KR100392996B1 - 세포성장조절제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 근육 세포 및 백혈구에서 분비되거나 흘러나오는 신규 물질을 개시한다. 이 신규 물질은 종양 세포의 증식 및 자극을 받은 림프구의 증식을 억제하는 데 활성이다. 이 물질은 정상 세포의 증식은 억제하지 않는다. 이 물질은 본 발명에 따르면 암의 치료 및 예방에 사용되며, 체액 중, 또는 개인에게서 채취한 세포의 그 안에서의 성장에 의해 조정되는 액 중의 상기 물질의 농도는 암 또는 개인이 암에 걸릴 위험 수준을 진단하는 데 사용된다.

Description

세포 성장 조절제

<발명의 분야>

본 발명은 일반적으로는 의학 및 수의학 분야에 속하며 세포의 성장 및 증식에 영향을 주는 신규 물질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질병의 예방 또는 치료에 있어서의 상기 물질의 용도에도 관련된다. 본 발명은 그 밖에도 질병의 진단 또는 질병에 걸리기 쉽거나 질병에 걸리는 소인을 가진 개인의 선별 방법에 관한 것이다.

<용어 해설>

본 명세서의 기술내용을 간결히 할 목적으로 몇가지 신조어가 사용된다. 이들 용어 중 일부 및 본 명세서의 문맥 내에서 이들이 이해되어야 하는 방식은 다음과 같다:

"세포 성장 조절제(GR)"- 세포의 성장 또는 증식에 영향을 주는 물질. 성장및 증식에 대한 GR의 효과는 세포의 성장 또는 증식을 촉진하는 데, 또는 세포의 성장 및 증식을 억제하는 데 있을 수 있다.

"내인성 GR(EGR)"- 신체 내의 세포에서 분비되거나 흘러나와 신체 내의 동일한 세포 또는 다른 세포의 성장 또는 증식에 영향을 미치는 물질.

"세포정지 GR/EGR"- 세포의 성장 또는 증식을 정지시키거나 현저히 느리게 하는 데 효과를 갖는 GR/EGR로서, 이것이 실질적으로 세포 파괴가 전혀 없이 이루어짐. 세포정지 EGR은 대개 세포 주기를 세포 주기 기(phase)들 중 하나에 붙잡아 둠으로써 작용함.

"저분자량-EGR(LMW-EGR)"- 분자량이 약 3,000 달톤 미만인 EGR.

"근육 인자(MF)"- 근육 세포에서 분비되거나 흘러나오는 LMW-EGR.

"백혈구 인자(WBF)"-백혈구에서 분비되거나 흘러나오는 LMW-EGR.

"원천 세포"- EGR을 분비하거나 흘리는 세포.

"표적 세포"- EGR에 의해 영향을 받는 세포.

"조정 배지(CM)"- 그 안에서의 원천 세포의 성장에 의해 조정되는 배지. CM은 따라서 원천 세포에 의해 분비되는 EGR을 함유한다.

"근육 세포 CM" 및 "백혈구 CM"- 각각 그 안에서의 근육 세포 및 백혈구의 성장에 의해 조정되는 배지. 근육 세포 CM 및 백혈구 CM은 개별적으로 MF 및 WBF를 함유한다.

상기 용어들은 이하의 설명 역시 참조하면서 파악하고 이해해야 한다.

<발명의 배경>

"시토킨"으로 알려진 EGR의 발견, 특성 파악, 생물학적 시험 및 임상적 개발과 관련한 다량의 연구가 행해지고 있다. 이제까지 발견된 모든 시토킨은 분자량이 수천 달톤에서 수만 달톤의 범위에 있는 단백질계 물질이다. 시토킨은, 상이한 원천 및 표적 세포를 갖고 상이한 작용 양식을 갖기는 하지만 모두가 단백질계 물질이라는 점에서 공통분모를 공유한다.

실험 동물의 경우 육체적 운동이 종양의 성장 및 진행을 현저히 억제한다는것이 보고된 바 있다(S.A. Hoffman et al., 1962, Cancer Res. 22:597-599; V.E. Baracos, 1989, Chem. J. Physiol. Pharmacol., 67:864-870). 스첸트-기요르기(A. Szent-Gyorgyi) 등 (1963, Science, 140:1391-1392)은 흉선, 대동맥, 근육 및 힘줄을 비롯한 몇몇 조직의 추출물이 두 가지 물질을 함유하는데, 하나는 생쥐의 복수 종양의 성장을 촉진하며("프로민"으로 지칭됨) 다른 하나는 그러한 성장을 억제함("레틴"으로 지칭됨)을 보고하였다. 이 문헌에서 레틴은 실온에서 약 일 주일만에 분해되어 비교적 불안정한, 분자량이 작은 물질로 설명되었다. 또한, 그 단리 방식을 근거로 할 때 이 물질은 친지성으로 보였다. 근육 세포 추출물에 의한 복수 종양 세포의 억제 역시 남바(T. Namba) 등 (1968, British J. of Exp. Pathol. 49:294-301)에 의해 설명되었으며, 근육 추출물에서 발견된 억제 활성은 규소 멤브레인을 통해 투석할 수 있었다. 이 활성은 추출물의 가열에 영향을 받았으나 투석액에서는 가열의 영향이 보이지 않았다.

와타(E. Watta) 등 (미국 특허 제4,708,948호)은 근육 조직에서 얻을 수 있는 종양 성장을 억제하는 고분자량의 폴리펩티드를 개시하였다. 드얄데티(M. Djaldetti) 등 (미국 특허 제5,242,692호)은 종양 세포의 증식을 억제하는, 근육 세포에서 유래한 인자를 개시하였다. 근육 세포 배양물의 상징액에서 단리된 이 인자는 겔 전기영동으로 측정한 겉보기 분자량이 25,000-30,000 달톤 범위인 것으로 밝혀졌다.

<발명의 요약>

본 발명은 정상적인, 비종양성 세포의 증식에는 거의 영향을 미치지 않으면서 종양 세포의 증식을 억제하는 데 생물학적으로 활성인, 근육 세포 또는 백혈구중 하나에 의해 분비되거나, 흘러나오거나, 생산되는 신규 물질의 발견에 근거한 것이다. 또한, 이들 물질은 자극을 받은 면역 세포의 증식을 억제하는 데 유효한 것으로도 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 그 한 측면으로,

(a) i) 세포, 특히 근육 세포 또는 백혈구에서 생산되거나, 분비되거나, 흘러나오며,

ii) 분자량이 약 3,000 달톤 미만이고,

iii) 단백질계가 아니며,

iv) 수용성이고,

v) 열에 안정하며,

vi) 세포의 증식을 억제하는 데, 특히 종양 세포의 증식 또는 자극을 받은 림프구의 증식을 억제하는 데 생물학적으로 활성인 특성을 갖는 물질인 LMW-EGR이거나,

(b) 상기 (a)의 물질의 유도체이고 세포의 증식을 억제하는 데 생물학적으로 활성인 물질인, 실질적으로 정제된 세포 성장 조절제를 제공한다.

본 발명은 다른 면의 하나로 질병의 예방 또는 치료에 있어서의 상기 물질의 용도를 제공한다. 이 측면에 따르면, 필요로 하는 환자에게 유효량의 상기 GR을 투여하는 것으로 이루어진 질병 또는 질환의 예방 방법이 제공된다. 증식 억제에 있어서 GR의 작용 방식이 알려지면, 이 GR을 대개 어느 기간 동안 주기적으로 환자에게 투여하게 될 것이다. 또한, 이 측면에 따르면 상기 GR 어느 양을 함유하는 조성물이 제공된다. 이 조성물은 치료 유효량의 상기 GR을 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 함유하는 제약 조성물일 수도 있다. 이 제약 조성물은 어떤 질병 또는 질환의 예방에 유용하게 되도록 조성되거나 어떤 질병 또는 질환의 치료에 유용하게 되도록 조성될 수도 있다. 이 조성물은 또한 비처방 조성물, 예를 들면 영양요법(neutraceutical) 조성물, 식품 첨가물, 건강 식품 제제 등일 수도 있다. 마지막으로, 이러한 조성물의 제조를 위한 상기 GR의 용도 역시 이 측면에 따라 제공된다.

특히 바람직한 것은 암의 치료 또는 예방을 위한, 또는 기능이 항진된 면역계에 기인한 다양한 상태의 치료 또는 예방, 예를 들면 조직 거부에 대응하려는 치료, 자기면역 질환의 치료 등의 기조 안에서 자극을 받은 림프구의 활성을 억제 (제거 또는 감소)하기 위한 상기 GR의 용도이다.

본 발명의 또다른 측면에 따르면, 개인에게서 얻어진 체액 중의, 또는 개인에게서 얻어진 세포의 배양물의 상징액 중의 상기 LMW-EGR의 농도를 측정하는 것으로 이루어진, 개인의 암 또는 암성 상태의 진단, 또는 암에 걸리기 쉽거나 그에 대한 소인을 가진 개인을 선별하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 적절한 조정 배지의 활성 분획의 정제에 기초한 본 발명의 GR의 제조 방법이다.

<발명의 기술>

본 발명은 저분자량인 신규 EGR의 발견에 기초한 것이다. "저분자량"이라는용어는 한외여과로 측정할 때 약 3,000 달톤 미만, 특히 약 2,000 달톤 미만이고 바람직하게는 약 500 달톤이거나 그 미만인 분자량으로 이해해야 한다. 이들 분자량은 근사치이며 정확한 숫자로 간주될 수 없다는 사실은 숙련자들에게는 명백하다.

본 발명의 LMW-EGR은 비단백질계인 것으로, 즉 단백질도 아니고, 펩티드도 아니며, 생물학적 활성에 참여하는 단백질 또는 펩티드 잔기를 갖는 다른 어떠 물질도 아닌 것으로 밝혀졌다. (본 발명의 발견은 이 LMW-EGR이 펩티드 또는 단백질 잔기에 결합하거나 그와 복합체를 이룬 형태로 존재하며, 성장 조절제로서의 LMW-EGR의 활성에 전혀 참가하지 않거나 제한된 역할만한다는 가능성을 배제할 수는 없다.)

본 발명에 따르면, LMW-EGR은 이제까지 근육 세포 CM 및 백혈구 CM으로부터 얻어졌다. 그러나, 본 발명에 따른 LMW-EGR은 다른 원천으로부터도 얻을 수 있다고 여겨진다. 본 발명은 따라서 MF 및 WBF에 한정되지 않는다. 반면, 본 발명에 따른 발견 및 가능한 표준 기술 및 지식을 사용함으로써 얻어진 지식을 구비한다면 당업자가 본 발명의 범위에 속하는 다른 LMW-EGR을 찾는 데 어려움이 없을 것이다.

MF 및 WBF는 종양 특이적 세포 증식 억제성 EGR인 것으로 밝혀졌다. 이들은 정상적인 비종양 형성 세포에는 감지할 수 있는 영향을 전혀 미치지 않으면서 종양 세포의 성장 및 증식을 특이적으로 억제한다는 점에서 독특한 생물학적 활성을 가지고 있다. 또한, MF 및 WBF는 둘 다 종양 비특이적(즉, 다양한 종양 세포의 성장 및 증식을 억제하는 데 유효함)이고 종 비특이적(다양한 동물 종에서 얻어진 종양세포의 성장 및 증식을 억제하는 데 활성을 보임)인 것으로 밝혀졌다.

다른 말로 하자면, MF 및 WBF는 암세포의 성장 및 증식을 억제하는 데 넓은 활성 스펙트럼을 보인다. 게다가, 본 발명에 따른 발견은 한 동물 종, 특히 포유동물에서 유래한 MF 또는 WBF가 다른 종, 특히 포유류인 동물의 암치료에 사용될 수도 있다는 것도 시사한다.

MF 및 WBF가 세포 증식 억제제인 것으로 밝혀지기는 했으나, 이들이 특히 지속적인 노출에 뒤이어서는 세포에 모종의 파괴적인 효과를 가질 수 있다는 것도 가능하다는 것을 지적해야 하겠다. 예를 들면, MF 또는 WBF 뿐만 아니라 그 유도체에 오랫동안 노출된 후에 표적 종양 세포가 세포 사멸의 결과 등으로 결국 죽을 수 있다.

종양 세포의 성장 및 증식을 억제하는 데 있어서의 활성 외에도, MF 및 WBF는 유사 분열 물질에 대한 림프구의 반응 및 혼합 림프구 반응 (MLR)의 억제에 의해 명백해지는 바와 같이 림프구의 증식을 억제하는 데에도 활성인 것으로 밝혀졌으며, 이것은 본 발명의 GR이 면역 억제 활성을 가졌을 수도 있음을 뜻한다.

일단 한 종에서 LMW-EGR이 단리되면 다른 종에서 동종의 LMW-EGR을 찾을 수 있다는 것이 명백하다. 예를 들면 지금까지 본 발명에 따라 얻어진 MF는 레트(rat) 및 사람 기원으로부터 였다. 다른, 특히 포유류인 종에서 동종의 MF를 얻을 수도 있다는 것은 의심할 여지가 없다. 마찬가지로, 이제까지 본 발명에 따라 얻어진 WBF는 사람 기원의 것이었다. 다른 종, 특히 포유류의 동종 WBF를 얻을 수도 있다는 것은 의심의 여지가 없다. 본 발명은 이러한 동족체를 포괄하기도 한다.

본 발명의 GR은 단일 분자, 세포의 성장 및 증식에 영향을 미치는 데 있어 부가적 또는 상승적 방식으로 함께 작용하는 일군의 분자들, 또는 그러한 활성을 가진 분자 복합체일 수 있다.

일단 단리가 되면, 화학적 변형 등에 의해 LMW-EGR의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 활성을 갖게 될 LMW-EGR 유도체를 제조하는 것이 가능하다. LMW-EGR에 유사한 생물학적 활성을 가진 유도체 또는 그러한 LMW-EGR의 동족체는 예를 들면 LMW-EGR을 특성화하는 데 사용된 동일한 생물학적 시험을 이용함으로써 동정할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포의 성장 또는 증식을 억제하는데 활성인 MF와 WBF의 경우, 가능한 경우에는 합성 유도체 또는 다른 종에서 유래한 분획화된 CM을 시험관내에서 키운 종양 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 활성에 대해 시험함으로써, 또는 MLR을 억제하는 능력에 의해서 유도체 및 동족체를 찾아낼 수 있다. 당업자는 물론 각 경우에 적절한 생물학적 검정법을 선택할 수 있을 것이다.

유도체는 분자 구조가 상기 LMW-EGR과 유사하지만 하나 이상의 화학적 기가 다른 기로 치환된 분자, 상기 LMW-EGR의 환원 또는 산화 생성물 등일 수 있다.

본 발명의 GR은 필요로 하는 대상에게 치료 유효량만큼 투여하게 되는 다양한 치료 목적으로 사용될 수 있다. 상기 GR이 사용될 수 있는 한 가지 바람직한 치료 용도는 암의 치료 또는 예방이다. 치료용으로는, 암 전력을 가진 개인에게 암 재발을 억제하기 위해서 등으로 GR을 투여할 수 있다. 이러한 치료는 대개 화학요법, 방사선 요법 또는 수술과 같이 암을 제거 또는 파괴하려는 초기 치료의 후처치가 될 것이다. 예방용으로는, 상기 GR을 암이 없는 개인 또는 암성 상태의 진단 이전의 개인, 특히 암에 걸리기 쉽거나 그 소인을 가진 고위험 개인에게 투여할 수 있다. 고위험 개인은 암에 걸릴 유전적 소인을 가진 개인, 예를 들면 암과 관련된 것으로 알려진 다수의 유전자 중 하나를 가진 것으로 진단된 개인; 암의 가족력이 있는 개인; 방사선 조사, 발암물질에의 노출 등과 같이 다양한 환경적 요인에의 노출의 결과로 암에 걸릴 위험이 높은 개인이라고 할 수 있다.

표적 세포의 즉각적인 파괴라기보다는 표적 세포의 증식의 억제라고 하는 GR의 생물학적 활성이 밝혀지면, 이 GR은 대개 어떤 기간에 걸쳐 주기적으로 투여될 것이다. 그러나, 위에서 이미 지적한 바와 같이, 성장이 장기간 정지된 후에는 종양 세포가 결과적으로 사멸하는 것이 가능하므로 특정한 기간 후에는 치료를 종료하는 것도 가능할 것이다.

상기 GR의 또다른 바람직한 치료 용도는 면역계의 성분의 활성을 억제하는 것이다. 그 예는 자기면역 질환의 치료, 이식 요법의 틀 내에서의 용도, 즉 이식 후 기관 또는 조직 거부를 피하기 위한 치료 등이다.

본 발명의 GR은 종양 세포의 피하, 근육내 또는 복강내 투입에 의해 종양이 유도된 일차 종양에 대한 동물 모델, 종양 세포의 정맥내 투입에 의해 종양이 유도된 전이에 대한 동물 모델을 포함하여 다양한 동물 모델에서 시험하였다. GR은 두가지 모델 종류 모두에서 종양의 진행을 억제하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이 GR은 비경구 및 경구 투여 모두에 의해 종양 진행을 억제하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 알려진 바와 같이, 경구 투여는 비경구 투여보다 생리적으로 훨씬 더 내용성이며 따라서 암의 치료 또는 예방을 위해, 특히 장기간에 걸친 GR의 주기적인 투여를 포함하는 치료 또는 예방 처방에서는 경구 투여 경로가 바람직하다.

이 GR은 유효량의 상기 GR을 상기 GR과 상용성인 생리학상 허용되는 담체와 함께 함유하게 될 제약 조성물로 조성할 수 있다. 상기 GR은 물에 가용성인 것으로 밝혀졌고, 따라서 생리학상 허용되는 담체는 비경구 투여용으로는 식염수일 수 있고, 경구 투여용으로는 식용 수성 액체일 수 있다. 또한, 경구 투여를 위해서는 GR을 다양한 복용 형태, 예를 들면 캡슐, 정제 등으로 조성할 수 있다. 또한, GR을 동결건조하여 사용 전에 담체 또는 희석제와 부가혼합시키도록 할 수도 있다.

본 명세서에 사용된 "유효량"이란 용어는 목적하는 효과를 달성하기에 충분한 양으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 암 치료법의 경우, 유효량은 발생률의 감소 또는 암 전이의 횟수의 감소 또는 암 연관 사망률의 감소 등으로 확인되는 바와 같이 종양 세포의 성장 및 증식을 억제하기에 충분한, 주어진 치료 처방 중의 상기 GR의 양이다. 암 예방의 경우, 유효량은 일차 암적 성장의 발생을 억제하기에 충분한, 주어진 예방 투여 처방 중의 상기 GR의 양이다.

GR의 제약 조성물로의 조성 외에도, 본 발명의 GR은 다른 종류의 조성물, 예를 들면 식품 첨가 조성물, 영양요법 조성물, 비처방 "건강" 제품 등으로 조성될 수 있다.

본 발명에 따라 수행된 실험에서 암 환자의 백혈구가 정상적인, 건강한 개인의 백혈구보다 훨씬 더 적은 양의 LMW-EGR을 분비한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 체액 (예, 혈청, 뇨 등) 중, 또는 개인의 세포, 예를 들면 근육 세포 또는 백혈구의 배양물의 상징액 중의 LMW-EGR의 농도를 측정함으로써 개인의 암을 진단하는 것뿐 아니라 개인의 암적 상태에 대한 지시를 얻는 것도 가능하다. 또한, 체액 또는 상기 상징액 중의 LMW-EGR의 농도의 측정은 암에 걸리기 쉽거나 소인을 가진 개인들에 대한 선별의 기초가 될 수 있다. LMW-EGR의 농도 측정은 종양 세포의 증식을 억제하는 데 있어 체액 또는 상징액의 활성, 또는 그 중 적절한 분획의 활성을 시험하는 것을 포함하는 생물학적 검정법을 통해 수행할 수 있다. 이러한 생물학적 검정법 외에도, LMW-EGR의 존재는 일반적으로 그 자체가 당업자에게 알려진, 다수의 분석적 방법에 의해 측정할 수도 있는데, 여기에는 LMW-EGR 특이적 항체의 사용에 기초한 다양한 면역학적 검정법, 적절한 화학적, 예를 들면 착색 시약이 사용에 기초한 검정법, 분광학적 검정법 또는 방사선의 흡수, 예를 들면 광흡수에 기초한 검정법, 다양한 크로마토그래피 기술 등이 포함된다.

본 발명의 또다른 측면에 의하면 생물학적 원천으로부터 본 발명의 GR을 정제하는 방법이 제공된다. 이 측면에 따른 방법은

(a) 세포가 그들을 둘러싼 배지 중으로 세포 성장 조절제를 생산하거나, 분비하거나, 흘리는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계;

(b) 세포 배양물의 상징액을 수집하는 단계;

(c) 분자량이 약 3,000 달톤 이상인 물질을 함유하는 상징액 분획과 분자량이 약 3,000 달톤 이하인 물질을 함유하는 상징액 분획을 분리하고, 후자를 선별하는 단계로 이루어진다.

단계 (c)에서 선택된 분획은 다양한 정제 기술, 구체적으로는 크로마토그래피, 예를 들면 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 추가로 정제할 수 있다.

이하에서, 본 발명은 첨부된 도면을 종종 참조하면서, 본 발명에 따라 행해진 몇몇 실험에 의해 예시될 것이다. 이들 실험에서는, MF 및 WBF의 시험관내 및 생체내 활성을 증명하였다. MF의 정제 및 특성화 과정도 기술하였다. 이 설명이 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안되며, 오히려 첨부된 청구의 범위에서 정의된 본 발명의 완전한 범위를 대표하는 것으로 간주되어야 함은 당업자에게 분명할 것이다. 당업자는 위의 설명과 하기 설명을 바탕으로 본 발명을 그 완전한 청구범위 내에서 실시할 수 있을 것이다.

도 1 내지 9는 분자량 차단치가 3,000 달톤인 멤브레인을 통해 여과된 근육 세포 CM 또는 백혈구 CM의 여액 (이러한 여액을 본 명세서에서는 각각 "3,000 달톤 MF 한외여액" 및 "3,000 달톤 WBF 한외여액"으로 지칭할 것임) 중에 함유된 상태에서 MF 또는 WBF의 효과를 보여준다. 도면에서, 세포는 96 마이크로웰 플레이트에서 성장시키고, 몇가지 희석 농도 ("1"-원액, "2"-2배 희석 등)의 3,000 달톤 MF 여액과 함께 인큐베이션하였다. 모든 실험에서 비조정 배지를 대조용으로 사용하였다. 도 1 내지 4 및 6, 8 및 9에서, 그리고 도 7에서도 부분적으로, 세포 천공은³H-티미딘 흡수를 통해 측정하였으며, 종축이 방사능 계수를 나타낸다. 도 5 및 도 7에서 부분적으로, 천공은 세포 계수에 의해 측정하였으며 종축은 세포 수를 나타낸다.

도 1은 2 종의 종양 세포주의 증식에 대한 신생 래트 줄무늬 근육 세포의 일차 배양액에서 얻은 2,000 달톤 MF 한외여액의 효과를 나타낸다: 쥐 흑색종 세포주 B16 (도 1A); 사람 선암 세포주 HTB-38 (도 1B). 이 도면에서는 3,000 달톤 MF 한외여액의 활성을 원상태의 조정 배지("조-CM")의 것과 비교하였다.

도 2는 2 종류의 정상적, 비종양 세포에 대한 신생 래트 줄무늬 근육 세포의 일차 배양액에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액의 효과를 보여준다: 래트 섬유아세포 (도 2A); 쥐 골수 세포 (도 2B).

도 3은 2 종의 종양 세포주의 증식에 대한 래트 줄무늬 근육 세포의 세포주 L-8에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액의 효과를 보여준다: B16 (도 3A); 쥐 폐메틸콜란트렌 유도 육종주 MCA-105, (도 3B).

도 4는 두 가지 정상적 유형의 세포에 대한 L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액의 효과를 보여준다; 쥐 골수 세포 및 래트 섬유아세포 일차 배양.

도 5는 세포 계수에 기초한 세포 성장 분석에서, Nb₂-11C 래트 림프종주 세포의 증식에 대한 신생 래트 줄무늬 근육 세포의 일차 배양액에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액의 효과를 보여준다. 이 분석에서 세포를 G⁰/G¹기로 동조화시키고, 3,000 달톤 MF 한외여액 조-CM 또는 대조 배지를 가한 다음 hGH의 첨가로 성장을 자극하였다.

도 6은 몇몇 종양 세포주의 증식에 대한 L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액의 효과를 보여준다. 각 경우의 결과는 개별 실험의 대조물에 대한 백분율이다.

도 7은 사람 근원세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액의 효과를 보여준다. B-16 및 K562 세포의 증식은³H-티미딘 흡수를 통해 측정하였으며, NBT 세포의 증식은 세포 계수를 통해 측정하였다.

도 8은 쥐 및 사람 종양 세포의 증식에 대한 사람 림프구에서 유래한 3,000 달톤 WBF 한외여액의 효과를 보여준다. 증식은 대조용에 대한 백분율로 표시하였다.

도 9는 PHA에 대한 림프구 반응에 대한, 그리고 혼합 림프구 반응 (MLR)에서, L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액의 효과를 보여준다.

도 10은 2 × 10⁵MCA-105 세포의 복강내 주사에 의해 종양을 유도한 두 마리의 대표 마우스의 노출된 복막을 보여주는 사진. 주사에 이어, 오른쪽 마우스는 예비 역상(RP) C18 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 칼럼에서 용출된 MF 함유 분획 (이 분획은 이하에서 "MF-SP"로 지칭됨 (7.6.2 참조)) 0.5 ml를 복강내 주사하는 처치를 매일 2회 받았으며, 왼쪽 마우스는 대조 RPMI 배지를 주사하였다.

도 11은 5 × 10⁵B-16 흑색종 세포의 복강내 주사에 의해 종양을 유도한 두마리의 대표 마우스의 노출된 복막을 보여주는 사진. 오른쪽 사진은 L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 (PBS 중) 1 ml를 매일 1 회 복강내 주사하는 것으로 처치한 마우스의 것이고, 왼쪽 사진은 복강내 주사되는 대조 PBS 배지로 매일 1회 처치된 마우스의 것이다.

도 12는 2 × 10⁵MCA-105 세포를 복강내 주사한 대표 마우스의 노출된 복막을 보여주는 사진, 도 12A에 보이는 마우스는 L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 1 ml로 매일 (종양 접종일부터 시작하여) 경구 처치된 마우스군에 속하는 것이다. 도 12B에 보이는 마우스는 대조 RPMI 배지로 경구 처리된 대조 마우스군에 속하는 것이다.

도 13은 5 × 10⁵B-16 흑색종 세포를 정맥내 주사한 마우스의 분리된 폐를 보여주는 사진. 윗단의 폐는 대조 PBS 용액 1 ml을 경구로 매일 투여한 대조 동물군의 것이다. 아랫단의 폐는 L-8 세포에서 얻어진 3,000 달톤 MF 여액 1 ml의 경구 투여로 매일 처치한 동물로 구성된 실험군의 것이다.

도 14는 세 가지 종양 세포주 (B-16, SK 및 K-562)의 증식을 억제하는 데 있어 암 환자의 혈액 및 건강한 개인의 혈액에서 얻은 백혈구의 상징액에서 얻어진 3,000 달톤 한외여액의 효과를 보여준다;

도 14a는 3,000 달톤 한외여액에 노출된 후 대조군에 대비되는 세 가지 세포주의 증식을 보여주며,

도 14b는 억제 백분율 (억제는 증식의 역수가 됨-100% 증식은 0% 억제가 되는 등 (100% 이상의 증식을 보인 결과 역시 "0%" 수치로 나타냄))로 주어지는 산포 결과를 보여준다.

도 15는 RP-HPLC 칼럼을 통해 재크로마토그래피된 MF-함유 용액의 220 nm 용출 프로필을 보여준다 (재크로마토그래피는 첫번째 크로마토그래피와 동일한 칼럼을 사용하여 동일한 방식으로 실시되었음).

도 16 내지 21은 세포 계수로 측정된, Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한 여러 HPLC 칼럼에서 용출된 각종 분획의 활성을 보여준다. 이들 그림 각각에서 횡축은 튜브 수를 나타낸다 (유속 및 각 튜브의 부피에 대해서는 하기 본문 참조). 종축은 블랭크 (Nb₂세포의 성장 배지에 어떤 용액도 가하지 않고 성장시킨 세포, 100%로 함)에 비교했을 때의 상대적 세포수를 나타낸다.

도 16 및 도 17은 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 예비 RP-HPLC (C-18) 칼럼에서 행한 2 회의 상이한 전개에서 용출된 여러 분획의 활성을 보여준다. 칼럼에 공급한 용액은 L-8 세포 (PBS 중)에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 또는 대조 PBS 용액이었다. 도 16에서, MF 함유 용액-빈 원 (○); 대조 PBS 용액-채워진 원 (●). 도 17에서, MF 함유 용액-채워진 세모 (▼); 대조 PBS 용액-채워진 원 (●).

도 18은 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 분석 RP-HPLC (C-18) 칼럼에서 용출된 여러 분획의 활성을 보여준다. 이 칼럼에 공급한 용액은 도 16의 분획 5 및 6을 합친 것으로 이루어졌다. MF 용액-채워진 원 (●); 대조-빈 원 (○).

도 19는 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 수퍼덱스 칼럼에서 용출된 여러 분획의 활성을 보여준다. 이 칼럼에 공급한 용액은 튜브 9-10 250 ml, 튜브 10-11 520 ml 및 분획 11-12 600 ml로 이루어진, 도 17의 용출액으로부터 모은 용액이었다.

도 20은 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 분석 RP-HPLC 칼럼에서 용출된 여러 분획의 활성을 보여준다. 칼럼에 공급한 용액은 도 17의 튜브 6-12를 합친 것으로 이루어졌다. MF 용액-채워진 네모 (■); 대조 PBS 용액-빈 원 (○).

도 21은 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 크기 배제(size exclusion, SE) 칼럼에서 용출된 여러 분획의 활성을 보여준다. 이 칼럼에 공급한 용액은 도 17에 나타낸 예비 RP-HPLC 칼럼에서 용출된 상이한 분획이었다: 분획 "A", 튜브 6-8-빈 원 (○); 분획 "B", 튜브 8-10-채워진 원 (●); 분획 "C", 튜브 10-12-빈 세모 (▽); 분획 "D", 튜브 12-14-채워진 세모 (▼).

도 22는 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 수퍼덱스 칼럼에서 용출된 여러 분획의 활성을 보여준다. 이 칼럼에 공급한 용액은 다음과 같이 도 21의 용출액에서 얻어진 여러 분획으로 이루어졌다:

도 22A는 다음 공급 용액의 결과를 보여준다: 분획 C의 튜브 28-30-빈 원 (○); 분획 C의 튜브 22-23-채워진 원 (●); 분획 B의 튜브 29-33-빈 세모 (▽);

도 22B는 다음 공급 용액의 결과를 보여준다: 분획 C의 튜브 31-32-채워진 원 (●); 분획 C의 튜브 23-26-빈 원 (○); 분획 B의 튜브 29-33-빈 세모 (▽).

도 23은 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 분석 RP-HPLC 칼럼에서 용출된 분획들의 활성 프로필을 보여준다. 칼럼에 공급한 용액은 예비 RP-HPLC 칼럼에서 얻어진 활성 분획들 (18%-28% 아세토니트릴에서 용출됨)로 이루어졌다.

도 24는 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 크기 배제 칼럼에서 용출된 분획들의 활성 프로필을 보여준다. 칼럼에 공급한 용액은 도 23에 나타낸 분취물에서 얻은 분획 13-17이었다.

도 25는 Nb₂세포의 증식을 억제하는 데 대한, 친수성 상호작용 (CHO) 칼럼에서 용출된 여러 분획들의 활성 프로필을 보여준다. 칼럼에 공급한 용액은 도 24에 나타낸 분취물에서 얻은 분획 27-30을 합친 것이었다.

도 26은 크기 배제 칼럼에서 얻어진 활성 분획들 (27-32 분 사이에 용출된 분획들)의 NMR 스캔을 보여준다.

이하에서 근육 세포 CM 및 백혈구 세포 CM에서 얻어진 활성 분획의 활성을 논의함에 있어 "MF" 또는 "WBF"에 대한 언급이 종종 있을 것이다. 이들 두 CM이 아래에 설명된 활성을 갖는 한 가지 이상의 인자를 함유하는 것이 가능하다는 것을 이해해야 한다. 실상, 아래에 그 일부를 보인, 본 발명에 따라 얻어진 HPLC 분획화 결과는 (다른 설명 역시 가능하기는 하지만) 이런 방식으로 설명될 수 있다. 따라서, 예를 들면 근육 세포 CM이 종양 성장 억제 효과를 가진 인자를 한 가지 이상 함유하는 것이 가능하다. 따라서, 예를 들면 종종 "상기 MF" 등으로 언급한 것이 근육 CM이 단 하나의 LMW-EGR만을 함유하는 것을 뜻한다고 간주되어서는 안 되는데, 이것은 근육 세포 CM이 사실은 모두를 "MF"로 부를 수 있는 두 가지 이상의 물질을 함유할 수 있기 때문이다.

1. 조정 배지

1.1 MF

MF는 세 가지 유형의 근육 세포 제제의 조정 배지 (CM)에서 얻었다.

1.1.1 신생 래트 근육의 일차 배양

24-48 시간 된 신생 래트의 뒷다리에 있는 근육을 분리하고 작은 조각으로 다졌다. 0.25% 트립신버산 용액으로 트립신처리한 후 세포를 조직 배양 접시에 예비 플레이팅하여 섬유아세포 및 단핵 세포를 제거하였다. 세포를 계수하고 강화 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에 접종하였다. 5 일 후, 배양액은 수축하는 근육 세포를 함유하였다. 그 때 배지를 버리고 RPMI 또는 PBS 배지를 가하였다. 세포를 RPMI 배지에서는 24 시간 동안, 그리고 PBS에서는 8 내지 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로 상징액을 모으고, 원심분리한 다음 후속 처리시까지 냉장고에서 -20℃로 유지하였다.

1.1.2 래트 근육 세포주 (L-8)

L-8 세포주 (ATCC에서 입수할 수 있음, 표시 CRL 1769)는 성장 인자의 첨가 없이도 증식하는 미분화된 근원세포로 이루어진 신생 래트 골격근 근원세포주이다. L-8 세포를 배양 접시에 접종하고 4% 글루코오스를 함유한 RPMI 배지 (이 배지를 이하에서 "RPMI"로 지칭할 것임)에서 성장시켰다. 분리 3 일 후, 배양 상징액을 버리고 RPMI 또는 인산염 완충 염수 (PBS)로 대체한 다음 24 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그 다음 상징액을 모으고 즉시 후속처리하지 않을 경우에는 냉장고에서 -20℃로 유지하였다.

1.1.3 사람 근원세포

사람 생검에서 얻어진 사람 근원세포를 회전 배양 플라스크에서 전면성장때까지 배양하였다 (미국 특허 5,130,441호 참조). 배양 배지를 제거하고 DMEM 또는 PBS 용액으로 대체한 다음 그 용액에서 세포를 24 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그 다음 상징액을 모으고, 원심분리로 세포를 분리하였다.

1.2 WBF

WBF는 단핵 세포의 조정 배지에서 얻었다. 다음과 같이 단핵 세포를 정맥혈에서 단리하였다. 헤파린처리된 주사기로 사람 공여자에게서 20 ml의 정맥혈을 채취하였다. 헤파린처리된 혈액을 PBS로 1:1 희석하고, 15 ml의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) (등록상표) (스웨덴 파마시아사) 또는 히스토파크(Histopaque) (등록상표) (미국 시그마사) 상에 적층시킨 다음 400 × g로 30 분 동안 원심분리하였다. 단핵 세포를 함유한 계면을 모으고 PBS로 3 회 세척하였다.

2 × 10⁶/ml 단핵 세포를 PBS에 현탁시키고 5% CO₂, 95% 대기로 된 가습분위기에서 48 시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 그 다음 세포 현탁액을 원심분리하고 상징액을 모았다.

2. 한외 여과

상기 원천에서 얻은 CM을 분자량 차단치가 500, 2,000, 3,000 및 10,000 달톤인 필터 (센트리콘(Centricon) (등록상표) 미국 아미콘사)를 사용하여 한외여과시켰다.

MF는 이하에서 자세히 보여지는 바와 같이 분자량 차단치가 10,000, 3,000, 2,000 달톤인 멤브레인을 통과한 한외여액뿐 아니라 분자량 차단치가 500 달톤인 멤브레인의 한외여액에도 존재하는 것으로 밝혀졌다. WBF는 분자량 차단치가 3,000 달톤인 멤브레인을 통해 한외여과하였으며 이 한외여액은 WBF를 함유하는 것으로 밝혀졌다.

분자량 차단치가 500, 2,000 등인 필터를 통과한 근육 세포 CM의 한외여액은 본 명세서에서 "500 달톤 MF 한외여액", "2,000 달톤 MF 한외여액" 등으로 지칭될 것이고, 분자량 차단치가 3,000 달톤인 필터를 통과한 림프구 CM의 한외여액은 본 명세서에서 "3,000 달톤 WBF 한외여액"으로 지칭될 것이다.

3. MF 및 WBF에 의한 종양 세포 증식의 시험관내 억제

3.1 방법

3.1.1 세포주

이 시험관내 분석에서 MF 또는 WBF의 효과는 몇몇 종양 세포주 및 몇 몇 비종양성세포에 대해 시험하였다. 시험된 세포는 다음과 같다:

(a) 종양 세포주:

HT-29, 사람 직장에서 유래한 선암 세포주 (ATCC, 표시 HTB-38);

MCA-105, 쥐 폐 메틸-콜란트렌 유도 육종 세포주;

B16-F1, 쥐 흑색종 세포주;

SK-28, 사람 흑색종 세포주;

K-562, 사람 백혈병 세포주;

DA3 세포, 유방암 세포주;

MCF-7, 유방암 세포주;

Nb₂-11C, 호르몬 의존성인 래트 림프종 세포주 (즉, 이들 세포의 성장에는 성장 호르몬의 첨가가 요구됨) (Gertler et al., 1985, Endocrinol., 116:1636-1644); 및

Nb₂-SP, 최유성 호르몬 비의존 래트 림프종 세포주.

(b) 비종양 세포:

쥐 골수 세포;

일차 래트 섬유아세포; 및

IM-9, 사람 림프구 세포주

3.1.2³H-티미딘 흡수 분석

시험 세포 (³H-티미딘 흡수를 분석하는 세포)를 96 마이크로웰 플레이트에 초기 세포 밀도 1 × 10⁴세포/마이크로웰로 접종하였다. 각 마이크로웰에는 RPMI와, 조정 배지 (RPMI 또는 PBS 중의, 근육 세포 CM 또는 백혈구 세포 CM), 분획화된 CM, 대조 RPMI 또는 PBS (즉, 조정되지 않음), 또는 분획화된 대조 RPMI 또는 PBS인 시험 용액의 혼합물을 담았다. 각 시험 용액의 결과를 대응하는 대조용과 비교하였다 (예, 분획화된 PBS 중의 시험 용액은 분획화된 PBS에 비교하는 등). 37℃에서 42 시간 동안 인큐베이션한 다음 각 마이크로웰에 10 μC의³H-티미딘 펄스를 가하고, 이어서 이 방사능 표지와 함께 6 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그 다음³H-티미딘 흡수의 양을 액체 신틸레이션 계수기에서 측정하였다.

3.1.3 세포 계수 분석

Nb₂-11C 래트 림프종 세포주의 세포를 동조화한 다음 세포를 5% 우태아 혈청을 보충한 RMPI에서 배양하는 것을 제외하고는 종래 기술된 대로 배양하였다(Gertler et al., 1985, Endocrinol., 116:1636-1644). Nb₂-11C 세포를 G₀/G₁기에 동조화하고 자기 증식을 모니터링하는 것은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Gertler et al., 상기 문헌). 간단히 하면, 세포를 말 혈청을 보충한 배지로 옮기고 철야 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 약 3 × 10⁵세포/ml로 희석하고, 24 마이크로웰 플레이트의 다수의 웰에 0.5 ml/웰로 분배하였다. 그 다음 최대 0.5 ml의 시험 용액을 첨가하고 hGH을 2 mg/ml의 최종 농도로 첨가하여 자기 증식을 개시하였다. 세포를 5% CO₂함유 분위기 중 37℃에서 인큐베이션하였고, 72 시간 동안 인큐베이션한 다음 코울터 계수기에서 세포를 계수하였다. 각 실험은 2회 반복 수행하였다.

Nb₂-SP 및 IM-9 세포주의 세포를 유사한 방법으로 시험하였다.

3.2 결과

3.2.1 MF

신생 래트 줄무늬 근육 세포의 일차 배양에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액을 사용하여 얻은 결과를 도 1 및 2에 나타내었고, L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액을 사용하여 얻은 결과는 도 3 및 4에 나타내었다. 이들 도면 각각에서, 횡축의 숫자는 희석비의 역수 ("1"-원액, "2"-2배 희석 등)를 나타내고 종축은 방사능 (분당 계수-CPM)을 나타내며, 대조용 (각 경우 왼쪽 열)은 CM과 동일한 방식으로 처리된 비조정 배지를 사용하여 얻은 것이다.

도 1 및 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 래트 줄무늬 근육 세포의 일차 배양 (도 1) 또는 L-8 줄무늬 근육 세포주 (도 3)로부터 얻어진 MF는 종양 세포의 증식을 억제하면서도 정상 세포에 대해서는 그러한 억제 효과를 갖지 않았다 (각각 도 2 및 4). 또한, 조-CM에 존재하는 항증식 활성이 한외여액에서 보존되어 있다는 점이 증명하는 바와 같이 MF가 분자량 차단치가 3,000 달톤인 멤브레인을 통과한다는 것도 알 수 있다. 도 1 및 3에서 더 알 수 있는 바와 같이, MF의 효과는 희석률을 증가시킴에 따라 감소하는데 이것은 이 효과가 한외여액 중의 특이적인 인자에 의해 매개된다는 사실을 추가로 교시한다.

도 5는 L-8 세포주에서 유래한 조-CM의 활성을 그의 3,000 달톤 MF 한외여액에서의 것과 함께 여러 희석률에서 보여준다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 조-CM은 한외여액에서 보존되는 항증식 활성을 보여준다. 또한, 이 효과는 희석비를 증가시킴에 따라 감소하여 이것이 특이적인, 인자 매개 활성이라는 것을 다시 보여준다.

L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 (원액)의 효과는 도 6에도 나타나 있다 (결과는 대조용의 경우에 대한 백분율로 표시되며, 각 실험에서의 대조용을 100%로 매김). 여기서 알 수 있는 바와 같이, MF는 시험된 모든 종양 세포주의 증식을 억제하는 데 활성이다.

도 7은 사람 근원세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액의 세 가지 세포주의 증식을 억제하는 데 대한 활성을 보여준다 (결과는 대조용의 경우에 대한 백분율로 표시됨). B-16 및 K562 세포주의 증식은³H-티미딘 흡수를 측정함으로써 시험하였고, Nb₂세포주의 증식은 세포 계수를 통해 시험하였다. 사람 유래 MF가 시험된 모든 종양 세포주의 증식을 억제하는 데 활성이라는 것을 알 수 있다.

다른 한 실험에서, 종양 세포의 증식을 억제하는 데 활성인 것으로 밝혀진, 예비 RP-HPLC에서 얻은 분획 (도 15의 분획 5 및 6)을 함께 모아서 45℃에서 증발시킨 다음 물 5 ml에 용해시키고, 튜브로 옮긴 후 다시 진공에서 건조시키고, 마지막으로 물 2 ml에 용해시킨 다음 멸균하였다. 이들 분획 소정량을 시험하여 세 가지 다른 세포주, 즉 Nb₂-11C, Nb₂-SP 및 IM-9의 증식을 억제하는 능력을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 I에 나타내었다 (증식은 세포 계수로 측정함):

위에서 알 수 있는 바와 같이, MF는 호르몬 의존성 Nb₂-11C 종양 세포주의 증식을 호르몬 비의존성 Nb₂-SP 종양 세포주의 증식과 마찬가지로 억제한다. 이에 반해, MF는 비종양성, 사람 림프구 세포주 IM-9에 대해서는 본질적으로 영향을 전혀 미치지 않았다.

도 8은 쥐 및 사람 세포주의 증식에 대한 3,000 달톤 WBF 한외여액의 효과를 보여준다. 여기서도 알 수 있는 바와 같이, WBF는 쥐 및 사람 기원의 시험된 모든 종양 세포주의 증식을 억제하였다.

4. MF 및 WBF에 의한, PHA에 대한 림프구 반응 및 MLR의 시험관내 억제

두 개인으로부터 나온 림프구를 함께 배양하면, 각 개인의 HLA 항원은 림프구 증식을 초래하는 세포 반응을 유발할 것이다 (증식은 두 개인의 HLA 항원들 사이의 차이에 직접적으로 연관됨). 이 반응에 대한 WBF 또는 MF의 효과를 탐구하기 위해, 두 공여자에게서 얻은 단핵 세포 1 × 10⁶세포/ml (세포는 상기 1.2 란에 기재된 대로 수득함)를 10% FCS를 함유한 PBS에서 인큐베이션하고 여러 가지 희석률의 3,000 달톤 MF 또는 WBF 한외여액을 세포에 가하였다. 배양물을 5% CO₂, 95% 공기로 된 가습 분위기 중 37℃에서 5 일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 마지막 6 시간 동안에 각 웰에³H-티미딘 1 μCi를 펄스식 주입하였다. 세포를 수득하고,³H-티미딘 흡수량을 LKB 액체 신틸레이션 계수기 (LKB, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 측정하였다.

PHA (식물성 혈구 응집소)는 림프구의 세포 표면 당에 결합하여 후속적인 세포 증식을 동반하는 아세포 형태로의 림프구 전환을 유도하는 유사분열물질이다. PHA 유도 반응에 대한 MF 또는 WBF의 효과를 탐구하기 위해, 농도 10⁶세포/ml인 단핵 세포를 10% 우태아 혈청을 보충한 RPMI (Israel Industries, 이스라엘 베트하에멕 소재) 0.2 ml 및 1 ㎍/ml PHA (Wellcome Laboratories, 영국 소재)를 함유한 96 웰 마이크로웰 플레이트에 접종하였다. 일부 웰의 경우 0.2 ml RPMI는 원상태 RPMI 반과 RPMI 중의, L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 반으로 이루어졌다. 배양물을 CO₂인큐베이터에서 4 일 동안 인큐베이션하고 인큐베이션 기간 말기에 세포에³H-티미딘 1 μCi를 펄스식 주입하고, 추가로 24 시간 동안 인큐베이션한 다음 Dyatech 세포 수득기로 수득한 후에 LKB 신틸레이터를 사용하여 방사능을 측정하였다.

도 9는 PHA에 대한 림프구 반응의 억제 및 MLR에 대한 MF의 효과를 보여준다(나타낸 결과는 1:1 희석분에 대한 것이며 대조용의 경우에 대한 백분율로 표시하였음). WBF의 경우에 정성적으로 유사한 결과가 얻어졌다. 또한, MF 및 WBF 모두의 효과는 희석률에 비례하였다 (희석률을 증가시킴에 따라 효과가 감소함) (결과는 도시되지 않음).

5. 생체내 연구

5.1 복강내 접종에 의한 종양 (MCA 105)의 유도 및 MF를 사용한 복강내 처치

C57BL6/J 마우스 30 마리에 2.5 × 10⁵MCA-105 세포를 복강내 주사하였다. 마우스들에 하기 (6.5.2 절)에서 "MF-SP"로 지칭된 RP-HPLC 분획 0.5 ml를 매일 2회 복강내 주사하여 처치하였다. 33일 째에 마우스들을 희생시키고 종양 병소를 평가하였다.

대표적인 결과를 도 10에 제시하였는데, 복막이 개방된 상태의 동물 두 마리를 보였으며, 도 10A에 보인 동물은 MF-SP 분획으로 처치하였고 도 10B에 보인 동물은 대조용 RPMI 배지로 처치하였다. 여기서 알 수 있는 바와 같이, 대조 동물에서는 매우 큰 종양 성장이 관찰되는 (도 10B의 화살표) 반면 MF 처치된 동물에서는 아주 작은, 거의 알아볼 수 없는 종양 병소 (그 중 하나를 도 10A의 화살표로 표시)만이 관찰되었다.

5.2 복강내 접종에 의한 종양 (B-16 흑색종)의 유도 및 복강내 MF 주사에 의한 처치

C57BL6/J 마우스 40 마리에 5 × 10⁵B-16 흑색종 세포를 복강내 주사하였다. 20 마리의 마우스를 대조군으로 사용하여 이들에게 PBS 용액을 매일 복강내 주사하였다. 20 마리의 마우스는 L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 1 ml로 매일 처치하였다. 15일 째에 마우스들을 희생시키고 동물들의 복막 상에서 종양 성장의 정도를 시험하였다. 각 실험군에서 뽑은 두 마리의 대표 마우스의 개방된 복막을 보여주는 도 11에서, 대조군에서 뽑은 동물에서는 크고 무수한 종양 병소를 볼 수 있는데 비해 처치된 동물에서는 소수의, 그리고 훨씬 크기가 작은 종양 병소만이 존재한다는 것을 알 수 있다.

5.3 복강내 접종에 의한 종양 (MCA-105)의 유도 및 복강내 및 경구 투여 양쪽에 의한 MF 처치

C57BL6/J 마우스 30 마리에 2.5 × 10⁵MCA-105 세포를 복강내 주사하였다. 10 마리의 마우스들은 L-8 근육 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 1 ml를 매일 경구 투여하여 처치하고, 10 마리는 동일한 용액의 복강내 주사로 매일 처치하였으며, 10 마리는 대조군으로 사용하여 RPMI 배지를 경구 투여하는 것으로 매일 처치하였다.

30일 째에 마우스들을 희생시키고 복막을 노출시킨 다음 그 안의 종양 성장 정도에 대해 시험하였다. 각 군에서 뽑은 두 마리 대표 마우스를 도 12에 보였다 (도 12A-MF 처치한 마우스, 도 12B-대조군). 도 12A에서 알 수 있는 바와 같이, MF 처치된 동물의 복막에서는 종양 성장의 징후가 전혀 없는 반면 대조군의 동물의 복막에서는 큰 종양 병소가 나타났다. 이 실험에서, 대조군 마우스 중 90%가 종양 병소를 나타낸 데 반해 MF를 복강내 또는 경구로 처치한 마우스의 40%에서만 병소가 나타났다.

5.4 근육내 접종에 의한 종양의 유도 (DA3 유방암) 및 복강내 및 경구 투여에 의한 MF 처치

BALB/C 마우스 30 마리의 다리에 1 × 10⁶DA3 세포를 근육내 주사하였다. 10마리의 마우스를 대조군으로 사용하여 PBS 복강내 주사로 매일 처치하였고, 10 마리는 L-8 근육 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 (PBS로 제조) 1 ml를 매일 복강내 주사하여 처치하였으며, 10 마리는 경구 투여 (1 ml)에 의해 동일한 MF 함유 용액으로 처치하였다. 마우스들은 다리에 큰 종양을 발육시켰으며, 3 주일 후 마우스들을 희생시키고 폐에서 전이성 폐 병소를 검출하고 계수할 수 있었다. 복강내 처치된 군의 6.2 ±1.3 병소 및 경구 처치된 군의 2.2 ±0.6 개에 비해 대조군에서는 23.4 ±6 개의 전이성 병소가 계수되었다.

5.5 정맥내 접종에 의한 종양의 유도 (B-16 흑색종) 및 경구 투여에 의한 MF 처치

C57BL6/J 마우스 30 마리에 5 × 10⁵B-16 흑색종 세포를 정맥내 주사하였다. 20 마리의 마우스는 종양 접종일부터 시작하여 L-8 세포에서 유래한 3,000 달톤 MF 한외여액 1 ml를 매일 경구 투여하여 처치하였고, 10 마리의 마우스는 대조군으로 사용하여 이들에게 PBS만을 경구 투여하였다. 18일 째에 마우스들을 희생시켰는데 발육된 검은 종양 병소를 이들의 폐에서 관찰할 수 있었다. 두 군에서 뽑은대표적인 폐를 도 13에서 볼 수 있다 (상단-대조군, 하단-MF 처치). 여기서 알 수 있는 바와 같이, 대조군의 폐에는 다수의 검은 전이성 병소가 존재하는 반면 실험군에서는 소수의 작은 것만을 볼 수 있다.

6. 건강한 개인 및 암 환자의 백혈구에서 분비되는 WBF의 정도

건강한 개인 23명의 정맥혈 (시료는 혈액 은행에서 얻음) 및 입원한 암 환자 33명에게서 단핵 세포를 분리하였다. 그 과정은 1.2절에 기술된 바와 같다. 2 × 10⁶/ml 단핵 세포의 배양물에서 상징액을 수집하였으며, 2 절에 기재한 바와 같이 상징액은 수집한 다음 분자량 차단치가 3,000 달톤인 필터를 통해 한외여과하였다.

이 한외여액을 3 종류의 암 세포주: B-16 쥐 흑색종, SK 사람 흑색종 및 K-562 사람 백혈병 세포주에서 취한 암 세포의 성장을 억제하는 능력에 대해 시험하였다.

결과는 도 14에 나타내었다. 도 14A에서 볼 수 있는 바와 같이, 건강한 개인의 단핵 세포에서 얻은 한외여액이 시험된 세포주의 50% 미만인, 증식의 현저한 억제를 보인 반면 암 환자에서 얻은 한외여액의 경우에는 아주 적은, 거의 무의미한 증식 억제만이 보였다. 도 14B에서 다시 볼 수 있는 바와 같이, 두 군 사이에는 겹쳐지는 일이 절대 없었다.

이들 결과는 암 환자의 단핵 세포에서 분비되는 WBF의 농도는 건강한 개인의 림프구에서 분비되는 것과 비교하면 상당히 낮은 정도라는 것을 보여준다. 따라서 이들 결과는 본 발명의 LMW-EGR의 농도 시험의 진단상 의의를 증명해준다. 또한,WBF의 활력 수준 억시 중요한 치료상 의의를 가진다.

7. MF의 특성파악

7.1 생물검정

근육 세포 CM을 아래에서 상세히 설명되는 바와 가팅 분획화하고 상기 언급한 세포를 사용하여 여러 분획을 검사하였다. 세포의 성장에 대한 각 분획의 효과는³H-티미딘 흡수량에 의해, 또는 상기한 세포 계수 검사법에 의해 측정하였다.

7.2 MF의 가상적 단백질 특성에 대한 검사

MF가 단백질성 물질인지 아닌지를 결정하기 위해 근육 세포 CM (일차 래트 근육 세포 배양에서 유래함)에 단백질분해 효소에 대한 감도, 동결건조시의 안정성 및 여러 온도에서의 인큐베이션의 효과를 포함한 일련의 처리를 행하였다. 이러한 처리에 이어 원래의 배지로 희석하여 CM을 원래의 염 및 단백질 농도로 되돌려 놓거나, 희석했을 경우에는 단백질 농도의 희석 계수를 결과를 평가하는 데 고려하였다. 사용된 검사법은³H-티미딘 흡수량 검사였다.

7.2.1 단백질분해 효소의 효과

두 가지 단백질분해 효소 제제인 트립신 및 프로나아제를 시험하였다. 트립신의 효가를 측정하기 위해 두 개의 과정을 사용하였다:

(i) MF 함유 용액을 트립신 (0.5-2 ㎍/ml)과 함께 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하고, 그 후 대략 2 배 몰 과량의 대두 트립신 억제제(STI)의 첨가로 트립신 활성을 중지시켰다. 조정되지 않은 (MF가 없는) 배지를 대조용으로 사용하였다;

(ii) MF 함유 용액을 트립신 (0.5-2 ㎍/ml)과 함께 37℃에서 1-4 시간 동안, 또는 실온에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 후에는 P-아미노벤즈아미딘아가로오스 칼럼에서 효소를 제거하였다. MF가 없는 배지를 대조용으로 사용하였다. 트립신만을 사용한 추가 대조 시험에서 칼럼의 전개 조건-중탄산염 완충액에서는 이 칼럼에서 트립신 활성이 전혀 용출되지 않는다는 것이 밝혀졌다.

프로나아제의 효과를 시험하기 위해, 근육 세포 CM을 세파로오스 겔에 고정시킨 프로나아제와 접촉하게 하는 것으로 처리하였다. 여기서도 MF가 없는 배지를 대조용으로 사용하였다. 그 결과를 하기 표 II에 나타내었다 (숫자는 비조정 대조배지의 경우에 비교한 %억제를 표시함).

위의 결과는 프로나아제 처리와 마찬가지로 두 가지 방법 모두에 의한 트립신 처리가 MF의 종양 성장 억제 활성에 유의한 효과를 전혀 갖지 않음을 증명한다.

7.2.2 동결건조

근육 세포 CM을 사전 투석 없이 동결건조시킨 다음 동결건조물을 물에 원래의 부피로 재용해시켰다. 이 처리 후에 MF의 종양 성장 억제 활성에는 눈에 띄는 손실이 전혀 없어 MF가 동결건조에 안정함을 나타내었다.

7.2.3 열처리

근육 세포 CM (이전의 래트 근육 세포 배양에서 유래함)을 4-100℃ 범위의 온도에서 여러 기간 동안 처리하였다. 이들 처리 후에 시료를 MCA 및 HTB 세포 모두로 시험하였다. 그 결과를 하기 표 III에 나타내었다 (숫자는 열처리에 이은 MF의 억제 역가의 변화 (%)를 나타낸다).

다른 일련의 실험에서, 조정 배지의 3,000 달톤 한외여액을, 종양 세포의 증식을 억제하는 이 저분자량 분획의 활성에 전혀 손실이 없이, 비등점까지 가열하는 것으로 처리하였다.

상기 결과는 100℃에서 끓이는 것을 포함하여 시험된 모든 온도에서 억제 역가에 감소가 없었다는 것을 보여준다.

7.2.4 요약

시험된 조건 하에서 종양 세포의 성장을 억제하는 MF의 역가에는 감소가 전혀 관찰되지 않았는데, 이것은 HF가 단백질이 아니라는 것을 명백히 지시한다. 이에 반해, 결과에서는 MF 함유 배지가 MF에 반대 효과를 가하고 처리과정에서 파괴되는 단백질계 인자를 함유한다는 사실에 의해 설명될 수도 있는, 일부 처리 후 억제 활성의 증가를 보였다.

7.3 MF의 크기

MF 함유 CM을 분자량 차단치가 10, 2 및 0.5 kD인 아이콘 멤브레인 상에서 한외여과로 분획화하였다 (잔류물은 각 경우 1 회 이상의 PBS 추가량으로 재여과하였다). 10 및 2 kD 멤브레인 모두의 경우, 거의 모든 억제 활성 (90% 이상)이 처음 두 여액에서 발견되었으며, 0.5 kD 멤브레인의 경우에는 대략 80%의 활성이 여액에서 발견되고 일부 활성 (20%)은 2차 잔류물에 남아있었다. 각 경우에 억제 활성을 HTB 38 및 MCA 세포 양쪽에서 검사하였다.

분자량 차단치가 12 및 3 kD인 멤브레인을 통한 MF 함유 CM의 투석에서는 활성 성분이 두 멤브레인 모두를 통과해 빠져나갔음을 알 수 있었다.

상기 결과는 MF가 분자량이 약 500 달톤 이하라는 것을 보여준다.

7.4 MF (래트 근육 세포의 일차 배양에서 유래한 것)의 RP-HPLC 특성파악

10 kD 멤브레인의 여액을 C-18 역상(RP) 칼럼 (4 × 250 mm)에서 크로마토그래피하였다. 칼럼에 가하기 전에 여액을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)에 희석시켜 원래의 농도로 만들었는데, 칼럼은 아세토니트릴 5-35% 구배를 가졌다 (이들 성분은 모두 사전에 검사하여 MF의 억제 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인함). HTB-38 세포로 시험한 활성은 0.1% TFA 중의 15% 아세토니트릴에서 용출되었다. 활성 분획을 이번에는 아세토니트릴 구배가 동일한 칼럼에서 재크로마토그래피하였으며 부분적으로 정제된 MF가 전과 동일한 위치에서 용출되었다 (보유 시간 약 21분). 이 마지막 분획에 대해 처음 두 번의 전개와 동일한 조건 하에서 세 번째 RP 크로마토그래피 전개를 행하였다. 하나의 억제 피크가 발견되었으며, 이것은 도 15에서 볼 수 있는 용출 프로필에서 220 nm 흡수 피크의 위치와 일치하였다.

7.5 MF (래트 근육 세포의 일차 배양에서 유래한 것)의 대규모 정제

7.5.1 실험 절차

래트 근육 세포 CM을 아미콘 10 kD 멤브레인에서 한외여과하였다. 이 10 kD 여액을 예비 HPLC 칼럼에 부착된 C-18 역상(RP) 칼럼 (47 × 300 mm)에서 크로마토그래피하였다. 분획들을 HTB-38 세포를 사용한 세포 증식 검사에서 시험하였으며 활성 분획을 두번째 C18 RP 칼럼 (분석용: 4 × 250 mm)에서 재크로마토그래피하였고, 활성 분획을 위와 같이 동정하였다.

7.5.2 정제된 MF 분획의 활성

7.5.1절의 마지막 단계에서 얻어진 물질을 "MF-P"로 지칭하고 처음 RP 칼럼에서 얻어진 물질을 "MF-SP" (이 분획은 5.1절에서 시험된 것이기도 함)라고 지칭하였다. 조 조정 배지(CM), MF-P 및 MF-SP 분획과 함께 한외여과의 잔류물(R)의 활성을 하기 표 IV에 나타내었다 (활성은 u/ml로 표현됨: 1 u는 증식 검사에서 50% 억제를 일으키는 물질의 양으로 정의함).

위에서 알 수 있는 바와 같이, 시험된 모든 분획이 시험된 세포주의 증식을 억제하는 데 활성이었다. 여기에는 R 분획 역시 포함되며, 여기서 활성인 인자는 미국 특허 제5,242,692호에서 개시된 종약 억제 물질일 가능성이 있다.

7.6. L-8 세포주에서 유래한 MF의 HPLC에 의한 특성파악

7.6.1-7.6.5 절에서는 일부 대표적인 HPLC 결과들을 설명한다. 7.6.1.에서는 MF의 정제를 위한 예시적인 방법을 제시한다.

7.6.1 역상(RP) HPLC

PBS 중의, 3,000 달톤 MF 한외여액 160 ml (근육 세포를 PBS와 함께 8 시간 인큐베이션한 후에 얻은 것)를 RP-HPLC 칼럼 (C-18)을 통해 크로마토그래피하였다. 용출액은 B-pure (등록상표) (Barnstead, 미국 아이오와주 듀부크 소재)에서 제조한 HPLC 등급 물 및 HPLC 등급 아세토니트릴 (G.T. Baker, 미국 소재)의 구배였다. 용출액 구배는 30 분의 기간에 걸친 0% 아세토니트릴에서 60% 아세토니트릴 사이였다. 유속은 100 ml/분이었다. 2분짜리 분획 (각각 200 ml로 이루어짐)을 수집하였다.

얻어진 HPLC 분획 각각의 20 ml를 농축 원심분리기에서 증발건조시킨 다음 건조된 분획을 이번에는 100 ㎕의 물에 현탁시키고, 다음으로 다시 증발건조시킨 후 2 ml PBS에 용해시키고, 그 다음 각 분획에서 취한 0.2 ml를 시험 세포를 함유한 마이크로웰에 가함으로써 세포 계수 검사에서 증식 억제 활성에 대해 분획들을 시험하였다.

도 16 및 17은 두 개의 다른 전개에서 각종 분획의 활성을 보여준다. 두 가지 경우 모두의 결과는 도 16의 분획 5 및 6에, 그리고 도 17의 분획 8-12에서 용출된 특이적인 억제의 존재를 보여준다.

도 16의 분획 5 및 6을 합치고, 45℃에서 증발시키고, 물 5 ml에 용해시키고, 튜브로 옮긴 다음 다시 진공 중에서 건조시키고, 물 2 ml에 용해시킨 다음 멸균하였다. 이들 농축된 분획 1 ml를 20 분 이내의 100% 물과 60% 아세토니트릴 사이의 전개액 구배로 분석 RP-HPLC (C-18) 칼럼에서 크로마토그래피하였으며, 유량은 1 ml/분이었다. 1 분 분획 (각 1 ml)을 수집한 다음 건조시키고, 5% HS를 함유한 RPMI 0.4 ml에 용해시킨 후 멸균하였다. 각 세포 함유 웰에 0.15 ml를 가하였다 (활성은 세포 계수 검사로 측정함). 대조를 위해 PBS 용액을 HPLC로 분획화하고 비슷한 방식으로 활성을 검사하였다.

여러 용출된 분획의 활성을 도 18에 나타내었다. 이들 결과는 분획 15에 특이적인 억제가 존재함을 지시한다.

7.6.2 수퍼덱스 칼럼을 사용한 HPLC

도 17의 활성 분획들을 두개의 합친 분획으로 나누었는데 "FRI"으로 지칭된첫번째 분획은 튜브 6-8로부터 1200 ml, 튜브 8-9로부터 550 ml, 튜브 9-10으로부터 300 ml, 그리고 튜브 10-11로부터 30 ml를 합한 것에서 얻었고, "FR2"로 지칭된 두번째 분획은 튜브 9-10으로부터 250 ml, 튜브 9-11로부터 520 ml, 그리고 튜브 11-12로부터 600 ml를 합하여 얻은 것이다. FR1 및 FR2 각각을 건조시키고 증류수 10 ml에 용해시켰다. 원심분리 후에 불용성 침전이 형성되었으므로, 이들 분획을 10 ml (FR1의 경우) 및 5 ml (FR2의 경우)의 PBS로 더 추출하였다. 2차 추출후에까지도 상당한 침전이 남아있었다.

이 결과는 대부분의 활성이 FR1에 존재하는 것을 보여주었으며, FR2는 FR1의 활성의 약 15-20%만을 가졌다. 불용성 침전의 PBS 추출물은 FR1에 비교하면 약 4%의 활성만을 나타내었다.

FR2 2 ml를 건조시키고 물 0.4 ml에 용해시켰다. 0.2 ml를 PBS와 평형을 이룬 수퍼덱스 칼럼에 가하였다. 칼럼을 1 ml/분으로 전개시키는데, PBS를 전개액으로 하고 1 ml 분획을 수집하였다. 수집은 분리 개시 후 0.3 분에 시작하였다. 용출된 분획들을 멸균하고 0.2 ml를 각 웰에 가하였다.

수퍼덱스 칼럼에서 용출된 여러 분획들의 억제를 도 19에 보였다. 분획 18-22에서 특이적인 억제를 볼 수 있다. 분획 18-22를 합치고 동일한 조건 하에서 동일한 칼럼에서 재크로마토그래피하였다. 재크로마토그래피 결과는 이들 분획 내에 3 가지 이상의 활성 물질 ("MF들")의 혼합물이 존재할 가능성을 지시하였다.

결과가 FR1이 MF 함량에 있어서 FR2에 비하면 약 10 배 더 농축된 것을 지시하는 것으로 보이기는 하지만, FR1에서도 비슷한 용출 프로필이 얻어졌다.

7.6.3 수퍼덱스 HPLC에 이은 분석 RP-HPLC

분획 FR1과 FR2를 합치고 1 ml 분량씩을 분석 RP-HPLC (C-18) 칼럼에 가하였다. 1 ml 분획을 수집하고, 건조시킨 다음 5% HS를 함유한 RPMI 0.4 ml에 용해시키고, 이 용액 0.5 ml를 각 세포함유 웰에 가하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다. 여기서 볼 수 있는 바와 같이, 튜브 16에서 한 개의 예리한 활성 피크가 존재한다. 또한, 튜브 4에도 낮은 억제 활성이 있었다. 이들 결과는 근육 세포 CM에 2 가지 이상의 종양 증식 억제 물질이 있을 수도 있다는 것을 지시한다.

7.6.4 크기 배제(SE) HPLC

예비 RP-HPLC에서 나온 분획 6-8 ("A"), 8-10 ("B"), 10-12 ("C") 및 12-14("D")를 폴리히드록시에틸 아스파트아미드(PolyHYDROCYETHYL-A (등록상표), PolyLC 제조)로 피복된 실리콘 겔 입자를 함유한 칼럼에서 개별적으로 크로마토그래피하였다. 전개액은 50 μM 포름산 수용액인 이소크라틱 용액(즉, 구배가 없음)이었다.

0.5 ml 분획을 수집하고, 건조시킨 다음 PBS 0.8 ml에 용해시켰다. 그 다음 각 분획 0.15 ml를 각 세포 함유 웰에 가하였다. 크로마토그래피 결과는 도 21에서 볼 수 있다. 이 결과는 분획 6-8에는 튜브 32의 약한 활성일 수도 있는 것을 빼고는 활성이 전혀 없었다는 것을 보여준다. 분획 B에서는 명확하고 폭넓은 활성 피크를 튜브 29-37에서 볼 수 있다. 분획 C에는 튜브 21-23에서 하나, 튜브 28-31에서 하나, 이렇게 두 개의 명확한 활성 피크가 존재하였다. 마지막으로, 분획 D에서는 튜브 21-22에서 단 하나의 활성 피크가 있는 것으로 보인다.

7.6.5 SE-HPLC에 이은 수퍼덱스 HPLC

SE 칼럼에서 용출된 활성 분획을 합치고 고진공 하의 농축 원심분리기 (Hetovac (등록상표) VR-1, 덴마크 Heto사 제조)에서 건조시키고, 0.4 ml에 용해시킨 다음 0.2 시료를 PBS와 평형을 이룬 수퍼덱스 칼럼에서 분리하였다. 1 ml 씩의 분획을 수집한 후 0.2 ml를 각 세포 함유 웰에 가하였다.

도 22A에서 볼 수 있는 바와 같이, 분획 B의 SE-HPLC 튜브 29-33은 수퍼덱스 칼럼에서 용출된 튜브 21-24에서 억제 활성을 보였다. 이 활성의 프로필은 2가지 이상의 활성 물질이 존재하거나 활성 물질이 몇 가지 형태로 나타날 수 있는 가능성을 지시할 수도 있다.

도 22B는 17-21분에 용출되는 특이적인 억제 피크를 보여준다.

7.6.6 친수성 상호작용 HPLC

아래의 도 25에 나타낸 크기 배제 HFLC의 분량에서 나온 분획 27-32를 함께 모으고, 건조시킨 다음 물 0.2 ml에 용해시켰다. 각 0.085 ml의 두 분량을 친수성 상호작용(CHO) HPLC 칼럼 (PolyGLYCOPLEX (등록상표), Poly-LC사 제조) 내에 주입하였다. 그 다음 물 중의 70% 아세토니트릴로 이루어진 용액을 사용하여 1 ml/분의 전개 속도로 컬럼을 전개하였다. 1 ml 분획을 수집하고, 건조시킨 다음 PBS 0.6 ml에 용해시키고, 이어서 0.1 ml 분획을 96 마이크로 적정기 플레이트의 각 웰에 가하고 염수 계수 검사법으로 시험하였다 (3.1.3절).

이 칼럼에서 용출된 용액의 활성 프로필을 도 23에서 볼 수 있다. CHO 분획 중 최고로 특이적인 억제가 분획 2-8에서 발견되었으나 이차적인 억제 피크를 분획10에서도 볼 수 있다는 것을 알 수 있다. 일부 약한 활성은 분획 21-30에 있는 넓은 피크에서도 관찰할 수 있다.

8. MF의 정제

8.1 절차

MF의 정제를 위해 다음 단계로 이루어진 방법을 개발하였다.

(a) 조정 배지의 제조:

조정 배지는 1.1.2절에 기술된 바와 같이 PBS 중의 L-8 세포에서 제조한다.

(b) 한외 여과:

조정 배지를 2절에 기술된 바와 같이 분자량 차단치가 3,000 달톤인 멤브레인을 통해 한외여과시킨다.

(c) 예비 RP-HPLC:

3,000 달톤 한외여액을 다음에는 예비 RP-HPLC, C-18 칼럼에서 크로마토그래피한다. 대개는 칼럼을 먼저 20 분 동안 HPLC 등급 물로 세척한 다음 3,000 달톤 한외여액 200 ml를 칼럼에 적재하고 추가로 10 분 동안 물로 세척하기를 계속한다. 그 다음 칼럼을 30 분에 걸쳐 0% 아세토니트릴에서 60% 아세토니트릴 사이의 아세토니트릴:물 구배로 전개시킨다. 전개액의 속도는 약 100 ml/분이다. 활성 성분은 약 8-14 분 사이에 칼럼에서 나오는 분획에 용출된다.

그 다음 활성 성분을 함께 모은 다음 모아진 분획을 회전 증발기(Rotovap (등록상표), 스위스 B

chi사 제품)에 이어서 농축 원심분리기로 농축시켰다.

(d) 분석 RP-HPLC:

모아지고 농축되고 건조된 분획을 다음에는 물 5 ml에 용해시키고, 진공 중에서 다시 건조시킨 다음 물 2 ml에 용해시킨다. 이 농축된 분획 1 ml를 분석 RP-HPLC C-18 칼럼에서 20 분에 걸친 0% 아세토니트릴에서 60% 아세토니트릴사이의 아세토니트릴:물 구배를 전개액으로 사용하여 유속 1 ml/분으로 크로마토그래피한다. 칼럼에 적재한 다음 5분 동안 물로 칼럼을 세척한다. 이 세척에 이어 아세토니트릴 구매로 칼럼을 전개시킨다.

활성 분획은 12-19 분 사이에 칼럼에서 나오는 분획에 용출된다. 그 다음 활성 분획을 농축 원심분리기에서 농축 및 건조시킨다.

(e) 크기 배제 크로마토그래피:

건조된 분획을 다음에는 포름산과 혼합하고, 이 용액의 시료 200 ml를 7.6.4절에서 설명한 크기 배제 칼럼 상에 적제하며, 전개액 및 전개 조건 역시 상기 절에 설명된 바와 같다. 활성 성분은 27-32분 후에 주로 용출된다.

심지어는 위에 언급된 것들과 유사한 규격의 칼럼과 같은 다른 칼럼들, 그리고 용출 조건의 경미한 변동에 의해서도 상이한 용출 프로필이 얻어질 수 있으며 그에 따라 활성 분획이 위에 기재된 보유 시간과는 다른 보유 시간 후에 용출될 수도 있다. 그러나, 위에 설명된 대로 각 분획의 억제 활성을 시험함으로써 당업자는 부당한 어려움이 전혀 없이, 본 발명의 GR을 함유한 정제된 분획을 파악하고 단리하는 것이 가능할 것이다.

8.2 정제 결과

도 24는 분석 RP-HPLC에서 용출된 분획들의 억제 활성 프로필 및 크기 배제HPLC에서 용출된 분획의 활성 (도 25)을 보여주는데, 정제 과정은 위 8.1절에서 설명한 바와 같다.

9. NMR-HF의 가능한 올리고사카라이드 특성

도 25에 보인 것과 같은 크기 배제 칼럼에서 용출된 활성 분획을 건조시킨 다음 메탄올에 용해시켰다 (건조에 이은 메탄올에의 용해를 연속 3회 반복하였음). 그 다음 메탄올 추출물을 증발건조시키고, 제제를 중수소 메탄올 0.5 ml에 재용해시켰다. 메탄올 추출 후의 잔류물은 중수 0.5 ml에 용해시켰다.

NMR 스펙트럼은 도 26에서 볼 수 있다. 여기서 보이는 바와 같이, 물 분획의 NMR 스캔 결과는 한 개의, 아마도 무의미한 피크를 보이는 반면, 메탄올 추출물의 NMR 스캔 결과는 3-4 ppm의 자력장에서 몇 개의 피크를 보였다. 이들 피크는 올리고사카라이드에 전형적인 C-OH 기의 양성자의 특징적인 것이다.

이들 결과는 MF가 올리고사카라이드일 가능성을 제시한다.

10. 백혈구 CM의 3,000 달톤 한외여액 및 그 분획의 활성

백혈구 CM에서 얻은 3,000 달톤 한외여액의 활성을 시험하고, L-8 CM에서 얻어진 8,000 달톤 한외여액의 경우와 비교하였다. 그 결과를 하기 표 V에 나타내었다.

백혈구 CM에서 얻은 3,000 달톤 한외여액 200 ml를 위에 설명된 바와 같이 예비 RP-HPLC에서 분리하였다 (7.6.6절 참조). 200 ml씩의 분획을 수집하였다. (200 중) 10 ml 중량을 건조시키고 0.6 ml에 용해시켰다. 그 후 0.1 ml를 각 웰에 가하였다.

비교를 위해, L-8 CM에서 얻은 3,000 달톤 한외여액을 동일한 방식으로 분획화하였다.

결과는 하기 표 VI에 나타내었다.

위에서 볼 수 있는 바와 같이, 두 가지 분취액이 모두 분획 4-6에서 억제 피크를 보인다.

Claims (20)

1. (a) i) 근육 세포 또는 백혈구에서 생산되거나, 분비되거나, 흘러나오며,

   ii) 분자량이 약 3,000 달톤 미만이고,

   iii) 단백질계가 아니며,

   iv) 수용성이고,

   v) 열에 안정하며,

   vi) 세포의 증식을 억제하는 데 생물학적으로 활성인 특성을 갖는 물질인 저분자량 내인성 세포 성장 조절제(LMW-EGR)인, 실질적으로 정제된 세포 성장 조절제(GR).
2. 제1항에 있어서, 상기 LMW-EGR이 근육 세포 또는 백혈구에서 생산되거나, 분비되거나, 흘러나오는 것인 세포 성장 조절제.
3. 제1항에 있어서, 종양 세포의 증식, 또는 자극을 받은 림프구의 증식을 억제하는 데 생물학적으로 활성인 세포 성장 조절제.
4. 제1항에 있어서, 비종양성 세포의 증식에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 종양 세포의 증식을 억제하는 데 생물학적으로 활성인 세포 성장 조절제.
5. 제4항에 있어서, 골수 세포의 증식에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 종양 세포의 증식을 억제하는 데 생물학적으로 활성인 세포 성장 조절제.
6. 제4항에 있어서, 비종양성 림프구의 증식에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 림프종 세포의 증식을 억제하는 데 생물학적으로 활성인 세포 성장 조절제.
7. 제1항에 있어서, 상기 LMW-EGR이 배지 안에서 근육 세포 또는 백혈구의 성장에 의해 조정된 배지에서 얻을 수 있는 것인 세포 성장 조절제.
8. 제1항에 있어서, 분자량이 약 2,000 달톤 미만인 세포 성장 조절제.
9. 제8항에 있어서, 분자량이 약 500 달톤 이하인 세포 성장 조절제.
10. 제1항에 있어서, 상기 LMW-EGR이 L-8로 표시되고 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁 번호 CRL 1769로 기탁된 래트(rat) 근육 세포주에서 분비되거나 흘러나오는 것인 세포 성장 조절제.
11. 치료 유효량의 제1항에 따른 세포 성장 조절제 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
12. 치료 유효량의 제1항에 따른 세포 성장 조절제 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 면역계가 감작된 상태의 질병의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
13. 제11 또는 12항에 있어서, 경구 투여용 제약 조성물.
14. (a) 사람을 제외한 포유 동물에서 취한 체액, 또는 상기 포유 동물에서 채취한 세포의 배양물에서 취한 상징액인 시험액을 얻는 단계,

    (b) 시험액 중의 제1항에서 정의한 LMW-EGR의 농도를 측정하는 단계,

    (c) 상기 농도를 건강한 포유동물에서 상기 LMW-EGR의 평균 농도와 비교하는 단계(평균 미만의 농도는 상기 포유동물이 암에 걸렸거나 암에 걸릴 위험이 높다는 것을 지시함)를 포함하는, 개인의 암적 상태의 진단, 또는 사람을 제외한 포유동물의 암에 걸릴 위험의 측정 방법.
15. (a) 세포가 주변 배지 중으로 세포 성장 조절제를 생산하거나, 분비하거나, 흘리는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계;

    (b) 세포 배양물의 상징액을 수집하는 단계;

    (c) 분자량이 약 3,000 달톤을 넘는 물질을 함유하는 상징액 분획과 분자량이 약 3,000 달톤 미만인 물질을 함유하는 상징액 분획을 분리하고, 후자를 선택하는 단계를 포함하는, 실질적으로 정제된 세포 성장 조절제의 제조 방법.
16. 제15항에 있어서, (d) 선택된 분획을 추가의 크로마토그래피 정제 과정으로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
17. (a) 근육 세포 또는 백혈구를 배양하는 단계,

    (b) 세포 배양물에서 상징액을 수집하는 단계,

    (c) 분자량 차단치가 약 500-3,000 달톤인 멤브레인을 통해 상징액을 여과하는 단계,

    (d) (c) 단계에서 얻어진 여액을 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼을 통해 크로마토그래피하고, 종양 세포에 대해 성장 억제 활성을 나타내는 분획을 선택하는 단계를 포함하는, 실질적으로 정제된 세포 성장 조절제의 제조 방법.
18. 제17항에 있어서, (e) (d) 단계에서 얻은 선택된 분획을 RP-HPLC 칼럼으로 재크로마토그래피하고, 종양 세포에 대해 성장 억제 활성을 나타내는 분획을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
19. 제17항에 있어서, (e) (d) 단계에서 얻어진 선택된 분획을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 크로마토그래피하고, 종양 세포에 대해 성장 억제 활성을 나타내는 분획을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
20. 진단 유효량의 제1항에 따른 세포 성장 조절제를 포함하는, 개인의 암적 상태의 진단 또는 개인의 암에 걸릴 위험성 측정용 조성물.

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