, 적합한 rNTP)가 사용된다. 따라서, 본 발명은 상술된 방법을 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열을 서열화하는 방법을 제공하며, 여기에서는 프라이머 신장 종결인자인 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있는 dNTP 및 dNTP 유사체, 및/또는 프라이머 신장 종결인자인 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있는 rNTP 및 rNTP 유사체가 사용되고, 증폭 생성물이 아래 설명된 바와 같이 서열 정보에 대해 분석된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 핵산 서열 돌연변이를 검출하는 방법 및/또는 표적 서열(들)을 특성화하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드에 돌연변이의 존재 또는 부재는, 본 발명의 방법을 사용하여 RNA 부분이 돌연변이된 서열을 함유하거나 또는 이것이 결여된 복합 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 능력을 기초로 하여 검출된다. 다른 구체예에서, 증폭 생성물은 특이적 프로브와의 혼성화에 의한 돌연변이의 검출에 사용된다. 또 다른 구체예에서, 증폭 생성물은 표적 폴리뉴클레오티드에서 단일가닥 입체구조 다형성을 검출 및/또는 확인하는데 사용된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 선형 또는 증대된 선형 핵산 증폭 방법의 증폭 생성물을 사용하여 핵산(DNA 또는 RNA)의 마이크로어레이를 생성하는 방법을 제공한다.
본원에 설명된 증폭 생성물을 사용하는 다른 방법이 아래에 제공된다.
본 발명의 증폭 방법의 이점
본 발명의 증폭 방법은 다른 핵산 증폭 방법을 능가하는 몇가지 의미 있는 이점을 제공한다. 프라임된 주형의 형성, 프라이머 확장 및 이전에 생성된 확장 생성물의 치환은 리보뉴클레아제 활성에 의한 혼성화된 프라이머의 RNA 부분의 절단에 의존한다. 따라서, 프라이머 확장 생성물은 프라이머의 5'-말단(5'-most) 부분이 결여되어 있다. 결과적으로, 확장 생성물과 주형 스위치 올리고뉴클레오티드, 또는 프로모터 주형 올리고뉴클레오티드의 복합체로부터 생성된 RNA 전사 생성물은 이 부분의 프라이머에 상보하는 서열을 그것의 3'-단부에 함유하지 않는다. 따라서, 증폭 생성물은 생산적인 증폭을 위해 프라이머에 혼성화할 수 없으며, 이로써 이전 증폭 반응에 의해 생성된 생성물로의 오염으로 인한 비-특이적 증폭에 내성인 본 발명의 증폭 방법을 만든다. 이 특징은 본 발명을 PCR, NASBA 등과 같은 다른 공지의 표적 증폭 방법과 명백히 구별하며, 본 발명의 방법을 임상 연구소에서 통상 사용되는 오픈 튜브 플랫폼, 고처리량 시험 부위 등에 적합하게 한다.
표적 핵산 서열의 증폭을 더 이상 진행시키기 위한, RNaseH와 같은 리보뉴클레아제에 의한, 혼성화되고 확장된 형태에 있는 복합 프라이머의 RNA 부분의 절단에 대한 독특한 필요는 DNA 표적에 대한 독점적인 증폭을 가져온다. 따라서, 과량의 mRNA의 존재하에 게놈 DNA 표적 증폭을 위해 본 발명의 방법을 사용하는 것을 가능하게 한다. 이 특징은 유전자 양(dosage)의 정확한 정량에 유용하다. 시험 표적 핵산 서열이 RNA인 경우, 표적은 먼저 전사되어 cDNA를 생성하며, 이것이 본 발명의 방법을 사용하여 증폭될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 주형에 관하여 높은 정확성을 갖는 표적 핵산의 증폭을 제공한다. 각 증폭 생성물은 인풋 주형 DNA(선형 증폭 방법에서), 또는 인풋 주형 DNA 및 인풋 주형 DNA의 프라이머 확장 생성물(증대된 선형 증폭 방법에서)에 있는 표적 서열의 직접적 카피이다.
본 발명의 방법은 증폭이 등온적으로 수행될 수 있다는 점에서 열순환이 필요하지 않다. 이 특징은 고처리량 증폭 및/또는 핵산의 분석을 위한 자동화 및 적합화를 용이하게 한다는 것을 포함하여, 수많은 이점을 제공하다. 예를 들어, 본 발명의 증폭 방법을 기초로 하는 서열화 방법은 반응을 등온적으로 수행하는 능력에 의해 단순해진다. 보고된 다른 방법들은 표적 서열로부터 프라이머 확장 생성물을 분리하기 위한 열순환이 필요하다. 등온 반응은 열순환에 의해 제공되는 반응 보다 빠르고, 소형화된 장치에서 표적 핵산의 서열화를 수행하는데 적합하다.
본 발명 방법의 또 다른 이점은 단지 단일 프라이머만이 필요하다는 것이다. 단일 프라이머는 주형 핵산의 증폭을 가져오는 단향성 프라이머 확장을 제공하기 위해 이용된다. 이것은 프라이머쌍을 사용해야 하는데 관련된 수많은 단점, 예를 들어 2 세트의 프라이머를 디자인하고 제작하는 비용, 주형 핵산내에 있는 추가의 서열 영역에 대한 선행 지식을 가져야 할 필요성, 및 증폭된 생성물이 비-특이적 프라이밍의 결과일 증가된 가능성을 미연에 방지한다.
또한, 본 발명의 선형 등옥 증폭 방법은 핵산 표적의 검출, 규정된 핵산 서열의 정량, 및 규정된 핵산 서열용 프로브의 생성에 사용하는데 적합하다. 본 발명의 방법은 핵산 서열의 정량적 검출, 표적 핵산 서열의 양의 정량적 측정, 유전자형화에 요구되는 규정된 서열 변경 존재의 검출, 및 서열화에 유용하다. 본 발명의 방법에 따르는 증폭 생성물은 단일가닥이며, 다양한 공지된 핵산 검출 방법에 의해 쉽게 검출가능하다.
더 이상으로, 본 발명의 방법은 핵산 서열의 다중가닥 분석에 유용하다. 다시 말해서, 다양한 표적 서열이 한 반응 혼합물에서 동시에 증폭될 수 있다. 다양한 표적 서열은 단일 게놈 DNA의 일부일 수 있거나, 또는 다양한 핵산 표적의 특이적 서열을 나타낼 수 있으며, 이것은 한 시험 샘플에 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 한 생물학적 샘플에 있는 다양한 병원균 존재의 검출에 유용하다. 유사하게, 한 게놈 DNA 샘플에 있는 다양한 다형성 부위의 측정이 한 반응에서 동시에 측정될 수 있다.
본원에 설명된 모든 구체예와 관련하여, 일반적으로 성분 또는 양태를 "포함하는"과 같이, 본 발명이 또한 이들 성분 또는 양태로 "본질적으로 구성되는" 구체예를 포함한다는 것이 이해된다. 또한, 본 발명은 이들 성분 또는 양태로 "구성되는" 구체예를 포함한다. 이것은 본원에 설명된 모든 구체예에 적용된다.
일반적 기술
본 발명의 실행은, 달리 나타내지 않는다면, 분자생물학(재조합 기술을 포함하는), 미생물학, 세포생물학, 생화학, 및 면역학에 관한 종래의 기술을 사용할 것이며, 이것들은 본 분야의 범위내이다. 그러한 기술은 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd edition(Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis"(M. J. Gait, ed. 1984); "Animal Cell Culture"(R. I. Freshney, ed. 1987); "Methods in Enzymology"(Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology"(F. M. Ausubel et al. eds. 1987, 정기적 업데이트); "PCR: The Polymerase Chain Reaction"(Mullis et al. eds. 1994)와 같은 문헌에 충분히 설명된다.
본 발명에 사용되는 프라이머, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 본 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
정의
본원에 설명된 바와 같은, "표적 서열"은 증폭하기 원하는 관심의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 표적 서열은 그것의 실제 서열에 대해, 공지이거나 또는 미공지일 수 있다. 어떤 경우에, 용어 "표적 서열", "주형 DNA", "주형 폴리뉴클레오티드", "표적 핵산", "표적 폴리뉴클레오티드" 및 그것들의 변형은 상호 교환가능하게 사용된다.
본원에 설명된 바와 같은, "증폭"은 일반적으로 원하는 서열의 다중 카피를 생성하는 과정으로 간주된다. "다중 카피"는 적어도 2개의 카피를 의미한다. "카피"는 필수적으로 완전한 서열 상보성을 의미하거나, 또는 주형 서열과 동일한 것은 아니다. 예를 들어, 카피는 디옥시이노신과 같은 뉴클레오티드 유사체, 고의적 서열 변경(주형에 혼성화할 수 있지만 상보하지는 않는 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입된 서열 변경과 같은), 및/또는 증폭중에 발생한 서열 오차를 포함할 수 있다.
본원에서 상호 교환가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 어떤 길이의 뉴클레오티드의 중합체로 간주하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그것들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체에 결합될 수 있는 어떤 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 그것들의 유사체와 같은, 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 회합 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 인터럽트될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지 성분과의 콘쥬게이션에 의한 것과 같이, 중합 후에 더 변형될 수 있다. 다른 종류의 변형은, "모자", 예를 들어 자연발생한 뉴클레오티드 중 1개 이상의 유사체로의 치환, 예를 들어 하전되지 않은 결합(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 결합 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들, 예를 들어 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-리신 등)과 같은 펜던트 부분을 함유하는 것들, 개재인자(예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것들, 킬레이트제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)을 함유하는 것들, 알킬화제를 함유하는 것들, 변형된 결합(예를 들어, α-아노머 핵산 등)을 갖는 것들과 같은 뉴클레오티드간 변형, 그리고 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 더 이상으로, 대개 당에 존재하는 히드록실기 중 어느 것이, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기로 교환되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 추가의 결합을 만들도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 콘쥬게이트될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 포스포릴화되거나, 또는 1 내지 20 탄소원자의 아민 또는 유기 모자기 부분으로 치환될 수 있다. 또한, 다른 히드록실이 표준 보호기에서 유도될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스를 포함하여, 일반적으로 본 분야에 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 디옥시리보스 당, 탄소환식 당 유사체, α-아노머 당, 아라비노스, 크실로스 또는 리소스와 같은 에피머 당, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵튤로스, 아크릴 유사체 및 메틸 리보시드와 같은 아바스 뉴클레오시드 유사체를 함유할 수 있다. 이들 다른 결합기는, 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈")로 교환되는 구체예를 포함하며, 여기에서 각 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알켄일, 시클로알킬, 시클로알켄일 또는 아랄딜을 선택적으로 함유하는 치환 또는 비치환 알킬(1 내지 20 C)이다. 폴리뉴클레오티드에 있는 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여, 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용한다.
본원에 사용된 바와 같은, "올리고뉴클레오티드"는 필수적이지는 않지만 일반적으로 길이가 약 200 뉴클레오티드 미만인, 짧은 일반적으로 단일가닥인 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드로 일반적으로 간주된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 복합 프라이머, TSO, PTO 및 차단인자 서열을 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오티드에도 동일하고 완전하게 적용할 수 있다.
"프라이머"는 표적 서열과의 혼성화에 의해 관심의 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적에 결합하고, 그 후에 표적에 상보하는 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진하는, 일반적으로 3'-OH 기가 없는 일반적으로 짧은 단일가닥 폴리뉴클레오티드이다.
본원에 상호 교환가능하게 사용된 바와 같은, "종결 폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "종결 서열"은 표적 서열을 포함하는 주형에 관한 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제를 중지시키는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 종결 서열은, 일반적으로 종결 지점(부위)까지 5' 위치에서 주형에 혼성화하는 부분(또는 영역)을 포함한다. 혼성화가능한 부분은 전체 종결 서열을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 적합한 종결 폴리뉴클레오티드 서열(차단인자 서열 또는 TSO와 같은)의 예가 본원에 제공된다.
본원에 상호 교환가능하게 사용된 바와 같은, "차단인자 서열" 또는 "차단 서열"은 종결 서열의 예로서, 일반적으로 높은 친화성으로 종결 부위까지 5' 위치에서 주형 핵산에 결합하고, 표적 서열을 포함하는 주형에 관한 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제를 중지시키는 올리고뉴클레오티드로 간주된다. 그것의 3'-단부는 DNA 중합효소에 의한 확장에 대해 차단될 수 있거나 또는 차단되지 않을 수 있다.
본원에 상호 교환가능하게 사용된 바와 같은 "종결 부위" 또는 "종결 지점"은 중합(일반적으로, 프라이머 확장)의 종결 또는 주형 스위치 전에 DNA 중합효소에 의해 최종 복제된 주형의 부위, 지점 또는 영역으로 간주된다. 예를 들어, TSO와 관련하여, 그것은 주형 폴리뉴클레오티드에서 TSO의 비혼성화된 부분으로 주형을 스위치하기 전의 프라이머 확장 생성물의 3'-단부에 상보하는 표적 서열의 위치 또는 영역이다.
본원에 사용된 바와 같은, "프로토프로모터 서열" 및 "프로프로모터 서열"은 단일가닥 DNA 서열 영역으로 간주되며, 이것은 이중가닥 형태로 RNA 전사를 매개할 수 있다. 어떤 문맥에서는 "프로토프로모터 서열", "프로토프로모터", "프로프로모터 서열", 및 "프로모터"가 상호 교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, "주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)"는 프라이머 확장의 종결 부위까지 5' 위치에서 주형에 혼성화가능한 부분(또는 영역)을 포함하고, DNA 중합효소에 의한 프라이머 확장 과정에서 주형 스위치를 행할 수 있는 올리고뉴클레오티드로 간주된다. TSO가 일반적으로 본 분야에 공지된다. "주형 스위치"는 한 라운드의 프라이머 확장 과정 동안, 일반적으로 표적 핵산에서 TSO의 비혼성화된 부분으로의, 주형 핵산의 변화로 간주한다.
본원에 사용된 바와 같은, "프로프로모터 주형 올리고뉴클레오티드(PTO)"는 프로프로모터 서열 및 프라이머 확장 생성물의 3' 영역에 혼성화가능한 부분(일반적으로 3' 부분)을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 간주된다. 프로프로모터 서열 및 혼성화가능한 부분은 동일하거나, 다르거나 또는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드에 부분적으로 일치할 수 있다.
복합 프라이머의 RNA 부분과 같은, 제 2 서열에 "상응하는" 제 1 서열은 제 1 서열이 제 2 서열과 관련하여 의미 있는 서열 동일성을 가진다는 것을 의미한다. 이 용어는 일반적으로 돌연변이의 검출 또는 표적 서열의 특성화와 관련하여 사용된다.
"억제"하는 것은 기준과 비교하여 활성, 기능 및/또는 양을 감소시키거나 또는 줄이는 것이다.
"복합체"는 성분들의 회합이다. 복합체는 안정하거나 또는 안정하지 않을 수 있고, 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같이, 어떤 반응 성분 및 반응 생성물(들)의 종류가 주어지면, 복합체의 존재가 추론될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 복합체는 일반적으로 최종 증폭 생성물(들)에 관한 중간체이다.
본원에 상호 교환가능하게 사용된 바와 같은, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 "부분" 또는 "영역"은 연속하는 2개 이상의 염기 서열이다. 다른 구체예에서, 영역 또는 부분은 적어도 약 3, 5, 10, 15, 20, 25 연속 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
다른 서열에 "인접"해 있는 영역, 부분 또는 서열은 그 영역, 부분 또는 서열에 직접적으로 접해 있다. 예를 들어, 복합 프라이머의 5' DNA 부분에 인접한 RNA 부분은 그 영역에 직접적으로 접해 있다. 이것의 실례는 도 1a 내지 도 1c 참조.
"반응 혼합물"은 성분들의 집합이며, 이것은 적합한 조건하에서 반응하여 복합체(이것은 중간체일 수 있다) 및/또는 생성물(들)을 형성한다.
"어떤" 및 "이" 등은 달리 나타내지 않는다면, 복수형을 포함한다.
"포함하는"은 포함하는 것을 의미한다.
혼성화, 가닥 확장 등과 같은 사건이 일어나도록 "허용하는" 조건 또는 사건이 일어나기에 적합한 조건, 또는 "적합한" 조건은 그러한 사건이 일어나는 것을 방해하지 않는 조건이다. 따라서, 이들 조건은 사건을 허락하고, 사건을 증대시키고, 사건을 용이하게 하고, 및/또는 사건에 이바지한다. 본 분야에 공지되고 본원에 설명된 그러한 조건은, 예를 들어 뉴클레오티드 서열, 온도 및 완충액 조건에 의존한다. 또한, 이들 조건은 혼성화, 절단, 가닥 확장 또는 전사와 같은, 원하는 사건에 의존한다.
본원에 설명된 바와 같은, 서열 "돌연변이"는 기준 서열과 비교하여 관심의 서열에 있는 어떤 서열 변경으로 간주한다. 기준 서열은 야생형 서열 또는 관심의 서열과 비교하고 싶은 서열일 수 있다. 서열 돌연변이는 치환, 결실 또는 삽입과 같은 메카니즘으로 인한, 단일 뉴클레오티드 변화, 또는 서열에 있는 1개 이상의 뉴클레오티드 변경을 포함한다. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이 또한 본원에 설명된 바와 같은 서열 돌연변이이다.
본원에 사용된 바와 같은, "단일가닥 입체구조 다형성" 및 "SSCP"는 일반적으로 그것의 특이적 핵산 서열에 의해 영향을 받는 단일가닥 핵산의 특이적 입체구조로 간주된다. 단일 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입과 같은 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 서열 변경은 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 입체구조의 변화 또는 다형성을 가져온다. 폴리뉴클레오티드의 입체구조는 일반적으로 겔 전기영동에 의해 측정된 바의 전기영동도, 모세관 전기영동 및/또는 엔도뉴클레아제 소화에 대한 감수성과 같은, 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 검출가능하고, 확인가능하고 및/또는 구별가능하다.
본원에 상호 교환가능하게 사용된 바와 같은, "마이크로어레이" 및 "어레이"는 집중된 위치에 있는 뉴클레오티드 서열 콜렉션의 배열로 간주한다. 어레이는 유리 슬라이드와 같은 고체 기판 위에, 또는 니트로셀룰로스 멤브레인과 같은 반고체 기판 위에 있을 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA, 또는 그것들의 어떤 과돌연변이일 수 있다.
용어 "3'"은 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 있는 다른 영역 또는 위치로부터 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 3' (하류)에 있는 영역 또는 위치로 간주한다.
용어 "5'"는 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 있는 다른 영역 또는 위치로부터 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 5' (상류)에 있는 영역 또는 위치로 간주한다.
용어 "3' DNA 부분", "3' DNA 영역", "3' RNA 부분" 및 "3' RNA 영역"은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 3'-단부를 향해 위치한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 부분 또는 영역으로 간주하며, 3'-말단(3'-most) 뉴클레오티드(들) 또는 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오티드에 부착된 부분을 포함할 수 있거나 또는 포함할 수 없다. 3'-말단 뉴클레오티드(들)은 바람직하게 약 1 내지 약 20, 더 바람직하게 약 3 내지 약 18, 더욱 더 바람직하게 약 5 내지 약 15 뉴클레오티드일 수 있다.
용어 "5' DNA 부분", "5' DNA 영역", "5' RNA 부분" 및 "5' RNA 영역"은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5'-단부를 향해 위치한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 부분 또는 영역으로 간주하며, 5'-말단 뉴클레오티드(들) 또는 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드에 부착된 부분을 포함할 수 있거나 또는 포함할 수 없다. 5'-말단 뉴클레오티드(들)은 바람직하게 약 1 내지 약 20, 더 바람직하게 약 3 내지 약 18, 더욱 더 바람직하게 약 5 내지 약 15 뉴클레오티드일 수 있다.
"검출"은 직접 및 간접 검출을 포함하여, 어떤 검출 수단을 포함한다. 예를 들어, "검출가능한 더 적은" 생성물은 직접적으로 또는 간접적으로 관찰될 수 있으며, 이 용어는 어떤 감소(생성물이 없는 것을 포함하여)를 나타낸다. 유사하게, "검출가능한 더 많은" 생성물은 직접적으로 또는 간접적으로 관찰되는 어떤 증가를 의미한다.
본 발명의 방법에 사용되는 성분 및 반응 조건
주형 핵산
증폭되는 핵산(NA) 표적은 정제된 또는 미정제된 형태의 어떤 공급원으로부터의 핵산을 포함하며, 이것은 tRNA, mRNA, rRNA, 미토콘드리아 DNA 및 RNA, 엽록체 DNA 및 RNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 그것들의 혼합물을 포함하는 DNA(dsDNA 및 ssDNA) 또는 RNA, 유전자, 염색체, 플라스미드, 미생물과 같은 생물학적 물질의 게놈, 박테리아, 이스트, 바이러스, 비로이드, 곰팡이, 진균, 식물, 동물, 사람 및 그것들의 단편일 수 있다. 핵산을 얻고 정제하는 것은 본 분야의 표준 기술을 사용한다. RNA 표적의 증폭은 본 분야에 개시된 바와 같은, 초기 cDNA 합성이 필요할 것이다. DNA-RNA 혼성체의 증폭은 ssDNA를 얻기 위한 혼성체의 변성, 또는 변성에 이어지는 cDNA를 얻기 위한 역전사가 필요할 것이다. 표적 핵산은 생물학적 샘플과 같은 복합체 혼합물의 단지 부차적인 부분일 수 있으며, 본 분야에 잘 공지된 과정에 의해 다양한 생물학적 물질로부터 얻어질 수 있다.
표적 핵산 서열 증폭의 초기 단계는 표적 단일가닥을 만드는 것이다. 만일 표적 핵산이 이중가닥(ds) DNA라면, 초기 단계는 표적 변성이다. 변성 단계는 열변성 또는 알칼리 처리와 같은 본 분야에 공지된 어떤 다른 방법일 수 있다. 만일 표적이 RNA라면, 초기 단계는 단일가닥 cDNA의 합성일 수 있다. RNA로부터 cDNA의 합성 기술은 본 분야에 공지되어 있다.
복합 프라이머
본 발명의 증폭 방법은 RNA 및 DNA 부분으로 이루어진 단일 복합 프라이머를 사용한다. 프라이머의 복합적 디자인은 새로운(추가) 복합 프라이머의 결합에 의한 프라이머 확장 생성물의 이어지는 치환 및 중합효소에 의한 새로운 프라이머의 확장에 중요하다. 여기에 더하여, 프라이머 확장 생성물의 RNA 부분의 절단은, 아래 설명된 바와 같이, 복합 프라이머에 의한 증폭 대상물이 아닌 증폭 생성물의 생성을 가져온다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 복합 프라이머는, (a) DNA 부분(들)과 표적 핵산상의 서열의 혼성화에 독립적인 표적 핵산(주형)상의 서열에 결합(혼성화) 할 수 있고, (b) 표적 DNA에 혼성화된 경우 리보뉴클레아제를 사용하여 절단될 수 있는 적어도 1개의 RNA 부분을 포함한다. 복합 프라이머는 표적 핵산에 결합하여 부분적 이형-듀플렉스를 형성하는데, 여기에서는 단지 프라이머의 RNA 부분만이 RNaseH와 같은 리보뉴클레아제와의 접촉에 의해 절단되는 한편, 표적 가닥은 완전하게 남게됨으로써 다른 복합 프라이머의 아닐링을 가능하게 한다.
또한, 복합 프라이머는 표적 핵산(주형)상의 서열에 혼성화할 수 있는 3' DNA 부분을 포함하며, 이로써 표적 서열(주형)에 대한 복합 프라이머의 혼성화가 DNA 중합효소에 의해 표적 핵산으로부터 치환된 핵산 가닥의 혼성화 이상으로 장려된다. 그러한 프라이머는 서열 길이 및/또는 동일성과 같은, 핵산 결합 친화성에 영향을 미치는 잘 공지된 인자, 그리고 혼성화 조건을 기초로 하여 합리적으로 디자인될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표적 핵산에 있는 상보성 서열에 대한 복합 프라이머의 3' DNA 부분의 혼성화는 치환된 가닥의 5'-단부에 있는 상동성 서열과 표적 핵산의 혼성화 이상으로 장려된다.
중합에 의한 확장에 적합한 프라이머의 생성은, PCT 공보 번호 WO 99/42618(및 본원에 인용된 참고자료)에 설명된 바와 같이, 본 분야에 잘 공지된다. 복합 프라이머는 RNA 및 DNA의 조합(상기 정의 참조)을 포함하며, 3'-단부 뉴클레오티드가 핵산 확장에 적합한 뉴클레오티드이다. 3'-단부 뉴클레오티드는 프라이머가 존재하는 경우, DNA 중합효소에 의해 확장가능한 어떤 뉴클레오티드 또는 유사체일 수 있다. 일반적으로, 3'-단부 뉴클레오티드는 3'-OH를 가진다. 적합한 프라이머는 RNA의 적어도 한부분 및 DNA의 적어도 한부분을 포함하는 것들을 포함한다. 한 유전자에 대해 실시예 5(E. coli J 유전자의 증폭에 사용된 여러가지 프라이머의 상대적 성능을 나타내는)에 나타낸 바와 같이, 복합 프라이머는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분(여기에서, RNA 부분은 3' DNA 부분에 인접해 있다); 또는 RNA 부분이 개재되어 있는 5' 및 3' DNA 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 복합 프라이머는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하며, 바람직하게는 RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있다. 다른 구체예에서, 복합 프라이머는 적어도 1개의 RNA 부분이 개재되어 있는(즉, DNA 부분들 사이의 RNA 부분) 5' 및 3' DNA 부분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 복합 프라이머는 3' DNA 부분 및 적어도 1개의 RNA 부분이 개재되어 있는(즉, DNA 부분들 사이의 RNA 부분)을 포함한다.
3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 RNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 25, 더 바람직하게 약 3 내지 약 20, 더욱 더 바람직하게 약 4 내지 약 15, 가장 바람직하게 약 5 내지 약 10 뉴클레오티드일 수 있다. 3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, RNA 부분은 적어도 약 1, 3, 4, 5 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 10, 15, 20, 25, 30 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 5' RNA 부분의 길이는 바람직하게 약 3 내지 약 25 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 5 내지 약 20 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 7 내지 약 18 뉴클레오티드, 바람직하게 약 8 내지 약 17 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 10 내지 약 15 뉴클레오티드일 수 있다. 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 다른 구체예에서, 5' RNA 부분은 적어도 약 3, 5, 7, 8, 10 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 15, 17, 18, 20 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
비-5' RNA 부분(들)을 더 포함하는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 구체예에서, 비-5' RNA 부분은 바람직하게 약 1 내지 약 7 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 2 내지 약 6 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 3 내지 약 5 뉴클레오티드일 수 있다. 비-5' RNA 부분(들)을 더 포함하는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 비-5' RNA 부분은 적어도 약 1, 2, 3, 5 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 5, 6, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
5' RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 구체예에서, 5' RNA 부분의 길이는 바람직하게 약 3 내지 약 25 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 5 내지 약 20 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 7 내지 약 18 뉴클레오티드, 바람직하게 약 8 내지 약 17 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 10 내지 약 15 뉴클레오티드일 수 있다. 5' RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 5' RNA 부분은 적어도 약 3, 5, 7, 8, 10 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 15, 17, 18, 20 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
적어도 1개의 RNA 부분이 개재되어 있는 5' 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 개재 RNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 7 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 2 내지 약 6 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 3 내지 약 5 뉴클레오티드일 수 있다. 적어도 1개의 RNA 부분이 개재되어 있는 5' 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 개재 RNA 부분은 적어도 약 1, 2, 3, 5 뉴클레오티드 중 어느 것 일 수 있고, 상한선은 약 5, 6, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것이다. 3' DNA 부분 및 적어도 1개의 개재 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 개재 RNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 7 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 2 내지 약 6 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 3 내지 약 5 뉴클레오티드일 수 있다. 3' DNA 부분 및 적어도 1개의 개재 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 개재 RNA 부분은 적어도 약 1, 2, 3, 5 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 5, 6, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것이다. 5' RNA 부분을 더 포함하는 3' DNA 부분 및 적어도 1개의 개재 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에서, 5' RNA 부분은 바람직하게 약 3 내지 약 25 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 5 내지 약 20 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 7 내지 약 18 뉴클레오티드, 바람직하게 약 8 내지 약 17 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 10 내지 약 15 뉴클레오티드일 수 있다. 5' RNA 부분을 더 포함하는 3' DNA 부분 및 적어도 1개의 개재 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에서, 5' RNA 부분은 적어도 약 3, 5, 7, 8, 10 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 15, 17, 18, 20 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 3' DNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 20, 더 바람직하게 약 3 내지 약 18, 더욱 더 바람직하게 약 5 내지 약 15, 가장 바람직하게 약 7 내지 약 12 뉴클레오티드일 수 있다. 3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 3' DNA 부분은 적어도 약 1, 3, 5, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 10, 12, 15, 18, 20, 22 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 3' DNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 20 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 3 내지 약 18 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 5 내지 약 15 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 7 내지 약 12 뉴클레오티드일 수 있다. 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 3' DNA 부분은 적어도 약 1, 3, 5, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 10, 12, 15, 18, 20, 22 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
비-3' DNA 부분(들)을 더 포함하는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 구체예에서, 비-3' DNA 부분은 바람직하게 약 1 내지 약 10 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 2 내지 약 8 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 3 내지 약 6 뉴클레오티드일 수 있다. 비-3' DNA 부분(들)을 더 포함하는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 비-3' DNA 부분은 적어도 약 1, 2, 3, 5 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 6, 8, 10, 12 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
5' RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 구체예에서, 3' DNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 20 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 3 내지 약 18 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 5 내지 약 15 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 7 내지 약 12 뉴클레오티드일 수 있다. 5' RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 프라이머의 어떤 구체예에서, 3' DNA 부분은 적어도 약 1, 3, 5, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 10, 12, 15, 18, 20, 22 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
적어도 1개의 RNA 부분이 개재되어 있는 5' 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 비-3' DNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 10 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 2 내지 약 8 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 3 내지 약 6 뉴클레오티드일 수 있다. 적어도 1개의 RNA 부분이 개재되어 있는 5' 및 3' DNA 부분을 포함하는 프라이머의 어떤 구체예에서, 비-3' DNA 부분은 적어도 약 1, 2, 3, 5 뉴클레오티드 중 어느 것 일 수 있고, 상한선은 약 6, 8, 10, 12 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
적어도 1개의 RNA 부분이 개재되어 있는 5' 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 3' DNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 20 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 3 내지 약 18 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 5 내지 약 15 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 7 내지 약 12 뉴클레오티드일 수 있다. 적어도 1개의 RNA 부분이 개재되어 있는 5' 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 3' DNA 부분은 적어도 약 1, 3, 5, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것 일 수 있고, 상한선은 약 10, 12, 15, 18, 20, 22 뉴클레오티드 중 어느 것이다.
3' DNA 부분 및 적어도 1개의 개재 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 비-3' DNA 부분(즉, 3' DNA 부분 이외의 어떤 DNA 부분)의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 10 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 2 내지 약 8 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 3 내지 약 6 뉴클레오티드일 수 있다. 3' DNA 부분 및 적어도 1개의 개재 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 비-3' DNA 부분은 적어도 약 1, 3, 5, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 6, 8, 10, 12 뉴클레오티드 중 어느 것이다. 3' DNA 부분 및 적어도 1개의 개재 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머에 있는 3' DNA 부분의 길이는 바람직하게 약 1 내지 약 20 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 3 내지 약 18 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 5 내지 약 15 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 7 내지 약 12 뉴클레오티드일 수 있다. 3' DNA 부분 및 적어도 1개의 개재 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머의 어떤 구체예에서, 3' DNA 부분은 적어도 약 1, 3, 5, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 10, 12, 15, 18, 20, 22 뉴클레오티드 중 어느 것이다. 여러가지 부분의 길이는, 본 발명 방법의 반응 조건하에 적합한 바에 따라, 더 크거나 더 작을 수 있다는 것이 이해된다.
어떤 구체예에서, 복합 프라이머의 5' DNA 부분은 프라이머의 5'-말단 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체에에서, 복합 프라이머의 5' RNA 부분은 프라이머의 5'-말단 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 복합 프라이머의 3' DNA 부분은 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체에에서, 3' DNA 부분은 5' RNA 부분에 인접해 있으며, 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드를 포함한다(5' RNA 부분은 프라이머의 5'-말단 뉴클레오티드를 포함한다).
복합 프라이머의 총길이는 바람직하게 약 10 내지 약 40 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 20 내지 약 25 뉴클레오티드일 수 있다. 어떤 구체예에서, 길이는 적어도 약 10, 15, 20, 25 뉴클레오티드 중 어느 것일 수 있고, 상한선은 약 25, 30, 40, 50 뉴클레오티드 중 어느 것이다. 본 발명 방법의 반응 조건하에 적합한 바에 따라, 길이가 더 크거나 더 작을 수 있다는 것이 이해된다.
혼성화(이것은 본 분야에 잘 공지되고 이해된 바대로, 예를 들어 이온 강도 및 온도와 같은 다른 인자에 의존한다)를 달성하기 위해서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 복합 프라이머는 표적 핵산에 대해 바람직하게 적어도 약 60%, 더 바람직하게 적어도 약 75%, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 90%, 가장 바람직하게 적어도 약 95% 상보성이다. 복합 프라이머의 개별 DNA 및 RNA 부분은 표적 핵산에 대해 바람직하게 적어도 약 60%, 더 바람직하게 적어도 약 75%, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 90%, 가장 바람직하게 적어도 약 95% 상보성이다.
본원에 설명된 바와 같은, 1개 이상의 복합 프라이머가 증폭 반응에 사용될 수 있다.
종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
본 발명 방법의 어떤 구체예에서, 특히 전사-기초 증폭이 사용된다면, 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함되며, 이것의 예가 아래 제공된다.
주형 스위치 올리고뉴클레오티드
본 발명의 증폭 방법에 사용될 수 있는 제 2 올리고뉴클레오티드는 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)이다. 한 구체예에서, TSO는 종결 서열로서 기능한다. 다른 구체예에서, TSO는 종결 서열로서 기능하고 프로프로모터 서열을 제공한다.
이전에 설명된 주형 스위치 올리고뉴클레오티드를 기초로 하는 증폭 방법은, 제 2 프라이머의 혼성화, 또는 이 방법이 단일 프라이머 종을 이용하도록 디자인된 경우 동일한 프라이머의 제 2 혼성화 단계의 억제로 인한 이 올리고뉴클레오티드의 농도에서 제한되었다. TSO를 사용하는 이전에 설명된 방법과는 반대로, 주형 스위치 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따르는 증폭을 위해 고농도에서 사용될 수 있다. 이 특징은 올리고뉴클레오티드와 표적 가닥의 효과적인 혼성화를 확실하게 하고, 프라이머 확장 및 주형 스위치의 대상물인 3분자 복합체의 수율을 최대로 한다. 이 특징의 추가적 매력은 RNA 중합효소에 대한 기질을 형성하기 위한 치환된 프라이머 확장 생성물과 주형 스위치 올리고뉴클레오티드의 효과적인 혼성화이다.
TSO는 표적에 혼성화할 수 있는 3' 부분 및 중합 동안의 가닥 스위치를 위해 디자인되는 5' 부분을 포함한다(도 2a 내지 2c 참조). 가닥 스위치를 행하는 TSO의 디자인은 Patel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:2969-2974에 이전에 설명되었던 바와 같이, 본 분야에 공지되어 있다.
3' 부분은 주형 폴리뉴클레오티드에서 TSO의 비혼성화된 부분("종결 부위")으로 주형을 스위치하기 전에 프라이머 확장 생성물의 3'-단부에 상보하는 주형 폴리뉴클레오티드의 위치 또는 영역까지 5' 위치에서 주형에 혼성화한다.
한 구체예에서, 가닥 치환은 TSO의 혼성화된 부분과 비혼성화된 부분 사이의 접합부에 5' 및 3' 인접하여 TSO 세그먼트에 있는 상호적으로 상보하는 짧은 서열의 존재에 의해 촉진된다. 이론에 결부시킬 의도는 없으나, 한 설명은 프라이머 확장 생성물이 TSO에 혼성화된 표적 핵산의 부분으로 확장되는 사건(TSO의 혼성화된 부분의 치환을 통해)에서, 프라이머 확장 생성물의 3'-단부는 TSO의 혼성화된 부분과 비혼성화된 부분 사이의 접합부에 바로 인접한 TSO의 세그먼트에 있는 짧은 서열의 상보성 짧은 서열에 결합할 수 있는 짧은 서열을 포함할 것이라는 것이다. 이것은 프라이머 확장 생성물이 주형으로서 TSO 꼬리 부분으로 스위치할 가능성을 증가시킴으로써 주형 스위치의 효율을 증가시킨다. 짧은 상보성 서열의 길이는 바람직하게 약 3 내지 약 20 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 5 내지 약 15 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 7 내지 약 10 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 길이는 적어도 약 1, 3, 5, 7, 10 뉴클레오티드 중 어느 것이고, 상한선은 약 10, 15, 20, 25 뉴클레오티드 중 어느 것이다. 본 발명 방법의 반응 조건하에 적합한 바에 따라, 길이가 더 크거나 더 작을 수 있다는 것이 이해된다.
어떤 구체예에서, TSO의 5' 부분은 RNA 중합효소의 이중가닥 프로모터의 형성을 위해 디자인된 서열(이후, "프로프로모터 서열")을 포함한다. 이 구체예의 TSO는 종결 서열로서 기능하고, 프로모터 주형을 제공할 것이다. 이 구체예에서, TSO의 프로프로모터 서열은 프로프로모터 서열(일반적으로, 주형 TSO의 프로프로모터 서열에 상보하는)과 프라이머 확장 생성물의 결합을 위한 주형으로서 작용한다. 프라이머 확장 생성물의 프로프로모터 서열에 혼성화할 수 있는 프로프로모터 서열을 포함하는 TSO의 이어지는 혼성화는 적합한 RNA 중합효소에 의한 전사를 행할 수 있는 이중가닥 프로모터의 형성을 가져온다. 주형 DNA의 전사를 허용하는 프로모터 서열은 그것들을 얻고 및/또는 제작하는 방법으로서 본 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 프로모터 서열은 사용된 특정 RNA 중합효소의 최적 전사 활성을 제공하는 것이 선택된다. 그러한 선택 기준이, 즉 특정 RNA 중합효소에 의해 특히 장려되는 특정 프로모터 서열이 또한 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, T7 DNA 의존성 RNA 중합효소 및 SP6에 의한 전사를 위한 프로모터의 서열이 본 분야에 공지되어 있다. 프로모터 서열은 원핵생물 또는 진핵생물 공급원으로부터 유래될 수 있다.
한 구체예에서, 프로모터 서열은 사용된 RNA 중합효소에 의한 증대된 또는 더욱 최적의 전사를 제공하도록 디자인된 서열에 인접해 있다. 어떤 구체예에서, 서열은 표적 핵산과는 무관하다(즉, 실질적으로 혼성화하지 않는다). 더욱 최적의 전사는, 상기 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터로부터의 중합효소의 전사 활성이 그렇게 연결되어 있지 않은 프로모터로부터 보다 큰 경우에 일어난다. 최적 전사를 위한 서열 필요조건은, 미국 특허 번호 5,766,849 및 5,654,142에서와 같이, 다양한 DNA 의존성 RNA 중합효소에 대해 이전에 설명된 바, 일반적으로 본 분야에 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 주형 DNA에 혼성화하는 TSO의 3' 부분(표적에 혼성화하는 전체 3' 부분을 포함하는)의 세그먼트는 주형 DNA에 부착되고, 이로써 프라이머 확장을 행하는 중합효소에 의한 TSO의 치환이 실질적으로, 또는 적어도 충분히 억제된다. 그러한 부착을 달성하는 적합한 방법은 본 분야에 공지된 기술, 예컨대 G-클램프 헤테로고리 변형을 함유하는 시토신 유사체(Flanagan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96(7):3513-8에 설명); 및 록크된 핵산(예를 들어, Kumar et al. Bioorg. Med. Chem Lett. 1998, 8(16):2219-22, 및 Wahlestedt et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(10):5633-8에 설명)의 사용을 포함한다. 다른 적합한 방법은, 적합한 경우, 높은 GC 함량 및/또는 교차결합을 갖는 서열의 사용을 포함한다. 강화된 부착을 얻기 위한 이들 방법 중 어느 것이 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 만일 중합효소가 프라이머 확장 사건의 적어도 약 25%, 바람직하게 적어도 약 50%, 더 바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%로 표적 핵산 가닥에서 TSO의 비혼성화된 부분으로 주형을 스위치한다면, TSO의 치환은 실질적으로 또는 충분히 억제된다. 또한, 만일 증폭 방법이 원하는 생성물의 양에 관하여 만족할만한 결과를 가져온다면, 실질적으로 또는 충분히 억제된 TSO 치환은 실험적으로 나타내질 수 있다. 일반적으로, 주어진 세트의 조건하에서, "변형된" TSO는 그렇게 변형되지 않은 TSO와 비교하여 주형에 더욱 단단히 결합한다.
표적 핵산 가닥에 혼성화하는 TSO 부분의 길이는 바람직하게 약 15 내지 50 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 20 내지 45 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 25 내지 40 뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 길이는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30 중 어느 것이며, 약 35, 40, 45, 50, 55 중 어느 것의 미만이다. 본 발명 방법의 반응 조건하에 적합한 바에 따라, 길이가 더 크거나 더 작을 수 있다는 것이 이해된다. 표적 핵산 가닥에 혼성화하는 TSO 부분의 상보성은 표적 핵산상의 의도된 결합 서열에 대해 바람직하게 적어도 약 25%, 더 바람직하게 적어도 약 50%, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%이다.
차단인자 서열
어떤 구체예에서, 프라이머 확장 종결 서열은 차단인자 서열에 의해 제공된다. 차단인자 서열은 폴리뉴클레오티드, 보통 합성 폴리뉴클레오티드로서, 이것은 단일가닥이고, 프라이머 확장 생성물의 3'-단부("종결 부위")에 상보하는 표적 서열에 있는 표적 핵산 서열 5' 위치의 세그먼트에 혼성화가능한, 바람직하게는 상보하는 서열을 포함한다. 차단인자는 친화성, 바람직하게는 높은 친화성으로 표적 핵산에 결합하는 뉴클레오티드를 포함하며, 이로써 차단인자 서열은 프라이머 확장 사건의 바람직하게 약 30% 이상, 더 바람직하게 약 50% 이상, 더욱 더 바람직하게 약 75% 이상, 가장 바람직하게 약 90% 이상으로, 프라이머 확장 과정에서 DNA 중합효소에 의한 치환에 내성으로 된다. 차단인자 폴리뉴클레오티드의 길이 및 조성은 본 발명 방법의 조건하에서 과잉의 무작위 비-특이적 혼성화를 피할 수 있어야 한다. 차단인자 폴리뉴클레오티드의 길이는 바람직하게 약 3 내지 약 30 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 5 내지 25 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 8 내지 약 20 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 10 내지 약 15 뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 차단인자 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 3, 5, 8, 10, 15 중 어느 것이며, 약 20, 25, 30, 35 중 어느 것 미만이다. 본 발명 방법의 조건하에 적합한 바에 따라, 길이가 더 크거나 더 작을 수 있다는 것이 이해된다. 차단인자 폴리뉴클레오티드의 상보성은 표적 핵산상의 의도된 결합 서열에 대해 바람직하게 적어도 약 25%, 더 바람직하게 적어도 약 50%, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%이다.
한 구체예에서, 차단인자 서열은 표적 DNA에 혼성화하여 표적 서열에 부착되는 세그먼트를 포함하며, 이로써 프라이머 확장을 행하는 중합효소에 의한 차단인자 서열의 치환이 실질적으로, 또는 적어도 충분히 억제된다. 그러한 부착을 달성하고 실질적인 또는 충분한 치환 억제를 측정하는 적합한 수단은 본 발명의 방법에 사용되는 TSO에 대해 상기 설명된 바와 같다.
한 구체예에서, 차단인자 서열은 핵산 확장용 프라이머로서 효과적으로 기능할 수 없다(즉, 차단인자 서열로부터의 확장은 감소되거나 또는 억제된다). 차단인자 폴리뉴클레오티드의 프라이머 기능을 차단하는 기술은 DNA 중합효소에 의한 프라이머의 3'-단부에 뉴클레오티드의 부가를 방지하는 어떤 것을 포함한다. 그러한 기술은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 3' 히드록실기의 치환 또는 변형, 또는 DNA 중합효소에 의해 부가된 뉴클레오티드를 고정시킬 수 없는 차단인자 폴리뉴클레오티드의 3'-말단 위치에 이디옥시뉴클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드의 결합을 포함한다.
프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드
어떤 구체예는 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 상기 논의된 바와 같은 프로프로모터 서열을 함유하는 TSO이다. 다른 구체예에서, 프로프로모터 서열은 아래 설명된 바와 같이 PTO에 함유된다.
프로프로모터 주형 올리고뉴클레오티드
어떤 구체예에서, 방법은 프로프로모터 주형 올리고뉴클레오티드(PTO)에 의해 제공되는 전사용 프로모터 서열을 사용한다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 PTO는 RNA 중합효소의 프로모터를 형성하도록 디자인된 프로프로모터 서열, 및 프라이머 확장 생성물의 3'-단부에 혼성화할 수 있는 부분을 포함하는 단일가닥 폴리뉴클레오티드, 일반적으로 DNA이다. 바람직한 구체예에서, 프로프로모터 서열은 올리고뉴클레오티드의 5' 위치에 위치하고, 혼성화 서열은 올리고뉴클레오티드의 3' 위치에 위치한다. 한 구체예에서, 그리고 가장 전형적으로, 프로모터 및 혼성화 서열은 상이한 서열이다. 다른 구체예에서, 프로모터 및 혼성화 서열은 서열 동일성에 있어 일부분 일치한다. 또 다른 구체예에서, 프로모터 및 혼성화 서열은 동일한 서열이며, 따라서 PTO상의 동일한 위치에 있다. PTO와 프라이머 확장 생성물의 혼성화가 오버행(전형적으로 프로프로모터 서열 중 일부 또는 모두를 포함하는, 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하지 않은 PTO의 5'-단부)을 포함하는 듀플렉스를 가져오는 구체예에서, DNA 중합효소는 오버행을 채워서 적합한 RNA 중합효소에 의해 전사를 행할 수 있는 이중가닥 프로모터를 만든다.
주형 DNA의 전사를 허용하는 프로모터 서열은 본 분야에 공지되어 있으며, 상기 논의되었다. 바람직하게, 프로모터 서열은 사용된 특정 RNA 중합효소의 최적 전사 활성을 제공하는 것이 선택된다. 그러한 선택 기준은, 즉 특정 RNA 중합효소에 의해 특히 장려되는 특정 프로모터 서열이 또한 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, T7 DNA 의존성 RNA 중합효소 및 SP6에 의한 전사에 대한 프로모터의 서열이 본 분야에 공지되어 있다. 프로모터 서열은 원핵생물 또는 진핵생물 공급원으로부터 유래될 수 있다.
어떤 구체예에서, PTO는 프로프로모터 서열과 프라이머 확장 생성물의 3'-단부에 혼성화할 수 있는 부분 사이의 개재 서열을 포함한다. 개재 서열의 적합한 길이는 실험적으로 결정될 수 있으며, 적어도 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 뉴클레오티드일 수 있다. 개재 서열의 적합한 서열 동일성이 또한 실험적으로 결정될 수 있으며, 서열은 필수적이지는 않지만 바람직하게 이 서열이 생략된 것과 비교하여 증폭 정도를 증대시키도록 디자인된다. 한 구체예에서, 개재 서열은 사용된 RNA 중합효소에 의한 증대된 또는 더욱 최적의 전사를 제공하도록 디자인된 서열이다. 일반적으로, 이 서열은 표적 핵산과 무관하다(즉, 실질적으로 혼성화하지 않는다). 더욱 최적의 전사는 상기 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터로부터의 중합효소의 전사 활성이 그렇게 연결되지 않은 프로모터로부터 보다 큰 경우에 일어난다. 최적 전사를 위한 서열 필요조건은, 미국 특허 번호 5766849 및 5654142에서와 같이 다양한 DNA 의존성 RNA 중합효소에 대해 이전에 설명된 바와 같이, 일반적으로 본 분야에 공지되어 있으며, 또한 실험적으로 결정될 수 있다.
다른 구체예에서, PTO는 프로모터 서열에서 5'인 서열을 포함한다. 즉, PTO는 프로모터 서열에서 5'에 위치한 추가의 뉴클레오티드(이것은 전사 조절 서열일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다)를 포함한다. 필수적이지는 않지만 일반적으로, 이 서열은 프라이머 확장 생성물에 혼성화할 수 없다.
한 구체예에서, PTO는 핵산 확장용 프라이머로서 효과적으로 기능할 수 없다. PTO의 프라이머 기능을 차단하는 기술은 DNA 중합효소에 의한 PTO의 3'-단부에 뉴클레오티드의 부가를 방지하는 어떤 것을 포함한다. 그러한 기술은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 3' 히드록실기의 치환 또는 변형, 또는 DNA 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 부가를 앵커링할 수 없는 PTO의 3'-말단 위치에 이디옥시뉴클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드의 결합을 포함한다. 표지, 또는 바이오틴과 같은 특이적 결합쌍의 구성원인 작은 분자를 사용하여 3'-단부를 차단하는 것이 또한 가능하다.
치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 PTO 부분의 길이는 바람직하게 약 5 내지 약 50 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 10 내지 약 40 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게 약 15 내지 약 35 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 20 내지 약 30 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 혼성화 부분은 적어도 약 3, 5, 10, 15, 20 중 어느 것이며, 약 30, 40, 50, 60 중 어느 것 미만이다. 혼성화 부분의 상보성은 표적 핵산상의 의도된 결합 서열에 대해 바람직하게 적어도 약 25%, 더 바람직하게 적어도 약 50%, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%이다.
DNA 중합효소, 리보뉴클레아제 및 RNA 중합효소
본 발명의 증폭 방법은 다음의 효소들을 사용한다: DNA 중합효소, RNaseH와 같은 리보뉴클레아제, 및 선택적으로 DNA 의존성 RNA 중합효소.
본 발명 및 본 발명의 조성물에 사용되는 DNA 중합효소는 본 발명의 방법에 따르는 복합 프라이머의 확장을 행핼 수 있다. 따라서, 바람직한 중합효소는 적어도 지배적으로 디옥시뉴클레오티드로 이루어진 핵산 주형을 따라서 핵산 프라이머를 확장할 수 있는 것이다. 또한, 중합효소는 치환된 가닥이 결합되는 폴리뉴클레오티드로부터 핵산 가닥을 치환할 수 있어야 하며, 일반적으로 중합효소가 더 많은 가닥 치환 능력을 나타내는 것(즉, 그만큼의 가닥 치환 능력을 가지지 않는 다른 중합효소와 비교하여)이 바람직하다. 바람직하게, DNA 중합효소는 핵산 가닥에 혼성화된 올리고뉴클레오티드의 3'-단부에서의 결합에 대해 높은 친화성을 가진다. 바람직하게, DNA 중합효소는 실질적인 니킹 활성을 가지지 않는다. 바람직하게, 중합효소는 프라이머, 종결 또는 프라이머 확장 폴리뉴클레오티드의 분해를 최소화하기 위해서 5' → 3' 엔도뉴클레아제를 거의 가지지 않는다. 일반적으로, 이 엔도뉴클레아제 활성은 pH, 염농도, 주형이 이중가닥 또는 단일가닥인지의 여부 등과 같은 인자에 의존하며, 이것들 모두는 당업자에게 익숙하다. 5' → 3' 엔도뉴클레아제 활성이 결실된 돌연변이 DNA 중합효소가 본 분야에 공지되어 있으며, 본원에 설명된 증폭 방법에 적합하다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 적합한 DNA 중합효소는 미국 특허 번호 5648211 및 5744312에 개시된 것들을 포함하며, 이것은 엑소- Vent(뉴잉글랜드 바이오랩스), 엑소- Deep Vent(뉴잉글랜드 바이오랩스), Bst (바이오라드), 엑소- Pfu(스트라타진), Bca(판베라), 시퀀싱 그레이드 Tap(프로메가), 및 서모언에어로박터 서모히드로술푸리쿠스로부터의 열안정성 DNA 중합효소를 포함한다. DNA 중합효소가 중합효소와 프라이머 확장 생성물의 5'-단부 사이의 접촉 발생률 중 적어도 약 25%, 더 바람직하게 적어도 약 50%, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%로, 주형 핵산으로부터 프라이머 확장 생성물을 치환하는 것이 바람직하다. 어떤 구체예에서, 가닥 치환 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소의 사용이 바람직하다. 그러한 중합효소는 미국 특허 번호 5744312(및 거기에 인용된 참고자료)와 같이, 본 분야에 공지되어 있다. 바람직하게, DNA 중합효소는 해독방어 활성을 거의 가지지 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 리보뉴클레아제는 RNA/DNA 혼성체에 있는 리보뉴클레오티드를 절단할 수 있다. 바람직하게, 리보뉴클레아제는 절단될 리보뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드의 동일성 및 종류와 무관하게 리보뉴클레오티드를 절단한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 적합한 리보뉴클레아제의 예가 본 분야에 공지되어 있으며, 리보뉴클레아제 H(RNaseH)를 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 DNA-의존성 RNA 중합효소는 본 분야에 공지되어 있다. 원핵생물 또는 진핵생물 중합효소가 사용될 수 있다. 예들은 T7, T3 및 SP6 RNA 중합효소를 포함한다. 일반적으로, 선택된 RNA 중합효소는 본원에 설명된 TSO 또는 PTO에 의해 제공된 프로모터 서열로부터 전사할 수 있다. 일반적으로, RNA 중합효소는 DNA 의존성 중합효소이며, 이것은 바람직하게 프로모터 영역이 이중가닥인 한, 단일가닥 DNA 주형으로부터 전사할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물에 포함되는 사용된 효소는 상기 방법 및 조성물의 핵산 성분의 실질적인 분해물을 생성하지 않아야 한다.
반응 조건 및 검출
본 발명의 방법을 수행하기 위한 적합한 반응 배지 및 조건은 본 발명의 방법에 따르는 핵산 증폭을 허락하는 것들이다. 그러한 배지 및 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 5,676,512 및 PCT 공보 번호 WO 99/42618과 같은, 여러 공보에 설명된다. 예를 들어, 완충액은 트리스 완충액일 수 있으며, 완충액 성분들이 본 발명 방법의 효소 성분에 비-억제성인 한, 다른 완충액도 사용될 수 있다. pH는 바람직하게 약 5 내지 약 11, 더 바람직하게 약 6 내지 약 10, 더욱 더 바람직하게 약 7 내지 약 9, 가장 바람직하게 약 7.5 내지 약 8.5이다. 또한, 반응 배지는 Mg2+ 또는 Mn2+와 같은 2가 금속 이온을 자유 이온의 최종 농도가 약 0.01 내지 10mM, 가장 바람직하게 약 1 내지 5mM의 범위내에 있도록 포함할 수 있다. 또한, 반응 배지는 배지의 총 이온 강도에 기여하는 KCl과 같은 다른 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, KCl과 같은 염의 범위는 바람직하게 약 0 내지 약 100mM, 더 바람직하게 약 0 내지 약 75mM, 가장 바람직하게 약 0 내지 약 50mM이다. 반응 배지는 증폭 반응의 성능에 영향을 미칠 수는 있지만, 본 방법의 효소 성분의 활성에 절대 필요한 것은 아닌 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그러한 첨가제는 BSA와 같은 단백질, 및 NP40 또는 트리톤과 같은 비이온성 세제를 포함한다. 효소 활성을 유지시킬 수 있는 DTT와 같은 시약이 또한 포함될 수 있다. 그러한 시약이 본 분야에 공지되어 있다. 적합한 경우, 본 방법에 사용되는 RNase의 활성을 억제하지 않는 RNase 억제제(Rnasine와 같은)이 또한 포함될 수 있다. 본 발명의 어떤 양태는 동일한 온도에서 또는 온도를 변화시키면서 일어날 수 있다. 바람직하게, 본 발명은 등온적으로 수행되며, 이것은 귀찮은 열순환 과정을 피한다. 증폭 반응은 본 발명의 올리고뉴클레오티드(프라이머, TSO, 차단인자 서열 및/또는 PTO)와 주형 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 허락하고, 사용된 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 온도에서 수행된다. 온도는 바람직하게 약 25℃ 내지 약 85℃, 더 바람직하게 약 30℃ 내지 약 75℃, 가장 바람직하게 약 37℃ 내지 약 70℃의 범위에 있을 수 있다. RNA 전사를 포함하는 어떤 구체예에서, 전사 단계의 온도는 선행 단계의 온도(들) 보다 더 낮다. 이들 구체예에서, 전사 단계의 온도는 약 25℃ 내지 약 85℃, 더 바람직하게 약 30℃ 내지 약 75℃, 가장 바람직하게 약 37℃ 내지 약 70℃의 범위에 있을 수 있다.
본 발명의 방법에서 프라이머 확장 생성물의 합성에 사용될 수 있는 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트와 같은, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 바람직하게 약 50 내지 약 2500μM, 더 바람직하게 약 100 내지 약 2000 μM, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 약 1700μM, 가장 바람직하게 약 800 내지 약 1500μM의 양으로 제공된다. 어떤 구체예에서, 프라이머 확장 가닥에 존재함으로써 가닥 치환(예를 들어, 종래의 AT, CG 염기쌍 보다 약한 염기쌍을 일으킴에 의해)을 증대시키는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 포함된다. 그러한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 디옥시이노신 및 다른 변형된 염기를 포함하며, 이것들 모두 본 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에서 RNA 전사체의 합성에 사용될 수 있는 리보뉴클레오시드 트리포스페이트와 같은, 뉴클레오티드 및/또는 유사체는 바람직하게 약 0.25 내지 약 6mM, 더 바람직하게 약 0.5 내지 5mM, 더욱 더 바람직하게 약 0.75 내지 약 4mM, 가장 바람직하게 약 1 내지 약 3mM의 양으로 제공된다.
본 발명의 증폭 반응의 올리고뉴클레오티드 성분은 일반적으로 증폭될 표적 핵산 서열의 수를 초과하여 있다. 그것들은 표적 핵산 양의 약 또는 적어도 약 10, 102, 104, 106, 108, 1010, 1012 배 중 어느 것으로 제공될 수 있다. 복합 프라이머, TSO, PTO 및 차단인자 서열은 각각 약 또는 적어도 약 50nM, 100nM, 500nM, 1000nM, 2500nM, 5000nM 중 어느 것으로 제공될 수 있다.
한 구체예에서, 전술한 성분들은 증폭 과정이 개시될 때 동시에 첨가된다. 다른 구체예에서, 성분들은 증폭 반응의 필요에 따라 및/또는 반응에 의해 허락된다면, 증폭 과정 동안 적합한 시간 포인트 전에 또는 후에 어떤 순서로 첨가된다. 이들 중 일부가 아래 주지된 그러한 시간 포인트는 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르는 핵산 증폭에 사용되는 효소는 핵산 변성 단계 전, 변성 단계 후, 또는 프라이머 및/또는 차단인자 서열과 표적 DNA의 혼성화 후에 반응 혼합물에 첨가될 수 있으며, 그것들의 열안정성 및/또는 당업자에게 공지된 다른 고려사항들에 의해 결정된다.
증폭 반응은 여러 시간 포인트에서 중지되고, 나중에 재개될 수 있다. 상기 시간 포인트는 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 반응을 중시시키는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 효소 활성을 억제하는 온도로 반응 혼합물을 냉각하는 것을 포함한다. 반응을 재개시키는 방법 또한 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 효소 활성을 허락하는 온도로 반응 혼합물의 온도를 올리는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 반응 성분들 중 1개 이상은 반응의 재개 전, 재개시, 또는 재개 후에 재공급된다. 또는 달리, 반응은 중지 없이 진행되도록(즉, 시작부터 끝까지) 허용될 수 있다.
증폭 생성물의 검출은 표적 서열의 존재에 대한 표지이다. 정량적 분석이 또한 가능하다. 직접적 및 간접적 검출 방법(정량을 포함하는)이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 표적 서열을 함유하는 미지의 양의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시험 샘플로부터의 증폭 생성물의 양을 표적 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 양을 알고 있는 기준 샘플의 증폭 생성물과 비교함에 의해, 시험 샘플에 있는 표적 서열의 양이 측정될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 방법은 서열 변경의 분석 및 표적 핵산의 서열화까지 확대될 수 있다. 더욱이, 검출은, 예를 들어 RNA 증폭 생성물로부터의 전사 생성물의 시험에 의해 행해질 수 있다.
본 발명의 증폭 방법
다음은 본 발명의 증폭 방법의 예들이다. 여러가지 다른 구체예가 상기 제공된 일반적인 설명에 따라 실행될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 본원에 설명된 복합 프라이머 중 어느 것인 복합 프라이머 수단을 사용하는데 대한 기준이 사용될 수 있다.
본 발명의 한 양태로서, 표적 뉴클레오티드 서열에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 증폭하는 방법이 제공된다. 이 방법에서, 등온 선형 핵산 서열 증폭이 달성된다. 다른 양태로서, 증폭 생성물이 센스 RNA인 표적 뉴클레오티드 서열 증폭 방법이 제공되며, 이것은 때로 본원에서 "증대된" 선형 증폭 방법으로서 언급된다. 한 구체예에서, TSO를 기초로 하는 증대된 등온 선형 핵산 서열 증폭 방법(이후, "방법 1")이 제공된다. 다른 구체예에서, 차단 서열 및 PTO를 기초로 하는 증대된 등온 선형 핵산 서열 증폭 방법(이후 "방법 2")이 제공된다.
상보하는 DNA 생성물을 가져오는 선형 핵산 서열 증폭
전사와 결합되지 않을 때, 본 발명의 증폭 방법은 표적 핵산 서열의 등온 선형 증폭을 제공한다. 이 방법은 단일 복합 프라이머를 이용한다. 한 구체예에서, 이 방법은 또한 방법 2에 설명된 바와 같은 차단인자 서열, 또는 방법 1에 설명된 바와 같은 TSO와 같은, 종결 서열을 사용한다. 방법 1 및 방법 2가 아래에 설명된다. 선형 증폭이 전사와 결합되지 않는 한, DNA 의존성 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 복합체의 형성을 가져오는 성분 및 단계는 포함되지 않는다.
종결 서열(사용된다면, TSO 또는 차단인자 서열 성분)이 규정된 3'-단부의 생성물을 생성하기 위해 첨가된다. 어떤 구체예에서, 프라이머 결합 부위의 주형 5'내에 있는 천연 서열(들)은 핵산 중합을 억제하고, 이로써 프라이머 확장의 종결이 달성된다. 그러한 천연 서열은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 GC 풍부 서열이고, 또는 실험적으로 결정될 수 있다. 종결 서열의 사용은 규정된 단부의 프라이머 확장을 제공하기 위해 게놈 DNA를 증폭할 때 특히 유익하다. 이 특징이 바람직하지 않을 때, 본 발명의 방법에 따르는 등온 선형 증폭은 종결 서열 없이 수행될 수 있다. 등온 선형 증폭은 2개의 효소, DNA 중합효소 및 RNaseH와 같은 리보뉴클레아제를 더 이용한다. 본 발명의 선형 등온 핵산 증폭의 도식적 묘사를 도 1a 내지 1c에 나타낸다.
아래 설명된 바와 같은 방법 1 및 2와 유사한, 선형 증폭 방법은 단일가닥 DNA 표적을 증폭하도록 디자인된다. 증폭될 표적이 dsDNA인 경우, 표적은 먼저 변성되어 단일가닥 표적을 생성한다. 표적 변성은 열 또는 알칼리 처리와 같은, 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 표적이 mRNA 또는 바이러스 RNA와 같은 단일가닥 RNA인 경우, 표적은 본 분야에 공지된 방법에 의해 먼저 전사되어 cDNA 표적을 생성한다.
도 1a 내지 1c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 선형 등온 증폭 방법은 아래에 설명되고 도 2a 내지 2c 및 도 3a 내지 3d에 설명된 증대된 선형 증폭 방법(방법 1 및 2)의 초기 단계들과 유사한 단계들을 포함한다. 표적 핵산은 상기 설명된 바와 같은, 복합 프라이머, DNA 중합효소, RNaseH와 같은 리보뉴클레아제, 및 선택적으로 차단인자 서열 성분 또는 TSO와 조합된다. 한 구체예에서, 각 증폭 반응은 한 동일한 서열의 복합 프라이머를 포함한다. 다른 구체예에서, 각 증폭 방법은 복합 프라이머 변이체의 혼합물을 포함하며, 여기에서 변이체는 2개 이상의 상동성이지만 비-동일성 서열로 나타나며, 모두 동일한 표적 핵산 서열에 혼성화할 수 있다. 상보성은 바람직하게 적어도 약 50%, 더 바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%이다. 이 구체예의 이점은 프라이머 확장 생성물에 상이한 관심의 서열 도입하는 능력을 포함한다는 것이다. 또 다른 구체예에서, 각 증폭 반응은 복합 프라이머의 혼합물을 포함하며, 여기에서 프라이머는 상동성이 낮거나 또는 없는 2개 이상의 비-동일성 서열로 나타나고, 프라이머는 동일한 표적 핵산 가닥을 따라서 상이한 표적 핵산 서열 또는 상이한 부위에 우선적으로 혼성화한다. 이 구체예의 이점은 단일 증폭 반응에서 복수의 표적 핵산 종의 증폭을 통한 다중가닥 결실 및/또는 표적 핵산의 분석을 포함한다는 것이다.
도 1a 내지 1c는 종결 서열을 포함하는 구체예를 예시한다. 복합 프라이머 및 종결 서열(TSO 또는 차단인자 서열 성분)는 표적의 동일한 가닥에 혼성화하여 3분자 복합체 XX(도 1a 내지 1c)를 형성한다. 복합 프라이머의 3'-단부는 중합효소에 의해 표적 가닥을 따라서 TSO 또는 차단인자 서열 성분의 혼성화 부위까지 확장되며, 복합체 XXI(도 1a 내지 1c)를 얻는다. RNaseH와 같은 리보뉴클레아제는 복합체 XXI(도 1a 내지 1c)의 확장된 프라이머의 부분인 RNA, 일반적으로 5' RNA를 절단하여 복합체 XXII(도 1a 내지 1c)를 생성한다. 제 2 복합 프라이머는 RNA, 일반적으로 5' RNA 부분의 혼성화에 의해 복합체 XXII(도 1a 내지 1c)에 결합하여 복합체 XXIII(도 1a 내지 1c)를 제공한다. 다음에, 결합된 복합 프라이머의 자유 3' 부분이 프라이머 확장 생성물의 5'-단부를 치환하고, 표적에 혼성화하여 복합체 XXIV(도 1a 내지 1c)를 형성한다. 복합 프라이머의 3'-단부와 표적의 혼성화는 프라이머의 혼성화된 3'-단부가 DNA 중합효소의 결합 부위이고, 이것이 다음에 표적을 따라서 프라이머의 3'-단부를 확장할 것이기 때문에, 일반적으로 프라이머 확장 생성물의 5'-단부의 혼성화 이상으로 장려된다. 프라이머 확장은 제 1 프라이머 확장 생성물의 치환을 가져오며, 이로써 복합체 XXV(도 1a 내지 1c)가 얻어진다. 이 과정이 반복되어 일반적으로 표적 서열에 상보하는 다중 단일가닥 DNA 치환 생성물이 얻어진다.
등온 선형 증폭 방법의 단일가닥 DNA(즉, 치환된 프라이머 확장 생성물)는 본 분야에 공지된 많은 검출 방법 중 어느 것에 의해 쉽게 검출가능하다. 단일가닥 핵산 분자의 검출에 적합한 다양한 상동성 또는 이종성 검출 방법이 이전에 설명되었으며, 이것은 겔 전기영동에서 크기 및/또는 이동성에 의한 확인, 또는 서열 -특이적 프로브와의 혼성화에 의한 확인을 포함한다.
증폭 생성물의 검출은 표적 서열의 존재에 대한 표지이다. 정량적 분석이 또한 가능하다. 예를 들어, 표적 서열을 함유하는 미지의 양의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시험 샘플로부터의 증폭 생성물의 양을 표적 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 양을 알고 있는 기준 샘플의 증폭 생성물과 비교함에 의해, 시험 샘플에 있는 표적 서열의 양이 측정될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 방법은 서열 변경의 분석 및 표적 핵산의 서열화까지 확대될 수 있다.
적어도 1, 적어도 10, 적어도 약 100, 적어도 약 1000, 적어도 약 105, 적어도 약 107, 적어도 약 109, 적어도 약 1012의, 주형 폴리뉴클레오티드의 각 카피의 상보하는 카피들의 생성이 기대될 수 있으며, 따라서 주형 폴리뉴클레오티드의 각 카피에 관하여 적어도 1, 적어도 10, 적어도 100, 적어도 1000, 적어도 약 105, 적어도 약 107, 적어도 약 109, 적어도 약 1012-배 증대를 가져온다.
센스 RNA 생성물을 가져오는 증대된 선형 증폭
또한, 본 발명은 증폭 생성물이 센스 서열(즉, 표적과 같은 서열)을 함유하는 RNA인 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하는 방법을 제공한다. 표적 및 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)-관련 부분을 포함하는 유일한 중간 증폭 생성물을 생성을 가져오는, 방법 1에 따르는 표적 핵산의 증폭은 선형 증폭과 전사의 커플링을 제공한다. 주형 스위치 올리고뉴클레오티드와 치환 프라이머 확장 생성물의 혼성화에 의해 형성된 복합체는 RNA 중합효소에 의해 전사되는 기질이며, 이것은 초기 표적 서열과 같은 센스 RNA 생성물을 생성한다. 유사하게, 방법 2에 따르는 핵산 표적의 증폭은 프로모터 주형 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 때 RNA 중합효소의 기질인 복합체를 형성하는 치환된 프라이머 확장 생성물의 형성을 가져온다. 방법 1에 따라서, 이 과정은 선형 증폭과 전사의 커플링을 가져온다. 각 프라이머 확장 생성물로부터의 RNA 전사체 생성물은, 바람직하게 적어도 약 1, 더 바람직하게 적어도 약 50, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 75, 더더욱 바람직하게 적어도 약 100, 가장 바람직하게 적어도 약 1000의 생성이 기대되며, 따라서 비-전사 연결 증폭 방법에 관하여, 바람직하게 적어도 약 1, 더 바람직하게 적어도 약 50, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 75, 더더욱 바람직하게 적어도 약 100, 가장 바람직하게 적어도 약 1000-배 증대를 가져온다.
아래에 2가지 방법을 예시한다.
방법 1 - TSO-기초 증대된 선형 핵산 증폭
한 구체예에서, 본 발명의 TSO-기초 선형 증폭 방법은 프라이머 확장 생성물로부터의 전사와 연결되어 증대된 핵산 증폭을 제공한다. 이 신규한 증폭 방법, 방법 1의 도식적 설명을 도 2a 내지 2c에 나타낸다.
본 발명의 TSO-기초 핵산 증폭 방법은 상기 설명된 바와 같은 단일 복합 프라이머를 사용한다. 본 발명의 증폭 방법에 사용되는 제 2 올리고뉴클레오티드는 상기 설명된 바와 같은 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)이다. 본 발명의 증폭 방법은 다음의 효소들을 사용한다: DNA 중합효소, RNaseH와 같은 리보뉴클레아제, 및 DNA 의존성 RNA 중합효소. 증폭될 핵산 표적은 DNA 또는 RNA일 수 있다. RNA 표적 증폭은 본 분야에 공지된 바와 같이, 초기 cDNA 합성이 필요할 것이다.
본 발명의 새로운 TSO-기초 증대된 선형 증폭 방법은 표적 DNA 서열에 상동성(즉, 센스)인 RNA 생성물의 다중 카피를 생성할 수 있다.
단일가닥 표적 핵산은 본 분야에 공지된 바와 같이, 복합 프라이머, TSO 올리고뉴클레오티드, DNA 중합효소, RNaseH와 같은 리보뉴클레아제, DNA 의존성 RNA 중합효소, 및 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 및 리보뉴클레오시드 트리포스페이트(rNTP)와 같은 뉴클레오티드와 핵산 혼성화 및 증폭에 적합한 반응 배지에서 조합된다. 적합한 반응 배지 및 조건은 상기 설명된 바와 같다. 한 구체예에서, 전사는 선행 단계의 온도 보다 일반적으로 낮은 상이한 온도에서 수행된다. 다른 구체예에서, 본 방법의 모든 단계는 등온적으로 수행된다.
한 구체예에서, 각 증폭 반응은 한 동일한 서열의 복합 프라이머를 포함한다. 다른 구체예에서, 각 증폭 반응은 복합 프라이머 변이체의 혼합물을 포함하며, 여기에서 변이체는 상동성이지만 동일하지 않은 2개 이상의 서열로 나타나고, 2개 모두는 동일한 표적 핵산 서열에 혼성화할 수 있다. 상동성(서열 동일성)은 바람직하게 적어도 약 50%, 더 바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%이다. 이 구체예의 이점은 프라이머 확장 생성물에 상이한 관심의 서열을 도입하는 능력을 포함한다는 것이다. 또 다른 구체예에서, 각 증폭 반응은 복합 프라이머의 혼합물을 포함하며, 여기에서 프라이머는 상동성이 낮거나 없는 2개 이상의 동일하지 않은 서열로 나타나고, 프라이머는 동일한 표적 핵산 서열을 따라서 우선적으로 상이한 표적 핵산 서열 또는 상이한 부위에 혼성화한다. 이 구체예의 이점은 표적 핵산의 단일 증폭 반응에서 복수의 표적 핵산 종의 증폭을 통한 다중 결실 및/또는 분석을 포함한다는 것이다.
한 구체예에서, TSO는 종결 서열로서 기능하고, 프로프로모터 서열을 제공한다. 다른 구체예에서, TSO는 프로프로모터 서열을 포함하지 않는다. 이 구체예에서, 프로프로모터 서열은 프로프로모터 서열을 포함하고 프라이머 확장 생성물에 3' 부분에 혼성화가능하고, 이로써 프라이머 확장 생성물의 전사를 일으킬 수 있는 PTO와 같은 다른 올리고뉴클레오티드에 의해 별개로 제공된다.
다음에, 단일 복합 프라이머 및 TSO는 증폭될 핵산의 동일한 가닥에 혼성화한다. 2개의 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산 변성 단계 전에 핵산 표적을 함유할 것으로 기대되는 샘플에 첨가될 수 있다. 2개 올리고뉴클레오티드와 표적 가닥의 혼성화는 3분자 복합체 I(도 2a 내지 2c)의 형성을 가져온다.
DNA 중합효소는 프라이머 확장을 수행한다. 프라이머는 복합체 I(도 2a 내지 2c)의 표적 핵산 가닥을 따라 TSO 혼성화 부위까지 확장된다. 표적 가닥에서 TSO의 5' 미혼성화된 부분으로의 주형 스위치, 및 TSO 주형을 따라서 더 이상의 프라이머 확장은 3분자 복합체 II의 형성을 가져온다. 마지막 과정은 표적 핵산, TSO 및 제 1 프라이머 확장 생성물을 포함한다. 제 1 프라이머 확장 생성물을 표적 의존성 부분(즉, 표적 핵산에 상보하는 서열) 및 TSO 의존성 부분(즉, TSO의 비혼성화된 부분에 상보하는 서열)을 포함하는 유일한 DNA이다.
복합체 II(도 2a 내지 2c)는 RNA 중합효소 및 RNaseH와 같은 리보뉴클레아제 모두에 대한 기질이다. DNA 의존성 RNA 중합효소는 복합체 II의 기능적 ds 프로모터에 결합하고, 제 1 프라이머 확장 생성물을 전사하여 RNA 생성물 III(도 2a 내지 2c)를 생성한다. RNA/DNA 이형가닥의 RNA 가닥의 분해에 대해 특이적인 RNaseH와 같은 리보뉴클레아제는 복합체 II의 프라이머 확장 생성물의 5' 부분을 분해하여 3분자 복합체 IV를 형성한다.
자유 복합 프라이머는 복합체 IV(도 2a 내지 2c)에 있는 표적 핵산의 프라이머 상보성 부위에 혼성화한다. 이 혼성화는 프라이머의 단지 RNA 부분, 일반적으로 5' RNA 부분만이 표적 가닥에 혼성화되는 일반복합체 V(도 2a 내지 2c)의 형성을 가져온다. 부분적으로 혼성화된 프라이머의 3' DNA 부분에 의한 프라이머 확장 생성물의 5'-말단 부분의 치환은 복합체 VI(도 2a 내지 2c)의 형성을 가져올 것이며, 이것은 DNA 중합효소의 기질이다. 표적 가닥(VII; 도 2a 내지 2c)을 따라서 프라이머의 확장은 복합체로부터 제 1 프라이머 확장 생성물의 치환을 가져온다. 반복된 프라이머 확장 및 가닥 치환은 표적 핵산에 적어도 실질적으로 상보하는 폴리뉴클레오티드의 다중 카피의 생성을 가져온다.
상기 설명된 바와 같이 생성된 프라이머 확장 생성물은 프로프로모터 서열을 포함하는 TSO가 제공되는 구체예에서 전사에 대한 주형으로서 사용된다. 치환된 프라이머 확장 생성물(VIII; 도 2a 내지 2c)은 자유 TSO 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 부분적 듀플렉스 IX(도 2a 내지 2c)을 형성한다. 복합체(듀플렉스) IX는 한 단부에 있는 이중가닥 부분, 및 프라이머 확장 생성물 및 TSO로부터 각각 유도된 2개의 비-상보성 단일가닥을 포함한다. 이 부분적 듀플렉스의 이중가닥 부분은 DNA 의존성 RNA 중합효소에 대한 충분히 기능적인 이중가닥 프로모터를 함유한다. 마지막은 부분적 듀플렉스 IX의 프로모터에 결합하고, 프라이머 확장 생성물을 전사하여 센스 RNA 생성물 X(도 2a 내지 2c)의 다중 카피를 형성한다.
상기 설명된 증폭 생성물은 겔 전기영동에서 크기 및/또는 이동성에 의한 확인, 또는 서열-특이적 프로브에 혼성화에 의한 확인을 포함하여, 상동성 또는 이종성 검출 방법에 의해 검출될 수 있다. 증폭 생성물의 검출은 표적 핵산의 존재에 대한 표시이다. 정량적 분석이 또한 가능하다. 예를 들어, 표적 서열을 함유하는 미지의 양의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시험 샘플로부터의 증폭 생성물의 양을 표적 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 양을 알고 있는 기준 샘플의 증폭 생성물과 비교함에 의해, 시험 샘플에 있는 표적 서열의 양이 측정될 수 있다. 서열 변경의 분석 및 표적 핵산의 서열화에 대한 새로운 증폭 방법의 더 이상의 확장이 아래 설명된 바와 같이 또한 가능하다.
방법 2 - 차단인자 서열-기초 증대된 핵산 증폭
다른 구체예에서, 본 발명의 차단인자 서열-기초 선형 증폭 방법은 프라이머 확장 생성물로부터의 전사와 결합되어 증대된 핵산 증폭을 제공한다. 주형 스위치 단계를 포함하지 않는 다른 증대된 선형 증폭, 방법 2를 도 3a 내지 3d에 나타낸다.
방법 2는 상기 설명된 바와 같은 방법 1에서 처럼 단일 복합 프라이머, 상기 설명된 바와 같이 단일 프라이머로서 동일한 표적 핵산 가닥상의 서열에 대한 더 이상의 혼성화를 가능하게 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체인 차단인자 서열 성분, 상기 설명된 바와 같은 치환된 확장 생성물의 3'-단부에 혼성화할 수 있는 3' 부분 및 5'-단부에 DNA 의존성 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 5' 부분을 포함하는(그리고 바람직하게는 상보하는) 프로모터 주형(PTO)을 이용한다. 상기 설명된 TSO에서와 같이, 프로모터 서열에 바로 인접해 있는 서열은 본 발명의 방법에 따르는 증폭에 사용된 RNA 중합효소에 의한 바람직한 최적의 전사 활성을 제공하도록 디자인된다. 차단인자 서열 성분은 단일 프라이머의 혼성화 부위에 관한 표적의 5'-단부를 향하여 상류에 위치한 부위에서 표적 서열에 혼성화하도록 디자인된다. 또는 달리, 상기 설명된 바와 같이, 차단인자 서열이 프라이머 확장 생성물의 3'-단부에 상보하는 표적 서열에 있는 위치의 표적 핵산 서열 5'의 세그먼트에 혼성화한다. 차단인자 서열은 표적에 대한 차단인자 혼성화의 부위에서 프라이머 확장을 차단하는 한, 충분히 높은 친화성으로 결합한다. 이 특징은 중합효소에 의한 프라이머 확장에 대한 강력한 중지를 제공하며, 프라이머 확장 생성물의 3'-단부를 규정한다.
방법 1에서와 같이, 방법 2에 따르는 증폭용 표적 핵산은 단일가닥 DNA이다. 표적 핵산이 dsDNA인 경우, 표적은 먼저 변성에 의해 단일가닥으로 된다. dsDNA 표적의 변성은 가열, 또는 알칼리 처리와 같은 본 분야에 공지된 어떤 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 표적 핵산이 mRNA와 같은 RNA인 경우, 표적은 먼저 본 분야에 공지된 방법에 의해 역전사되어 cDNA를 생성하고, 다음에 본 발명의 방법에 따라 증폭된다.
단일가닥 핵산 표적은, 방법 1에 대해 설명된 바와 같이, 단일 복합 프라이머, 차단인자 성분, 프로프로모터 주형 (PTO), DNA 중합효소, RNaseH와 같은 리보뉴클레아제, DNA 의존성 RNA 중합효소, NTP(예를 들어, dNTP 및 rNTP)와 같은 뉴클레오티드와 결합된다. 적합한 반응 배지 및 조건은 상기 설명된 바와 같다. 한 구체예에서, 전사는 선행 단계의 온도 보다 일반적으로 더 낮은 상이한 온도에서 수행된다. 다른 구체예에서, 방법의 모든 단계는 등온적으로 수행된다.
한 구체예에서, 각 증폭 반응은 한 동일한 서열의 복합 프라이머를 포함한다. 다른 구체예에서, 각 증폭 반응은 복합 프라이머 변이체의 혼합물을 포함하며, 여기에서 변이체는 상동성이지만 동일하지 않은 2개 이상의 서열로 나타나고, 2개 모두는 동일한 표적 핵산 서열에 혼성화할 수 있다. 상동성(서열 동일성)은 바람직하게 적어도 약 50%, 더 바람직하게 적어도 약 75%, 가장 바람직하게 적어도 약 90%이다. 이 구체예의 이점은 프라이머 확장 생성물에 상이한 관심의 서열을 도입하는 능력을 포함한다는 것이다. 또 다른 구체예에서, 각 증폭 반응은 복합 프라이머의 혼합물을 포함하며, 여기에서 프라이머는 상동성이 낮거나 없는 2개 이상의 동일하지 않은 서열로 나타나고, 프라이머는 동일한 표적 핵산 서열을 따라서 우선적으로 상이한 표적 핵산 서열 또는 상이한 부위에 혼성화한다. 이 구체예의 이점은 표적 핵산의 단일 증폭 반응에서 복수의 표적 핵산 종의 증폭을 통한 다중 결실 및/또는 분석을 포함한다는 것이다.
단일 복합 프라이머 및 차단인자 서열 성분은 동일한 표적 가닥에에 혼성화하여 3분자 복합체를 형성한다. 프라이머는 표적 서열을 따라서 차단인자 서열의 혼성화 부위까지 확장되어 복합체 XII(도 3a 내지 3d)를 형성한다.
방법 1에서와 같이, RNaseH와 같은 리보뉴클레아제는 복합체 XII의 단일 복합 프라이머의 RNA 부분, 일반적으로 5' RNA 부분을 절단하여 복합체 XIII(도 3a 내지 3d)를 형성한다. 상기 설명된 바와 같이, 이 효소는 RNA/DNA 혼성체의 RNA 가닥을 절단하는데 특이적이며, 단일가닥 RNA는 소화시키지 않는다. 도 3a 내지 3d에 예시된 바와 같이, 이 단계에 이어서 프라이머 혼성화(XIV), 복합 프라이머 (XV)의 3' DNA 부분에 의한 프라이머 확장 생성물의 5'-단부의 치환, 프라이머 확장 및 제 1 프라이머 확장 생성물(XVI)의 치환이 방법 1에서와 같이 진행되어, 치환된 확장 생성물(XVII)의 다중 카피를 얻는다. 방법 1의 치환 생성물과는 달리, XVII는 표적 서열에 충분히 상보하며, 표적에 상보하지 않는 3'-단부 부분을 포함하지 않는다.
프로모터 주형 올리고뉴클레오티드(PTO)는 치환된 확장 생성물에 결합하여, 프로모터 주형의 3'-단부 부분(A)과 치환된 프라이머 확장 생성물의 3'-단부의 혼성화에 의해 복합체 XVIII(도 3a 내지 3d)를 형성한다. 상기 설명된 바와 같이, PTO의 3'-단부는 차단되거나 또는 차단되지 않을 수 있다. 프로프로모터 주형의 3'-단부가 차단되지 않는 경우, 주형은 치환된 프라이머 확장 생성물을 따라 확장될 것이다. 치환된 생성물의 3'-단부는 혼성화된 프로프로모터 주형의 B 부분(도 3a 내지 3d 참조)을 따라서 뉴클레오티드(DNA) 중합효소에 의해 확장되어, DNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 이용될 수 있는 ds 프로모터 서열을 그것의 한 단부에 포함하는 복합체 XIX를 형성할 것이다. 복합체 XIX는 3'-단부가 중합효소에 의한 확장에 대해 차단된 프로프로모터 주형의 혼성화 생성물처럼, 도 3a 내지 3d에 묘사된다. 또는 달리, 프로프로모터 주형의 3'-단부가 치환된 프라이머 확장 생성물을 따라서 3'-단부의 확장이 차단되지 않은 경우, 완전한 이중가닥 복합체의 형성을 가져온다. DNA 의존성 RNA 중합효소는 복합체 XIX의 확장된 치환된 프라이머 확장 생성물을 2가지 형태(RNA 중합효소의 선택은 ds 및/또는 ss DNA 주형으로부터 전사하는 능력을 고려해야 한다)로 전사할 것이다. 즉, 부분적 듀플렉스 또는 완전한 이중가닥 듀플렉스 형태의 복합체라고 말할 수 있다.
상기 설명된 증폭 생성물은 겔 전기영동에서 크기 및/또는 이동성에 의한 확인, 또는 서열-특이적 프로브에 혼성화에 의한 확인을 포함하여, 상동성 또는 이종성 검출 방법에 의해 검출될 수 있다. 증폭 생성물의 검출은 표적 핵산의 존재에 대한 표시이다. 정량적 분석이 또한 가능하다. 예를 들어, 표적 서열을 함유하는 미지의 양의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시험 샘플로부터의 증폭 생성물의 양을 표적 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 양을 알고 있는 기준 샘플의 증폭 생성물과 비교함에 의해, 시험 샘플에 있는 표적 서열의 양이 측정될 수 있다. 본 발명의 증폭 방법은 또한 아래 논의된 바와 같이, 서열 변경의 분석 및 표적 핵산의 서열화까지 확대될 수 있다.
본 발명의 증폭 방법 및 조성물을 사용하는 방법
본 발명의 방법 및 조성물은 여러가지 목적에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명이 방법에 의해 생성된 증폭된 핵산 성성물을 사용한 서열화, 유전자형화(핵산 돌연변이 검출), 마이크로어레이 제조 방법, 및 핵산 서열을 특성화하는 방법이 설명된다.
본 발명의 선형 증폭 방법을 사용한 규정된 핵산 표적의 등온 서열화
본 발명의 선형 등온 증폭 방법은, 예를 들어 규정된 핵산 표적 서열의 서열화에 유용하다. 서열화 과정은 본원에 설명된 증폭 방법에 대해 설명된 바와 같이 수행된다. 본 발명에 따르는 증폭 방법에 사용되는 천연 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)와 같은 뉴클레오티드에 더하여, 서열화 반응 혼합물은 또한, 프라이머 확장 생성물로의 결합에 의하여 뉴클레오티드 중합의 종결을 행하는 표지되거나 표지되지 않을 수 있는 적합한 뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체를 포함한다. 이디옥시리보뉴클레오티드와 같은 그러한 유사체는 다른 서열화 방법에 통상 사용되고, 본 분야에 잘 공지되어 있다. 그것들은, 예를 들어 형광색소 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있다. 또한, 표지는 특이적 결합쌍의 구성원인 작은 분자일 수 있으며, 각각 특이적 결합쌍의 다른 구성원에 결합된 후 검출될 수 있고, 예컨대 열량분석, 형광분석 또는 화학발광분석과 같은 방법에 의해 검출될 수 있는 검출가능한 신호의 생성을 촉매하는 효소에 콘쥬게이션된 결합쌍의 마지막 구성원을 갖는 바이오틴 및 스트렙토아비딘이다. 상기 모든 예들은 본 분야에 잘 공지되어 있다, 이들은 중합효소에 의해 프라이머 확장 생성물에 결합되며, 표적 서열을 따라서 더 이상의 확장을 중지시키기 위해 사용한다. 결과의 절단된 확장 생성물은 표지된다. 축적된 다중 치환된 프라이머 확장 생성물은 각 유사체의 결합 부위에 따라 길이가 다양하고, 이것은 표적 서열상의 상보성 뉴클레오티드이 다양한 서열 위치로 나타난다.
서열 정보를 해석하기 위한 반응 생성물의 분석이 본 분야에 공지된 여러 방법 중 어느 것을 사용하여 수행될 수 있다. 그러한 방법은 겔 전기영동 및 적합한 스캐너를 사용한 표지된 밴드의 검출, 겔 전기영동의 서열화 및 몰리큘라 다이나믹스 리더와 같은 인광에 의한 직접적인 방사성 표지된 밴드의 검출, 반응에 사용된 표지에 특이적인 검출기에 적합하게 된 모세관 전기영동 등을 포함한다. 또한, 표지는 결합 단백질에 콘쥬게이션된 효소와 조합하여 표지의 검출에 사용되는 결합 단백질에 대한 리간드일 수 있다. 표지는 검출가능한 신호를 생성하는 효소의 효소 활성에 의해 검출된다. 본 분야에 공지된 다른 서열화 방법에 따라서, 4 뉴클레오티드 종류(A, C, G, T)의 서열화 반응이 단일 반응 용기에서, 또는 분리된 반응 용기(4 뉴클레오티드 종류에 각각 1개씩)에서 수행된다. 사용될 방법의 선택은 사용된 뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체 및/또는 표지와 같은, 당업자에게 쉽게 분명한 실질적 고려사항에 의존한다. 따라서, 예를 들어, 각각의 유사체가 상이하게 표지된 경우, 서열화 반응은 단일 용기에서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르는 서열화 분석의 최적 성능을 위한 시약 및 반응 조건 선택의 고려사항은 이전에 설명된 서열화 방법에 대한 것들과 유사하다. 시약 및 반응 조건은 본 발명의 선형 핵산 증폭 방법에 대해 상기 설명된 바와 같야야 한다.
본 발명의 증대된 선형 증폭 방법(방법 1 및 2)을 사용한 규정된 핵산 표적의 등온 서열화
전사-기초 서열화는, 예를 들어 Sasaki et al. PNAS, 95:3455-3460, 1998에서 이전에 설명되었다. RNA 전사체로의 결합에 의하여 증대된 선형 증폭 반응의 반응 혼합물에서 rNTP 중합의 종결을 행하는 표지되거나 표지되지 않을 수 있는 rNTP 유사체의 포함은 유사체의 결합 부위에서 RNA 중합효소의 차단에 기인하는 절단된 RNA 생성물의 생성을 가져올 것이다. 적합한 rNTP 유사체가 본 분야에 공지되어 있다. 마지막은 사용된 방법(방법 1 또는 방법 2)에 따르는 관련 복합체에서 치환된 확장 생성물상의 결합된 마주하고 있는 상보하는 뉴클레오티드이다.
서열 정보를 해석하기 위한 반응 생성물의 분석이 본 분야에 공지된 바와 같은 여러가지 방법 중 어느 하나를 사용하여 수행된다. 그러한 방법은 본 발명의 (증대되지 않은) 선형 증폭 방법을 사용한 규정된 핵산 표적의 서열화에 대해 상기 설명된 것들을 포함한다.
본 발명의 증폭 방법을 이용하는 RNA 부분-기초 등온 돌연변이 검출
본 발명의 등온 증폭 방법에 사용되는 복합 프라이머의 유일한 특성은 표적 핵산 서열에 있는 규정된 돌연변이 또는 다형성 부위(SNP와 같은)의 검출의 등온 방법에 대한 근거를 제공하는 것이다. 이 방법은 유전자형화, 약물 내성을 가져오는 돌연변이의 검출 등에 유용하다. 이들 방법은 복합 프라이머의 RNA 부분에 일반적으로 혼성화하는 주형 가닥에 있는 영역의 서열을 특성화하는데 이용가능하다 - 그러므로, "규정된" 돌연변이에 대한 기준은 그것들의 위치에 관해 규정된다.
본 발명의 방법에 적합한 표적 핵산 서열은 ssDNA이다. 그러나, dsDNA 표적 또는 RNA 표적으로부터 ssDNA 표적의 제조가 상기 설명되고 본 분야에 공지된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 한 구체예가 도 4에 도식적으로 예시된다. 이 구체예에서, 복합 프라이머의 RNA 부분(들)은 서열 변경의 존재가 기대되는 시험 표적 핵산 서열에 상보하도록 디자인된다. 또는 달리, 프라이머는 시험 표적 핵산의 서열과 비교하여, 기준 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 상보하는 서열을 포함하는 RNA 부분(들)을 포함한다. 어떤 구체예에서, 변경된 서열(즉, 서열 변경을 포함하는 서열) 및 기준 서열은 대립유전자이다. 서열 변경은 단일 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 서열 변경의 부위가 도 4에서 X에 의해 도식적으로 표시된다.
다른 구체예에서, 복합 프라이머의 부분(들)은 시험 표적 핵산에 존재할 것이 기대되는 변경된 서열에 상보하도록 디자인된다. 또는 달리, 프라이머는 시험 표적 핵산에 상보하는 서열을 포함하는 RNA 부분(들)을 포함하며, 따라서 시험 핵산의 서열과 비교하여, 기준 서열(예를 들어, 야생형 서열)에는 상보하지 않는다. 어떤 구체예에서, 변경된 서열(즉, 서열 변경을 포함하는 서열) 및 기준 서열은 대립유전자이다.
복합 프라이머의 RNA 부분, 일반적으로 5' RNA 부분은 공지된 정상 야생형 서열, 또는 공지된 돌연변이 또는 다형성 유전자형에 상보하는 서열을 포함한다. 일반적으로, 적합한 복합 프라이머는, 만일 표적 핵산 서열이 미스매치(즉, 프라이머가 돌연변이된 서열을 가지고, 표적은 가지지 않거나, 그 반대의 경우)의 경우와 비교하여, 프라이머의 RNA 부분에 상보하는 서열을 포함한다면, 프라이머가 표적 핵산에 우선적으로 혼성화하는 것을 허용하는 RNA 부분을 포함하며, 여기에서 표적 핵산은 결합된 프라이머 확장 생성물이고, 절단된 5' RNA 부분을 가진다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 서열 변경의 존재는 일반적으로 증폭의 초기 단계를 방지한다. 복합 프라이머는 표적 서열에 혼성화하여 제 1 3분자 복합체를 형성하고, 확장된다. 다음에, RNaseH와 같은 리보뉴클레아제가 복합체의 확장된 프라이머의 RNA 부분을 절단한다. 미스매치된 염기쌍의 존재가 RNA/DNA 혼성체의 절단 패턴에 영향을 미칠 것 같지만, 그럼에도 절단은 일어날 것 같다. 5' RNA 부분의 혼성화에 의한 복합 프라이머와 혼성체 결합의 다음 단계는 매스매치에 의해 억제, 바람직하게 방지될 것이다. 이 효과는 혼성화한 올리고뉴클레오티드의 크기 및 반응 조건의 긴축도와 같은 인자에 의존한다. 이들 인자가 잘 공지된 기술 및 본 분야의 관행에 따르는 복합 프라이머의 디자인에 있어 고려된다. 또한, 미스매치가 복합 프라이머의 RNA 부분(들)의 절단을 억제하고, 따라서 표적 서열의 증폭을 방지하는 것이 가능하다. 다른 가능성은 미스매치가 프라이머의 RNA 부분 절단의 낮은 효율을 가져옴으로써 보다 적은 증폭 생성물의 증폭 또는 생성의 낮은 효율을 가져오는 것이다. 증폭의 이 단계에서 표적에 혼성화하는 복합 프라이머의 무능은 프라이머 확장 가닥 치환 및 증폭 생성물의 다중 카피의 생성의 더 이상의 단계를 방지한다. 본 발명의 방법에 의한 돌연변이의 검출이 프라이머 확장 생성물의 보재 또는 존재, 또는 축적된 프라이머 확장 생성물 양의 정량적 비교를 기초로 할 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 복합 프라이머가 기준 서열(예를 들어, 야생형)을 포함하는 경우, 표적 가닥에 돌연변이의 존재는 검출가능한 증폭 생성물을 가져오지 않을 수 있다. 또는 달리, 검출 가능한 생성물을 가져온지만 돌연변이가 없는 주형 가닥으로부터 생성된 것들 보다 적을 수 있다.
복합 프라이머가 돌연변이 유전자형에 완전히 상보하는 RNA 부분, 일반적으로 5' RNA 부분을 포함하는 경우, 정상 유전자형을 갖는 서열의 증폭은 방지될 것이며, 돌연변이 유전자형 표적이 증폭될 것이다. 따라서, 이 경우에, 증폭 생성물의 다중 카피의 검출 및/또는 정량적 측정은 돌연변이 유전자형의 표적 서열의 존재에 대한 표지일 것이다. 예를 들어, 관심의 핵산 샘플 또는 야생형 서열을 갖는 표적 핵산의 기준 샘플을 포함하는 병렬 반응이 수행될 수 있다. 후자의 반응과 비교하여 전자의 반응에서 더 많은 프라이머 확장 생성물의 축적은 관심의 샘플에 있는 돌연변이 유전자형의 존재에 대한 표지일 것이다. 또는 달리, 복합 프라이머가 시험 표적의 정상 유전자형 서열에 완전히 상보하는 5' RNA 서열을 포함하는 경우, 돌연변이 유전자형의 표적 서열의 증폭은 방지되고, 증폭 생성물의 검출 및/또는 정량적 측정은 정상 유전자형에 대한 표지이다.
본 발명의 증폭 방법 중 어느 것이 상기 설명된 바와 같은 돌연변이의 검출에 적합하다.
본 발명의 증폭 방법을 이용한 3'-뉴클레오티드-기초 등온 돌연변이 검출
이 방법에서, 복합 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드의 상보성이 돌연변이된 서열의 존재 또는 부재를 특성화하는데 사용된다. 복합 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드와 표적 핵산의 혼성화는 프라이머 확장을 필요로 한다. 그러므로, 생성물 증폭은 표적 핵산이 복합 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드에 의해 규정된 서열을 함유한다는 것을 나타낸다. 생성물 증폭의 감소 또는 부재는, 한편, 표적 핵산이 복합 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드에 상보하는 염기를 적어도 포함하는 서열 변경을 함유한다는 것을 나타낸다. 서열의 결여는 점돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성, 3'-말단 뉴클레오티드에 의해 규정된 서열을 포함하는 서열 세그먼트의 삽입 또는 결실에 기인할 수 있다.
한 구체예에서, 변이체 뉴클레오티드 위치에 있는 다양한 서열(대립유전자로 인한 것과 같은)에 상응하는 3'-말단 뉴클레오티드를 가지도록 디자인된, 유전자형 -특이적 프라이머가 본 발명의 방법에 따르는 증폭에 사용된다. 증폭 생성물의 존재는 표적 핵산이 사용된 특정 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드에 의해 규정된 서열을 포함한다는 것을 나타낼 것이다. 증폭 생성물의 부재 또는 부족(사용된 특정 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드에 의해 규정된 서열을 갖는 기준 핵산과 비교하여)은 표적 핵산이 사용된 특정 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드에 의해 규정된 서열을 포함하지 않는다는 것을 나타낼 것이다.
본 발명의 증폭 방법을 이용하는 단일가닥 입체구조 다형성을 기초로 한 돌연변이 검출
또한, 본 발명의 방법에 따라서 생성된 DNA 또는 RNA 증폭 생성물은 서열 변경 이외에는 표적 핵산 서열과 동일한 기준 핵산 서열과 비교하여, 표적 핵산 서열에 있는 어떤 변경의 검출에 대한 분석에 적합하며, 이것은 다음에 논의된다.
이전에 설명된 선형 핵산 증폭 방법(DNA) 및 증대된 선형 증폭 방법(RNA)의 생성물은 단일가닥 입체구조 다형성(SSCP 또는 rSSCP) 기초 돌연변이 검출에 적합하다. 새로운 증폭 방법의 RNA 생성물이 더 이상의 증폭에 대한 기질이 아닌 한, 새로운 방법에 따르는 서열 증폭은 단일가닥 생성물에서 2차 구조를 감소시키는 제제의 존재를 필요로 하지 않는다. 다른 사람들에 의해 설명된 전사-기초 증폭 방법은 DMSO와 같은 2차 구조를 감소시키는 제제의 존재하에서 수행된다. 따라서, 본 발명의 증대된 선형 증폭 방법은, 특이적 서열 특징의 존재, 또는 기준 핵산과 비교하여 시험 핵산에 있는 어떤 차이의 존재를 해석하기 위한 단일가닥 RNA 생성물에 대한 특이적 이동도 패턴의 확인을 위한 전기영동 분리법과 같은 단일가닥 입체구조 다형성을 검출하기 위한 적합한 수단과 직접적으로 결합될 수 있다고 예상된다.
겔 전기영동 또는 모세관 전기영동을 기초로 하는 방법은 다양한 단일가닥 입체구조 이성질체의 검출 및 분석에 사용될 수 있다. 또는 달리, 또한, 서열 의존성 2차 구조를 인식하는 뉴클레아제를 사용한 단일가닥 DNA 또는 RNA 생성물의 절단이 서열 특이적 입체구조 다형성의 검출에 유용할 수 있을 것 같다. 그러한 뉴클레아제는 Cleavase 분석(제 3 파)과 같은, 본 분야에 공지되어 있다. 전기영동법은 고처리량 돌연변이, 또는 유전자형화, 검출 방법에 잠재적으로 더 적합하다.
주어진 핵산 서열에 대한 서열 특이적 전기영동 패턴의 측정은 시험 서열의 특이적 대립유전자의 검출에 유용하다. 더욱이, 다양한 대립유전자에 대한 전기영동도 패턴은 잘 분화되고, 이로써 이형성 유전자형 또는 다중 대립유전자에 필요한 바와 같은, 단일 게놈 DNA 샘플에 있는 2개 대립 유전자의 검출을 허용할 수 있다고 기대된다. 염기 치환, 삽입 또는 결실과 같은 시험 핵산 서열에 있는 어떤 변경이 이 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 방법은 특이적 단일 염기 다형성 SNP의 검출 및 새로운 SNP의 발견에 유용할 것이라고 기대된다.
핵산의 마이크로어레이 제조 방법
이전에 설명된 선형 핵산 증폭 방법(DNA) 및 증대된 선형 증폭 방법(RNA) 생성물의 단일가닥 성질은 특히 증폭 생성물을 포함하는 마이크로어레이를 제조하는데 적합하다.
핵산을 유리 슬라이드와 같은 고체 기판에 부착하기 위한 몇가지 기술이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 한 방법은 아민기, 아민기의 유도체 또는 양전하를 갖는 다른 기와 같은 고체 기판에 부착할 수 있는 부분을 함유하는 변형된 염기 또는 유사체를 증폭된 핵산에 결합하는 것이다. 다음에, 증폭 생성물이 증폭 생성물상의 유리 슬라이드에 공유적으로 부착되는 반응성 기와 공유 결합을 형성하는 알데히드 또는 다른 반응성 기로 코팅된 유리 슬라이드와 같은 고체 기판과 접촉된다. 아미노 프로필 실리칸 표면 화학을 사용하는 것들과 같은 다른 방법이 또한 본 분야에 공지되어 있으며, http://www.cmt.corning.com 및 http://cmgm.standord.ecu/ pbrown1에 설명된다.
나중에 반응성 기로 스위치될 수 있는 프라이머에 대한 기의 부착이 또한 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 가능하다. 복합 프라이머의 뉴클레오티드에 대한 어떤 부착은 선형 증폭 방법의 단일가닥 DNA 생성물의 일부가 될 것이며, 다음에 이것이 마이크로어레이의 고체 표면에 부착될 수 있다.
본 발명의 증폭 방법은, 사용된 기술에 의해 필요 및/또는 허락된다면, 고체 기판에 부착 전 또는 후에 단편으로의 절단을 통하거나 또는 검출가능한 표지의 부착에 의한 것과 같이, 더 변형될 수 있다.
핵산의 특성화
본 발명의 방법에 의해 얻어진 증폭 생성물은 생성물이 단일가닥이기 때문에, 특히 더 특성화된다. 증폭 생성물인 DNA 또는 RNA는 서든 및 노던 블롯팅과 같은, 본 분야에 공지된 프로브 혼성화 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 또한, 증폭 생성물은 그것들은 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 마이크로어레이와 접촉시킴으로써 분석될 수 있다. 프로브의 동일성이 증폭 생성물의 서열 동일성에 대한 특성을 제공하며, 따라서 외삽에 의해 상기 주형 핵산을 함유할 것이 기대되는 샘플에 존재하는 주형 핵산의 동일성을 제공한다.
본 발명의 조성물 및 키트
또한, 본 발명은 본원에 설명된 방법에 사용되는 조성물 및 키트를 제공한다. 조성물은 본원에 설명된 어떤 성분(들), 반응 혼합물 및/또는 중간체, 그리고 어떤 조합일 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 예에서, 본 발명은 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, RNA 부분은 DNA 부분에 인접해 있다. 다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 RNA 부분이 개재된 5' 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 예에서, 본 발명은 복합 프라이머를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 핵산 마이크로어레이의 제조에 사용되는 고체 기판의 부착을 행할 수 있는 부분의 부착에 의해 더 유도된 복합 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 복합 프라이머는 아민과 같은 양으로 하전된 부분의 부착에 의해 더 유도된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 TSO(즉, 주형과의 결합을 증대시키는 1개 이상의 변형을 함유하는 TSO를 포함하여, 본원에 설명된 TSO 구체예 중 어느 것)를 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 조성물은 복합 프라이머 및 종결 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 TSO 또는 PTO(즉, 본원에 설명된 구체예들 중 어느 것)와 같은 프로프로모터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 복합 프라이머 및/또는 차단인자 서열을 더 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 차단인자 서열(즉, 변형을 갖는 차단인자 서열을 포함하여, 본원에 설명된 구체예 중 어느 것)을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 (a) RNA 부분 및 3' DNA 부분(어떤 구체예에서, RNA 부분은 DNA 부분에 인접해 있다)을 포함하는 복합 프라이머; 및 (b) 종결 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 종결 서열은 TSO이다. 다른 구체예에서, 종결 서열은 차단인자 서열이다. 어떤 구체예에서, 복합 프라이머는 5' RNA 부분 및 3' DNA 부분(어떤 구체예에서, RNA 부분은 DNA 부분에 인접해 있다)을 포함한다. 다른 구체예에서, 복합 프라이머는 적어도 하나의 RNA 부분이 개재된 5' 및 3' DNA 부분을 포함한다. 어떤 구체예에서, 조성물은 (a) 복합 프라이머; (b) 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (c) 프로프로모터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, 프로프로모터 서열은 PTO에 의해 제공된다. 다른 구체예에서, 프로프로모터 서열은 TSO에 의해 제공된다. 상기 조성물 중 어느 것은 주형(표적 서열을 포함하는) 및/또는 본원에 설명된 효소 (DNA 중합효소, RNaseH 및/또는 RNA 중합효소와 같은) 중 어느 것을 더 포함할 수 있다. 조성물은 일반적으로 수성 형태, 바람직하게는 적합한 완충액 중에 있다.
또한, 본 발명은 본원에 설명된 증폭 생성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 표적 서열의 카피인 DNA(안티센스) 또는 RNA(센스) 분자의 집단을 제공하며, 이것은 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 의해 생성된다.
동결건조 형태일 수도 있지만, 조성물은 일반적으로 적합한 배지중에 있다. 적합한 배지는 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 수성 배지(순수한 물 또는 완충액)을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 따라서, 여러가지 키트가 적합한 패키지 상태로 제공된다. 이 키트는 본원에 설명된 사용 중 어느 1개 이상에 사용될 수 있고, 따라서 다음 사용 중 어느 1개 이상에 대한 지시사항을 함유한다: 뉴클레오티드 서열 증폭; 증폭된 폴리뉴클레오티드의 서열화; 및 증폭된 폴리뉴클레오티드에 있는 서열 돌연변이의 검출.
본 발명의 키트는 본원에 설명된 성분들의 어떤 조합을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함하며, 다음은 그러한 키트의 예들이다. 어떤 구체예에서, 키트는 2개 이상의 복합 프라이머를 포함하며, 이것은 개별적으로 패키지되거나, 또는 그렇지 않을 수 있다. 다른 구체예에서, 키트는 복합 프라이머 및 종결 서열(본원에 설명된 것들 중 어느 것)을 포함한다. 키트는 복합 프라이머, 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 프로프로모터 서열(PTO 또는 TSO일 수 있다)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 복합 프라이머는 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 또한, 키트는 본원에 설명된 효소 중 어느 1개 이상, 그리고 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 및/또는 리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 선택적으로 포함한다. 또한, 키트는 1개 이상의 적합한 완충액(본원에 설명된 바와 같은)을 포함한다. 핵산 서열화에 유용한 키트는 프라이머 확장 생성물로의 결합에 의하여 뉴클레오티드 중합의 종결을 행하는 표지되거나 표지되지 않은 뉴클레오티드 유사체를 선택적으로 포함한다. 부형제를 포함하여, 키트중의 1개 이상의 시약은 보통 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있으며, 이것은 용해시에 본원에 설명된 방법 중 어느 것을 수행하기 위한 적합한 농도의 시약 용액을 제공할 것이다. 각 성분은 개별 용기에 패키지될 수 있거나, 또는 교차 반응성 및 자체 생존이 허락되는 경우, 일부 성분들이 한 용기에서 조합될 수 있다.
본 발명의 키트는 의도된 핵산 증폭을 위한 본 발명 방법의 성분들의 사용에 관한, 및/또는 적합하게는 핵산 서열화 및 서열 돌연변이의 검출과 같은 목적을 위한 증폭 생성물의 사용을 위한 지시사항 지시사항 세트를 선택적으로 포함할 수 있으며, 이것은 일반적으로 서면이지만, 지시사항을 함유하는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기디스켓 또는 광디스켓)도 이용가능하다. 키트와 함께 포함된 지시사항은 일반적으로 본 발명의 방법을 실행하는데 필수적인 시약에 관한 정보(키트에 포함되는지 아닌지의 여부), 키트를 사용 방법에 대한 지시, 및/또는 적합한 반응 조건에 관한 정보를 포함한다.
키트의 성분(들)은 어떤 편리하고 적합한 패키지로 패키지될 수 있다. 성분들은 개별적으로, 또는 1개 이상의 다중 조합으로 패키지될 수 있다. 키트가 본 발명의 증대된 선형 증폭 방법의 실행을 제공하는 경우, RNA 중합효소(포함된다면)가 바람직하게 전사 단계 전의 단계에서 사용된 성분들과 분리하여 제공된다.
키트에 있는 여러 성분의 상대적인 양은 본원에 설명된 방법을 실행하는데 필요한 반응을 실질적으로 최적화하는, 및/또는 어떤 분석에 대한 감도를 더 최적화하는 시약의 농도를 제공하도록 광범위하에 변할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 설명된 방법을 행하기 위한 시스템을 제공한다. 이들 시스템은 상기 논의된 성분들의 다양한 조합을 포함한다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 본 발명은 (a) 복합 프라이머(본원에 설명된 것들 중 어느 것), (b) DNA 중합효소, 및 (c) 리보뉴클레아제를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는(또는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하는) 적합한 시스템을 제공한다. 어떤 구체예에서, 시스템은 종결 서열(본원에 설명된 것들 중 어느 것)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 시스템은 프로프로모터 서열(이것은 PTO 또는 TSO일 수 있다) 및 DNA 의존성 RNA 중합효소를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 시스템 구체예들 중 어느 것은 또한 본원에 설명된 바와 같은 주형(표적) 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 설명된 성분들의 다양한 조합을 함유하는 반응 혼합물(또는 반응 혼합물을 포함하는 조성물)을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 (a) 폴리뉴클레오티드 주형, (b) 3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머, 및 (c) DNA 중합효소를 포함하는 반응 혼합물을 제공한다. 본원에 설명된 바와 같이, 3' DNA 부분에 인접한 5' RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 포함하여, 복합 프라이머 중 어느 것(또는 복수의 복합 프라이머)이 반응 혼합물에 있을 수 있다. 반응 혼합물은 또한 RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 RNaseH와 같은 효소를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 반응 혼합물은 또한 본원에 설명된 종결 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함할 수 있다. 반응 혼합물의 다른 예는 (a) 치환된 프라이머 확장 생성물(및, 5'-단부에 복합 프라이머의 3' DNA 부분에 상보하지만, 복합 프라이머의 RNA 부분에는 상보하지 않는 서열을 함유하는 것과 같은); (b) 프로프로모터 서열(예를 들어, PTO)를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) RNA 중합효소이다. 다른 반응 혼합물이 본원에 설명되며, 본 발명에 의해 포함된다.
또한, 본 발명은 본원에 설명된 복합체(이것은 본원에 설명된 반응에서의 중간체이다) 중 어느 것을 포함하는 조성물을 포함한다. 이 복합체가 도 1 내지 도 4에 도식적으로 묘사된다. 예로서, 본 발명의 한 복합체는 (a) 주형 가닥; 및 (b) 3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 포함하는 복합체이다. 복합 프라이머는 5'이고 3'' DNA 부분에 인접한 RNA 부분을 가질 수 있다. 복합체는 종결 서열(TSO 또는 차단인자 서열과 같은)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 복합체는 또한 PTO와 같은 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
다음의 실시에는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
일반적 방법
이 실시예에서 설명되는 일반적 방법은 본원에 제공된 다른 실시예에도 이용된다.
완충액
실시예 전체를 통해 사용된 완충액은 다음 물질을 사용하여 만들었다.
TE 완충액: 10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA
TBE 완충액: 89mM 트리스 염기, 89mM 붕산, 2mM EDTA, pH 8.3
FX 완충액: 20mM 트리스-SO4, pH 9.0, 20mM (NH4)2SO4, 0.1% NP-40
단일 키메라 프라이머, DNA 중합효소 및 RNaseH를 사용한 등온 선형 증폭
서열 증폭을 20mM 트리스-HCl, pH 8.5, 6.0mM MgCl2, 1.0mM dATP, 1.0mM dCTP, 1.0mM dTTP, 0.8mM dGTP, 0.2mM dITP(아메르샴의 dNTP), 0.6% DMSO, 0 내지 8% 글리세롤, 0 내지 100ug/ml 아셀틸화 BSA(암비온, 텍사스 오스틴), 0.6 유니트/ ul 재조합 리보뉴클레아제 억제제(rRNasin, 프로메가, 위스콘신 메디슨), 0.5 내지 5uM 복합 프라이머 IA005, 및 100 내지 200nM 프로모터-주형 올리고뉴클레오티드 (PTO) IA015C를 함유하는 15ul 반응물에서 수행했다. 복합 프라이머 IA005는 ACGG AUGCGGUCUCCAGTGT(SEQ ID NO:1)의 서열을 갖는 20-mer 프라이머이다. 프로모터-주형 올리고뉴클레오티드(PTO)는
ggAATTCTAATACgACTCACTATAgggAgAgCggTACgCTgATCAAAgATCCgTg-바이오틴(SEQ ID NO:12)
의 서열을 갖는 55-mer 올리고뉴클레오티드이다.
반응물에는 2개 효소를 제외한 모든 성분들이 모여있다. 프로그램가능한 열순환기(GeneAmp 9600, 퍼킨엘머)에서 10초간 70℃ 또는 99℃로 가열한 후, 각 실시예들에 설명된 바와 같이, 반응 혼합물을 55℃, 60℃ 또는 65℃로 냉각한다. 온도를 낮추면서, 0.05 내지 0.24 유니트 RNaseH(희석제/저장 용액: 10mM 트리스-HCl, pH 8.5, 30% 글리세롤을 사용하여 5 U/ul 스톡 용액으로부터 희석; 하이브리다제 열안정성 RNaseH, 에피센터 테크놀로지스, 위스콘신 메디슨) 및 1.0 내지 5.0 유니트 Bca DNA 중합효소(2 U/ul; 판베라, 위스콘신 메디슨)를 가했다. 반응물을 30분간 55℃ 내지 65℃에서 인큐베이션하고 4℃로 냉각했다. 반응물은 RNA 전사 단계가 요구될 때까지 4℃에 있을 수 있다.
선형 증폭 ssDNA 생성물의 RNA 전사에 의한 증대된 선형 증폭
전사를 상기 선형 증폭 반응 혼합물 2.5ul, 및 40mM 트리스-HCl, pH 8.5, 70mM KCl, 5.0mM DTT, 12mM MgCl2, 110ug/ml BSA, 3mM 각 rNTP(ATP, UTP, CTP, GTP, 아메르샴), 7.5% DMSO, 1 유니트/ul rRNasin(프로메가, 위스콘신 메디슨), 및 20 유니트 T7 RNA 중합효소(암비온, 텍사스 오스틴)를 함유하는 10ul 반응물중에서 3시간 동안 37℃에서 수행했다.
DNA 주형
E. coli K12의 J-유전자 영역으로부터의 서열을 다음 실시예 중 몇몇에 대한 DNA 주형으로서 선택했다. 3가지의 DNA 주형을 이들 실험을 위해 사용했다: 합성 DNA 표적(IA013), PCR 증폭에 의해 일차적으로 생성된 단일가닥 DNA(351 염기) 주형, 및 E. coli의 K12 균주로부터의 게놈 DNA(실시예 4에 설명된 제조물). 합성 DNA 표적 IA013은
Spacer18-Spacer18CGGTACGCTGATCAAAGATCCGTGCAACAAATGTCATGGTCATGGTCGTGTTGA GCGCAGCAAAACGCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGGACACTGGAGACCGCATCCGT(SEQ ID NO:18)
을 포함한다.
Spacer18은 폴리옥시에틸렌 스페이서로 간주한다. 이것들은 100bp ssDNA 생성물과 관련하여 그것의 이동도를 지연시키기 위해서 올리고에 부가된다. 전술된 PCR 증폭에 의해 일차적으로 생성된 단일가닥 DNA(351 염기) 주형의 서열은
이며, 여기에서 PCR 프라이머는 밑줄친 굵은 글씨이고, 복합 프라이머는 굵은 이탤릭체의 RNA 부분이다.
PCR 증폭 생성물로부터 ssDNA 표적의 제조
등온 선형 증폭용 단일가닥 DNA 주형을 프라이머 IA006 및 IA004를 사용하여 E. coli J 유전자의 351bp 세그먼트의 PCR 증폭에 의해 제조했다. 프라이머 IA006은 CGGTACGCTGATCAAAgATCCGT(SEQ ID NO:16)의 서열을 갖는 23-mer이다. 프라이머 IA004는 CGCATACGGAATAGCTTACCGGTCT(SEQ ID NO:15)의 서열을 갖는 26-mer이다.
PCR을 20mM 트리스-SO4, pH 9.0, 20mM (NH4)2SO4, 0.1% NP-40, 2.0mM MgCl2, 300uM 각 dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 5 유니트 Taq DNA 중합효소, 400nM 프라이머 IA006, 400nM 5'-포스페이트 프라이머 IA004, 및 E. coli K12 균주의 미정제 세포용해액 0.2ul을 함유하는 100ul 반응물중에서 수행했다. 변형된 "터치다운 PCR" 프로토콜을 다음의 파라미터와 함께 사용했다: 95℃ 5초, 68℃ 1분 5사이클; 94℃ 5초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 5 사이클; 94℃ 5초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 40 사이클; 72℃ 15분; 무기한으로 4℃에 유지함. 프라미어 IA004를 람다 엔도뉴클레아제 (Strandase 키트, 노바겐, 위스콘신 메디슨)에 의한 소화로부터 센스-가닥을 보호하기 위해 5'-포스페이트를 사용하여 합성했다. Strandase 소화를 제조자의 권고에 따라 수행했다. 간단히 말해서, 상기 설명된 바와 같이 제조된 PCR 생성물을 1시간 동안 -20℃로 냉각하면서 1/10 부피의 3M 나트륨 아세테이트, pH 5.2 및 0.6 부피의 이소프로판올을 가하여 반응 혼합물로부터 침전시키고, 30분간 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 원심분리했다. DNA 펠렛을 75% 에탄올로 1번 세척한 후, 80ul 물에 재현탁하기 전에 간단히 공기-건조했다. 농도를 260nm에서의 OD로부터 추정했고, 60 유니트 람다 엑소뉴클레아제(Strandase, 노바겐)를 가했다. 소화를 20분간 37℃에서 진행시킨 후, 반응물을 10분간 75℃로 가열하고 4℃로 냉각했다. 인큐베이션을 프로그램가능한 열순환기(GeneAmp 9600, 퍼킨엘머)에서 수행했다. 남아 있는 DNA를 제조자의 권고 과정에 따라서 QiaQuick 뉴클레오티드 제거 칼럼(퀴아겐, 캘리포니아 발렌시아)을 사용하고, 키트(퀴아겐, 캘리포니아 발렌시아)와 함께 제공된 완충액을 사용하여 정제했다. 간단히 말해서, 10 부피의 완충액 PN(퀴아겐)을 샘플에 가했다. 다음에, 전 부피를 퀴아겐 스핀 칼럼에 적용하여 원심분리(마이크로 원심분리기에서 6000rpm 1분)했다. 여과물을 버리고, 칼럼을 완충액 PE(퀴아겐) 500ul로 2번 세척했다. 다음에, 칼럼을 3분간 최대 속도에서 원심분리하여 완전히 건조시켰다. DNA를 50ul 완충액 EB(10mM 트리스-HCl, pH 8.5, 퀴아겐)으로 용출했다. 농도를 260nm에서의 OD로부터 약 2.5x1012 카피/ 5ul로 추정했다. 겔 분석으로 상당한 dsDNA(전체의 반 미만)가 남아있음을 밝혔으며, 농도의 오차는 2배 미만이었다. DNA를 TE 완충액으로 1010 카피/5ul로 희석했다. 일련의 희석물을 필요에 따라 1010 카피 스톡 용액으로부터 제조했다. OD 측정에 근거한 농도를 제한 희석 PCR 분석에 의해 확인했다.
겔 전기영동
증폭 생성물을 Novex 전기영동 장치(EI9001-XCell II Mini Cell, 노벡스)에서 1x TBE 완충액(89mM 트리스 염기, 89mM 붕산, 2mM EDTA, pH 8.3) 중의 Novex 예비-캐스트 4 내지 20% 폴리아크릴아미드 구배 겔(인비트로겐, 캘리포니아 칼스배드; 파트 번호 EC62255) 상에서 전기영동적으로 분리했다. 선형 증폭 또는 전사(증대된 선형 증폭)로부터의 반응 혼합물(5ul)을 6x 겔 로딩 용액(40% 수크로스, 0.25% 브로모페놀 블루, 0.25% 크실렌 시아놀) 1ul과 혼합하고, 전체 샘플을 각 웰에 즉시 로딩했다. 모든 샘플이 겔에 들어갈 때까지 대략 5분간 겔에 250V를 걸고, 전압을 45분간 175V로 낮췄다. 플라스틱 플레이트들 사이의 겔을 제거하고, 1x TBE 완충액(89mM 트리스 염기, 89mM 붕산, 2mM EDTA, pH 8.3) 중의 0.5ug/ml 에티듐 브로마이드로 염색했다. dsDNA 분자 크기 마커(Hi-Lo DNA 마커, 바이오넥수스, 캘리포니아 산레안드로)를 각 겔 전개 레인 중 1개 레인에 포함시켰다. 이 마커는 50, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1400, 1550, 2000, 3000, 4000, 6000, 8000 및 10000bp 크기의 16 단편을 함유한다. 전형적으로, 50 내지 2000bp가 사용된 겔상에서 분해될 수 있다.
혼성화
혼성화 실시예를 위한 올리고뉴클레오티드 프로브(ssDNA 생성물용 IA010; ssRAN 생성물용 IA014)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(뉴잉글랜드 바이오랩스, 메사츄세츠 베버리) 및 γ-32P-ATP(아데노신 5'-[γ-32P]트리포스페이트, 트리에틸암모늄염, 아메르샴, 뉴저지 피스카타웨이; PB10218, >5000Ci/mmol, 10mCi/ml)를 사용하여 5'-단부-표지했다. 프라이머 IA010은 ATGTCATGGTCATGGTCGTGT(SEQ ID NO:13)의 서열을 갖는 21-mer이다. 프라이머 IA014는 CTCAACACGACCATGACCATGACATTTGTTG (SEQ ID NO:14)의 서열을 갖는 31-mer이다. 표지한 반응물(총부피 50ul)은 70mM 트리스-HCl, pH 7.6, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 1ug 올리고(프라이머 IA010에 대해 147 pmol; 프라이머 IA014에 대해 101pmol), 250uCi γ-32P-ATP, 및 30 유니트 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 함유했다. 인큐베이션을 30분간 37℃에서 수행하고, 이어서 QIAquick 뉴클레오티드 제거 키트(퀴아겐, 캘리포니아 발렌시아)를 사용하여 미결합 뉴클레오티드를 제거했다. 붕괴 속도(cpm)를 Packard Minaxi Tri-Carb 4000 시리즈 액체 섬광계수기에서 표지된 올리고 1ul를 케렌코브 계수하여 측정했다.
혼성화를 30ul 반응물에서 수행했다. 생성물 DNA(또는 RNA, 10ul)를 프로브 혼합물 20ul에 가했다. 반응물은 100mM NaCl 및 106cpm의 프로브(14.3일의 반감기를 사용하여 붕괴에 대해 보정함)함유했다. 15초간 65℃로 가열한 후, 혼성화를 30분간 42℃에서 진행하고, 이어서 4℃로 냉각했다. 이들 단계는 가열된 커버가 있는 프로그램가능한 열순환기(GeneAmp 9600, 퍼킨엘머)에서 수행했다. 혼성화 반응물의 전 부피를 3시간 동안 150V에서 1x TBE 완충액(89mM 트리스 염기, 89mM 붕산, 2mM EDTA, pH 8.3) 중의 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동했다. 유리 플레이트에서 겔을 제거하고, 플라스틱 덮개로 덮고, 2개의 증감 스크린을 사용하여 -20℃에서 하룻밤(~ 16시간) 방사선 사진법 필름(BioMax MR, 코닥)에 노출시켰다.
실시예 2
등온 선형 증폭
단일 복합 프라이머, DNA 중합효소, RNaseH, 및 TSO 또는 차단인자를 사용하여 등온 선형 증폭을 수행했다. 상기 설명된 모든 반응 성분을 함유하는 반응 혼합물, 그리고 복합 프라이머, RNaseH, 또는 Bac DNA 중합효소(판베라, 위스콘신 메디슨)과 같은 중요 시약 중 하나가 없는 반응 혼합물을 1010 카피의 합성 ssDNA 표적(IA010 - 실시예 1에 기재된 서열)을 사용하여 스파이크했다. 또한, 표적 ssDNA를 제외한 모든 시약을 함유하는 음성 대조표준 반응을 포함시켰다. 표적 DNA 서열의 등온 선형 증폭을 상기 설명된 바와 같이 수행했다. 표적 변성을 70℃에서 수행하고, 등온 증폭을 65℃에서 수행했다.
증폭 생성물을 겔 전기영동에 의해 분해했다(도 5)(레인 1: 분자량 사다리; 레인 #1-4: 각각 DNA 미함유, 프라이머 미함유, RNaseH 미함유, Bca DNA 중합효소 미함유; 레인 5: 모든 성분을 함유함). 프라이머, RNaseH 또는 Bca DNA 중합효소가 없는 반응 혼합물에서는 증폭 생성물이 검출되지 않았다.
선형 증폭 방법의 ssDNA 생성물에 대한 프로브 IA010 혼성화 및 방사선 사진법은, 도 6(레인 1-4: 각각 DNA 미함유, 프라이머 미함유, RNaseH 미함유, DNA 중합효소 미함유; 레인 5: 모든 성분을 함유함)에 나타낸 바와 같이, 증폭 생성물의 동일성을 입증했다. 이 실험에서 합성 올리고뉴클레오티드 표적의 선형 증폭을 차단되지 않은 프로모터-주형 올리고뉴클레오티드(IA015b)를 사용하여 행했다. 프로모터 -주형 올리고뉴클레오티드 IA015b는 GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTA CGCTGATCAAAGATCCGTG(SEQ ID NO:11)의 서열을 갖는 55-mer이다. 이 증폭 반응에 사용된 증폭 반응 표준 반응물 성분은 상기 주어진 바와 같다. 반응물을 65℃로 냉각하고, Bca 중합효소 및 RNaseH를 첨가한 후 30분간 이 온도에서 더 인큐베이션했다. 대조표준 반응(DNA 미함유, 프라이머 미함유, RNaseH 미함유, Bca 미함유)에서는 혼성화가 검출되지 않았다.
실시예 3
등온 선형 증폭 및 전사가 짝을 이룬 프로모터-주형 올리고뉴클레오티드
프로모터-주형 올리고뉴클레오티드(PTO)는 2개의 본질적인 서열 모티프: T7 프로모터 서열(5'-TAATACGACTCACTATAGGGAgGAG(SEQ ID NO:20)) 및 ssDNA 주형에 상보하는 서열을 함유한다. 4가지 버전의 PTO를 디자인했다(IA012, IA012b, IA015, IA015b). IA012 PTO는
GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG(SEQ ID NO:8)
의 서열을 갖는 67-mer이다. IA012 PTO는 핵 T7 프로모터에 더하여 2개 서열: 5'-확장(5'-GGAATTC(SEQ ID NO:21)) 및 프로모터와 표적 DNA-상보성 서열 사이의 스페이스(5'-ATCGAGTAGCTC(SEQ ID NO:22))를 함유한다. IA015는 5'-확장 및 스페이서가 결여된 더 짧은 PTO(48-mer)이다. IA015 PTO는
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG(SEQ ID NO:10)
의 서열을 가진다. IA012b PTO는 스페이서는 함유하지만, 확장은 함유하지 않는 60-mer이다. IA012b PTO는
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG(SEQ ID NO: 9)
의 서열을 가진다. IA015b는 확장은 함유하지만, 스페이서는 함유하지 않는다. IA015b의 서열은 실시예 2에 개시된다. 키메라 올리고뉴클레오티드 IA005, IA019 및 IA020 이외의 모든 프라이머들은 Keystone(디비젼 오브 바이오소스 인터내셔날, 캘리포니아 카마릴로)에 의해 합성하고 PAGE 정제했다.
이 증폭 방법에 대한 일반적 도해가 도 2a 내지 2c에 예시된다. ssDNA 주형을 T7 RNA 중합효소용 기질로 스위치하는 IA012, IA012b, IA015 및 IA015b의 능력을 합성 올리고 생성물(IA009)와 각 PTO 사이에 형성된 오버랩-확장 생성물의 전사 후 생성된 RNA의 양을 비교함으로써 평가했다. 합성 올리고 생성물 IA009는
AGTGTCCACCCCTGCCGGGATTTTAACGGACAGCGTTTTGCTGCGCTCAACACGACCATGACCATGACATTTGTTGCACGGATCTTTGATCAGCGTACCG(SEQ ID NO:19)
의 서열을 갖는 100-mer이다. 오버랩-확장을 20mM 트리스-HCl, pH 8.5, 6mM MgCl2, 1mM 각 dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 100nM IA009, 100nM PTO, 및 1 유니트 Bca DNA 중합효소를 함유하는 15ul 반응물에서 수행했다. 반응물을 Bca DNA 중합효소 없이 구성하여, 95℃로 가열한 후 10분에 걸쳐 60℃로 냉각했다. DNA 중합효소를 가한 후, 반응물을 30분간 60℃에서 인큐베이션했다. 반응 혼합물의 일부 (2.5ul)를 표준 RNA 전사 반응 혼합물에 가하고, 전사 반응을 겔 전기영동에 의해 평가했다.
도 7(레인 1: 분자량 사다리; 레인 2-5: 각각 IA012, IA012b, IA015, IA015b로부터의 오버랩-확장 생성물; 레인 6-13: 각각 IA012, IA012b, IA015, IA015b, IA012, IA012b, IA015, IA015b로부터의 RNA)에 나타낸 바와 같이, IA012 또는 IA012b에 의해서 보다 상당히 더 많은 RNA가 더 짧은 PTO(IA015, IA015b)를 사용하여 생성된 전사 기질에 의해 생성되었다. 5'-확장은 함유하지만 스페이서는 함유하지 않는 PTO(IA015b)는 명백히 더 높은 수율로 RNA를 생성했다. 그러나, 모든 경우에, 다중 생성물이 메이저 RNA 밴드에 더하여 나타났다. 자유 3'-OH를 제거하기 위해 3'-차단기(바이오틴)를 갖는 것을 제외하고 IA015b와 동일한 서열을 갖는 제 5 PTO를 디자인하여, 3'-차단 PTO의 개선된 성능을 증명했다. PTO의 자유 3'-OH의 차단은 전사 생성물의 비-특이적 생성을 가져오는 기능적 프로모터 서열과 증폭 생성물의 비-특이적 결합을 개시하는 PTO의 능력을 제거한다. 증대된 등온 선형 증폭에서 3'-차단 및 미차단 PTO의 성능을 표준 조건을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드 표적의 증폭으로부터 평가했다. 3'-차단 PTO(IA015c)는 IA015b와 비슷한 수율로 특이적 RNA를 생성했지만, 도 8(레인 1: 분자량 사다리; 레인 2, 9: DNA 미함유, 30분; 레인 3, 10: DNA 미함유, 1시간; 레인 4, 11: DNA 미함유, 2시간; 레인 5, 12: 1010 카피 IA013, 30분; 레인 6, 13: 1010 카피 IA013, 1시간; 레인 7, 14: 1010 카피 IA013, 2시간; 레인 8, 15; 1011 카피 IA013, 30분; 반응 1 내지 7은 차단되지 않았고(IA015b), 반응 8 내지 15는 차단되었다(IA015c))에 나타낸 바와 같이, 바탕값은 상당히 더 낮았다. 음성 대조표준 반응물(DNA 주형 없음) 및 1010 카피의 올리고 표적(IA013)을 함유하는 반응물을 55℃에서 30분, 1시간 또는 2시간 동안 가닥 치환에 의해 증폭했다. 가닥 치환 반응에는 IA015b 또는 IA015c를 포함시켰다. 3'-OH가 차단되지 않았을 때, 비-특이적 RNA가 모든 반응에서 생성되었고, 특이적 RNA 밴드의 확인은 분명하지 않았다. 반대로, 차단된 PTO는 일차적으로 단일 RNA 생성물을 생성했다.
실시예 4
증대된 등온 선형 증폭에 의한 E. coli 게놈 DNA의 J 유전자 서열의 증폭
DNA를 트립톤-NaCl 배지에서 하룻밤 성장시킨 E. coli(ATCC 10798) 25ml로부터 분리했다. 제조자의 권고 과정에 따라서, 리소자임 소화 및 무질서성 세포용해 용액(Bactozol 키트, 몰리큘라 리서치 센터, 오하이오 신시내티) 중의 가용화에 의해 게놈 DNA를 분리했다. 간단히 말해서, 박테리아를 5분간 6000x g에서 원심분리하여 수집했다. 세포 펠렛을 Bactozyme 소화 완충액에 재현탁하고, 30분간 50℃에서 인큐베이션했다. 결과의 세포용해액은 소화의 마지막에 어떤 눈에 보이는 소화되지 않은 세포 덩어리 없이 투명했다. 세포용해액을 4 부피의 DNazol 시약(몰리큘라 리서치 센터, 오하이오 신시내티)와 혼합하고, 실온에서 15분간 인큐베이션했다. 0.6 부피의 얼음-냉각 에탄올을 가하여 DNA를 용액으로부터 침전시켰다. 실온에서 5분간 인큐베이션한 후, 침전된 DNA를 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 5분간 원심분리하여 수집했다. DNA 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고, 다시 원심분리하고, 자주 휘저으면서 50℃ 내지 55℃에서 30분간 가열함으로써 1.5ml TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁했다. 결과의 용액을 22 게이지 주사기 바늘을 통해 반복적으로 통과시켜 DNA를 잘라서 용액의 점도를 감소시켰다. 1/10 부피의 5M 암모늄 아세테이트 및 3 부피의 얼음-냉각 에탄올을 가하여 DNA를 다시 침전(EPI005-35)시켰다. 1시간 동안 -20℃에서 인큐베이션한 후, DNA를 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 원심분리하여 수집했다. 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고, 다시 원심분리하고, 150ul TE 완충액에 재현탁했다. OD 측정(Beckman DU640 분광광도계)용으로 TE 완충액중의 희석물을 2개 제조하여, 50ug/ml dsDNA는 260nm에서 OD가 1이라고 가정하여 DNA 농도를 계산했다. 2개 희석물의 DNA 농도는 24.2ug/10ul 및 24.6ug/10ul였다. 이들 두 측정값의 평균 (24.2ug/10ul)은 대략 2.5x109 게놈 카피/5ul(E. coli 게놈 DNA 5fg = 1 카피)에 상응한다.
증대된 등온 선형 증폭
DNA를 TE 완충액으로 109, 108 또는 107 카피/5ul로 연속적으로 희석하고, 5분간 95℃로 가열하여 변성시킨 후, 얼음에서 빠르게 냉각했다. 또한, 단일가닥 주형 DNA를 109 카피/5ul로 희석했다. DNA 미함유, 107, 108, 109 또는 2.5x109 카피의 게놈 DNA를 함유하도록 반응물을 모집했다.
증폭을 20mM 트리스-HCl, pH 8.5, 6.0mM MgCl2, 1.0mM dATP, 1.0mM dCTP, 1.0mM dTTP, 0.8mM dGTP, 0.2mM dITP(아메르샴의 dNTP), 6% DMSO, 8% 글리세롤, 100ug/ml 아세틸화 BSA(암비온, 텍사스 오스틴), 0.6 유니트/ul 재조합 리보뉴클레아제 억제제(rRNasin, 프로메가, 위스콘신 메디슨), 5uM 복합 프라이머 IA005(실시예 1에 개시된 서열), 200nM 프로모터-주형 올리고뉴클레오티드(PTO) IA015C(실시예 1에 개시된 서열)을 함유하는 15ul 반응물에서 수행했다. 2개 효소를 제외한 모든 성분들을 가지도록 반응물을 모집했다. 프로그램가능한 열순환기(GeneAmp 9600, 퍼킨엘머)에서 10초간 99℃로 가열한 후, 반응물을 30분간 60℃에서 인큐베이션했다. 60℃를 만들면서, 0.6ul RNaseH(10mM 트리스-HCl, pH 8.5, 30% 글리세롤중에 5 U/ul로부터 희석된 5 유니트, 하이브리다제, 에피센터 테크놀로지스, 위스콘신 메디슨) 및 1.0ul Bac DNA 중합효소(2.0 유니트, 판베라, 위스콘신 메디슨)을 가했다. 60℃ 인큐베이션의 마지막에, 반응물을 4℃로 냉각했다. 5.0ul 부피의 단일-치환 생성물을 각 RNA 전사 반응물(총부피 20ul)에 가했다. RNA 전사를 표준 조건을 사용하고, 직접적 겔 분석(5ul) 및 프로브 혼성화(10ul)을 위해 충분한 물질을 제공하도록 20ul까지 반응 부피를 스케일업하여 수행했다.
규정된 단일가닥 합성 표적의 증폭과는 달리, 본 발명의 방법에 따르는 게놈 DNA의 증폭은 규정된 3'-단부를 갖는 ssDNA 생성물의 형성에 대한 규정된 중지의 형성을 필요로 한다. 프라이머 확장에 대한 규정된 중지의 형성은, 표적 서열상의 규정된 부위에 혼성화하고, 중합효소에 의해 치환되지 않을 수 있는 차단인자에 의해 달성될 수 있다. 또는 달리, 본 실시예에서처럼, 프라이머 부위의 GC가 풍부한 서열 상류가 프라이머 확장에 대한 중지점을 제공하고, 이로써 규정된 3'-단부를 갖는 ssDNA 생성물의 형성을 가져온다.
본 발명의 증대된 등온 선형 증폭 방법에 의한 게놈 DNA의 규정된 서열의 성공적인 증폭이 도 9(레인 1: DNA 미함유; 레인 2: 107 카피 E.coli 게놈 DNA; 레인 3: 비어있음; 레인 4: 108 카피 E.coli 게놈 DNA)에 나타낸다. ssRNA 생성물은 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화하는 것으로 나타난다.
실시예 5
증대된 등온 선형 증폭의 성능에 대한 프라이머 디자인의 효과 평가
본 발명의 증폭 방법에서 3개 복합 프라이머의 성능을 각각 평가했다. 등온 선형 증폭을 20mM 트리스-HCl, pH 8.5, 6.0mM MgCl2, 1.0mM dATP, 1.0mM dCTP, 1.0mM dTTP, 0.8mM dGTP, 0.2mM dITP(아메르샴의 dNTP), 6% DMSO, 8% 글리세롤, 100ug/ml 아세틸화 BSA(암비온, 텍사스 오스틴), 0.6 U/ul 재조합 리보뉴클레아제 억제제(rRNasin, 프로메가, 위스콘신 메디슨), 5uM 복합 프라이머, 200nM 프로모터 -주형 올리고뉴클레오티드(PTO) IA015C를 함유하는 15ul 반응물에서 수행했다. PTO IA015C의 서열은 실시예 1에 개시된다. 복합 프라이머 IA005(20-mer)의 서열은 실시예 1에 개시된다. 문자와 숫자가 조합된 이름을 갖는 다른 복합 프라이머 서열은 다음과 같다:
IA019(20-mer) ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NO:2)
IA020(21-mer) GACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NO:3)
문자와 숫자가 조합된 이름을 갖지 않는 4개의 다른 복합 프라이머 서열을 사용했다. 이 서열들은 각각
(1) GCAAGACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NO:4)
(2) GACGATGCGUCTCCAGTGT (SEQ ID NO:5)
(3) GACGGATGCGGUCTCCAGUGT (SEQ ID NO:6)
(4) GACGGATGCGGUCTCCAGUGUCCA (SEQ ID NO:7)
이들 복합 프라이머는 다마콘 리서치 인코퍼레이티드(콜로라도 보울더)가 합성했다. 올리고뉴클레오티드의 RNA 부분을 산불안정성 2'-오르토에스테르 보호기 (2'-비스(아세톡시에톡시)-메틸 에테르 또는 "2'-ACE"(Scaringe, S. A. 등 J. Am. Chem. Soc. 120:11820-11821 (1998) 및 Scaringe, S. A. RNA 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 진전된 5'-실릴-2'-오르토에스테르 접근법. Methods in Enzymology)와 함께 5'-실릴 보호기를 사용하여 합성했다. 프라이머를 PAGE 정제했다.
2개 효소를 제외한 모든 성분들을 가지도록 반응물을 모집했다. 프로그램가능한 열순환기(GeneAmp 9600, 퍼킨엘머)에서 10초간 70℃로 가열한 후, 반응물을 55 내지 65℃로 냉각했다. 온도를 낮추면서, 0.05 유니트 RNaseH(희석액/저장 용액: 10mM 트리스-HCl, pH 8.5, 30% 글리세롤을 사용하여 5 U/ul 스톡 용액으로부터 희석; 하이브리다제 열안정성 RNaseH, 에피센터 테크놀로지스, 위스콘신 메디슨) 및 2.0 유니트 Bca DNA 중합효소(2 U/ul, 판베라, 위스콘신 메디슨)를 가했다. 반응물을 30분간 55 내지 65℃에서 인큐베이션했다. 인큐베이션의 마지막에, 반응물을 RNA 전사때까지 4℃로 냉각했다. RNA 전사를 2.5ul 상기 선형 증폭 반응물, 및 40mM 트리스-HCl, pH 8.5, 70mM KCl, 5.0mM DTT, 12mM MgCl2, 110ug/ml BSA, 3mM 각 rNT(ATP, UTP, CTP, GTP, 아메르샴), 7.5% DMSO, 1 유니트/ul rRNasin(프로메가, 위스콘신 메디슨) 및 20 유니트 T7 RNA 중합효소(노바겐, 위스콘신 메디슨)을 함유하는 10ul 반응물에서 3시간 동안 37℃에서 수행했다.
각각의 복합 프라이머를 사용하여 생성된 증대된 선형 증폭의 생성물을 도 10(레인 1: 분자량 사다리; 레인 1, 2: IA015, 60℃; 레인 3, 4: IA019, 55℃; 레인 5, 6: IA019, 60℃; 레인 7, 8: IA019, 65℃; 레인 9, 10: IA020, 55℃; 레인 11, 12: IA020, 60℃; 레인 13, 14: IA020, 65℃)에 나타낸 바와 같이 겔 전기영동에 의해 분해했다. 복합 프라이머를 3'-단부에 있는 디옥시뉴클레오티드의 수를 다르게 하여, 표적 가닥상의 동일한 부위에서 혼성화하도록 디자인했다. 프라이머 IA020을 사용하여 RNA 생성물을 최고 수율로 생성했고, IA005 및 IA019는 동등했다. 다른 4개의 복합 프라이머로는 더 적은 RNA 생성물을 얻었다. 등온 선형 증폭 단계를 위한 최적 온도는 예상된 바와 같이 상이한 프라이머에 따라 상이했다.
실시예 6
선형 증폭 방법을 사용한 핵산 표적의 등온 서열화
먼저, 분석될 핵산을 그것들의 공급원으로부터 분리한다. 이 실시예에 사용되는 공급원의 비제한적인 예는 동물, 식물, 박테리아, 바이러스, 이스트, 또는 진균이다. 핵산(DNA 또는 RNA)의 공급원이 동물 조직이라면, 이 조직을 균질화 또는 초음파처리하거나, 또는 이 조직에 단일 세포를 연결 조직으로부터 분리할 수 있는 어떤 힘을 가한다. DNA 및 RNA, 특히 mRNA의 분해를 방지하기 위해서, 그리고 조직을 다루는 동안 게놈 DNA가 잘려지는 것을 방지하기 위해서 주의깊게 행한다. 동물 세포는 또한 상업적 공급원, 즉 기브코 비알엘로부터, 또는 비이익 공급원, 즉 아메리칸 티슈 타입 컬처(ATCC)로부터 얻을 수 있다. 원하는 핵산 형태에 따라서, 게놈 DNA, 총 RNA 또는 mRNA를 Sambrook 등(상동)에 알려진 다음의 표준 프로토콜에 따라 분리할 수 있다. 또한, 식물 세포로부터 핵산을 분리하는 프로토콜은 Current Protocols in Molecular Biology(상동)에서 알 수 있다. 핵산의 공급원이 비-포유류 공급원, 예를 들어 박테리아, 이스트, 진균 또는 바이러스라면, 핵산을 분리하는데 약간 상이한 프로토콜이 사용된다. 이들 프로토콜은 박테리아, 이스트, 진균 및 바이러스에 관해 Sambrook 등, 또는 Current Protocols in Molecular Biology에서 알 수 있다.
규정된 표적 핵산 서열의 증폭을 본원에 설명된 바와 같은, 등온 선형 증폭에 관해 설명된 바와 같이 수행한다. 약 102 내지 1012 카피가 주형으로 사용된다. 증폭 방법에 사용되는 천연 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)에 더하여, 서열화 반응 혼합물은 표지된 트리포스페이트 유사체를 포함한다. 각 유사체를 유일하게 표지한다면, 4개 모두를 동일한 반응 튜브에 가할 수 있다. 달리, 각 뉴클레오티드 유사체를 동일한 표지로 표지한다면, 서열화 반응은 각 반응 혼합물이 1개의 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 4개의 상이한 반응 튜브에서 수행한다. 이들 유사체를 중합효소에 의한 프라이머 확장 생성물에 결합시켜, 표적 서열을 따르는 더 이상의 확장을 중지시킨다. 결과의 절단된 확장 생성물을 표지한다. 축적된 다중 치환 프라이머 확장 생성물은 각 유사체의 결합 부위에 따라 길이가 다양하며, 이것은 표적 서열상의 상보성 뉴클레오티드의 다양한 서열 위치를 표시한다. 서열 정보를 해석하기 위한 반응 생성물의 분석을 겔상에 생성물을 전개시킴에 의해 수행할 수 있다. 또는 달리, 다른 분석 방법을 또한 사용할 수 있다. 다른 서열화 방법에서도, 서열화 반응은 단일 반응 용기, 또는 개별 반응 용기에서 수행한다. 사용될 방법의 선택은 사용된 핵산 트리포스페이트 유사체에 의존한다. 따라서, 각각의 유사체를 상이하게 표지한 경우, 서열화 반응은 단일 용기에서 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르는 서열화 분석의 최적 성능을 위한 시약 및 반응 조건의 선택에 관한 고려사항은 앞서 설명된 다른 방법에 관한 것들과 유사하다.
신장 종결인자의 특이적 결합에 따른 크기가 다른 복수의 프라이머 확장 생성물을 본 분야에 공지된 여러가지 방법 중 어느 것을 사용하여 크기 분리한다. 각각의 종결인자 유사체를 사용하여 생성된 복수의 프라이머 확장 생성물의 프로파일은 시험 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열에 대한 표지이다.
실시예 7
증대된 증폭을 사용한 핵산 표적의 서열화
규정된 표적 핵산 서열의 증폭을 등온 선형 증폭에 관해 설명된 바와 같이 수행한다. 이것은 본원에 설명된 바와 같이 전사를 포함한다. TSO 또는 PTO를 사용하여 등온 선형 증폭 생성물에 프로토프로모터 서열을 첨부할 수 있다. 본 발명에 따르는 증대된 선형 증폭 방법에 사용되는 천연 리보뉴클레오티드 트리포스페이트(RTP)에 더하여, 서열화 반응 혼합물은 또한, 본 분야에 공지된 다른 서열화 방법에 통상 사용되는 적합한 표지된 트리포스페이트 유사체를 포함한다. 이것들을 RNA 중합효소에 의한 확장 생성물에 결합시켜 표적 서열을 따르는 더 이상의 확장을 중지시킨다. 결과의 절단된 확장 생성물을 표지한다. 축적된 다중 치환 프라이머 확장 생성물은 각 유사체의 결합 부위에 따라 길이가 다양하며, 이것은 표적 서열상의 상보성 뉴클레오티드의 다양한 서열 위치를 표시한다. 서열 정보를 해석하기 위한 반응 생성물의 분석을 상기 서열화 실시예에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
실시예 8
증대된 등온 증폭 및 유전자형 특이적 복합 프라이머를 사용한 유전자형화
게놈 DNA를 이전 실시예에서 설명된 방법을 사용하여, 또는 당업자에게 공지된 다른 수단에 의해 시험 세포로부터 분리한다. 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 박테리아, 바이러스, 진균, 이스트, 식물 및 동물을 포함하는, 상이한 유기체를 유전자형화한다. 유전자형 특이적 프라이머를 특이적 핵산 서열의 1개 유전자형에 혼성화하거나, 또는 대응부 유전자형에 혼성화하는 3'-단부 뉴클레오티드를 포함하도록 디자인한다. 특이전 유전자형을 결정하는 서열 변화는 점돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 삽입 결실 등일 수 있다.
규정된 표적 핵산 서열의 증폭을 상기 실시예의 게놈 E. coli 서열의 증폭에 관해 설명된 바와 같이 수행한다. 유전자형 특이적 프라이머 및 교정 활성이 없는 DNA 중합효소를 사용한 경우, 증폭 생성물의 생성은 규정된 유전자형의 표적 서열의 존재를 표시한다. 프라이머의 3'-단부와 표적 핵산 서열의 혼성화를 방지하는 서열 변화는 증폭을 방지할 것이다. 증폭 생성물을 본 분야에 공지된 단일가닥 핵산 서열 검출 방법에 관한 다양한 방법 중 어느 하나에 의해 검출한다. 예를 들어, 특이적 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브와 증폭 생성물의 혼성화를 겔 전기영동에 의해 검출한다.
동형접합체 또는 이형접합체 유전자형의 결정과 같은, 배수염색체 세포의 유전자형화가 필요한 경우, 야생형 및 돌연변이 유전자형에 대해, 또는 어떤 유전자형 및 다른 유전자형에 대해 디자인된 특이적 프라이머를 사용하여 특이적 핵산 표적 서열의 증폭을 수행하는 것이 편리하다. 특이적 프라이머를 사용하는 증폭 반응은 개별 반응 용기에서 수행한다. 단지 1개 반응 튜브에서만 증폭 생성물이 검출되거나, 또는 더 적은 증폭 생성물이 검출되는 것은 동형접합체, 즉 야생형 또는 돌연변이 동형접합체의 표지이다. 양쪽 증폭 반응 모두에서 증폭 생성물이 검출되는 것은 이형접합체 유전자형을 표시한다.
실시예 9
증폭 방법을 이용한 RNA 부분-기초 등온 돌연변이 검출
본원에 개시된 등온 증폭 방법을 표적 핵산 서열에서 규정된 돌연변이, 또는 다형성 부위(SNP와 같은)를 검출하는데 사용한다. 이 방법을 약물 내성을 가져오는 돌연변이의 유전자형화 또는 검출에 사용한다. 표적 핵산 서열은 단일가닥 DNA이다. 단일가닥 DNA 표적을 본원에 설명된 등온 증폭 방법을 사용하여 이중가닥 DNA 표적 또는 RNA 표적으로부터 제조한다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 정밀한 조사하에 대립유전자내에 돌연변이를 가지거나 또는 가진다고 의심되는 ssDNA와 함께 야생형 DNA 서열에 상보하는 복합 프라이머를 사용한다. 약 102 내지 약 1012 카피의 ssDNA 표적 및 약 0.05 내지 5μM의 복합 프라이머를 사용한다. 서열 변경의 존재는 증폭의 초기 단계를 방지하지 않았으며, 이로써 복합 프라이머가 표적 서열에 혼성화하여 제 1의 3분자 복합체를 형성하고, 증폭 생성물을 만든다. 다음에, 리보뉴클레아제인 RNaseH가 복합체의 확장된 프라이머의 RNA 부분을 절단한다. RNaseH에 의한 복합 프라이머, 또는 프라이머 확장 생성물의 RNA 부분의 절단은 미스매치의 존재에 의해 영향을 받는다. 이것은 절단을 방지하거나, 절단 패턴을 변경하거나, 또는 절단 효율을 감소시킬 수 있다. 5' RNA 부분의 혼성화에 의한 복합체와 복합 프라이머 결합의 다음 단계는 상술된 이유 때문에 미스매치에 의해 억제된다. 표적에 혼성화하는 복합 프라이머의 무능력은 프라이머 확장 가닥 치환 및 증폭의 다중 카피 생성에 대한 더 이상의 단계를 방지한다. 증폭 생성물, 또는 그것들의 부족은 겔 전기영동 또는 다른 동등한 수단에 의해 시각화된다.
프라이머 혼성화의 억제에 기여하는 인자는 혼성화 올리고뉴클레오티드의 크기 및 반응 조건의 긴축도를 포함한다. 본 분야에 공지된 통상적인 기술에 따라서 복합 프라이머를 디자인할 때 이들 인자가 고려된다.
돌연변이된 DNA 서열에 상보하는 복합 프라이머를 또한 상술된 등온 증폭 방법에서 야생형 ssDNA 표적과 함께 사용한다. 이 경우, 프라이머는 표적 DNA와 결합하여 확장된다. 그러나, RNaseH로 처리한 후에는 뉴클레오티드 미스매치 때문에 더 많은 프라이머가 야생형 DNA에 결합할 수 없으며, 따라서 증폭 생성물이 거의 만들어지지 않는다. 증폭 생성물, 또는 그것들의 부족은 겔 전기영동 또는 다른 동등한 수단에 의해 시각화된다.
또한, 관심의 핵산 샘플 또는 야생형 서열을 갖는 표적 핵산의 기준 샘플을 포함하는 병렬 반응을 수행한다. 후자의 반응과 비교하여 전자의 반응에서 더 많은 프라이머 확장 생성물의 축적은 관심의 샘플에 있는 돌연변이 유전자형의 존재를 표시한다. 또는 달리, 복합 프라이머가 시험 표적의 정상 유전자형 서열에 완전히 상보하는 5' RNA 서열을 포함할 때, 돌연변이 유전자형의 표적 서열의 증폭은 방지되며, 증폭 생성물의 검출 및/또는 정량적 측정은 정상 유전자형을 표시한다.
실시예 10
등온 증폭 방법 및 유전자형 특이적 프로브 혼성화를 사용한 유전자형화
혼성화에 의한 서열화 방법은 이전 실시예에 설명된다. 특이적 프로브의 혼성화에 의한 서열 동일성의 측정은, 본 발명의 방법에 의해 생성된 증폭 생성물이 단일가닥이고 특이적 프로브의 혼성화에 쉽게 사용할 수 있는 한, 본 발명의 등온 방법을 사용하는 것이 특히 유리하다. 규정된 유전자형에 대한 특이적 프로브를 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 디자인한다. 단지 한 유전자형만의 증폭에 의해 생성된 증폭 생성물에 대한 선택적 프로브 혼성화를 지지하는 혼성화 기준을 결정하는 것이 가능하다. 단일 뉴클레오티드 만큼 작은 서열 변화도 프로브 혼성화를 방지할 수 있다. 다음의 인자가 혼성화 기준으로 고려된다: 프로브 길이, 혼성화 반응의 온도, 및 완충액 조성, 특히 2가 이온 농도. 분석에 사용되는 프로브는 용액중에 있거나, 또는 고체 표면에 부착할 수 있다. 더 이상으로, 프로브를 직접 표지하거나, 또는 특이적 결합쌍의 한 구성원에 부착시킴으로써 직접적 또는 간접적으로 표지할 수 있는 특이적 결합쌍의 다른 구성원에 특이적으로 결합시킬 수 있다.
게놈 DNA를 본 분야에 공지된 방법에 의해, 또는 상시 실시예에 설명된 바와 같이 시험 샘플로부터 분리한다. 시험 DNA를 설명된 증폭 성분들, 표적-특이적 키메라 프라이머, 및 프로프로모터 서열(PTO와 같은)과 조합한다. 이 조합을 본원에 설명된 바와 같은 조건으로 인큐베이션하여, 단일가닥 RNA 증폭 생성물을 생성한다. 증폭 생성물과 유전자형 특이적 프로브의 혼성화를 부착된 유전자형 특이적 프로브를 갖는 용액 또는 고체상에서 수행한다. 증대된 등온 선형 증폭 방법의 생성물이 단일가닥이므로, 이 생성물은 이상적으로는, 공간적으로 분해된 특이적 프로브의 어레이(즉, 유전자 칩)를 생성하도록 유리 슬라이드와 같은 고체상에 부착시키는 것이 적합하다. 또는 달리, 고체상은 특이적 프로브가 부착된 입자를 포함한다. 증폭 생성물에 대한 프로브 혼성화의 검출을, 예를 들어 Sambrook 등(상동)에 개시된, 본 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 수행한다. 특이적 프로브를 표지하고, 혼성화로 인한 표지 스펙트럼 특성의 변화를 컴퓨터 알고리듬에 의해 검출 및 기록한다.
또한, 특이적 프로브와 증폭 생성물의 혼성화로 인한 입자 회합을 프로브 혼성화의 검출에 사용한다. 표지된 증폭 생성물을 생성하고, 고체 표면위에 고정된 프로프에 대한 생성물 혼성화를 컴퓨터 알고리듬에 의해 검출 및 기록한다. 표지된 증폭 생성물의 생성을 4개의 rNTP 유사체에 의해 rNTP 중 1개를 치환시킴으로써 전사 단계 동안 표지된 rNTP의 결합에 의해 수행한다. 표지는 염료, 또는 바이오틴과 같은 작은 분자이며, 다음에 이것이 표지된 스트렙트아비딘과 같은 특이적 결합체에 결합함으로써 검출된다. 고체 표면위의 프로브 혼성화를 검출하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다.
실시예 11
rSSCP(RNA 단일가닥 입체구조 다형성)에 의한 유전자형화
유전자형화를 본원에 설명된 방법을 사용하여 특이적 표적 핵산 서열의 증폭 및 단일가닥 RNA 생성물의 전기영동 밴드 패턴의 측정에 의해 수행하며, 이것은 단일가닥 입체구조를 반영한다. SSCP는 서열 변경의 검출에 광범위하게 사용된다. 유전자형 특이적 단일가닥 입체구조를 샘플을 겔 또는 모세관 전기영동하여 측정한다. 본 발명의 방법에 따르는 표적 핵산 서열의 증폭에 의한 단일가닥 생성물의 생성은 이 방법을 증폭 방법과 rSSCP 분석을 조합함에 의한 유전자형 측정에 특히 적합하게 만든다.
정제된 시험 게놈 DNA를 상술된 바와 같은 본 발명의 증폭 방법의 성분들, 및 표적 특이적 복합 프라이머 및 PTO와 같은 프로프로모터 서열과 조합한다. 이 조합에 표적 서열의 등온 증폭 조건을 행한다. 증폭 생성물을 포함하는 반응 혼합물을 본 분야에 공지된 기계 및 조건을 사용하여 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동한다. 증폭 생성물의 전기영동 밴드 패턴을 측정한다. 올리고뉴클레오티드 생성물의 시각화를 염료 개재인자를 포함시켜 달성한다. 증폭 생성물의 전기영동 패턴을 공지된 유전자형의 세포로부터 얻어진 표적 핵산 서열의 증폭에 의해 생성된 증폭 생성물과 비교한다. 전기영동도 패턴의 어떤 변화는 서열 변화성을 표시한다. 본 발명의 증폭 반응과 rSSCP의 조합은 규정된 표적 서열의 서열 다형성의 발견, 및 이전에 규정된 유전자형의 검출을 위한 간단한 방법을 제공한다. 공지된 핵산 서열, 또는 규정된 유전자형의 전기영동 패턴은 사전측정할 수 있으며, 시험 DNA의 증폭 생성물에 의해 생성된 패턴을 유전자형 측정에 대한 공지된 패턴과 비교한다.
<110> NUGEN TECHNOLOGIES, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR LINEAR ISOTHERMAL AMPLIFICATION OF POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES <150> US 60/153,604 <151> 1999-09-13 <150> US 60/175,780 <151> 2000-01-12 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> Chimeric DNA/RNA primer. IA005 <400> 1 acggaugcgg ucuccagtgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> Chimeric DNA/RNA primer. IA019 <400> 2 acggaugcgg ucuccagtgt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> Chimeric DNA/RNA primer. IA020 <400> 3 gacggaugcg gucuccagtg t 21 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> Chimeric DNA/RNA primer <400> 4 gcaagacgga ugcggucucc agtgt 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> Chimeric DNA/RNA primer <400> 5 gacggatgcg guctccagtg t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> Chimeric DNA/RNA primer <400> 6 gacggatgcg guctccagug t 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> Chimeric DNA/RNA primer <400> 7 gacggatgcg guctccagug ucca 24 <210> 8 <211> 67 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA012 <400> 8 ggaattctaa tacgactcac tatagggaga gatcgagtag ctccggtacg ctgatcaaag 60 atccgtg 67 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA012b <400> 9 taatacgact cactataggg agagatcgag tagctccggt acgctgatca aagatccgtg 60 60 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA015 <400> 10 taatacgact cactataggg agagcggtac gctgatcaaa gatccgtg 48 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA015b <400> 11 ggaattctaa tacgactcac tatagggaga gcggtacgct gatcaaagat ccgtg 55 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> Guanine has biotin molecule attached. IA015c <400> 12 ggaattctaa tacgactcac tatagggaga gcggtacgct gatcaaagat ccgtg 55 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA010 <400> 13 atgtcatggt catggtcgtg t 21 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA014 <400> 14 ctcaacacga ccatgaccat gacatttgtt g 31 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA004 <400> 15 cgcatacgga atagcttacc ggtct 25 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA006 <400> 16 cggtacgctg atcaaagatc cgt 23 <210> 17 <211> 351 <212> DNA <213> Synthetic primer <400> 17 cggtacgctg atcaaagatc cgtgcaacaa atgtcatggt catggtcgtg ttgagcgcag 60 caaaacgctg tccgttaaaa tcccggcagg ggtggacact ggagaccgca tccgtcttgc 120 gggcgaaggt gaagcgggcg agcatggcgc accggcaggc gatctgtacg ttcaggttca 180 ggttaaacag cacccgattt tcgagcgtga aggcaacaac ctgtattgcg aagtcccgat 240 caacttcgct atggcggcgc tgggtggcga aatcgaagta ccgacccttg atggtcgcgt 300 caaactgaaa gtgcctggcg aaacccagac cggtaagcta ttccgtatgc g 351 <210> 18 <211> 115 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA013 <400> 18 cggtacgctg atcaaagatc cgtgcaacaa atgtcatggt catggtcgtg ttgagcgcag 60 caaaacgctg tccgttaaaa tcccggcagg ggtggacact ggagaccgca tccgt 115 <210> 19 <211> 100 <212> DNA <213> Synthetic primer <220> <223> IA009 <400> 19 agtgtccacc cctgccggga ttttaacgga cagcgttttg ctgcgctcaa cacgaccatg 60 accatgacat ttgttgcacg gatctttgat cagcgtaccg 100 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Bacteriophage <400> 20 taatacgact cactataggg agag 24 <210> 21 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic primer <400> 21 ggaattc 7 <210> 22 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic primer <400> 22 atcgagtagc tc 12

Claims (78)

  1. 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 방법으로서, 이 방법은
    (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 DNA 주형과 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 혼성화하는 단계;
    (b) 복합 프라이머와 주형의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 혼성화하는 단계;
    (c) DNA 중합효소를 사용하여 복합 프라이머를 확장하는 단계;
    (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복할 수 있도록, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 사용하여 아닐된 복합 프라이머의 RNA 부분을 절단하여, 이로써 표적 서열의 상보성 서열의 다중 카피가 생성되는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 방법으로서, 이 방법은
    (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 DNA 주형과 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 혼성화하는 단계;
    (b) 복합 프라이머와 주형의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 혼성화하는 단계;
    (c) DNA 중합효소를 사용하여 복합 프라이머를 확장하는 단계;
    (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복하여 치환된 프라이머 확장 생성물을 생성할 수 있도록, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 사용하여 아닐된 복합 프라이머의 RNA 부분을 절단하는 단계;
    (e) 전사가 RNA 중합효소에 의해 일어나는 것을 허용하는 조건하에, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼성화함으로써, 치환된 프라이머 확장 생성물에 상보적인 서열을 포함하는 RNA 전사체를 생성하여, 이로써 표적 서열의 다중 카피가 생성되는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 복합 프라이머의 RNA 부분이 3' DNA 부분에 관한 5'인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 5' RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 복수의 복합 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, TSO가 주형에 혼성화하는 영역에 변형을 포함하며, 주어진 세트의 조건하에서 이 TSO는 변형이 없는 TSO와 비교하여 이 영역에 더욱 단단히 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 차단 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 차단 서열이 주형에 혼성화하는 영역에 변형을 포함하며, 주어진 세트의 조건하에서 이 차단 서열은 변형이 없는 차단 서열과 비교하여 이 영역에 더욱 단단히 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, RNA를 절단하는 효소가 RNaseH인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 2 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 3'-단부에 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하며, 이로써 치환된 프라이머 확장 생성물의 DNA 중합효소 확장이 전사가 일어나는 이중가닥 프로모터를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 프로프로모터 주형 올리고뉴클레오티드(PTO)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 어떤 순서로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (a), (b) 및 (c)를 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 단계 (c) 전에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 모든 단계를 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 표적 뉴클레오티드 서열을 서열화하는 방법으로서, 이 방법이
    (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 DNA 주형과 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 혼성화하는 단계;
    (b) 복합 프라이머와 주형의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 혼성화하는 단계;
    (c) DNA 중합효소 및 dNTP와 dNTP 유사체의 혼합물을 사용하여 복합 프라이머를 확장함으로써, 프라이머 확장이 dNTP 유사체의 결합시 종결되는 단계;
    (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복할 수 있도록, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 사용하여 아닐된 복합 프라이머의 RNA 부분을 절단하여, 이로써 표적 서열의 상보성 서열의 다중 카피가 다양한 길이로 생성되는 단계;
    (e) 단계 (a)부터 (d)까지의 생성물을 분석하여 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 표적 뉴클레오티드 서열을 서열화하는 방법으로서, 이 방법이
    (a) 표적 서열을 포함하는 단일가닥 DNA 주형과 RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 혼성화하는 단계;
    (b) 복합 프라이머와 주형의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 혼성화하는 단계;
    (c) DNA 중합효소를 사용하여 복합 프라이머를 확장하는 단계;
    (d) 다른 복합 프라이머가 주형에 혼성화하고 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복하여 치환된 프라이머 확장 생성물을 생성할 수 있도록, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 사용하여 아닐된 복합 프라이머의 RNA 부분을 절단하는 단계;
    (e) rNTP와 rNTP 유사체의 혼합물을 사용하여, 전사가 RNA 중합효소에 의해 확장 생성물로부터 일어나도록 하는 조건하에, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼성화함으로써, 치환된 프라이머 확장 생성물에 상보적인 서열을 포함하는 RNA 전사체를 생성하고 전사가 rNTP 유사체의 결합시 종결되어, 이로써 표적 서열의 다중 카피가 다양한 길이로 생성되는 단계;
    (f) 단계 (a)부터 (e)까지의 생성물을 분석하여 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 복합 프라이머의 RNA 부분이 3' DNA 부분에 관한 5'인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 5' RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. (i) 복합 프라이머의 RNA 부분이 관심의 서열을 포함하는 기준서열에 혼성화하는 것으로 알려져 있는, 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의한 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계, 및
    (ii) 단계 (i)로부터의 증폭 생성물과 기준 주형으로부터의 증폭 생성물의 양을 비교하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드에서 관심의 서열을 특성화하는 방법으로서,
    복합 프라이머의 RNA 부분에 상보적인 영역을 포함하는 기준 주형으로부터의 증폭 생성물의 양과 비교하여, 표적 폴리뉴클레오티드로부터의 검출가능한 더 적은 증폭 생성물의 생성이, 관심의 서열이 표적 뉴클레오티드에 존재하지 않고 표적 폴리뉴클레오티드가 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보적인 서열에 관하여 서열 변이체를 포함할 수 있음을 가리키는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열이 야생형 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 관심의 서열이 야생형 서열의 존재 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열이 돌연변이 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 관심의 서열이 돌연변이 서열의 존재 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열이 대립유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 관심의 서열이 대립유전자 서열의 존재 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. (i) 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계; 및 (ii) 단일가닥 입체구조에 관해 증폭 생성물을 분석하는 단계를 포함하는 단일가닥 입체구조 다형성에 의해 표적 폴리뉴클레오티드에 있는 돌연변이를 검출하는 방법으로서, 여기에서 기준 단일가닥 폴리뉴클레오티드와 비교한 입체구조의 차이가 표적 폴리뉴클레오티드에 있는 돌연변이를 가리키는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 23 항에 있어서, 복합 프라이머의 RNA 부분이 3' DNA 부분에 관한 5'인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 5' RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. (i) 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해서 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계; 및 (ii) 증폭 생성물을 고체 기판위에 부착하여 증폭 생성물의 마이크로어레이를 제작하는 단계를 포함하는, 마이크로어레이의 제조 방법.
  31. (a) (i) 표적 서열을 포함하는 DNA 주형; 및
    (ii) RNA 부분 및 3' DNA 부분을 포함하는 복합 프라이머를 DNA 중합효소를 사용하여 확장함으로써 생성된, DNA 주형에 혼성화되어 있는 복합 프라이머 확장 생성물을 포함하는 복합체를 제공하는 단계;
    (b) 다른 복합 프라이머가 DNA 주형에 혼성화할 수 있도록 RNA/DNA 혼성체로부터 RNA 를 절단하는 효소를 사용하여 복합 프라이머 확장 생성물의 RNA 부분을 절단하는 단계;
    (c) DNA 중합효소를 사용하여 가닥 치환에 의해 프라이머 확장을 반복하는 단계;
    (d) 단계 (b) 및 (c) 를 반복함으로써 표적 서열의 상보성 서열의 다중 카피를 생성하는 단계
    를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 복합체는 복합 프라이머와 주형의 혼성화에 관한 5'인 주형의 영역에 혼성화된 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항의 방법을 수행하는 단계 및
    (e) 전사가 RNA 중합효소에 의해 일어나는 것을 허용하는 조건하에, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화함으로써, 치환된 프라이머 확장 생성물에 상보적인 서열을 포함하는 RNA 전사체를 생성하여, 이로써 표적 서열의 다중 카피가 생성되는 단계를 더 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 방법.
  34. 제 31 항의 방법을 수행하는 단계 및 이 방법의 생성물을 분석하여 서열을 결정하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 서열화하는 방법으로서, 프라이머 확장은 DNA 중합효소 및 dNTP와 dNTP 유사체의 혼합물을 사용하여 종결 부위까지 복합 프라이머를 확장함으로써, 프라이머 확장이 dNTP 유사체의 결합시 종결되고, 이로써 표적 서열의 상보성 서열의 다중 카피가 다양한 길이로 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 32 항의 방법을 수행하는 단계 및 이 방법의 생성물을 분석하여 서열을 결정하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 서열화하는 방법으로서, 프라이머 확장은 DNA 중합효소 및 dNTP와 dNTP 유사체의 혼합물을 사용하여 종결 부위까지 복합 프라이머를 확장함으로써, 프라이머 확장이 dNTP 유사체의 결합시 종결되고, 이로써 표적 서열의 상보성 서열의 다중 카피가 다양한 길이로 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 32 항의 방법을 수행하는 단계 및
    (e) rNTP와 rNTP 유사체의 혼합물을 사용하여, 전사가 RNA 중합효소에 의해 확장 생성물로부터 일어나도록 하는 조건하에, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화함으로써, 치환된 프라이머 확장 생성물에 상보적인 서열을 포함하는 RNA 전사체를 생성하고 전사가 rNTP 유사체의 결합시 종결되어, 이로써 표적 서열의 다중 카피가 다양한 길이로 생성되는 단계;
    (f) 단계 (a)부터 (e)까지의 생성물을 분석하여 서열을 결정하는 단계를 더 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열을 서열화하는 방법.
  37. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 복합 프라이머는 3' DNA 부분에 인접해 있는 5' RNA 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 34 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 복합 프라이머는 3' DNA 부분에 인접해 있는 5' RNA 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 복합 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 34 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 복합 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서, 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO), 또는 차단 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO), 또는 차단 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 41 항에 있어서, TSO 또는 차단서열은 주형에 혼성화하는 영역에 변형을 포함하며, 주어진 세트의 조건하에서 이 TSO 또는 차단 서열은 변형이 없는 TSO 또는 차단서열과 비교하여 이 영역에 더욱 단단히 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 42 항에 있어서, TSO 또는 차단서열은 주형에 혼성화하는 영역에 변형을 포함하며, 주어진 세트의 조건하에서 이 TSO 또는 차단 서열은 변형이 없는 TSO 또는 차단서열과 비교하여 이 영역에 더욱 단단히 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 를 절단하는 효소는 RNaseH 인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 34 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 를 절단하는 효소는 RNaseH 인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 33 항에 있어서, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 36 항에 있어서, 프로프로모터 및 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 33 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 3' 단부에 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하며, 이로써 치환된 프라이머 확장 생성물의 DNA 중합효소 확장이 전사가 일어나는 이중가닥 프로모터를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 36 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 3' 단부에 치환된 프라이머 확장 생성물에 혼성화하는 영역을 포함하며, 이로써 치환된 프라이머 확장 생성물의 DNA 중합효소 확장이 전사가 일어나는 이중가닥 프로모터를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 복합 프라이머는 5 내지 20 뉴클레오티드의 5'RNA 부분 및 5 내지 15 뉴클레오티드의 3'DNA 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 34 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 복합 프라이머는 5 내지 20 뉴클레오티드의 5'RNA 부분 및 5 내지 15 뉴클레오티드의 3'DNA 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 5'RNA 부분이 10 내지 15 뉴클레오티드이고, 3'DNA 부분이 7 내지 12 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 52 항에 있어서, 5'RNA 부분이 10 내지 15 뉴클레오티드이고, 3'DNA 부분이 7 내지 12 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. (i) 복합 프라이머의 RNA 부분이 관심의 서열을 포함하는 기준서열에 혼성화하는 것으로 알려져 있는, 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 방법에 의한 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계, 및
    (ii) 단계 (i)로부터의 증폭 생성물과 기준 주형으로부터의 증폭 생성물의 양을 비교하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드에서 관심의 서열을 특성화하는 방법으로서,
    복합 프라이머의 RNA 부분에 상보적인 영역을 포함하는 기준 주형으로부터의 증폭 생성물의 양과 비교하여, 표적 폴리뉴클레오티드로부터의 검출가능한 더 적은 증폭 생성물의 생성이, 관심의 서열이 표적 뉴클레오티드에 존재하지 않고, 표적 폴리뉴클레오티드가 복합 프라이머의 RNA 부분에 상보적인 서열에 관하여 서열 변이체를 포함할 수 있음을 가리키는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열이 야생형 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 관심의 서열이 야생형 서열의 존재 여부를 결정하는 것을 특징으로 하거나; 또는 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열이 돌연변이 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 관심의 서열이 돌연변이 서열의 존재 여부를 결정하는 것을 특징으로 하거나; 또는 복합 프라이머의 RNA 부분의 서열이 대립유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 관심의 서열이 대립유전자 서열의 존재 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. (a) 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계; 및 (b) 단일가닥 입체구조에 관한 방법의 증폭된 생성물을 분석하는 단계를 포함하는 단일 가닥 입체구조 다형성에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드에 있는 돌연변이를 검출하는 방법으로서, 여기에서 기준 단일가닥 폴리뉴클레오티드와 비교된 입체구조의 차이가 표적 폴리뉴클레오티드에 있는 돌연변이를 가리키는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. (a) 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 증폭 방법을 수행하는 단계; 및 (b) 증폭 생성물을 고체 기판위에 부착하여 증폭 생성물의 마이크로어레이를 제작하는 단계를 포함하는, 마이크로어레이의 제조 방법.
  59. (a) 3' DNA 부분 및 5' RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머 및 (b) 주형 스위치 올리고뉴클레오티드를 포함하는 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 종결 폴리뉴클레오티드 서열이 DNA 중합효소에 의한 주형의 DNA 복제의 중지를 초래하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  60. 제 59 항에 있어서, 복합 프라이머는 3' DNA 부분에 인접해 있는 5'RNA 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 제 59 항 또는 60 항에 있어서, 5'RNA 부분이 5 내지 30 뉴클레오티드이고, 3'DNA 부분이 1 내지 20 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  62. 제 59 항 또는 제 60 항에 있어서, TSO가 주형에 혼성화하는 영역에 변형을 포함하며, 주어진 세트의 조건하에서 이 TSO는 변형이 없는 TSO와 비교하여 이 영역에 더욱 단단히 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 제 59 항 또는 제 60 항에 있어서, 프로프로모터 주형 올리고뉴클레오티드(PTO)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  64. (a) 폴리뉴클레오티드 주형; (b) 제 59 항 또는 제 60 항의 조성물 및 (c) DNA 중합효소를 포함하는 반응 혼합물.
  65. 제 64 항에 있어서, RNA/DNA 혼합체로부터 RNA 를 절단하는 효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 반응 혼합물.
  66. 제 65 항에 있어서, 효소는 RNaseH 인것을 특징으로 하는 반응 혼합물.
  67. 제 64 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 반응 혼합물.
  68. 제 67 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 프로프로모터 주형 올리고뉴클레오티드(PTO)인 것을 특징으로 하는 반응 혼합물.
  69. (a) 3' DNA 부분 및 RNA 부분을 포함하는 복합 프라이머, 및 (b) 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 키트로서, 이 종결 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 중합효소에 의한 주형의 DNA 복제의 중지를 초래하는 것을 특징으로 하는 키트.
  70. 제 69 항에 있어서, RNA 부분이 3' DNA 부분에 관한 5'인 것을 특징으로 하는 키트.
  71. 제 70 항에 있어서, 5' RNA 부분이 3' DNA 부분에 인접해 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  72. 제 69 항에 있어서, 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)인 것을 특징으로 하는 키트.
  73. 제 69 항에 있어서, 종결 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 차단 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  74. 제 69 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  75. 제 74 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 주형 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)인 것을 특징으로 하는 키트.
  76. 제 74 항에 있어서, 프로프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 프로프로모터 주형 올리고뉴클레오티드(PTO)인 것을 특징으로 하는 키트.
  77. 제 69 항에 있어서, RNA/DNA 혼성체로부터 RNA를 절단하는 효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  78. 제 77 항에 있어서, 효소가 RNaseH인 것을 특징으로 하는 키트.
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