DE69526096T2

DE69526096T2 - Wachstumsregulator

Info

Publication number: DE69526096T2
Application number: DE69526096T
Authority: DE
Inventors: Pnina Fishman
Original assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Current assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 2002-09-26
Anticipated expiration: 2015-09-23
Also published as: FI971190A; CN1164190A; MX9702174A; CN1146432C; EP0782452A1; IL115415A0; US5962331A; RU2199327C2; FI113153B; FI971190A0; JP3778366B2; BR9509154A; IL111021A0; EP0782452B1; AU3681695A; IL115415A; CA2198727A1; DK0782452T3; KR100392996B1; AU692931B2

Description

Fachgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der Human- und Veterinärmedizin und betrifft neue Substanzen, die auf das Wachstum und die Proliferation von Zellen wirken. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Substanzen zum Herstellen eines Medikaments zum Verhindern oder Behandeln von Krankheiten. Ferner betrifft die Erfindung ein in-vitro-Verfahren zum Diagnostizieren von Krankheiten oder zum Screening nach Individuen, die für eine Krankheit anfällig sind oder die eine Veranlagung für eine Krankheit haben.

Glossar

In der vorliegenden Beschreibung werden der Einfachheit halber mehrere geprägte Begriffe verwendet. Im folgenden werden einige dieser Begriffe sowie die Art und Weise erklärt, wie sie im Zusammenhang der vorliegenden Beschreibung zu verstehen sind.
"Zellwachstums-Regulator (GR)" - ein Mittel, das auf das Wachstum oder die Proliferation von Zellen wirkt. Die Wirkung des GR auf das Wachstum oder die Proliferation kann entweder darin bestehen, das Wachstum oder die Proliferation von Zellen zu fördern, oder darin, das Wachstum oder die Proliferation von Zellen zu hemmen.
"Endogener GR (EGR)" - ein Mittel, das von einer Zelle innerhalb des Körpers ausgeschieden oder abgestoßen wird und das auf das Wachstum oder die Proliferation der gleichen Zelle oder anderer Zellen innerhalb des Körpers wirkt.
"Zytostatischer GR/EGR" - ein GR/EGR, dessen Wirkung darin besteht, das Wachstum oder die Proliferation von Zellen anzuhalten oder deutlich zu verlangsamen, wobei dies im wesentlichen ohne jegliche Zerstörung der Zelle erfolgt. Zytostatische EGRs wirken typischerweise, indem sie den Zellzyklus in einer Phase des Zellzyklus anhalten.
"EGR mit einem niedrigen Molekulargewicht (LMW-EGR)" - ein EGR, der ein Molekulargewicht unter etwa 3000 Dalton aufweist.
"Muskelfaktor (MF)" - ein LMW-EGR, der von Muskelzellen ausgeschieden oder abgestoßen wird.
"Leukozyten-Faktor (WBF)" - ein LMW-EGR, der von Leukozyten ausgeschieden oder abgestoßen wird.
"Ursprungszelle" - eine Zelle, die den EGR ausscheidet oder abstößt. "Zielzelle" - eine Zelle, auf die der EGR wirkt.
"Konditioniertes Medium (CM)" - ein Medium, das durch das Wachstum von Ursprungszellen darin konditioniert wurde. Ein CM umfasst somit den durch die Ursprungszellen ausgeschiedenen EGR.
"Muskelzellen-CM" und "Leukozyten-CM" - ein Medium, das durch das Wachstum von Muskelzellen bzw. Leukozyten konditioniert wurde. Das Muskelzellen-CM und das Leukozyten-CM umfassen den MF bzw. den WBF.
Die vorstehenden Begriffe sollten auch mit Bezug auf die nachstehende Beschreibung ausgelegt und verstanden werden.

Stand der Technik

Enorme Forschungsanstrengungen wurden in die Entdeckung, Charakterisierung, in biologische Tests und in die klinische Entwicklung von EGRs, die als "Zytokine" bekannt sind, investiert. Alle bisher entdeckten Zytokine sind proteinartige Substanzen mit einem Molekulargewicht im Bereich von mehreren tausend Dalton bis mehreren zehntausend Dalton. Die verschiedenen Zyktokine können zwar eine unterschiedliche Herkunft und unterschiedliche Zielzellen sowie außerdem verschiedene Arten von Aktivitäten haben, sie haben jedoch die eine Gemeinsamkeit, dass sie nämlich alle proteinartige Substanzen sind.
Es gibt Berichte, dass bei Versuchstieren das Wachstum und die Progression von Tumoren durch körperliche Bewegung signifikant gehemmt wird (S. A. Hoffman et al., Cancer Res. (1962), 22: 597-599; V. E. Baracos, Chem. J. Physiol. Pharmacol. (1989), 67: 864-870). A. Szent-Gyorgyi et al. (Science (1963), 140: 1391-1392) beschrieben, dass Extrakte aus verschiedenen Geweben, einschließlich Thymus, Aorta, Muskel und Sehne, zwei Substanzen enthalten, wobei die eine das Wachstum von Aszitestumoren bei Mäusen fördert (und von ihnen als "Promine" bezeichnet wurde) und die andere ein solches Wachstum hemmt (und von ihnen als "Retine" bezeichnet wurde). Das "Retine" wurde dort als eine Substanz mit einem niedrigen Molekulargewicht beschrieben, das relativ instabil ist, so dass es sich bei Raumtemperatur in etwa einer Woche zersetzt. Außerdem zeigte sich aufgrund der Art der Isolierung, dass die Substanz lipophil ist. Die Hemmung von Aszitestumorzellen durch Muskelzellextrakte wurde auch von T. Namba et al. (British J. of Exp. Pathol. (1968), 49: 294-301) beschrieben, wobei die im Muskelextrakt gefundene Hemmwirkung durch eine Silikonmembran dialysierbar war. Durch Erhitzen des Extrakts wurde die Aktivität beeinträchtigt, während das Erhitzen des Dialysats keine Wirkung zeigte.
E. Watta et al. (US-Patent Nr. 4 708 948) beschrieben ein Polypeptid mit einem hohen Molekulargewicht, das das Tumorwachstum hemmt und das auch aus Muskelzellen erhalten wurde. M. Djaldetti et al. (US-Patent 5 242 692) beschrieben einen Faktor, der aus Muskelzellen stammte und der die Proliferation von Tumorzellen hemmt. Dieser Faktor, der aus dem Überstand einer Muskelzellkultur isoliert wurde, zeigte bei der Gel- Elektrophorese ein offensichtliches Molekulargewicht im Bereich von 25 000 bis 30 000 Dalton.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung von neuen Substanzen, die entweder durch Muskelzellen oder durch Leukozyten ausgeschieden, abgestoßen oder produziert werden und die biologisch wirksam sind, indem sie die Proliferation von Tumorzellen hemmen, im wesentlichen ohne die Proliferation normaler nicht-tumoröser Zellen zu beeinflussen. Außerdem wurde gefunden, dass diese Substanzen wirksam die Proliferation von stimulierten Immunzellen hemmen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem ihrer Aspekte einen im wesentlichen gereinigten Zellwachstums-Regulator bereit, der entweder (a) ein LMW-EGR ist, der ein Faktor mit den folgenden Merkmalen ist:
i. er wird durch Zellen, insbesondere Muskelzellen oder Leukozyten, produziert, von ihnen ausgeschieden oder abgestoßen,
ii. er hat ein Molekulargewicht von weniger als etwa 3000 Dalton,
iii. er ist nicht proteinartig,
iv. er ist in Wasser löslich,
v. er ist hitzestabil, und
vi. er ist biologisch wirksam, indem er die Proliferation von Zellen hemmt, insbesondere indem er die Proliferation von Tumorzellen oder die Proliferation von stimulierten Lymphozyten hemmt; oder der
(b) ein Faktor ist, der ein Derivat des Faktors nach (a) ist und der biologisch wirksam ist, indem er die Proliferation von Zellen hemmt.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Substanz zum Herstellen eines Medikaments zum Verhindern oder Behandeln von Krankheiten bereit. Gemäß diesem Aspekt wird die Verwendung der Substanz zum Herstellen eines Medikaments zum Verhindern einer Krankheit oder Störung bereitgestellt, die das Verabreichen an ein Individuum umfasst, das eine wirksame Menge des GR benötigt. Aufgrund der Wirkungsart des GR, die Proliferation zu hemmen, wird er an das Individuum typischerweise über einen gewissen Zeitraum in regelmäßigen Abständen verabreicht. Außerdem wird gemäß diesem Aspekt eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine bestimmte Menge des GR enthält. Die Zusammensetzung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung sein, die eine therapeutisch wirksame Menge des GR in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann so formuliert werden, dass sie zum Verhindern einer Krankheit oder Störung eingesetzt werden kann, oder sie kann so formuliert werden, dass sie zum Behandeln einer Krankheit oder Störung verwendet werden kann. Die Zusammensetzung kann auch eine nicht verschreibungspflichtige Zusammensetzung darstellen; z.B. eine "neutrazeutische" Zusammensetzung, einen Nahrungsmittelzusatzstoff, ein Gesundheitskost-Präparat usw.. Schließlich wird gemäß diesem Aspekt außerdem die Verwendung des GR zum Herstellen solcher Zusammensetzungen bereitgestellt.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung des GR zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln oder zum Verhindern von Krebs, oder zum Hemmen (Ausschalten oder Reduzieren) der Aktivität von stimulierten Lymphozyten, eingebunden in ein Schema zum Behandeln oder Verhindern verschiedener Leiden, die durch ein hyperaktives Immunsystem zustande kommen, z.B. eine Behandlung, die gegen eine Organabstoßung wirken soll, eine Behandlung von Autoimmunkrankheiten usw..
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Diagnose von Krebs oder eines krebsartigen Zustands eines Individuums, oder zum Screening nach Individuen bereitgestellt, die für Krebs anfällig sind oder eine Veranlagung für die Entwicklung einer Krebserkrankung haben, umfassend das Bestimmen des Spiegels des LMW-EGR in einer Körperflüssigkeit, die aus dem Individuum erhalten werden kann, oder in einem Überstand einer Kultur von Zellen, die aus dem Individuum erhalten werden können.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen des GR der Erfindung, das auf einer Reinigung von aktiven Fraktionen aus geeigneten konditionierten Medien beruht.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung von neuen EGRs, die ein niedriges Molekulargewicht aufweisen. Der Begriff "niedriges Molekulargewicht" sollte als ein Molekulargewicht verstanden werden, das durch Ultrafiltration bestimmt wird und unter etwa 3000 Dalton liegt, das insbesondere unter etwa 2000 Dalton und vorzugsweise bei etwa 500 Dalton oder darunter liegt. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass diese Molekulargewichte nur ungefähre Angaben darstellen und nicht als exakte Werte angesehen werden können.
Es wurde gefunden, dass die LMW-EGRs der Erfindung nicht proteinartig sind, d.h. sie sind weder Proteine noch Peptide noch irgendwelche andere Substanzen, die eine Protein- oder Peptideinheit aufweisen, die in der biologischen Aktivität der Substanz eine Rolle spielt. (Durch die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung lässt sich die Möglichkeit nicht ausschließen, dass der LMW-EGR in einer Form vorliegen kann, in der er an eine Peptid- oder Proteineinheit gebunden oder komplexiert ist, die in der Aktivität des LMW-EGR als Wachstumsregulator jedoch keine oder nur eine begrenzte Rolle spielt).
Die LMW-EGRs gemäß der vorliegenden Erfindung wurden bisher aus einem Muskelzellen-CM und aus einem Leukozyten-CM erhalten. Man kann jedoch davon ausgehen, dass erfindungsgemäße LMW-EGRs auch aus anderen Ausgangsmaterialien erhalten werden können. Die vorliegende Erfindung ist somit nicht auf den MF und den WBF beschränkt. Vielmehr wird der Fachmann anhand der Ergebnisse der vorliegenden Erfindung und anhand von herkömmlichen Erfahrungen und verfügbarem Wissen keine Schwierigkeiten haben, andere LMW-EGRs zu finden, die im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Es wurde gefunden, dass der MF und der WBF tumorspezifische zytostatische EGRs sind. Sie besitzen eine einzigartige biologische Aktivität, indem sie spezifisch das Wachstum und die Proliferation von Tumorzellen hemmen, ohne auf normale nicht- tumorbildende Zellen eine merkliche Wirkung auszuüben. Außerdem wurde gefunden, dass sowohl der MF als auch der WBF Tumor-unspezifisch (d.h., dass sie das Wachstum und die Proliferation von verschiedenen Tumorzellen wirksam hemmen) und Artunspezifisch sind (wobei sie eine Aktivität zeigen, die das Wachstum und die Proliferation von Tumorzellen aus verschiedenen Tierarten hemmt).
Mit anderen Worten haben der MF und der WBF ein breites Wirkungsspektrum, wobei sie das Wachstum und die Proliferation von Tumorzellen hemmen. Außerdem machen diese Ergebnisse gemäß der vorliegenden Erfindung deutlich, dass ein MF oder ein WBF, der aus einer bestimmten Tierart, insbesondere aus einer Säugerart, stammt, für die Krebsbehandlung eines Tieres einer anderen Art, insbesondere einer Säugerart, eingesetzt werden kann.
Es sollte darauf hingewiesen werden, dass zwar gefunden wurde, dass der MF und der WBF zytostatische Mittel sind, dass sie jedoch auf Zellen, insbesondere nach einer längeren Exposition, auch eine gewisse zerstörerischen Wirkung ausüben können. Z.B. können die Ziel-Tumorzellen nach einer längeren Exposition gegenüber dem MF oder dem WBF sowie gegenüber ihren Derivaten möglicherweise absterben, z.B. als Ergebnis einer Apoptose.
Zusätzlich zur Aktivität des MF und des WBF, das Wachstum und die Proliferation von Tumorzellen zu hemmen, wurde gefunden, dass sie auch die Proliferation von Lymphozyten hemmen, wie durch die Hemmung der Lymphozyten-Antwort auf ein Mitogen und einer gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR) gezeigt wurde, dies bedeutet, dass die GRs der Erfindung möglicherweise eine immunsuppressive Wirkung haben.
Natürlich lässt sich, sobald ein LMW-EGR aus einer bestimmten Art isoliert wurde, ein homologer LMW-EGR aus einer anderen Art finden. Z.B. stammte der bisher gemäß der Erfindung erhaltene MF aus der Ratte und aus dem Menschen. Es besteht jedoch kein Zweifel, dass es möglich ist, homologe MFs auch aus anderen Arten, insbesondere Säugerarten, zu isolieren. Genauso stammt der bisher gemäß der Erfindung erhaltene WBF aus dem Menschen. Zweifellos können jedoch homologe WBFs auch aus anderen Arten, insbesondere Säugerarten, erhalten werden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch solche Homologe.
Der GR der vorliegenden Erfindung kann ein einzelnes Molekül, eine Gruppe von Molekülen, die in additiver oder synergistischer Art zusammenwirken, um das Wachstum und die Proliferation von Zellen zu beeinflussen, oder ein Molekülkomplex sein, der eine solche Aktivität aufweist.
Sobald der LMW-EGR isoliert wurde, können z.B. durch chemisches Modifizieren Derivate davon hergestellt werden, die eine biologische Aktivität besitzen, die ähnlich ist wie die des LMW-EGR. Die Derivate mit einer ähnlichen biologischen Aktivität wie ein LMW-EGR oder Homologe zu einem solchen LMW-EGR können identifiziert werden, indem z.B. die gleichen biologischen Tests verwendet werden, die zum Charakterisieren des LMW-EGR eingesetzt werden. Im Fall des MF und des WBF, die wirksam das Wachstum oder die Proliferation von Tumorzellen hemmen, können z.B. Derivate und Homologe gefunden werden, indem synthetische Derivate oder fraktionierte cm aus anderen Arten, je nach dem vorliegenden Fall, auf eine Aktivität, das Wachstum oder die Proliferation von in-vitro-gezüchteten Tumorzellen zu hemmen, oder auf die Fähigkeit, die gemischte Lymphozyten-Reaktion (MLR) zu hemmen, getestet werden. Der Fachmann ist zweifellos in der Lage, den jeweils geeigneten biologischen Test auszuwählen.
Das Derivat kann ein Molekül mit einer ähnlichen Molekülstruktur wie der LMW- EGR sein, bei dem jedoch eine oder mehrere chemische Gruppen durch eine andere substituiert wurde/n; es kann ein Reduktions- oder Oxidationsprodukt des LMW-EGR usw. sein.
Der GR der Erfindung kann für verschiedene therapeutische Zwecke eingesetzt werden, wobei er in einer therapeutisch wirksamen Menge an ein Individuum verabreicht wird, das eine solche Behandlung benötigt. Eine bevorzugte therapeutische Indikation, für die der GR eingesetzt werden kann, besteht im Behandeln oder Verhindern von Krebs. Zum Behandeln kann der GR an Individuen verabreicht werden, die bereits eine Krebserkrankung durchgemacht haben, um z.B. ein Rezidiv der Krebserkrankung zu verhindern. Eine solche Behandlung ist typischerweise eine Nachbehandlung einer Initialtherapie, die darauf ausgerichtet ist, den Krebs zu entfernen oder zu zerstören, wie Chemotherapie, Strahlentherapie oder Operation. Als Prophylaxe kann der GR an krebsfreie Individuen oder an Individuen vor der Diagnose einer Krebserkrankung verabreicht werden, insbesondere an Individuen mit einem hohen Risiko, die für eine Krebserkrankung anfällig sind oder die eine Veranlagung für die Entwicklung einer Krebserkrankung haben. Solche Individuen mit einem hohen Risiko können Individuen sein, die eine genetische Veranlagung für die Entwicklung eher Krebserkrankung haben, z.B. Individuen, bei denen das Vorliegen eines von verschiedenen Genen diagnostiziert wurde, von denen man weiß, dass sie mit Krebs assoziiert sind; Individuen, bei denen in der Familie Krebserkrankungen aufgetreten sind; Individuen, bei denen ein hohes Risiko für die Entwicklung einer Krebserkrankung besteht, weil sie verschiedenen Umweltfaktoren ausgesetzt waren, wie Strahlung, Kontakt mit Karzinogenen, usw..
Aufgrund der biologischen Aktivität eines bestimmten GR, die darin besteht, die Proliferation von Zielzellen zu hemmen und nicht die Zielzellen sofort zu zerstören, wird der GR typischerweise über einen gewissen Zeitraum in regelmäßigen Abständen verabreicht. Wie jedoch vorstehend schon angedeutet wurde, besteht auch die Möglichkeit, dass die Tumorzellen nach einem längeren Stillstand ihres Wachstums eventuell absterben, so dass die Behandlung nach einem bestimmten Zeitraum beendet werden kann.
Eine weitere bevorzugte therapeutische Indikation des GR besteht darin, die Aktivität von Komponenten des Immunsystems zu hemmen. Beispiele sind die Behandlung von Autoimmunkrankheiten; die Verwendung innerhalb von Schemata der Transplantationstherapie, d.h. bei der Behandlung nach einer Transplantation, die darauf ausgerichtet ist, eine Organ- oder Gewebeabstoßung zu verhindern, usw..
Die GRs der Erfindung wurden in verschiedenen Tiermodellen getestet, z.B. in Tiermodellen für Primärtumoren, in denen ein Tumor durch eine subkutane, intramuskuläre oder intraperitoneale Inokulation von Tumorzellen induziert wird, wie auch in Tiermodellen für Metastasen, in denen ein Tumor durch eine intravenöse Inokulation von Tumorzellen induziert wird. Es wurde gefunden, dass der GR in den beiden Klassen von Modellen die Entwicklung von Tumoren wirksam hemmt. Dabei zeigte sich, dass die GRs die Tumorentwicklung sowohl bei parenteraler als auch bei oraler Verabreichung wirksam hemmten. Es ist bekannt, dass eine orale Verabreichung physiologisch viel besser toleriert wird als eine parenterale Verabreichung, weshalb eine orale Verabreichungsroute zum Behandeln oder Verhindern von Krebserkrankungen bevorzugt ist, insbesondere bei Behandlungs- oder Prophylaxeschemata, die eine Verabreichung des GR über einen längeren Zeitraum in bestimmten Abständen umfassen.
Der GR kann in eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden, die eine wirksame Menge des GR in Kombination mit einem physiologisch verträglichen Träger enthält, der mit dem GR kompatibel ist. Es wurde gefunden, dass der GR in Wasser löslich ist, und demgemäß kann ein physiologisch verträglicher Träger für die parenterale Verabreichung eine Kochsalzlösung oder für die orale Verabreichung eine zum Verzehr geeignete wässrige Flüssigkeit sein. Außerdem kann der GR für eine orale Verabreichung in verschiedene Dosierungsformen formuliert werden, z.B. Kapseln, Tabletten usw.. Ferner kann der GR auch gefriergetrocknet vorliegen und dann vor der Verwendung mit dem Träger oder dem Verdünnungsmittel gemischt werden.
Der hier verwendete Begriff »wirksame Menge" soll als eine Menge verstanden werden, die ausreichend ist, um eine gewünschte Wirkung zu erreichen. Z.B. ist im Fall einer Krebstherapie eine wirksame Menge eine Menge des GR in einem bestimmten therapeutischen Schema, die ausreichend ist, um das Wachstum und die Proliferation von Tumorzellen zu hemmen, was z.B. durch eine Abnahme der Rezidivrate oder durch eine Abnahme der Zahl der Krebsmetastasen oder durch eine Abnahme der mit der Krebserkrankung zusammenhängenden Mortalitätsrate deutlich wird. Im Fall einer Krebsprävention ist eine wirksame Menge eine Menge des GR in einem bestimmten präventiven Verabreichungsschema, die ausreichend ist, um das Wiederauftreten des primären Krebswachstums zu hemmen.
Der GR kann außer in pharmazeutische Zusammensetzungen auch noch in andere Arten von Zusammensetzungen formuliert werden, z.B. Nahrungsmittelzusatzstoff- Zusammensetzungen, "neutrazeutische" Zusammensetzungen, nicht-verschreibungspflichtige "Gesundheits"-Produkte usw..
Experimente, die gemäß der Erfindung durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass Leukozyten von Krebspatienten viel kleinere Mengen des LMW-EGR ausscheiden als Leukozyten von normalen gesunden Individuen. Somit ist es möglich, durch Bestimmen des LMW-EGR-Spiegels in einer Körperflüssigkeit (z.B. Serum, Urin usw.) oder in einem Überstand einer Kultur von Zellen, z.B. Muskelzellen oder Leukozyten, eines Individuums eine Krebserkrankung bei einem Individuum zu diagnostizieren und außerdem das Krebsstadium eines Individuums zu bestimmen. Ferner kann das Bestimmen des LMW-EGR-Spiegels in einer Körperflüssigkeit oder in dem Überstand eine Basis für das Screening nach Individuen darstellen, die für eine Krebserkrankung anfällig sind oder die eine Veranlagung für die Entwicklung einer Krebserkrankung haben. Der LMW-EGR-Spiegel kann durch einen biologischen Test bestimmt werden, wobei die Aktivität der Körperflüssigkeit oder des Überstands oder die Aktivität einer geeigneten Fraktion davon, die Proliferation von Tumorzellen zu hemmen, getestet wird. Zusätzlich zu einem solchen biologischen Test kann das Vorliegen des LMW-EGR auch durch verschiedene analytische Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann im allgemeinen per se bekannt sind und die folgende Tests umfassen: verschiedene immunologische Tests, die auf der Verwendung von LMW-EGR-spezifischen Antikörpern beruhen; Tests, die auf der Verwendung geeigneter chemischer Reagenzien, z.B. Farbreagenzien, beruhen; spektroskopische Tests oder Tests, die auf der Absorption von Strahlung, z.B. einer Licht-Absorption, beruhen; die verschiedensten chromatographischen Techniken; usw..
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reinigen eines GR der Erfindung aus einem biologischen Ausgangsmaterial bereit. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt umfasst die folgenden Schritte:
(a) Züchten von Zellen unter Bedingungen, unter denen die Zellen einen Zellwachstums-Regulator produzieren, in das sie umgebende Medium ausscheiden oder abstoßen;
(b) Gewinnen des Überstands der Zellkultur,
(c) Abtrennen einer Fraktion des Überstands, die Substanzen mit einem Molekulargewicht über etwa 3000 Dalton umfasst, von Fraktionen des Überstands, die Substanzen mit einem Molekulargewicht unter etwa 3000 Dalton umfassen, und Auswählen der Letzteren.
Die in Schritt (c) ausgewählten Fraktionen können durch verschiedene Reinigungstechniken weiter gereinigt werden, insbesondere chromatographisch, z.B. durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC).
Die Erfindung wird im folgenden durch einige Experimente erläutert, die gemäß der Erfindung durchgeführt wurden, wobei gegebenenfalls auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen wird. In diesen Experimenten werden die in-vitro- und die in- vivo-Aktivität des MF und des WBF gezeigt. Außerdem werden Reinigungs- und Charakterisierungsverfahren für den MF beschrieben. Für den Fachmann ist hieraus ersichtlich, dass diese Erläuterung den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken soll und lediglich als Beispiel des vollständigen Umfangs der Erfindung dient, der in den beiliegenden Patentansprüchen definiert ist. Der Fachmann ist aufgrund der vorstehenden und der folgenden Beschreibung zweifellos in der Lage, die Erfindung in ihrem ganzen beanspruchten Umfang durchzuführen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den Zeichnungen:
zeigen die Fig. 1 bis 9 die Wirkung des MF oder des WBF, der im Filtrat eines Muskelzellen-CM oder eines Leukozyten-CM enthalten ist, das durch eine Membran mit einem Molekülausschluss von 3000 Dalton filtriert wurde (ein solches Filtrat wird hier als "3000-Dalton-MF-Ultrafiltrat" bzw. als "3000-Dalton-WBF-Ultrafiltrat" bezeichnet). In den Figuren wurden die Zellen in Platten mit 96 Mikrovertiefungen gezüchtet und mit einem 3000-Dalton-MF-Filtrat in verschiedenen Verdünnungen inkubiert ("1" - unverdünnt, "2" - zweifache Verdünnungen, usw.). In allen Experimenten diente ein nicht-konditioniertes Medium als Kontrolle. In den Fig. 1 bis 4 und 6, 8 und 9 und teilweise in Fig. 7 wurde die Proliferation der Zellen durch den Einbau von ³H-Thymidin gemessen, wobei der gezählte Radioaktivitätswert auf der Ordinate angegeben ist. In Fig. 5 und teilweise in Fig. 7 wurde die Proliferation der Zellen durch das Zählen der Zellen gemessen, wobei die Zellzahl auf der Ordinate dargestellt ist.
Fig. 1 zeigt die Wirkung eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats, das aus einer primären Kultur von gestreiften Muskelzellen neugeborener Ratten erhalten wurde, auf die Proliferation von zwei Tumorzelllinien: B16, die eine murine Myelomzelllinie ist (Fig. 1A); HTB-38, die eine menschliche Adenokarzinom-Zelllinie ist (Fig. 1B). In dieser Figur wird die Aktivität des 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats mit der des rohen konditionierten Mediums (rohes CM) verglichen.
Fig. 2 zeigt die Wirkung eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats, das aus einer primären Kultur von gestreiften Muskelzellen neugeborener Ratten erhalten wurde, auf zwei Typen von normalen Nicht-Tumor-Zellen: Ratten-Fibroblasten (Fig. 2A); murine Knochenmarkzellen (Fig. 2B).
Fig. 3 zeigt die Wirkung eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats, das aus einer Linie von gestreiften Muskelzellen der Ratte, L-8, erhalten wurde, auf die Proliferation von zwei Tumorzelllinien: B16 (Fig. 3A); MCA-105, eine murine Methylcholantren-induzierte Sarkomlinie der Lunge (Fig. 3B).
Fig. 4 zeigt die Wirkung eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats, das aus L-8-Zellen erhalten wurde, auf zwei normale Zelltypen: murine Knochenmarkzellen und eine primäre Kultur von Rattenfibroblasten.
Fig. 5 zeigt die Wirkung eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats, das aus einer primären Kultur von gestreiften Muskelzellen der neugeborenen Ratte erhalten wurde, auf die Proliferation von Zellen der Rattenlymphomlinie Nb&sub2;-11C, wobei ein Zellwachstumstest verwendet wurde, der auf dem Zählen von Zellen basierte. In diesem Test wurden die Zellen in der G&sup0;/G¹-Phase synchronisiert, das 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrat eines rohen CM oder ein Kontrollmedium zugegeben und anschließend das Wachstum durch Zugabe des hGH stimuliert.
Fig. 6 zeigt die Wirkung eines aus L-8-Zellen stammenden 3000-Dalton-MF- Ultrafiltrats auf die Proliferation verschiedener Tumorzelllinien. Die Ergebnisse sind in jedem Fall als Prozent der Kontrolle des jeweiligen Experiments angegeben.
Fig. 7 zeigt die Wirkung eines aus menschlichen Myoblasten stammenden 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats. Die Proliferation der B-16- und der K562-Zellen wurde mit Hilfe des Einbaus von ³H-Thymidin bestimmt; die Proliferation der NBT-Zellen wurde anhand des Zählens von Zellen bestimmt.
Fig. 8 zeigt die Wirkung eines aus menschlichen Lymphozyten stammenden 3000-Dalton-WBF-Ultrafiltrats auf die Proliferation von murinen und menschlichen Tumorzellen. Die Proliferation ist als Prozent der Kontrolle angegeben.
Fig. 9 zeigt die Wirkung eines aus L-8-Zellen stammenden 3000-Dalton-MF- Ultrafiltrats auf die Lymphozyten-Antwort auf PHA und in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR).
Fig. 10 ist eine Abbildung, die das freigelegte Peritoneum von zwei repräsentativen Mäusen zeigt, bei denen durch eine intraperitoneale Injektion von 2 · 10&sup5; MCA- 105-Zellen ein Tumor induziert wurde. Nach der Injektion wurde die Maus auf der rechten Seite zweimal täglich mit einer intraperitonealen Injektion von 0,5 ml einer MFenthaltenden Fraktion behandelt, die aus einer präparativen Umkehrphasen- (RP-) C18-Hochdruck-Flüssigchromatographie- (HPLC-) Säule eluiert worden war (diese Fraktion wird im nachstehenden Text als "MF-SP" bezeichnet (vgl. 7.6.2)); der Maus auf der linken Seite wurde ein Kontroll-RPMI-Medium injiziert.
Fig. 11 ist eine Abbildung, die das freigelegte Peritoneum von zwei repräsentativen Mäusen zeigt, bei denen durch eine intraperitoneale Injektion von 5 · 10&sup5; B-16- Melanomzellen ein Tumor induziert wurde. Die Abbildung auf der rechten Seite zeigt eine Maus, die einmal täglich mit einer i.p.-Injektion von 1 ml eines aus L-8-Zellen stammenden 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats (in PBS) behandelt worden war; die Abbildung auf der linken Seite stellt eine Maus dar, der einmal täglich ein Kontroll-PBS- Medium i.p. injiziert worden war.
Fig. 12 ist eine Abbildung, die das freigelegte Peritoneum von repräsentativen Mäusen zeigt, denen 2,5 · 10&sup5; MCA-105-Zellen intraperitoneal injiziert worden waren. Die in Fig. 12A dargestellten Mäuse stammen aus der Gruppe von Mäusen, die täglich (beginnend am Tag der Tumor-Inokulation) per os (p.o.) mit 1 ml eines aus L-8-Zellen stammenden 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats behandelt worden waren. Die in Fig. 12B dargestellten Mäuse stammen aus einer Kontrollgruppe von Mäusen, die p.o. mit einem Kontroll-RPMI-Medium behandelt worden waren.
Fig. 13 ist eine Abbildung, die isolierte Lungen von Mäusen zeigt, denen 5 · 10&sup5; B-16-Melanomzellen i.v. injiziert worden waren. Die Lungen in der oberen Reihe stammten aus einer Kontrollgruppe von Tieren, denen täglich p.o. 1 ml einer Kontroll- PBS-Lösung verabreicht worden war. Die Lungen in der unteren Reihe stammten aus der Versuchsgruppe, die aus Tieren bestand, denen täglich p.o. 1 ml eines aus L-8- Zellen erhaltenen 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats verabreicht worden war.
Fig. 14 zeigt die Wirkung eines 3000-Dalton-Ultrafiltrats, die Proliferation von drei Tumorzelllinien (B-16, SK und K-562) zu hemmen, wobei das Ultrafiltrat aus dem Überstand von Leukozyten aus dem Blut von Krebspatienten und aus dem Blut von gesunden Individuen stammte:
Fig. 14a zeigt die Proliferation der drei Zeillinien gegenüber der Kontrolle nach der Exposition gegenüber dem 3000-Dalton-Ultrafiltrat; und
Fig. 14b zeigt die gestreuten Ergebnisse, angegeben als Prozent der Hemmung (wobei die Hemmung der reziproke Wert der Proliferation ist - 100% Proliferation ist 0 % Hemmung, usw. (Ergebnisse mit mehr als 100% Proliferation wurden auch als "0%" eingeteilt)).
Fig. 15 zeigt ein 220-nm-Elutionsprofil einer MF-enthaltenden Lösung, die durch eine RP-HPLC-Säule rechromatographiert wurde (wobei die Rechromatographie genauso wie die erste Chromatographie unter Verwendung der gleichen Säule durchgeführt wurde).
Die Fig. 16 bis 21 zeigen die Aktivität verschiedener Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;-Zellen zu hemmen, wobei die Fraktinen aus verschiedenen HPLC- Säulen eluiert wurden und wobei dies durch Zählen der Zellen bestimmt wurde. In jeder dieser Abbildungen ist auf der Abszisse die Röhrchen-Nummer angegeben (hinsichtlich der Fließrate und des Volumens jedes Röhrchens vgl. nachstehend im Text). Auf der Ordinate ist die relative Zahl der Zellen im Vergleich zu einem Leerwert angegeben (wobei Zellen, die ohne Zugabe einer Lösung zum Wachstumsmedium der Nb&sub2;-Zellen gezüchtet werden, 100% sind).
Die Fig. 16 und 17 zeigen die Aktivität von verschiedenen Fraktionen, die Proliferation von NB&sub2;-Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen in zwei unterschiedlichen Läufen aus einer präparativen RP-HPLC-(C18)-Säule eluiert wurden. Die Lösungen, die auf die Säulen aufgetragen wurden, waren entweder ein aus L-8-Zellen stammendes 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrat (in PBS) oder eine Kontroll-PBS-Lösung. In Fig. 16 bedeutet die MF-enthaltende Lösung - leere Kreise (O); die Kontroll-PBS-Lösung - gefüllte Kreise ( ). In Fig. 17 bedeutet die MF-enthaltende Lösung - gefüllte Dreiecke ( ); die Kontroll-PBS-Lösung - gefüllte Kreise ( ).
Fig. 18 zeigt die Aktivität verschiedener Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;- Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen aus einer analytischen RP-HPLC-(C-18)- Säule eluiert wurden. Die Lösung, die auf diese Säule aufgetragen wurde, bestand aus einem Pool der Fraktionen 5 und 6 aus Fig. 16. MF-Lösung - gefüllte Kreise ( ); Kontrolle - leere Kreise (O).
Fig. 19 zeigt die Aktivität verschiedener Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;- Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen aus einer Superdex-Säule eluiert worden waren. Die Lösung, die auf diese Säule aufgetragen worden war, stellte eine vereinigte Lösung aus dem Eluat von Fig. 17 dar, die aus 250 ml der Röhrchen 9 bis 10, 520 ml der Röhrchen 10 bis 11 und 600 ml der Fraktionen 11 bis 12 bestand.
Fig. 20 zeigt die Aktivität verschiedener Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;- Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen aus einer analytischen RP-HPLC-Säule eluiert wurden. Die auf die Säule aufgetragene Lösung war ein Pool der Röhrchen 6 bis 12 von Fig. 17. MF-Lösung - gefüllte Quadrate ( ); Kontrolle, PBS-Lösung - leere Kreise (O).
Fig. 21 zeigt die Aktivität verschiedener Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;- Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen aus einer Größenausschluss- (SE-) Säule eluiert wurden. Die auf die Säule aufgetragenen Lösungen waren verschiedene Fraktionen, die aus der präparativen RP-HPLC-Säule eluiert worden waren, wie in Fig. 17 dargestellt Fraktion "A", Röhrchen 6 bis 8 - leere Kreise (O), Fraktion "B", Röhrchen 8 bis 10 - gefüllte Kreise ( ); Fraktion "C", Röhrchen 10 bis 12 - leere Dreiecke ( ); und Fraktion "D", Röhrchen 12 bis 14 - gefüllte Dreiecke ( ).
Fig. 22 zeigt die Aktivität verschiedener Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;- Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen aus einer Superdex-Säule eluiert wurden. Die auf die Säule aufgetragenen Lösungen bestanden aus verschiedenen Fraktionen aus dem Eluat von Fig. 21, wie folgt:
Fig. 22A zeigt die Ergebnisse der folgenden aufgetragenen Lösungen: Röhrchen 28 bis 30 von Fraktion C - leere Kreise (O); Röhrchen 22 bis 23 von Fraktion C - gefüllte Kreise ( ); Röhrchen 29 bis 33 von Fraktion B - leere Dreiecke - ( ); und
Fig. 22B zeigt die Ergebnisse der folgenden aufgetragenen Lösungen: Röhrchen 31 bis 32 von Fraktion C - gefüllte Kreise ( ); Röhrchen 23 bis 26 von Fraktion C - leere Kreise (O); Röhrchen 29 bis 33 von Fraktion B - leere Dreiecke ( ).
Fig. 23 zeigt das Aktivitätsprofil von Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;-Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen aus einer analytischen RP-HPLC-Säule eluiert wurden. Die auf die Säule aufgetragene Lösung bestand aus aktiven Fraktionen (die bei 18 bis 28% Acetonitril eluiert wurden) aus einer präparativen RP-HPLC-Säule.
Fig. 24 zeigt das Aktivitätsprofil von Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;-Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen aus einer Größenausschluss-Säule eluiert wurden. Die auf die Säule aufgetragenen Lösungen waren die Fraktionen 13 bis 17 aus dem in Fig. 23 dargestellten Aliquot.
Fig. 25 zeigt das Aktivitätsprofil verschiedener Fraktionen, die Proliferation von Nb&sub2;-Zellen zu hemmen, wobei die Fraktionen aus einer Säule mit hydrophilen Wechselwirkungen (CHO-Säule) eluiert wurden. Die auf die Säule aufgetragenen Lösungen waren die vereinigten Fraktionen 27 bis 30 aus dem in Fig. 24 dargestellten Aliquot.
Fig. 26 zeigt ein NMR-Spektrum von aktiven Fraktionen, die aus einer Größenausschluss-Säule erhalten wurden (Fraktionen, die zwischen 27 und 32 Min. eluiert wurden).

Genaue Beschreibung der Erfindung

Im folgenden wird manchmal auf "MF" oder "WBF" Bezug genommen, wenn die Aktivität von aktiven Fraktionen beschrieben wird, die aus einem Muskelzellen-CM und aus einem Leukozyten-CM erhalten wurden. Es ist so zu verstehen, dass diese zwei CMs möglicherweise mehr als einen Faktor mit den nachstehend beschriebenen Aktivitäten enthalten. Tatsächlich können die Ergebnisse der HPLC-Fraktionierung, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, und von denen einige nachstehend gezeigt werden, auf diese Weise erklärt werden (wobei jedoch auch andere Erklärungen möglich sind). So ist es z.B. möglich, dass das Muskelzellen-CM mehr als einen Faktor enthält, der eine Tumorwachstum-hemmende Wirkung besitzt. Somit wird z.B. manchmal auf "den MF" usw. Bezug genommen, dies sollte jedoch nicht so verstanden werden, dass das Muskelzellen-CM nur einen einzelnen LMW-EGR enthält, da das Muskelzellen-CM tatsächlich mehr als eine Substanz enthalten kann, die alle zusammen mit "MF" bezeichnet werden können.

1. Konditioniertes Medium

1.1. MF

MF wurde aus den konditionierten Medien (CM) von drei Typen von Muskelzellpräparaten erhalten:

1.1.1. Primäre Kulturen von Muskeln neugeborener Ratten

Muskeln aus den Hinterbeinen von 24 bis 48 Stunden alten neugeborenen Ratten wurden abgetrennt und in kleine Stücke zerkleinert. Nach dem Trypsin-Behandeln mit 0,25% Trypsinversan-Lösung wurden die Zellen in Gewebekulturschalen vorplattiert, um die Fibroblasten und Monozyten zu entfernen. Die Zellen wurden gezählt und in angereichertes Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) ausgesät. Fünf Tage später enthielten die Kulturen kontrahierende Muskelzellen. Danach wurde das Medium verworfen und RPMI- oder PBS-Medium zugefügt. Die Zellen wurden 24 Stunden in RPMI-Medium und 8 oder 24 Stunden in PBS inkubiert. Anschließend wurde der Überstand gewonnen, zentrifugiert und bis zur weitere Verarbeitung im Gefrierschrank bei -20ºC aufbewahrt.

1.1.2. Rattenmuskel-Zelllinie (L-8)

Die Linie L-8 (erhältlich von der American Type Culture Collection - ATCC, Bezeichnung CRL 1769) ist eine Skelettmuskel-Myoblastenlinie der neugeborenen Ratte, die undifferenzierte Myoblasten umfasst, die ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren proliferieren. L-8-Zellen wurden in Kulturschalen ausgesät und in einem RPMI-Medium (dieses Medium wird nachstehend als "RPMI" bezeichnet), das 4% Glucose enthielt, gezüchtet. Drei Tage nach dem Ausstreichen wurde der Kulturüberstand verworfen und entweder durch RPMI oder durch Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ersetzt, worauf eine weitere Inkubation von 24 Stunden folgte. Danach wurden die Überstände gesammelt und, wenn sie nicht gleich weiterverarbeitet wurden, im Gefrierschrank bei -20ºC aufbewahrt.

1.1.3. Menschliche Myoblasten

Menschliche Myoblasten, die aus einer Biopsie eines Menschen erhalten wurden, wurden in rotierenden Kulturflaschen bis zur Konfluenz gezüchtet (vgl. US-Patent 5 130 441). Das Kulturmedium wurde entfernt und entweder durch eine DMEM- oder durch eine PBS-Lösung ersetzt, anchließend wurden die Zellen in den Lösungen weiterhin 24 Stunden inkubiert. Danach wurde der Überstand gewonnen und die Zellen durch Zentrifugation davon abgetrennt.

1.2. WBF

Der WBF wurde aus einem konditionierten Medium von mononukleären Zellen erhalten. Die mononukleären Zellen wurden aus venösem Blut wie folgt isoliert: Von einem menschlichen Spender wurden 20 ml venöses Blut mit einer heparinisierten Spritze abgenommen. Das heparinisierte Blut wurde 1 : 1 mit PBS verdünnt, auf 15 ml Ficoll-HypaqueTM (Pharmacia, Schweden) oder HistopaqueTM (Sigma, St. Louis, USA) geschichtet und 30 Minuten bei 400 · g zentrifugiert. Die Grenzfläche, die die mononukleären Zellen enthielt, wurde gewonnen und dreimal mit PBS gewaschen.
2 · 10&sup6; mononukleäre Zellen pro ml wurden in PBS suspendiert und bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 95% Luft 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert und der Überstand gewonnen.

2. Ultrafiltration

Das aus den vorstehenden Ausgangsmaterialien erhaltene CM wurde einer Ultrafiltration unterworfen, wobei Filter mit Molekülausschlüssen von 500, 2000, 3000 und 10 000 Dalton (CentriconTM, Amicon, USA) verwendet wurden.
Dabei wurde gefunden, dass der MF im Ultrafiltrat der Membranen mit den Molekülausschlüssen von 10 000, 3000 und 2000 Dalton vorlag, außerdem im Ultrafiltrat der Membran, die einen Molekülausschluss von 500 Dalton aufwies, wie nachstehend noch gezeigt wird. Der WBF wurde durch eine Membran ultrafiltriert, die einen Molekülausschluss von 3000 Dalton aufwies, und dabei wurde gefunden, dass das Ultrafiltrat den WBF enthielt.
Das Ultrafiltrat des Muskelzellen-CM durch ein Filter mit einem Molekülausschluss von 500, 2000 Dalton usw. wird hier als das "500-Dalton-MF-Ultrafiltrat", "2000- Dalton-MF-Ultrafiltrat" usw. bezeichnet; das Ultrafiltrat des Lymphozyten-CM durch die Filter mit einem Molekülausschluss von 3000 Dalton wird hier als das "3000-Dalton- WBF-Ultrafiltrat" bezeichnet.

3. In-vitm-Hemmung der Proliferation von Tumorzellen durch einen MF und durch einen WBF

3.1. Methoden

3.1.1. Zelllinien

In diesem in-vitro-Test wurde die Wirkung eines MF oder eines WBF auf verschiedene Tumorzelllinien und auf verschiedene nicht-tumoröse Zellen getestet. Die folgenden Zellen wurden getestet:
(a) Tumorzelllinien:
HT-29, die eine aus einem menschlichen Kolon stammende Adenokarzinom-Zelllinie ist (ATCC, Bezeichnung HTB-38);
MCA-105, die eine murine Methylcholanthren-induzierte Sarkomzelllinie der Lunge ist:
B16-F1, die eine murine Melanomzelllinie ist;
SK-28, die eine humane Melanomzelllinie ist;
K-562, die eine humane Leukämiezelllinie ist;
DA3-Zellen, wobei es sich um eine Brustkrebs-Zelllinie handelt;
MCF-7, die eine Brustkrebs-Zelllinie ist;
Nb&sub2;-11C, die eine Rattenlymphom-Zelllinie ist, welche Hormon-abhängig ist (d.h. für das Wachstum dieser Zellen ist die Zugabe eines Wachstumshormons erforderlich) (Gertler et al., Endocrinol. 1985, 116: 1636-1644); und
Nb&sub2;-SP, die eine laktogene Hormon-unabhängige Rattenlymphom-Zelllinie ist;
(b) Nicht-Tumor-Zellen:
murine Knochenmarkzellen;
primäre Rattenfibroblasten; und
IM-9, die eine menschliche Lymphozyten-Zelllinie ist.

3.1.2. Test anhand des Einbaus von ³H-Thymidin

Die Testzellen (die Zellen, bei denen der Einbau von ³H-Thymidin bestimmt wurde) wurden in eine Platte mit 96 Mikrovertiefungen mit einer anfänglichen Zelldichte von 1 · 10&sup4; Zellen pro Mikrovertiefung ausgesät. Jede Mikrovertiefung enthielt ein Gemisch aus RPMI und einer Testlösung, die ein konditioniertes Medium (ein Muskelzellen-CM oder ein Leukozyten-CM entweder in RPMI oder in PBS), ein fraktioniertes CM, ein Kontroll-RPMI oder PBS (d.h. nicht konditioniert) oder ein fraktioniertes Kontroll-RPMI oder PBS war. Die Ergebnisse jeder Testlösung wurden mit der entsprechenden Kontrolle verglichen (z.B. wurde eine fraktionierte Testlösung in PBS mit einer fraktionierten PBS verglichen usw.). Nach 42 Stunden Inkubation bei 37ºC wurde jede Mikrovertiefung mit 10 uCi von ³H-Thymidin gepulst, worauf eine weitere Inkubation von sechs Stunden mit diesem radioaktiven Marker folgte. Anschließend wurde das Ausmaß der ³H-Thymidin-Aufnahme in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen.

3.1.3. Test anhand des Zählens von Zellen

Die Zellen der Rattenlymphom-Zelllinie Nb&sub2;-11C wurden synchronisiert und wie bereits beschrieben gezüchtet (Gertler et al., Endocrinol. 1985, 116: 1636-1644), mit der Ausnahme, dass die Zellen in RMPI gezüchtet wurden, das mit 5% fetalem Kälberserum angereichert war. Das Synchronisieren von Nb&sub2;-11C-Zellen in der G&sub0;/G&sub1;-Phase und das Überwachen der Selbstproliferation erfolgten wie früher beschrieben (Gertler et al., vorstehend). Kurz gesagt wurden die Zellen auf ein mit Pferdeserum angereichertes Medium überführt und über Nacht inkubiert. Danach wurden die Zellen auf etwa 3 · 10&sup5; Zellen/ml verdünnt und mit 0,5 ml/Vertiefung in zahlreiche Vertiefungen in Platten mit 24 Vertiefungen verteilt. Anschließend wurde eine Menge von bis zu 0,5 ml der Testlösung zugegeben und die Selbstproliferation durch Zugabe von hGH bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml in Gang gesetzt. Die Zellen wurden bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;- enthaltenden Atmosphäre 72 Stunden inkubiert und danach in einem Coulter-Zählgerät gezählt. Jedes Experiment wurde mit zwei Wiederholungen durchgeführt.
Zellen der Nb&sub2;-SP- und der IM-9-Zelllinie wurden in ähnlicher Weise getestet.

3.2. Ergebnisse

3.2.1. MF

Die Ergebnisse mit einem 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrat, das von einer primären Kultur von gestreiften Muskelzellen neugeborener Ratten stammte, sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt; die Ergebnisse mit einem 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrat, das von L-8- Zellen hergeleitet wurde, sind in den Fig. 3 und 4 dargestellt. In jeder dieser Figuren stellen die Ziffern auf den Abszissen einen reziproken Wert der Verdünnung dar ("1" - unverdünnt, "2" - zweifache Verdünnung, usw.), und auf der Ordinate ist die Radioaktivität aufgetragen (Zählimpulse ("counts") pro Minute - CPM); bei der Kontrolle (jeweils die linke Säule) wurde ein nicht-konditioniertes Medium verwendet, das genauso behandelt wurde wie das CM.
Wie aus den Fig. 1 und 3 ersichtlich ist, hemmt ein MF aus einer primären Kultur gestreifter Muskelzellen der Ratte (Fig. 1) oder aus der gestreiften Muskelzelllinie L-8 (Fig. 3) die Proliferation von Tumorzellen, während er auf normale Zellen keine solche Hemmwirkung zeigt (Fig. 2 bzw. 4). Außerdem ist ersichtlich, dass der MF durch die Membran mit einem Molekülausschluss von 3000 Dalton läuft, dies wird durch die Tatsache deutlich, dass die antiproliferative Aktivität, die im rohen CM vorliegt, auch im Ultrafiltrat erhalten bleibt. Wie weiterhin aus den Fig. 1 und 3 ersichtlich ist, nimmt die Wirkung des MF mit zunehmender Verdünnung ab, dies zeigt weiterhin, dass diese Wirkung durch einen spezifischen Faktor im Ultrafiltat vermittelt wird.
Fig. 5 zeigt die Aktivität eines rohen, aus der L-8-Linie hergeleiteten CM und außerdem eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats davon, die beide in verschiedenen Verdünnungen vorliegen. Wie ersichtlich ist, zeigt das rohe CM eine antiproliferative Aktivität, die im Ultrafiltrat erhalten bleibt. Außerdem nimmt die Wirkung mit zunehmender Verdünnung ab, dies zeigt wiederum, dass es sich hier um eine spezifische Aktivität handelt, die durch einen Faktor vermittelt wird.
Auch in Fig. 6 ist die Wirkung eines aus L-8-Zellen stammenden 3000-Dalton- MF-Ultrafiltrats (unverdünnt) dargestellt (wobei die Ergebnisse als Prozent der Kontrolle angegeben sind; die Kontrolle wurde in jedem Experiment auf 100% gesetzt). Wie ersichtlich ist, hemmt der MF wirksam die Proliferation aller getesteten Tumorzelllinien.
Fig. 7 zeigt die Aktivität eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats, die Proliferation von drei Zelllinien zu hemmen, wobei das Ultrafiltrat aus menschlichen Myoblasten stammte (und die Ergebnisse als Prozent der Kontrolle angegeben sind). Die Proliferation der B- 16- und der K562-Zelllinien wurde getestet, indem der Einbau von ³H-Thymidin bestimmt wurde; die Proliferation der Nb&sub2;-Zelllinie wurde anhand des Zählens von Zellen bestimmt. Es ist ersichtlich, dass der vom Menschen stammende MF wirksam die Proliferation aller getesteten Tumorzelllinien hemmt.
In einem anderen Experiment wurden die Fraktionen aus einer präparativen RP- HPLC, deren Aktivität, die Proliferation von Tumorzellen zu hemmen, nachgewiesen wurde (die Fraktionen 5 und 6 aus Fig. 15), vereinigt, bei 45ºC eingedampft und danach in 5 ml Wasser gelöst, in Röhrchen überführt und erneut im Vakuum getrocknet und schließlich in 2 ml Wasser gelöst und sterilisiert. Bestimmte Mengen dieser Fraktionen wurden getestet, wobei jeweils ihre Fähigkeit bestimmt wurde, die Proliferation von drei verschiedenen Tumorzelllinien zu hemmen: Nb&sub2;-11C, Nb&sub2;-SP und IM-9.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I dargestellt (wobei die Proliferation anhand des Zählens von Zellen bestimmt wurde). Tabelle I
Wie ersichtlich ist, hemmt der MF die Proliferation der Hormon-abhängigen Tumorzelllinie Nb&sub2;-11C und außerdem der Hormon-unabhängigen Tumorzelllinie Nb&sub2;-SP. Dagegen hatte der MF im wesentlichen keine Wirkung auf die nicht-tumoröse menschliche Lympozyten-Zelllinie IM-9.
Fig. 8 zeigt die Wirkung eines 3000-Dalton-WBF-Ultrafiltrats auf die Proliferation von murinen und menschlichen Zeillinien. Wie hier wieder ersichtlich ist, hemmte der WBF die Proliferation aller getesteter Tumorzelllinien sowohl muriner als auch menschlicher Herkunft.

4. In-vitro-Hemmung der Lymphozyten-Antwort auf ein PHA und der MLR durch den MF und den WBF

Wenn Lymphozyten aus zwei Individuen zusammen gezüchtet werden, lösen die HLA-Antigene von jedem Individuum eine Zellreaktion aus, die zu einer Proliferation der Lymphozyten führt (wobei die Proliferation in einem direkten Zusammenhang zu dem Unterschied zwischen den HLA-Antigenen der zwei Individuen steht). Um die Wirkung des WBF oder des MF auf diese Reaktion zu testen, wurden mononukleäre Zellen aus zwei Spendern (wobei die Zellen wie vorstehend unter 1.2. beschrieben zubereitet wurden) mit einer Konzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml in PBS, die 10% FCS enthielt, inkubiert, außerdem wurden zu den Zellen verschiedene Verdünnungen eines 3000-Dalton- MF- oder WBF-Ultrafiltrats zugegeben. Die Kulturen wurden fünf Tage bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 95% Luft inkubiert. Während der letzten sechs Stunden der Inkubation wurde jede Vertiefung mit 1 uCi ³H-Thymidin gepulst. Die Zellen wurden geerntet und die Aufnahme von ³H-Thymidin in einem LKB-Flüssigkeits-Szintillationszähler (LKB, Piscataway, NJ, USA) bestimmt.
PHA (Phytohämagglutinin) ist ein Mitogen, das an Zuckerreste in der Zelloberfläche von Lymphozyten bindet und die Transformation von Lymphozyten zu einer Blastenform mit einer anschließenden Zellproliferation induziert. Um die Wirkung des MF oder des WBF auf die durch PHA induzierte Reaktion zu testen, wurden mononukleäre Zellen mit einer Konzentration von 10&sup6; Zellen/ml in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät, die jeweils 0,2 ml RPMI, angereichert mit 10% fetalem Kälberserum (Israel Industries, Bet-ha-Emek, Israel) und 1 ug/ml PHA (Wellcome Laboratories, UK), enthielten. In einigen Vertiefungen bestanden die 0,2 ml RPMI zur Hälfte aus nativem RPMI und zur Hälfte aus einem 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrat aus L-8-Zellen in RPMI. Die Kulturen wurden vier Tage in einem CO&sub2;-Inkubator inkubiert und am Ende der Inkubationsperiode mit 1 uCi ³H-Thymidin gepulst, sodann wurden sie weitere 24 Stunden inkubiert und mit einer Zellerntevorrichtung von Dynatech geerntet und danach die Radioaktivität mit einem LKB-Szintillator gezählt.
Fig. 9 zeigt die Wirkung des MF, die Lymphozyten-Reaktion auf PHA und die MLR zu hemmen (wobei die Ergebnisse für eine 1 : 1-Verdünnung und als Prozent der Kontrolle angegeben sind). Mit dem WBF wurden qualitativ ähnliche Ergebnisse erhalten. Außerdem war die Wirkung sowohl des MF als auch des WBF proportional zur Verdünnung (wobei die Wirkung mit zunehmenden Verdünnungen abnahm) (Ergebnisse nicht gezeigt).

5. In-vivo-Studien

5.1. Induktion eines Tumors (MCA 105) durch i.p.-Inokulation; i.p.-Behandlung mit einem MF

30 C57BL6/J-Mäuse erhielten intraperitoneale (i.p.) Injektionen mit 2,5 · 10&sup5; MCA-105-Zellen. Die Mäuse wurden zweimal täglich mit i.p.-Injektionen von 0,5 ml der RP-HPLC-Fraktion behandelt, die nachstehend (Abschnitt 6.5.2.) als "MF-SP" bezeichnet wird. Die Mäuse wurden am Tag 33 eingeschläfert und auf Tumorherde untersucht. Repräsentative Ergebnisse sind in Fig. 10 zu sehen, wo zwei Tiere mit eröffnetem Peritoneum dargestellt sind, wobei das in Fig. 10A dargestellte Tier mit der MF- SP-Fraktion behandelt worden war und das in Fig. 10B dargestellte Tier mit einem Kontroll-RPMI-Medium behandelt worden war. Wie ersichtlich ist, lässt sich im Kontrolltier ein sehr großes Tumorwachstum feststellen (Pfeil in Fig. 10B), wohingegen in dem mit MF behandelten Tier nur sehr kleine, kaum erkennenbare Tumorherde zu sehen sind (einer wird in Fig. 10A durch einen Pfeil hervorgehoben).

5.2. Induktion eines Tumors 1B-16-Melanom) durch i.p.-Inokulation: Behandlung durch i.p.-Iniektion eines MF

40 C57BL6/J-Mäuse erhielten i.p.-Injektionen mit 5 · 10&sup5; B-16-Melanomzellen. 20 Mäuse dienten als Kontrolle und erhielten täglich i.p.-Injektionen mit einer PBS- Lösung. 20 Mäuse wurden täglich mit 1 ml eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats behandelt, das von L-8-Zellen stammte. Die Mäuse wurden am Tag 15 eingeschläfert und das Ausmaß des Tumorwachstums im Peritoneum der Tiere untersucht. Aus Fig. 11, die die eröffneten Peritonea von zwei repräsentativen Mäusen aus jeder Versuchsgruppe zeigt, ist ersichtlich, dass in dem Tier aus der Kontrollgruppe zahlreiche große Tumorherde zu sehen sind, während in dem behandelten Tier nur einige wenige und viel kleinere Tumorherde vorliegen.

5.3. Induktion eines Tumors (MCA-105) durch i.p.-Inokulation: Behandlung mit einem MF sowohl durch i.p.- als auch durch p.o.-Verabreichung

30 C57BL6/J-Mäuse erhielten i.p.-Injektionen mit 2,5 · 10&sup5; MCA-105-Zellen. Zehn Mäuse wurden täglich durch eine per-os- (p.o.-) Verabreichung von 1 ml des 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats behandelt, das von den L-8-Muskelzellen stammte; zehn Mäuse wurden täglich durch i.p.-Injektion der gleichen Lösung behandelt; und zehn Mäuse dienten als Kontrollgruppe und wurden täglich p.o. mit einem RPMI-Medium behandelt.
Die Mäuse wurden am Tag 30 eingeschläfert, ihre Peritonea eröffnet und das Ausmaß des Tumorwachstums darin bestimmt. In Fig. 12 sind zwei repräsentative Mäuse aus jeder Gruppe dargestellt (Fig. 12A - mit MF behandelte Mäuse; Fig. 12B - Kontrolle). Wie aus Fig. 12A ersichtlich ist, sind in den Peritonea der mit MF behandelten Tiere keine Zeichen von Tumorwachstum zu sehen, während in den Peritonea der Tiere der Kontrollgruppe große Tumorherde erscheinen. In diesem Experiment entwickelten sich bei 90% der Mäuse der Kontrollgruppe Tumorherde, während sich nur bei 40% der Mäuse, die entweder i.p. oder p.o. mit dem MF behandelt worden waren, Tumorherde entwickelten.

5.4. Induktion eines Tumors durch i.m.-Inokulation (DA3-Brustkrebs): Behandlung mit einem MF durch i.p.- und p.o.-Verabreichung

1 · 10&sup6; DA3-Zellen wurden intramuskulär (i.m.) jeweils in das Bein von 30 BALB/C-Mäusen injiziert. Zehn Mäuse dienten als Kontrolle und wurden täglich durch i.p.-Injektionen mit PBS behandelt; zehn Mäuse wurden täglich durch i.p.-Injektionen von 1 ml eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats behandelt, das von den L-8-Muskelzellen hergeleitet war (zubereitet in PBS); und zehn Mäuse wurden mit der gleichen MF- enthaltenden Lösung durch p.o.-Verabreichung (1 ml) behandelt. Bei den Mäusen entwickelten sich in den Beinen große Tumoren, und nach drei Wochen wurden die Mäuse eingeschläfert, danach konnten metastatische Lungenherde nachgewiesen und in der Lunge gezählt werden. In der Kontrollgruppe wurden 23,4 ± 6 metastatische Herde gezählt, im Vergleich zu 6,2 ± 1,3 Herden in der i.p.-behandelten Gruppe und zu 2,2 ± 0,6 in der p.o.-behandelten Gruppe.

5.5. Induktion eines Tumors durch i.v.-Inokulation (B-16-Melanom); Behandlung mit einem MF durch p.o.-Verabreichung

30 C57BL6/J-Mäuse erhielten intravenöse Injektionen mit 5 · 10&sup5; B-16-Melanomzellen. 20 Mäuse wurden durch tägliche p.o.-Verabreichung von 1 ml eines 3000- Dalton-MF-Ultrafiltrats behandelt, das von L-8-Zellen stammte, wobei die Behandlung am Tag der Tumor-Inokulation begonnen wurde; zehn Mäuse dienten als Kontrolle und erhielten nur PBS p.o. verabreicht. Die Mäuse wurden am Tag 18 eingeschläfert, und in ihren Lungen konnten die entstandenen schwarzen Tumorherde festgestellt werden. Repräsentative Lungen der zwei Gruppen sind in Fig. 13 zu sehen (obere Reihe - Kontrolle; untere Reihe - MF-Behandlung). Hieraus ist ersichtlich, dass in den Lungen der Kontrollgruppe viele schwarze metastatische Herde vorliegen, in der Versuchsgruppe dagegen nur einige wenige und kleine Herde zu sehen sind.

6. Spiegel des WBF, der durch Leukozyten von gesunden Individuen und von Krebspatienten ausgeschieden wurde

Mononukleäre Zellen wurden aus dem venösen Blut von 23 gesunden Individuen (wobei die Proben aus einer Blutbank erhalten wurden) und von 33 hospitalisierten Krebspatienten isoliert. Das Verfahren wurde wie in 1.2. beschrieben durchgeführt. Von Kulturen mit 2 · 10&sup6; mononukleären Zellen pro ml wurden die Überstände gewonnen, wobei der Überstand jeweils gewonnen und anschließend durch ein Filter mit einem Molekülausschluss von 3000 Dalton wie in 2. beschrieben ultrafiltriert wurde.
Die Ultrafiltrate wurden auf ihre Fähigkeit getestet, das Wachstum von Krebszellen aus drei Krebszelllinien zu hemmen: die murine Melanom-Zelllinie B-16, die menschliche Melanom-Zelllinie SK und die menschliche Leukämie-Zelllinie K-562.
Die Ergebnisse sind in Fig. 14 dargestellt. Wie aus Fig. 14A ersichtlich ist, zeigte das Ultrafiltrat aus den mononukleären Zellen der gesunden Individuen eine deutliche Hemmung der Proliferation, die bei den getesteten Zelllinien unter 50% lag, während dagegen mit dem Ultrafiltrat aus den Krebspatienten nur eine sehr geringe, kaum signifikante Hemmung der Proliferation zu sehen war. Wie ferner aus Fig. 14B ersichtlich ist, gab es zwischen den zwei Gruppen absolut keine Überlappung.
Die Ergebnisse machen deutlich, dass der Spiegel des WBF, der durch mononukleäre Zellen aus Krebspatienten ausgeschieden wurde, im Vergleich zu dem Spiegel des durch Lymphozyten aus gesunden Individuen ausgeschiedenen Faktors deutlich niedriger war. Diese Ergebnisse zeigen somit die diagnostische Signifikanz des Tests des LMW-EGR-Spiegels der vorliegenden Erfindung. Außerdem hat der wirksame WBF-Spiegel auch eine wichtige therapeutische Signifikanz.

7. Charakterisierung des MF

7.1. Bioassay

Das Muskelzellen-CM wurde fraktioniert, wie nachstehend noch ausführlicher beschrieben wird, und die verschiedenen Fraktionen wurden unter Verwendung der vorstehend angegebenen Zelllinien getestet. Die Wirkung von jeder Fraktion auf das Wachstum der Zellen wurde durch die vorstehend beschriebenen Tests anhand der Aufnahme von ³H-Thymidin oder mittels Zählen von Zellen bestimmt.

7.2. Test auf eine mögliche Protein-Natur des MF

Um zu bestimmen, ob der MF eine proteinartige Substanz ist oder nicht, wurde das Muskelzellen-CM (das aus einer primären Kultur von Muskelzellen der Ratte erhalten wurde) einer Reihe von Behandlungen unterworfen, wobei die Empfindlichkeit gegenüber proteolytischen Enzymen, die Stabilität während der Gefriertrocknung und die Wirkung einer Inkubation bei verschiedenen Temperaturen getestet wurden. Nach solchen Behandlungen wurde das CM durch Verdünnen mit dem Originalmedium wieder auf die ursprüngliche Salz- und Proteinkonzentration gebracht, oder falls es verdünnt vorlag, wurde der Verdünnungsfaktor der Proteinkonzentration beim Auswerten der Ergebnisse berücksichtigt. Der hierbei verwendete Test war der ³H-Thymidin- Aufnahme-Test.

7.2.1. Wirkung von proteolytischen Enzymen

Trypsin und Pronase, zwei proteolytische Enzympräparate, wurden getestet. Die Wirkung von Trypsin wurde anhand von zwei Verfahren bestimmt:
(i) Eine MF-enthaltende Lösung wurde mit Trypsin (0,5 bis 2 ug/ml) vier Stunden bei 37ºC inkubiert, danach wurde die Trypsinaktivität durch Zugabe eines etwa zweifachen molaren Überschusses des Sojabohnen-Trypsin-Inhibitors (STI) gestoppt. Ein nicht-konditioniertes (MF-freies) Medium wurde als Kontrolle verwendet.
(ii) Eine MF-enthaltende Lösung wurde mit Trypsin (0,5 bis 2 ug/ml) eine bis vier Stunden bei 37ºC oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und nach der Inkubation das Enzym auf einer Säule mit P-Aminobenzamidin-Agarose entfernt. Ein MF-freies Medium diente als Kontrolle. Weitere Kontrolltests mit Trypsin alleine haben gezeigt, dass aus dieser Säule unter den Laufbedingungen der Säule (Bicarbonatpuffer) keine Trypsin-artige Aktivität eluiert wird.
Um die Wirkung von Pronase zu testen, wurde das Muskelzellen-CM behandelt, indem es mit Pronase in Kontakt gebracht wurde, die auf einem Sepharose-Gel immobilisiert war. Auch hier wurde ein MF-freies Medium als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II dargestellt (wobei die Zahl jeweils die Prozent Hemmung im Vergleich zu einem nicht-konditionierten Medium angibt). Tabelle II
(a) Trypsin-Verfahren (i) vorstehend
(b) Trypsin-Verfahren (ii) vorstehend
(c) "-" = nicht getestet
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass eine Behandlung mit Trypsin durch beide Verfahren und auch mit Pronase keine signifikante Wirkung auf die Tumorwachstum-hemmende Aktivität des MF hatte.

7.2.2. Gefriertrocknung

Ein Muskelzellen-CM wurde ohne vorherige Dialyse gefriergetrocknet und das gefriergetrocknete Produkt sodann wieder in Wasser gelöst und auf das ursprüngliche Volumen gebracht. Nach dieser Behandlung war kein nennenswerter Verlust der Tumorwachstum-hemmenden Aktivität des MF feststellbar, dies zeigt, dass der MF gegenüber Gefriertrocknung stabil ist.

7.2.3. Hitzebehandlung

Ein Muskelzellen-CM (das von einer früheren Rattenmuskel-Zellkultur stammte) wurde bei Temperaturen im Bereich von 4 bis 100ºC verschiedene Zeitspannen inkubiert. Nach diesen Behandlungen wurden die Proben sowohl mit MCA- als auch mit HTB-Zellen getestet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III dargestellt (wobei die Zahlen die Änderung (in %) der inhibitorischen Potenz des MF nach der Temperaturbehandlung angeben). Tabelle III
"-" = unter solchen Bedingungen nicht getestet
In anderen Versuchsansätzen wurde ein 3000-Dalton-Ultrafiltrat des konditionierten Mediums durch Erhitzen bis Kochen behandelt, ohne dass ein Verlust der Aktivität dieser Fraktion mit einem niedrigen Molekulargewicht, die Proliferation von Tumorzellen zu hemmen, auftrat.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass es bei allen getesteten Temperaturen, einschließlich Kochen bei 100ºC, zu keiner Abnahme der inhibitorischen Potenz kam.

7.2.4. Zusammenfassung

Unter den getesteten Bedingungen wurde keine Abnahme der Potenz des MF, das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen, festgestellt, dies zeigt eindeutig, dass der MF kein Protein ist. Statt dessen zeigten die Ergebnisse nach einigen Behandlungen sogar eine Zunahme der Hemmaktivität, die durch die Tatsache zu erklären ist, dass das MF-enthaltende Medium einen proteinartigen Faktor enthält, der eine dem MF entgegengesetzte Wirkung ausübt und der durch die Behandlung zerstört wird.

7.3. Größe des MF

Ein MF-enthaltendes CM wurde durch Ultrafiltration auf Amicon-Membranen mit Molekülausschlüssen von 10, 2 und 0,5 kD fraktioniert (wobei das zurückgehaltene Produkt in jedem Fall mit mindestens einem weiteren PBS-Volumen filtriert wurde). Im Fall sowohl der 10- als auch der 2-kD-Membran lag im wesentlichen die gesamte inhibitorische Aktivität (über 90%) in den ersten zwei Filtraten vor, und bei der 0,5-kD- Membran wurden etwa 80% der Aktivität in den Filtraten gefunden, und eine gewisse Aktivität (20%) verblieb im zweiten zurückgehaltenen Produkt. Die Hemmaktivität wurde jeweils sowohl auf HTB-38- als auch auf MCA-Zellen getestet.
Das Dialysieren des MF-enthaltenden CM durch Membranen mit Molekülausschlüssen von 12 und 3 kD zeigte, dass die aktive Komponente durch beide Membranen durchlaufen konnte.
Die vorstehenden Ergebnisse machen deutlich, dass der MF ein Molekulargewicht in der Größenordnung von oder weniger als etwa 500 Dalton oder weniger hat.

7.4. RP-HPLC-Charakterisierung eines MF (der aus einer primären Kultur von Rattenmuskelzellen stammte)

Filtrate der 10-kD-Membranen wurden auf einer C18-Umkehrphasen- (RP-) Säule (4 · 250 mm) chromatographiert. Das Filtrat wurde jeweils zuerst auf die ursprüngliche Konzentration gebracht, indem es in einer Lösung von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) verdünnt wurde, danach wurde es auf die Säule aufgetragen, die mit einem 5 bis 35% Gradienten von Acetonitril entwickelt wurde (diese beiden Komponenten wurden vorher getestet, wobei sich zeigte, dass sie keine Wirkung auf die Hemmaktivität des MF hatten). Die Aktivität, die mit HTB-38-Zellen nachgewiesen wurde, wurde bei 15% Acetonitril in 0,1% TFA eluiert. Anschließend wurde die aktive Fraktion nochmals auf der gleichen Säule mit dem Acetonitril-Gradienten chromatographiert, wobei ein teilweise gereinigter MF an der gleichen Position wie vorher eluiert wurde (Retentionszeit etwa 21 Minuten). Mit dieser letzten Fraktion wurde ein dritter Lauf der RP- Chromatographie unter den gleichen Bedingungen wie die ersten zwei Läufe durchgeführt. Dabei wurde ein einzelner inhibitorischer Peak gefunden, der mit der Position eines 220-nm-Absorptionspeaks im Elutionsprofil übereinstimmte, das aus Fig. 15 ersichtlich ist.

7.5. Reinigung eines MF (der aus einer primären Kultur von Rattenmuskelzellen stammte im großen Maßstab

7.5.1. Versuchsprotokoll

Ein Rattenmuskelzellen-CM wurde auf Amicon-10-kD-Membranen ultrafiltriert. Das 10-kD-Filtrat wurde auf einer C-18-Umkehrphasen (RP-) Säule (47 · 300 mm) chromatographiert, die mit einer präparativen HPLC-Säule verbunden war. Die Fraktionen wurden in einem Zellproliferationstest unter Verwendung von HTB-38-Zellen getestet, die aktive Fraktion wurde erneut auf einer zweiten C18-RP-Säule (analytisch: 4 · 250 mm) chromatographiert und die aktive Fraktion wie vorstehend identifiziert.

7.5.2. Aktivität von gereinigten MF-Fraktionen

Das im letzten Schritt von Abschnitt 7.5.1. erhaltene Material wurde mit "MF-P" bezeichnet, während das nach der ersten RP-Säule erhaltene Material mit "MF-SP" bezeichnet wurde (dies ist auch die Fraktion, die in Abschnitt 5.1. getestet wurde). Die Aktivitäten des rohen konditionierten Mediums (CM), die Fraktion MF-P und die Fraktion MF-SP sowie das zurückgehaltene Material (R) der Ultrafiltration sind in der folgenden Tabelle IV dargestellt (wobei die Aktivität in U/ml aufgedrückt ist 1 U ist als die Menge an Material definiert, die im Proliferationstest eine Hemmung von 50% bewirkt). Tabelle IV
(a) = Die Experimente mit HTB-38-Zellen wurden getrennt an zwei unterschiedlichen Stellen durchgeführt.
"-" = nicht getestet
Wie ersichtlich ist, hemmten alle getesteten Fraktionen wirksam die Proliferation der getesteten Zelllinien. Hierbei war auch die R-Fraktion enthalten, wobei es sich bei dem aktiven Faktor möglicherweise um das Tumorproliferation-hemmende Mittel handelt, das im US = Patent 5 242 692 beschrieben wird.

7.6. Charakterisieren eines aus der L-8-Zelllinie stammenden MF durch HPLC

In den Abschnitten 7.6.1. bis 7.6.5. sind einige repräsentative HPLC-Ergebnisse dargestellt. Im Abschnitt 7.6.1. ist ein Beispiel eines Verfahrens zum Reinigen des MF angegeben.

7.6.1. Umkehrphasen- (RP-) HPLC

160 ml eines 3000-Dalton-MF-Ultrafiltrats in PBS (erhalten nach acht Stunden Inkubation der Muskelzellen mit der PBS) wurden auf einer RP-HPLC-Säule (C-18) chromatographiert. Die Elutionsflüssigkeit war ein Gradient aus Wasser in HPLC- Qualität, hergestellt in einer B-pureTM-Vorrichtung (Bamstead, Dubuque, Iowa), und Acetonitril in HPLC-Qualität (G. T. Baker, USA). Der Gradient der Elutionsflüssigkeit lag innerhalb von 30 Minuten zwischen 0% Acetonitril und 60% Acetonitril. Die Fließrate betrug 100 ml/Min.. Zwei-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt (die jeweils aus 200 ml bestanden).
20 ml von jeder erhaltenen HPLC-Fraktion wurden in einer Anreicherungszentrifuge zur Trockene eingedampft und die trockenen Fraktionen anschließend in 100 ul Wasser suspendiert, danach erneut zur Trockene eingedampft und anschließend in 2 ml PBS gelöst, danach wurden die Fraktionen in dem Test mittels Zählen von Zellen auf ihre Proliferation-hemmende Aktivität getestet, indem 0,2 ml von jeder Fraktion in eine Mikrovertiefung gegeben wurden, die Testzellen enthielt.
Die Fig. 16 und 17 zeigen die Aktivität von verschiedenen Fraktionen aus zwei unterschiedlichen Läufen. Die Ergebnisse aus beiden Läufen zeigen das Vorliegen einer spezifischen Hemmaktivität, die in den Fraktionen 5 und 6 von Fig. 16 und in den Fraktionen 8 bis 12 von Fig. 17 eluiert wurde.
Die Fraktionen 5 und 6 von Fig. 16 wurden vereinigt, bei 45ºC eingedampft, in 5 ml Wasser gelöst, in Röhrchen überführt und erneut im Vakuum getrocknet, in 2 ml Wasser gelöst und sterilisiert. 1 ml dieser eingeengten Fraktionen wurde in einer analytischen RP-HPLC-(C18)-Säule mit einem Gradienten aus Laufflüssigkeiten zwischen 100% Wasser und 60% Acetonitril innerhalb von 20 Minuten chromatographiert, wobei die Fließrate 1 ml/Min. betrug. 1-Minute-Fraktionen (jeweils 1 ml) wurden gesammelt, sodann getrocknet, in 0,4 ml RPMI, enthaltend 5% HS, gelöst und sterilisiert. 0,15 ml wurden zu jeder Zellen-enthaltenden Vertiefung zugegeben (wobei die Aktivität durch den Test mittels Zählen von Zellen bestimmt wurde). Zur Kontrolle wurden PBS- Lösungen in ähnlicher Weise durch HPLC fraktioniert und auf Aktivität getestet.
Die Aktivität der verschiedenen eluierten Fraktionen ist in Fig. 18 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass in Fraktion 15 eine spezifische Hemmaktivität vorliegt.

7.6.2. HPLC mit einer Superdex-Säule

Die aktiven Fraktionen von Fig. 17 wurden in zwei vereinigte Fraktionen aufgeteilt; eine erste Fraktion, die mit "FR1" bezeichnet wurde, wurde aus der Kombination von 1200 ml aus den Röhrchen 6 bis 8, von 550 ml aus den Röhrchen 8 bis 9, 300 ml aus den Röhrchen 9 bis 10 und 30 ml aus den Röhrchen 10 bis 11 erhalten; eine zweite Fraktion, die mit "FR2" bezeichnet wurde, wurde aus 250 ml der Röhrchen 9 bis 10, 520 ml der Röhrchen 9 bis 11 und 600 ml der Röhrchen 11 bis 12 erhalten. Die Fraktionen FR1 und FR2 wurden jeweils getrocknet und in 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Da sich nach der Zentrifugation ein unlöslicher Niederschlag bildete, wurden diese Fraktionen weiter mit 10 ml (im Fall von FR1) und mit 5 ml (im Fall von FR2) PBS extrahiert. Auch nach der zweiten Extraktion blieb ein deutlicher Niederschlag zurück.
Die Ergebnisse zeigten, dass der größte Teil der Aktivität in FR1 vorlag; FR2 wies nur etwa 15 bis 20% der Aktivität von FR1 auf. Der PBS-Extrakt des unlöslichen Präparats besaß im Vergleich zu FR1 nur etwa 4% der Aktivität.
2 ml von FR2 wurden getrocknet und in 0,4 ml Wasser gelöst. 0,2 ml wurden auf eine mit PBS äquilibrierte Superdex-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 1 ml/Min. mit PBS als Laufmittel entwickelt und 1-ml-Fraktionen gesammelt. 0,3 Min. nach dem Beginn der Trennung wurde mit dem Sammeln begonnen. Die eluierten Fraktionen wurden sterilisiert und 0,2 ml zu jeder Vertiefung zugegeben.
Die Hemmaktivität der verschiedenen Fraktionen wurde aus der Superdex-Säule wie in Fig. 19 dargestellt eluiert. Eine spezifische Hemmaktivität ist in den Fraktionen 18 bis 22 zu sehen. Die Fraktionen 18 bis 22 wurden herausgegriffen und erneut auf der gleichen Säule unter den gleichen Bedingungen chromatographiert. Die Ergebnisse der erneuten Chromatographie weisen auf die Möglichkeit hin, dass in diesen Fraktionen ein Gemisch aus zwei oder mehr Wirkstoffen ("MFs") vorliegt.
Ein ähnliches Elutionsprofil wurde auch mit FR1 erhalten, wobei die Ergebnisse jedoch zu zeigen scheinen, dass FR1 in seinem MF-Gehalt im Vergleich zu FR2 etwa 10-mal stärker angereichert war.

7.6.3. Analytische RP-HPLC nach der Superdex-HPLC

Die Fraktionen FR1 und FR2 wurden vereinigt und 1-ml-Aliquots auf eine analytische RP-HPLC-(C18)-Säule aufgetragen. 1-ml-Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet und in 0,4 ml RPMI, enthaltend 5% HS, gelöst, sodann wurden 0,5 ml dieser Lösung zu jeder Zellen-enthaltenden Vertiefung zugegeben. Die Ergebnisse sind in Fig. 20 dargestellt. Wie ersichtlich ist, liegt in Röhrchen 16 ein einzelner scharfer Aktivitätspeak vor. Außerdem war in Röhrchen 4 auch eine schwache Hemmaktivität zu sehen. Diese Ergebnisse zeigen, dass im Muskelzellen-CM möglicherweise mehr als ein Tumorproliferation-hemmendes Mittel vorliegt.

7.6.4. Größenausschluss- (SE-) HPLC

Die Fraktionen 6 bis 8 ("A"), 8 bis 10 ("B"), 10 bis 12 ("C") und 12 bis 14 ("D") aus der präparativen RP-HPLC wurden getrennt auf einer Säule chromatographiert, die Silicon-Gelpartikel enthielt, welche mit Polyhydroxyethylaspartamid beschichtet waren (PolyHYDROXYETHYL-ATM, hergestellt von PolyLC). Das Laufmittel war eine isokratische Lösung (d.h. ohne Gradient), die eine wässrige Lösung von 50 uM Ameisensäure darstellte.
Fraktionen zu 0,5 ml wurden gesammelt, getrocknet und in 0,8 ml PBS gelöst. Anschließend wurden 0,15 ml von jeder Fraktion zu jeder Zellen-enthaltenden Vertiefung zugegeben. Die Ergebnisse der Chromatographie sind in Fig. 21 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass in der Fraktion 6 bis 8 keine Aktivität vorlag, außer vielleicht eine schwache Aktivität im Röhrchen 32. In der Fraktion B ist ein sehr deutlicher und breiter Aktivitätspeak in den Röhrchen 29 bis 37 zu sehen. In der Fraktion C liegen zwei deutliche Aktivitätspeaks vor, einer in den Röhrchen 21 bis 23 und der andere in den Röhrchen 28 bis 31. Schließlich scheint in der Fraktion D in den Röhrchen 21 bis 22 ein einzelner Aktivitätspeak vorzuliegen.

7.6.5. Superdex-HPLC nach der SE-HPLC

Die aus der SE-Säule eluierten aktiven Fraktionen wurden vereinigt und in einer Anreicherungszentrifuge unter hohem Vakuum getrocknet (HetovacTM VR-1, hergestellt von Heto, Dänemark), in 0,4 ml gelöst und danach 0,2-Proben auf mit PBS äquilibrierten Superdex-Säulen aufgetrennt. Fraktionen zu 1 ml wurden gesammelt und danach 0,2 ml zu jeder Zellen-enthaltenden Vertiefung zugegeben.
Wie aus Fig. 22A ersichtlich ist, zeigten die SE-HPLC-Röhrchen 29 bis 33 von Fraktion B in den aus der Superdex-Säule eluierten Röhrchen 21 bis 24 eine Hemmaktivität. Das Profil dieser Aktivität legt die Möglichkeit nahe, dass mehr als ein einziger Wirkstoff vorliegen oder dass der Wirkstoff in mehreren Formen auftritt.
Fig. 22B zeigt einen spezifischen Hemmpeak, der bei 17 bis 21 Minuten eluiert wurde.

7.6.6. Hydrophile-Wechselwirkung-HPLC

Die Fraktionen 27 bis 32 aus dem Aliquot einer Größenausschluss-HPLC, wie in der nachstehenden Fig. 25 dargestellt, wurden vereinigt, getrocknet und in 0,2 ml Wasser gelöst. Zwei Mengen von jeweils 0,085 ml wurden in eine Hydrophile-Wechselwirkung- (CHO-) HPLC-Säule injiziert (PolyGLYCOPLEXTM, hergestellt von Poly-LC). Anschließend wurde die Säule mit einer Lösung, die aus 70% Acetonitril in Wasser bestand, mit einer Fließrate von 1 ml/Min. entwickelt. 1-ml-Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet und in 0,6 ml PBS gelöst, sodann wurden 0,1-ml-Fraktionen zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben und in Kochsalzlösung im Zähltest getestet (Abschnitt 3.1.3.).
Das Aktivitätsprofil der aus dieser Säule eluierten Lösung ist in Fig. 23 zu sehen. Hieraus ist ersichtlich, dass die höchste spezifische Aktivität im CHO-Aliquot in den Fraktionen 2 bis 8 gefunden wurde, wobei jedoch auch in der Fraktion 10 ein schwächerer Hemmpeak zu sehen ist. Eine gewisse schwache Aktivität lässt sich auch in einem breiten Peak in den Fraktionen 21 bis 30 feststellen.

8. Reinigen des MF

8.1. Verfahren

Ein Verfahren zum Reinigen des MF wurde entwickelt, das aus den folgenden Schritten bestand:

(a) Herstellen eines konditionierten Mediums:

Das konditionierte Medium wird aus den L-8-Zellen in PBS wie unter 1.1.2. beschrieben hergestellt.

(b) Ultrafiltration

Das konditionierte Medium wird einer Ultrafiltration durch eine Membran mit einem Molekülausschluss von 3000 Dalton wie unter 2. beschrieben unterworfen.

(c) Präparative RP-HPLC

Anschließend wird das 3000-Dalton-Ultrafiltrat auf einer präparativen RP-HPLC- C18-Säule chromatographiert. Typischerweise wird die Säule zuerst 20 Minuten mit Wasser in HPLC-Qualität gewaschen, danach werden 200 ml des 3000-Dalton-Ultrafiltrats auf die Säule aufgetragen und das Waschen mit Wasser wertere zehn Minuten fortgesetzt. Sodann wird die Säule mit einem Acetonitril:Wasser-Gradienten zwischen 0% Acetonitril bis 60% Acetonitril innerhalb von 30 Minuten entwickelt. Die Fließrate des Laufmittels beträgt etwa 100 ml/Min.. Die aktiven Fraktionen werden in Fraktionen eluiert, die nach etwa 8 bis 14 Minuten aus der Säule erhalten werden.
Anschließend werden die aktiven Fraktionen vereinigt und die vereinigte Fraktion sodann auf einem Rotationsverdampfer (RotovapTM, Büchi, Schweiz) und danach mit einer Anreicherungszentrifuge eingeengt.

(d) Analytische RP-HPLC

Die vereinigte, eingeengte und getrocknete Fraktion wird sodann in 5 ml Wasser gelöst, erneut im Vakuum getrocknet und danach in 2 ml Wasser gelöst. 1 ml dieser angereicherten Fraktion wird danach auf einer analytischen RP-HPLC-C18-Säule chromatographiert, wobei als Laufmittel ein Acetonitril:Wasser-Gradient zwischen 0% und 60% Acetonitril innerhalb von 20 Minuten mit einer Fließrate von 1 ml/Min. eingesetzt wird. Die Säule wird beladen und danach fünf Minuten mit Wasser gewaschen. Nach dem Waschen wird die Säule mit dem Acetonitril-Gradienten entwickelt.
Die aktive Fraktion wird bei den Fraktionen eluiert, die aus der Säule nach 12 bis 19 Minuten erhalten werden.
Danach werden die aktiven Fraktionen in einer Anreicherungszentrifuge eingeengt und getrocknet.

(e) Größenausschluss-Chromatoqranhie

Die getrockneten Fraktionen werden mit Ameisensäure gemischt und die 200- ml-Proben dieser Lösung sodann auf die unter 7.6.4. beschriebene Größenausschluss- Säule aufgetragen, wobei die Entwicklungsflüssigkeit und die Laufbedingungen genauso wie hier beschrieben waren. Die aktiven Fraktionen wurden hauptsächlich nach 27 bis 32 Minuten eluiert.
Es sollte beachtet werden, dass andere Säulen, auch wenn sie ähnliche Eigenschaften wie die hier vorstehend beschriebenen aufweisen, und leichte Variationen der Elutionsbedingungen zu unterschiedlichen Elutionsprofilen führen können und demgemäß aktive Fraktionen nach anderen als den vorstehend beschriebenen Retentionszeiten eluiert werden können. Der Fachmann ist jedoch in der Lage, indem er jede Fraktion wie vorstehend beschrieben auf die Hemmaktivität testet, ohne übermäßige Schwierigkeiten die gereinigten Fraktionen, die den GR der Erfindung enthalten, zu finden und zu isolieren.

8.2. Ergebnisse der Reinigung

Fig. 24 zeigt das Profil der Hemmaktivität von Fraktionen, die aus einer analytischen RP-HPLC eluiert wurden, und die Aktivität von Fraktionen, die aus einer Größenausschluss-HPLC eluiert wurden (Fig. 25), wobei das Reinigungsverfahren wie im vorstehenden Abschnitt 8.1. beschrieben durchgeführt wurde.

9. NMR - mögliche Oligosaccharid-Natur des MF

Aktive Fraktionen, die aus der Größenausschluss-Säule wie in Fig. 25 dargestellt eluiert wurden, wurden getrocknet und danach in Methanol gelöst (wobei drei aufeinander folgende Zyklen aus Trocknen und anschließendem Lösen in Methanol durchgeführt wurden). Der Methanol-Extrakt wurde sodann zur Trockene eingedampft und das Präparat in 0,5 ml Deutero-Methanol gelöst. Der Rückstand nach der Methanol-Extraktion wurde in 0,5 ml Deutero-Wasser gelöst.
Das NMR-Spektrum ist in Fig. 26 zu sehen. Wie ersichtlich ist, zeigt das NMR- Spektrum der Wasserfraktion einen möglicherweise insignifikanten Peak, wohingegen das NMR-Spektrum des Methanol-Extrakts mehrere Peaks in einem Feld von 3 bis 4 ppm zeigt. Diese Peaks sind für Protonen von C-OH-Gruppen, typischerweise von Oligosacchsariden, charakteristisch.
Diese Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, dass der MF ein Oligosaccharid ist.

10. Aktivität des 3000-Dalton-Ultrafiltrats von einem Leukozyten-CM und die Fraktionierung davon

Ein 3000-Dalton-Ultrafiltrat, das aus einem Leukozyten-CM erhalten wurde, wurde auf seine Aktivität getestet und mit der eines 3000-Dalton-Ultrafiltrats aus einem L-8- CM verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V dargestellt. Tabelle V
200 ml des 3000-Dalton-Ultrafiltrats von dem Leukozyten-CM wurden auf einer präparativen RP-HPLC wie vorstehend beschrieben aufgetrennt (vgl. Abschnitt 7.6.6.). Fraktionen zu 200 ml wurden gesammelt. Aliquots zu 10 ml (von 200 ml) wurden getrocknet und in 0,6 ml gelöst. Danach wurde in jede Vertiefung 0,1 ml zugegeben.
Zum Vergleich wurde ein 3000-Dalton-Ultrafiltrat von dem L-8-CM in gleicher Weise fraktioniert.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI dargestellt. Tabelle VI
(1) 3000-Dalton-Ultrafiltrat von einem Leukozyten-CM
(2) 3000-Dalton-Ultrafiltrat von L-8-Zellen
Wie ersichtlich ist, zeigen beide Aliquots in den Fraktionen 4 bis 6 einen Hemmpeak.

Claims

1. Im wesentlichen gereinigter Zellwachstums-Regulator (GR), der entweder

(a) ein endogener GR mit niedrigem Molekulargewicht (LMW-EGR) ist, der ein Faktor mit den folgenden Merkmalen ist

i. er wird durch Muskelzellen oder Leukozyten produziert, von ihnen ausgeschieden oder abgestoßen,

ii. er hat ein Molekulargewicht von weniger als etwa 3000 Dalton,

iii. er ist nicht proteinartig,

iv. er ist in Wasser löslich,

v. er ist hitzestabil, und

vi. er ist biologisch wirksam, indem er die Proliferation von Zellen hemmt; oder der

(b) ein Faktor ist, der ein Derivat des Faktors nach (a) ist, und der biologisch wirksam ist, indem er die Proliferation von Zellen hemmt.

2. GR nach Anspruch 1, wobei der LMW-EGR durch Muskelzellen oder Leukozyten produziert, von ihnen ausgeschieden oder abgestoßen wird.

3. GR nach Anspruch 1, der biologisch wirksam ist, indem er die Proliferation von Tumorzellen oder die Proliferation von stimulierten Lymphozyten hemmt.

4. GR nach Anspruch 1, der biologisch wirksam ist, indem er die Proliferation von Tumorzellen hemmt, ohne die Proliferation von nicht-tumorösen Zellen wesentlich zu beeinträchtigen.

5. GR nach Anspruch 4, der biologisch wirksam ist, indem er die Proliferation von Tumorzellen hemmt, ohne die Proliferation von Knochenmarkzellen wesentlich zu beeinträchtigen.

6. GR nach Anspruch 4, der biologisch wirksam ist, indem er die Proliferation von Lymphomzellen hemmt, ohne die Proliferation von nicht-tumorösen Lymphozyten wesentlich zu beeinträchtigen.

7. GR nach Anspruch 1, wobei der LMW-EGR aus einem Medium erhalten werden kann, das durch das Wachstum von Muskelzellen oder Leukozyten konditioniert wurde.

8. GR nach Anspruch 1 mit einem Molekulargewicht unter etwa 2000 Dalton.

9. GR nach Anspruch 8 mit einem Molekulargewicht von etwa 500 Dalton oder darunter.

10. GR nach Anspruch 1, wobei der LMW-EGR von einer Ratten-Muskelzell-Linie ausgeschieden oder abgestoßen wird, die mit L-8 bezeichnet wird und die in der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Bezeichnung CRL 1769 hinterlegt ist.

11. Verwendung des GR nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln oder Verhindern einer Krankheit oder Störung.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Krankheit oder Störung Krebs ist.

13. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Störung ein Zustand ist, bei dem das Immunsystem sensibilisiert ist.

14. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Medikament an das Individuum oral verabreicht werden kann.

15. Zusammensetzung, die einen GR nach Anspruch 1 umfasst.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, die eine pharmazeutische Zusammensetzung ist und eine therapeutisch wirksame Menge eines GR nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16 zum oralen Verabreichen.

18. In-vitro-Verfahren zum Analysieren einer Körperflüssigkeit oder von Zellen, die von einem Individuum stammt/stammen, das an Krebs leidet oder bei dem ein Risiko vorliegt, dass ein Krebs entsteht, umfassend das Bestimmen des Spiegels des LMW-EGR, wie in Anspruch 1 definiert, in einer Körperflüssigkeit aus dem Individuum oder einem Überstand einer Kultur von Zellen, entnommen aus dem Individuum.

19. In-vitro-Verfahren zum Diagnostizieren einer Krebserkrankung eines Individuums oder zum Bestimmen des Risikos eines Individuums, dass bei ihm ein Krebs entsteht, umfassend:

(a) Bestimmen des Spiegels des LMW-EGR, wie in Anspruch 1 definiert, in einer getesteten Flüssigkeit, die entweder eine aus dem Individuum erhaltene Körperflüssigkeit oder ein Überstand einer Kultur von Zellen ist, entnommen aus dem Individuum;

(b) Vergleichen des Spiegels mit einem durchschnittlichen Spiegel des LMW- EGR in gesunden Individuen, wobei ein Spiegel über dem Durchschnitt anzeigt, dass das Individuum Krebs hat oder dass bei ihm ein hohes Risiko vorliegt, dass ein Krebs entsteht.

20. Verfahren zum Herstellen eines im wesentlichen gereinigten Zellwachstums- Regulators nach Anspruch 1, umfassend

(a) Züchten von Zellen unter Bedingungen, unter denen die Zellen einen Zellwachstums-Regulator in dem sie umgebenden Medium produzieren, in dieses ausscheiden oder abstoßen;

(b) Gewinnen des Überstands der Zellkultur

(c) Abtrennen einer Fraktion des Überstands, der Substanzen mit einem Molekulargewicht über etwa 3000 Dalton umfasst, von Fraktionen des Überstands, die Substanzen mit einem Molekulargewicht unter etwa 3000 Dalton umfassen, und Auswählen der Letzteren.

21. Verfahren nach Anspruch 20, umfassend

(d) Unterwerten der ausgewählten Fraktion weiteren chromatographischen Reinigungsverfahren.

22. Verfahren zum Reinigen eines Zellwachstums-Regulators, umfassend

(a) Züchten von Muskelzellen oder Leukozyten;

(b) Gewinnen des Überstands der Zellkultur;

(c) Filtrieren des Überstands durch eine Membran mit einem Molekülausschluss von etwa 500 bis 3000 Dalton;

(d) Chromatographieren des in (c) erhaltenen Filtrats mit einer Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie- (RP-HPLC)-Säule und Auswählen der Fraktionen, die eine wachstumshemmende Wirkung auf Tumorzellen zeigen.

23. Verfahren nach Anspruch 21, umfassend:

(a) erneutes Chromatographieren der in Schritt (d) erhaltenen ausgewählten Fraktionen mit einer RP-HPLC-Säule und Auswählen von Fraktionen, die eine wachstumshemmende Wirkung auf Tumorzellen zeigen.

24. Verfahren nach Anspruch 21, umfassend:

(e) Chromatographieren der in Schritt (d) erhaltenen ausgewählten Fraktionen mit einer Größenausschluss-Chromatographie und Auswählen von Fraktionen, die eine wachstumshemmende Wirkung auf Tumorzellen zeigen.