KR100418962B1

KR100418962B1 - 2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류를사용하여 펩티드를 고수율 및 고순도로 제조하는 방법

Info

Publication number: KR100418962B1
Application number: KR10-2001-0031768A
Authority: KR
Inventors: 김학주; 김영덕; 고찬영
Original assignee: 김학주
Priority date: 2001-06-07
Filing date: 2001-06-07
Publication date: 2004-02-14
Also published as: KR20020094068A; WO2002098903A1; US20040192888A1

Abstract

본 발명에 따라, 2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류 (Nsc-아미노산류)를 이용하여 고체상으로부터 목적하는 아미노산 서열을 가진 펩티드를단시간내에 고수율 및 고순도로 합성하는 방법이 제공된다.

Description

2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류를 사용하여 펩티드를 고수율 및 고순도로 제조하는 방법{Method for preparing peptide with high yield and purity using 2-(4-nitrophenylsulfonyl)ethoxylcarbonyl-amino acids}

본 발명은 2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류(Nsc-아미노산류)를 사용하여 고체상 펩티드 합성법(solide-phase peptide synthesis)으로 목적하는 펩티드를 단시간내에 고수율 및 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

고체상 펩티드 합성법은 의학과 생물학 연구 및 약학, 수의학, 농수산, 환경 및 진단 등에서 활성 물질로서 사용되는 생물학적 활성 펩티드의 제조에 광범위하게 적용된다.

고체상 펩티드 합성의 본질은 불용성 지지체(insoluble carrier)에 부착되어있는 최초의 C-말단 아미노산으로부터 시작하여, 화학반응의 반복에 의한 펩티드 사슬의 단계적 연장(elongation)으로 요약된다. 합성과정중 모든 반응의 목적물질은 지지체에 결합되어 있는 반면 과량의 반응물들과 부산물들은 지지체의 여과와 세척에 의해서 제거되는 것이다.

이러한 펩티드의 고체상 합성 방법을 구체적으로 살펴보면 보호된 아미노기를 갖는 최초 아미노산(목적 아미노산 서열의 C-말단)의 유리 카르복실기를 통하여 폴리머 지지체에 결합된 앵커기(anchor group)의 아미노 또는 하이드록실기와 아미드 또는 에스테르 결합을 형성함으로써 보호된 아미노아실-폴리머를 형성하는 단계; 보호된 아미노아실-폴리머를 염기성 시약으로 처리하여 탈보호(deprotection)하므로써 유리 아미노기를 갖는 아미노아실-폴리머를 형성시키는 단계; 이 폴리머의 유리 아미노기에 다음 순서의 보호된 아미노산 모노머를 아실레이션(acylation)시킴으로써 보호된 디펩티딜-폴리머를 형성하는 단계; 목적하는 아미노산 서열을갖는 펩티드가 얻어질 때까지 상기 탈보호 단계와 아실레이션 단계를 반복하는 단계; 및 합성된 펩티드 말단의 보호기를 탈보호하고, 불용성 지지체로부터 펩티드를 분리(detachment)하는 단계로 이루어진다.

그런데, 실제 고체상 합성에 있어서 과량(2~10배)의 아실레이션 시약이 완전한 전환반응(conversion)을 위해 사용되므로, 아미노산의 곁가지의 모든 관능성기, 예를 들어, 아미노기, 카르복실기, 하이드록실기, 티올기, 구아니디노기와 같은 관능기들을 적당한 보호기로 차단(blocking)해야 한다. 이런 목적을 위한 보호기는 일시적인 보호기의 제거중에 그리고 펩티드-폴리머 아실레이션 조건하에 곁가지를 확실하고 영구적으로 보호할 수 있도록 신중히 선택해야 한다.

종래 이러한 보호기로서 산성 시약에 의해 탈보호되는 Nα-tert-부톡시카르보닐기(Boc), 중간세기의 산성 시약에 의해 탈보호되는 1-(3,5-tert-부틸페닐)-1-메틸-에톡시카르보닐기(t-Bumeoc), 산성시약에 저항성이 있고, 비양성자성 용매에서 유기염기에 의해 탈보호되는 Nα-9-플루오레닐메톡시카르보닐기(Fmoc), 산에 의해 탈보호되는 tert-부톡시카르보닐기(tBU)기를 곁가지로 사용한 Fmoc/tBu 등이 있다. 이중 Fmoc기에 의해 보호된 아미노산류를 이용한 고체상 펩티드 합성법이 가장 많이 사용되고 있다.

그러나, Fmoc-아미노산류는 약한 염기 또는 중성에서 불안정하고, 긴 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 경우에 고농도의 피페리딘이 존재하여도 탈보호가 완전하게 이루어지지 않으며, Fmoc의 분절동안에 방출되는 디벤조플벤(divenzofulvene)의 트랩이 충분하지 않고, 소수성 부분으로 인하여 고체상 펩티드 합성법에서 사용되는 대부분의 용매에 대해 낮은 용해도를 가지고 있어 아실레이션 수율이 낮은 문제점이 있다.

따라서, 이러한 문제점을 해결할 수 있는 보호기의 개발이 요구되었고, 본 발명자들은 아미노산의 보호기로서 하기 구조를 갖는 2-(4-니트로페닐술포닐)에톡시카르보닐기(Nsc)를 개발하고, 이를 특허출원한 바 있다(대한민국 특허 등록 제 241948호).

이 Nsc는 분자내에 니트로기와 술포닐기를 가지고 있기 때문에 아미노산의 용해도가 증가되고, 펩티드 체인 사이의 소수성 부분의 상호작용을 방지할 수 있으며, 특히 펩티드 합성에서 이 보호기를 제거하기 위한 메카니즘이 Fmoc기의 탈보호 메카니즘과 유사하기 때문에, 최근에 펩티드 합성에서 유용하게 사용되고 있다.

나아가 본 발명자들은 고체상 펩티드 합성법에 적합한 보호기의 개발 이외에, 펩티드를 합성하는데 있어서, 짧은 시간 동안 고수율 및 고순도로 목적하는 펩티드를 합성할 수 있는 방법을 연구하게 되었다.

그 결과, 본 발명자들은 고체상 펩티드 합성법에서, 보호된 아미노산으로Nsc-아미노산류를 사용하고, 아실레이션 단계의 용매로서 디클로로메탄을 사용하며, 아실레이션 반응온도를 20~50℃로 한정한다면 상기한 목적을 달성할 수 있음을 발견하였다.

또한, Nsc-아미노산류를 사용하여 고체상 펩티드 합성법으로 펩티드를 합성하는데 있어 아실레이션 용매로 디클로로메탄을 사용하는 경우에, 디클로로메탄 중에서 Nsc-아미노산류가 안정하기 때문에, Nsc-아미노산류를 디클로로메탄에 용해시켜 보관하면 매번 합성시마다 Nsc-아미노산류를 제조할 필요가 없다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 고체상으로부터 목적하는 아미노산 서열을 가진 펩티드를 짧은 시간동안 고수율 및 고순도로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 고체상 펩티드 합성법에 사용되는 Nsc-아미노산류를 안정하게 보관하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 보호된 아미노산으로 Nsc-Tyr(tBu)-OH를, 아실레이션 용매로 디클로로메탄을 사용하여, 40℃의 온도에서 아실레이션시켜 제조된 타이로신 중합체인 펩티드(Tyr12)의 역상 고압액체크로마토그래피(HPLC) 결과를 나타낸 프로파일이다.

도 2는 보호된 아미노산으로 Fmoc-Tyr(tBu)-OH를, 아실레이션 용매로 디메틸포르아미드를 사용하여, 상온에서 아실레이션시켜 제조된 타이로신 중합체인 펩티드(Tyr12)의 역상 HPLC 결과를 나타낸 프로파일이다.

도 3은 보호된 아미노산으로 Nsc-아미노산을, 아실레이션 용매로 디클로로메탄을 사용하여, 40℃의 온도에서 아실레이션시켜 제조된 펩티드(Salmon calcitonin)의 역상 HPLC 결과를 나타낸 프로파일이다.

도 4는 보호된 아미노산으로 Fmoc-아미노산을, 아실레이션 용매로 디메틸포르아미드를 사용하여, 상온에서 아실레이션시켜 제조된 펩티드(Salmon calcitonin)의 역상 HPLC 결과를 나타낸 프로파일이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 방법은 보호된 아미노산의 유리카르복실기를 통하여 불용성 지지체에 보호된 아미노아실-폴리머를 형성하는 단계; 상기 보호된 아미노아실-폴리머를 탈보호시키는 단계; 상기 탈보호된 폴리머의 유리 아미노기에 다음 순서의 보호된 아미노산 모노머를 아실레이션시키는 단계; 최종 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 얻어질 때까지 상기 탈보호 단계와 아실레이션 단계를 반복하는 단계; 및 합성된 펩티드 말단의 보호기를 탈보호하고, 불용성 지지체로부터 펩티드를 분리(detachment)하는 단계로 이루어진 펩티드의 합성방법에 있어서, 보호된 아미노산으로 2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류(Nsc-아미노산류)를 사용하고, 상기 아실레이션 단계의 용매로 디클로로메탄을 사용하며, 아실레이션 반응을 20~50℃에서 수행함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용된 Nsc-아미노산류는 하기 구조식 (Ⅰ)로 표시되는 것으로서, 염기 존재하에 0~40℃의 온도, 바람직하게는 0~20℃에서 물/유기용매 혼합용매중에서 다음 일반 구조식(II)의 아미노산을 2-(나이트로페닐설포닐)클로로포르메이트(III)로 처리하여 제조한다.

[식중,

R₁은 수소원자 및

R₂는 수소원자, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 이소프로필, t-부톡시메틸, 1-t-부톡시에틸, 2-메틸티오에틸, 벤질, 카르복사미도메틸, 2-카르복사미도에틸, t-부톡시카르보닐메틸, 2(-t-부톡시카르보닐)에틸), 4-(t-부톡시카르보닐)에틸, 4-(4-부톡시카바미도)부틸, 4-t-부톡시벤질, 인돌릴-3-메틸, S-(트리페닐메틸)티오메틸, 1-(트리페닐메틸)이미다졸릴-4-메틸, 3-(N^G-메시틸렌설포닐)구아니디노프로필, N-잔틸카르복사미도메틸, 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸 또는 S-(아세트아미도메틸)티오메틸기이거나, R₁과 R₂가 모두 프로필렌기이다.]

상기한 방법으로 제조된 Nsc-아미노산류(I)는 물에서는 불용 또는 약간 녹고, 극성 유기용매에서는 용해되는 결정성 화합물들로, -10℃ 내지 25℃에서 장기간 저장에 안정한 특성을 갖는다.

상기한 Nsc-아미노산류(Ⅰ)를 사용하여 고체상 펩티드 합성법으로 펩티드를 합성하는 방법은 다음과 같다.

(1) 불용성 지지체에 보호된 아미노아실-폴리머를 형성하는 단계

최초의 Nsc-아미노산(목적 아미노산 서열의 C-말단)이 유리 카르복실기를 통하여 에스테르 또는 아미드 결합을 형성하여 불용성 폴리머 지지체에 공유결합됨으로써, Nsc-아미노아실-폴리머를 얻는다.

폴리머-지지체는 당분야에서 통상적으로 사용되는 것을 적의하여 선정하여 사용할 수 있는데, 예를 들면 교차결합된(cross-linked) 또는 다공성 폴리스티렌, 그래뉼형태의 또는 키젤겔(kieselgel)과의 혼성물로서의 교차 결합된 폴리-N,N-디메틸아크릴아미드, 교차결합된 덱스트란, 셀룰로오스, 종이 등이 있다.

한편, 최초 Nsc-아미노산의 부착을 위해, 상기한 폴리머 지지체는 적당한 앵커기(anchor group)을 포함해야 한다. 대부분의 경우 앵커기는 유기 용매에서 트리플루오르아세트산 및 그 용액, 또는 염화수소 용액과 같은 산성 시약으로 펩티딜-폴리머를 처리하는 동안 C-말단의 카르복실기 또는 카르복사미드기(carboxamide group)의 유리(liberation)와 함께 불용성 지지체로부터 합성된 펩티드의 분절을 제공하는 것이 바람직하다. 에스테르 형태의 부착을 위한 앵커기로는 4-하이드록시메틸페녹시알킬, 4-클로로 또는 4-브로모메틸페녹시알킬, α-하이드록시디페닐메틸 그리고 기존의 알려진 다른 그룹이 될 수 있으며, 카르복사미도 형태의 부착을 위한 것으로는 알려진 다이- 및 트리알콕시벤즈하이드릴아민기, 4-아미노메틸-3,5-디메톡시페녹시알킬기 및 다른 공지의 기들이 이 목적을 위해 사용될 수 있다.

불용성 지지체의 앵커기에 대한 C-말단 Nsc-아미노산의 부착은 당분야에서 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

(2) 탈보호 단계

제조된 Nsc-아미노아실-폴리머로부터 보호기를 분절하기 위하여, 상기 보호된 아미노아실-폴리머를 염기 시약으로 처리한다. 이 목적에 바람직한 염기 시약은 질소 염기들, 예를 들면, 암모니아, 모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 디에틸아민, 1,8-디아자비사이클로[5,4,0]운데스-7-엔, 1,1,3,3,-테트라메틸구아니딘 및 그들의 비양성자성 유기 용매중의 용액들이다. 더 바람직한 염기 시약은 DMF중의 피페리딘 20∼50% 용액이다.

이 경우에 있어서 Nsc-기는 N-[2-(나이트로페닐설포닐)에틸]피페리딘 및 이산화탄소 형성으로 분절되고, 아미노기가 유리된다.

(3) 아실레이션 단계

유리 아미노기를 갖는 아미노아실-폴리머는 다음의 Nsc-아미노산으로 아실화되어 Nsc-디펩티딜-폴리머를 생성한다.

아실레이션 시약으로는 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, Nsc-아미노산류의 4-나이트로페닐, 펜타클로로페닐, 펜타플루오르페닐, 1-하이드록시벤조트리아졸릴 에스테르와 고체상 펩티드 합성에 사용되는 활성 에스테르의 기존의 다른 형태; 또는 Nsc-아미노산류의 유사 무수물 등이 사용될 수 있다.

또한 아실레이션은 당분야에서 공지된 커플링시약, 예를 들면 디사이클로헥실카르보디이미드, 디이소프로필카르보디이미드, 벤조트리어졸릴-1-옥시-(트리스-디메틸아미노)포스포니움 헥사플루오르포스페이트와 같은 커플링시약의 존재하에서 Nsc-아미노산류를 가지고 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에서는 아실레이션 용매로 디클로로메탄을 사용한다. 종래 Fmoc-아미노산류에서 디메틸포름아미드를 사용하는 것보다, 보호된 아미노산으로 Nsc-아미노산을 사용하고, 아실레이션 용매로 디클로로메탄을 사용하는 것에 의해 목적하는 펩티드를 고수율 및 고순도로 제공할 수 있다.

또한, 반응시간도 종래 Fmoc-아미노산류/DMF를 사용한 합성방법은 상온에서 반응을 시키야만 하기 때문에 반응시간이 1시간 이상 소요되었지만, 디클로로메탄을 아실레이션 용매로 사용하고, 20~50℃의 고온에서 반응을 시키면, 합성하는 아미노산의 종류에 따라 5분~1시간이면 반응이 완결되어 짧은 시간내에 목적하는 펩티드를 얻을 수 있다.

(4) 펩티드 합성

탈보호단계와 아실레이션 단계로 이루어진 합성주기는 목적 아미노산 서열의 조합이 완결될 때까지 반복된다.

(5) 탈보호 및 목적 펩티드의 불용성 지지체로부터의 분리

원하는 Nsc-펩티딜-폴리머를 축합한 후, 말단의 보호기는 위에서 기술한 방법으로 분절시킨 다음, 불용성 지지체의 앵커기로부터 펩티드를 분리시킨다.

이 목적을 위한 산성 시약들은 tert-부틸 형태의 보호기의 분절을 위하여 당분야에서 공지된 것을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 발생되는 카르보니움 이온을 포획하는 공지의 첨가제, 예를 들어, 물, 아니솔, 티오아니솔, 디메틸설파이드, 에탄디티올-1,2-트리이소프로필실란 등을 포함하거나 포함하지 않는 트리플루오르아세트산, 메탄설폰산 또는 파라톨루엔설폰산의 용액 등이 사용될 수 있다.

한편, 상기한 방법으로 펩티드를 합성하는데 있어 Fmoc-아미노산류가 합성시 매번 제조하여야 하는것과 달리 Nsc-아미노산류는 매번 합성시마다 제조할 필요가 없는 장점이 있다. 이는 Nsc-아미노산류가 디클로로메탄에 용해된 상태에서는 안정하기 때문에 용액상태로 만들어 상온 또는 냉장온도에서 보관할 수 있기 때문이다.

이하 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들예로만 한정되는 것은 아니다.

<시험예 1> Nα-Nsc-아미노산류와 Nα-Fmoc-아미노산류의 용해도비교

아미노산류가 용매에 완전히 녹아야만 아실레이션 반응에 참여할 수 있기 때문에, 아미노산류가 적절하게 모두 녹는 용매 조건을 조사하고자 하기에서와 같이 시험하였다.

하기 표 1에 기재된 Nα-Nsc-아미노산과 Nα-Fmoc-아미노산 100 ㎎씩을 정확히 칭량한 뒤, 정확히 1 ㎖씩의 디클로로메탄(이하, 'DCM'이라 함)에 넣은 뒤 5분간 교반하여 녹은 상태를 (가)항에 표시하였다.

완전히 녹은 아미노산류를 제외한 나머지 아미노산류에 대하여 40℃ 오븐에서 5분간 가열하고 상온에서 5분 방치한 뒤 녹은 상태를 (나)항에 표시하였다.

이때 녹지 않은 아미노산은 15% 디메틸포름아미드(이하, 'DMF'라함)/DCM에(가)항과 동일한 방법으로 녹인 뒤 녹은 상태를 (다)항에 표시하였다.

녹지 않은 아미노산을 골라 40℃ 오븐에서 5분간 가열하고, 상온에서 5분간 방치 뒤 녹은 상태를 (라)항에 표시하였다.

	아미노산	Nsc	Fmoc
	아미노산	(가)	(나)	(다)	(라)	(가)	(나)	(다)	(라)
1	Ala	×	×	○	○	×	×	△	○
2	Gly	×	×	△	○	×	×	△	○
3	IIe	△	○	○	○	△	△	○	○
4	Leu	×	×	△	○	△	○	○	○
5	Met	△	○	○	○	×	○	○	○
6	Phe	×	×	○	○	×	×	△	○
7	Pro	○	○	○	○	○	○	○	○
8	Trp	×	×	△	○	×	×	○	○
9	Val	○	○	○	○	×	×	○	○
10	Cys	○	○	○	○	×	×	△	○
11	His	△	○	○	○	○	○	○	○
12	Asn	×	×	○	○	×	×	○	○
13	Gln	×	×	○	○	○	○	○	○
14	Asp	○	○	○	○	×	×	○	○
15	Glu	○	○	○	○	○	○	○	○
16	Ser	○	○	○	○	○	○	○	○
17	Thr	○	○	○	○	○	○	○	○
18	Tyr	○	○	○	○	△	○	○	○
19	Lys	b	○	○	○	○	○	○	○
20	Arg	○	○	○	○	○	○	○	○
○: 용해, △: 조금 녹음, ×: 녹지않음

상기 표 1로부터, Nsc-아미노산류는 Fmoc-아미노산류에 비하여 디클로로메탄에서 용해가 잘되지만, Nsc-아미노산류나 Fmoc-아미노산류 모두 디클로로메탄에 디메틸포름아미드를 85/15의 비율로 혼합한 용매에 대하여 용해성이 매우 우수하며, 이를 40℃로 가열하였을 경우에 용해성이 더욱 상승된다는 것을 알 수 있다.

<시험예 2> 수지의 해당용매에서의 부피변화

불용성 지지체로서 폴리스티렌 수지와 폴리에틸렌글리콜(PEG) 수지를 1 g씩 2개조로 정확히 재었다. 이를 4개의 표시된 25 ㎖ 메스 실린더에 넣고, DCM와 DMF를 25 ㎖씩 넣은 뒤 10분간 방치하였다. 10분 뒤 각 용매의 해당 수지의 부피를 측정하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

용매에 따른 수지의 팽윤도

수지	DCM(㎖)	DMF(㎖)
폴리스티렌 수지	7.9	6.5
PEG-수지	6.0	5.8

상기 표 2로부터, 고체상 펩티드 합성법에서 불용성 지지체로 주로 사용되는 폴리스티렌 수지의 경우 디클로로메탄(DCM)에서 팽윤이 잘된다는 알 수 있다. 따라서, 용매로서 DCM을 사용하면 아실레이션 반응, 탈착반응 또는 반응 종결후 세척단계에서 보다 효과적으로 반응 및 세척이 이루어질 수 있는 환경을 제공할 수 있을 것으로 예상된다.

<실시예 1> 도데카 타이로신 펩티드의 합성

a) 폴리머 말단그룹의 도입

3 ㎖의 DCM에 250 ㎎의 벤질옥시벤질-알콜 스타이렌-1% 디비닐벤젠 코폴리머 (1.0 meq, OH/g)를 넣고 0.7 mmol의 Nsc-타이로신과 0.35 mmol의 다이아이소프로필 카보디이미드를 넣었다. 0.1 mmol의 4-디메틸아미노피리딘을 가한뒤 상온에서 24시간 교반하였다. 폴리머를 여과하고 DCM으로 세척한 뒤, 다시 에탄올, 에테르, 그리고 헥산으로 세척하고, 오산화인을 흡습제로 하는 감압건조장치에서 24시간 건조하여 Nsc-타이로신-레진 폴리머 400 ㎎을 얻었다.

b) 펩티드 축합

상기 Nsc-타이로신-레진 폴리머(200 ㎎)를 10 ㎖의 폴리프로피렌 반응기에 넣고, DMF로 세척한 다음, 하기의 방법에 따라 합성공정을 수행하였다.

1. 전세척: 33% 피페리딘/DMF, 4 ㎖:0.5분

2. 탈보호: 33% 피페리딘/DMF, 4 ㎖:15분

3. 세척: DMF, 3 x (4 ㎖: 1분); DCM, 3 x (4 ㎖: 1분)

4. 아실레이션: Nα-Nsc-타이로신, 0.5 mmol; 벤조트라아조릴-1-옥소-(다이멜칠아미노)포스포늄 헥사플루오르포스페이트, 0.5 mmol; 1-하이드록시벤조트리아졸, 0.5 mmol; 디아이소프로필이미드 1 mmol; DCM, 3 mmol: 10분(40℃)

5. 세척: DCM, 5 x (4 ㎖: 1분)

상기 반응을 11회 반복하여 12잔기의 폴리 타이로신-레진 폴리머를 합성하였다.

폴리타이로신-레진 폴리머를 20분동안 33% 피페리딘/DMF(4 ㎖)로 처리하고, 그 다음 DMF와 DCM, 에탄올, 에테르, 마지막으로 헥산으로 세척하였다.

c) 탈보호 및 펩티드 분리

폴리타이로신-레진 폴리머를 실온에서 60분 동안 95% 트리플루오르아세트산과 2.5%의 물, 2.5%의 트리아이소프로필실란 혼합액 5 ㎖에 넣고 흔들었다. 고분자를 여과한뒤 트리플루오르아세트산 2 ㎖로 세척하여 처음 여액과 합쳤다. 여액을 차가운 무수 에테르 100 ㎖로 묽힌 다음, 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 후 진공하에서 건조시켰다. 그 결과, 정제하지 않은 타이로신 폴리머 170 ㎎을 얻었다(수율: 85%).

d) 분석

정제하지 않은 타이로신 폴리머를 DMF 1 ㎖에 녹이고, DISOGEL RP-C18 (Disogel, Japan 4.5 x 250 ㎖)을 가지고 역상 HPLC로 분석을 하여 도 1과 같은 프로파일(순도 89%)을 얻었다. 나머지 도테카 펩타이드는 이때 순수한 펩티드를 포함하는 부분의 일부분을 모아 질량분석기를 이용해 분석하여 원하는 M+H값인 1999를 얻을 수 있었다.

<비교예 1>

아미노산으로 Fmoc-타이로신을, 아실레이션 용매로 DMF를 사용하여 상온에서 1시간동안 아실레이션 반응을 시킨다는 것을 제외하고, 공지의 Fmoc 아미노산을 사용한 고체상 펩티드 합성법으로 합성하여 정제하지 않은 타이로신 폴리머 160 mg을 얻었다(수율: 80%). 이를 역상 HPLC로 분석을 하여 도 2와 같은 프로파일(순도 27.3%)을 얻었다.

<실시예 2> 연어 칼시토닌의 고형상 합성

a) 펩티드 축합

250 ㎎의 4-(2,4-다이메톡시페닐-Nsc-아미노메칠)-페녹시 레진(1.0 meq, NH₂/g)을 DMF 5 ㎖로 세 번 세척한 후, 33% 피페리딘/DMF를 넣어 20분간 반응한 뒤 다시 DMF 5 ㎖로 세 번 세척하고, 다시 DCM 5 ㎖로 3번 세척한 뒤 하기의 방법에 따라 합성을 수행하였다.

1. 전 세척: 33% 피페리딘/DMF, 4 ㎖:0.5분

2. 탈보호: 33% 피페리딘/DMF, 4 ㎖:15분

3. 세척: DMF, 3 x (4 ㎖: 1분); DCM, 3 x (4 ㎖: 1분)

4. 아실레이션: 하기의 Nα-Nsc-아미노산, 0.5 mmol; 벤조트라아조릴-1-옥소 -(다이메칠아미노)포스포늄 헥사플루오르포스페이트, 0.5 mmol; 1-하이드록시벤조트리아졸, 0.5 mmol; 디아이소프로필이미드 1 mmol; DCM, 3 mmol: 10분(40℃)

5. 세척: DCM, 5 x (4 ㎖: 1분)

Nα-Nsc-아미노산들은 다음과 같은 순서에 따라 합성에 사용되었다.:

Nsc-Pro-OH, Nsc-Thr(tBu)-OH, Nsc-Gly-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Gly-OH, Nsc-Thr(tBu)-OH, Nsc-Asn(trt)-OH, Nsc-Thr(tBu)-OH, Nsc-Arg(pbf)-OH, Nsc-Pro-OH, Nsc-Tyr(tBu)-OH, Nsc-Thr(tBu)-OH, Nsc-Gln(trt)-OH, Nsc-Leu-OH, Nsc-Lys(Boc)-OH, Nsc-His(trt)-OH, Nsc-Leu-OH, Nsc-Glu(OtBu)-OH, Nsc-Gln(trt)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Leu-OH, Nsc-Lys(Boc)-OH, Nsc-Gly-OH, Nsc-Leu-OH, Nsc-Val-OH, Nsc-Cys(acm)-OH, Nsc-Thr(tBu)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Leu-OH, Nsc-Asn(trt)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Cys(acm)-OH.

목표 아미노산 배열 펩티딜-레진 폴리머의 조합을 만든뒤 오산화인이 있는 진공에서 24시간 건조하여 잘 말렸다.

b) 시스테인 부분탈보호 및 시스테인 브리지 형성

잘 마른 상기 펩티딜-레진 폴리머를 DMF 10 ㎖에 30분간 잘 팽윤시킨 뒤, 아이오다인 2.5 mmol을 넣은 뒤 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 2시간 뒤 아스코르빈산을 3 g 가하고 1시간 교반하여 반응을 멈춘 뒤 여과하였다. DMF로 세 번 세척한 후, 브리지가 형성된 Nsc-사카토닌-폴리머를 20분간 33% 피페리딘/DMF (4 ㎖)로 처리하고, 그 다음 DMF와 DCM, 에탄올, 에테르, 마지막으로 헥산으로 세척하였다.

c) 탈보호 및 펩티드 분리

사카토닌-폴리머는 실온에서 60분 동안 95% 트리플루오르아세트산과 2.5%의물, 2.5%의 트리아이소프로필실란 혼합액 5 ㎖에 넣고 흔들었다. 고분자를 여과한 뒤 트리플루오르아세트산 2 ㎖로 세척하여 처음 여액과 합친 다음, 여액을 차가운 무수 에테르 100 ㎖로 묽혔다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 후, 진공하에서 건조시켜 정제하지 않은 사카토닌 810 ㎎을 얻었다(수율: 92%).

d) 분석

정제하지 않은 사카토닌중 일부를 취해 1% 초산/정제수 1 ㎖에 녹이고 DISOGEL RP-C18(Disogel, Japan 4.5 x 250 ㎖)을 가지고 역상 HPLC로 분석하여 도 3과 같은 프로파일(순도 47%)을 얻었다. 이때 순수한 펩티드를 포함하는 부분의 일부분을 모아 질량분석기를 이용해 분석하여 원하는 M+H값인 3432를 얻을 수 있었다

<비교예 3>

아미노산으로 하기의 Fmoc-아미노산류을 사용하고, 아실레이션 용매로 DMF를 사용하여 상온에서 1시간동안 아실레이션 반응을 시킨다는 것을 제외하고 Fmoc-아미노산류를 사용하는 고체상 펩티드 합성법으로 정제하지 않은 사카토닌 755 mg을 얻었다(수율: 85.8 %). 이를 역상 HPLC로 분석을 하여 도 4와 같은 프로파일(순도 14.5%)을 얻었다.

Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Cys(acm)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Cys(acm)-OH.

이상에서 설명한 바와 같이, Nsc-아미노산류를 사용하여 고체상 펩티드 합성법으로 펩티드를 합성하는데 있어서, 아실레이션 용매로서 디클로로메탄을 사용하여 고온에서 반응을 시킴으로써 단시간내에 고수율 및 고순도로 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, Nsc-아미노산류를 디클로로메탄에 녹여 용액상태로 보관할 수 있어 펩티드를 합성할 때마다 매번 Nsc-아미노산류를 제조할 필요가 없고, 냉동보관할 필요없이 상온에서 보관할 수 있는 장점이 있다.

Claims

보호된 아미노산의 유리 카르복실기를 통하여 불용성 지지체에 보호된 아미노아실-폴리머를 형성하는 단계; 상기 보호된 아미노아실-폴리머를 탈보호 (deprotection)시키는 단계; 상기 탈보호된 폴리머의 유리 아미노기에 다음 순서의 보호된 아미노산 모노머를 아실레이션(acylation)시키는 단계; 최종 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 얻어질 때까지 상기 탈보호 단계와 아실레이션 단계를 반복하는 단계; 및 합성된 펩티드의 말단의 보호기를 탈보호하고, 불용성 지지체로부터 합성된 펩티드를 분리(detachment)하는 단계로 이루어진 펩티드의 합성방법에 있어서,

보호된 아미노산으로 2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류 (Nsc-아미노산류)를 사용하고,

상기 아실레이션 단계의 용매로 디클로로메탄을 사용하며,

상기 아실레이션 단계의 반응온도가 20~50℃임을 특징으로 하는 펩티드의 합성방법.
제 1항에 있어서, 상기 아실레이션 단계의 반응시간은 5분~1시간인 것을 특징으로 하는 펩티드의 합성방법.
2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류(Nsc-아미노산류)를 디클로로메탄에 용해된 용액상태로 보관하는 것을 특징으로 하는 Nsc-아미노산류의 보관방법.