KR100479735B1 - 대식세포특이 나노입자-면역조절제-면역원 복합체를이용한 치아우식증을 예방하는 비경구용 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치아우식증을 면역학적으로 예방하기 위한 비경구용 백신에 관한 것으로, 본 발명의 치아우식증을 면역학적으로 예방하기 위한 비경구용 백신은 기존의 경구용 백신의 단점 즉, 다량이 필요하며 경구투여후 소화효소에 의해 파괴될 수 있으며 면역학적 반응을 일으키는 등의 단점들을 보완하는데 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 입자크기가 균일하고, 표면적이 크며, 물에서 분산이나 분리가 쉬운 특징을 갖는 대식세포특이 나노입자(만노우즈로 코팅된 중합체성 미셀, mannose-coated polymeric micelle)에 면역조절제인 레티노산을 담지시켜 표적장기나 세포에 선택적으로 전달하여 약물의 부작용을 줄이며, 고효능의 항원-특이 면역글로불린(IgA)의 생산을 다량 유도하고, 혈액내 항원-특이 IgA 생산 림프구를 증가시키는 데 뛰어난 효과가 있다.

Description

대식세포특이 나노입자-면역조절제-면역원 복합체를 이용한 치아우식증을 예방하는 비경구용 백신{Non-oral vaccine for preventing dental caries using mannose-coated polymeric micelle-immunoregulator-immunogen complex}

본 발명은 치아우식증을 면역학적으로 예방하기 위한 비경구용 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 면역원인 글루코실트랜스퍼라아제를 분리, 정제하고 대식세포특이 나노입자에 면역조절제인 레티노산을 담지시켜 고효능의 항원-특이 면역글로불린(IgA) 생산을 다량 유도하고 혈액내 항원-특이 IgA 생산 림프구를 증가시키는 비경구적인 새로운 메카니즘의 점액성 항-치아우식 면역백신에 관한 것이다.

감염성 질환은 주로 위장관계(gastro-intestinal system)나 호흡기계 (respiratory system)의 경로를 통해 감염되므로 점액성 면역(Mucosal Immunity)이 중요하게 다뤄지고 있다. 따라서, 감염경로에 따른 점액성 면역을 위한 백신이 개발되어야 한다. 면역글로불린 중 IgA는 구강이나 장관내에서 가장 많이 분비되는 면역글로불린의 동종형으로, 특히 분비성 IgA (sIgA)는 장내에 침범하는 각종 세균, 바이러스 및 곰팡이 등의 병원미생물의 점액조직의 통과를 차단하기위해 다량으로 분비되는 것으로 보인다. 따라서 구강과 장관을 통한 감염성 질환의 면역 메카니즘을 이용한 효과적인 예방을 위해서는 항원특이 IgA의 생산이 효과적으로 유도되어야 한다.

한편, 치아에서 가장 흔하게 발생하는 대표적인 질환인 '치아우식증'은 우리 나라의 경우, 영구 치아의 충치 이환율이 약 80%에 이르며, 한 사람이 평균 2-3개의 충치를 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 사람의 치아우식증은 세균에 의한 것으로 주요 원인균으로는 치아세균막에서 흔히 발견되는 스트렙토코커스 뮤탄(Sterptococcus mutans, SM)과 스트렙토코커스 소브리누스(Sterptococcus sobrinus)가 있다. 상기 균들이 갖는 항원 중 Ag I/II, PAc 및 글루코실트랜스퍼라아제(glucosyltransferase, GTF)는 항-우식증 백신과 관련된 연구들에서 주로 다루어져 왔다. 특히, GTF나 Ag I/II등을 이용한 경구면역에 의해 생산된 항원-특이 분비형 면역글로불린(sIgA)은 우식형성 스트렙토코커스 뮤탄에 의한 집락형성을 억제하고 치아우식의 형성을 감소시킨다고 보고되어 있다. 대체로 점액성 IgA의 생산을 유도하기 위해서는 경구적 경로로 항원을 투여하는데 항원을 경구적으로 투여하기 위해서는 다량의 항원이 필요하며 또한 이들 항원은 소화효소에 의해 쉽게 파괴되기도 하고 면역학적 관용을 일으키기도 하는 단점이 있다. 따라서, 이러한 단점들을 보완하기 위해 항원에 콜레라 톡신 B 서브유닛(cholera toxin B subunit)이나 리포좀(liposome)을 결합시키거나 혹은 여러 보조제를 함께 사용하기도 하지만 효과적으로 IgA를 유도하기에는 보완하여야 할 여러 가지 문제점들이 있다.

보통, B 세포에서의 IgA 생산에는 1) B세포의 전환판별단계(switch differentiation) 2) IgA B세포 종결판별단계(terminal differentiation)를 거친다. 이중 특히 첫 단계는 주변면역계의 Th1/Th2 균형과 관련하여 사이토카인의 조절을 받는다고 알려져 있다. 실제로 면역계는 신경계 및 내분비계와 상호 밀접한 관계(Neuroendocrinoimmunology)를 유지하고 있으며 여러 가지 호르몬들이 면역반응에 관여하고 있다고 알려져 있다. 이러한 사실들로부터 면역원에 면역조절성 호르몬을 첨가하면 면역반응의 양상을 변화시킬 수 있으며 경구적 면역법의 단점을 보완하기 위한 비경구적 백신요법의 가능성을 엿볼 수 있다.

최근 각광을 받고 있는 나노입자를 이용한 약물방출시스템(durg delivery system, DDS)은 리포좀(liposome), 미소구(微小球, microsphere), 중합체성 미셀(polymeric micelle)등을 이용하고 있다. 특히, 고분자 미립자는 일반적으로 10nm-150nm에 해당되는 크기의 미립자를 말하며, 입자크기가 균일하고, 표면적이 크고, 물에서 분산이나 분리가 쉬운 특징을 갖고 있기 때문에 약물방출의 여러 방면에 널리 응용되고 있다. 이러한 미립자는 비교적 많은 양의 약물을 함유할 수 있고 지속적인 약물방출이 가능하며 각 고분자 미립자의 특징에 따라 체내의 약물이 요구되는 부위에만 집중시키며 기타 부위에는 약물 농도를 극소화시킬 수 있기때문에 진잔 약용고분자에도 사용되고 있다. 특히, 중합체성 미셀법은 단일항원성 항체법과 같은 활성 타겟팅(active targeting)에 비해 광범위한 표적 장기에 적용될 수 있는 방법으로서 표적약물방출계에서 사용되고 있다. 생체내에서는 정맥주사를 통하여 표적 장기나 세포에 선택적으로 전달되게 함으로써 약물의 부작용을 줄이는 장점을 갖고 있다. 또한, 적은 양의 항원으로도 면역세포에 장기적으로 잔류, 자극함으로서 일회의 투여로 높은 효능의 면역성을 나타낸다. 이들은 미립자의 표면구조를 바꾸기도 하고 대식세포와의 반응을 촉진시켜 특정 항원에 대한 면역성을 높이므로 백신으로서의 새로운 이용가능성을 유추할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 우리나라에서 가장 높은 빈도로 발생하는 세균성 질환 중 하나인 치아우식증을 예방하는데 있어, 종래의 구강 백신(oral vaccine)의 단점들을 보완하며 보다 강력한 새로운 개념의 비경구적 점액성 항-치아우식 면역백신을 제공하고자 한다.

본 발명의 목적은 스트렙토코커스 뮤탄으로부터 치아우식항원인 글루코실트랜스퍼라아제(GTF)를 생산한 후 정제하고 새로운 PLA 나노입자를 합성하여 상기 PLA 입자에 다시 당쇄 PV-Man기로 코팅한 후 그것의 물리화학적 특성을 조사하고 상기 나노입자와 대식세포와의 친화성 및 상호작용을 분석하고 나노입자의 안정성 및 약물방출을 조사하며 나노입자-면역조절제의 림프구, 대식세포의 활성 및 사이토카인의 생산능을 조사하고 미셀-항원-면역조절제의 생체내 면역글로불린(IgA)의 생산능 및 IgA 생산 B 림프구를 검사하고 치아우식동물모델에서의 면역성과 부작용을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 치아우식의 주된 인자중의 하나인 GTF를 스트렙토코커스 뮤탄으로부터 생산 및 정제하는 단계; 새로운 PLA 나노입자를 합성하고 당쇄 PV-Man기로 코팅 및 제조한 후 물리화학적 특성을 조사하는 단계; 상기 나노입자와 대식세포와의 친화성 및 상호작용을 분석하며 상기 나노입자의 안정성과 약물방출을 조사하는 단계; 나노입자-면역조절제의 림프구, 대식세포의 활성 및 사이토카인의 생산능을 시험하는 단계; 나노입자-항원-면역조절제의 생체내 IgA 생산능과 IgA 생산 B 림프구를 검사하는 단계; 치아우식동물모델에서의 면역성 효과와 부작용을 분석하여 새로운 비경구적 항-치아우식 백신을 개발하는 단계로 구성된다.

본 발명은 특정 감염성 질환에만 국한하지 않으며 기타 모든 감염성 질환의 백신개발에 응용될 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다

[실시예]

실시예 1 : 면역원 글루코실트랜스퍼라아제(GTF)의 정제

본 발명의 치아우식을 예방하기 위한 비경구용 백신을 개발하기 위해 주요 치아우식항원인 GTF를 스트렙토코커스 뮤탄 SJ32(S. mutans SJ32)로부터 Smith등이 서술한 방법(Smith D.J. et al, Infect. Immun. 64:3069-3073, 1996)에 따라 정제하였다. 포도당을 함유한 BHI 브로스에서 스트렙토코커스 소브리누스 B13(Streptococus sobrinus B13) 균주를 2일간 배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 Sephadex G-100 (파마시아사 제품)을 이용한 크로마토그래피를 실시하여 GTF를 정제하고 GTF가 풍부한 용액은 6M의 구아니딘(guanidine)에 희석하여 Superose 6 (파마시아사 제품)을 이용한 FPLC 크로마토그래피를 실시한 후, 활성도를 분석하고 SDS-PAGE를 시행하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 스트렙토코커스 소브리누스로부터 분리한 글루코실트랜스퍼라아제를 단일 밴드로 확인하였다.

실시예 2 : 본 발명의 대식세포에 특이적으로 결합하는 나노입자의 합성

시약

컴플리트 Freund's 보조제(Complete Freund's adjuvant), 오브알부민(OVA), 3-아미노-9-에틸카바졸, 2-머캅토에탄올, 레티노산(RA), 필로카르핀, 소듐 파이로포스페이트, 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5 디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT), 퍼록시데이즈로 표지된 항-IgM(μ체인) 항체, 퍼록시데이즈로 표지된 항-IgG(γ체인) 항체, 퍼록시데이즈로 표지된 항-IgA(α체인) 항체, 아비딘-페록시데이즈, o-페닐디아민 디하이드로클로라이드(OPD), 디아미노벤지딘(DAB), PKH26/PKH67 키트, LPS (E. coli O111;B4) 및 카바콜 등은 시그마사 제품을 사용하고, 래트 α 체인에 대한 마우스 단일항원제제와 염소의 항-마우스 IgG-알칼라인 포스파타아제는 타고(TAGO)사 제품를 사용하며, 페이탈 카프 씨럼(fetal calf serum, FCS), L-글루타민, RNase 억제제(RNasin), 랜덤 프라이머, 역전사 효소, dNTP, 디티올트레이톨(DTT) 그리고 RPMI 1640 배지는 기브코사(GIBCO, Grand Island, NY) 제품을 그리고 폴리 L-락트산(Poly (L-lactic acid, PLA, Mn=10,000)은 와코 퓨어 케미칼사(Wako pure Chemicals Inc.)에서, 폴리 [N-p-비닐벤질-o-D-만노피라노실(1-4)-D-글루코나마이드](PV-Man, Mn=40,000)는 일본의 세이카가쿠사에서 구입하였다. 키토산(고분자량)과 트리폴리포스페이트(TPP, 펜타소듐염) 그리고 Tween^ⓡ 80은 시그마-알드리치 코리아(Sigma-Aldrich Korea)에서 구입하였다.

실험예 1 : 대식세포에 특이적으로 결합하는 나노입자의 합성

대식세포에 특이적으로 결합하는 PLA 나노입자를 합성하기 위하여 단량체인 L-락트산을 개시제인 트리에틸아민을 사용하여 중합하였다. 이때 소정의 PLA와 대식세포를 인식하는 당쇄중 만노우즈를 포함한 폴리[N-p-비닐벤질-o-D-만노피라노실(1-4)-D-글루코나마이드](PV-Man)을 DMSO에 녹인 후에 이것을 투석하여 나노미립자를 제조하였다. 투석 후 코팅되지 않은 PV-Man은 원심분리기로 제거하고 동결건조하였다. 다이나믹 라이트 스캐터링(dynamic light scattering, DLS)방법을 이용하여 합성된 미립자의 크기분포를 측정하였다. 투과전자현미경(TEM) 및 주사전자현미경(SEM)으로 미립자의 형태를 관찰하였다. 나노미립자에 FITC를 부착시키고 비장세포를 이용하여 대식세포와의 선택적 결합여부를 FACS를 이용하여 분석하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PV-Man으로 코팅된 PLA 나노입자의 크기를 TEM으로 확인한 결과, 250-500nm의 크기를 가지고 있다. 도 2b는 상기 나노입자의 크기분포를 포톤 코럴레이션 분광법을 실시하여 알아본 결과를 나타낸 것이다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, FITC에 표지된 FITC-PLA-PV-Man의 세포친화성을 조사한 결과, 대식세포에 대한 특이적 친화성을 나타내었다.

실험예 2 : 키토산 미립자의 제조

2% (v/v)의 아세트산과 1% (v/v)의 Tween^ⓡ-80의 혼합액을 이용하여 키토산 용액(0.25%)을 제조하였다. 그리고 나서 100ml의 상기 키토산 용액에 20 ml의 15% (w/v) TPP를 방울씩 첨가한 다음 5분동안 섞어주고 계속적으로 초음파 처리(5W, Vibra cellTM, Sonics & Materials, Inc., USA)하였다. 상기 키노산 미립자 현탁액을 3,000rpm에서 30분동안 원심분리한 다음, 미립자를 세척하기위해 펠렛을 증류수에서 현탁한 다음 세척된 상기 미립자를 동결건조하였다.

실험예 3 : 오브알부민의 로딩(loading)

키토산 미소구의 오브알부민 로딩은 인산염 완충액(PBS, pH 7.4)에 1.5 % (w/v)의 키토산 미소구와 0.5 % (w/v)의 오브알부민을 넣고 25℃에서 흔들어주면서 24시간동안 항온처리함으로써 이루어졌다. 24시간 후, 상기 현탁액을 3,000rpm에서 30분간 원심분리하여 로딩되지않은 알부민을 제거하였다. BCA 단백질 분석(피어스사 제품)을 이용하여 상층액내의 결합되지않은 오브알부민을 정량하여 로딩 정도를 측정하였으며, 오브알부민의 평균 로딩율은 55~60 %였다.

실험예 4 : 레티노산의 로딩 및 시험관내 유리시험

본 발명의 대식세포특이 나노입자의 담지 약물의 유리정도를 알아보기 위해, 투석후, PLA 코아-쉘 타입의 나노입자(core-shell type nanoparticle)에 담지된 레티노산의 용량을 10.8 wt.-% 과 15.7 wt.-%으로 하여 실시하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 대식세포특이 나노입자에 담지된 약물의 유리는 보다 높은 농도에서 즉 15.7%에서 둔화되었다. 또한, 담지 약물의 초기방출은 처음 1 일 이전에 나타났고, 이 후 8일이상 동안 느린 속도로 유리되었다.

실시예 3 : 본 발명의 PV-Man-RA 나노입자의 세포 독성 및 사이토카인에 생성에 대한 효과

본 발명의 대식세포특이 나노입자의 세포 독성과 시험관내에서 면역세포의 활성을 측정하기 위하여, 마우스 비장의 림프구와 대식세포 및 섬유아세포주 (L929)를 사용하였다. 이때 사용한 배지로는 10% FCS와 L-글루타민, 2-머캅토에탄올(2-ME), 그리고 항생제가 첨가된 RPMI 1640와 DMEM배지를 사용하였다. 배양 중 이들 비장세포들을 자극하기 위하여 분열촉진물질로써 일정농도의 항-CD3 항체 및 PHA/Con-A를 사용하였다.

실험예 1 : PV-Man-RA 복합체의 세포독성 및 세포분열주기에 대한 효과

본 발명의 레티노산을 담지한 합성복합체의 세포독성을 조사하기 위하여 MTT방법을 통하여 마우스의 섬유아세포주인 L929와 마우스 비장 림프구를 조사하였다.

도 5a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PV-Man-RA 복합체는 배양액 내에서 5 ug/ml에 이를 때까지는 L929 세포와 림프구에서 거의 독성을 나타내지 않았다.

본 발명의 합성복합체의 세포분열주기는 PKH26염색법을 사용하여 조사하였다. 일정시간 배양한 세포들을 유식세포측정기(Becton-Dickinson, Oxnard, CA)의 FACScan 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 세포분열주기를 측정하기 위해, 세포주기분석 소프트웨어(Verity S/W House Inc, Maine, U.S.A)를 이용하여 최종 분석하고 아래의 공식을 이용하여 분열지수 (proliferation index, PI)를 산정하였다.

(Ak, 각 세대의 가우스 영역; k, 세대수)

도 5b 에 그 결과를 나타내었다.

실험예 2 : 본 발명의 PV-Man-RA 복합체의 사이토카인의 생산능에 대한 효과

본 발명의 PV-Man-RA 복합체의 IL-2, IL-4 및 IFN-γ의 생산능에 대한 효과를 알아보기 위하여, 본 발명의 레티노산을 담지한 대식세포특이 나노입자를 투여한 실험군과 대조군 마우스로부터 비장을 적출하고 세포액을 제조하였다. 상기 세포액에 일정농도의 분열촉진물질인 항-CD3 또는 PHA를 투여하여 24시간 배양한 다음 상기 배양액의 상층액을 모아 원심분리하였다. 아래에 설명하는 방법으로 각 림포카인을 측정하였다.

IL-2와 IL-4의 검사법

항-CD3 단세포군 항체로 자극한 T-세포 배양액의 상층액내의 IL-2와 IL-4의 양은 지시 세포주인 CTLL-2 세포의 성장촉진능력을 관찰함으로써 IL-2 와 IL-4의 활성역가를 검사하였다. 항-IL-2항체(S4B6)와 항-IL-2 수용체 항체(7D4)를 사용하고, IL-2의 역가를 판정하기 위해서는 항-IL-4항체(11B11)를 사용하였다. 최종적으로 3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT)를 이용하여 570nm 파장 하에서 ELISA 판독기(Molecular Device Co.)를 사용하여 판독하였다.

IFN-γ의 검사법

배양상층액내에 존재하는 IFN-γ를 정량하기위해, 엔세팔로마이엘로-카디티스(encephalomyelo-carditis, EMC) 바이러스에 의한 세포변형효과 환원분석(cytopathic effect reduction assay)를 약간 변형하여 사용하였다. IFN-γ의 최종역가는 L929세포가 50% 이상 살아있는 가장 높은 희석배율로 하였다.

세포내 사이토카인 염색

마우스 비장세포를 항-CD3로 세포를 활성화시키고 단백질 전달 억제제인 미넨신을 2M이 되도록 첨가하여 생성된 사이토카인은 세포내에 축적되어 고정 완충액(PBS에 녹인 4%의 파라포름알데하이드), 투과완충액 (PBS에 녹인 0.1% 사포닌, 0.1% 소듐 아자이드, 1% FBS)으로 세척하였다. 항-IFN-γ(XMG1.2), 항-IL-4 (11B11)를 가한 다음 플로우 사이토미터(flow cytometer)로 분석하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 레티노산으로 전처리(2.5mg의 펠렛을 3일전 피하주사함)한 마우스로부터 적출한 비장세포를 배양하면서 항-CD3 항체로 자극하면 레티노산 처리군에서 활성화된 비장세포로부터 시험관내에서 생산된 IL-2의 양은 대조군에 비해 감소하였으나, IL-4의 생산은 오히려 증가하였고, 레티노산 처리군의 비장세포로부터 생산된 IFN-γ의 양은 대조군에 비해 현저히 억제되었다.

실시예 4 : 본 발명의 미셀-항원-면역조절제의 마우스실험모델을 이용한 면역효과

본 발명의 미셀-항원-면역조절제의 생체내 면역효과를 알아보기 위하여, 마우스실험모델로부터 면역글로불린의 생산능을 조사하였다.

이를 위하여, GTF와 OVA등을 면역원으로 사용하고 보조제로는 알룸(알루미늄 하이드록사이드)을 제조하여 사용하였다. 각각의 항원을 알룸과 혼합하거나 알룸 및 레티노산 을 함께 혼합하거나 미셀-항원-레티노산을 0.25 ml의 용적내의 알룸, OVA/GTF 및 RA의 최종농도는 60㎍, 5㎍ 및 10㎍이 되게 하였다. 항원의 조성 및 투여 경로에 따라 마우스를 5군으로 구별하고 각 군은 5-6 마리로 하였다. 즉, 제 1군은 항원과 알룸을 가는 비닐튜브를 이용하여 경구투여한 군이며 제 2군은 항원과 알룸을, 그리고 제 3군은 항원과 알룸과 레티노산을 마우스 복부에 피하투여한 군이며, 제 4군은 항원과 알룸과 미셀과 레티노산을 마우스 복부에 피하투여한 군이며, 제5군은 항원을 투여하지 않은 대조군으로 분류하였다. 최종투여 7일 후에 마우스로부터 비장과 혈액을 채취하여 실험에 사용하였다. 실험동물로는 생후 8주 - 10 주된 정상 BALB/c 암컷 마우스를 사용하였고, 실험 중 모든 마우스들은 크기가 18cm x 28cm인 케이지당 6마리 이하를 넣어 항온 항습 및 무균상태로 유지되는 동물사육시설에서 사육하고, 수돗물과 시판되는 실험동물 사료를 공급하였다.

실험예 1 : GTF로 면역시킨 마우스에서 항체의 응집역가반응

스트렙토코커스 뮤탄 균체를 컴플리트 Freund's 보조제(CFA)와 함께 투여하여 생산된 혈청을 2배 계단 희석하면서 잉그릿 균주(Ingritt strain)과 LM-7 및 OMZ-175와 반응시켜 응집역가를 측정하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 경구투여군에서는 거의 검출되지 않은 반면 피하투여군에서는 1:2560의 높은 응집역가를 나타냈으며 여기에 레티노산을 첨가하면 응집역가는 오히려 감소하였다. 또한 스트렙토코커스 뮤탄(Ingritt strain)균체로 면역하여 생산된 항체는 LM-7과는 강한 교차반응을 보였으나 OMZ-175와는 거의 교차반응을 일으키지 않았다. 이를 다시 GTF 및 Ag I/II를 이용하여 흡수반응을 시행한 후 다시 응집반응을 관찰한 결과, Ag I/II에 의하여 흡수반응후 응집역가는 상당히 감소하였으나 GTF에 의하여 흡수반응후에는 응집역가에 전혀 변화를 일으키지 않았다.

실험예 2 : 면역조절제의 사이토카인의 mRNA 발현에 대한 효과

면역조절제인 레티노산의 IL-10, IL-12 및 TGFβ1의 mRNA 발현에 대한 효과를 조사하기 위하여, 12-웰 배양판에 3×10⁶ cells/well로 있는 마우스 복강 대식세포를 0.5㎍/ml의 LPS로 자극하면서 RA (10^-7M) 또는 End (10^-12M)를 함께 투여하고 일정시간 후에 총 RNA를 추출하여 역전사 중합연쇄반응(RT-PCR)을 시행하였다.

면역조절제의 존재하에서 항원 또는 분열촉진물질 등(항-CD3, PHA, Con-A)에 의하여 활성화된 면역세포에서의 각종 사이토카인의 mRNA 발현을 분석하기 위하여 역전사 키트(프로메가사 제품)와 중합연쇄반응 키트(프리믹스사 제품)를 이용하여 역전사 중합연쇄반응을 실시하였다. 즉, 래피드 구아니디움 이소티오시아네이트(rapid guanidium isothiocyanate) 방법으로 추출한 1㎍의 총 RNA를 역전사 반응액 (0.1 ㎍; oligo(dT)15, 1x역전사 완충액, 5mM MgCl₂, 1mM dNTP 혼합액, 10 unit; rRNase 리보뉴클라아제 억제제, 10 units; AMV 역전사효소)과 혼합하여 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 상기에서 합성된 cDNA의 2.5㎕를 중합연쇄반응액(1 unit; 열에 안정적인 DNA 중합효소, 0.25mM dNTP, 50mM Tris-HCl (pH 9.0), 40mM KCl, 1.5mM MgCl₂)과 혼합하여 ThermoCycler (Molecular Biology Technique Center, Thermojet, THE-NEW. V 1.0)를 이용하여 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 42초 동안 30회 실시하여 cDNA를 증폭한 후 1.2% 아가로우즈겔에 전기영동하였다. 표 1에는 사용된 사이토카인의 프라이머들을 나타내었다.

역전사 중합연쇄반응에 사용된 사이토카인의 프라이머

사이토카인과 프라이머		올리고뉴클레오타이드(5 ---> 3)	PCR 프러덕트(bp)
β-액틴	센스안티센스	TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA CTAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G	348
IL-4	센스안티센스	CAG TTT GTA TCT CTG AGA ACC TCTCTC ACT ACC TGT GAT GAG TTT T	515
TGF-β	센스안티센스	CTG GTG ACA ACC ACG GCC TTC CCT AATG CTT AGG CAT AAC GCA CTA GGT T	600
IFN-γ	센스안티센스	TGA ACG CTA CAC ACT GCA TCT TGGCGA CTC CTT TTC CGC TTC CTG AG	460

도 8a에 나타난 바와 같이, 면역조절제인 레티노산의 IL-10, IL-12 및 TGFβ1의 mRNA 발현에 대한 효과를 조사한 결과, 외부의 자극에 영향을 받지 않고 항상 일정한 양으로 발현된다고 알려진 HPRT의 경우 일정하게 발현됨을 볼 수 있었다. IL-12 p40은 LPS 자극 후 2시간 때에도 발현되었으며 4-8 시간 때에 정점을 이루고 24시간 때까지도 자극 전의 상태로 회복되지 않고 LPS 자극이 없을 때는 p40 mRNA는 거의 발현되지 않았다 (미도시됨). 배양 8시간 후 복강 대식세포의 IL-12 p40 mRNA 발현에 대해 RA는 IL-12 mRNA 발현을 감소하였고, End는 IL-12 mRNA 발현을 증가시켰다.

한편, 도 8b에 나타난 바와 같이, LPS 자극 후 1일 또는 2일후 RA를 처리한 후 TGFΒ1 발현은 LPS만을 반응시킨 대조군에 비하여 차이를 나타내지 않았다.

도 8c에 나타난 바와 같이, 비장세포를 LPS 자극 2시간후 측정한 IL-12는 발현되지 않은 반면, IL-10은 PBS(레인 4), LPS(레인 5)처리군에 비하여 LPS + RA 처리군(레인 6)에서 발현이 증가됨을 볼 수 있었다.

실험예 3 : 면역조절제들의 비장세포에서의 IgA 생산 및 IgA 생산 B 세포수에 미치는 영향

면역조절제들을 각각 혹은 병용처리한 후 비장세포에서의 IgA 생산 및 IgA 생산 B 세포수를 조사하기 위하여, 마우스 비장대식세포를 5㎍/ml의 LPS존재하에 배양하면서 레티노산(10^-7M), VD3(10^-9M) 및 DHEA를 함께 투여하고 5일간 배양한 다음 배양상층액내의 IgA 양을 ELISA에 의하여 측정 비교하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 면역조절제들을 처리한 결과, 비장세포의 IgA 생산은 레티노산의 첨가로 상당히 증가되었으며 특히 DHEA는 단독첨가시 IgA생산에는 영향을 미치지 않으나 VD3만을 투여한 군과 VD3와 DHEA를 함께 첨가한 군은 LPS를 단독투여한 군에 비하여 의의있게 (P < 0.05) 증가하였다.

실험예 4 : 레티노산의 GTF 면역된 마우스의 GTF특이 항체 생산에 대한 효과

면역조절제인 레티노산의 GTF 면역된 마우스의 GTF특이 항체의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여, GTF를 알룸과 함께 투여하여 생산되는 혈청내 항-GTF 항체를 ELISA법에 의하여 조사하였다. 상기 항체를 검사하기 위해서, 면역혈청과 비장세포 배양액, 그리고 타액내에서 항원-특이 항체 IgG, IgM, IgA와 모든 분비성 IgA(sIgA)를 검출하였다. 즉, 항원과 항-마우스 IgA를 카보네이트 완충액에 각각 5 ㎕/ml의 농도로 용해한 후 96-웰 배양판에 50㎕씩 분주하여 실온에서 1주야로 두어 부착시키고 일정배율로 희석한 시료를 4℃에서 1주야로 반응시켰다. 이어서 항원에 부착된 항체를 페록시데이즈-부착 항 마우스 IgA(1:1000 희석액)를 반응시킨 다음, 효소색소기질인 올소페닐렌디아민(orthophenylenediamine, OPD)과 반응시키고 5N 황산액으로 반응을 정지시켜 최종적으로 생산된 색소를 490nm 파장 하의 ELISA 판독기(Molecular Devices Inc.)를 사용하여 판독하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 항-GTF 항체중 IgM은 피하투여한 군에서 상당량이 검출되었으며 RA를 첨가하면 그 생산이 증가되었고, 경구투여한 군에서는 대조군에 비하여 약간의 증가를 보였으나 피하투여한 군 보다는 적었다. GTF-특이 IgG는 경구투여한 군에서는 전혀 검출되지 아니하였으며, 피하투여한 군에서만 현저한 증가를 보였고, RA를 첨가하여도 별 변화는 보이지 않았다. 항-GTF IgA는 피하투여한 군에서 전혀 검출되지 아니하였으나 여기에 RA를 첨가하면 항체생산이 증가되었고 증가 정도는 경구투여한 군의 생산량을 능가하였다.

실시예 5 : 본 발명의 PV-Man/RA 항원복합체의 마우스 치아우식실험모델을 이용한 면역효과 조사

병원균으로부터 감염되지 않은 SPF Sprague-Dawley 백서를 본 실시예에 사용하였다. 본 실험에 사용된 마우스는 생후 20일째에 고농도의 수크로오스 다이어트 2000을 투여하였으며, 각 실험군은 아래와 같이 구성하였다. 1) 면역되지 않고 감염되지 않은 군, 2) GTF+Alum 을 구강투여한 군, 3) GTF+Alum을 피하투여한 군, 4) GTF+Alum+RA 을 피하투여한 군, 5) GTF+Alum+PLA-Pv-Man-RA을 피하투여한 군. 2차 면역주사 후 13일 후, 백서의 후안와 혈관에서 채혈하고, 타액은 필로카르핀(1.0mg/100g 체중)을 주사한 후 얻었다. 모든 실험은 S. mutans를 감염시킨 후 71일 후에 종결하였으며, 균의 회복능 측정을 위한 구강내 스트렙토코커스 뮤탄의 구성을 관찰하였다. 전체적인 치아의 세척, 초음파 분해에 의해 얻은 균을 적당히 희석하여 MS 배지와 1mg의 바시트라신을 함유한 MS 배지에 접종하고 스트렙토코커스 뮤탄은 그것의 콜로니 모양으로 구별하였고, 전체 스트렙토코커스중에서 백분율로 나타내었다. 충치 분석은 충치의 깊이와 정도는 변형된 Keyes의 방법에 따라 현미경하에 실시하였다.

실험예 1 : PV-Man/RA 항원복합체의 비장세포에서의 IgA 생산 B 세포수에 미치는 영향

마우스에 항원투여시 알룸과 함께 유리형 레티노산을 투여하거나 PV-Man-RA를 투여하여 PV-Man/RA/항원복합체투여가 비장세포에서의 IgA 생산 B세포수에 미치는 영향을 조사하였다. IgA를 분비하는 비장세포의 숫자를 측정하기위해, 어피니티-퓨리파이드 동종형 특이 항체(Affinity-purified goat anti-mouse isotype specific antibody, 150ng/ml)와 항원(50ug/ml)을 니트로셀룰로오스가 바닥에 부착된 폴리스티렌 96-웰 플레이트(밀리포아사 제품)에 코팅한 후 4℃에서 1주야로 부착시켰다. 이 후 플레이트의 각 웰은 200 ㎕의 1% BSA-PBS-0.05% Tween (PBST)으로 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 블록킹하였다. 적정수의 비장세포를 각 웰에 넣은 후 37℃, CO₂ 배양기에서 2.5시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 다시 PBST로 세척한 후 150 ㎕의 바이오틴이 표지된 염소의 항-마우스 동종형 특히 항체를 1% BSA가 함유된 PBST에 희석시키고, 2시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST로 씻고 150 ㎕의 아비딘-페록시데이즈를 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 스팟은 3-아미노-9-에틸카바졸로 발색하여 입체현미경 상에서 숫자와 크기를 측정하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PV-Man/RA/항원복합체를 마우스에 투여하여 비장세포에서의 IgA 생산 B세포수에 미치는 영향을 조사한 결과, PV-Man/RA/항원복합체를 피하로 투여하면 알룸과 항원을 구강내로 투여한 군과 알룸+항원+유리형 레티노산을 피하로 투여한 군에 비하여 비장세포에서의 IgA 생산 B세포수는 현저히 증가하였다.

실험예 2 : 본 발명의 PV-Man/RA 항원복합체의 타액내 항-GTF 항체 생산에 미치는 영향

마우스에 항원투여시 알룸과 함께 유리형 레티노산을 투여하거나 PV-Man-RA를 투여하여 PV-Man/RA/항원복합체투여가 타액내의 항-GTF 항체변화에 미치는 영향을 조사하였다.

도 12에 나타난 바와 같이, PV-Man/RA/항원복합체를 피하로 투여하면 알룸과 항원을 구강내로 투여한 군과 알룸+항원+유리형 레티노산을 피하투여한 군과 함께 항-GTF IgA는 모두 증가하였으나 PV-Man/RA/항원복합체를 피하투여한 군에서 가장 현저히 증가하였다.

이상과 같이 본 발명은 실시예 및 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명의 치아우식증을 면역학적으로 예방하기 위한 비경구용 백신은 기존의 경구용 백신의 단점 즉, 다량이 필요하며 경구투여후 소화효소에 의해 파괴될 수 있으며 면역학적 관용을 일으키는 등의 단점들을 보완하는데 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 입자크기가 균일하고, 표면적이 크고, 물에서 분산이나 분리가 쉬운 특징을 갖는 대식세포특이 나노입자(만노우즈로 코팅된 중합체성 미셀, mannose-coated polymeric micelle)에 면역조절제인 레티노산을 담지시켜 표적장기나 세포에 선택적으로 전달하여 약물의 부작용을 줄이며, 고효능의 항원-특이 면역글로불린(IgA) 생산을 다량 유도하고, 혈액내 항원-특이 IgA 생산 림프구를 증가시키는 데 뛰어난 효과가 있으므로 본 발명은 비경구적인 새로운 메카니즘의 점액성 항-치아우식 면역백신으로 제조할 수 있어 의약산업상 매우 유용한 발명이다.

도 1은 스트렙토코커스 뮤탄으로부터 분리한 치아우식항원인 글루코실트랜트퍼라아제(GTF)의 FPLC 크로마토그래피와 SDS-PAGE의 실시 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 대식세포특이 나노입자의 크기와 안정성을 TEM과 포톤 코럴레이션 분광법으로 알아본 결과를 나타낸 것이다. a)는 대식세포특이 나노입자의 크기를 나타낸 것이며, b)는 나노입자의 크기분포를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 대식세포특이 나노입자의 대식세포에 대한 친화성을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 대식세포특이 나노입자의 시험관내 유리정도를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 대식세포특이 나노입자의 세포독성에 대한 효과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 대식세포특히 나노입자에 면역조절제인 레티노산이 담지된 복합체의 사이토카인에 대한 효과를 나타낸 것이다. a)는 IL-2와 IL-4의 생산능을 나타낸 것이고, b)는 IFN-γ의 생산능을 나타낸 것이다.

도 7은 스트렙토코커스 뮤탄으로부터 분리한 치아우식항원인 글루코실트랜트퍼라아제(GTF)로 면역시킨 마우스에서의 항체의 응집역가를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 대식세포특이 나노입자의 사이토카인 mRNA 발현에 대한 효과를 나타낸 것이다. a)는 IL-2의 mRNA를, b)는 TGFβ1의 mRNA를, c)는 IL-10의 mRNA 발현에 대한 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 면역조절제들의 비장세포의 IgA 및 IgA 생산 B 세포수에 미치는 영향을 ELISA로 나타낸 결과이다. a)는 면역조절제들의 면역글로불린 및 면역글로불린 생산 B 세포수에 미치는 영향을, b)는 분열촉진물질인 LPS를 투여한 후, 면역조절제들의 면역글로불린 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 10은 치아우식항원인 GTF로 면역시킨 마우스의 GTF 특이항체에 대한 레티노산의 효과를 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명의 대식세포특이 나노입자의 마우스 비장세포에서의 IgA 생산 B 세포수에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 12는 본 발명의 대식세포특이 나노입자의 마우스의 타액내에서의 GTF 특이항체 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

Claims (3)

1. 폴리 L-락트산(PLA)과 폴리[N-p-비닐벤질-o-D-만노피라노실(1-4)-D-글루코나마이드](PV-Man)을 DMSO에 녹인 후 투석함으로써 얻어진 PV-Man이 코팅된 PLA 나노입자; 레티노산(retinoic acid); 및 글루코실트랜스퍼라아제(glucosyltransferase, GTF) 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 치아우식증 예방용 비경구용 백신.
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