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KR100260110B1 - 담즙으로부터 추출된 면역조절제 조성물 - Google Patents

담즙으로부터 추출된 면역조절제 조성물 Download PDF

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KR100260110B1
KR100260110B1 KR1019960701198A KR19960701198A KR100260110B1 KR 100260110 B1 KR100260110 B1 KR 100260110B1 KR 1019960701198 A KR1019960701198 A KR 1019960701198A KR 19960701198 A KR19960701198 A KR 19960701198A KR 100260110 B1 KR100260110 B1 KR 100260110B1
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KR
South Korea
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bile
solution
tnf
macrophages
Prior art date
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KR1019960701198A
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English (en)
Inventor
로미오 랑
Original Assignee
라카일레 지. 필리페
로러스 세러퓨틱스 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 3000 달톤 미만의 작은 분자항을 가지고 있는 성분을 포함하고 있는 면역조절제 조성물에 관한 것으로서 a) 동물의 담즙으로부터 추출가능함; b) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극할 수 있음; c) 종양괴사인자의 생산을 조절할 수 있음; d) IL-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF 또는 IFN-Γ를 측정불가능한 수준으로 포함하고 있음; e) 악성 마우스 하이브리도마 세포주에서 항증식효과를 가지고 있음; f) 사람의 말초혈관 단핵세포에 대해 세포득성을 가지고 있지 않음; g) 내독소가 아니라는 특성을 가지고 있다. 본 발명은 또한 상기 조성물의 제조방법 및 면역조절제로서의 그 이용방법에 관한 것이기도 하다.

Description

[발명의 명칭]
담즙으로부터 추출된 면역조절제 조성물
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 면역조절제 조성물, 그 면역조절제를 포함하는 약제 및 이러한 조성물과 약제를 동물의 질병 치료시 이용하는 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
후천성면역결핍증(Acquired Immunodeficiency Syndrome:AIDS)과 같은 감염성 질병과 암의 예방 및 치료를 위해 여러 가지 치료요법들이 계속적으로 개발되고 있다. 이러한 치료요법 중의 일부는 면역시스템을 치료학적으로 이용하고자 하는 것이다. 첫 번째 접근방법은 면역시스템의 항원 특이적 요소 즉, 항체와 T 세포를 기초로 하고 있다. 예를 들어, 외래 인자, 또는 인터루킨과 같이 항체반응을 억제하는 특정의 내인성 화학적 전령체(endogenous chemical messenger)에 대항하는 백신을 계발하는 것을 목적으로 연구가 이루어져 왔다. 두 번째 접근방법은 면역시스템의 비항원 특이적 부분으로부터 펩티드와 단백질을 분리, 클로닝, 발현 및 생산하는 것을 기초로 하고 있다. 예를 들어 백혈구 세포에 의해 생산되는 인터루킨을 포함하는 사이토킨과 같은 단백질과, 림프구 세포를 자극하고 외래의 항원을 섭취하는 포착 세포(scavenger cell)를 자극하는 인터페론과 같은 단백질은 치료요법에 이용될 가능성을 제공한다.
종양에 대한 초기 면역반응이 증대되어 종양이 임계 크기에 도달하지 않는다면, 암의 치료는 크게 개선될 수 있을 것이다. 종양에 대한 면역반응을 증대시키기 위해 제안된 방법으로는 종양과 연관된 항원에 대해 특이적인 백신을 이용하는 방법; 인터루킨-2 수용체에 대한 모노클로날 항체와 같이 종양 세포 표면상의 항원어 대한 모노클로날 항체를 이용하는 방법; 항종양 항체와 초항원(superantigen)을 가지고 있는 이중 특이적 분자(bispecific molecule) 이용하는 방법이 있다.
비교적 최근에, 종양괴사인자(tumor necrosis factor:TNF)로 알려져 있는 생리학적으로 활성이 있는 폴리펩티드의 역할, 특히 생체의 정상적인 조직에는 영향을 주지 않으면서 종양의 괴사를 유도하는 그것의 능력에 대해 연구가 이루어졌다. TNF를 코딩하는 DNA의 염기 씨퀀스 뿐만아니라 TNF의 아미노산 씨퀀스가 미국특허 제4,879,226호에 개시되어 있다.
TNF가 종양의 괴사를 유도하는 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 생체내에서 TNF의 생산 또는 생물하적 이용성을 촉진할 수 있는 인자는 모두 여러 가지 종양성 상티의 치료제로서의 이용가능성을 가지고 있다. 또한, 사람의 단핵세포(monocyte)와 대식세포(macrophage)를 자극하여 시험관내에서 TNF를 생산할 수 있는 인자는 모두 분석목적 및 진단목적 뿐만아니라 치료학적 요법을 위한 TNF의 원천을 제공하는 수단으로서 유용하다.
간에 의해 분비되어 담낭에 저장되는 담즙에 대해, 정상적인 간기능(WO 90/12583 참조)에 의해 쉽게 대사되는 약의 생물학적 이용성의 증진을 위해, 또한 포유동물에 있어서 백혈구증가증(leucocytosis)을 저해하기 위해서(시노다 등, Chem. Pharm. Bull., 30 4429-4434(1982) 참조) 담즙 추출물을 이용하는 방법을 포함하여 여러 가지 목적으로 연구가 이루어져 왔다. 그러나, 종양 또는 감염성 질병에 대하여 담즙이 치료학적으로 유용한 조성물의 원천이 되는 것으로는 결코 생각도 못했었다. 흥미롭게도, 영국특허 제337,797호에서 항암제의 잠재적인 원천으로서 담낭 자체 단, 담낭으로부터 담즙을 제거하고 담낭을 완전히 새척한 다음 담낭 자체를 이용하는 방법이 제안되었다.
[발명의 요약]
이제 담즙은 생체내와 시험관내에서 모두 TNF의 생산을 자극할 수 있는 조성물의 중요한 원천이며, 여러 가지 악성 종양, 특히 췌장암의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다.
담즙 조성물은 수용성 또는 수혼화성 용매로 담즙을 추출함으로써 얻어진다. 이렇게 하여 얻어진 담즙 추출물은 불필요하고 바람직하지 아니한 성분의 제거를 위해 더 가공될 수 있다.
이하 보다 상세히 기재되어 있는 담즙 추출방법에 의해 얻어지는 생성물은 생성물은 TNF 자극활성을 가지고 있고, 항암작용, 특히 췌자암이나 기타 암에 대한 항암작용을 가지고 있는 것으로 보인다. 분명한 것은, 이렇게 하여 얻어지는 조성물 전체가 이러한 합성에 필요하지는 않다는 것이다. 따라서, 더 분리하고 분별하거나 또는 가공하여 원하는 TNF 자극 활성과 항암작용을 여전히 가지고 있는 생성물을 얻을 수 있다. 또한, 동일한 또는 유사한 TNF 자극활성과 항암작용을 가지고 있는 생성물을 합성방법에 의해 얻을 수 있다는 것에 대해서도 생각해볼 수 있다. 그러므로, 원하는 활성을 나타내는 성분 또는 조합에 대해 이러한 생성물의 성분들을 분석할 수 있고, 이러한 분석을 토대로 합성 생성물이 만들어질 수 있다.
본 발명의 일태양은, 3000달톤 미만의 작은 분자량을 가지고 있는 성분을 포함하고 있고 하기와 같은 성질을 하나 이상 가지고 있는 면역조절제로서 이용되는 조성물에 관한 것이다:
a) 동물의 담즘으로부터 추출가능함;
b) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극할 수 있음;
c) 종양괴사인자의 생산을 조절할 수 있음;
d) IL-1a, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF 또는 IFN-ｒ를 측정불가능한 수준으로 포함하고 있음;
e) 악성 마우스 하이브리도마 세포주에서 항증식효과를 가지고 있음;
f) 사람의 말초혈관 단핵세포에 대해 세포독성을 가지고 있지 않음;
g) 내독소가 아님.
바람직한 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 소의 담즘으로부터 추출되며, 종양괴사인자의 분비를 자극할 수 있다.
본 발명의 조성물은 (a) 동물, 바람직하기로는 소의 담즙을 수용성 또는 물과 혼화가능한 용매, 바람직하기로는 알콜, 보다 바람직하기로는 동일량의 알콜과 혼합하여 담즙/알콜 용액을 제조하는 단계; (b) 바람직하기로는 알콜 용해성 분획(fraction)을 상기 용액으로부터 분리하여, 가열 등의 방법을 이용하여 대분분의 알콜을 제거함으로써 알콜이 실질적으로 포함되지 않은 용액을 분리하는 단계; (c) 상기 용액으로부터 담즙 색소를 제거하여 무색의 액체를 얻는 단계; (d) 필요에 따라 상기 무색 액체를 처리하여 잔류하는 알콜을 실질적으로 제거하는 단계; (e) 상기 무색 액체를 에테르로 추출한 다음 수상을 분리하는 방법에 의해 지방성 유기물질을 제거하는 단계; 및 (f) 필요에 따라 상기 수상으로부터 잔류하는 에테르를 제거하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
상기 조성물은 더 가공됨이 없이 단순히 바이알에 포장되어 멸균됨으로써 이용될 수 있다. 또한 농축된 형태로도 이용될 수 있다. 바람직한 농축형태는 다음과 같이 제조된다. 상기 (e) 단계에 앞서서, 필요에 따라 무색의 액체가 담즙/알콜 용액 부피의 약 1/8로 농축되고, (f) 단계 이후에 수상이 상기 담즙/에탄올 용액 부피의 1/10로 되도록 농축될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 신규의 조성물을 포함하고 있는 약제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 환자에게 본 발명의 조성물 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역반응의 조정을 요하는 질병 및 상태, 바람직하기로는 감염성 질병과 종양의 예방 및 치료시 본 발명의 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 태양 및 기타 티양은 하기 상세한 설명과 첨부된 도면을 참조로 보다 명확하게 될 것이다. 또한, 여기에 전체로서 참고문헌으로 인용되어 있는 여러 가지 다양한 공개문헌도 참고로 이용된다.
[도면의 간단한 설명]
본 발명의 보다 상세한 사항은 첨부된 도면에 도시되어 있는 예들을 참조로 아래에 기재되어 있다.
제1도는 본 발명의 농축된 조성물에 대한 HPLC 프로파일이다.
제2도는 본 발명의 농축된 조성물에 대한 HPLC 프로파일이다
제3도는 본 발명의 농축된 조성물에 대한 HPLC 프로파일이다.
제4도는 본 발명의 조성물에 대한 HPLC 프로파일이다.
제5도는 본 발명의 조성물어 대한 HPLC 프로과일이다.
제6도는 본 발명의 조성물어 대한 HPLC 프로파일이다.
제7도는 본 발명의 조성물에 대한 HPLC 프로파일이다.
제8도는 PBMN에 의한 TNF의 LPS-유도성 분비에 미치는 조성물의 영향을 나타내는 그래프이다.
제9도는 PBMN에 의한 TNF의 LPS-유도성 분비에 미치는 조성물의 영향을 나타내는 막대 그래프이다.
제10도는 본 발명의 조성물에 대한 C18RP-HPLC 프로파일이다.
제11도는 본 발명의 조성몰의 침전물 분획에 대한 RP-HPLC 분석 결과를 나타낸다.
제12도는 본 발명의 조성물의 수용성 분획에 대한 RP-HPLC 분석 결과를 나타낸다.
제13도는 췌장암으로 진단된 환자를 본 발명의 조성물로 치료하여 얻은 생존율을 나타내는 그래프이다.
제14도는 췌장암으로 진단된 환자를 본 발명의 조성물로 치료한 경우의 생존율을 나타내는 그래프이다.
제15도는 흑색종 환자를 본 발명의 조성물로 치료한 경우의 생존율을 나타내는 그래프이다.
제16도는 둘 또는 그 이상의 종양 부위를 가지고 있는 흑색종 환자를 본 발명의 조성물로 치료한 경우의 생존율을 나타내는 그래프이다.
제17도는 셋 또는 그 이상의 종양 부위를 가지고 있는 흑색종 환자를 본 발명의 조성물로 치료한 경우의 생존율을 나타내는 그래프이다.
제18도는 본 발명의 전체 조성물에 대한 RP-HPLC 프로파일을 나타내는 그래프이다.
제19도는 본 발명의 조성물의 침전물에 대한 RP-HPLC 프로파일을 나타내는 그래프이다.
제20도는 본 발명의 조성물의 상등액에 대한 RP-HPLC 프로파일을 나타내는 그래프이다.
제21도는 본 발명의 조성물에 대한 SDS겔이다.
제22(a)도는 친수성 HPLC 상에서의 본 발명의 조성물의 상태 및 용출시간을 나타내며, 제22(b)도는 본 발명의 조성물의 상등액에 대한 용출 프로파일을 나타낸다.
제23도는 친수성 HPLC 상에서 본 발명의 조성물의 침전물이 용출되는 프로파일을 나타낸다.
제24도는 말초혈관 단핵세포의 기능을 자극하는데 있어서 본 발명의 조성물애 대한 투여량 반응을 나타내는 그래프이다.
제25도는 본 발명의 조성물로 치료하기 전(25A도)과 후(25B도)의 악성 흑색종에 대한 사진이다.
[발명의 상세한 설명]
전술한 바와 같이, 본 발명은 3000 달톤 미만의 작은 분자량을 가지고 있는 성분을 포함하고 있으며, 다음과 같은 성질을 가지고 있는 면역조절제용 조성물에 관한 것이다:
a) 동물의 담즙으로부터 추출가능함;
b) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극할 수 있음;
c) 종양괴사인자의 생산을 조정할 수 있음;
d) IL-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF 또는 IFN-Γ를 측정불가능한 수준으로 포함하고 있음;
e) 악성 마우스 하이브리도마 세포주에서 항증식효과를 가지고 있음;
f) 사람의 말초혈관 단핵세포에 대해 세포독성을 가지고 있지 않음;
g) 내독소가 아님.
보다 상세하게는, 조사 결과 본 발명의 조성물의 적어도 일부는 정상적인 단핵세포를 자극하여, 단핵세포의 독성을 측정하는데 이용되는 창 간종양 세포주(Chang hepatoma cell line)에 대해 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 암환자(자궁경부암과 난소암)의 단핵세포와 대식세포는 또한 상기 조성물에 의해 자극을 받아 그 자신의 특정 종양세포를 공격하여 파괴시키는 것으로도 보고되었다.
본 발명의 조성물은 종양괴사인자(TNF)의 생산을 조절할 수 있다. 소의 담즙으로부터 추출된 본 발명의 바람직한 조성물은 사람의 말초혈관 단핵세포로부터 생리적인 양 정도로 TNF의 분비를 촉진한다. TNF가 염증성 및 항종양성 사이토킨으로 인한 일련의 단계적 효과를 개시케하는 것으로 알려져 있기 때문에 바람직한 조성물은 TNF(및 가능하다면 그밖의 사이토킨까지도)를 분비하도록 사람의 림프구세포를 자극함으로써 자기의 항암효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 종양세포에 대한 림프구세포와 대식세포의 세포독성을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 마우스 하이브리도마 세포주 #6-1의 성장을 저해하는 것으로도 밝혀졌다. 마우스 하이브리도마 세포에 있어서의 이러한 조성물의 저해효과는 증식억제작용을 의미하는 것이다.
말초혈관 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell:PBMN)의 생존성에 대한 상기 조성물의 영향에 대해서도 조사가 이루어졌다. 이 조성물은 사람의 PBMN에 대해 세포독성이 없는 것으로 밝혀졌다.
하기 더 예시되어 있는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 다른 무엇보다도 하기와 같은 특징을 가지고 있다:
1) PBMN으로부터 TNF를 분비시키는테 관여하는 성분 또는 성분들은 C18RP-HPLC 칼럼으로부터 초기에 용출되어 나온다.
2) TNF-분비성분(들)은 80% 아세토니트릴에 의해 부분적으로 침전된다.
3) 80% 아세토니트릴에 의해 침전되지 않는 물질은 약간의 TNF 분비활성을 나타낸다.
4) 80% 아세토니트릴에서의 침전물과 상등액에서의 TNF 분비활성은 RP-HPLC로부터 초기에 동시에 용출된다. 이러한 결과는, 조성몰에 있는 활성 TNF 분비성분은 용해도 차이를 의미하는 약간의 분자량 차이는 있을 수 있지만 동일한 분자군에 속하고 있다는 것을 나타내는 것이다.
5) 상기 조성물은 인터루킨-1β(IL-1β의 분비를 야기하며, IL-1β를 분비하는 작용을 하는 성분은 RP-HPLC로부터 초기에 용출되는데, 이는 이 성분이 TNF를 분비하는 물질과 동일한 물질이라는 것을 암시하는 것이다.
6) 상기 조성물은 또한 적은 양의 인터루킨-2(IL-2)의 분비를 야기한다.
7) 상기 조성물은 과립 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor:GM-CSF)의 분비를 야기한다; 80%
아세토니트릴에 침전되는 분획은 상등액 분획보다 활성이 크다.
8) TNF:GM-CSF의 분비비율은 약 2:1이다.
9) 80% 아세토니트릴에 침전되는 분획은 상등액분획보다 약 3배의 TNF 및 GM-CSF 분비성분을 가지고 있다.
10) RP-HPLC에 의해 분리된 상기 침전물과 상등액에 대한 분석결과 TNF, IL-1β 및 GM-CSF에 대한 분비활성은 침전물과 상등액의 경우 모두 초기에 용출되는 것으로 나타났다. 그러나, 상등액의 경우 약간의 IL-1β 활성이 늦게 용출된다.
11) 상기 조성몰에서 동일한 분자(들) 즉, 성분(들)이 TNF, IL-1β 및 GM-CSF에 대한 분비기능을 가지고 있다. 이 조성물이 여러 가지 사이토킨의 분비를 자극하는 작용을 하거나 또는 하나의 사이토킨의 생산과 분비를 자극한 다음 이 사이토킨이 다시 다른 사이토킨의 생산과 분비를 자극하는 작용을 할 수도 있다.
12) 침전물과 상등액을 포함하여 조성물을 DSD 겔 전기영동 및 분자체(molecular sieve) HPLC 등에 물리화학적으로 분석하면 주성분들은 분자량이 2500달톤 미만이다.
13) 친수성(폴리하이드록시에틸) 분자체 HPLC에 의해 물리화학적으로 좀 더 분석하면 조성물의 저분자량 성분들을 확인할 수 있다.
14) 산가수분해 전, 후의 아미노산 분석에 의하면 펩티드의 존재를 의미하는 펩티드결합이 존재하는 것을 알 수 있다.
15) RP-HPLC로부터의 활성 분획의 아미노산 분석 결과 많은 부분을 차지하는 것은 글루타메이트/글루타민과 글리신인 것으로 나타났다. 또한, 아스파라긴, 트레오닌, 세린 및 알라닌의 잔기들도 검출되었다.
16) 유리 아미노산인 듯한 미확인된 닌히드린 양성 잔기가 약간 존재한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 (a) 동물, 바람직하기로는 소의 담즙을 동일량의 알콜과 혼합하여 담즙/알콜 용액을 제조하는 단계; (b) 알콜 용해성 분획을 상기 용액으로부터 분리하여, 알콜이 실질적으로 포함되지 않은 용액을 분리하는 단계; (c) 상기 용액으로부터 담즙 색소를 제거하여 무색의 액체를 얻는 단계; (d) 상기 무색 액체를 처리하여 잔류하는 알콜을 실질적으로 제거하는 단셰; (e) 상기 무색 액체를 에테르로 추출한 다음 수상을 분리하는 단계: 및 (f) 상기 수상으로부터 잔류하는 에테르를 제거하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
상기 조성물은 담즙을 생산하는 동물, 바람직하기로는 사람을 제외한 동물로부터 얻어진다. 이 조성물이 다른 종(species)에 적대적인 하나의 종으로부터 얻어진다면, 특정 질병에 대해 서로 다른 활성을 나타낼 수 있기는 하지만, 일반적으로 적합한 담즙의 원천은 소, 양, 돼지로부터 추출되는 것이다. 대부분의 경우에, 본 발명의 조성물을 제조하는데 있어서 소, 양, 돼지와 같이 도살된 건강한 식용 동물의 담즙을 이용하는 것이 실용적이다. 이렇게 하여 수집된 담즙은 도살된 동물의 담낭으로부터 직접 추출된 것이어야 하며, 실질적으로 께꿋해서 점액의 양이 아주 적어야 하고 실질적으로 고름 또는 혈액이 없어야 한다.
상기 제조방법에 대한 바람직한 구체적 실시예에 있어서, 소에서 추출된 담즙이 이용된다. 소의 담즙은, 한 마리로부터 비교적 다량의 담즙이 추출될 수 있기 때문에 풍부하다. 또한, 소들은 루틴하게 도살되고 보건관련규정에 따라 검사를 거치므로, 이러한 동물들은 본 발명의 조성물의 제조를 위한 믿을만한 원천을 제공한다. 더구나, 사람들은 소에 기원을 두고 있는 물질에 대해서는 그다지 알러지 반응을 나타내지 않는다.
담즙이 동일량의 알콜과 혼합되어 50% 알콜인 담즙/알콜 용액이 만들어진다. 알콜로는 지방족 알콜, 바람직하기로는 메탄올, 에탄올 또는 프로판올, 가장 바람직하기로는 에탄올이 이용된다.
50% 알콜-불용성 물질이 거의 없는 용액은 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 바람직하기로는, 담즙/알콜 혼합액이 3000-5000rpm, 가장 바람직하기로는 4200rpm, 약 15-25℃에서 적어도 2시간동안 원심분리된다. 담즙/알콜 용해성 분획에 포함된 알콜은 종래의 방법 즉, 상기 부분을 적절한 온도, 예를 들어 80-85℃로 적절한 시간, 예를 들어 약 10시간까지 가열하는 등의 방법에 의해 알콜과 물의 서로 다른 휘발성을 이용하여 제거될 수 있다.
담즙의 색소가 활성화된 차콜, 폴리아미드로된 미세입자 또는 여과법에 의해 용액으로부터 제거됨으로써 무색의 액체가 얻어진다. 바람직하기로는 활성화된 차콜을 처리하는 방법이 이용된다. 상기 용액이 광학밀도(Optical density:O.D.)와 전도도 표준치(Conductivity standard)를 만족시키도록 이와 같은 처리들이 반복될 수 있다.
상기 무색의 액체가 종래의 방법에 의해 처리됨에 따라 잔류하는 알콜이 실질적으로 제거된다. 바람직하기로는, 약 1.0-3.5㎛, 가장 바람직하기로는 2.5㎛의 잔류크기를 가지고 있는 필터를 이용하여 무색의 액체을 여과한다.
이어서 에테르를 이용하여 무색의 액체를 추출하고 수상을 분리한다. 이 과정에서 이용되는 에테르는 바람직하기로는 디메틸에테르, 에틸에테르, n-프로필에테르, 이소프로필에테르, 또는 n-부틸에테르이며, 가장 바람직하기로는 에틸에테르이다.
잔류 에테르는, 예를 들어 상기 용액을 55℃, 바람직하기로는 약 40℃까지, 약 5-15시간, 가장 바람직하기로는 약 10시간동안 가열함으로써 수상으로부터 제거될 수 있다.
상기 조성물은 더 가공됨이 없이 단순히 바이알에 포장되어 멸균됨으로써 이용될 수 있다. 또한 농축된 형태로도 이용될 수 있다. 바람직한 농축형태는 다음과 같이 제조된다. 상기 (e) 단계에 앞서서, 필요에 따라 무색의 액체가 예를 들어 약 85℃ 미만의 온도, 바람직하기로는 약 60-70℃의 온도로 가열됨으로써 담즙/알콜 용액 부피의 약 1/8로 농축된다. (f) 단계 이후에, 예를 들어 약 80-85℃의 온도로 가열됨으로써 수상이 상기 담즙/에탄올 용액 부피의 1/10이 되도록 농축될 수 있다.
본 발명의 조성물 제조를 위한 바람직한 방법에 있어서, 수집된 담즙을 동일량의 에탄올과 혼합한다. 담즙/알콜 혼합액을 20±2℃에서 적어도 약 2시간 반동안 약 4200rpm으로 원신분리한다. 상등액을 따라내고 pH와 에탄올의 함량을 조사한다. 담즙의 색소는 활성화된 차콜을 이용하여 제거한다. 처리된 담즙/에탄올 용액에 대해 광학밀도와 전도도를 조사한다. 허용가능한 범위를 벗어나는 O.D. 값 또는 전도도는 담즙의 색소 제거를 위해 담즙/에탄올 용액을, 예를 들어 활성화된 차콜을 다시 한 번 처리해야 한다는 것을 나타내는 것이며 이러한 처리에 의해 범위 내의 수치를 얻게 된다.
활성화된 차콜로 처리한 후에는 상기 용액을 2.5㎛의 잔류크기를 갖는 필터로 여과하고, 알콜은 85℃ 미만의 온도로 가열함으로써 증발시키고, 용액은 원래 담즙/에탄올 용액 부피의 약1/8로 농축한다. 농축된 용액을 액 20-25℃의 온도로 냉각한다. 이 용액을 에틸에테르와 혼합하여 에테르상을 따라 낸다. 바람직하기로는, 비교적 적은 양의 에테르, 예를 들어 0.1-1배, 바람직하기로는 0.2-0.5배의 에테르를 이용하며, 강하게 교반한다. 이 과정은 한 번 반복될 수 있다. 수상을 55℃까지 약 10시간 동안 가열하여 잔류 에테르를 제거한 다음, 약 80-85℃로 가열하여 그 부피를 원래 담즙/에탄올 부피의 1/10로 줄인다. 이 용액에 대해 외양, 생물학적 활성 및 에탄올과 에테르 함량을 조사한다.
상기 조성물의 pH는 염산(1%) 용액과 수산화나트륨(1%) 용액을 이용하여 생리적 pH 즉, 7.4-7.5로 조절될 수 있으며 , 종래의 통상적인 방법에 의해 완충제로서 제1 및 제2 인산나트륨을 이용하여 완충용액이 얻어질 수 있다.
상기 조성몰은 더 가공됨이 없이 단순히 바이알에 포장되어 멸균됨으로써 이용될 수 있다. 바람직한 멸균방법은 상기 조성물에 대해 오오토클레이빙한 다음 항온처리(incubation)하는 멸균 사이클을 3회 실시하는 것이다.
상기 조성물은 농축형태로 이용될 수 있다. 농측형태의 제조방법은 전술한 바와 같다. 상기 조성물은 또한 동결건조될 수도 있다.
상기 조성물과 농축된 조성몰은 10ppm 이하의 에탄올과 5ppm 이하의 에테르를 포함하며, 그 외의 외래 물질이 거의 없는 맑은 황색 용액이다. 실시예 4에 기재되어 있는 생물학적 분석 결과, 상기 조성물은 약 18유니트/㎖에서 비증식성장을 야기하는 것으로 나타났다.
본 발명의 조성물은 배치(batch)마다 표시된 동일성, 강도 및 순도로, 일반적으로 전출한 방법에 따라 일관되게 재현가능한 형태로 제조될 수 있다. 동일성과 순도는 역상 고압액체크로마토그라피를 이용하여 결정된다(실시예 1 참조). 본 발명의 조성물은 역상 HPLC상에서 일관되게 재현성 있는 패턴을 가지는데, 여기에서 피크들은 약 27분과 32분에서 배재분획(exclusion fraction)으로서 초기에 나타난다. 높이가 높은 피크들 이전과 그 사이 및 그후에 강도가 다른 여러 개의 보다 작은 피크들이 존재한다. 본 발명의 조성물에 대한 3개의 롯트에 대한 HPLC 결과는 제1도 내지 제3도에 나타나 있다. 배치 B0211(제4도), B0209(제5도), B29/3006(제6도) 및 B15/1606(제7도)에 대한 RP-HPLC 프로파일도 또한 재현성이 우수한 패턴을 보여주고 있다. 이러한 조성물은 또한 실시예 4에 기재되어 있는 생물학적 분석에 의하면 약 18유니트/㎖에서 비증식성장을 나타나는 것으로 밝혀졌다. 이 조성물은 또한 전술한 성질, 예를 들어 시험관내에서 단핵세포와 대식세포 등을 자극하는 성질을 특징으로 하고 있다.
그 원천을 생각해볼 때, 본 조성물에 존재하는 것으로 보이는 화합물로는 설폰화된 담즙산, 산화된 담즙산, 기타 자연적으로 존재하는 담즙산 및 그들의 아미노산(특히 글리신과 토린), 콘쥬게이트 및 스테로이드가 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 하기 식으로 표시되는 화합물을 적어도 하나 포함하는 것으로 생각된다.
여기에서, 상기 분자는 완전히 포화되어 있거나 또는 그러하지 아니한데, 예를 들면 A와 B, B와 C, 또는 C와 D 사이의 결합이 단일 또는 이중결합일 수 있으며, X는 H, OH, =O 또는 OSO3H이고; Y는
R은 예를 들어 글리실, 글루타밀 또는 토릴과 같은 아미노산 잔기이므로 글리신 또는 토린 콘쥬게이트를 형성한다.
특히, 본 발명의 조성물에 대해 유기성분과 무기성분을 포함하여 그것의 성분 화합물을 분석하였다. 이러한 정보는 질량 스펙트로스코피(MS)를 포함하여 분석화학의 표준화된 방법을 이용하여 유추되었다. 이러한 연구의 결과. 예를 들어 콜린산, 글리코콜린산, 데옥시클리코콜린산. 우르소데옥시콜린산, 황산 콜레스테롤, 데옥시콜린산, 케노테옥시콜린산 및 토로콜린산을 포함하여 특이적인 담즙산 화합물이 존재하는 것으로 밝혀졌다.
MS로부터, 일부 화합물의 OH와 H2가 MS에서 소실되는지 또는 디옥시, 디데옥시 및 이러한 화합물의 불포화 아날로그도 발생하여 존재하는 지는 구별이 불가능하다. 이들 화합물들은 모두 암모늄, 알킬암모늄 및 무기 양이온의 염으로 존재할 수 있다.
MS 분석결과는 또한 본 발명의 조성물에서 인지질, 스핑고지질 및 기타 화합물을 이루는 관련 인자의 확인을 가능케한다. 존재하는 것으로 판단되는 특이적인 화합물로는;
스데아린 산 CH3(CH2)16COOH,
팔미틴산 CH3(CH2)14COOH,
올레산 Z-9 옥타테카논산 CH3(CH2)2CH=CHCH2(CH2)6COOH,
산화된 또는 하이드록시화된/볼포화 단쇄(short chain) 지방산:
C6H8O3(예: CH3CH=CHCOCH2COOH 또는 2개의 이중결합과 하나의 하이드록사이드를 가지고 있는 C6산),
아세트산, 스테아린산 디글리세라이드, 팔리틴산 디글리세라이드, 스테아린산, 팔미틴산 디글리세라이드, 스테아린산-모노글리세라이드-포스포콜린(리소레시틴(lysolecithin)), 스테아린산 모노글리세라이드, 스테아린산 트리글리세라이드, 팔미틴산 모노글리세라이드, 포스포콜린, 포스포세린, 포스포스핑고신, 스테아린산-스핑고신, 스핑고신, 스테아린산 아미드, 스테아린산 메틸아미드, 팔미틴산 아미드, 레시틴, 스테아린산-글리세롤 다이머.
또한, 예비 HPLC 및 적정시험에 의해 체인의 길이가 보다 짧은 지방산도 존재하는 것으로 나타났다.
조성물의 원천과 MS 및 HPLC 분석결과로부터 유추되는 결과를 고려해볼 때, 하기 식을 가지고 있는 적어도 하나의 화합물을 포함하여 인지질, 스핑고지질 및 이와 관련된 가수분해 생성 화합물도 존재할 수 있다.
여기에서, Rl, R2, R3는 다르거나 동일하며 H, COR4, CH=CH-R5, X, -P(O)(OH)O-, 또는 -S(O)2O- 이고; X는 콜린, 에탄올아민, N-알킬화 에탄올아민, 세린, 이노시톨, 유리 수산기를 가지고 있는 당, 아미노당, 설폰화된 당 및 시알린산으로 구성된 군으로부터 선택되며; R4는 포화 또는 불포화된 C1-C30알킬 또는 산화 또는 하이드록시화된 그 유도체이고; R5는 알킬기 또는 산화 및/또는 하이드록시화된 그 아날로그이다.
지방산과 그 콘쥬게이트는 염과 같은 전술한 수용성 추출물 형태로 존재할 수 있다. 이러한 화합물의 용해도는 또한 혼합물의 다른 성분에 의해 증진된다. 카르복시산의 아미드, RCONR1R2(여기에서 R1과 R2는 동일하거나 다르며 H 또는 알킬이다)도 존재하는 것으로 믿어진다.
상기 조성물의 원천과 전술한 이것의 MS 분석결과를 고려하면, 화합물의 세 번째 부류, 즉 뮤신과 프로테오글리칸 가수분해 생성물도 또한 존재할 수 있다. 이러한 화합물에는 담즙과 담낭 벽으로부터의 점단백질(mucoprotein)의 가수분해생성물이 포함되는데, 예를 들면 콘드로이틴 4- 및 6-설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 히알유론산 및 이러한 점액소의 가수분해 생성물(모노머, 타이머, 올리고머 및 폴리머)가 있다. 키틴과 기타 점액소도 유사하게 가수분해될 수 있으며, 그 가수분해 싱성물로는 다음과 같은 것이 있다:
N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민-4-설페이트, 갈락토오스-6-설페이트, N-아세틸-D-글루코사민-6-설페이트, 글루코사민-6-설페이트, D-글루코사민-2-설페이트, D-글루코사민-2,3-디설페이트, D-갈락토오스-6-설페이트, 글루큐론산-2-설페이트, N-아세틸렌우라민산, 시알린산, N-아세틸 콘드로이신, 콘드로이신-4-설페이트, 콘드로이신-6-설페이트, D-글루코사민, D-갈락토사민, 글루큐론산, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 이듀론산, 헥소오스, 헥소사민, 에스테르 설페이트, 글루큐론산, 콘드로사민, 2-아미노-2-데옥시-D-갈락토오스, 세린, 프롤린, 트레오닌, 알라닌, 글리신, 토린, 글루타민산, 아스파틴산, 히스티딘, 및 작은 펩티드.
케라틴 설페이트, 데르마탄 설페이트와 같은 점액소의 가수분해에 의해 유사한 생성물들이 얻어지며, 다이머, 올리고머 및 폴리머에 있는 자연적인 당-당 결합들이 당 모노머들사이 또는 인접한 당의 체인간의 -O-Si(OH)2-O- 브릿지에 의해 대치될 수 있다.
특히, 특이적인 점액소와 프로테오글리칸 가수분해 생성물이 존재하는 것으로 생각되는데, 그 예로는 다음과 같은 것이 있다:
시알린산과 그것의 모노- 및 디-아세틸레이트화 및 글리콜레이트화된 모노머들; N-아세틸뉴라민산; 헥소사민; L-퓨코오스; 헥소사민-헥소유론산(다이머) 디설페이트; 모노아세틸화된 글루큐론산 또는 이듀론산 디설페이트; 시알린산-글리세롤(다이머); 및 전술한 모노머들의 아세틸화된 또는 셀페이트화된 형태의 다이머, 트라이머, 올리고머 및 폴리머들.
본 발명의 조성물의 원천 및 전술한 MS 분석결과를 고려해볼 때, 네번째 부류의 화합물, 즉 지용성 비타민도 존재할 수 있는데, 그 예로는 A, D 및 K 비타민(예: Dl, D3, D4, K1, K2, K5, K6, K7, K-S(II)) 및 비타민 E 아세테이트가 있다.
특히, 존재하는 것으로 여겨지는 특이적인 지용성 화합물은 비타민 A2, 비타민 D1, 루미스테롤(이것의 비타민 Dl 복합체로부터 존재함), 비타민 E, 비타민 Kl 옥사이드 및 비타민 K5로 구성되는 군중에서 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 조성물의 원천 및 전술한 MS 분석결과를 고려해볼 때, 여러 가지 유기 화함물도 존재할 수 있다. 이러한 화합물의 예로는 다음과 같은 것이 포함된다:
빌리루빈과 그 글루코누라이드 콘쥬게이트; 빌리베르딘과 그 글루코누라이드 콘쥬게이트; 미량의 스테로이드: 당, 퓨린과 피리미딘과 같은 기타 혈장의 용질; 기타 식품으로 섭취된 지질: 및 글루타티온과 그 가수분해 생성물.
특히, 존재하는 것으로 믿어지는 기타 특이적인 유기 화합물은 요소, 메틸아민, 디메틸아민, 에틸아민, 메틸에틸아민, 디에틸아민, 디프로필아민, 부틴에틸아민, 암모니아, 콜린, 토린, 글루타민산, 글리신, 알라닌, p-ser, p-eu, p-ea, asp, thr, ser, sar, a-aba, cit, val ile, leu, B-ala, G-aba, OH-lys, orn, lys, 부틸화된 하이드록시톨우엔(BHT), 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 조성물에 존재하는 아민, 특히 2차 아민은 공기로부터의 질소산화물을 포함할 수 있어서 니트로소 화함물을 형성한다. N-옥사이드 및 N-카바메이트 부생성물도 또한 포함될 수 있다. 전습한 이러한 계통의 아민들은 모든 1차, 2차 및 3차 알킨아민까지 포함하는 것으로 확대되어야 한다.
또한 다음과 같은 무기 원소가 다음과 같은 양(mg/l)으로 존재하는 것으로 확인되었다:
텅스텐 0.07, 아연 0.666, 인 0.378. 카드뮴 0.01, 코발트 0.008, 니켈 0.022, 바륨 0.032, 철 0.022, 망간 0.039, 크롬 0.060, 마그네슘 7.46, 알루미늄 0.136, 칼슘 5.97, 구리 0.087, 티타늄 0.01 스트론튬 0.060, 나트륨 9600, 칼륨 483, 염소 15400, 암모니아 218, 바나듐 1ppm.
본 발명의 조성물은 가치 있는 약학적 성질을 가지고 있다. 특히 본 발명의 조성물은 항증식효과, 항종양성장효과 및 종양괴사인자의 분비효과클 가지고 있다. 이 조성물은 별다른 독성을 나타내지 않으며 단지 일시적인 부작용만을 나타낸다(예: 미열, 조갈증, 주사부위의 통증). 이들은 또한 고분자량 물질(즉, 약 5000달톤 이상)은 가지고 있지 않은 것으로 나타났는데, 이러한 고분자량 물질은 유례한 면역반응을 일으킬 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 감염성 질병, 종양 및 자가면역 질병 등과 같이 면역반응의 변형을 필요로 하는 상태의 치료제 및 예방제로서 이용될 수 있다. 이들은 특히 여러 가지 형태의 종양의 치료에 유용한데, 이러한 종양의 예로는 백혈병, 림프종, 흑색종, 선종(adenoma), 육종(sarcoma) 및 악성종양이 있다. 특히, 악성 흑색종, 췌장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 폐암, 직장암, 유방암, 대장암, 간암, 갑상선암, 후두암, 경부암, 침샘암, 다리암, 혀암, 입술암, 담즙관암, 골반암, 종격암(mediastinum cancer), 요도암, 기판지암, 방광암, 식도 및 결장암과 AIDS를 가지고 있는 HIV-감염 환자와 연관된 암 형태인 카토시의 육종(Kaposi′s Sarcoma)의 치료에 유용하다. 본 발명의 조성물은 또한 관절경화증과, 특히 AIDS와 같은 바이러스 감염과 같은 기타 항증식상태의 치료에 이용될 수 있다. 또한, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 타잎I 당뇨병, 중증근무력증, 애디슨병(Addison′s disease), 자가면역성 용혈성 빈혈, 크론병(Crohn′s disease) 굿파스튜어증후군(Goodpasture′s syndrome), 그래이브스병(Graves′ disease), 하시모토갑상선염(Hashimoto′s
thyroiditis), 특발성 혈소판감소성자반, 악성빈혈, 포스트 스트렙토코커스 사구체신염(poststreptococcal glomerulonephritis), 건선, 경피증, 쇼그렌증후군(Sjogren′s syndrome), 자발적 불임증 및 심상성천포창(pemphigus vulgaris)의 치료에도 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 의해 약제로 전환될 수 있다. 이러한 약제는 본 발명의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성물질과 함께 포함한다. 이러한 약제는 경구, 국소, 직장, 비경구, 국부, 흡입 또는 대뇌내 투여용으로 만들어질 수 있다. 그러므로, 고체 또는 반고체형, 예를 들면, 환제, 정제, 크림, 젤라틴캡슐, 캡슐, 좌약, 연성젤라틴캡슐, 겔, 멤브레인 및 튜브렛(tubelet) 형태로 되어 있다. 비경구투여와 대뇌내 투여를 위해서는, 근육내 또는 피하투여용 형태 또는 주입 또는 정맥내 또는 대뇌내 주사용 형태가 이용될 수 있다. 그러므로, 조성물 용액으로 제조되거나 또는 활성 조성물의 파우더 형태로 제조되어 전술한 용도에 적합한, 약학적으로 허용가능한 하나 또는 그 이상의 부형제 또는 희석제와 혼합되는데, 이러한 희석제 등은 생리용액과 조화될 수 있는 삼투압농도를 가지고 있는 것이다. 국부투여를 위해서는, 국소투여용의 크림 또는 연고 형태 또는 분무형태가 고려될 수 있다; 흡입 투여방식을 위해서는, 분무형태, 예를 들면 비강 분무방식이 고려될 수 있다. 바람직하기로는, 상기 조성물은 근육내로 주입된다.
본 발명의 약학적 조성물은 환자에게 투여될 수 있는 약학적으로 허용가능한 조성물의 제조방법으로서 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있는데, 즉 유효량의 활성물질이 약제학적으로 허용가능한 매개체(vehicle)와 혼합된다. 적절한 매개체에 대해서는 예를 들어 레밍턴의 약학서(Remington′s Pharmaceutical Sciences, Nack 출판사, 이스턴, 펜실베니아, 미국(1985))에 기재되어 있다.
이를 바탕으로, 반드시 그러한 것은 아니라하더라도 본 발명의 약제는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 매개체 또는 희석제와 함께 본 발명의 조성물을 포함하고 있고, 상기 희석제 등은 pH가 적절하고 생리용액과 등장액을 이루는 완충용액의 형태로 되어 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제 또는 다른 치료형태와 병합하여 이용된다. 예를 들면, 악성종양인 경우에 현재의 치료방법은 이전에는 수출이 블가능하였던 종양을 외과적으로 제거할 수 있도록 해준다. 본 발명의 조성물과 약제는 사람 또는 동물에게 투여코자 하는 것이다.
일반적으로, 상기 조성물의 투여량의 범위는 사람에게 투여하는 경우 체중 1kg, 1일 기준으로 0.01-20mg/kg, 바람직하기로는 0.1-10mg/kg, 가장 바람직하기로는 0.1-1mg/kg이다. 정맥내 투여의 경우에는, 체중 1kg, 1일 기준으로 약 0.1-5mg/kg이고, 경구투여의 경우에는 1-5mg/kg이다. 농축된 조성물이 이용되는 경우에는 전술한 양의 대략 반 정도로 이용될 수 있다. 예를 들어, 근육내 투여의 경우에는 체중 1kg, 1일 기준으로 약 0.2-1.0mg/kg, 바람직하기로는 0.275-0.75mg/kg 정도로 이용될 수 있다.
그러나, 의료실무자들은 특히 체중, 치료대상인 동물의 상태, 치료대상인 특정 질병, 투여경로의 특성과 원하는 치료요법에 따라 상기 투여량 범위로부터 벗어나 투여량을 조절할 필요가 있다는 점을 인식해야 할 것이다. 또한, 동물의 유형과 약제에 대한 개별적인 양상 또는 체형의 특성과 투여시간 또는 간격에 따라서도 투여량이 달라질 수 있다. 그러므로, 어떤 경우에는 전술한 최소량보다 적은 양을 이용할 수도 있지만 다른 경우에는 전술한 최대량도 초과해야 한다. 하루에 다량을 투여하는 경우에는 이를 여러 차례로 나누어 투여한다.
본 발명은, (a) 동물의 담즙과 수용성 용매를 혼합하여 담즙/용매 용액을 제조하는 단계:(b) 상기 담즙/용매 용액으로부터 용매가 실질적으로 포함되지 않은 수상을 분리하는 단계; (c) 용매가 실질적으로 포함되지 않은 용액으로부터 담즙 색소를 분리하여 무색 액체를 얻는 단계를 포함하며 바람직하기로는 상기 수용성 용매가 알콜이고, 동물의 담즙이 동일량의 알콜과 혼합되는 것을 특징으로 하는, 면역조절제 조성물의 제조방법도 포함한다. 상기 방법의 바람직한 일태양에 있어서, 상기 무색 액채를 담즙/용매 용액의 원래 부피의 1/8 또는 1/10로 농축하는 단계가 더 포함된다. 또한 상기 방법을 통해 제조되는 조성물이 본 발명의 바람직한 일면을 이루는 것도 분명하다.
본 발명은 또한 면역조절제로서 사용되는 조성물도 포함하는데, 이 조성물은 약3000달톤 미만의 분자량을 가지고 있는 성분을 적어도 하나 포함하고 있고 사람의 말초혈관 단핵세포에 대해 세포독성을 나타내지 않으며, 하기와 같은 특성 중의 적어도 한 가지를 가지고 있다:
(a) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음;
(b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 종양괴사인자를 생산할 수 있음; 또는
(c) 악성 마우스 하이브리도마 세포주에서 항증식효과를 가지고 있음; 및
상기 성분은 내독소, IL-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GN-CSF 또는 IFN-Γ가 존재하지 않는 상태에서, 종양괴사인자를 자극한다.
본 발명의 조성물은 또한 칼럼 크토마토그라피에 의해 특징지워질 수 있는 성분을 포함하고 있다. 상기 크로마토그라피에 있어서, 상기 조성물을 건조시켜 고체형태로 만들어서 2g을 취해 진한(10%) 수산화나트륨 메탄올용액 20㎖에 용해된다. 이어서, 불용성 물질을 모두 제거하고, 60Å의 플래시 실리카 겔 102g이 충진되어 있는 5cm×12.5cm크기의 메탄올 칼럼, 10파운드/inch2의 압력과 11㎖/min의 유속, 진한(10%) 수산화암모늄 메탄올용액을 이용하여 칼럼 크로마토그라피를 실시하면, 전체 용출량이 약 180-220㎖, 약 220-260㎖, 또는 약 260-300㎖일 때 상기 성분이 용출된다.
이러한 성분들의 특징은 이온교환 크로마토그라피에 의해 알 수 있다. 상기 조성물 10㎖에 존재하는 모든 음이온을 실질적으로 결합시키기에 충분한 양의 바이오-라드 AG-1(Bio-Rad AG-1) 하이드록사이드형 수지를 포함하고 있는 칼럼을 이용하여 상기 조성물 10㎖에 대해 음이온교환 크로마토그라피를 실시하는데, 이때 중탄산암모늄 완충용액을 이용하여 단계적으로 농도경사를 두면 상기 성분이 완충용액농도가 약0.5-1.5M, 바람직하기로는 약 1.0-1.5M, 가장 바람직하기로는 약 1.5M일때 칼럼으로부터 용출된다.
역상(C18) HPLC도 또한 상기 성분의 특성을 알아내는데 이용될 수 있다. 상기 조성물을 동결건조시킨 다음 0.1% TFA 수용액에 다시 용해하여 250mm×1.6mm 크기의 칼럼(Phenomenex WP600009-C18)을 이용하여 크로마토그라피를 실시한다. 이때, 처음 10분간은 0.1% TFA 수용액(제1완충용액)을 흘려 주고, 이어서 55분 동안은 0.1% TFA 아세토니트릴용액(제2완충용액)을 0-80%까지 직선형태로 농도경사를 이루도록 흘려주고, 다음 5분간은 상기 제2완충용액 80%용액을 흘려주고, 이어서 5분간은 상기 제2완충용액을 80-0%의 농도경사로 흘려준다. 또한, 유속을 1㎖/min로 하고 상기 칼럼의 용적과 완충용액이 초과되지 않도록 하면, 상기 성분은 칼럼에 주입된 지 약 2.4-3.4분 후에 용출된다. 상기 조성물의 성분들의 특성은 추가적인 역상 HPLC 방법에 의해서도 알 수 있다. 즉, 상기 조성물을 0.1% TFA 수용액(제1완충용액)을 이용하여 투석 또는 용해한 다음 크기가 250×4.6mm인 바이오-라드 칼럼(Hi-Pore RP 318)을 이용하여 역상(C18) HPLC를 실시하는데, 이때 상기 칼럼을 통해 상기 제1완충용액을 약 10분간 흘려주고 0.1% TFA 아세토니트릴 용액(제2완충용액)을 0-80%로 직선형태로 농도경사를 이루도록 흘려주고, 다음 5분간은 상기 제2완충용액을 8-10%의 농도경사로 흘려준다. 또한 유속을 1㎖/min로 하고 상기 칼럼에 주입된지 약 2-약 21.4분, 또는 약 21.4-약 25.6분 후에 용출된다.
본 발명의 조성물은 TLC에 의해서도 그 특성을 알 수 있다. 즉, 상기 조성물을 10% 진한 수산화암모늄 메탄올 용액을 용해하여 박층크로마토그라피를 실시한 다음 닌히드린을 분무하여 발색반응을 관찰하는데, 이때 닌히드린에 의한 양성반응은 Rf값이 약 0.8-0.9일 때 나타난다.
본 발명은 또한 사람에게서 종양괴사인자를 자극하는 방법도 포함하는데, 이 방법은 하기 화합물 중의 하나를 포함하고 있는 조성물을 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다:
(a) 하기 식의 화합물
여기에서, A와 B, B와 C, 또는 C와 D 사이의 결합이 단일 또는 이중결합일 수 있으며, X는 H, OH, =O 또는 OSO3H이고; Y는
R은 아미노산 잔기이다;
(b) 하기 식의 화합물
(R1O)CH2CH(OR2)CH2(OR3-X) 또는
여기에서 R1, R2, R3는 H, COR4, CH=CH-R5, X, =P(O)(OH)O-, 또는 -S(O)2O-이고;
X는 콜린, 에탄올아민, N-알킬화 에탄올아민, 세린, 이노시톨, 유리 수산기를 가지고 있는 당, 아미노당, 설폰화된 당 및 시알린산이고;
R4는 포화 또는 불포화 C1-C30 알킬기 또는 산화 또는 하이드록시화된 그 아날로그이고;
R5는 알킬기 또는 산화 및 하이드록시화된 그 아날로그이다.;
(c) 뮤신 또는 프로테오글리칸 가수분해 생성물; 또는
(d) 지용성 비타민.
바람직하기로는 본 발명의 독창적인 방법에 따른 조성물은 토로콜린산 및 그것의 황산염 유도체; 글리코콜린산 및 그것의 황산염 유도체; 스핑고신; 디아실 글리세롤; 레시틴; 길이가 10개의 단위당 미만이며 시알린산, 퓨코오스, 헥소사민 또는 황산 헥소사민을 포함하는 올리고당; 비타민A; 레니놀산 유도체; 레티놀 유도체; 토린; 및 글루타민산과 그 콘쥬게이트로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다. 상기 조성물은 또한 암모니아; 1차알킬아민; 2차알킬아민; 3차알킬아민; 및 카르복시산 R6CO2H(여기에서 R6는 포화 또는 불포화 C1-C30알킬 및 산화 및/또는 하이드록시화된 그 유도체이다)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 추가로 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 토로콜린산 및 그것의 황산염 유도체; 글리코콜리산 및 그것의 황산염 유도체; 스핑고신; 디아실 글리세롤; 레시틴; 길이가 10개의 단위당 미만이며 시알린산, 푸코오스, 헥소사민 또는 황산 헥소사민을 포함하는 올리고당; 비타민A; 레티놀산 유도체; 레니놀 유도체; 토린; 및 글루타민산과 그 콘쥬게이트로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 조성물을 투여함으로써 TNF 생산을 자극하는 방법도 포함한다.
본 발명은 또한 췌장암을 앓고 있는 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 췌장암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 일부를 형성하는 것은 또한 (1) 스핑고신 또는 염과 복합된 스핑고신의 마이셀(micelle) 또는 (2) 레티놀산 또는 그유도체의 마이셀을 포함하고 있는 조성물인데, 이들은 다음과 같은 성질 중 적어도 한 가지를 가지고 있다:
(a) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음;
(b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있음; 또는
(c) 악성 마우스 하이브리도마 세포주에서 항증식효과를 가지고 있음.
상기 마이셀은 또한 디아실 글리세라이드 또는 레시틴을 포함할 수 있으며, 담즙산염 및 암모늄 또는 알킬암모늄 이온의 원천을 더 포함할 수도 있다.
마지막으로, 본 발명은 또한 (1) 스핑고신, 담즙산염과 암모늄 또는 알킬암모늄 이온의 원천, (2) 담즙산염, 스핑고신, 디아실 글리세롤, 암모늄 또는 알킬암모늄 이온의 원천, 및 레티놀 유도체, (3) 디아실 글리세라이드, 레시틴 및 담즙산염, 또는 (4) (a) 디아실 글리세라이드, (b) 레시틴, 및 (c) 뮤신 가수분해 생성물 또는 프로테오글리칸 가수분해 생성물을 포함하고 있는 조성물을 포함하는데, 이것은 다음과 같은 특성중 적어도 한 가지를 가지고 있다:
(a) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음;
(b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있음; 또는
(c) 악성 마우스 하이브리도마 세포주에서 항증식효과를 가지고 있음.
하기 비제한적인 실시예들은 본 발명을 상세히 설명해주는 것이다.
[실시예 1]
[본 발명의 조성물의 제조]
소의 담즙은 허가를 바고 검사를 거핀 도살장에서 식용을 위해 도살된 적어도 1살 내지 1살 반인 건강한 무리로부터 추출된다. 담낭은 검사를 거친 도살육으로부터 수집되는데, 간에서 담낭을 분리한 다음 담낭에 기생충이 없는 지, 감염의 흔적이 없는 지 즉, 담즙의 원천으로서 적절한 지에 대해 수의사가 검사하게 된다.
이러한 검사를 마친 담낭을 70% 에탄올 용액으로 세척하여 외부를 위생처리하고 주사기를 삽입하여 담즙을 분리한다. 이렇게 분리된 담즙에 대해 수의사가 육안으로 검사하여 주사기내에 혈액 또는 고름이 없는 지 즉, 만족스러운 것인 지에 대해 확인한다. 만족스러운 것으로 확인된 담즙은 에탄올이 들어 있고 눈금이 매겨져 있는 황갈색 병에 옮겨 넣는다. 담즙은 혈액과 고름이 실질적으로 없는 녹색 액체이다. 상기 각각의 병에 표시한 부분까지 담즙을 첨가하는데, 에탄올 눈금의 두배까지 첨가하게 되면 50% 담즙/에탄올 용액이 된다. 담즙/에탄올 용액은 담즙/에탄올이 대략 50%/50%로 포함되어 있고 외부 물질이 실질적으로 없는 녹색 액체이다. 이 용액은 또한 에탄올 USP XXII 파트B에 대해 양성을 나타낸다. 이들 병들에 수집일을 롯트 번호로서 기재한 라벨을 붙인다. 최소 50마리의 동물이 하나의 롯트를 이루는 풀(pool)로서 작용한다. 간, 지라 및 림프 노드의 파편들도 담즙 채취 동물로부터 수집하는데 이러한 파편들에 대해 기생충이나 기타 질병의 징후가 존재하는 지에 대해 조사한다.
이어서 담즙/알콜 혼합액을 20±2℃에서 적어도 2시간 반동안 4200rpm으로 원심분리한다. 상등액을 따라 내어 pH와 에탄올 함량을 조사한다. 이 상등액에 대해 활성화된 차콜로 처리한다. 처리된 담즙/에탄올 용액에 대해 O.D.와 전도도를 조사한다. O.D.값 또는 전도도가 허용범위를 벗어나면, 담즙/에탄올 용액에 대해 활성화된 탄소로 추가적인 처리를 실시하여 허용범위 내의 수치를 얻는다.
활성화된 탄소로 처리한 이후, 상기 용액을 필터(예를 들어, 2.5㎛의 잔류크기를 갖는 필터)를 통해 여과하고 알콜을 증발(예를 들어, 85℃ 미만으로 가열함)시키고, 원래 담즙/에탄올 용액 부피의 약 8/1로 상기 용액을 농축한다. 농축된 용액을 20-25℃로 냉각한다. 이 용액을 에틸에테르와 혼합하여 에테르상을 제거한다. 이 과정을 한번 더 반복할 수 있다. 수상을 가열하여 잔류 에테르를 제거하고(예를 들어, 약 10시간 동안 약 55℃까지 가열함), 약 80-85℃로 가열함으로써 원래 담즙/에탄올 용액 부피의 1/10로 부피를 더 감소시킨다. 결과 형성되는 조성물에 대해 외양, 생물학적 활성과 에탄올 및 에테르 함량을 조사한다. 이 조성물은 외부물질이 거의 없는 맑은 황색 용액이며, 에탄올을 10ppm 이하, 에테르를 5ppm 이하 포함하고 있다. 실시예 4에 기재되어 있는 생물학적 분석실험에서, 비증식적 성장은 약 18유니트/㎖이다.
역상 크로마토그라피를 이용하여 동일성과 순도에 대해서도 측정하였다. 실시예 4에 기재되어 있는 항증식방법을 이용하여 강도가 분석된다.
본 발명의 조성물의 초기 배치들은 비완충용액으로서 제조되었다. 후속되는 배치들은 완충제로서 제1- 및 제2-인산나트륨 뿐만 아니라 염산 1%용액과 수산화나트륨 1%용액을 이용하여 조성물의 pH를 약 7.4±0.05로 조절함으로써 완충용액으로서 제조되었다. 104±2℃의 스팀 오오토클레이브에서 60분간 처리(Bioburden reduction)하였다. 이 용액은 5㎖ 또는 10㎖ 멸균병에 채워져 밀봉된다. 이렇게 하여 준비된 병을 104±2℃에서 60분간 멸균하고 35℃에서 23±1시간 항온처리하는 멸균 사이클을 3회 실시하였다. 매 사이클(오오토클레이빙과 항온처리) 사이에 바이오버든에 대해 시험하였다. 마지막 사이클 이후, 존재할 수도 있는 입자를 검출하기 위해 상기 병들을 흑색과 백색 배경에 대해 육안으로 검사하였다.
검사 후, 각가긔 롯트에 대해 샘플링을 하여 일정 사양(specification)에 적합한 지에 대해 테스트한다. 이러한 테스트로는 동일성, 멸균도, 발열성, 내독소, 생물학적 분석, HPLC 및 일반적인 안전성검사가 있다(표 1참조).
[표 1]
[실시예 2]
[본 발명의 조성물의 물리적, 화학적, 생물학적 특성]
본 발명의 조성물에 대한 물리화학적 특성들(전도도, 삼투압농도 및 전체 고체량)은 표 2에 나타나 있다. 보다 상세하게는, 실시예 1에 따라 제조된 3개의 배치에 대해 테스트하였다. 표 2에 도시되어 있는 그 결과들은 제조된 생성물 멸균도, 강도 및 재현도를 나타낸다. 에탄올과 에테르는 제조과정 중의 테스트로서만 측정되었음을 상기해야 한다. 생물학적 활성에 대한 측정방법은 실시예 4에 요약되어 있다.
[표 2]
전도도, 삼투압농도 및 전체 고체량과 같은 물리적 및 화학적 특성들은 99% 이상이 용액인 조성물과 일치하는 것이다. 조성물에서 1%미만의 고체는 유기물질인데, 지방은 없고, 약 반이 탄수화물이고 그 나머지가 아미노산이다. SDS 겔 전기영동은 조성물에 단백질보다 펩티드가 많이 존재함을 확인시켜 준다. 고분자량 물질은 검출되지 않는다. 이는 펩티드 약제의 중요한 특징인데, 그 이유는 이 약제가 면역성이 아닌 것으로 기대되기 때문이다.
본 발명에 대한 HPLC와 생물학적 분석실험방법들은 비완충화된 생성물에 대해 개발되었다. 이들 테스트들은 상기 생성물을 완충화된 액체와 농축된 형태로서 특성화하는데 이용된다. 하기 언급된 HPLC 결과들은 상기 생성물이 예시된 모든 예에서 동일하다는 것을 나타낸다. 생물학적 분석결과는 농축된 조성물의 활성이 원래 조성물에 비해 2배 반 높다는 것을 보여주고 있다. 그러므로, 본 연구에서 이용된 생성물은 균등한 것으로 나타났다.
[본 발명의 조성물에 대한 역상(C18) HPLC 분석]
본 발명의 조성물은 역상 HPLC에서 일정하게 재현되는 패턴을 보여주고 있는데, 피크들은 용출 초기와 약 27-32분에서 나타난다. 길이가 긴 피크 이전과 이들 피크 사이 및 이들 피크 이후에는 강도가 다양한 작은 피크들이 존재한다. 본 발명의 농축된 조성물의 세 개의 롯트에 대한 HPLC 프로파일이 제1도 내지 제3도에 도시되어 있다. 배치 Bo211(제4도), B0209(제5도),, B29/3006(제6도) 및 B15/1606(제7도)에 대한 RP-HPLC 프로파일은 재현성이 매우 높은 패턴을 나타낸다.
본 발명의 조성물을 특성화하기 위한 RP-HPLC가 다음과 같이 실시되었다. 바이오-라드 gkl-포어 RP 318 가드(C18) 칼럼(4.6×30mm)과 바이오-라드 하이-포어 RP 318(C18) 칼럼(4.6×250mm)을 사용하였다. 시료를 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA, Pierce) 수용액(완충용액A)에 투석하여 칼럼에 주입하였다. 10분간 완충용액A를 흘려준 다음 완충용B(0.1% TFA 아세토니트릴 용액)를 55분가 0-80%로 직선형태로 농도경사지도록 흘려주었다. 이어서, 완충용액B 80% 용액을 5분간 흘려 준 다음 다시 5분간 완충용액B를 80-0%로 농도경사지도록 흘려주었다. 유속은 1.0㎖/min로 하였다. 연속적으로 HPLC를 실시하여 수집된 분획들을 농축하였다(Speedvac, Model SVC 200H, 사반트 인스트루먼트, 파밍턴, 뉴욕).
[조성물의 1차적인 특성]
HPLC의 피크치들에 대해 단백질 씨퀀싱을 실시하였다. 첫 번째 시료는 RP-HPLC에서 31분에 나타난 주요 피크로서 배치 0210을 TFA/CH3CN에 용해한 것이었으나, N-말단 씨퀀스 분석시 데이터가 얻어지지 않는다. 이러한 결과는 양적인 문제 또는 N-말단의 블로킹 때문인 것으로 해석될 수 있다. 산 가수분해 후 아미노산 분석법을 이용하여 상기 분획에 대해 단백질 정량실험을 실시한 결과, 충분한 양에 대해 씨퀀스 분서글 실시했어야 했다는 것을 알게 되었다; 그러나, 그 조성으로 보아 상기 시료는 단백질이 아닐 수도 있으며, 따라서 N-말단 블록킹이 문제가 되지 않을 것으로 생각되었다. 상기 시료는 다음과 같은 조성인 것으로 나타났다: 약 70% Glx(글루타메이트/글루타민)과 약 15%의 글리신(Gly). 또한, RP-HPLC로부터의 균등 시료에 대해 분석한 결과도 다음과 같이 유사하였다: 68% Glx와 15% Gly(표 3참조). 또한 분획되지 않은 물질과 여러 가지 기타 다른 분획에 대한 특성은 다음과 같았다. 출발물질(32mg/㎖)은 폴리글루타메이트 펩티드/단백질을 나타내는 씨퀀스 신호를 보였는데, 이는 아미노산 조성 데이터와 일치하는 것이었다.
[표 3]
여러가지 HPLC 분획들에 대해 분석한 결과(표 3 참조), 모두 Glx(Glu/Gln)(28-70몰%)와 Gly(10-44몰%)가 매우 풍부한 것으로 나타났다. 그러나, 각각의 분획은 다른 아미노산의 상대적인 양에 있어서는 실질적인 차이를 보였다.
[실시예 3]
[본 발명의 조성물의 각 분획에 대한 생물학적 활성]
본 발명의 조성물의 각 분획에 대해 생물학적 활성을 조사하였다. 조성물의 생물학적 활성은 작은 분자량 성분에 기인하는 것으로 생각된다(분자량 3000 달톤 미만). 이는, 조성물의 네가지 분획과 분획화되지 않은 조성물에 대한 생물학적 실험을 통해 결정되었다. 첫번째 분회은 분자량이 3000 달톤 미만인 단백질과 펩티드를 포함하고 있었지만, 나머지 세 종류의 분획에는 분자량이 보다 큰 단백질과 폴리펩티드가 추가적으로 포함되어 있었다. 모든 분획들이 분자량이 보다 큰 추가적인 단백질과 폴리펩티드를 포함하고 있었다. 모든 분획들과 미분획화된 조성물은 동일한 생물학적 활성을 나타내었다. 모든 분획들이 미분획 생성물과 동일한 정도로 효과적이고, 또한 모든 분획의 공통적인 특성이 3000 달톤 미만의 분자가 동일한 농도로 존재한다는 것이므로, 이러한 사실은 상기 조성물의 생물학적 활성이 분자량 3000 달톤 미만인 성분에 기인한다는 결론을 도출시켰다.
[실시예 4]
[악성 세포주에 대한 효과]
본 발명의 조성물이 네 종류의 악성 세포주(도디(Daudi)-사람 림프종 세포, ME-180 사람의 자궁경부 악성종양 세포, T-24-사람의 방광 악성종양 세포 및 마우스 하이브리도마 세포 #6-1)의 배양, 증식에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 본 발명의 조성물은 마우스 하이브리도마 세포에 대해 항증식효과를 나타내었다. 이러한 연구결과는 마우스 하이브리도마 세포에서 상기 조성물의 저해효과는 세포치사라기보다는 항증식효과임을 나타내는 것이다.
본 발명의 조성물이 재현성 있는 항증식효과를 가지고 있다는 사실을 기초로 하는 생물학적 분석법은 상기 조성물의 보다 용이한 특성화를 위하여 마우스 하이브리도마 세포 모델에서 디자인 되었다. 이러한 생물학적 분석법은 다음과 같이 실시되었다. 조성물의 생물학적 활성을 그것의 물리적 및 화학적 활성과 구별되도록 하기 위하여 조성물의 삼투압농도와 pH를 세포배양배지의 삼투압농도 및 pH와 맞도록 조절한다. 등장 조성물을 배양배지에 대해 1:5 내지 1:10,000 비율로 연속적으로 희석한다. 하이브리도마 세포 시료를 특이적으로 정량한다. 헤모사이토미터를 이용하여 100㎕ 시료에 있는 세포의 갯수를 센다. 이들 세포를 원심분리를 통해 농축하고, 적절한 양의 새로운 배지를 첨가하여 1㎖당 1,000개의 세포가 존재하도록 세포의 농도를 조절한다(최종 원하는 농도의 2배). 하이브리도마 세포 현탁액(1㎖)을 대응하는 조성물 희석액 (1㎖)과 혼합한 다음, 24웰-플레이트를 이용하여 37℃, CO2 6%의 습한 분위기에서 배양한다. 96시간 경과후, 각각의 웰로부터 100㎕×3회 샘플링하여 96웰-플레이트에 접종한다(기준(블랭크))으로서는 세포가 포함되지 않은 배지만 100㎕ 포함하는 것을 이용한다).
세포밀도는 프로메가 셀타이터 (PROMEGA CellTiter 96TM키트)를 이용하여 측정한다. 세포농도는 595nm (기준: 650nm)에서의 흡광도를 기록함으로써 측정되며 기록은 엘리자 플레이트 기록기 (ELISA plate reader)에 의해 이루어졌다. 각각의 분석에 대해, 세포농도의 표준곡선을 작성한다. 성장의 대수기 중의 배양 세포를 샘플링하여 갯수를 측정하고 농축한 다음 연속적으로 희석하여 재현탁시킨다. 각각의 희석액을 100㎕×3회 샘플링하여 96웰-플레이트에 접종한다. 상기 표준곡선은 650nm에서의 OD와 상기 블랭크에 대한 값을 감산하여 얻은 595nmdptjml OD에 대해 세포밀도를 플롯팅함으로써 만들어진다. 미지 시료의 세포밀도는 보간에 의해 결정된다.
생물학적 활성을 계산하기 위해, 대조군 (조성물 없음)의 세포밀도 퍼센트를 최종 조성물 희석액 (로그 및 일직선적인 스케일로 함)에 대해 플롯팅하고, 스플라인 커브 보정법 (Spline curve fitting method)을 이용하여 포인트를 통해 상기 곡선을 보정한다. 이어서, 세포증식 50% 저해에 해당하는 조성무 희석농도를 수동으로 결정하고 조성물의 단위 유니트로 직접 전환한다. 정의에 따르면, 조성물 1유니트는 500세포/㎖로 접종된 세포주 HYB #6-1의 세포배양액 1㎖을 37℃, 6% CO2에서 96시간 후 50% 증식 저해하는 양이다. 이러한 생물학적 분석시 본 발명의 조성물의 평균활성은 18.24±1.82 유니트/㎖이다.
[실시예 5]
[T 및 B 림프구세포 배양에 대한 효과]
본 발명의 조성물은 정상적인 T 및 B 림프구세포의 배양에 대해서는 독성을 나타내지 않는다. 사람의 림프구세포의 성장에 대해 본 발명의 조성물의 존재하에서와 부재하에서 면밀하게 조절된 상태에서 조사가 이루어졌다. 표준농도의 림프구세포를 여러 가지 농도의 조성물을 포함하고 있는 웰에 넣어 배양하였다. 정상적인, 사람의 T 및 B 림프구세포를 임상적으로 사용되는 농도와 유사한 농도로 본 조성물과 함께 배양했을 때, 트리판 블루 염색법(Trypan Blue exclusion)에 의해 판단되는 좋지 않은 효과가 전혀 발견되지 않았다.
사람의 말초현관 단핵세포(PBMN)의 생존에 미치는 조성물의 효과에 대해서 실험하였다. 이 실험에서, PBMN을 24시간, 48시간동안 배양했는데, 이때 조성물과 조직배양배지의 양을 다양하게 변화시키고 플라스틱 마이크로웰 플레이트를 이용하였다. 상기 기간이 종료될 때, 트리판 블루 염색법을 이용하여 생존하는 세포의 수를 조사하였다. 표 4는 생존 세포의 수가 24시간과 다시 48시간에서 감소하는 것을 보여주고 있으나, 본 조성물이 존재 또는 부재에 따라 생존 세포의 수가 다르지 않았다. 더욱이, 조성물의 양이 증가되어도 생존에는 영향을 미치지 않았다(표 4참조). 그러므로, 본 조성물은 사람의 PBMN에 대해 세포독성을 보이지 않았다.
[표 4]
1대략 웰당 1×106개의 세포가 3회 플레이팅됨
2웰당 실제 세포의 수를 셈(×106)
[실시예 6]
[조성물의 사이토킨 함량]
TNF-α, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF 및 IFN에 대한 엘리자 분석을 본 발명의 조성물에 대해 실시하였다. 본 발명의 조성물은 사이토킨(TNF-α, IL-α, IL-2, IL-4, IL-6, Il-8, GM-CSF 및 IFN-γ)을 측정불가능한 수준으로 포함하고 있는 것으로 측정되었다(표 5참조).
[표 5]
[실시예 7]
실시예 1에 기재된 방법에 따라 본 발명의 여러 가지 배치의 조성물에 대해 물리적, 화학적 및 생물학적 특서을 조사하였다. 또한, 이들 배치에 대해 화학적 조성과 아미노산 분석을 실시하였다. 그 결과가 표 6-8에 나타나 있다.
[표 6]
1 배치# B0106과 B0706에는 완전한 등장성 PBS 고체가 첨가되었다.
2 배치# B1306, B2006 및 B2306은 pH조절 없이 2배로 농축되었다.
[표 7]
[표 8]
[실시예 8]
[단핵세포와 대식세포의 활성화]
조사한 바에 의하면, 본 발명의 조성물은 단핵세포 독성을 측정하는데 이용되는 창(Chang) 간종양 세포에 대해 세포독성을 나타내는 정상적인 단핵세포를 활성화시키며, 암환자 (자궁경부암 및 난소암)로부터 단핵세포와 대식세포는 본 조성물에 의해 자극을 받아서 그들 자신의 특정 종양세포를 공격하고 파괴시키는 것으로 나타났다.
보다 상세하게는, 단핵세포의 종양세포 파괴작용을 본 발명의 조성물의 존재하에서 시험하였는데, 그 기본적인 실험순서는 다음과 같다.
정맥의 혈액을 헤파린이 들어 있는 튜브에 수집한다. 이 혈액을 행크스 평형 염용액(Hank balanced salt solution:HBSS)을 이용하여 3:1로 희석한 다음 림프구세포 분리배지상에 도포하고 원심분리하여 말초혈관 단핵세포(PBMN)를 얻는다. 원심분리 후, 단핵세포층을 경계층(interface)으로부터 회수하여 배지로 두 번 세척하고 라텍스 인제스천(latex ingestion)에 의해 단핵세포의 수를 센다. 단핵세포를 96웰 플레이트에 흡착시킴으로써 분리한다(예를 들어 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 2회 세척함). 흡착된 세포는 단핵세포의 90% 이상인 것으로 측정된다. 흡착세포가 들어 있는 웰을 본 발명의 조성물(1:10 희석액), 과립대식세포 자극 인자 또는 PMA의 존재하에서 밤새 배양한다. 표준 세포주를 이용하여 연구하기 위해51CR-표지된 창 간종양세포를 이용하였는데, 그 이유는 이 세포주가 천연의 킬러세포 세포독성에 대한 감응성을 가지고 있지 않기 때문이다. 이러한 간종양 표적 종양세포를 효과기(effect):표적세포 (target cell)의 비율 (E:T)을 20:1로 하여 흡착된 단일 세포층에 첨가한다. 상기와 같은 비율은 E:T의 비율을 5:1 내지 30:1로 변화시킴으로써 만들어지는 커브상의 고원형태 범위내라는 점에서 이용되고 있다. 24시간 후, 상등액을 수집하여51Cr 분비를 정량분석하였다. 비(比)세포독성 퍼센트는 다음과 같이 계산된다:
여기에서, E는 효과기 세포의 존재하에서 표적세포로부터 분비되는 CPM이고; S는 효과기 세포의 부재하에서 표적세포로부터 분비되는 CPM이고; T는 2% 도데실황산나트륨으로 처리 한 후 표적세포로부터 분비되는 CPM이다.
비분비(比分泌)%=(E-S)/(T-S)×100
여기에서, E는 효과기 세포의 존재하에서 표적세포로부터 분비되는 CPM이고; S는 효과기 세포의 부재하에서 표적세포로부터 분비되는 CPM이고; T는 2% 도데실황산나트륨으로 처리한 후 표적세포로부터 분비되는 CPM이다.
이러한 방법을 이용하여, 본 발명의 조성물은 창 간종양 세포주에 대해 세포독성을 발휘하도록 건강한 사람의 단핵세포를 자극하는 것으로 밝혀졌다. 이어서, 암환자의 단핵세포와 대식세포가 본 발명의 조성물에 의해 자극을 받아 그들 자신의 특정 종양세포를 공격하고 파괴시키는 지에 대한 실험이 이루어질 수 있다. 표준 세포주(창 간종양 세포주)에 대해 전술한 바와 유사한 방법을 이용하여, 암환자의 단핵세포 및/또는 복막 대식세포가 분리되었다). 이러한 조성물은 자궁경부암 환자의 말초혈관 단핵세포와 복막 대식세포를 활성화시켜 환자 자신의 종양세포에 대한 세포독소를 생산케 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 효과는 인터페론이나 리포폴리사카라이드에 의해 이루어지는 효과와 대적할만하거나 또는 이보다 우수한 것이다. 난소암 환자의 복막 대식세포도 또한 본 조성물에 의해 자극을 받아서 배양되고 있는 난소종양 세포를 공격하고 파괴시키는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 9]
[TNF의 효과]
본 발명의 조성물이 말초혈관 단핵세포(PBMN)로부터의 사이토킨분비에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실험을 실시하였다. TNF-α, IL-1a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF 및 IFN에 대해 엘리자 분석을 실시하였다.
본 실시예의 상기 실험에서는 다음과 같은 방법을 이용하였다.
TNF의 연구에 있어서는, 5명의 건강한 검사자로부터 완전혈액을 채혈하여 헤파린이 들어 있는 튜브(heparinized Vacutainer)에 넣었다. 피콜-하이자크(Ficoll-Hypaque, Pharmacia)상에서 구배원심분리(gradient centrifugation)법에 의해 말초혈관 단핵세포를 분리하였다. PBMN을 인산완충용액 생리식염수(PBS)로 2회 세척하고 세포의 수를 센 다음 RPMI 1640 배양배지(Gibco Labs)에 106세포/0.5mℓ의 농도로 재현탁시켰다. 이들 세포를 바닥이 평평한 24웰 조직배양 플레이트(Falcon, Becton, Dickinson)에 넣고 배양하였다. PBMN 현탁액 0.5mℓ을 각각의 웰에 첨가하였는데, 이들 웰은 50ng의 리포폴리사카가이드(LPS)(E.coli로부터 추출), 10㎕의 태중의 송아지 혈청과 테스트 조성물(10-300㎕)을 포함하고 있는 것이다. 조성물의 지나친 삼투효과를 중화시키기 위해 사용되는, 조성물 부피의 10%에 해당하는 양의 증류수를 배양 웰에 첨가하였다 전체 부피는 RPMI를 이용하여 1mℓ/웰이 되도록 하였다. 대조군으로서는, 조성물 대신 PBS를 이용하였다. 세포를 37℃, 습한 5% CO2배양기에서 2, 6, 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 각각의 배양기간 종료시 세포를 분리하여 모아서 9000rpm으로 10분간 원심 분리함으로써 세포가 들어 있지 않은 배양액을 얻었다. 이 시료를 사이토킨에 대한 엘리자 분석을 실시할 때까지 (2주일 내) -70℃에서 보관하였다.
조성물의 단백질 분석은 피어스 마이크로 BCA 단백질 측정법(Pierce Micro BCA Protein determination technique, 스미드 등, Anal. Biochem. 1985, 150 76-85)을 이용하여 이루어졌다. 10㎕의 조성물 시료를 증류수를 이용하여 1mℓ로 만들었다. 소의 혈청 알부민(0.150μg/mℓ)도 역시 표준물질로서 사용되도록 만들었다. 블랭크(기준치)로서는 0.1N NaOH를 이용하였다. 이러한 모든 시료에 BCA, 8% 바이신코닌산(Bicinchonic Acid) 나트륨염(Pierce), 황산동 4% 및 미량 시약(Microreagent A(Na채3, NaHCO3, 타르타르산나트륨 0.2N NaOH용액)의 혼합물을 첨가하였다. 이러한 시료 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 배양하고 냉각한 다음 스펙트로포토미터를 이용하여 562nm에서 흡광도를 측정하였다. 테스트 시료에 들어 있는 단백질의 양을 표준곡선과 비교하고 적절하게 계산하였다. 상기 조성물의 단백질농도는 낮은 것으로 나타났고, 32μg/mℓ인 것으로 측정되었다.
본 발명의 조성물을 웰당 200-300㎕로 하여 사람의 PBMN을 자극한 후 상등액에서의 사이토킨 합성에 대해 측정하였다. 본 조성물의 초기 생성물은 사이토킨 생성에 대해 자극효과를 보이지 않는다(표 9 참조). 어떤 효과가 있다면, 그 효과는 PBMN이 배지에서만 배양될 때 사이토킨 생산이 구성상의 수준(constitutive level) 미만이라는 것을 암시한다는 것이다.
[표 9]
18명의 환자의 시료를 2회씩 실험하여 얻은 평균값
27명의 환자의 시료를 2회씩 실험하여 얻은 평균값
3ng/㎖
본 발명의 조성물이 LPS-자극성 분비에 손상을 주는 지에 대해 알아보기 위하여 실험을 실시하였다. LPS가 양성 자극제로 사용되었고, 본 발명의 조성물이 LPS-자극에 의한 사이토킨의 분비에 손상을 주는지의 여부를 여러 가지 사이토킨에 대해 비교하였다(표 10 참조). 본 조성물은 IL-1α, IL-β 및 TNF를 착실하게 저해한다. 기타사이토킨으로서 IL-6, IL-8, IFN-γ 및 GM-CSF에 대한 영향은 그다지 뚜렷하지 않았다. 그러나, 시험된 조성물 중의 어느 것도 LPS-자극성사이토킨 분비 효과를 증대시키지는 않았다.
[표 10]
1 6명의 환자로부터의 PBMN이 2회씩 테스트되었다.
2 조성물 배치 #B0209
LPS-자극성 TNF 분비를 저해하는데 있어서의 본 발명의 조성물이 어떠한 영향을 미치는 지에 대해 알아보기 위하여 조성물의 양을 변화시켜 가면서 실험하였다. 제8도는 LPS로 자극된 PBMN에 의한 TNF의분비가 본 조성물의 양에 따라 어떠한 영향을 주는 지를 나타내는 그래프이다. 조성물 10㎕가 약 10%의 저해효과를 나타내었고, 100㎕에서 저해효과가 30%에 근접하게 증가하였다. 다른 배치 (B0201)의 조성물은 200, 100, 10㎕에서 LPS-유도성 TNF 분비를 각각 45, 21, 12% 저해하였다.
이와 유사하게, IL-1β 생산도 조성물의 투여량에 따라 저해되는 현상을 보였다:즉, 조성물 100, 25, 10㎕는 각각 16, 10, 9%의 저해효과를 나타내었다.
이외에 다른 배치의 조성물에 대해서도 LPS-유도성 TNF 분비에 미치는 영향을 조사하였다. 요약하면, 같은 동물로부터 같은 방식으로 제조된 배치의 조성물은 동일한 효과를 나타내었다. 그러나, 동물의 종을 달리하고 조성물 제조방법을 달리하면, 다른 효과가 나타났다. 배치 B29/3006, B0213(B는 소를 의미함), C0203(염소)은 LPS만에 의해 유도되는 정도보다 높은 정도로 TNF 분비를 유도하였다(표 11 참조).
[표 11]
표 12는 자극성이 중간정도인 배치 B15/1606(농축 생성물)과 B27/2806에 대한 결과를 나타내고 있다.
[표 12]
표 13은 배치 013/2109(양)이 최소의 자극성을 나타낸다는 것을 보여준다.
[표 13]
표 14는 배치 R0201(상어)이 대부분의 농도 범위에 있어서 LPS-유도성 TNF 생산에 대해 저해현상을 나타낸다는 것을 보여주고 있다.
[표 14]
처음에는, 본 발명의 조성물이 사람의 PBMN으로부터의 LPS-유도성 TNF 분비에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러므로, 다음 단계의 실험에 있어서는 LPS-유도성 TNF 분비에 대한 본 조성물의 시간에 따른 효과를 알아보았다(표 15 참조). LPS는 TNF의 분비를 자극하였다. 2시간 후 그 수준이 697pg/mℓ 수준으로 증가하여 6시간이 경과된 시점에서 약 2006pg/mℓ로 정점을 이루었다. 24, 48 및 72시간이 경과된 시점에서의 TNF의 분비는 구성적 생산 수준을 약간 상회하는 수준이었다. 이와는 달리, 배치 0213의 조성물은 TNF에 대해 강자극성을 나타내는 것인데 2시간 및 6시간 시점에서 LPS단독에 의해서 제조되는 수준보다 높은 수준으로는 TNF를 분비하지 않았다. LPS에 의한 TNF 분비가 6시간시점에서 정점을 이루는 반면, LPS와 조성물을 조합하여 사용하는 경우에는 LPS의 자극효과가 떨어지기 시작하는 24시간 시점에서 정점을 이루고 있다. LPS 단독으로 사용한 경우와는 달리, 조성물과 LPS를 조합하여 사용하는 경우에는, 분비되는 TNF의 양이 급격하게 감소되기는 할지라도 48시간과 72시간 시점에서도 계속적으로 TNF 분비를 자극한다(표 15 참조). 그러므로, 배치 0213은 TNF 분비 자극제였다. 배치 B15/1606은 중간 수준의 자극제인데, 2시간 및 6시간 시점에서 LPS-유도성 분비를 저해하였다. 24시간 시점에서 LPS와 조합하여 이용된 B15/1606은 TNF 분비에 대해 보통 수준의 자극성을 나타내었다. 48시간 및 72시간 시점에서, LPS와 조합하여 사용된 B15/1606은 TMF 분비에 대해 중간 정도의 자극성을 나타내었다. 그러므로, 배치 B15/1606은 이중적인 양상의 효과를 나타낸다; 초기에는 LPS에 의한 TNF 분비를 저해하며, 24시간 시점에서는 LPS와 조합하여 TNF 분비에 대해 보통 수준의 자극성을 나타내었다. 그러므로, 배치 B15/1606은 이중적인 양상의 효과를 나타낸다; 초기에는 LPS에 의한 TNF 분비를 저해하며, 24시간 시점에서는 LPS와 조합하여 TNF 분비에 대해 보통 수준의 부가적인 효과를 나타내었다.
[표 15]
배치 R0201은 LPS-유도성 TNF 분비에 대해 저해효과를 나타내는데, 2, 6 및 24시간 시점에서 LPS-유도성 TNF 분비에 대해 현저하게 저해효과를 나타내었다. 48시간과 72시간 시점에서는 LPS-유도성 TNF분비가 최소 수준이었으며, 배치 R0201은 이러한 시점에 있어서 최소의 양성 또는 음성 효과를 나타내었다.
배치 B0203의 직접적인 자극 효과를 양을 변화시켜 가면서, 또한 시간을 달리하면서 시험하였다.
배치 B0203은 약 100ya로 최대의 TNF 분비 자극효과를 나타내었다(표 16 참조). 24시간 시점에서는 200㎕의 양으로 최대의 효과가 관찰되었다(표 17 참조). 그러므로, 이 조성물은 그 자체로서 즉, LPS없이 TNF 분비를 자극할 수 있으며, TNF 분비곡선은 조성물과 LPS가 조합하여 사용된 경우와 유사하였다. 조성물 자체로서만 이용되는 경우의 자극효과는 LPS와 조합하여 사용된 경우에 얻어지는 부가적인 효과보다는 떨어지는 것으로 보인다.
[표 16]
[표 17]
요약하면, 상기 실험결과들은 사람의 PBMN이 LPS에 의해 자극을 받을 때 일부 배치의 조성물들이 TNF 분비를 저해할 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 다른 배치들의 조성물은 이중적인 양상의 효과를 나타내는데, 이는 이들이 LPS-유도성 TNF 분비를 부분적으로 저해하며, 말기 효과로서 TNF의 분비를 보통의 수준으로 유도할 수 있다는 것이다. 세 번째의 생성물은 LPS-유도성 TNF 분비에 대해 저해효과를 나타내지 않았다; 그러나 LPS와는 다른 시점에서 사람의 PBMN을 자극하여 TNF의 분비를 자극할 수 있었다. 결론적으로, 본 발명의 조성물은 항종양 반응의 중요한 조절제인 TNF의 생산을 조절할 수 있다. 이러한 실험데이터가 제9도와 표 18에 요약되어 있다.
[표 18]
[실시예 10]
본 실시예는 요약하면 다음과 같은 사항을 보여주는 것이다:
본 발명의 조성물은 TNF-a 분비활성을 가지고 있고, TNF-α 분비활성은 내독소를 가지고 있는 어떠한 오염물질과도 관계가 없다. 대식세포의 프라이밍(priming)은 TNF-α의 분비를 촉진하는 본 조성물의 활성을 증진시킨다. 본 조성물의 과도한 삼투압농도는 TNF-α 분비활성과 관계가 없다. TNF-α 분비활성을 갖는 본 조성물은 다른 성분으로부터 부분적으로 분리될 수 있다. TNF-α 분비활성을 나타내는 본 발명의 조성물은 C18RP-HPLC 칼럼과 결합하지 않거나 미약하게 결합한다. 활성을 갖는 대부분의 조성물 성분은 RP-HPLC에 의하면 초기에 용출된다. 조성물의 20% 미만의 활성이 RP-HPLC 칼럼 상에 잔류하여 뒤늦게 용출되는 분획으로부터 얻어질 수 있다. TNF-α 분비활성을 나타내는 성분은 고농도의 유기완충용액인 80% 아세토니트릴에 의해 침전된다. 침전된 물질을 수용성 완충용액에 재용해한 다음 RP-HPLC를 이용하여 분석하면, 상기 조성물에 대한 RP-HPLC 프로파일 상에서 배제된 피크와 높은 유사성을 나타낸다. 본 발명의 활성성분은 원래 물질의 약 30%를 이루는 분획으로 분리되어 농축될 수 있다.
A. 폴리믹신(polymyxin)과 TNF-α 분비
본 조성물이 내독소로 작용할 가능성을 제거하기 위하여 반응물에 폴리믹신을 첨가하여 실험을 실시하였다. 폴리믹신은 백혈구에 대한 내독소의 작용을 저해한다. 표 19는 폴리믹신이 LPS-유도성 TNF-α의 분비를 완전하게 저해하는 것을 보여주고 있다. 폴리믹신이 존재하지 않는 상태에서는, LPS가 TNF-α를 517pg/mℓ 유도해 내지만, 폴리믹신이 존재하면 11pg/mℓ의 TNF-α가 유도된다. 한편, 본 발명의 조성물은 폴리믹신의 존재 하에서는 1591pg/mℓ의 TNF-α를 분비시킨다. 폴리믹신이 존재하지 않는 상태에서, LPS와 조성물이 가극제의 부가적인 효과 이상의 효과를 나타내는데, 이는 대식세포가 프라이밍되어 있는 경우에는 본 발명의 조성물이 보다 높은 강도로 작용한다는 것을 의미하는 것이다.
[표 19]
주:
1. 분비된 TNF 총량은 1640 배지에 의한 TNF 분비양량 대해 보정된 값.
2. 폴리믹신 농도:50,000유니트/㎖.
3. 조성물 양: 200㎕
4. 폴리믹신을 첨가한 경우 8명, 첨가제 없는 경우 3명의 환자에 대해 테스트함.
5. LPS 농도: 50ng/10㎕.
B. RP-HPLC 분획들의 TNF 분비 활성
제10도는 배치 0213의 조성물에 대한 C18RP-HPLC 프로파일을 나타내는데, 5종의 분획에 대해 TNF 분비활성을 시험하였다.
초기에는, 폴리믹신의 존재 하에서 서로 다른 분획들의 효과를 시험하였다. 표 20은 RP-HPLC의 초기 용출 분획(2:05-21:20분)들이 대부분의 검출 가능한 TNF 분비활성을 가지고 있다는 것을 보여주고 있다. 그러나, 이러한 활성은 출발 조성물의 단지 약 50%에 불과하다. 표 20의 우측 칼럼은 시료의 삼투압농도를 나타낸다 배치 B0213은 369로서 높다. 21분 이후의 분획들은 정상적인 삼투압농도를 가지고 있는 반면, 활성을 가지고 있는 첫 번째 분획은 출발물질보다 오히려 높은 삼투압농도를 나타내는데, 이는 조성물 중의 많은 염도 역시 초기에 용출되었다는 것을 나타내는 것이다. 그러므로, 시료의 과도한 삼투압농도가 TNF-α 분비를 저해하는지 또는 증진시키는 지에 대해 다음과 같이 조사하였다.
[표 20]
주 :
1. 분비된 TNF 총량은 RPMI 배지에 의한 TNF 분비량에 대해 보정된 값.
2. 분획들은 PBS에 재용해된 것이다.
3. 조성물과 분획의 양: 200㎕.
4. 폴리믹신 농도:50,000유니트/㎖.
5. 환자 수:5명.
6. LPS에 대해서는 삼투압농도 미측정.
표 21은 조성물 분획 1(2:05-21:20)과 2(21:20-25:32)를 이용하여 2명의 환자에게 행한 추가적인 실험에 대한 결과를 나타낸다. 대분분의 활성이 분획 1에서 회수되었지만, 분획 2에도 일부의 활성이 존재하였다. 그러나, 분획 1과 2는 단지 본 조성물의 출발 활성의 약 50%만을 가지고 있었다.
[표 21]
주:
1. 분비된 TNF 총량은 RPMI 배지에 대해 보정된 값.
2. 분획들은 PBS에 재용해된 것이다.
3. 조성물과 분획의 양: 200㎕.
4. 폴리믹신 농도:50,000유니트/㎖
5. 환자 수: 2명.
분획 중에 비특이적 활성 성분이 존재하는 지를 알아보기 위하여 블랭크를 만들어 이로부터 동일한 분획을 모아서 농축하고 테스트하였다. 블랭크의 분획들은 실제로 TNF분비 효과를 나타내지 않았다. 이러한 결과는, 칼럼이나 완충총액이 TNF-α 분비 활성에 기여하는 지에 대한 염려 없이 RP-HPLC로부터의 분획들에 대해 TNF-α 분비활성을 테스트할 수 있다는 것을 의미한다.
이어서, LPS의 프라이밍 효과를 알아보기 위해 폴리믹신이 존재하지 않는 상태에서 조성물의 분획들에 대해 테스트하였다. 표 22는 배치 B0213이 TNF-α 분비를 현저하게 유도한다는 것을 나타낸다. 표시된 용출시간에 따라 조성물에 대한 RP-HPLC로부터 5종의 분획이 존재한다. 분획 1이 대부분의 TNF-α 분비활성을 가지고 있다. 그러나, LPS가 프라이밍되면, 분획 2-4도 약간의 TNF-α 분비활성을 가진다. 분획 2(21:20-25:32)는 분획 1의 활성의 약 25%를 가지고 있는데, 이는 이후 분획들의 활성의 2배에 해당한다.
[표 22]
주:
1. 분비된 TNF 총량은 RPMI 배지에 의한 분비에 대해 보정된 값.
2. 분획중 2:05-21:20은 물에, 21:20-48:55는 PBS에 재용해된 것이다.
3. 조성물과 분획의 양: 200㎕.
4. TNF 분비 실험을 위한 환자 수: 5명.
5. 삼투압농도는 5인중 2인의 환자에 대한 평균임; 표준치 에러는 매우 작으므로 미기록.
표 22가 사용량을 200㎕로 하여 얻은 결과를 나타내는 반면, 표 23은 폴리믹신의 부재 하에서 100㎕의 조성물과 100㎕의 HPLC 분획을 이용하여 3명의 환자에 대하여 추가적으로 시험하여 얻은 결과를 나타낸다. 본 시험에서의 분비 조성물(100㎕)에 의한 분비가 200㎕의 조성물(표 22참조)을 이용하여 얻은 경우에 비해 분비량이 적다 할지라도 그 결과는 유사하다. 분획 1이 대부분의 활성을 나타내며, 약간의 활성이 이후의 분획들인 분획 2 및 3에서 나타나고 있다.
[표 23]
주:
1. 분비된 TNF 총량은 RPMI 배지에 의한 분비에 대해 보정된 값.
2. 분획중 2:05-21:20은 물에, 21:20-48:55는 PBS에 재용해된 것이다.
3. 조성물과 분획의 양:200㎕.
4. TNF 분비 실험을 위한 환자 수: 3명.
5. 삼투압농도는 시험된 환자에 대한 평균임; 표준치 에러는 매우 작으므로 미기록.
C. 조성물의 삼투압농도가 TNF 분비에 미치는 영향
본 발명의 조성물은 삼투압농도가 높은 고장액(hyperosmolar solution)이다. 조성물의 과도한 삼투압농도가 TNF-α 분비활성에 미치는 영향에 대해 연구하였다. 그 결과, 삼투압농도를 저장액의 수준에 이를 정도로 조절하더라도 본 조성물이 TNF-α를 계속 분비하는 것으로 밝혀졌다.
D. 고농도 유기용매에 의한 침전을 이용한 조성물의 물리화학적 분리.
본 조성물 중 TNF 분비활성을 가지고 있는 성분은, 그 대부분이 RP-HPLC 시 초기에 빨리 용출되는 것으로부터 알 수 있듯이 RP-HPLC칼럼에 결합하지 않았기 때문에, 고농도의 유기 용매에 용해된 상태로 시료가 존재하는 RP-NPLC 분리법의 역원리로 작용하면서 친수성상보작용이 가능한 칼럼을 이용하기로 결정하였다. 이러한 분리법은 크기가 작은 극성 물질을 분리하는데 이용된다. 그러나, 조성물을 80%아세토니트릴 용매 중에 넣으면 침전이 형성된다. 그러므로, 고농도 유기용매 완충용액 중의 조성물의 일부는 침전을 이루었다. 이러한 침전물과 용해성 분획들을 분리하였다. 침전물과 용해성 분획 모두 동결 건조법에 의해 건조시켰다. 침전물과 용해성 분획을 다시 수용성 용액에 용해하고 RP-HPLC로 분석하여 TNF-α 분비활성에 대해 테스트하였다. 표 24는 대부분의 TNF-α 분비활성이 침전된 물질에 포함되어 있다는 것을 나타내고 있다.
[표 24]
주:
1. 분비된 TNF 총량은 1×199 배지에 대해 보정된 값.
2. 상등액은 PBS, 침전물은 재증류수에 재용해된 것이다.
3. 침전물은 (저장액인) 70% 1×199 배지에 존재한다.
4. 테스트 환자 수: 5명.
5. 삼투압농도는 시험된 5명의 환자 중 4명에 대한 평균인; 표준치 에러는 매우 작으므로 미기록.
조성물 중의 침전물(제11도)과 용해성 분획(제12도)에 대한 RP-HPLC 분석결과는 침전물이 주로 조성물의 RP-HPLC의 분획 1에 포함되어 있는 물질이며, 용해성 물질은 조성물의 RP-HPLC의 다른 분획(제10도)에 포함되어 있다. 그러므로, 두 가지 서로 다른 방법으로, 조성물의 활성이 RP-HPLC에서 최소한으로 잔류하는 분획에 포함되어 있다는 것을 알 수 있었다. 사실상 100㎕와 200㎕로 테스트 시, 침전물은 미침전된 조성물과 동일한 활성을 가지고 있었다.
200㎕ 침전물만이 정상 삼투압농도 이상이었다. 결론적으로, 조성물의 침전물과 용해성 분획(상등액)을 RP-HPLC에 의해 분리하여(제11도 및 제12도) 두 개의 분획으로 나누었다(RP-HPLC 프로파일참조). 분획 1(2:00-21:10분)은 RP-HPLC에 의해 분리된 조성물의 동일한 분획 1과 균등하였고, 분획 2는 RP-HPLC에 의해 분리된 조성물의 분획 2-5와 균등하였다. 분리물에 대하여 TNF-α 분리활성을 테스트하였다. 표 26은 2명의 환자를 대상으로 테스트한 것인데, RP-HPLC분리 후 침전물이나 상등액 모두 TNF 분비활성을 가지고 있지 않음을 보여주고 있다. 그러나, 처음 2명의 환자에 대한 결과(표 25 참조)는 침전물이 이상적인 양으로 테스트되지 않았을 수도 있었을 가능성을 나타내었다. 결론적으로, 2명의 추가적인 환자를 대상으로 보다 낮은 농도로 분획에 대한 재시험을 실시하였다. 표 26을 살펴보면, 50 및 100㎕에서 침전물의 분획 1이 대부분의 활성을 나타내었다. 50㎕에서, 50ng LPS의 경우에 비해 TNF-α를 2배 정도나 많이 분비하였다. 그러나, 침전물의 RP-HPLC 분획 2에서 적은 분비활성이 발견되었을 뿐만 아니라 상등액의 RP-HPLC 분획 1 및 2에서도 적은 분비활성이 발견되었다.
[표 25]
주:
1. 분비된 TNF 총량은 199 배지 1×에 의한 TNF 분비에 대해 보정된 값.
2. 첫 번째 분획은 재증류수에, 두 번째 분획은 PBS에 재용해된 것이다.
3. 테스트 환자의 수: 2명.
4. 삼투압농도는 시험된 화나에 대한 평균임; 표준치 에러는 매우 작으므로 미기록.
5. 1×와 70% 1×199 배지에서 얻은 값의 평균임.
[표 26]
주:
1. 분비된 TNF 총량은 199 배지 1×에 의한 TNF 분비에 대해 보정된 값.
2. 첫 번째 분획은 재증류수에, 두 번째 분획은 PBS에 재용해된 것이다.
3. 테스트 환자의 수: 2명.
4. 삼투압농도는 시험된 환자에 대한 평균임; 표준치 에러는 매우 작으므로 미기록.
5. 모든 시료는 1× 199 배지 중에 존재함.
E. 다른 배지에 의한 TNF-α 분비
RPMI 1640과 배지 199를 이용하여 배지 199와 RPMI 1640 중 어느 배지에서 TNF-α 분비활성이 보다 낮은 지에 대해 측정하였다(표 27 참조). 이러한 결과는 TNF-α를 분비하는데 있어서 10-200ng의 LPS가 배지 199에서보다는 배지 RPMI 1640에서 보다 효과적임을 의미한다. 또한, 배지 RPMI 1640에서 보다 왕성한 분비를 나타내는 것으로 보인다. 그러므로, 배양조건은 TNF-α의 분비정도에 영향을 줄 수 있다.
[표 27]
F. 조성물의 삼투압농도
표 28은 서로 다른 배치의 조성물의 삼투압농도를 나타내고 있다. B0213은 676mOsm으로서 약간 높다. B0213보다 TNF 분비활성이 높은 것으로 밝혀진 B0222는 삼투압농도가 581mOsm으로서 덜 높다. 분획들 B0226, BC11-06과 BC11-09은 540-603mOsm 범위에 있다.
[표 28]
[실시예 11]
A. 본 발명의 조성물의 종양괴사인자(TNF) 분비활성
1. 조성물의 아세토니트릴 침전물과 상등액
전술한 실시예들에 기재되어 있는 바와 같이, 80% 아세토니트릴 침전물이 본 발명의 조성물을 형성한다. 침전물과 미침전물(이하, 상등액이라 칭함)에 대해 TNF 분비활성을 측정하였다.
표 29는 조성물의 TNF 분비 성분이 유기 용매인 80% 아세토니트릴에 의해 침전되는 것을 보여주고 있다. 전체 조성물은 0.04mℓ로서 약 15pg/mℓ의 TNF를 분비하는 반면, 침전물은 0.05mℓ로서 각각 58pg/mℓ(B0222), 0(B0221), 17pg/mℓ(B0213)을 분비하는데, 이는 80% 아세토니트릴 침전법에 의해 TNF 분비 성분이 회수될 수 있다는 것을 의미하는 것이다. 침전된 조성물을 동량의 침전용 액체에 재용해하였다. 따라서, 침전물 0.1mℓ은 0.1mℓ의 전체 조성물로부터 얻은 것이므로 0.1mℓ의 전체 조성물에 상응하는 것이다.
[표 29]
주:
1. 테스트 환자의 수: 5명.
2. 분비된 TNF 총량은 1× 199 배지에 의한 TNF 분비에 대해 보정된 값.
3. 삼투압농도는 1× 199 배지 (311mOsm)에 대해 보정되지 않았음.
4. 삼투압농도는 시험된 환자에 대한 평균임; 표준치 에러는 매우 작으므로 미기록.
5. 침전물은 재증류수에 재용해된 것이다.
6. 웰에 첨가된 LPS의 양은 10㎕임.
7. 웰은 총 1000㎕를 포함하고 있음.
8. 시료의 양은 동일함.
*본 발명의 조성물은 비룰리진(Virulizin)으로 지칭되기도 함.
초기 연구에서 일반적으로 0.1-0.2mℓ의 조성물이 TNF 분비를 자극하는데 이용되었다는 것을 알게된 것은 흥미롭다. 0.1-0.2mℓ에 재용해된 B0222, B0221 및 B0213의 침전물들은 205-821pg/mℓ의 TNF를 분비하였다. 0.1mℓ의 침전물로는, 배치 B0222, B0221 및 B0213이 상당히 비슷한 범위의 양인 205-365pg/mℓ의 TNF를 분비하였는데, 이는 3개의 서로 다른 배치가 TNF 분비활성면에서 일정성을 나타내는 것으로 해석된다.
별개 그룹의 기여자(donor)의 백혈구를 대상으로 하여, 조성물의 80% 아세토니트릴 침전 후 잔류하는 상등액에 대해 테스트하였다. 조성물의 전체 배치(B0222, B0213) 0.04mℓ이 TNF를 각각 175 및 233pg/mℓ 분비하는 반면, 상등액 0.05mℓ은 전체 조성물 활성의 약 33%에 해당하는 42 및 41pg/mℓ을 분비하였다. 80% 아세토니트릴을 이용하여 같은 방식으로 만들어진 블랭크는 TNF 분비활성을 나타내지 않았다. 그러므로, 침전물에 있어서의 TNF 분비활성은 침전물을 유도하는데 이용되는 완충용액의 일부 잔류물질에 의해 생기는 것이 아니다.
전술한 연구에서는 서로 다른 기여자로부터의 백혈구세포에 대해 침전물과 상등액이 테스트되었지만, 동일한 기여자로부터의 백혈구세포에 대해서도 2개의 분획이 별도의 연구를 통해 테스트되었다. 2개의 테스트배치에 대해, 전체 조성물은 0.04mℓ로서 0.41pg/mℓ의 TNF를 분비하였다. 반면, 조성물의 동일한 배치의 침전물은 0.05mℓ로서 141-749pg/mℓ의 TNF를 분비하였으며, 상등액 분획은 0.05mℓ로서 6-57pg/mℓ의 TNF를 분비하였다 그러므로, 침전물이 TNF 분비활성을 많이 포함하고 있었다. 상등액 분획도 여전히 약간의 TNF 분비활성을 가지고 있기는 하였지만, 침전물보다 훨씬 적은 양이며, 전체 조성물과 동일하거나 그 이하이다.
2. 본 발명의 조성물의 RP-HPLC에 의한 분획들
조성물의 침전물이 TNF 분비활성을 많이 가지고 있는 것으로 나타났기 때문에 침전물의 프로파일을 C18RP-HPLC로 조사하였다. 제18-20도는 각각 전체 조성물, 침전물, 상등액의 RP-HPLC 프로파일을 나타낸다. 침전물의 프로파일은 기본적으로 전체 조성물에서 초기에 용출되는 피크들을 나타내는 반면(제19도), 상등액의 프로파일은 초기피크들의 강도가 약한 것을 제외하고는 전체 조성물과 유사하다(제20도).
다음 단계의 일련의 실험에서는, C18RP-HPLC에 의한 분리 후 침전물과 상등액의 활성을 평가하였다. 침전물과 상등액을 RP-HPLC로부터 2개의 풀(pool)로서 수집하였다:2-21분과 21-46분. RP-HPLC에 의해 분리된 전체 조성물의 분획들에 대한 초기 연구들은 TNF분비활성 성분이 기본적으로 2-20분 분획으로 용출되었다는 것을 밝혀주었다. 표 30은 전체 조성물과 침전물과 상등액의 RP-HPLC 분획들에 대한 테스트 결과를 나타낸다. 본 실험에서, 단지 10㎕의 전체 조성물이 이용되었으며, 이 양은 TNF 분비를 일으키지 않았다. 2-21분 풀의 침전물은 TNF를 분비하였지만, 21-46분 풀은 분비하지 않았다(표 30참조). 2-21분 풀의 상등액도 역시 TNF를 분비하였지만, 21-46분 풀은 최소량의 TNF만을 분비하였다(표 30 참조). 그러므로, 침전물과 상등액 모두에 있어서, TNF 분비활성은 기본적으로 C18RP-HPLC로부터 초기에 용출되는 분획에 존재한다.
[표 30]
주:
1. 테스트 환자의 수: 5명.
2. 분비된 TBF 총량은 1×199 배지에 의한 TNF 분비에 대해 보정된 값.
3. 삼투압농도는 1×199배지 (309mOsm)에 대해 보정되지 않았음; 표준치 에러는 매우 작으므로 미기록.
4. 침전물은 타잎 1물에, 상등액은 PBS 완충용액에 재용해된 것이다.
5. 웰에 첨가된 LPS의 양은 10㎕를 포함하고 있음.
이러한 결과는 침전물과 상등액에 있는 TNF 분비물질이, 동일하지는 않더라도 아마도 80%아세토니트릴에 대한 용해도 차이 정도의 미세한 차이만을 가지고 있는 정도로 밀접하게 연관된 분자임을 나타내는 것이다.
또 다른 실험을 통해, 침전물의 2개의 RP-HPLC 풀의 TNF 분비활성을 3개 배치의 조성물에 대해 알아보았다. 표 31은, 이들 3개의 서로 다른 배치(B0222, B0221, B0213)에 있어서, TNF 분비활성이 기본적으로 2-21 풀에 존재하고 있음을 보여주고 있다. 그러므로 서로 다른 배치라고 하더라도 일정하다.
[표 31]
주:
1. 100,10㎕ 시료; 테스트 환자의 수는 3명.
2. 200,40㎕ 시료; 테스트 환자의 수는 4명.
3. 분비된 TNF 총량은 199 배지 1×에 의한 TNF 분비에 대해 보정된 값.
4. 199 배지 1×@ 100 ＆ 10㎕-306mOsm, @ 200＆ 40㎕-305mOsm.
5. 삼투압농도는 199 배지 1×에 대해 보정되지 않았음; 표준치 에러는 매우 작으므로 미기로.
6. 웰에 첨가된 LPS의 양은 10㎕임.
7. 웰은 총 1000㎕를 포함하고 있음.
8. 시료의 부피는 동일함.
9. 첫 번째 분획은 재증류수에, 두 번째 분획은 PBS 완충용액에 재용해된다.
후속되는 실험에서는, 침전물을 80% 아세토니트릴로 세척하는 효과에 대해 알아보았다. 실험의 목적은 TNF 분비활성이 간단하게 잡혀지지는 않는다는 것을 입증하기 위한 것이다. 전체 조성물은 0.04mℓ로서 325pg/mℓ의 TNF를 분비하였다. 2-24분 풀의 침전물은 0.1mℓ로 324pg/mℓ의 TNF를, 0.05mℓ로 3pg/mℓ의 TNF를 분비하였다. 24-46분 풀은 TNF를 분비하지 않았다. 마찬가지로, 2-24분 풀의 상등액은 0.1mℓ과 0.05mℓ로 TNF를 분비하였고, 24-46분 풀은 TNF를 약간 분비하기는 하였지만, 상당히 낮은 수준이었다.
조성물의 RP-HPLC 분리체들의 취급과정이 TNF 분비활성에 영향을 미치지 않았는지를 확인하기 위하여 조성물을 제외하고 동일한 방식으로 시료를 준비하였다. PBS와 H2O 블랭크의 경우, 이들의 침전물과 상등액의 RP-HPLC 프로파일은 어떠한 피크도 나타내지 않았다.
동일한 기여자로부터의 단핵세포를 이용하여 동일한 기여자로부터의 백혈구세포에 대하여 테스트하였다. 전체 조성물과 RP-HPLC 칼럼 상에서 2-24분에 용출되는 침전물은 TNF를 분비하는 반면, PBS, H2O 또는 이들의 침전물은 HPLC의 2-23분 풀에서 TNF 분비활성을 나타내지 않았다. 그러므로, 2-24분 사이에 용출되는 침전물은 특이적인 TNF 분비를 야기한다.
24-46분 사이에 용출되는 조성물의 침전물 풀은 TNF를 분비하지 않았다. 대조군으로서 물과 PBS는 각각 114 및 40pg/mℓ의 분비량을 나타냈다. 따라서, 24-46분 풀의 침전물로부터는 특이적인 TNF 분비가 이루어지지 않았다.
2-24분과 24-46분의 상등액 풀은 TNF를 각각 82, 68pg/mℓ분비하였다. RP-HPLC로부터의 물과 PBS 블랭크 풀은 약간의 THF 활성을 나타냈다. 2-25분과 25-46분의 물에 대한 풀은 각각 149 및 216pg/mℓ의 분비량을 나타냈으며. PBS 풀은 0 및 126pg/mℓ의 TNF를 분비하였다.
그러므로, 침전물과 상등액 분획들은 TNF 분비활성을 가지고 있었다. RP-HPLC 결과, TNF 분비활성을 나타내는 성분은 RP-HPLC로부터 초기에 용출되는 것으로 나타났는데, 이는 활성 성분들이 동일하지는 않더라도 물리적으로 매우 유사하다는 것을 의미하는 것이다.
표 32는 RP-HPLC 분리 후 80% 아세토니트릴 침전물과 상등액에 대해 더 실험하여 유사하게 제조된 블랭크 시료에 대한 활성을 감산함으로써 얻은 결과를 나타낸다.
[표 32]
주:
1. 데이터는 비룰리진 Sumtable 24.4로부터 도입됨.
2. 비룰리진 재용해: 제1 침전물 분획은 타잎1 물에, 기타 다른 분획들은 모두 PBS에 재용해됨.
3. 전체량은 재용해되지 않았으므로 보정되지 않음.
4. 시료의 부피는 동일함.
전체 조성물은 시험관내에서 단핵세포로부터 24시간 후 TNF, GM-CSF, IL-1β를 분비한다. 80% 아세토니트릴 침전물은 동일한 분비활성을 가지고 있으며, 대부분 RP-HPLC로부터 초기에 용출된다. 상등액 분획도 TNF 분비활성을 가지고 있으며, 대부분 RP-HPLC로부터 초기에 용출된다. 상등액 분획은 분비활성을 가지고 있지만, TNF와 GM-CSF에 대한 경우 초기에 용출된다. 이러한 결과는, 거의 동일한 성분이 3종의 사이토킨을 분비하는 것을 의미한다. GM-CSF와 IL-1β의 경우에는, 약간의 분비활성이 RP-HPLC의 후기 용출 분획으로 용출되는데, 이는 단핵세포에 작용하여 GM-CSF와 IL-1β를 분비하도록 할 수 있는 또 다른 성분이 조성물에 있을 수 있다는 것을 암시하는 것이다.
[물리 화학적 분석]
[SDS 겔 전기 영동]
TNF, GM-CSF와 IL-1β 분비 활성성분이 80% 아세토니트릴에 의해 부분적으로 침전될 수 있으며, 분비활성의 대부분이 C18RP-HPLC시 초기에 용출된다는 사실을 알아냈기 때문에, 침전물 분획의 물리화학적 성질을 연구하여 이러한 성질을 전체 조성물과 조성물의 상등액 분회에 대해 비교하였다.
제21도는 전체 조성물, 조성물의 침전물과 상등액에 대한 SDS겔 전기영동 결과를 나타내는 것이다. 세 가지 경우에, 조성물은 SBS전반부에서 나타났는데, 이는 분자량이 작다는 것을 의미하는 것이다. 가장 최고의 표준품으로서는 14,400달톤이 사용되었다.
[분자체 HPLC(Molecular Sieve HPLC)]
조성물의 분자량 크기는 분자체 HPLC를 이용하여 용출되는 시간을 측정함으로써 조사하였다. 전체 조성물, 침전물과 상등액의 용출시간을 표준품과 비교하였다. 3개의 시료는 모두 24.5분에 용출되는 인슐린보다 후에 용출되었다. 이러한 물리화학적 분석에 의해 분자량이 2,400달톤 미만임이 다시 한 번 밝혀졌다.
[친수성(폴리하이드록시 에틸) HPLC]
TNF 분비 성분은 초기에 용출된다. 그러므로, 반대 효과를 가지고있는 칼럼인 친수성 칼럼을 유기 용매의 존재 하에서 선택한다. 폴리하이드록시 에틸 칼럼에 대한 이상적인 용출 조건은 80%아세토니트릴이다. 그러나, 전술한 실시예에 언급되어 있는 바와 같이, 생성물 중 일부의 물질이 이 농도에서 침전한다. 결과적으로, 칼럼이 대체로 분자체 칼럼으로 작용하는 저농도의 아세토니트릴 조건에서 이 성분이 분석되었다. 제22도와 23도는 전체 상등액과 침전물의프로파일을 나타낸다. 전자는 서로 다른 피크에 대한 용출시간을 보여주고 있다. 이러한 용출 시간은 조성물의 활성 성분의 분자량이 작다는 것을 의미한다.
[침전된 성분의 아미노산 분석 및 씨퀀싱]
2개의 시료에 대해 산가수분해 전, 후로 아미노산 조성을 분석함으로써 단백질 분식을 실시하였다:즉, 아세토니트릴 침전물과 침전물의 RP-HPLC의 2-20분 용출 풀이다. 이들 2개의 시료는 산가수분해 전, 후 아미노산 면에서 상당히 유사하였다. 그러나 (가수분해 후)아미노산의 조성과, 펩티드결합이 가수분해되었음을 의미하는 유리아미노산 함량 사이에는 상당히 차이가 있다. 상기 시료 조성물은 글리신과 글루타메이트/글루타민이 매우 풍부하다는 면에서 특이했다.
전술한 사항으로부터, 활성 성분 중 적어도 하나는 단백질성이라는 것을 알 수 있다. 분석 결과 산가수분해에 대해 안정한 것으로 보이는 미확인 닌히드린 양성 (대부분은 아미노산이지만, 다른 화합물이 반응을 나타낼 수도 있음)을 나타내는 성분이 상당히 보이고 있다. 시료 중 1000개의 잔기당 주 아미노산은 Asx(아스파라긴) 143개, Thr(트레오닌) 31개, Glx(글루타메이트) 381개, Gly(글리신) 187개 및 Ala(알라닌)170개이다.
유리 아미노산과 분비된 (산 가수분해) 아미노산을 비교하여보았다. 그 결과 잔기 1000개당 다음과 같은 아미노산이 존재하였다:Asx(아스파라긴) 51개, Thr(트레오닌) 8.6개, 세린 18개, Glx(글루타민 )375개, Pro(프롤린) 17개, Gly(글리신) 429개 및 Ala(알라닌) 86개.
유리 아미노산/1000 비는 다음과 같다:
5개의 미확인(닌히드린 양성) 성분이 있다. 시스테인산, 글루코사민 및 사코신(sarcosine)일 가능성이 매우 높다. 또한, 메티오닌 설폭사이드와 메티오닌 설폰이 있을 수도 있다. 미확인 닌히드린 성분 중 주된 것은 시료 중의 유리 성분인 것으로 보인다.
[실시예 12]
[IL-1β와 IL-8의 분비]
표 33은 본 발명의 조성물이 배양 중의 사람의 단핵세포를 자극하여 IL-1β를 분비하며, 조성물의 80% 아세토니트릴 침전물이 잔류하는 상등액 성분보다 많은 양을 분비하는 것을 보여주고 있다. 전체 조성물은 IL-8 분비를 자극하지 않지만, 분획화된 조성물은 약간의 IL-8을 분비하는 것으로 보인다. 표 33의 결과는 대조 시료의 IL-1β와 IL-8에 대한 결과를 감산한 값이다.
[표 33]
주:
1. 테스트 환자의 수: 5명.
2. 재용해: 침전물은 타잎1 물에, 상등액은 PBS에 재용해됨.
3. 시료는 1×199 배지와 LPS에 의한 분비에 대해 보정된 값: IL-16과 IL-8에 대해 각각 154,1065pg/㎖, 68, 294ng/㎖.
4. 배지와 LPS에 대한 삼투압 농도: 각각 311,309.
5. 웰에 첨가된 LPS의 양은 10㎕임.
6. 웰은 총 용적: 1000㎕.
7. 시료의 부피는 동일함.
[물리화학적 특성]
조성물과 그 침전물 및 상등액을 이온-교환 HPLC로 분리하였다. Ax300(음이온 교환) 크로마토그라피와 CMX 300(양이온 교환)크로마토그라피를 사용하였는데, 성분이 상당히 분리되는 정도는 아니었다. 소수성 역상 크로마토그라피에 의해서도 피크가 분리되지 않았다.
[모세관 전기영동(Capillary electrophoresis)]
침전물에 대해 모세관 전기영동 분석을 실시하였다. 높은 pH에서, W 흡수 피크가 190nm에서 검출되었지만, 200nm에서 완전히 사라졌다. 214nm에서 UV 흡수 피크는 없었다.
유리 아미노산은 유도체화되지 않으면 보이지 않는다. 190nm에서의 W 피크는 염인 것으로 생각된다.
[실시예 13]
다음의 3개의 인디케이터 시스템에서 조성물의 자극 활성에 대해 평가하였다:1) 림프구세포 DNA 합성의 자극; 2) 림프구세포-매개형 세포독성 작용의 유도; 3) 단핵세포/대식세포-매개형 세포독성 작용의 유도. 이들 테스트를 선택한 것은, 악성 질병을 앓고 있는 환자에 있어서, 서로 다른 임상적 변수와 연관된 것으로 보이는 면역학적 기능의 측정이 가능하기 때문이다. 이러한 면역 작용의 인디케이터들은, 인터페론이나 인터루킨-2 등의 다른 생물학적 반응 변형제로 치료를 받은 암 환자에게서도 조절될 수 있다. 초기 실험 결과는 다음과 같다.
1) 림프구세포 DNA 합성의 자극: 식물성 적혈구 응집소인 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin:PHA)의 최적 자극 농도 비교
결과:기본형 유사분열 유발인자(마이토젠:mitogen)인 PHA와는 달리, 조성물은 블라스토제네시스(blastogenesis:소림프구로부터 대림프구 세포로의 형태적 전환)와 세포분열을 일으키도록 림프구 세포를 자극하지는 않는다.
2) 림프구 세포-매개형 세포독성 작용의 자극: 인터루킨-2 (IL-2)의 최적 자극 활성 비교
결과: 림프구세포 세포독성 작용의 기본적 자극제인 인터루킨-2와는 달리, 본 조성물은 림프구세포 세포독성을 유발하지 않는다.
3) 조성물에 의한 단핵세포-매개형 세포독성 작용의 자극: 감마 인터페론과 내독소와의 비교(γ-IFN + LPS)
결과: 조성물은 말초혈관 단핵세포를 자극하여 투여량에 따라 종양세포 치사작용을 발휘할 수 있다. 자극의 크기는 기본적인 대식세포활성화 인자의 조합인 γ-IFN + LPS에 의해 일어나는 정도와 같은 수준이다. 시험관 내 실험에서, 기타 다른 대식세포 활성화 인자의 경우에 필요한 추가적인 내독소를 이들 조성물은 필요로 하지 않는다는 것을 알게된 것은 중요하다. 조성물에 내독소 성분이 없으면, 이러한 대식세포의 생물학적 활성분석에서 얻은 결과는 생물학적으로 의미가 있을 것이다.
[조성물을 이용한 단핵세포/대식세포 연구]
실험 결과, 본 발명의 조성물이 림프구세포 작용을 자극하지는 않지만 단핵세포 작용을 자극할 수 있는 것으로 나타났기 때문에, 후속연구는 이러한 화합물의 단핵세포/대식세포 자극활성의 특성에 대해 촛점을 두고 이루어졌다. 또한, 서로 다른 배치의 화합물뿐만 아니라 투여량에 따른 단핵세포/대식세포 종양세포 치사작용을 알아보기 위해 수많은 비교 연구가 이루어졌다. 이러한 연구의 주된 목적은 본 발명의 조성물이 암환자의 서로 다른 부위로부터의 단핵세포와 대식세포의 종양세포 치사작용을 자극하는 능력을 테스트하기 위한 것이었다. 이러한 연구를 이끄는 중심적인 가정은 모든 생물학적 자극제의 치료효능은 대부분 악성 질병을 가지고 있는 환경에서 종양세포 치사작용을 일으키는 능력에 달려 있다는 것이다. 비는 종양의 미세환경에서 존재하는 면역세포의 직접적인 자극에 의해 일어날 수 있다. 다른 방법으로는, 악성 질병 부위로 유도되어 그 환경에서 작용할 수 있는, 순환하는 면역세포의 자극에 의해서도 일어날 수 있다. 이러한 연구에 있어서, 다음과 같은 요소가 중요하다:1) 암환자와 대조 개체로부터의 말초혈관 단핵세포; 2) 폐암환자와 양성 폐질환 환자의 폐포 대식분자; 3) 악성 부인병 질환 환자의 복막 대식세포
1. 조성물에 대한 투여량 반응 및 배치별 연구
본 연구는, 조성물의 투여량과 제조 배치를 달리했을 때의 자극활성을 테스트하기 위해 말초혈관 단핵세포를 대상으로 이루어졌다. 3개 배치의 조성물을 테스트하였다. 이들은 각각 배치 #216, 219, 222로 지정된 것이었다. 각각의 배치의 조성물에 대해, 희석을 하지 않은 채 전체로서 테스트하는 한편, 1:10, 1:50으로 희석한 것에 대해서도 테스트하였다. 그 결과가 제24도에 그래프로서 나타나 있다.
결과:배치 #222와 216은 단핵세포 종양 치사작용을 자극하였지만 배치 #219는 그렇지 않았다. 예비실험에서는 배치 #222가 배치 #216에 비해 우수한 것으로 나타났다. 배치 #222는 희석되지 않은 (즉, 전체)상태에서와 1:10 희석 상태에서 동일한 수준의 종양파괴 작용을 나타냈고, 1:50 희석 상태에서도 검출가능한 정도로 활성을 가지고 있었다. 배치 #216의 경우, 희석되지 않은 상태일 때 종양파괴 작용이 가장 높았고 1;10 희석 상태에서는 활성이 감소되었고, 1:50 희석상태에서는 활성이 검출되지 않았다. 전술한 바와 같이, 배치 #219는 어떠한 상태에서도 단핵세포 종양파괴 작용을 나타내지 않았다.
2. 말초혈관 단핵세포에 있어서의 종양파괴 작용
대조 개체로부터 얻은 4개의 말초혈관 단핵세포 시료에 대해테스트를 실시하였다. 이들 테스트에서는 최적 자극 농도의 조성물(배치 #222의 1:10 희석비율)과 최적 자극 농도의 γ-IFN + LPS를 이용하였다. 이들 연구에서 표적세포는 배양된 NK-비감수성 세포주인, 창 종양세포였다.
자궁경부암 환자에게서 얻은 1개의 단핵세포 시료에 대해서도 테스트를 하였다. 이 테스트는, 환자 자신의 종양세포가 분석시 표적세포로서 이용될 수 있다는 가능성 면에서 중요하다. 전술한 바와 같이, 이러한 테스트에는 최적 자극 농도의 조성물(배치 #222의 1:10 희석액)과 최적 농초의 γ-IFN + LPS이 이용되었다. 종양세포를 보존하기 위해 효과기/표적세포의 비도 15/1로 감소되었다.
결과:대조 개체로부터 얻은 말초혈관 단핵세포에 있어서, 상기 조성물은 최적 자극 농도의 γ-IFN + LPS에 의해 일어나는 수준 이상으로 창 간종양에 대하여 단핵세포 종양파괴 작용을 자극하였다. 자궁경부암 환자에게서 얻은 말초혈관 단핵세포에 있어서는, 본 조성물은 γ-IFN + LPS에 의해 일어나는 수준보다 약 30% 높은 수준으로 환자 자신의 종양세포에 대하여 종양파괴 작용을 자극하였다.
3. 악성 부인병 환자의 복막 대식세포에 있어서의 종양파괴 작용
자궁경부암 환자 1인과 난소암 환자 1인의 세척액에서 추출된 복막대식세포에 대해 테스트를 실시하였다. 이들 테스트는 환자 자신의 종양세포를 분석의 표적세포 이용하여 이루어졌다. 전술한 바와 같이, 최적 자극 농도의 조성물(배치 #222의 1:10희석액)과 최적 농도의 γ-IFN + LPS을 이용하여 비교하였다 또한, 환자의 종양세포를 보존하기 위해 효과기/표적세포의 비도 15/1로 감소되었다.
결과:이들 테스트 결과는 국부적인 종양 환경이 면역학적 활성제에 대한 면역세포의 반응 결정기로 작용할 수 있다는 것을 보여주었다. 자궁경부암의 경우에, 복강 내에서 악성 질병의 병리학적인 징후가 발견되지 않았고, 자기의 종양에 대한 종양파괴 작용이 조성물만 존재하는 경우보다 γ-IFN + LPS가 존재하는 경우에 더 양호하였다. 난소암 환자의 경우에는, γ-IFN + LPS 존재시 활자 자신의 종양에 대한 반응이 오히려 높지 않은 반면, 조성물 존재시 반응이 보다 큰 것으로 나타났다.
4. 폐암 환자와 대조 개체의 폐포 대식세포에 있어서 종양파괴 작용
폐암 환자 1인과 양성 폐질환 환자 3인의 기관지 세척액으로부터 분리한 폐포 거대세포에 대해 테스트를 실시하였다. 이들 테스트에서는 최적 자극 농도의 조성물(배치 #222의 1:10희석액)과 최적 자극 농도의 γ-IFN + LPS을 이용하였다. 본 연구에서 표적세포는 창 간종양 세포였고 효과기/표적세포 비는 20/1이었다.
결과:폐암 환자의 폐포 대식세포는 γ-IFN + LPS와 같은 종래의 거대세포 활성제에 대하여 종양파괴 작용을 나타내는 데 있어서 손상을 받는다. 위의 결과는 이러한 관찰사항과 일치하고 있다; 폐암 환자의 폐포 대식세포의 종양파괴 작용은 대조 개체에 비해 크게 떨어지는 것이다. 또한, 상기 결과는 폐암 판자의 폐포 대식세포 또는 양성폐질한 환자의 대조군의 폐포 대식세포에 있어서 본 조성물이 종양파괴작용을 활성화시키지 않는 것을 보여주고 있다.
조성물에 대한 상기 시험관 내 예비 실험들은 본 조성물이 대식세포 활성제임을 보여주고 있단. 제공된 물질은 NK-비감수성 세포주와 바로 분리된 사람의 종양세포 모두에 대한 표준 세포독성 분석실험시 종양파괴작용을 일으킬 수 있는 것이었다. 또한, 활성은 상기 테스트시 사용된 물질의 농도에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 시험관내에서 대식세포종양파괴 작용을 활성화시키는 본 조성물의 능력은, 현재 이용 가능한 것으로서 최대의 대식세포 활성화 작용을 가지고 있는 조합체인 γ-IFN + 내독소에 견줄만한 것이다. 전술한 바와 같이, 내독소의 부재 하에서 본 조성물이 이러한 수준의 종양파괴 작용을 일으킬 수 있는 능력은, 여기에 내독소와 같은 오염물질이 존재하지 않는다면 생물학적으로 중요한 것으로 간주될 것이다.
다른 대식세포 활성제에 대해서도 밝혀진 바와 같이, 대식세포종양파괴 작용을 자극하는데 있어서의 본 조성물의 활성은 대식세포의 원천에 따라 달라진다. 본 조성물은, 정상적인 개체에 대해서는 γ-IFN + LPS와 동등한 정도, 암환자에 대해서는 γ-IFN + LPS보다 월등한 정도의 활성을 가지고 있는, 말초혈관 단핵세포의 우수한 활성제인 것으로 보인다. 악성 질환은 사용되는 활성제에 따라 단핵세포 종양파괴 작용에 심각한 손상을 준다(브라운 등, 1991). 암 판자 단핵세포에 있어서 서로 다른 대식세포의 생물학적 활성의 결정인자 중 하나는 프로스타글란딘 세포에 의한 아라키돈산 대사와 분비에 대한 활성제의 감수성이다. 조성물에 대한 초기 연구로부터, 상기 화합물에 의해 생성된 활성은 프로스타글란딘의 저해효과에 대해 감수성을 나타내지 않는 것으로 보인다. 프로스타글란딘 비감수성이 본 조성물에 의해 자극된 암 환자의 단핵세포에 대해서 결정적으로 입증될 수 있다면 이는, 기타 많은 생물학적 활성제의 효능이 프로스타글란딘에 의해 제한되기 때문에, 치료학적으로 중요한 의미를 가질 것이다. 2개의 시료에 대한예비 실험은 본 조성물이 복막 대식세포의 활성화, 특히 복강 내에 악성질환을 가지고 있는 경우 복막 대식세포의 활성화에 크게 기여하는 것을 보여주고 있다.
이러한 예비 실험 결과들은 또한 다른 종류의 악성 부인병 환자의 복막 대식세포에 있어서 종양파괴 작용을 활성화시키는 다른 활성제들의 능력에 대해 비교할 때 밝혀지는 것들이다. 이러한 연구에 있어서, 복강 내에 악성 질환이 존재하면 특정 활성제에 대한 복막 대식세포의 반응성이 영향을 받게 된다. 자궁경부암 환자의 경우에는, 일반적으로 악성 질환이 복강 내에는 존재하지 않으므로, γ-IFN + LPS에 대한, 대식세포의 반응은 정상적이다. 그러나, 난소암과 같이 복강 내에 질병이 생기면, γ-IFN + LPS에 대한 반응은 억제된다. 이는 부분적으로는 악성질환이 존재하는 경우 복막 대식세포의 아라키돈산 대사가 변화되는 것과 관련이 있다(브라운(Braun) 등, 1993). 본 발명의 조성물이 난소암환자 자신의 복막 대식세포에 있어서 환자 자신의 종양세포에 대해 종양파괴 작용을 활성화시킬 수 있다는 사실은, 아라키돈산 대사경로와 관계 없는 활성화 메카니즘의 존재를 다시 한 번 상기시키는 것이다.
한편, 악성 질환이 폐에 존재하는 지의 여부와는 관계 없이 종양파괴 작용을 하게 되는 폐포 대식세포를 본 발명의 조성물이 활성화시키지 않는 것은 분명하다. 폐암 환자의 폐포 대식세포는 동일한 한자의 말초혈관 단핵세포 또는 양성 폐질환 환자의 폐포 대식세포에 비해 종양파괴 작용을 분화시키는데 있어서 상당히 저해를 받는 것으로 밝혀졌다(시지오니코우(Siziopikou) 등, 1991). 그러므로, 이 경우에 조성물이 황성을 가지고 있지 않은 것은 놀랄만한 일이 아니다.
[실시예 14]
본 발명의 조성물과 기타 대식세포 활성제에 대한 종양파괴 작용을 부인병 질환 환자의 말초혈관 단핵세포와 복막 대식세포를 대상으로 조사하였다. 보다 상세하게는, 환자 집단은 7명으로 구성되어 있는데, 이중 3명은 양성 질환 한자이고, 4명은 악성 질환 환자(2명은 난소암, 1명은 자궁내막암, 1명은 자궁경부암)이다. 수술 시에 환자로부터 시료를 분리하였다. 브라운 방법(브라운 등, Cancer Immunol. Immunother, 32 55-61, 1590)을 이용하여 혈관 시료로부터 말초혈관 단핵세포를 가지고 있는 시료를 준비하고, 브라운 방법(브라운 등, Cancer Research, 53:3362, 1993)을 이용하여 복막 대식세포를 가지고 있는 시료를 준비하였다. 본 발명의 조성물(배치 222의 1:10 희석액)과 감마-인터페론(100U/mℓ), 인터루킨-12(500U/mℓ), 단핵세포-CSF(5000/mℓ)와 같은 기타 활성제에 대한 종양 세포 세포독성은 브라운방법(브라운 등, Cancer Immunol. Immunother. 32:55-61, 1990)을 이용하여 분석하였다.
그 결과가 표 34에 나타나 있는데, 본 발명의 조성물이 악성 및 양성부인병 질환 환자의 말초혈관 단핵세포와 복막 대식세포 모두에 있어서 종양파괴 작용을 자극한다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 야기되는 종양 세포독성은 시험된 기타 생물학적 자극제에 의해 야기되는 세포독성 보다 높다.
[표 34]
[실시예 15]
암 환자의 말초혈관 단핵세포에서 본 발명의 조성물과 기타대식세포 활성제에 반응하여 종양파괴 작용을 일으키는데 있어서 프로스타글란딘 합성저해베인 인도메타신(indomethacin)이 어떠한 영향을 미치는 지에 대해서도 조사하였다. 실시예 14의 악성질환자로부터 얻은 시료를 실시예 14에 기재되어 있는 분석방법에 따라 이용하였는데, 단 인도메타신(5ng/mℓ까지)을 본 발명의 조성물, 인터루킨-12(500U/mℓ) 및 단핵세포-CSF(500U/mℓ)와 동시에 첨가하였다.
그 결과가 표 35에 나타나 있는데, 인도메타신은 IFNa, GM-CSF 및 M-CSF에 대하여 세포독성을 증가시킨다. 그러므로, IFNa, GM-CSF 및 M-CSF에 의한 종양파괴 작용의 전개는 인도메타신-민감성 작용에 의해 조절되었다. 반면, 포볼 에스테르(Phorbol Ester:PNA), IL-12 및 본 발명의 조성물에 의한 종양파괴 작용의 전개는 인도메타신 작용에 의해 조절되지 않았다. 즉, 인도메타신은 본 발명의 조성물, IL-12 및 PNA에 반응하여 세포독성을 증가시키지 않았다.
[표 35]
[실시예 16]
인도메타신 존재 하에서의 본 발명의 조성물에 반응하여 종양파괴작용을 전개하는데 있어서의 프로스타글란딘 E2의 영향에 대해 조사하였다. 실험 집단은 1명의 정상인과 8명의 환자(1명은 췌장암, 2명은 뇌 및 목의 종양, 1명은 자궁내막증, 4명은 HIV)로 구성하였다. 브라운 방법(브라운 등, Cancer Immunol. Immunother. 32:55-61, 1990)을 이용하여 환자의 혈액 시료로부터 말초혈관 단핵세포를 포함하고있는 시료를 분리하였다. PGE2(108M)의 존재 또는 부재 하에서 브라운방법(브라운 등, Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990)을 이용하여 본 발명의 조성물(배치 222의 1:10 희석액)과 인도메타신(5ng/mℓ까지)에 대한 종양세포 세포독성을 분석하였다.
표 36의 결과는 PGE2(108M)의 병리학적 수준은 본 발명의 조성물에 대하여 발생된 종양파괴 작용의 수준을 억제하지 못하였다는 것을 보여주고 있다. 이는, γ-인터페론에 의해 자극된 단핵세포에서 PGE2가 종양파괴 작용을 억제하는 것과는 대조적인 것이다(브라운 등, Cancer Research 53.3362, 1993).
[표 36]
[실시예 17]
본 발명의 조성물에 의해 자극을 받은 단핵세포에 있어서 자가 종양세포에 대한 종양파괴 작용의 전개에 대하여 조사하였다. 브라운 등의 방법(1990)을 이용하여 6명의 환자(3명은 난소암, 1명은 자궁내막암, 1명은 자궁경부암, 1명은 ENT암)의 혈액 시료로부터 말초혈관 단핵세포를 포함하고 있는 시료를 준비하였다. 창 간종양 세포대신 환자의 종양세포를 사용하는 것을 제외하고는 브라운 등의 방법(1990)에 따라, PGE(108M)의 존재 또는 부재 하에서, 본 발명의 조성물(배치 222의 1:10 희석액)과 인도메타신(50ng/mℓ까지)에 대한 종양세포 세포독성을 분석하였다. 환자의 종양세포를 콜라게나제와 DN아제로 처리하고, 단일세포 시료를 준비하여 브라운 등의 방법(1990)에 따라 세포에 표지를 하였다.
표 37에 나타난 결과는, 본 발명의 조성물이 환자 자신의 단핵세포를 활성화시켜 환자의 종양세포를 죽일 수 있다는 것을 보여주고 있다. 본 발명의 조성물은 적어도 현재 사용중인 표준화된 생물학적 활성제 정도의 효능을 가지고 있다.
[표 37]
실시예 14-17의 실험 결과들은 본 발명의 조성물이 단핵세포를 활성화시켜 종양파괴 작용을 일으키며, 그 효능은 적어도 현재 임상적으로 사용되고 있는 다른 활성제의 효능보다 높다; 본 발명의 조성물은 복막 대식세포를 가지고 있는 혈액에서 작용하며 환자의 주요 면역억제 유형의 하나인 프로스타글란딘 저해 효과를 받지 않는 것으로 보인다. 이러한 실험 결과들은 또한 악성 복막 질환 띤 부인병의 치료시 본 발명에 따른 조성물의 이용성을 뒷받침해 주고 있다.
[실시예 18]
[초기 독성 연구]
여러 가지 동물 종에 대하여 독성 연구를 실시하였다. 이들 연구들은 표 38에 요약되어 있다. 14일, 21일, 30일 및 그 후에 주사를 하고 작성된 임상관찰일지를 토대로 모든 동물을 분석하였다. 주사가 이루어지는 기간 동안 또는 그 후의 추적기간(개에 대해서 4개월을 추적한 것을 제외하고는 모두 1개월) 동안 악영향은 발견되지 않았다.
[표 38]
본 발명의 조성물을 한 번에 다량 근육 주사한 경우에 발생하는 효과를 알아보기 위한 독성 연구를 실시하였다. 13마리의 랫트에 대해서는 본 발명의 조성물 5mℓ/kg을 한 번에 근육내 주사하였다. 3마리의 랫트에 대해 7일 동안 관찰하였다. 10마리의 랫트에 대해서는 14일 동안 관찰한 다음 안락사시켜 부검하였다. 이들 두 그룹에서 독성의 징후는 발견되지 않았고 부검된 동물에게서 병리학적 징후들이 많이 발견되지 않았다. 이러한 관찰 결과를 토대로, 랫트에 있어서 본 발명의 조성물의 근육내 주사시 LD50은 5mℓ/kg 이상인 것으로 측정되었다. 표 39는 이러한 결과를 요약한 것이다.
[표 39]
[개에 있어서의 독성 연구]
온타리오 수의과대학에 의해 수행된 연구 과정에서, 본 발명의 조성물이 2마리의 잡종 개에게 투여되었다. 그 구체적인 방법은 표 40에 요약되어 있다. 각각의 경우에, 처음에는 우측 다리에 투여하고, 두 번째는 좌측 뒷다리에 투여하였다. 첫 번째 주사를 한 후 14일 동안 2마리의 개를 관찰하였다. 식욕, 운동성, 체온 박동수, 호흡수를 매일 2회 조사하였다. 통상적인 소변검사와 혈액검사 및 혈청검사를 실시하고, 첫 번째 주사 후 24, 72시 간, 7일, 14일째에 조사를 하였다. 이러한 주사와 관련한 통증의 징후가 모든 동물에게서 발견되지 않았다. 두 번째 주사와 관련해서도 과민중의 징후가 없었다. 약으로 인한 물리적 또는 실험적인 변수상의 이상이나 변화가 없었다. 건강한 개의 경우에는 약에 대해 충분한 내성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
[표 40]
[악성 종양을 가지고 있는 동물의 치료]
애완동물의 여러 가지 악성 종양의 치료를 위해 본 발명의 조성물을 수의과 병원에서 임상적으로 사용했다. 종래의 치료법에 대하여 별다른 반응을 보이지 않는 진전된 종양성 질환을 가지고 있는 11마리의 고양이와 10마리의 개에게 본 발명의 조성물을 매주 근육 주사하였다. 표 41에는 본 연구에서의 임상예가 개별적으로 요약되어 있다. 주사회수는 2-69회로 하고, 하나의 근육주사 위치에 대해 투여량을 7.5mℓ까지 조절하였다. 매주 주사하여 투여하는 방법을 이용함으로써 각각의 경우에 대해 개별적으로 정해진 진단 시험을 이용하여 개별적인 경우마다 면밀하게 조사하고 모니터링하였다. 그 결과, 임상요원들은 국부적인 자극과민성이나 과민반응을 포함하여 심한 알러지 반응이 없었다는 것을 알았다. 임상요원들과 동물의 소유주들은 전신성의 좋지 않은 반응을 발견하지 못했다. 또한, 식욕과 운동성이 개선되고 몇몇 동물에서는 체중이 많이 늘고 통증이나 불쾌감이 감소하는 등의 임상적인 개선사항 등이 약간 있는 것으로 발견되었다.
[표 41]
[표 41a]
[표 41b]
임상결과가 다음과 같이 요약된다:
6마리(3/10개와 3/11고양이)는 완전 반응을 하였다. 1마리(1/11 고양이)는 초기 메저(major) 타입의 부분 반응을 나타냈다. 11마리(5/10 개와 6/11 고양이)는 마이너(minor) 타입의 부분 반응을 나타냈다. 1마리(1/10 개)는 불변인 상태로 남았고 1마리(1/11 고양이)는 반응을 나타내지 않았다. 표 42는 각각의 치료에 대한 정의를 제공한다. 이러한 동물에서의 임상적 경험은 악성 종양을 치료하는데 있어서의 본 조성물의 이용가능성을 보여주고 있다.
[표 42]
병변부위의 출현.
[실시예 19]
[예비적 임상 실험]
불치성 종양을 가지고 있는 환자에 대해 실시예 1에 기재되어 있는 방법에 따라 제조된 조성물 0.11mℓ/kg을 사용하여 치료하였다. 3일-5일 간격으로 본 조성물을 근육 내 주사하였다. 치료된 58명의 환자 중에서, 심각한 독성을 나타내 보인 환자는 하나도 없었다. 37명의 평가 가능한 환자 중에서, 3명이 마이너한 반응 즉, 25-50%의 종양의 감소 현상을 보였고, 5명의 환자가 적어도 8주간 정도 불변성 질병상태를 보였다. 가장 흥미로운 결과는 가장 고무적인 결과인 것으로 보이는 췌장암환자에게서 나타났다. 7명의 환자 중, 1명은 만 11개월 동안 불변성질병 상태에 있었다. 암이 극도로 진전된 1명의 환자는 4개월 동안 불변성 질병 상태에 있었다. 이러한 결과를 토대로 하여, 본 발명의 기본적인 연구의 대상으로서 췌장암이 선택되었다. 본 연구의 목적은 이러한 부류의 환자에게 있어서 본 발명의 조성물의 안전성과 효능을 알아보고자 하는 것이다.
치료방법은 본 발명의 조성물을 0.11mℓ/kg, 한 번 주사시 최소 7.5mℓ 취하여 둔부에 근육내 주사하는 것으로 이루어졌다. 처음 1주 동안에는 1주일에 3회 주사하고, 그 후에는 질병이 진전될 때까지 1주일에 2회 주사하였다 모두 22명의 환자를 본 연구에 참여시켜 독성 연구를 실시하였다. 효능시험에 대해서는 17명만 대상으로 하였다. 모두 570회 주사하여도 국부적 또는 전신성 독성이 관찰되지 않았다. 또한 외적인 반응도 없었다. 그러나, 6명의 환자는 3개월 또는 그 이상 동안 불변성질병 상태에 있었지만, 나머지 완자들은 3개월 이내에 질병의 진전현상이 관찰되었다. 생존수명 중간값(median survival)은 진단 시로부터 8개월이었다. 첫 번째 주사시점으로부터는 생존수명 중간값이 4개월이었다. 6개월 이상 불변성 질병 상태를 보인 환자는 3명이었다. 환자 1명은 75세의 남자인데, 18개월 후 간으로 전이되면서 재발하였다. 이 환자는 병이 더 진전되기 전 8개월 동안 불변성 질병 상태에 있었다. 수술로서 절제 불가능한 질병을 가지고 있는 71세의 여성 환자 1명은 적어도 10개월 동안 불변성 질병 상태로 있었고 하루종일 일을 계속하였다. 치료 4개월 후 국부적으로 병이 재발된 64세의 여성 환자는 적어도 8개월 동안 불변성 질병 상태로 있었다.
수술 불가능한 췌장암 환자로서 조직을 얻을 수 없어서 본 연구에 참여할 수 없었던 환자의 경우에는, 본 조성물을 과량으로 투여해도 암이 진전되었지만, 거의 1년 동안은 불변성 질병 상태로 있었다. 즉, 본 발명의 조성물은 이러한 투여량으로는 췌장암에 대하여 독성현상을 일으키지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물을 사용하여 이러한 질병을 치료하는 경우에 있어서, 몇몇 경우에는 일시적인 항증식 효과가 나타나기도 한다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 20]
[췌장암에 대한 임상 연구]
본 조성물을 이용한 2단계 실험이 측정가능하며 생검(biopsy)에 의해 입증 가능한 췌장암을 가지고 있는 환자에 대해 이루어졌다. 조성물의 투여방식은 처음 1주일 동안은 1주에 3회 7.5mℓ(0.11mℓ/kg)근육주사하고 그 다음에는 질병이 진전될 때까지 1주일에 2회 주사하는 것이었다. 본 연구의 상세한 사항은 다음과 같다.
[방법]
한 번의 근육주사시 실시예 1에서 제조된 조성물 0.11mℓ/kg(최소투여량 7.5mℓ)을 둔부에 주사하고, 매번 좌측과 우측 둔부로 교대하면서 주사하였다. 처음 1주일 동안은 3회 주사하고 질병이 진전될 때까지 1주일에 2회 주사하였다. 표준 범주에 따라 정의되는 바에 의해 반응을 정의하였다(밀러 등, Cancer 1981; 47:207-214). 완전 반응(CR)은 적어도 4주일 동안 질병의 모든 징후가 완전히 사라지는 것으로서 정의하였다. 부분 반응(PR)은 적어도 4주일 동안 새로운 병변부위가 없거나 또는 질병의 어떠한 진전도 발견됨이 없이 가장 커다란 측정 가능한 병변부위의 두 개의 가장 큰 수직 직경을 갖는 생성물이 50%이상 감소하는 것으로서 정의하였다. 진전성 질병은 하나 또는 그 이상의 측정 가능한 병변부위의 크기가 25%이상 증가하거나 또는 새로운 병변부위가 출현하는 것으로서 정의하였다. 반응 또는 진전성 질병에 대한 범주에 맞지 않는 질병은 불변성 질병으로서 정의하였다.
[결과]
22명의 환자가 본 연구에 참여하였으나, 5명의 환자에 대해서는 효능시험을 실시할 수 없었다. 완전 또는 부분 반응이 관찰되치 않았다. 3명의 환자는 1개월 이내에 질병의 진전현상을 보였다. 6명의 환자는 3개월 이상 동안 불변성 질병 상태를 나타내었다(3.5, 3.5, 5, 8, 12+, 14+). 전체 그룹에 대한 생존율 중간값은 진단시로부터 8개월, 치료시작시점으로부터 5개월이었다. 생검 결과간으로 전이되었고 CEA가 37ng/mℓ(정상은 <3ng/mℓ)인 환자 1명은 간전이와 CEA에 대해 8개월 동안 절대적인 불변성을 나타내었다. 1명은 5개월 동안 불변성 질병 상태를 나타내었다. 1명의 환자의 경우에는, 위플(Whipple) 치료 시작 후 4개월 경과되었을 때 췌장에 병이 재발하였고, CEA가 천천히 증가하는 것을 제외하고는 적어도 1년 동안 본 조성물에 대해 불변성을 유지하였다. 세 번째 환자에 대해서는 피부를 통해 스텐트(stunt)를 삽입하였고, 이 경우 이 환자는 종양이 더 진전되는 징후 없이 적어도 14개월 동안 하루종일 작업을 계속하였다.
22명의 환자 모두에 대해 독성 실험을 하였는데, 500회 이상 주사를 실시하였다. 약과 관련한 독성에 대한 징후는 임상적으로든 실험적으로든 발견되지 않았다. 일반적으로 질병의 활성도와 마찬가지인 삶의 질을 해치는 효과는 발견되지 않았다. 전체 백혈구의 수, 혈청의 면역글로블린 상의 절대적인 림프구세포의 수에도 심각한 변화가 없었다.
진단시와 치료시작시점으로부터의 생존 기간을 나타내는 생존곡선이 제13도와 14도에 각각 도시되어 있다. 비교를 위해, 굿존슨(Gudjonsson, 1987)의 역사적인 생존 곡선을 제13도에 포개 놓아 보았다. 또 다른 예의 비교가 되는 역사적인 생존 곡선도 발견될 수 있다(Bakkevold, Petterson, Arnesjo 및 Espenhaug 1990).
생존율 분석에 대한 결과가 표 43에 요약되어 있다. 진단시로부터의 평균 생존기간(mean survival time)은 281일이었다(제13도). 생존기간 중간값은 182일(약 5개월)이었다. 굿존슨(Gudjonsson, 1987)의 역사적인 생존 곡선에 의하면, 그의 수술 환자 188명이 평균 208일 생존하였고, 생존기 간 중간값은 120일이었다. 치료시점으로부터의 평균생존밀수는 166일이었다(제14도). 생존기간 중간값은 133일(약 4개월 1주일)이었다.
[표 43]
적어도 13회 개별적으로 투여를 받은 평가 가능한 환자의 소그룹에 대해 생존율을 측정하였다. 22명의 환자 중 14명이 평가 가능하였다. 이들 환자 중에서(표 43 참조), 진단시로부터의 생존기간 중간값은 219일(약 7개월 1주)이었다. 치료시점으로부터의 생존기간 중간값은 146일(약 5개월)이었다.
[실시예 21]
[악성 흑색종양에 대한 임상 실험]
말기 악성 흑색종은 Ⅲ기 또는 Ⅳ기 환자 모두를 포함하며, 예비치료 후 일어나는 국부전이적 또는 원거리성 재발을 포함하는 것으로 정의되었다. 기타 모든 치료방법을 판단하는 표준 치료방법은 DTIC(dacarbazine)을 이용하는 것인데, 이것은 반응율이 약 15%인 것으로 보도되었다. 중간 반응기간은 3-6개월이고 심한 메스꺼움과 구토를 동반하며, 간정맥의 혈전증에 의한 급성 간괴사에 의해 치사에 이르게되는 부작용의 가능성도 있다. 이러한 치료방법은 생존율상의 개선점을 결정적으로 보여주지 못하고 있다.
본 연구는 본 발명의 조성물을 말기의 악성 흑색종 환자에게 이용하는 경우에 그 안전성과 효능을 알아보고, 생존율과 삶의 질에 미치는 그것의 영향을 알아보기 위한 것이다. 본 연구는 비교 대상이 없이 복수회 실시하는 방식으로 진행하였다.
본 발명의 조성물을, 처음에는 1주에 3회 7.5mℓ씩 근육주사 방식으로 투여하였다. 기관이나 골수에 대한 독성이 없는 것을 확인한 후, 매일 주사하는 방식으로 주입량을 증가시켜 15일 동안 주입한 다음 다시 1주일에 3회 주사하였다.
이어서, 주입량을 증가시켜 30일까지 주입하였다. 치료기간을 36주로 한 다음 16주로 줄이고, 그 다음에는 계속 치료할 것인지에 대해 선택하였다.
본 연구에는 17-85세 사이의 말기 흑색종 환자 33명(여자 17명, 남자 16명)이 참여시켰다. 64%는 이전에 치료 경험이 있는 환자였고, 36%는 치료 경험이 없는 환자였다. 본 연구에 참여한 33명의 환자 중25명에 대해 평가할 수 있었다. 카르노프스키 행동상태(Karnofsky Performance Status)(기저선)는 40-100% 범위에 있으며, 그 중간값은 80%로 하였다. 11명의 환자가 본 연구가 종료될 때까지도 생존하였으며, 5명의 환자는 치료상태에 있었다.
마이너 타입의 부분 반응이 33명 중 16명(16/33)에게서 발견되었다(48%). 환자 1명은 폐가 33% 감소하였고, 6명의 환자는 통증이 감소하고 8명의 환자는 1개월 이상 동안 1000g 이상(1000-2600g) 체중이 중가하였다. 또한, 불변성 질병 상태도 19/33 환자에게서 발견되었다(58%)(60-170일, 중앙값 77일).
제15도-17도는 본 발명의 조성물로 치료받은 환자의 생존율을 역사적인 대조군과 비교한 그래프로서, 전이/재발의 진단시로부터의 생존율을 일(day) 단위로서 보여주고 있다. 실선은 본 발명의 조성물로 치료 받은 환자에 대한 생존 곡선을 나타내고, 파선은 역사적인 생존곡선(Balch, C. M. 등, Cutaneous melanoma, 2판, 1992, 14, 19 챕터, pp.165-187, pp.495-508, Lippincott Co., 필라델피아, 펜실베니아)을 나타낸다. 본 발명의 조성물로 치료받은, 1 내지 3개 이상의 종양부위를 가지고 있는 환자들 모두에 대한 생존 곡선이 제15도에 도시되어있다. 2개의 종양 부위를 가지고 있는 환자 및 3개 또는 그 이상의 종양부위를 가지고 있는 환자들에 대한 생존 곡선은 제16도와 17도에 각각 도시되어 있다.
본 발명의 조성물로 치료받은 모든 환자들은 1년 생존율이 39%였다(카플란-마이어(Kaplan-meier) 평가법). 모든 말기 악성 흑색종(advanced malignant melanoma:AMM) 환자가 1년간 생존하는 비율은 역사적인 대조군(종양 부위의 수에 상응함)의 경우 약 11%이다. 역사적인 생존기간의 중간값이 89일인데 반해, 본 발명의 경우에는 생존기간 중간값이 315일이다.
종양 부위가 2개인 경우, 1년간 생존율은 본 발명의 조성물로 치료받은 경우에는 49%인데 반해, 역사적 인 대조군의 경우에는 13%이다. 이 그룹은 생존기간 중간값이 360일인데 반해, 역사적인 대조군의 경우에는 120일이다. 종양부위가 3개 또는 그 이상인 경우, 1년간 생존율은 본 발명의 조성물로 치료받은 경우에는 31%인데 반해, 역사적인 대조군의 경우에는 0%이다. 이 그룹은 생존기간 중간값이 205일인데 반해, 역사적인 대조군의 경우에는 60일이다.
체중의 증가, 행동양상(카르노프스키), 삶의 질 지수(스피쳐(Spitzer)) 및 통증의 크기(유사 직선형(Linear Analogue))에 의해 삶의 질을 평가하였다. 시간의 경과에 따른 체중의 증가는 표 39에 나타나 있다.
[표 44]
카르노프스키와 스피쳐 크기는 둘 다 주관적이고 각각의 개별적인 경우에 거의 일치하는 것으로 밝혀졌다. 15명의 환자는 이들 변수상변화가 없는 것으로 나타났다. 4명의 환자는 변동되는 양상을 나타냈는데, 후기에는 원래의 수준으로 복귀하였다. 1명의 환자는 감소현상(40-20%)을 나타내었다.
통증에 대한 평가 결과는 6명의 환자의 경우 1주일만에 통중의 등급이 “5”(최악)에서 “2”(중간) 또는 “0”(통증 없음)으로 떨어진 것을 보여주었다. 1명의 환자는 통증의 등급이 “3”에서 “0”으로 떨어졌다. 간으로의 전이현상을 보인 1명의 환자는 통증이 “0”으로 떨어져서 11개월 동안 불변성 상태를 유지하였다. 본 연구에 참여한 환자 중 통증의 등급이 “0”이었던 9명의 환자는 그 수준을 계속 유지하였다. 5명의 환자의 경우에는 통증 등급이 약간 증가(2 유니트)하였다. 3명의 환자와 경우에는 제2월 또는 제3월 기간 중에 통증의 등급이 일시적으로 증가(1-2 유니트)하였다.
33명의 환자에 대잔 1734회의 주사 중, 21명의 환자는 약에 대한 좋지 않은 반응을 나타내지 않았다. 12명의 환자에게서 약에 대한 좋지 않은 반응이 나타났다. 이러한 좋지 않은 반응은 통상 4주 또는 8주에 일어나고, 그 정도는 증간이거나 일시적이며, 가장 빈번한 것은 미열이었다.
역사적인 대조군과 본 발명의 조성물로 치료받은 실험군 사이의 생존율 차이는 본 발명의 조성물로 치료받은 환자의 경우가 생존율면에서 유리하다는 것을 암시하고 있다. 암은 19명의 환자에게서 불변성인 것으로 나타났다. AHM에 대해 치료받은 환자는 모두 생존율실험 데이터에 포함되었다. 또한, 이전에 치료 경험이 있는 환자 21명도 예후 때문에 많은 임상실험에서 치료 경험이 없는 환자를 필요로 함). 종양의 부담이 높았다(82%가 하나 이상의 전이 부위를 가지고 있었다).
생존과 삶의 질에 대한 데이터는 대부분의 환자가 치료로 인해 약간의 득을 얻었다는 것을 보여준다. 연구 기간이 종료될 때까지 11명의 환자가 여전히 생존하였고, 11명 중의 5명이 계속 치료를 받았다.
[실시예 22]
[병리학적 프로토콜: 악성 흑색종]
다음은 경구개 잇몸(hard palate and gum)에 진전성 악성 흑색종을 가지고 있는 73세 여성에 대한 보고서이다. 제25도는 현미경에 의해 관찰되는 악성 흑색종에 대한 사진이다. 제25(a)도에서 상부에서 하부로 관찰할 때, 케라틴을 수반하는 상피층과, 그 하부에 악성 세포가 보다 분명하게 나타나기 시작하는 것을 볼 수 있다. 이러한 흑색종 세포는 원형 또는 타원형으로 보일 수 있으며, 에오신 친화성 세포질이 풍부하고 다형태적 다염색성 핵을 가지고 있다. 이러한 세포들은 정상적인 점막하조직을 채우게된다. 혈관은 정상으로 보이며, 백혈구(다형태성단핵성 세포)로 상징되는 어떠한 종류의 염증성/면역 반응도 결핍되어있다. 이것은 번성하고 있는 종양 즉, 종양의 구조가 완전한 상태로 있는 한 예이다.
제25(b)도는 2달간 본 발명의 조성물로 치료한 동일한 환자의 종양조직 시료를 나타낸다. 상부에서 하부로 살펴보면, 상피의 연속성이 괴사 과정에 의해 파괴된 것을 볼 수 있다. 이러한 괴사는 임계 크기에 도달한 모든 종양의 중앙에서는 공통적이지만 주변부위, 특히 악성흑색종에서는 거의 발견되지 않으며, 숙주의 면역 반응이 종양에 대하여 공격을 준비하는 표시이기도 하다. 사진 전체를 통해 원래의 종양세포와는 다른 수많은 세포가 존재하고 있는 것을 볼 수 있다. 이들은 면역세포들이다 - 호중구(neutrophil), 림프구세포, 대식세포-이들은 전형적인 종양 구조의 파괴를 유도한다. 혈관벽에는 많은 수의 숙주 면역세포가 빽빽하게 침윤해 있다(화살표). 이러한 세포의 침윤은 혈관의 파괴를 야기하며, 이는 다시 종양으로의 영양분과 산소 공급을 막게 된다(국소빈혈에 의한 괴사). 이 환자의 조직 슬라이드에서 관찰되고 있는 종양의 파괴에 기여하는 면역반응은 TNF(봉양괴사인자)에 의해 일어나는 것으로 알려진 변화와 일치하며, 전술한 실시예에 기재된 실험의 결과와도 일치하는 것이다.
본 발명의 조성물을 이용한 후 치료에서 나타나는 면역반응은(제25(b)도) 생체에서의 항종양 TNF 효과가 공지되어 있는 조성물에 의한 시험관 내에서의 TNF 면역 조절작용과 크게 연관되어 있다.
전술한 바로부터 , 예시를 위해 비록 본 발명의 특정 실시예에 대해 기재하였다 하더라도 본 발명의 정신과 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 변형들이 이루어질 수 있다는 것에 대해 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 것 외에는 제한되지 않는다.
[실시예 23]
[활성 분획들의 분리]
배쓰(bath)의 온도가 40℃를 넘지 않게 하면서 조성물 시료 300mℓ을 로토뱁(rotovap)을 이용하여 증발 건조시켰다. 증발 과정동안 용액이 염기성으로 유지되도록 하기 위하여, 진한 수산화암모늄 용액 5방울을 증발이 종료될 때까지 30분 간격으로 첨가하였다. 결과 형성된 잔류물은 11.6g이었다.
진한 수산화암모늄 메탄올 용액(10%) 20mℓ을 상기 잔류물 2g에 첨가하였다. 불용성 물질을 여과하여 제거하고 여과액에 대해 칼럼(101.93g의 60Å 플래시 실리카겔이 충진되어 있고 크기가 5cmx12.5cm임)을 이용하여 크로마토그라피를 실시하였다. 이용된 용매시스템은 진한 수산화암모늄 메탄올 용액(10%)이었다. 칼럼에 10psi의 압력을 걸고 유속을 11mℓ/min로 하였다. 100mℓ의 용매를 칼럼에 통과시킨 후, 20mℓ 분획 12개를 수집하였다. 이들 분획들은 칼럼에서 빠르게 이동하여 용출되는 회색 밴드를 나타낸다는 점에서 공통점이 있다.
이들 분획들에 대해 실리카겔 플레이트와 10% 진한 수산화암모늄 메탄올 용액을 이용하여 박층 크로마토그라피(TLC)를 실시한 다음, 닌히드린을 이용하여 발색시켰다. 유사한 TLC 프로파일을 가지고 있는 분획들을 다음과 같은 조합으로 결합시켜 로토뱁을 이용하여 건조시켰다.
분획 5-6, 7-8 및 9-10은 Rf값 0.81에서 닌히드린에 대해 양성반응을 나타낸다.
[실시예 24]
실시예 23의 분획 5-6 및 9-10을 대상으로 항증식 효과(실시예 4의 방법에 따름)와 TNF 자극성(실시예 9에 따름)에 대해 시험관내 시험을 실시하였다. 그 결과는 다음과 같다:
그러므로, 분획 5-6은 항증식 효과가 크고, 분획 9-10은 활성이 극히 높은 TNF 자극제이지만 항증식 효과는 보통이었다.
[실시예 25]
분획 5-6 시료에 대해서, 분획에 존재할 가능성이 있는 특정화합물을 확인하기 위해 전자 충격 질량 분석(Electron Impact Mass Spectroscopy:EI MS)과 전자분무 질량 분석(Electrspray Mass Spectroscopy)을 실시하였다. 전자분무 MS는 용질로서 5% 아세트산수용액과 퍼킨-엘머 사이엑스(Pertain-Elmer Sciex) API-III를 이용하여 이루어졌다. 몇몇 예에서는, 용해를 돕기 위해 메탄올이 첨가되었다. 직접 삽입 프로우브를 이용한 EI MS는 매트릭스로서 글리세롤을 이용하여 VG 분석 모델(Analytical model) ZAB-SE 스펙트로미터에서 이루어졌고, DCI 프로우브를 이용한 경우에는 크라토스 분석 프로파일(Kratos Analytical Profile) 질량분석기에서 이루어졌다.
그 결과 얻은 스펙트럼은 분획 5-6에 다음과 같은 화합물이 존재할 수 있음을 나타내었다:포스포콜린, 토로콜린산, 콜린-스테아린산 디글리세라이드, 스테아린산, 스테아린산 디글리세라이드, 팔미틴산-스테아린산 디글리세라이드 및 스핑고신-올레산 콘쥬게이트.
[실시예 26]
100mℓ의 조성물에 대해 pH가 3이 되도록 4mℓ의 1N HCl 용액으로 산성화시켰다. 이 조성물을 HPLC급 디클로로메탄 100mℓ로 추출하는 과정을 3회 실시하였다. 디클로로메탄 분획을 모아서 소량의 무수황산나트륨을 이용하여 건조시켰다. 페이퍼를 이용하여 디클로로메탄용액을 여과하여 둥근 바닥 플라스크에 모은 다음 로토뱁을 이용하여 증발 건조시켜 0.0049g의 갈색 필름을 얻었다.
이 필름 0.0017g을 pH7의 NH3·H2O 용액(214ppm)에 용해한 다음, 실시예 4에 기재된 바와 같이 항증식 활성에 대하여 조사하였다. 그 결과, 이 용액은 항증식 활성이 14U/mg 정도로 높았다.
[실시예 27]
다음과 같이 보다 확대된 규모로 실시예 23을 반복 실시하였다. 10mℓ의 진한 수산화나트륨 용액을 900mℓ의 조성물에 첨가한 다음 얻어진 용액을 배쓰의 온도가 40℃를 넘지 않는 로토뱁을 이용하여 증발 건조시켰다. 증발과정 동안 용액이 염기성으로 유지되도록 하기 위하여, 증발과정이 종료되어 잔류물이 생성될 때까지 진한 수산화암모늄 용액 5방울을 30분 간격으로 조성물에 첨가하였다.
상기 잔류물에 150mℓ의 10% 진한 수산화암모늄 메탄을 용액을 첨가하였다. 이 용액에 대해 15분간 초음파 처리한 다음 불용성 물질을 여과하여 제거하였다. 여과액에 대해서는 크기가 30cmx12cm이고 1695g의 60Å 플래시 실리카겔이 충진되어 있는 칼럼을 이용하여 크로마토그라피를 실시하였다. 사용된 용매 시스템은 10% 진한수산화암모늄 메탄을 용액이었다. 칼럼에 6p.s.i.의 압력을 걸어주고 유속을 30mℓ/min로 하였다. 그 결과가 하기 표에 요약되어 있다.
10% 진한 수산화암모늄 용액을 이용하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC를 실시한 다음 닌히드린을 분무하여 발색시켰다. 유사한 TLC 프로파일을 가지고 있는 분획을 다음과 같은 조합으로 수집한 다음 로토뱁을 이용하여 건조시켰다.
분획 조합 15-16 내지 31-34는 모두 Rf값 0.87에서 닌히드린에 대한 양성 반응을 나타내었는데. 이러한 Rf값은 실시예 23의 활성 분획에 대한 Rf값과 매우 유사한 것이었다. 분획 24-30 및 31-34는 Rf값 0.85에서 닌히드린에 대해 추가적인 양성 반응을 나타내었다.
[실시예 28]
분획 4-5 및 15-16을 대상으로 항증식 효과(실시예 4의 방법에 따름)와 TNF 자극성(실시예 9에 따름)에 대해 시험관내 시험을 실시하였다. 그 결과는 다음과 같다:
즉, 분획 4-5, 15-16 및 17-18은 항증식 효과를 나타냈지만 TNF자극성은 나타내지 않았다. 상기 분획들에 대한 원소 분석결과, TNF생산을 저해하는 NH4Cl의 함량이 높은 것으로 나타났다.
[실시예 29]
분획 15-16, 24-30 시료를 투석한 다음, 실시예 25에 기재되어 있는 방법에 따라 질량분석기를 이용한 분석실험을 실시하였다. 분획 17-18및 24-30의 비투석 시료에 대해서도 역시 분석을 실시하였다. 그 결과 얻은 스펙트럼에서는 다음과 같은 화합물이 존재할 수 있는 것으로 나타났다:글리콜산, 트리헥소사민 트라이머 및 토로콜린산(분획15-16); 스테아린산 및 헥소사민 트라이머; 및 글리코콜인산(분획24-30).
[실시예 30]
별도의 투석 튜브를 이용하여 조성물을 다음과 같이 투석하였다:
100mℓ의 조성물을 분자량 차단치가 100인 스펙트라/포어(Spectra/por) 멤브레인 튜브 안에 넣었다. 튜브의 말단을 클립으로 봉한 다음 튜브를 10리터의 증류수가 들어 있는 교반 수조에 넣어주었다. 투석 튜브로부터 매일 용액 1mℓ씩 취하여 여기에 1/10N 질산은용액 3-4반울을 첨가하였다. 클로라이드의 존재는 투석이 완전치 못함을 나타내는 것이었다. 투석이 완전치 않으면 수조의 증류수를 교체하여 주었다. 약 3-4일 후 투석이 완료되었다. 투석이 완료된 후, 로토뱁을 이용하여 투석물을 건조시켜 원래 부피 1mℓ당 평균 0.3mg의 고체를 얻었다.
상기 고체 물질 시료를 HPLC급 물에 용해하여, 이 용액에 대해 10%진한 수산화암모늄 메탄올 용액을 이용하여 실리카겔 플레이트 상에서TLC를 실시한 다음 닌히드린을 분무하여 발색시켰다. Rf값 0.83에서 닌히드린에 대한 양성 반응이 관찰되었다.
[실시예 31]
실시예 30에서 얻은 고체 물질 시료에 대해서도 실시예 25에 기재되어 있는 방법에 따라 질량분석기를 이용한 실험을 실시하였다. 그 결과 얻은 스펙트럼에서는 다음과 같은 화합물이 존재할 수 있는 것으로 나타났다:스핑고신-올레산 콘쥬게이트, 디아세틸 시알린산, 퓨코오스-헥소사민 다이머, 데옥시클리코콜린산, 토로콜린산, 시알린산-퓨코오스 다이머 및 디(퓨코오스)헥소사민 트라이머.
[실시예 32]
상기 실험 결과들은 본 조성물의 활성 성분(적어도 TNFα 분비 분석실험에 따름)은, C18 μ본다팍(μBondapack)칼럼을 이용한 역상 HPLC후 비결합 분획(사용적:void volume)에 존재한다는 것을 보여주었다. 또한, C18 μ본다팍 칼럼에 주입된 조성물 추출액 중 대부분(70%)이 사용적에서 용출되었다. 이러한 결과는, 본 조성물의 활성 성분들이 매우 유사하고 극성이거나 심지어는 이온성 분자라는 것을 나타내었다.
상기 결과들을 보다 면밀히 조사하기 위하여, 이온-교환 크로마토그라피 방법을 이용하여 상기 활성 성분들에 대한 정제실험을 실시하였다. 존재하는 것이 있다면, 그것은 음이온성 활성 성분(정상세포가 아닌 종양 세포에 대한 항증식 효과 및 TNFα 분비 유도 활성에 대한 분석실험에 의함)이며, 음이온 교환 수지에 결합될 것이다.
[실험 방법]
10mℓ의 전체 비룰리진 추출물을 음이온-교환 크로마토그라피 칼럼(바이오-라드 AG-1, 하이드록사이드 형태, 전체 수지 습윤 부피는 10mℓ(칼럼 크기는 1.5cmx6.0cm), 밀리포어(Millipore) 탈이온수로 평형화함)에 주입하였다. 사용된 수지의 부피는 추출물에 존재하는 모든 음이온을 결합시키기에 충분한 양으로 계산된 것이었다. 수지에 대한 결합을 최대화시키기 위해 비결합 분획을 수집하여 칼럼에 다시 주입하였다. 이렇게 2회 통과시에 얻은 비결합 분획을 수집하여 보관하였다. 칼럼의 사용적에 잔류하는 비결합 물질 모두를 탈이온수로 세척(2×20mℓ)해 냄으로써 제거하였다. 결합된 분자에 대해서는 다음과 같이 중탄산암모늄(NH4NCO3)을 단계적으로 농도 경사지도록 하여 용출시켰다.(20mℓ/1단계)
[실시예 33]
실시예 32의 모든 분획의 시료들에 대해 각각 실시예 4와 9에 기재되어 있는 방법에 따라 항증식 효과와 TNF 자극 활성에 대하여 분석하였다.
그 결과는 다음과 같다:
상기 활성 시험의 결과는 TNF 생산 자극성이 0.6M, 1.0M, 1.5M 분획에서 발견된다는 것을 보여주고 있다. 항증식 활성은 0.4M 분획(미약한 활성)과 0.5M분획(주 활성 분획)에서 발견되었다.
[실시예 34]
활성 분획들에 대해 박층 크로마토그라피를 실시한 결과 여러 가지 성분의 혼합물이 나타났다. 실시예 32의 1.0M 분획 시료에 대해 실시예 25에 기재되어 있는 방법에 따라 질량분석기를 이용하여 분석실험을 실시하였다. 그 결과 얻은 스펙트럼은 다음과 같은 화합물이 존재할 수 있다는 것을 보여주었다:시알린산-글리세롤 다이머, 콜레스테롤 설페이트 및 토로콜린산.
[실시예 35]
(1) 페노메넥스 WP60009-C18 칼럼(250×4.6mm)을 이용하는 것과, (2) 시료를 동결 건조시킨 다음 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)수용액에 용해시키는 것과, (3) 상기 용액 150㎕를 칼럼에 주입하는 것을 제외하고는 실시예 2에 기재되어 있는 방법에 따라 본 조성물 시료에 대해 역상 HPLC를 실시하였다.
상기 용액을 칼럼에 주입한 다음 약 2.4-3.4분 경과 후 용출되는 분획을 포함하여 여러 가지 분획의 용출액을 수집하였다.
[실시예 36]
실시예 35에서 약 2.4-3.4분 시점에서 용출되는 분획의 시료에 대해 실시예 9에 기재되어 있는 방법에 따라 TNF 자극 활성 시험을 3회 반복 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
실시예 35에서 약 2.4-3.4분 시점에서 용출되는 분획의 시료에 대해 다음과 같이 직렬로 역상(C18) HPLC를 실시하였다. 실시예 35의 칼럼과 직렬로 페노멕스 프라임-스페어(Phenomenex prime-sphere) HC-C18 칼럼(250X4.6mm)을 사용하였다. 시료를 동결 건조하여 0.1% TFA 수용액(완충용액A)에 용해한 다음 이 용액 150㎕를 칼럼에 주입하였다. 완충용액A를 20분 동안 흘려준 다음, 0.1% TFA 아세토니트릴 용액(완충용액B)를 35분 동안 0-80%로 직선형으로 농도 경사지도록 흘려주었다. 그 다음에는 완충용액B를 5분 동안 80-0%의 농도경사로 흘려주었다. 유속은 0.9mℓ/min로 하였다. 주입시점으로부터 대략 다음과 같은 시점에서 6개의 용출 분획을 수집하였다.
[실시예 38]
분획 1(“1”)의 시료와 분획 2(“2”)의 시료를 동결 건조시켜 214ppm NH3·H2O에 용해하였다. 이 용액 시료에 대해 실시예 4에 기재되어 있는 방법에 따라 항증식 활성을 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다:
실시예 37의 6개의 분획 각각의 시료에 대해 실시예 25에 기재되어 있는 방법에 따라 질량분석기를 이용하여 분석실험을 실시하였다. 실험결과 다음과 같은 화합물이 존재할 가능성이 있는 것으로 나타났다:토로콜린산, 시알린산-글리세롤 다이머, NaCl, 트리메틸아민, 메틸에틸아민 및 프로필아민.
[실시예 41]
실시예 4에 기재되어 있는 방법에 따라 다음과 같은 3개의 시료에 대해 항증식 활성을 측정하였다:(1) 2mℓ의 물에 토로콜린산 10-11mg 용해한 용액; (2) 214ppm NH3·H2O; (3) 4mℓ의 214ppm NH3·H2O에 토로콜린산 0.7mg을 용해한 용액.
시료 (1)과 (2)에서는 항증식 활성이 전혀 검출되지 않았다. 그러나, 시료 (3)은 14유니트/mg의 항증식 활성을 가지고 있었다.
이러한 결과는, 토로콜린산과 같은 담즙산이 암모늄 이온과 결합하여, 상기 성분이 개별적으로는 활성을 보이지 않는 농도미만에서도, 항증식 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다. 따라서, 이들 두 성분이 조합되면 항증식 활성에 상승적인 영향을 미치는 것이 분명하다.

Claims (33)

  1. 3000 달톤 미만의 작은 분자량을 가지고 있는 성분을 포함하고 있으며, 다음과 같은 성질을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물: a) 동물의 담즙으로부터 추출됨; b) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극할 수 있음; c) 종양괴사인자의 생산을 조절할 수 있음; d) IL-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 또는 IFN-γ를 측정불가능한 수준으로 포함하고 있음; e) 사람의 말초혈관 단핵세포에 대해 세포독성을 가지고 있지 않음; f) 내독소가 아님.
  2. 제1항에 있어서, 소의 담즙으로부터 추출된 것이며, 사람의 말초혈관 단핵세포로부터 종양괴사인자의 분비를 자극하는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  3. (a) 동물의 담즙을 동일량의 알콜과 혼합하여 담즙/알콜 용액을 제조하는 단계; (b) 알콜 용해성 부분을 상기 용액으로부터 분리하여, 알콜이 실질적으로 포함되지 않은 용액을 분리하는 단계; (c) 상기 용액으로부터 담즙 색소를 제거하여 무색의 액체를 얻는 단계; (d) 상기 무색 액체를 처리하여 잔류하는 알콜을 실질적으로 제거하는 단계; (e) 상기 무색 액체를 에테르로 추출한 다음 수상을 분리하는 단계; 및 (f) 상기 수상으로부터 잔류하는 에테르를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항의 조성물의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (e) 단계에 앞서서, 상기 무색의 액체를 담즙/알콜 용애 부피의 약 1/8로 농축하고, 상기 (f) 단계 이후에, 상기 수상을 상기 담즙/에탄올 용액 부피의 1/10로 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 면역반응의 조절을 필요로하는 질병 및 상태의 예방 및 치료에 이용되는 약학적 조성물에 있어서, 제1항에 따른 조성물과 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 전달체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 면역반응의 자극을 필요로하는 질병 및 상태의 예방 및 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제7항에 있어서, 전염성 질병 및 종양 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. (a) 동물의 담즙을 수용성 용매와 혼합하여 담즙/용매 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 담즙/용매 용액으로부터 용매가 실질적으로 포함되지 않은 수용액을 분리하는 단계; (c) 상기 용매가 실질적으로 제거된 용액으로부터 담즙 색소를 제거하여 무색의 액체를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역조절제 조성물의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수용성 용매가 알콜인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 동물로부터 추출된 상기 담즙의 동일량의 알콜과 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 무색의 액체를 상기 담즙/용매 용액의 원래 부피의 약 8/1로 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 무색의 액체를 상기 담즙/용매 용액의 원래 부피의 약 1/10로 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 약 3000 달톤 미만의 분자량을 가진 적어도 하나의 성분을 포함하고 있고 사람의 말초혈관 단핵세포에 대해 세포독성을 나타내지 않으며, (a) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음; (b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있음; 중 적어도 한 가지 성질을 가지고 있는 면역조절제 조성물에 있어서, 상기 성분이 내독소, IL-1α, IL-1β, TNF, IL_6, IL-8, Il-4, GM-CSF 또는 IFN-γ가 아닌 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 동물의 담즙으로부터 추출된 것임을 특징으로 하는 면멱조절제 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물이 소의 담즙으로부터 추출된 것임을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 시험관내 또는 생체내에서 IL-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 및 IFN-γ의 부재하에서 종양괴사인자의 생산을 자극하는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조성물이 사람에게서 종양괴사인자의 생산을 자극하는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 상기 조성물을 건조시켜 고체로 만들어 상기 고체 2g을 20㎖의 10%의 진한 수산화암모늄 메탄올 용액에 용해한 다음, 불용성 물질을 모두 제거하고 60Å의 플래시 실리카 겔 102g이 충진되어 있는 5cm×12.5cm 크기의 메탄올 칼럼, 10파운드/inch2의 압력과 1㎖/min의 유속, 진한 (10%) 수산화암모늄의 메탄올 용액을 이용하여 칼럼 크로마토그라피를 실시하면, 전체 용출량이 약 180-220㎖, 약 220-260㎖, 또는 260-300㎖일 때 상기 성분이 용출되는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  19. 제13항에 있어서, 상기 조성물 10㎖에 존재하는 모든 음이온을 실질적으로 결합시키기에 충분한 양의 바이오-라드 AG-1(Bio-Rad AG-1) 하이드록사이드형 수지를 포함하고 있는 칼럼을 이용하며, 중탄산암모늄 완충용액을 이용하여 단계적으로 농도가 경사지도록 하여 상기 조성물 10㎖에 대해 음이온교환 크로마토그라피를 실시하면, 상기 성분이 완충용액농도가 약0.5-1.5M일 때 칼럼으로부터 용출되는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 성분이 완충용액의 농도가 약 1.0-1.5M일 때 칼럼으로부터 용출되는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 성분이 완충용액의 농도가 약 1.5M일 때 칼럼으로부터 용출되는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  22. 제13항에 있어서, 상기 조성물을 동결건조시킨 다음 0.1% TFA 수용액에 다시 용해하여 250mm×4.6mm 크기의 칼럼(Phenomenex WP60009-C18)을 이용하여 크로마토그라피를 실시하는데, 약 10분간은 0.1% TFA 수용액(제1완충용액)을 흘려 주고, 이어서 55분 동안은 0.1% TFA 아세토니트릴용액(제2완충용액)을 0-80%까지 직선형태로 농도경사를 이루도록 흘려주고, 다음 5분간은 상기 제2완충용액 80%용액을 흘려 주고, 이어서 5분간은 상기 제2완충용액을 80-0%의 농도경사로 흘려주며, 유속을 1㎖/min로 하고 상기 칼럼의 용적과 완충용액이 초과되지 않도록 하면, tdrl 성분은 칼럼에 주입된 지 약 2.1-3.4분 후에 용출되는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  23. 제13항에 있어서, 상기 조성물을 0.1% TFA 수용액(제1완충용액)을 이용하여 투석시킨 다음 크기가 250×4.6mm인 바이오-라드 칼럼(Hi-Pore RP 318)을 이용하여 역상(C18) HPLC를 실시하는데 있어서, 상기 칼럼을 통해 상기 제1완충용액을 약 10분간 흘려주고 0.1% TFA 아세토니트릴 용액(제2완충용액)을 0-80%로 직선형태로 농도경사를 이루도록 약 55분간 흘려주고, 다음 5분간은 상기 제2완충용액 80% 용액을 흘려 주고, 이어서 5분간은 상기 제2완충용액을 80-0%의 농도경사로 흘려주며, 유속을 1㎖/min로 하고 상기 칼럼의 용적과 완충용액이 초과되지 않도록 하면, 상기 성분은 상기 투석된 조성물이 칼럼에 주입된 지 약 2-dir 21.4분, 또는 약 21.4-약 25.6분 후에 용출되는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  24. 제13항에 있어서, 상기 조성물을 10% 진한 수산화암모늄 메탄올 용액에 용해하여 박층크로마토크라피를 실시한 다음 닌히드린을 분무하여 발색시킬 때, 상기 닌히드린에 의한 양성반응이 Rf값이 약 0.8-0.9일 때 나타나는 것을 특징으로 하는 면역조절제 조성물.
  25. 제8항 내지 12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 췌장암 치료용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제13, 18, 19, 22, 23항 중 어느 한 항의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 췌장암 치료중인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 동물의 담즙으로부터 추출되어 스핑고신 또는 염과 복합된 스핑고신의 마이셀(micelle)을 포함하며, 다음과 같은 성질 중 적어도 한 가지 성질을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 조성물: (a) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음; 또는 (b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있음.
  29. 제28항에 있어서, 담즙산염 및 암모늄 또는 알킬암모늄이온의 원천을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 동물의 담즙으로부터 추출되어 스핑고신, 담즙산염 및 암모늄 또는 알킬암모늄이온의 원천을 포함하며, 다음과 같은 성질 중 적어도 한 가지 성질을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 조성물: (a) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음; 또는 (b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있음.
  31. 동물의 담즙으로부터 추출되어 담즙산염, 스핑고신, 디아실 글리세롤, 암모늄 또는 알킬암모늄이온의 원천 및 레티놀산 유도체를 포함하며, 다음과 같은 성질 중 적어도 한 가지 성질을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 조성물: (a) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음; 또는 (b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있음.
  32. 동물의 담즙으로부터 추출되어 디아실 글리세라이드, 레시틴 및 담즙산염을 포함하며, 다음과 같은 성질 중 적어도 한 가지 성질을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 조성물: (a) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음; 또는 (b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있음.
  33. 동물의 담즙으로부터 추출되어 (1) 디아실 글리세라이드, (2)레시틴 및 (3) 뮤신 가수분해 생성물 또는 프로테오글리칸 가수분해 생성물을 포함하며, 다음과 같은 성질 중 적어도 한 가지 성질을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 조성물: (a) 시험관내에서 단핵세포와 대식세포를 자극하여 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산할 수 있음; 또는 (b) 시험관내 또는 생체내에서 단핵세포 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있음.
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NZ (1) NZ273258A (ko)
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1182368A (zh) * 1995-03-16 1998-05-20 伊姆特克药物公司 来源于胆汁的治疗免疫系统紊乱的免疫调节组合物
CA2277112C (en) 1997-01-07 2008-08-26 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake
CA2206047A1 (en) * 1997-05-23 1998-11-23 Romeo Rang (Deceased) Immunomodulating compositions for the treatment of viral disorders
NZ516848A (en) * 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
WO2002038164A1 (en) * 2000-11-08 2002-05-16 Lorus Therapeutics Inc. Combination preparation of a biological response modifier and an anticancer agent and uses thereof
ITRM20010688A1 (it) * 2001-11-21 2003-05-21 Univ Roma Composti immunoregolatori.
US20040171522A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-02 Yaron Ilan Regulation of immune responses by manipulation of intermediary metabolite levels
US9717754B2 (en) 2003-02-27 2017-08-01 Enzo Therapeutics, Inc. Glucocerebroside treatment of disease
WO2005032462A2 (en) 2003-02-27 2005-04-14 Enzo Therapeutics, Inc. Glucocerebroside treatment of disease
JP4274469B2 (ja) * 2004-01-20 2009-06-10 Ｏｋｉセミコンダクタ株式会社 データ取り込みクロック補正回路
US8287851B2 (en) 2005-03-08 2012-10-16 Lorus Therapeutics Inc. Use of interleukin 17E for the treatment of cancer
GB0513431D0 (en) * 2005-06-30 2005-08-10 Kherion Technology Ltd Prophylactic compositions and uses
CN101629951B (zh) * 2009-08-20 2013-01-02 吴广印 一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法
US8338383B1 (en) 2012-02-17 2012-12-25 Gregory Jr Daniel Tyree Use of immunomodulators for the treatment of cancer
US8236354B1 (en) * 2012-02-17 2012-08-07 ZOR Pharmaceuticals, LLC Use of immunomodulators for the treatment of cancer

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2046092B (en) 1979-03-05 1983-11-02 Toyama Chemical Co Ltd Pharmaceutical composition containing a lysophospholid and a phospholipid
US4562179A (en) 1982-04-19 1985-12-31 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Phospholipid derivatives, and pharmaceutical composition of the same
US4585762A (en) 1982-07-30 1986-04-29 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Phospholipid derivatives, processes for use thereof and pharmaceutical composition of the same
JPS5984824A (ja) 1982-11-08 1984-05-16 Takeda Chem Ind Ltd 抗腫瘍剤
US4767610A (en) 1984-10-19 1988-08-30 The Regents Of The University Of California Method for detecting abnormal cell masses in animals
US4916249A (en) 1985-07-03 1990-04-10 Hans Brachwitz Glycero-3(2)-phospho-L-serine derivatives and salts thereof
IE59778B1 (en) 1985-12-04 1994-04-06 Max Planck Gesellschaft Medicament with anti-tumour action containing hexadecylphosphocholine
GB8706313D0 (en) * 1987-03-17 1987-04-23 Health Lab Service Board Treatment & prevention of viral infections
US5087721A (en) 1987-10-23 1992-02-11 The University Of Michigan Radioiodinated phosphate esters
US4965391A (en) 1987-10-23 1990-10-23 The University Of Michigan Radioiodinated phospholipid ether analogues
US5138067A (en) 1987-12-17 1992-08-11 Shionogi & Co. Ltd. Lipid derivatives
WO1989006977A1 (en) 1988-02-04 1989-08-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Formulation and use of retinoids in treatment of cancer and other diseases
EP0356765A3 (en) 1988-08-19 1991-08-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Carboxylic acid derivatives, their production and use
CA2001532A1 (en) 1988-10-27 1990-04-27 Hiroaki Nomura Lipids, their production and use
US5109118A (en) 1989-07-06 1992-04-28 Yutaka Mizushima Modified biologically active proteins
GB8928580D0 (en) 1989-12-19 1990-02-21 Scras 3-(n-methyl-n-alkylamino)-methoxymethyl-propanol phosphocholine derivatives
US5369097A (en) 1991-04-25 1994-11-29 The University Of British Columbia Phosphonates as anti-cancer agents

Also Published As

Publication number Publication date
CN1132586C (zh) 2003-12-31
CA2171281A1 (en) 1995-03-16
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CN1136777A (zh) 1996-11-27
US6280774B1 (en) 2001-08-28
NO960907D0 (no) 1996-03-06
WO1995007089A1 (en) 1995-03-16
AU7648994A (en) 1995-03-27
CA2171281C (en) 1998-12-29
HK1007922A1 (en) 1999-04-30
ES2207639T3 (es) 2004-06-01

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