KR100257214B1

KR100257214B1 - 거세되지 않은 수컷가축의 고기의 관능적 품질을 개선하기 위한 방법

Info

Publication number: KR100257214B1
Application number: KR1019920702707A
Authority: KR
Inventors: 레이몽듀푸르; 끌로드룰레; 끌레르슈베; 베르냐르보노미셸
Original assignee: 데스꼴롱그 티에리; 메리알(쏘시에떼 빠르 악씨옹 쌩플리휘에)
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 2000-05-15
Also published as: CZ287775B6; SK328092A3; EP0501882A3; CA2081660A1; HU9203419D0; SK282056B6; EP0501882A2; JP3177246B2; HU214453B; HUT63338A; EP0501882B1; DK0501882T3; DE69231232T2; ATE194625T1; US5573767A; CZ328092A3; JPH05506459A; IE920648A1; UA40570C2; GR3034509T3

Abstract

본 발명은 거세되지 않은 수컷 가축의 고기의 관능적 품질을 증진시키는 방법. 이 방법에 이용 가능한 백신, 특히 이 백신을 생산하기 위한 신규의 펩티드 및 거기에 관계된 백신 반응 키트에 관한 것이다.

거세되지 않은 수컷 가축의 고기의 관능적 품질, 특히 향기, 맛 그리고 연함을 개선하기 위한 방법은 시험할 동물의 도살 직전에 능동적 또는 수동적 항 - LHRH 면역중화법에 의해 안드로겐계 및 비안드로겐계 스테로이드의 활성을 소멸시키는 반면 동물의 남성 형질에 연관된 잇점은 도살때까지 실질적으로 유지시킴을 포함한다. 백신은 펩티드로서, 면역 발생 전달 단백질에 결합하는 천연 LHRH 또는 일반식 Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂의 펩티드를 함유한다.

Description

거세되지 않은 수컷 가축의 고기의 관능적 품질을 개선하기 위한 방법

본 발명은 거세되지 않은 수컷 가축, 특히 수컷 소, 양 및 돼지로 부터 얻은 고기의 관능적 품질, 특히 향기, 맛 및 연함을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 이 방법에 사용될 수 있는 백신, 그러한 백신을 생산하기 위한 새로운 펩티드 및 그에 관계된 백신접종 키트에 관한 것이다.

고기 생산을 위한 가축의 비육단계에서 거세된 수컷보다 완전한 수컷을 사용하는 것의 잇점은 축산학의 전문가들에 의해 수십년간 강조되어 왔다. 그 잇점은 특히 소 및 양에 있어서의 높은 성장율, 모든 가축에 있어서, 사료공급의 증진된 이용성 및 좀 더 야위었으나 근육질이 더 부여된 몸통에 관한 것이다 (S.C. SEIDEMAN et al., J., of Animal Science, 1982, 55 (4) 826 ∼ 840 및 M. BONNEAU, INRA Prod. Anim., 1988, 1 (2) 133140).

전술한 문헌에서 지적하고 있는, 완전한 수컷을 사용하는 주요 단점은 수컷 돼지 및 양의 경우에는 불쾌한 냄새와 맛에 관한 것과, 소와 양의 완전한 수컷으로 부터의 연한 고기에 관한 것이고, 이것이 수술적 거세의 현행을 정당화하게 해준다.

사실상, 안드로스텐디올, 안드로스텐디온 및 테스토스테론을 포함하는 안드로겐계 스테로이드는 모든 가축에 있어서 기대되는 빠른 성장 및 사료 공급의 증진된 이용성에 관한 장점에 있어서 결정적인 요소인 반면, 완전한 수컷 소고기 및 양고기의 덜 연함에 관계한다. 수컷 돼지에서의 비안드로겐계 스테로이드 또는 5α- 안드로스테논 (5α- 안드로스트 - 16 - 엔 - 3 - 온)을 포함하는 16 - 안드로스텐 유도체는 특히 일단 발정기에 도달한 많은 완전한 수컷 돼지의 고기의 불쾌한 냄새와 맛에 부분적으로 관계되므로 고기의 질을 떨어뜨리고 신선한 상태의 시장화에 장애가 되는 요소이다.

트립토판으로 부터 유도된 생성물이고 내장 미생물군에 의해 생성된 스카톨(skatole) 은 완전한 수컷 돼지로 부터의 고기의 불쾌한 냄새와 맛에 부분적으로 관계한다. 그것의 생상은 환경적, 영양적 및 육종적 요소에 의존한다. 지방조직내의 상기 스카톨의 축적은 완전한 수퇘지에서 더 많고, 생식선 성호르몬의 분비와 연관되어 있는 것으로 보인다.

실험적 목적으로, 어린 동물의 남성형질의 발현 또는 고환 호르몬, 특히 고환 스테로이드의 분비를 이들 호르몬 또는 이들의 분비에 관계하는 호르몬, 특히 황체 형성 호르몬 또는 LH 및 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH)로 알려진 고나돌리베린 (GnRH) 호르몬에 대한 능동 또는 수동 면역중화법에 의해 감소 또는 중지시키고자 하는 시도가 이미 행해져 왔다. 또한, 돼지에 대한 16 - 안드로스텐기의 5α- 안드로스테논의 조직 수준을 이 화합물에 대한 능동 면역 (E.D. WILLIAMSON et al., Livestock Production Science, 1985, 12, 251 ∼ 264) 또는 이 동일 화합물에 대한 수동 면역 (R. CLAUS, Immunization with Hormones in Reproduction Research, ed. Nieschlag, 1975) 에 의해 낮추는 시험이 행해졌다. 시험하고자 하는 종의 특이적 생식선 자극 호르몬 LH 의 면역중화법 (R.E. FALVO et al., J. Anim. Science, 1986, 63, 986 ∼ 994)에 의해, 또는 내생 LHRH 의 항 - LHRH 면역중화법에 의해 고환호르몬의 분비를 중지시키거나 감소시키고자 하는 것이 가능하다. 능동적 항 - LHRH 면역법만이 여러 저자들에 의해 추천되어 왔다. 돼지에 있어서, 상기 방법에 의해 α- 안드로스테논을 감소시킬 수 있었다. (A. CARATY 및 M. BONNEAU, C.R. Acad. Sci. Paris 1986, 303, Series III (16) 673 ∼ 676; R.E. FALVO et al., J. Anim. Sci., 1986, 63, 986 ∼ 994).

양에 있어서, 수컷 양의 고환 발생을 늦추고 거세 효과를 생성하기 위해 비.디. 스캔바처 (B.D. SCHANBACHER; Am. J. Physiol., 1982, 242, E201 ∼ 205)는 항 - LHRH 면역법을 추천한다. 소의 경우, 피. 에스. 로버트슨이 항 - LHRH 면역적 거세를 설명하고 있다(Vet. Rec., 1979, 105, 516 ∼ 517).

실험실용 동물 (ARIMURA et al., Endocrinology, 1973, 93, 1092, 1103; FRASER H.M. et al., J. Endocr. 1974, 63, 399 ∼ 406; MAKINO T. et al., Contraception, 1973, 8(2), 133 ∼ 145; CARELLI C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1982, 79, 5392 ∼ 5395) 및 수개의 가축중 (JEFFCOATE et al., Theriogenology, 1978, 10(4), 323 ∼ 335; ROBERTSON I. S. et al., Veterinary Record, 1979, 105, 556; SCHANBACHER B.D. Am. J. Physiol., 1982, 242, E201 ∼E205)에 대해 기술한 항 - LHRH 면역 중화시험은 테스토스테론 분비의 저지, 고환 및 그에 부착된 선의 중량 퇴화, 정자 생성 저지 및 행동면에서의 성적충동을 없애는 것이 가능하다는 것을 보여준다.

이 연구는 육종 목적의 전통적인 수술적 거세를 대체하는 초기 면역중화법, 특히 항 - LHRH 에 대한 의존을 제안하고 있다.

미국 특허 제4,556,555호에서는 고나도트로핀에 대해 직접 작용하는 항체를 포함하는 항혈청을 사용하여 발정기 전의 동물의 수동적 면역화법에 대해 기재하고 있다.

국제 특허출원 제WO 90/11,298호에서는 돼지 고기의 질을 향상시키기 위해, 운반 단백질과 직렬로 결합하는 두개의 LHRH 서열을 사용한 출생시의 항 - LHRH 면역법을 기재하고 있다.

국제 특허출원 제WO 88/00,056호에서는 성장률에 영향을 주는 수술적 거세대신에 수컷 동물의 사회적 및 생식적 행동을 향상시키기 위한 항 - LHRH 면역적 거세법을 기재하고 있다. 완전한 황소를 8 내지 40주의 나이때에 백신접종하고 수회의 추가항원을 준다.

오스트리아 웹스터사가 제조한 상표명 벡스스트레이트 (VAXSTRATE) 로서 판매되는 항 - LHRH 백신을 암소에 사용한다.

알. 이. 팔보 등 (J. Anim. Sci. 1986, 63; 986 ∼ 994)은 프런드 완전 보조제내의 LHRH - 인간 혈청 글로불린 컨쥬게이트를 사용하여 또는 보조제로서 뮤라밀 펩티드를 함께 사용하여 여러 그룹의 완전한 수퇘지를 면역화시켰다.

백신 접종 및 수회의 추가 항원 접종후, 저자들은 항-LHRH 항체의 높은 역가를 관측하였으나, 고역가의 항체를 유지하기 위해 반복된 추가항원접종을 수행할 필요가 있음을 관측하였다.

아이. 에스. 로버트슨은 파상풍 아나톡신 또는 티로글로불린에 결합하는 LHRH 를 사용하는 면역법을 설명하고, 면역적 접근이 무게 증가의 견지로 부터 기대되는 잇점을 가진 후기 거세를 가능하게 해줌을 제안하고 있다. 그러나, 그는 프런드 보조제가 실용상 금지되고 있어 방법 그 자체 및 보조제 양자에 대해서, 실용화에 이용될 수 있는 거세 방법에 도달하기 위해 여전히 노력이 이루어져야 한다고 결론짓고 있다.

마지막으로, 에이. 카라티 및 엠. 보노 (A. Caraty 및 M. Bonneau; C.R. Acad. Sc. Paris. vol 303, Series III, No. 16, 1986) 는 수퇘지에 대해 항-LHRH 면역법을 수행하였다. 상기 저자는 도살 2 내지 3주 전에 스테로이드 생성의 차단이 지방조직내에 안드로스테논의 축적으로 인해 발생하는 문제점을 피하면서 이용될 이러한 유형의 동물의 고기 생산에 대한 높은 가능성을 얻을 수 있음을 제시하고 있다. 그러나, 그들은 능동적 항 - LHRH 면역법이 돼지 축산에 이용될 수 있는 기술로서 제안될 수 있기 전에 실질적인 진보가 면역기술에서 이루어져야 한다고 결론짓고 있다.

더구나, 최근의 면역 중화법은 실용면에서 처리의 안정성 및, 특히 백신 특히 오일성 백신에 의해 발생하는 지역 반응의 문제로부터 발생하는 고기의 거절 또는 등급하락의 위험을 가져오게하는 상당한 문제점을 야기한다.

소와 양에 대한 관능적 품질의 증진은 제안되어 있지 않다.

본 출원인은 실제로, 능동 또는 수동적 항 - LHRH 면역 중화법에 의해 동물의 도살 조금전에 안드로겐계 및 비안드로겐계 스테로이드의 활성을 실질적으로 소멸시키고 그 동물의 남성 형질에 기인한 잇점은 도살때까지 실질적으로 유지시키는, 동물의 고기의 관능적 특성을 증진시킬 수 있는 산업적으로 이용 가능한 방법을 발견하였다.

이 방법의 첫번째 바람직한 실시예에 따라, 항 - LHRH 백신을 바람직하기로는 유액형태로, 동물의 비육 단계동안 또는 그 이전에 동물에게 접종한 다음, 동물의 도살 조금전에 항 - LHRH 백신을 다시 접종한다. 상기 방법은 두개의 독립된 접종, 또는 방출 조절법 (controlled-release method) 으로 수행될 수 있다.

돼지의 경우, 도살전, 수성형 보조제, 특히 알루미늄 히드록시드 겔 및/ 또는 사포닌과 함께 항 - LHRH 백신을 접종하는 것이 특히 유리하다.

이 접종은 도살전 15 내지 21일에 수행하는 것이 바람직하다.

반면에, 소 및 적절하다면 양의 경우에, 도살전의 접종은 유액 형태의 보조제와 함께, 도살 1 내지 2개월 전에 수행하는 것이 바람직하다. 이 접종은 첫번째 접종후 적어도 4주, 바람직하기로는 여러달 후에 수행하는 것이 바람직하다.

어떠한 경우에도, 첫번째 접종용, 및 소의 경우 두번째 접종용 유액 형태의 백신에 대해, 백신을 수 - 중 - 유 (water - in - oil) 유액 형태로 사용함이 바람직하다. 그러나, 다른 형태의 유액도 상정할 수 있다.

바람직하기로는 유액 형태의 이 백신은 본 발명에 따라, 생식선 스테로이드 분비에 대한 상당한 또는 심지어는 측정 가능한 정도의 효과 없이 일차적, 저강도 면역 반응을 유도하도록 고안된다. 유액 형태의 제제가 바람직하나, 동일한 효과를 나타내는 한 다른 제제도 이용가능하다.

도살전의 접종은 이 시기에 고기의 외관 또는 질을 손상시킬 수 있는 부위적 또는 전체적 역작용 없이 스테로이드 분비를 제거 또는 상당히 감소시키도록 제제화된 백신을 사용하여 수행한다.

바람직하기로는, 특히 돼지에 있어서, 수성 용액 형태의 컨쥬게이트를 하기 두가지 제제에 첨가한다: 첫번째, 생식선 스테로이드 분비에 대한 측정 가능한 효과없이 저강도 면역 반응을 유발하기 위한, 고정제된 무기질, 동물성 또는 식물성 오일 및 비이온계 표면활성제의 혼합물로 부터 만들어진 안정한 수 - 중 - 유 유액의 형태 제제, 두번째, 급속하고 강력한 면역반응을 야기시켜 중화하는 항 - LHRH 항체를 충분히 생성하여 생식선 스테로이드의 감소 또는 제거 및 내장 유래의 스카톨의 결합 수송을 감소시키는, 알루미늄 히드록시드 겔 및 사포닌을 가진 비유액형태의 제제.

프런드 완전 또는 불완전 보조제를 사용하여 수득함을 특징으로 하는 사용 유액은 즉석에서 사용할 수 있는 백신을 제조할 수 있는 안정한 유액이다. 피부 염증 반응은 두개의 백신 제제가 투여된 위치에서 매우 약하고 지협적으로 남아있고, 외견 검사시에 경계가 명확한 구진 형태로 그 자체로 선명하게 나타난다. 그의 내부적 발현은 표면 진피에 제한되게 남아 있다. 그것은 동물의 도살시 분명한 육아종을 남김이 없이 사라진다.

이 방법의 다른 구현예에 따라, 고면역 항 - LHRH 혈청 또는 혈장 또는 택일적으로 항 - LHRH 단일클론성 항체는 도살 몇일전, 특히 5 내지 15일전에 동물에게 투여된다.

안드로겐계 또는 비안드로겐계 스테로이드 분비의 감소 또는 심지어 소멸을 일으키는 수동적 항 - LHRH 면역은 고면역 말 혈장의 근육내투여에 의해 수득된다. 충분한 수준에 도달하여 수령 동물의 혈청의 LHRH 항체 역가를 측정하면, 이 면역화는 3일 부터 혈장내의 테스토스테론의 감소를 일으키고; 그후 12일 동안 동일한 수준을 유지하면, 수퇘지 고기의 불쾌한 냄새와 특별한 맛이 더이상 소비자에게 인식되지 않는 값인 0.50㎍/g 이하로 조직 안드로스테론이 감소되기에 충분하다. 이 수동면역법은 12일 동안의 테스토스테론의 상당한 감소를 유지시키는 조직 안드로스테론 농도를 정해진 역치 이하로 감소시키기에 충분하다는 것을 나타낸다. 이 수동 면역법은 돼지의 하이브리도마 또는 헤테로하이브리도마에 의해 분비되는 항-LHRH 단일클론성 항체를 사용하여 수행될 수 있다.

이들 제제의 투여 방법은 바람직하기로는 투피 접종, 특히 압력하의 분출구 (jet) 를 통한 무바늘 주사장치를 사용하여, 특히 특허출원 제FR - A - 2,652,257에 따라 행한다.

본 발명에 따른 방법은 완벽하게 안전하고, 특히 고기의 질을 하락시키기 쉬운 부위 반응을 일으키지 않는 뛰어난 잇점을 가진다.

피부 염증반응은 두가지 백신 제제를 투여한곳에 부위적으로 남아 있고, 외견 심사시에 경계가 명확한 구진형태로서 그 자체로 선명하게 나타난다. 그것의 내부 발현은 표면 진피에 한정되게 남아 있다. 그것은 동물의 도살시에 분명한 육아종을 남기지 않고 사라진다. 시간 및 투여 위치에 제한되는 염증 반응은 두가지 백신 제제에 대한 내성을 시사하고 무바늘 주사기를 사용하여 수행한 이들의 투피 투여에 의해 수득된다.

항- LHRH 면역법은 사용되는 경제적 조건하에서 면역을 일으키지 않는 LHRH 펩티드 또는 LHRH 펩티드의 단편을 전달체라 불리는 면역을 일으키는 단백질과 공유결합을 통한 결합이 필요하다.

천연 또는 합성 LHRH 또는 GnRH 는 하기 식에 따른 아미노 말단으로 부터 카르복시 말단방향으로 1 내지 10까지 번호를 부친 10 아미노산으로 구성된다:

협약에 의한 이들 기호는 하기를 나타낸다: pGlu, 피로글루탐산; His, 히스티딘; Trp, 트립토판; Ser, 세린; Tyr, 타이로신; Gly, 글리신; Leu, 류신; Arg, 아르기닌; Pro, 프롤린.

많은 저자들에 의해 기재된 항 - LHRH 면역유발성 컨쥬게이트는 햅턴에 관하여 하기와 같이 제조될 수 있다: a) 완전한 LHRH 또는 원하는 아미노말단, 크르복시말단 또는 중간 결합물을 수득하기 위해 1 이상의 부분이 변형된 LHRH, b) 원하는 아미노말단, 카르복실말단 또는 중간 결합물을 수득하기 위해 5 내지 7개의 아미노산으로 구성되고 변형되거나 그렇지 않은 그의 펩티드 단편하나, c) 중간 결합물을 얻기 위해 가장 일반적으로는 6번 위치에 치환된 아미노산을 가지는 작용약.

운반 단백질에 관해서, 소혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 티로글로불린, 오브알부민 및 인간 또는 말의 글로불린이 사용된다.

따라서, 유럽 특허출원 제EP - A - 181,236호에서는 리신 또는 시스테인-리신 서열이 아미노말단 측면상에 첨가된 LHRH 분자의 마지막 8 아미노산에 상응하는 서열을 포함하는 노나펩티드 또는 데카펩티드를 함유하는 면역 유발 컨쥬게이트를 기재하고 있다.

더구나, 특허출원 제WO 88/05,308호는 천연 분자의 5, 6 또는 7 인접 아미노산의 단편을 사용하여 만들어진 컨쥬게이트를 공개하고 있고 그것의 각 단편은 N - 말단 피로글루탐산 또는 카르복시 - 말단 글리신아미드를 함유하고 있고 거기에 부가적인 아미노산 또는 아미노산 서열이 면역유발성 단백질에 연결된 말단에 첨가될 수 있다.

사용된 결합제는 세가지 주요 범주; 활성제, 동질 이기능제 및 이질이 기능제로 분류될 수 있다. 활성제를 사용하면 두분자 사이의 결합이 이미 존재하는 이기능기사이에 만들어지는 반면, 다른 결합제는 리간드라 불리는 탄화수소 잔기를 통해 결합이 만들어진다.

활성제들 중에서, 글리코프로테인의 올리고사카라이드 잔기를 알데히드로 산화하는데 사용되고, 결합에 관여하는 다른 분자의 아민기가 연속해서 반응하는 과요오드산을 들 수 있다.

카르보디이미드는 항원을 단백질에 연결시키기 위해 널리 사용되는 활성제이고, 이들중 가장 광범위하게 사용되는 것은 확실히 수성매질 내에서 반응이 수행될 수 있게해주는 N - 에틸 - N' - (3 - 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 히드로클로라이드이다. 이들의 작용은 중간체 0 - 알킬이소우레아의 형태로서 활성화되는 한 단백질의 카르복실기와 다른 분자로 부터 생긴 아민기간의 아미드 결합을 형성시킨다. 그들의 잇점은 사용의 간편성에 있다. 동질이기능적 약제는 탄화수소 사슬로 부터 분리된 두개의 동일한 반응기를 가진 분자이다. 이들중, 두개의 일차 아민기, 알킬 또는 아릴 디이소티오시아네이트와 반응하고, 일차 아민 및 티올과 반응하는 글루타르알데히드, 및 타이로신의 방향족 잔기와 결합하는 비스디아조화된 벤지딘을 들수 있다. 비스말레이미드 및 비스아미디네이트를 공식적으로 들 수 있다.

동질이기능약제의 주요 단점은 이 약제가 동일한 특성의 두 분자와 반응할 수 있어 올리고머 또는 폴리머를 형성하기 때문에, 형성된 컨쥬게이트의 특성에 대한 열등한 조절에 관한 것이다.

이를 해결하기 위해, 화학자들은 두개의 기가 다른 특성을 가진 이질기능기 약제를 도입하였다. 일반적인 경우에, 이들 기중의 하나는 온화한 조건하에서 단백질의 유리 아민기와 반응하여 한편으로는 N - 히드록시숙신이미드, 다른 한편으로는 공유 아미드 결합을 통해 두번째 기능기가 발생하는 커플링제를 가지는 단백질을 생성하는 N - 히드록시숙신이미드 에스테르이다. 다소 일반적인 관점에서, 후자는 결합된 분자에 의해 제공되는 티올과 반응할 수 있고, 이들 티올은 최초에는 시스테인 잔기의 형태로 분자내에 존재하거나 (이것은 후자가 천연 성분이거나, 펩티드의 경우에 합성동안 의도적으로 도입될 수 있다), 환원 반응후 2 - 이미노티올란 또는 N - [(3 - (2 - 피리딜디티오) 프로파노일옥시] 숙신이미드 (SPDP) 와 같은 약제에 의해 제공된다.

전술한 가능성 가운데, 전체의 LHRH 를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 천연 LHRH 는 이들 두개의 펩티드를 사용하여 제조된 컨쥬게이트의 면역발생 활성과 비교하여 (D - Lys⁶) - LHRH 와 같은 작용약이 바람직하다.

카르보디이미드는 천연 - 형성 LHRH 를 알파 - 글로불린과 결합하기 위한 약제로서 글루타르알데히드가 바람직하다.

인간 또는 말 알파 - 글로불린, 분획 IV - 1 또는 IV - 4 가 인간 또는 소 혈청알부민으로서 바람직하다.

바람직하기로는, 백신은 알파 - 글로불린 - LHRH 컨쥬게이트를 바람직하게 함유하는 하나의 그리고 동일한 활성원을 함유하고; LHRH 는 천연 형태이고 인간 또는 말 기원의 알파 - 글로불린, 특히 분획 IV - 1 및/또는 IV - 4 가 바람직하다. 컨쥬게이트는 0.9% NaCl 에 용해된 2.5% N - 에틸 - N' - (3 - 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 히드로클로리드 용액 0.5 내지 2 부피를 0.9% NaCl 내에 2 내지 20mg/ml 을 함유하는 알파 - 글로불린 / LHRH 혼합물 용액 1부피에 첨가하여 바람직하게 제조된다. 교반후, 혼합물을 밤새 방치한 후 겔 투과 크로마토그래피로 정제한다.

운반 단백질에 관해, 특히 소 또는 인간 혈청 알부민, 티로글로불린, 오브알부민, 인간 또는 말 글로불린 및 아나톡신, 특히 파상풍 아나톡신을 사용할 수 있다.

관측한 수퇘지의 카르보디이미드와 결합한 LHRH 펩티드의 카르복시 - 말단 분획에 대한 면역 반응 또는 SPDP 와 결합한 그의 작용물질 (D-Lys⁶) - LHRH 의 알파 - 글로불린에 대한 면역반응의 우세는 LHRH 의 카르복시 말단을 가지는 유리한 펩티드를 사용하는 항 - LHRH 면역발생 턴쥬게이트의 정의를 이끌어낸다.

결과적으로, 본 발명의 두번째 바람직한 실시예에 따라, 본 출원인은 LHRH 의 최종 8 아미노산, 즉 하기의 일반식을 가지는 데카펩티드를 함유하고 천연 LHRH 의 호르몬 활성을 나타냄이 없이 탁월한 면역활성을 가진 신규의 펩티드를 사용하는 것이 매우 유리함을 발견하였다:

따라서, 본 발명의 주제는 이 신규의 펩티드 (3 ∼ 10) 및, 그것을 통합시키고, 상기에서 전술한 면역발생 운반 단백질에 결합하며, 오브알브민 및 말 알파 - 글로불린, 특히 분획 IV-1 및/또는 IV-4 가 바람직한 컨쥬게이트에 관한 것이다.

본 발명에서, 카르보디이미드는 글루타르알데히드 및 LHRH (3 ∼ 10) 펩티드를 결합시키는 약제와 같은 이질 이기능기 약제, 특히 말 알파 - 글로불린 또는 오브알부민이 바람직하다.

바람직한 컨쥬게이트의 제조에서, LHRH (3 ∼ 10) 및 전달 단백질, 오브알부민 또는 알파 - 글로불린은 0.1M NaCl/0.1M 2 - (N - 모르폴리노) 에탄술폰산 완충액내에 각각 ml 당 2 내지 40mg 의 비율로 용해되어 있다. 동일한 완충액에 용해된 2.5% N - 에틸 - N' - (3 - 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 용액 0.5 내지 2 부피를 더 첨가한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH 를 맞춘다. 교반후, 혼합물을 밤새 방치한뒤, 비결합된 LHRH (3 ∼ 10), 잔류 카르보디이미드 및 그의 가수분해 생성물을 제거하는 겔 투과크로마토그래피로 정제한다.

본 발명의 주제는 또한 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있는, 활성원과 같은 컨쥬게이트를 사용하는 신규의 항 LHRH 백신에 관한 것이다.

본 발명의 주제는 또한 전술한 방법에 의한 수동 항 LHRH (3 ∼ 10) 면역법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 단일 용기내에, 도살전에 투여될 백신 및 일차 주사에 투여될 백신 동량의 투여량을 겸비한 키트에 관한 것이다. 바람직하기로는, 이들 백신은 예를들어 전술한 프랑스 특허출원에 따라 투피성 분출구를 사용하여 투여하기 위해 감소될 부피 및 증가된 투여농도로 포장된다.

본 발명은 한편으로는 본 발명에 따른 여러가지 생성물 및 백신 방법을 비교하는 시험으로, 다른 한편으로는 수퇘지의 LHRH 펩티드의 카르복시 말단 분획에 대한 면역반응의 우세를 나타내는 시험 및 본 발명에 따른 돼지에 대해 수행한 항 - LHRH 백신화의 시험에 의해 보다 상세하게 기술하기로 한다.

[I - 완전한 LHRH 의 사용]

A. LHRH 펩티드의 완전하고 가장 확장적인 카르복시 말단 분획을 유지하는 컨쥬게이트의 보다 뛰어난 면역 발생 활성 및 작용제 (D-Lys⁶) - LHRH 를 사용하여 수득한 것 보다는 천연적 - 일반식의 LHRH 를 기재로 하는 컨쥬게이트의 선택.

A1. 완전한 수퇘지 및 OFA 숫쥐의 항 - LHRH 면역.

천연형 LHRH (B1 및 B2) 또는 (D-Lys⁶) - LHRH (A1 및 A2) 및 인간 알부민간의 컨쥬게이트, 수성층내의 카르보디이미드를 사용하여 수득한 컨쥬게이트 및 SPDP 로 구성되는 2개의 항 - LHRH 백신을 각각 유 - 중 - 수(oil-in-water) 유액내에 넣고 돼지에게는 근육내 접종 및 쥐에게는 피하접종한 활성 비교시험은 하기와 같은 결론을 이끈다.

- 천연형 LHRH 를 기재로 하는 백신의 활성이 높다: 면역반응을 나타내는 보다 많은수의 동물의 건강회복을 위한 결합된 (D-Lys⁶) - LHRH 펩티드 보다 결합된 LHRH 펩티드의 양이 더 적다 (표 1 및 표 3).

- 동일한 컨쥬게이트를 사용하여 면역반응을 나타내는 보다 많은 수의 동물의 건강 회복에서 그 자체로 명백한 투여량 효과 (dose effect) (표 3).

A1.1 - SPDP 를 사용한 (D-Lys⁶) - LHRH - 알부민 컨쥬게이트의 제조.

(D-Lys⁶) - LHRH - 알부민 컨쥬게이트의 제조는 하기의 세단계:{N - [3 - (2 - 피리딜디티오) 프로파노일] D - Lys⁶} - LHRH 의 제조, N - (3 - 메르캅토프로파노일) 알부민의 제조에 이은 커플링 단계로 수행된다.

{N^ε- [3 - (2 - 피리딜디티오) 프로파노일] - D - Lys⁶} - LHRH 는 과량의 SPDP 를 수용액내에서 LHRH 와 반응시키고 (LHRH 의 몰당 SPDP 6몰), 이어서, 4℃ 에서 밤새 방치한 후 수득된 생성물을 원심분리하여 제조한다. 후자를 8M 우레아에 용해시키고 존재하는 2 - 피리딜디티오기를 분석한다.

N - (3 - 메르캅토프로파노일) 알부민은 인간 알부민 1g 상의 SPDP 0.2mmol 을 0.1M 인산 완충용액 100ml 에 용해시킨 후, 밤새 4℃ 에 접촉시키고 pH 6 으로 산성화하고 디티오트레이톨로 환원시켜 수득한다. 이어서 겔 여과 크로마토그래피로 정제한다. 티올 및 단백질 분석은 평균수준의 치환을 수득한다.

커플링은 1.25 티올기당 하나의 2 - 피리딜디티오기를 취하여 수행한다. pH 를 7 내지 7.5 로하고 이어서 한시간후, 유리된 2 - 피리딘티온을 측정하여 수율을 결정한다.

평균 수준의 치환은 이로부터 추론된다. 최종적으로, 컨쥬게이트를 크로마토그래피로 정제하고 한외여과로 농축한다.

[A1.2 - 카르보디이미드를 가진 LHRH - 알부민 컨쥬게이트의 제조]

사용하기 직전에 0.9% NaCl 40ml 에 용해된 N - 에틸 - N' - (3 - 디메틸아미노프로필( - 카르보디이미드 히드로클로리드 1000mg 을 0.9% NaCl 30ml 에 용해된 LHRH 300mg 및 인간 알부민 300mg 에 첨가한다. 교반후, 혼합물을 빛을 배제한 실온에서 밤새 방치한다. 이어서, 세파덱스 G-50 겔상의 크로마토그래피하고; 컨쥬게이트에 상응하는 분획을 수집하고 적절히 농축하고 동결시킨다.

비결합된 LHRH 를 함유하는 분획으로 부터, 비결합된 LHRH 의 양 및 그에 의한 결합의 평균 수준을 결정한다. 후자는 재생산가능하고 알부민 100mg 당 결합된 LHRH 는 8 내지 10mg 으로 다양하다.

크로마토그래피 전후의 컨쥬게이트의 UV 스펙트럼으로 부터, 컨쥬게이트의 크로마토그래피 수율 및 그에 따른 결합된 LHRH 의 양 (또는 농도) 을 계산해 낸다.

[A1.3 - 분석기술]

제프코에이트등의 문헌 (Acta. Endocr., Copenh., 1974, 75: 625 ∼ 635) 에 기재된 기술에 따라 항체 역가를 결정한다.

방사능 리간드 테스토스테론 C19 - 카르복시메틸 에테르 - [¹²⁵I] 히스타민을 사용한 RIA 기술에 의해 테스토스테론을 혈장상에서 직접 분석한다.

다양한 펩티드를 고콜랜드 등의 내분비학., 1979 104: 1504 ∼ 1506 에 따라 요오드 - 125 방사능 표지하고 제프코에이트 등의 문헌 (Acta. Endocr., Copenh., 1974, 75, 625 ∼ 635) 에 기재된 기술에 따른 결정후 방사능 표지된 펩티드에 대한 결합을 결정한다.

[A1.4 - 예해]

- 쥐에 대한 시험

o 표 1 : 요오드 - 125 - 표지된 LHRH 의 결합도에 의해 측정한 항 - LHRH 항체 반응

o 표 2 : 혈장 테스토스테론 농도에 따른 항 - LHRH 면역 효과

o 투여량

백신 A1 : 결합된 (D-Lys⁶) - LHRH 50μg

B1 : 결합된 LHRH 12㎍

- 완전한 수퇘지에 대한 시험

o 표 3 : 요오드 - 125 - 표지된 LHRH 의 결합도에 의해 측정한 항 - LHRH 항체 반응

o 투여량

백신 A1 : 결합된 (D-Lys⁶) - LHRH 0.5mg

A2 : 결합된 (D-Lys⁶) - LHRH 6mg

B1 : 결합된 LHRH 0.15mg

B2 : 결합된 LHRH 1.20mg

[표 1]

요오드 - 125 - 표지된 LHRH 의 결합도에 의해 측정한 항 - LHRH 항체반응 쥐내의 혈청 (1/100) 내의 항체 (% Bo/T) 에 대한 시험

[표 2]

혈장 테스토스테론 농도에 대한 항 - LHRH 면역 효과

쥐내의 혈장테스토스테론 (ng/ml) 의 분석

[표 3]

요오드 - 125 - 표지된 LHRH 의 결합도에 의해 측정한 항 - LHRH 항체 반응

혈청(희석) 내의 항 - LHRH 항체에 대한 시험

A2 - 각각 카르보디이미드를 가진 LHRH -α- 글로불린 컨쥬게이트 및 SPDP 와 결합된 (D-LYS⁶) - LHRH -α- 글로불린으로 구성된 두개의 항 - LHRH 백신을 유 - 중 - 수 유액내에 넣고 돼지에게 근육내 (IM) 또는 투피 (ID) 로 접종한 비교 시험

A2.1 - SPDP 를 가진 (D-Lys⁶) - LHRH -α- 글로불린 컨쥬게이트의 제조.

10mg/ml 농도의 알부민을 6mg/ml 농도의 α- 글로불린으로 대체하는 것을 제외하고는, 실시예 A1에서 기재한 방법을 정확하게 동일한 방법으로 시행한다.

결합된 (D-Lys⁶) - LHRH 의 전체 수율은 45 내지 50% 정도이다.

또한, MP -α- 글로불린의 제조동안 SPDP 및/또는 α- 글로불린 농도를 변화시킴으로써,α -글로불린의 치환도 및 그에 따른 결합수준을 뜻대로 변형시킬 수 있다.

A2.2 - 카르보디이미드 (EDC) 를 가진 LHRH - 인간 α-글로불린 컨쥬게이트의 제조.

인간 알부민을 인간 α- 글로불린으로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 A1 에서 기재된 방법을 정확하게 동일한 방법으로 시행한다. 결합수준은 인간 α- 글로불린 100mg 당 결합한 LHRH 가 24 내지 28mg 이다.

A2.3 - 카르보디이미드를 가진 LHRH -α- 글로불린 컨쥬게이트를 기재로하는 백신의 효율이 두번째 백신보다 더 높다. 효율은 혈장 테스토스테론이 모두 없어진 동물의 수로 표시한다 (표 4).

[표 4]

A.3 - 카르보디이미드와 결합한 LHRH 펩티드의 카르복시 - 말단 분획에 대한 수퇘지의 면역반응 또는 SPDP 와 결합한 그의 작용제 (D-Lys⁶) - LHRH 의 인간 α- 글로불린에 대한 면역반응의 우세.

이것은 두개의 방사능 표지된 LHRH 단편들 즉, 아미노 - 말단 분획이 결실된 LHRH (3 ∼ 10) 및 유리산 형태이고 그 결과로 그의 천연 카르복시 - 말단 분획의 아미드 분획이 결실된 LHRH (1 ∼ 10) 각각에 의한 항 - LHRH 및 항 - (D-Lys⁶) - LHRH 의 결합백분율을 비교하여 결정한다. 이 두가지 분획은 각각 더 특별하게는 한편으로 카르복시 - 말단 분획을 다른 한편으로는 아미노 - 말단 분획을 향하는 항체를 인지한다.

펩티드의 카르복시 - 말단 분획에 대한 반응의 우세는 LHRH 유리산의 결합을 배제한 펩티드 LHRH (3 ∼ 10) 에만 결합하는 항체를 나타내는 동물의 수 (항 - LHRH 혈청에 대해 10/58 및 항 - (D-Lys⁶) - LHRH 혈청에 대해 3/10)에서 그 자체로 명백하다.

아미노 - 말단 분획의 배제적 인지를 반영하는 LHRH 유리산 분획의 100% 결합을 나타내는 혈청은 없었다.

가장 빈번한 혼합 반응은 항 - LHRH 혈청에서 보다 항 - (D-Lys⁶) - LHRH 혈청에 의한 아미노 - 말단 분획의 인지가 더 좋게 나타난다. 후자의 경우에, 항 - (D-Lys⁶) - LHRH 혈청에 대해서는 10중 4혈청인데 반해, 단지 58중 3혈청만이 아미노 - 말단 분획의 40% 이상을 인지하였다.

B - 글루타르알데히드를 사용해 제조한 컨쥬게이트를 사용하여 수득한 것과 비교해서 카르보디이미드를 사용하여 생산한 LHRH -α - 글로불린 컨쥬게이트의 더 높은 면역 활성.

B.1 - 글루타르알데히드와 결합한 LHRH -α- 글로불린의 제조.

10mg/ml 을 함유하는 글루타르알데히드 용액 2.5 ml 을 pH 7.5 의 0.1M인산 완충용액 5ml 내에 LHRH 10mg 및 인간 α- 글로불린 (Serva) 50mg 을 각각 첨가한후 천천히 교반하여 용해된 용액에 30분에 걸쳐 적가한다. 혼합물을 실온에서 2.5시간동안 방치한 후, 물 0.5ml 에 용해된 소듐 비술파이트 25mg 을 첨가하여 반응을 종결시킨다. 컨쥬게이트를 pH 7.5 의 150mM NaCl/10mM 인산 완충용액에 대하여 4℃ 에서 투석하고 한외여과로 농축한다.

B.2 - 동량의 결합된 LHRH 를 사용하여 제제화한 항 - LHRH 백신의 돼지에 대한 비교 시험.

효율은 혈장 테스토스테론이 완전히 사라진 동물의 수로서 나타낸다(표 7).

[표 7]

C - 인간 혈청 알부민을 사용하여 컨쥬게이트에 대해 수득한 것과 비교해서 인간 α- 글로불린을 사용한 컨쥬게이트의 더 높은 면역발생 활성.

효율은 혈장 테스토스테론의 완전 소멸을 나타내는 동물의 수로서 나타낸다 (표 8).

[표 8]

돼지에 대한 시험 - 근육내 주사

D - 인간 α- 글로불린을 사용한 컨쥬게이트로 얻은 것과 동일한, 말 α - 글로불린, 분획 IV-1 을 사용한 컨쥬게이트의 면역발생 활성.

D.1 - 카르보디이미드와 결합한 LHRH - 말 α- 글로불린의 제조.

인간 알부민을 말 α- 글로불린 (분획 IV-1) 으로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 A1 에 기재된 방법을 정확하게 동일한 방법으로 시행한다.

D.2 - 인간 또는 말 α- 글로불린에 결합한 투여량 12㎍ 의 LHRH 백신의 4주 간격, 2회의 쥐에의 피하 접종

[표 9]

쥐에 대한 시험

E - 다른 유액 보다 높은 본 발명의 수 - 중 - 유 유액의 보조제 활성 (표 10).

LHRH 및 카르보디이미드를 가진 인간 α- 글로불린으로 구성된 동일한 컨쥬게이트를 사용하여 동일 부피내의 동일 투여량으로 5군데에 투피 접종한 돼지에 대한 시험.

시험된 유액은 하기와 같다: 유동성의 물내의 오일 유액 (B), 본 발명의 유액 (표의 일반식 C), 항원으로 희석된 상업적 유액 (E) 및 컨쥬게이트로 유화된 오일상 (F).

이 모든 제제에 대해, 투여량당 항원의 최종량은 동일하다.

유액은 이러한 유형의 제제에 특정화되어 사용되는 통상의 조건하에서 생산된다.

[표 10 ]

F. 고기의 관능적 품질을 향상시키기 위해서, 조직 안드로스테논을 감소시켜 측정한 수동적 항 - LHRH 면역의 효율

[표 11]

대조동물 및 도살전 16, 13, 9 및 5 일에 300ml 부피로 투여된 고면역말의 항 - (D-Lys⁶) - LHRH 를 사용하여 수동적 항 - LHRH 면역중화반응을 시킨 동물내의 지방조직의 안드로스테논 함량.

(α- 리스크 (risk) 에서의 유효 차이 (significant difference)=0.2)

G. 수 - 중 - 유 유액 형태 (1차 백신) 및 알루미늄 히드록시드 겔 및 사포닌 형태 (2차 백신) 의 카르보디이미드를 가진 α- 글로불린에 결합된 LHRH 를 함유하는 제제를 피그제트 (Pigjet) 로 알려진 무바늘 주사법을 사용하여 비육 전기 및 도살전 18 내지 20일 기간에 각각 결합된 LHRH 동량을 투피 접종한 제제의 효율 및 내성.

두가지 시험을 두개의 단계, 즉 첫번째 단계에서는 그룹 1, 3 및 5, 두번째 단계에서는 그룹 2 및 4 에 대해 수행한다 (표 12 및 13).

G.1 - 항 - LHRH 면역화의 효율을 투피 접종 위치를 배가시킴으로써 동 부피의 백신에 대해 증가시킨다.

[표 12]

ND : 측정 안됨

G.2 - 사용된 백신에 대한 내성은 접종후 나타나는 구진의 크기에 따라 동물을 1 내지 4등급으로 나타낸, 피부 염증 반응의 발현에 의해 판단한다; 구진은 각각의 접종한 위치에 나타난다. 각 그룹의 점수 등급을 하기와 같이 계산한다: 각 백신의 투여후 첫째주 말기에서의 평균 점수 (Ad1) 및 도살시 평균점수 (S1)(표 13). 가장 높은 내성은 그룹 4 의 백신을 사용하였을때 관찰된다.

[표 13]

수행된 2 시험 (그룹 1,3 및 5 의 시험 1 및 그룹 2 및 4 의 시험 2) 동안 관측된 투피 접종에 대한 내성

II. 펩티드 (3 ∼ 10) 의 사용

A. 혈장 테스토스테론 및 조직 안드로스테론의 분석에 의한 항 - LHRH 면역 반응 및 생물학적 활성의 측정 기술.

항 - LHRH 면역 반응은 제프코에이트 등의 문헌 (Acta. Endocr. (Copenh.), 1974, 75, 625 ∼ 635)에 기재된 기술에 따라 측정한 항체 역가에 의해 측정한다.

방사능 표지된 펩티드에의 결합은 다양한 펩티드를 요오드 - 125 로 표지화한후 코플랜드등의 내분비학 (Endocrinology) 1979, 104, 1504 ∼ 1506 에 따라 측정한다. 이들 펩티드에 관한 혈청의 결정은 전술한 제프코에이트의 기술에 따라 수행된다.

생물학적 활성은 혈장 테스토스테론 및 조직 안드로스테논의 감소 또는 소실에 의해 측정된다. 혈장 테스토스테론의 분석은 방사능 리간드 테스토스테론 C19 - 카르복시메틸에테르 - [¹²⁵-I] 히스타민을 사용한 RIA 기술(FURUYAMA S et. al., Steroids, 1972, 16, 415) 에 의해 혈장에 대해 직접적으로 수행한다. 조직 안드로스테논의 분석은 클라우스의 문헌 (C.R. Acad. Sci., Paris, 1974. 278, 299 ∼ 302) 에 기재된 방사능 리간드 5 α- [³H] 안드로스테논을 사용한 RIA 기술에 의해 지방조직의 시료에 대해 수행한다.

B. 카르보디이미드와 결합한 LHRH 펩티드의 카르복시 - 말단 분획에 대한 수퇘지의 면역 반응, 또는 SPDP 와 결합한 그의 작용제 (D-Lys⁶) - LHRH 의 인간 α- 글로불린에 대한 면역 반응의 우세.

B1. 카르보디이미드와 결합한 LHRH - 인간 α- 글로불린의 제조.

0.9% NaCl 내에 용해된 N - 에틸 - N' - (3 - 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 히드로클로리드의 2.5% 용액 0.5 내지 2 부피를 0.9% NaCl 내에 용해된 2 내지 20mg/ml 을 함유하는 α- 글로불린/LHRH 혼합물의 용액 1부피에 첨가함으로써 컨쥬게이트를 바람직하게 수득한다. 교반후, 혼합물을 밤새 방치하고 겔 투과 크로마토그래피로 정제한다.

B2. SPDP 와 결합한 [(D-Lys⁶) - LHRH] - 인간 α- 글로불린 컨쥬게이트의 제조.

[(D-Lys⁶) - LHRH] - 인간 - 글로불린 컨쥬게이트의 제조는 하기의 3단계로 수행된다: {N - [3 - (2 - 피리딜디티오) 프로파노일] - D - Lys⁶} - LHRH 의 제조, N - (3 - 메르캅토프로파노일) - 인간 α- 글로불린의 제조에 이은 커플링 단계.

[N^ε- [3 - (2 - 피리딜디티오) 프로파노일] - D - Lys⁶} - LHRH 는 수용액 내에서 과량의 SPDP 를 LHRH 의 반응 ((D-Lys⁶) - LHRH 의 몰당 SPDP 6몰) 시킨후, 4℃ 에서 하룻밤 방치시킨 후 수득한 생성물을 원심분리함으로써 제조된다. 후자를 8M 우레아에 용해시키고 존재하는 2 - 피리딜 디티오기를 분석한다.

N - (3 - 메르캅토프로파노일) - 인간 α- 글로불린은 0.2mmol 의 SPDP 를 0.1M 인산 완충 용액 100ml 내에 용해된 인간 α- 글로불린 0.6g 에 작용시킨후 4℃에서 하룻밤 접촉시키고 pH 6 으로 산성화하고 디티오트레이톨로 환원시켜 수득한다. 이어서 켈 여과 크로마토그래피로 정제한다. 티올 및 단백질 분석은 평균 수준의 치환을 나타낸다.

커플링은 1.25 티올기당 2 - 피리딜디티오기 하나를 취하여 수행된다. pH 를 7 ∼ 7.5 로 맞춘후 1시간후에 유리된 2 - 피리딘티온을 측정하여 수율을 결정한다.

평균 수준의 치환은 이로 부터 추론해낸다. 최종적으로 컨쥬게이트를 크로마토그래피로 정제하고 한외여과로 농축시킨다. 결합된 (D-Lys⁶) - LHRH 의 총 수율은 45 내지 50% 정도이다.

B3. Al 및 A2 에 기재된 조건하에서 결합된 LHRH 펩티드의 카르복시 - 말단 분획에 대한 수돼지의 면역 반응의 우세는 각각 2개의 표지된 LHRH 단편 즉, LHRH (3 ∼ 10) (아미노 - 말단 분획이 결실된 LHRH)및 유리산 형태인 LHRH (1 ∼ 10) (카르복시 - 말단 분획의 아미드 분획이 결실된 LHRH) 의 항 - LHRH 및 항 - (D-Lys⁶) - LHRH 혈청에 의한 결합을 비교하여 결정한다. 이들 두 분획은 보다 특별하게 각각 한편으로는 카르복시 - 말단 분획을 다른 한편으로는 아미노 - 말단 분획을 향한 항체를 인식한다.

펩티드의 카르복시 - 말단 분획에 대한 반응은 하나 또는 다른 컨쥬게이트로 면역화된 모든 동물에 있어서 일반적이다 (68/68). 결합된 (D-Lys⁶) - LHRH 로 면역화된 동물 10 마리의 10개중 3개의 혈청 및 결합된 LHRH 로 면역화된 동물의 68개중 10개의 혈청이 카르복시 - 말단 분획의 배제적인 결합을 보인다. 다른 동물들은 카르복시 - 말단 분획을 향한 선택적인 혼합반응을 보인다.

아미노 - 말단 분획에 대한 반응은 일반적이지 않다 (55/68). 혈청은 LHRH 유리산 분획에 대한 배제적 결합을 보이지 않는다.

C. 카르보디이미드를 사용하여 수득한 LHRH (3 ∼ 10) - 말 α- 글로불린 IV-4 및 LHRH (3 ∼ 10) - 오브알브민 컨쥬게이트를 사용한 활성 항 - LHRH 면역중화반응 시험.

C1. 카르보디이미드를 가진 LHRH (3 ∼ 10) - 말 α- 글로불린 IV-4 컨쥬게이트의 제조.

LHRH (3 ∼ 10) 85mg 및 말 α-글로불린 IV-4 170mg 를 0.1M NaCl/0.1M 2 - (N - 모르폴리노) 에탄술폰산 완충액 12.8ml 내에 용해시킨다. 상기 용액 17ml 에 용해된 N - 에틸 - N' - (3 - 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로리드 212mg 을 첨가한다. 1N 수산화나트륨 1.3ml 을 첨가하여 pH 를 즉시 6.0 으로 맞춘다.

교반후, 혼합물을 실온에서 16시간 방치하고, 컨쥬게이트를 겔 투과 크로마토그래피로 정제하여 비결합된 LHRH 로 부터 컨쥬게이트를 분리한다. 후자의 양 측정은 결합된 LHRH 의 양을 차이에 의해서 얻을 수 있게 해준다. 커플링 수율을 결정하는 것이 가능하다.

C2. 카르보디이미드를 가진 LHRH (3 ∼ 10) - 오브알부민 컨쥬게이트의 제조.

LHRH (3 ∼ 10) 60mg 및 오브알부민 120mg 을 0.1M NaCl/0.1M 2 - (N - 모르폴리노) - 에탄술폰산 완충액 9ml 내에 용해시킨다. 상기와 동일한 완충액 12ml 에 용해된 N - 에틸 - N' - (3 - 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로리드 150mg 을 첨가한다. 1N 수산화나트륨 (약 1.9ml) 을 첨가하여 pH 를 7.0 으로 맞춘다. 혼합물을 실온에서 밤새 방치한후, 농축하여 정제한다. 상층액을 세파덱스 겔 상의 크로마토그래피하여 미반응된 LHRH 및 초기 카르보디이미드로 부터 유래한 생성물로 부터 컨쥬게이트를 분리한다. 비결합 LHRH (3 ∼ 10) 의 양을 측정하여 LHRH (3 ∼ 10)의 결합 수율을 결정할 수 있다.

C3. 카르보디이미드를 가진 단편 LHRH (3 ∼ 10) 및 말 α- 글로불린 IV-4 사이에서 수득한 컨쥬게이트로 부터 제제화된 항 - LHRH 백신에 대한 면역반응, 생물학적 효율 및 내성.

결합된 LHRH (3 ∼ 10) 으로 구성되고 수 - 중 - 유 유액내에 넣은 제제 (일차백신) 및 알루미늄히드록시드 겔 및 사포닌에 넣은 제제 (이차백신) 를 각각에 대해 5군데씩 분배되는 0.2ml 의 두개의 접종에서, 투여량을 운반하는 피그제트라 불리는 무바늘 주사기를 사용하여, 비육단계의 초기 및 도살전 17일에 투여량당 0.4ml 의 부피로 6마리의 수퇘지에게 투피 접종한다.

2번째 백신의 투여후 10일에서의 면역 반응이 최대였다. 각 항체 역가 (요오드 - 125 가 50% 결합한 희석율의 역수) 는 각각 하기와 같다.

10 일 280 660 2700 3200 4600 13,000

16 일 290 400 2000 2400 3100 8600

이 면역반응의 생물학적 활성은 6마리 동물 모두에서 2번째 백신의 투여 10일후 부터 혈장 테스토스테론의 소멸로서 그 자체로 분명하다. 동일 조건하에서, 테스토스테론의 소멸은 조직 안드로스테논의 소멸을 동반한다.

백신에 대한 내성은 투여후 백신을 접종한 각 위치에 나타나는 구진의 크기에 따라 등급화한 피부염증반응의 발현에 의해 판단한다. 2번째 백신의 투여 10일후부터 이 국소 염증은 완전히 사라진다.

Claims

소, 양 및 돼지로 이루어진 군으로부터 선택된 안드로겐 스테로이드 및 비안드로겐 스테로이드를 갖는 비거세 수컷 동물을 비육하면서, 비육중에는 상기 동물의 남성 형질이 발현되게 하고, 그 동물들을 도살하기 직전에 항 - LHRH 활성 면역 중화법으로 실시하여, 도살직전에만 상기 안드로겐 스테로이드 및 비안드로겐 스테로이드의 활성을 실질적으로 제거하는 방법으로, 상기 동물의 비육전 또는 중에 생식 스테로이드 분비에 현저하거나 측정가능한 영향없이 일차적 낮은 강도의 면역 반응을 유도하여 상기 동물들의 남성 형질은 계속 발현되도록 고안된 항 - LHRH 백신을 1회 투여한 후, 도살직전에 안드로겐 스테로이드 및 비안드로겐 스테로이드의 활성을 실질적으로 제거하도록 고안된 항 항 - (LHRH) 백신을 접종하여 항 - LHRH 면역 중화반응을 유도하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 고기의 관능적 성질을 향상시키는 방법.
제1항에 있어서, 처음에 접종되는 항 - LHRH 백신이 동물이 비육 시기 이전에 접종하는 방법.
제1항에 있어서, 처음에 접종되는 항 - LHRH 백신이 유탁액 형태의 백신인 방법.
제1항에 있어서, 동물이 돼지이고, 상기 항 - LHRH 백신이 수성 형태의 보조제와 함께 도살 전에 접종되는 방법.
제4항에 있어서, 수성 형태의 보조제가 알루미늄 히드록시드겔, 사포닌, 및 알루미늄 히드록시드와 사포닌의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제4항에 있어서, 상기 백신이 도살 15 내지 21 일전에 수성 보조제와 함께 접종되는 방법.
제1항에 있어서, 동물이 소 및 양이고, 항 - (LHRH) 백신이 유탁액 형태의 보조제와 함께 도살 전에 접종되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 유탁액 형태의 백신이 도살하기 1 내지 2 달 전에 접종되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 유탁액 형태의 백신이 1차 접종 4주 내지 몇 개월 후에 접종되는 방법.
제3항 또는 제7항에 있어서, 상기 유탁액 형태의 백신이 유 - 중 - 수 유탁액 형태의 백신인방법.
제10항에 있어서, 상기 유 - 중 - 수 유탁액이 고도로 정화된 미네랄 오일 및 비이온성 계면활성제의 혼합물로 만들어진 방법.
제1항에 있어서, 상기 항 - (LHRH) 백신이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 면역원성 운반 단백질과 결합된 LHRH 의 컨쥬게이트를 함유하는 방법:-소 혈청 알부민,-인간 혈청 알부민,-티로글로불린,-오브알부민,-아나톡신,-파상풍 아나톡신,-말 글로불린,-인간 글로불린.
제12항에 있어서, 압력하의 분출을 통해 무바늘 주사 장치를 사용하여 여러 군데에 투피 접종하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 컨쥬게이트가 말 알파 - 글로불린, 말 알파 - 글로불린 분획 IV-1, 말 알파 - 글로불린 분획 IV-4 및 그것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 면역원성 운반 단백질에 결합된 LHRH를 함유하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 펩티드와 면역원성 운반 단백질이 카르보디이미드를 이용하여 결합되는 방법.
제12항에 있어서, 상기 컨쥬게이트가 오브알부민, 말 알파 - 글로불린, 말 알파 - 글로불린 분획 IV-1, 말 알파 - 글로불린 분획 IV-4 및 그 분획들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 면역원성 운반 단백질에 결합된 LHRH (3-10) 를 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 펩티드와 면역원성 운반 단백질이 카르보디이미드를 이용하여 결합되는 방법.
제1항에 있어서, 압력하의 분출을 통해 무바늘 주사 장치를 사용하여 여러 군데에 투피 접종하는 방법.