KR100499877B1

KR100499877B1 - 옻나무 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물

Info

Publication number: KR100499877B1
Application number: KR10-2002-0018514A
Authority: KR
Inventors: 나천수; 정남철
Original assignee: (주)생명의나무; 대한민국(관리부서:산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2002-04-04
Publication date: 2005-07-07
Also published as: KR20020077833A

Abstract

본 발명은 옻나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 우수한 간 보호효과를 갖는다.

Description

옻나무 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물{HEPATOPROTECTIVE COMPOSITION COMPRISING AN EXTRACT OF RHUS VERNICIFLUA}

본 발명은 옻나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것이다.

최근 한국인의 건강수준에서 간암에 의한 사망률은 세계 1위이고 만성 간질환의 경우도 그 사망률이 3번째로 조사되었다. 또한 최근 통계청에서 우리나라 40대의 경우는 간질환이 가장 높은 사망원인으로 발표하였다. 국내의 간질환중에서 가장 높은 사망률의 원인은 바이러스성 간염이지만, 서구에서는 바이러스성 간염보다는 간경화에 의한 사망이 5-10배 정도로 높게 보고되어있다. 간은 완충능력이 큰 기관으로 질환의 초기단계에서는 잘 나타나지 않고 상당히 악화되어서야 발견된다. 간경변증은 각종 간질환이 만성적으로 진행할 경우 공통적으로 이르는 마지막 단계이다. 그 원인으로는 알코올, 약물, 화학약품, 바이러스성 간염, 담도질환과 같은 대사성질환, 자가면역성 질환 등이 있으나 원인을 알 수 없는 경우도 많다. 간경변증의 경우 간혈류량저하, 간내혈류의 단축, 대사효소의 기능저하, 혈중단백의 질적, 양적 변화 및 담즙유량의 변화 등 전반적인 간기능이 저하된다.

또한 간은 인체에서 혈액 저장 및 순환, 혈액양 조절과 방어해독작용을 하며 정신적 활동과 밀접하게 관련되어 있다고 알려져 있다. 산업화에 따른 공해물질, 유독물질에 우리의 몸은 항상 노출되어 있어 우리의 간은 끊임없이 해독작용에 시달리고 있다. 더욱이 심각한 것은 정신적인 스트레스로 인한 간손상이다. 정신적 휴식을 가질 경우 손상된 간세포는 복구되지만 급박한 현대사회에서 정신적 휴식의 여유를 찾을 수 없어 정신적 스트레스, 과음, 흡연으로 간손상을 가중시켜 인체가 방어 해독 작용을 하지 못해 면역 체계에 이상을 가져와 다른 질병의 원인이 되기도 한다.

사염화탄소(CCl₄)는 간에 독성을 주는 표본물질로서 간세포 배양, 간 박편(slice) 배양 그리고 마우스나 래트에 직접 투여하는 방법 등을 이용하여 간독성을 연구하는데 널리 사용되고 있다. 사염화탄소는 간에서 복합적인 기능을 하는 시토크롬(cytochrome) P450과 같은 대사효소에 의해 대사되어 매우 반응성이 강한 자유 라디칼인 CCl₃와 Cl을 형성하게 되고 자유 라디칼인 CCl₃은 축적된 간 중성지방이나 막 인지질에 있는 지방산의 산화를 유발시켜 지질의 산패를 일으켜 산소와 결합한 후 지질 과산화 작용을 통하여 유기 과산화물을 형성한다. 이어서 지질 과산화작용을 통하여 간장에 지방이 축적되고, 단백질 합성능력은 감소하게 되어 글리코겐이 분해되고 혈관내의 세포질 효소들이 파괴되어 간조직의 괴사가 일어난다(Recknagel, R. O., et al., Pharmacol. Rev., 19, 145-208(1967) 및 Chang, I. M., et al., Drug and chemical toxicology, 6(5), 443-453(1983)).

옻나무는 중앙아시아의 고원지대인 티벳 및 히말라야 지방이 원산지이고(이필우 및 정연집, 나무 (Rhus verniciflua Stokes ) 혈액구의 해부학적 특성, 17 (2), 93-96(1992)), 주로 일본, 중국(Rhus vernicifera), 베트남과 대만(Rhus succedanea) 및 미얀마(Melanorrhaea uritate) 등의 아시아 지역에서 자생하는 것으로 보고되어 있으며(Yumn D.U. et al., Journal of chromatography, 295, 179-16(1984)), 우리나라에서도 2,000 년전인 낙랑시대부터 전국각처에서 재배되어 온 것으로 기록되어 있다(임경빈, 나무백과, 359(1984) 및 Lim, Y.M., et al., Planta Medica, 65, 120-125(1999)). 옻나무는 주로 옻나무의 사부에서 분비되는 수액(옻칠액)을 도로포장 등에 도료로서 사용하였으며 우루시올이 주성분이고 그외에 퓨스틴, 피세틴, 부테인 등의 플라보노이드를 함유하고 있으며, 세균 질환, 바이러스 질환과 관절염 등에 효능이 있는 것으로 보고되어 있다. 그러나 이러한 옻에 대한 연구는 많이 되어 있지 않고 특히, 약물대사 효소에 미치는 영향에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 계속 연구를 진행한 결과, 옻나무 추출물이 손상된 간기능을 회복시킨다는 사실을 발견함으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 간 보호효과를 갖는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 옻나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 좀더 상세하게 설명한다.

옻나무 추출물을 얻기 위해서는, 옻나무의 목재부를 절단하여 그늘에서 1 주일 내지 3 개월, 바람직하게는 1 개월 정도 건조한 후, 파쇄시키거나 그대로 사용한다. 또는, 옻나무의 목재부를 건조시키지 않고 목재칩이나 톱밥으로 제조하여 사용한다. 상기와 같이 가공된 옻나무 100g에 0.3 내지 1ℓ의 유기용매를 가하고 20 내지 60℃, 바람직하게는 40℃에서 1 내지 30 일간, 바람직하게는 5 일간 방치하여 노란색의 조추출물을 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 유기용매로는 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 이중 아세톤이 바람직하다. 특히 아세톤 및 에탄올은 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 아세톤 또는 에탄올 농도를 갖는 용액으로서 사용하는 것이 바람직하다. 이어서, 상기 조추출물에 물을 가하고 혼합물을 분획하여 수용성 분획을 얻은 다음, 여과 및 농축한다.

이어서 상기 농축액을 건조시켜 얻은 추출물을 유기용매, 예를 들어, 메탄올에 녹인 후 실리카 겔 흡착 칼럼 크로마토그래피(silica gel adsorption column chromatography)를 실시하여 옻나무 추출물을 수득할 수 있다. 이 때 용출액으로는 클로로포름과 메탄올의 비율(v/v)이 9:1 내지 7:3, 바람직하게는 9:1인 혼합용매를 사용하며, 용출용매가 노란색이 유출되지 않을 때까지 용출한 다음, 감압하에서 농축하고 건조시켜 본 발명의 옻나무 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 옻나무 추출물을 고압 액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 5가지 물질의 혼합물임을 확인하였다. 도 1은 본 발명의 옻나무 추출물을 고압 액체 크로마토그피(HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 그래프로서, 물질 1은 분자량 162를 갖는 신규 화합물이고, 물질 2는 분자식이 C₁₅H₁₂O₆(분자량 288)이며, 백색의 결정체를 갖는 푸스틴(Fustin; 3,3',4',7-tetrahydroxyflavanone) 화합물이고, 물질 3은 분자식이 C₁₅H₁₀O₆(분자량 286)이며 황색의 결정체를 갖는 피세틴(Fisetin; 3,3',4',7-Tetrahydroxyflavone) 화합물이고, 물질 4는 분자식이 C₁₅H₁₀O₅(분자량 272)이며 진한 오렌지색의 결정체를 갖는 설푸레틴(Sulfuretin; 3',4',6'-Trihydroxyaurone) 화합물이고, 그리고 물질 5는 분자식이 C₁₅H₁₂O₅(분자량272)이며 오렌지색의 결정체를 갖는 부테인(Butein; 2',3,4,4'- Tetrahydroxychalcone) 화합물인 것으로 확인되었다.

본 발명에서는 옻의 안정성을 확인하기 위해, 간내 약물대사 효소인 시트크롬 P450 총함량 및 에톡시레소루핀-O-데알킬라제(EROD), 벤질옥시레소루핀-O-데알킬라제(BROD), 아닐린 하이드록실라제(ANH) 및 p-니트로페놀 하이드록실라제(PNPH) 등의 시토크롬 P450 이소자임(isozyme)의 활성을 측정한 결과, 본 발명의 옻나무 추출물은 시토크롬 P450 총함량 및 EROD, ANH, PNPH 활성을 증가시키며, BROD 활성은 현저한 용량의존적인 감소를 나타낸다. 또한 옻나무 추출물은 손상된 간 기능을 회복시켜 혈액내 간독성 지표인 AST(Serum aspartate transaminase)와 ALT(alanine transaminase)의 농도를 저하시킨다.

이에 따라, 본 발명에서는 옻나무 추출물을 유효성분으로 하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간 보호용 조성물을 제조할 수 있다. 이 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 캅셀제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.

상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다.

본 발명에서 추출된 옻나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 옻나무 추출물은 하루에 체중 1㎏당 10 내지 100 ㎎, 바람직하게는 15 내지 60 ㎎의 양을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 배설 그리고 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다.

이하 하기 실시예에 의하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 옻나무로부터 물질 분리

(단계 1) 조추출물의 제조

옻나무의 목재부를 10cm의 길이로 절단하여 그늘에서 1 개월 정도 건조한 다음, 400g의 건조된 옻나무에 99.9%의 아세톤 4ℓ를 가하고 40℃에서 5 일간 방치하여 노란색을 띤 추출물을 얻었다. 이 추출물에 동량의 물을 가하고 40℃에서 교반한 다음, 실온에서 식혔다. 이어서 수득된 추출물을 No. 2 여과지(와트만사, 미국)를 이용하여 여과한 후 여과 추출물을 회전식 진공증발기(Rotary vacuum Evaporator; Labo rota 300, Resona Co. Swiss)로 농축한 다음 원심진공건조기(센트라백 비전사, 한국)를 이용하여 건조시켜 4.4g의 조추출물을 수득하였다(수율: 1.1%).

(단계 2) 실리카겔 흡착 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제

상기 (단계 1)에서 얻은 조추출물을 정제하기 위하여 실리카겔 흡착 칼럼 크로마토그래피(silica gel adsorption column chromatography)를 실시하였다. 즉, 130℃에서 3 시간 동안 활성화시킨 실리카겔(230-400메쉬, 크로마토그래피용, Merck사)을 n-헥산으로 슬러리(slurry)를 만들어 칼럼(column)(2.9×45cm)에 40g을 충진시켰다. 조추출물 내의 수분을 제거하기 위해, 칼슘 설페이트(calcium sulfate) 7g을 칼럼의 상부에 충진시킨 다음, 조추출물 4g을 메탄올 6ml로 녹여 로딩(loading)하고 클로로포름:메탄올(Chloroform:Methanol)(90:10(v/v)) 용매로 용출용매가 노란색이 유출되지 않을 때까지 용출하였다. 노란색 용출물을 모으고 감압하에서 회전식진공 증발기(Rotary vacuum Evaporator; Labo rota 300, Resona Co. Swiss)로 농축한 다음 원심진공건조기(센트라백 비전사, 한국)로 40℃에서 건조하여 옻나무 추출물 3g을 수득하였다(수율: 75%).

실시예 2: 옻나무 추출물의 분석

(단계 1) 고압 액체 크로마토그래피에 의한 성분의 해상도

상기 실시예 1에서 수득된 옻나무 추출물과 동량의 메탄올을 혼합한 다음, C₁₈-타입 Sep-pak(워터스사, 미국)으로 처리하고, 0.2㎛ 시린즈 여과기(사토리우스사, 독일)로 여과시켰다. 여과물을 RCM 8 x 10 칼럼(워터스사, 미국) 및 C₁₈ 8 x 10 카트리지(cartridge) 칼럼(노바-팍)이 장착된 DX-300 바이오 HPLC(디오넥스)에 주입하고 하기 표 1에 제시된 조건하에서 물과 메탄올의 혼합물을 사용하여 용출시켰다. 이어서 50㎕ 샘플 크기를 사용하여 크로마토그래피를 수행하고 용출물을 DX-300 UV 탐색기로 254nm에서 관찰하였다.

시간(분)	용출속도(㎖/분)	용출액
시간(분)	용출속도(㎖/분)	물(%)	메탄올(%)
0.0	1.5	80	20
0.5	1.5	80	20
3.0	1.5	50	50
12.8	1.5	20	80
14.9	1.5	0	100
16.7	1.5	0	100
18.6	1.5	80	20
20.0	1.5	80	20

도 1은 옻나무 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 것으로, 여기에서 보듯이, 옻나무 추출물을 5가지 성분의 혼합물임을 알 수 있다. 각 성분의 함량은 하기 표 2에 나타내었다.

성분	피크 1	피크 2	피크 3	피크 4	피크 5
함량(%)	10.00	40.69	10.80	9.56	2.43

(단계 2) 각 성분 분석

상기 단계 1에서 수득된 각 성분을 질량 분광계(JEOL MS-AX 505 WA, 일본; 주입: 직접주입, 이온 모드: EI₊, 온도: 71.4℃, m/z) 및 원소 분석기(펄킨-엘머, 미국)로 분석하였다. 그 결과, 피크 1은 분자량 162을 갖는 신규 화합물이고, 피크 2는 분자식이 C₁₅H₁₂O₆(분자량 288)이며, 백색의 결정체를 갖는 푸스틴(Fustin; 3,3',4',7-tetrahydroxyflavanone) 화합물이고, 피크 3은 분자식이 C₁₅H₁₀O₆(분자량 286)이며 황색의 결정체를 갖는 피세틴(Fisetin; 3,3',4',7-Tetrahydroxyflavone) 화합물이고, 피크 4는 분자식이 C₁₅H₁₀O₅(분자량 272)이며 진한 오렌지색의 결정체를 갖는 설푸레틴(Sulfuretin; 3',4',6'-Trihydroxyaurone) 화합물이고, 그리고 피크 5는 분자식이 C₁₅H₁₂O₅(분자량 272)이며 오렌지색의 결정체를 갖는 부테인(Butein; 2',3,4,4'-Tetrahydroxychalcone) 화합물인 것으로 확인되었다.

참조예 1: 간의 소포체 및 세포질 분획 분리

적출간으로부터 Trush 등(Trush, M.A., et al., Biochem. Pharmacol., 31, 805(1982))의 방법을 응용하여 간 소포체 및 세포질 분획을 분리하였다. 적출 간 2-3g을 미세가위로 세절한 후 간 무게의 약 4배가 되는 1.15% KCl 완충액을 첨가한 후 폴리트론을 사용하여 균질화하였다. 균질액을 600g에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 15,000g에서 20분간 원심분리하였으며 다시 상등액을 취하여 105,000g에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 상등액은 세포질분획으로 GST 등의 제 2상 대사효소의 활성측정에, 침전층은 1.15% KCl 완충액으로 재현탁시켜 시토크롬 P450, 시토크롬 P450 이소자임의 효소활성 및 간독성 지표인 지질 과산화 활성 측정에 사용하였다. 간 소포체 및 세포질 분획은 -70℃ 급속 냉각기에 보관하였다가 실험에 사용하였으며 검체 중의 단백질 농도는 소혈청 알부민(BSA)를 표준물질로 하여 BCA 단백질 분석키트를 사용하여 측정하였다.

참조예 2 : 약물 투여

실험동물로서 체중 230-250g의 웅성(male) 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트를 실험동물로서 체중 230-250g의 웅성(male) 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트를 사용하여 사료(Purina Korea사, 한국)와 물을 자유롭게 먹게 하고, 사육실의 온도는 23 ±2℃, 상대습도는 55±10%, 사육장내 빛(주야)은 12시간 주기로 하였다.

두 군의 실험군으로 나눈 다음, 한 군의 래트(대조군)에게는 폴리에틸렌글리콜:살린 혼합물(1:2(v/v))을 0.3㎖/㎏의 양으로 1일 1회씩 4일간 연속하여 복강주사로 투여하였다. 나머지 한 군의 래트(실험군)에게는 폴리에틸렌글리콜:살린 혼합물(1:2(v/v))에 10 내지 40mg/kg의 옻나무 추출물을 1일 1회씩 4일간 복강주사하였다.

참조예 3 : 사염화탄소(CCl ₄ )에 의한 간독성 유발

실험동물로서 체중 230-250g의 웅성(male) 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트를 사용하여 사료(Purina Korea사, 한국)와 물을 자유롭게 먹게 하고, 사육실의 온도는 23±2℃, 상대습도는 55±10%, 사육장내 조명주기는 12시간으로 하였다.

세군의 실험군으로 나눈 다음, 이 중 1 군의 래트(대조군)에게는 폴리에틸렌글리콜:살린 혼합물(1:2(v/v))을 0.3㎖/㎏의 양으로 1일 1회씩 4일간 연속하여 복강주사로 투여하였다. 다른 두 개의 군들에는 간독성 물질인 사염화탄소(CCl₄)를 0.3㎖/㎏ 의 양으로 1회 복강주사한 다음, 이 중 1 군(실험군)에는 실시예 1에서 제조된 옻나무 추출물을 20㎎/㎏ 및 40㎎/㎏의 양으로 1일 1회씩 4일간 연속하여 복강주사하고, 다른 1 군(비교군)은 그대로 방치하였다.

실시예 3 : 옻나무 추출물의 투여에 의한 혈액중 혈액학적 지표측정

상기 참조예 2의 방법에 따라 약물을 투여하고 24시간 후 복대정맥으로부터 500㎕의 혈액을 채취하여 EDTA가 처리된 용기(microtainer, Becton Dickinson)에 넣어 자동혈액 검사기(H-1, Technichon)를 이용하여 혈액학적 지표인 헤마토크릿치(PCV), 헤모글로빈(HGB), 적혈구수(RBC), 적혈구 평균용적(MCV), 평균 헤모글로빈양(MCH) 및 평균 헤모글로빈 농도(MCHC)를 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	적혈구수(RBC)(세포수/㎕)	적혈구 평균용적 (MCV)(fl)	평균 헤모글로빈양(MCH)(pg)	평균 헤모글로빈 농도(MCHC)(%)
대조군	7.33±0.33	68.28±2.46	20.47±0.45	20.47±0.45
실험군	7.41±0.23	71.35±0.21	18±0.57	25.3±0.71

상기 표 3에서 보듯이, 본 발명의 옻나무 추출물은 평균 헤모글로빈 농도(MCHC)를 유의적으로 증가시켰으나(p<0.001) 헤마토크릿치 등 다른 혈청학적 지표에는 별다른 영향을 미치지 않았다.

실시예 4: 옻나무 추출물의 투여에 의한 시토크롬 P450 함량 측정

옻이 간내 약물대사 효소에 미치는 영향을 알아보기 위하여 상기 참조예 2의 방법에 따라 약물을 투여하고 24시간 후 간을 적출하여 간 소포체내 시토크롬 P450 함량을 측정하였다. 즉, 참조예 1의 방법에 따라 수득한 소포체 분획을 단백질 량이 1 내지 2 ㎎/㎖이 되도록 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0)에 현탁시키고, 현탁용액을 1㎖ 세미마이크로큐베트(semimicrocuvette)에 1㎖씩 넣고 1㎎ 정도의 아디티온산 나트륨(sodium dithionite)을 각 세포에 가한 후 파장 350-500nm에서 기준선을 정하였다. 그 후 검체 세포에 CO 기체를 1 버블/초의 속도로 30-40초간 버블링시킨 후 다시 파장 350-500nm에서 시토크롬 P450 CO 결합 복합체의 상이 스펙트럼을 얻었다. 따라서 시토크롬 P450의 함량은 시토크롬 P450-CO 복합체 형성 전후의 각각 450nm와 490nm 사이의 흡광도 차이로 계산하였다.

그 결과는 도 2에 나타내었으며, 도 2에서 보듯이, 옻나무 추출물은 모든 투여용량에서 간 소포체내 시토크롬 P450 함량을 증가시켰으며, 이러한 옻의 시토크롬 P450 함량증가는 10 ㎎/㎏ 투여시에 최대치를 나타내었다(p<0.01).

실시예 5: 옻나무 추출물의 투여에 의한 시토크롬 P450 이소자임 활성 측정

옻이 간내 약물대사 효소에 미치는 영향을 알아보기 위하여 상기 참조예 2의 방법에 따라 약물을 투여하고 24시간 후 간을 적출하여 간 소포체내 시토크롬 P450 이소자임의 활성을 측정하였다.

(단계 1) 에톡시레소루핀-O-데알킬라제(EROD)의 활성측정

상기 에톡시레소루핀-O-데알킬라제(EROD)의 활성측정은 EROD에 의해 에톡시레소루핀이 특정 파장의 형상을 지닌 레소루핀으로 대사되는 성질을 이용하여 벌크(Burke) 등의 방법(Burke M.D., et al., Biochem. Pharmacol., 34, 3337(1995))에 따라 측정하였다. 우선 방사 스캔닝(emission scaning)을 실시하여 파장을 확인한 후(530nm 여기, 585nm 방사), 일정량의 단백질을 포함하는 포스트-미토콘드리알(post-mitochondrial) 분획과 디메틸설폭사이드에 용해시킨 0.25μM 에톡시레소루핀(ethoxyresorufin)에 0.1M 인산염 완충액(Na-K 염, pH 7.6)을 혼합하여 전체량이 2㎖가 되도록 한 후 37℃에서 5분간 가온하여 안정화시켰다. 250μM NADPH(인산염 완충액에 녹인 50mM 용액 10㎕)를 가해 반응을 개시한 20분 후, 3㎖ 메탄올을 가하여 반응을 종결시켰다. 1,500g에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 여기 530nm, 방사 585nm 형광을 관찰하였다.

그 결과는 도 3에 나타내었으며, 도 3에서 보듯이, EROD 활성은 옻나무 추출물 10 및 20㎎/㎏ 투여시에 유의적으로 증가하였으며(p<0.0001 및 p<0.05) 40㎎/㎏ 투여에 의해서는 감소하였음을 알 수 있다.

(단계 2) 벤질옥시레소루핀-O-데알킬라제(BROD)의 활성측정

BROD 활성은 EROD 활성 측정시와 동일한 방법으로 측정하였다. 80㎍의 단백질을 포함하는 포스트미토콘드리알 분획에 디메틸설폭사이드에 용해시킨 0.01mM 벤질옥시레소루핀 5㎕와 0.1M 인산염 완충액(Na-K 염, pH 7.6)을 혼합하여 199㎕가 되게 한 후 37℃에서 1분간 가온하여 안정화시켰다. 50mM NADPH 1㎕를 가해서 37℃에서 30분 동안 배양시켜 충분히 반응되도록 한 후 메탄올 400㎕를 가해 반응을 종결시켰다. 800g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 형광 분광광도계(SFH 25, Kontron Instrument)를 사용하여 여기 파장 530nm과 방사파장 585nm에서 형광도를 측정하였다.

그 결과는 도 4에 나타내었으며, 여기에서 보듯이, 옻나무 추출물 10 및 20 ㎎/㎏ 투여는 간 소포체내 7-벤질옥시레소루핀-O-데알킬라제(BROD)의 활성을 유의적으로 감소시켰으며(p<0.001), 이러한 옻나무 추출물의 BROD 활성 감소는 40 ㎎/㎏ 투여시에 가장 큰 것으로 나타났다.

(단계 3) 아닐린 하이드록시라제 활성측정

아닐린 하이드록시라제의 활성은 p-하이드록시아닐린으로 아닐린이 대사되는 것을 측정하였다.

P450 2E1의 촉매적 활성 측정을 위하여 재구성된 시스템은 0.1nmol P450, 0.1 또는 0.5nmol NADPH P450 환원효소와 30㎍/㎖ 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine, 초음파 처리된 미셀)로 이루어져 있다. 재구성된 시스템의 각 성분들을 섞은 후 37℃에서 2 분간 배양하고 얼음 위에 놓았다. 이어서, 0.1M 트리스 아세테이트(pH 8.0), 상기 재구성된 시스템 그리고 0.67mM NADP, 1 단위/㎖ 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제와 10mM 글루코스 6-포스페이트를 포함하는 NADPH 발생 시스템으로 이루어진 혼합물은 37℃에서 2 분간 예비배양하고 최종 농도가 8mM이 되도록 아닐린을 첨가하였다. 혼합물을 흔들어주면서 37℃에서 20분간 반응시켰고 반응은 20% 트리클로로아세트산(TCA)를 첨가하여 종결시켰다. 2000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 0.5㎖의 상층액을 회수하고 0.167㎖의 10% 탄산나트륨과 0.2N NaOH에 용해시킨 2% 페놀, 0.33㎖를 첨가하였다. 30분 후, 630nm에서 흡광도를 측정하였고 표준 검량선은 p-하이드록시아닐린(p-아미노페놀, MW 145.6)으로 만들었다.

그 결과는 도 5에 나타내었으며, 도 5에서 보듯이, 간 소포체내 아닐린 하이드록시라제 활성은 옻나무 추출물 10 및 20㎎/㎏ 투여시에 유의적으로 증가하였으며(p<0.001 및 p<0.01) 40㎎/㎏ 투여에 의해서는 감소되었음을 알 수 있다.

(단계 4) p-니트로페놀 하이드록시라제(PNPH) 활성측정

p-니트로페놀 하이드록시라제(PNPH) 활성은 p-니트로페놀(PNP)가 4-니트로카테콜로 대사되는 것을 이용하여 측정하였다. 1㎖ 1차 혼합물은 보통 0.1M 인산염 칼륨(pH 7.2) 시료와 NADPH 발생 시스템으로 이루어져 있다. 혼합물을 37℃에서 30분간 예비배양하고 반응은 최종 농도가 0.1mM이 되도록 PNP를 첨가하여 시작하였다. 3분 배양 후, 0.2㎖의 0.6N 과염산을 가하여 반응을 종결시켰다. 10N NaOH 0.1㎖를 첨가한 후, 상층액 1㎖를 취하여 생성된 4-니트로카테콜의 흡광도를 510nm에서 측정하였다.

그 결과는 도 6에 나타내었으며, 도 6에서 보듯이 간 소포체내 p-니트로페놀 하이드로시라제(PNPH) 활성은 옻나무 추출물 10 및 20 ㎎/㎏ 투여시에 유의적으로 증가하였으며(p<0.01) 40㎎/㎏ 투여에 의해서는 감소되었다.

실시예 6: 옻나무 추출물의 투여에 의한 간의 조직 검사

상기 참조예 3의 방법에 따라 사염화탄소(CCl₄)에 의해 간독성을 유발시킨 후 옻나무 추출물을 투여한 랫트의 간을 적출하여 생리식염수로 관류하여 간 조직내의 혈액을 충분히 제거시킨 후, 간의 모든 엽의 일정부위를 잘라내어 10% 중성 완충 포르말린 용액을 48시간 이상 고정시켰다. 일반적인 탈수, 치환 및 침투과정을 거쳐 파라핀에 포매시킨 후 4 ㎛로 절편하여 H&E 염색을 실시하였으며 광학 현미경하에서 조직의 병변 유무를 관찰하였다.

그 결과 옻나무 추출물은 모든 투여용량에서 간의 조직학적 변화를 일으키지 않았다. 또한, 옻나무 추출물을 미리 투여한 후 CCl₄에 의해 간독성을 유발시킨 경우(옻나무 예방효과)에는 육안소견상 CCl₄ 처치에 의해 유발된 주위 장기와의 유착 등을 감소시켰으나, CCl₄에 의한 간세포의 섬유화, 공포화 변성 및 괴사에는 통계적으로 유의성 있는 개선효과를 나타내지 않았다.

실시예 7: 옻나무 추출물의 투여에 의한 지질 과산화 작용 측정

상기 참조예 3의 방법에 따라 사염화탄소(CCl₄)에 의해 간독성을 유발시킨 후 옻나무 추출물을 투여한 랫트의 간을 적출하여 참조예 1의 방법에 따라 간 소포체 분획을 제조하였다. 제조된 간 소포체 분획 0.3㎖에 8% 트리클로로아세트산 0.9㎖를 가하고 4℃, 10,000g에서 5분간 원심분리하여 상등액 1㎖를 취하여 0.2% NaOH를 함유하는 1% 티오바비투르산(thiobarbituric acid) 용액 0.25㎖를 가하여 혼화한 후, 100℃에서 20분간 가열하여 발색시켰다. 실온으로 냉각시킨 후 엘리자 리더(Elisa Reader, Molecular Device, USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 지질 과산화 정도를 나타내는 지표인 말론디알데하이드(MDA) 함량을 측정하였다. MDA 생성량은 1,1,3,3-테트라메톡시프로판을 농도환산을 위한 표준물질로 사용하여 nmole/㎎단백질로 나타내어, 하기 표 4에 나타내었다.

	MDA(nmole/mg단백질)
대조군	0.99 ±0.29
비교군	1.09 ±0.38
실험군(20㎎/㎏)	1.03 ±0.36
실험군(40㎎/㎏)	1.13 ±0.41

상기 표 4에서 보듯이, 옻나무 추출물은 모든 투여용량에서 간 소포체내 지질 과산화에 영향을 미치지 않았으며, 또한, 옻나무 추출물을 미리 투여한 후 CCl₄에 의해 간독성을 유발시킨 경우(옻나무 예방효과)에는 CCl₄처치에 의해 증가된 MDA 함량에 비해 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

실시예 8: 옻나무 추출물의 투여에 의한 혈중 ALT 및 AST 함량 측정

상기 참조예 3의 방법에 따라 사염화탄소(CCl₄)에 의해 간독성을 유발시킨 후 옻나무 추출물을 투여하고 24시간 후 복대정맥으로부터 혈액을 채취하여 상온에서 30분간 방치 후 4,000 g에서 30분간 원심분리하여 혈청을 얻었으며, AST(Serum aspartate transaminase)와 ALT(alanine transaminase)의 농도(U/ℓ)를 리플레트론 에스 시스템(Refletron S system, Boeringer Mannheim Co., Ltd., Osaka, Japan)을 이용하여 측정하여 그 결과를 하기 표 5, 및 도 7 및 8에 나타내었다.

	대조군	비교군	실험군
AST(U/ℓ)	62.71 ±23.8	364.5±71.86^*	95.36±21.53^***
ALT(U/ℓ)	32.9±4.4	115.67±33.36^**	37.86±5.90^***
* 대조군과 유의성 있는 차이(p<0.001) 대조군과 유의성 있는 차이(p<0.0001)* 비교군과 유의성 있는 차이(p<0.0001)

상기 표 5, 및 도 7 및 8에서 보듯이, CCl₄ 처리군(비교군)은 ALT와 AST의 수준이 증가하였으나, 본 발명의 옻나무 추출물을 투여한 래트(실험군)에서는 ALT와 AST가 모두 대조군 수준으로 떨어졌으므로 본 발명의 옻나무 추출물이 간보호 활성을 나타냄을 알 수 있다.

본 발명의 옻나무 추출물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 주사제 및 액제 등과 같은 제제 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 하기에 제제예를 예시하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> 산제의 제조

실시예 1의 옻나무 추출물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

실시예 1의 옻나무 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

실시예 1의 옻나무 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 젤라틴 캡슐의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

실시예 1의 옻나무 추출물 100 ㎎

주사용 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 전체를 주사용 증류수로 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다.

본 발명의 옻나무 추출물은 안정하며 간 손상물질에 의해 손상된 간기능을 회복시키므로 간 보호용 의약 조성물로 유용하게 사용된다.

도 1은 본 발명의 옻나무 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 2는 옻나무 추출물이 투여된 래트에서의 시토크롬(cytochrome) P450의 함량 변화를 나타낸 그래프이고,

도 3은 옻나무 추출물이 투여된 래트에서의 에톡시레소루핀-O-데알킬라제(EROD)의 활성변화를 나타낸 그래프이고,

도 4는 옻나무 추출물이 투여된 래트에서의 벤질옥시레소루핀-O-데알킬라제(BROD)의 활성변화를 나타낸 그래프이고,

도 5는 옻나무 추출물이 투여된 래트에서의 아닐린 하이드록시라제의 활성변화를 나타낸 그래프이고,

도 6은 옻나무 추출물이 투여된 래트에서의 p-니트로페닐 하이드록시라제의 활성변화를 나타낸 그래프이고,

도 7은 옻나무 추출물이 투여된 래트에서 AST(Serum aspartate transaminase)의 저해효과를 나타낸 것이다.

도 8은 옻나무 추출물이 투여된 래트에서 ALT(alanine transaminase)의 저해효과를 나타낸 것이다.

Claims

옻나무(Rhus verniciflua) 목재부의 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는, 간 보호용 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,

상기 아세톤이 80% 이상의 아세톤 농도를 갖는 용액인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 추출물이 푸스틴((Fustin), 피세틴(Fisetin), 설푸레틴(Sulfuretin) 및 부테인(Butein)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.