ES2674439T3 - Administración sin aguja de vacunas contra el VSRRP - Google Patents

Abstract

Composición inmunológica que comprende un vector, en la que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ORF7 truncada del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) que consiste en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 85% de homología con la misma, para usar en un procedimiento para provocar en un animal una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP, comprendiendo el procedimiento por administrar vía transdérmica una cantidad eficaz de la composición usando un inyector sin aguja a chorro de líquido.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Administración sin aguja de vacunas contra el VSRRP

[0001] El virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) pertenece a una familia de virus de ARN de cadena positiva con envoltura llamados virus arteri. Otros virus de esta familia son el virus prototipo, el virus de la arteritis equina (VAE), virus que eleva la lactato deshidrogenasa (VLD) y el virus de la fiebre hemorrágica de los simios (VFHS) (de Vries et al., 1997 para una revisión). Las características llamativas comunes a los Coronaviridae y Arteriviridae han dado lugar recientemente a su colocación en un orden de nueva creación, los Nidovirales (Pringle, 1996; Cavanagh, 1997; de Vries et al., 1997). Los cuatro miembros del grupo Arterivirus, aunque son similares en la organización del genoma, la estrategia de replicación y la secuencia de aminoácidos de las proteínas también son similares en su preferencia por la infección de macrófagos, tanto in vivo como in vitro (Conzelmann et al, 1993; Meulenberg et al, 1993a).

[0002] La organización del genoma de arterivirus está revisado en de Vries et al. (1997). El ARN del genoma es de cadena sencilla, infeccioso, poliadenilado y bloqueado en 5'. El genoma de VSRRP es pequeño, de 15.088 bases. Tanto los genomas de VAE como de VLD son ligeramente más pequeños de 12.700 bases y 14.200 bases, respectivamente. Las secuencias completas de los genomas de VAE, VLD y VSRRP están disponibles (Den Boon et al, 1991; Godeny et al, 1993; Meulenberg et al 1993a.).

[0003] El genoma contiene ocho marcos de lectura abiertos (ORFs) que codifican, en el siguiente orden, los genes de la replicasa (ORF 1a y 1b), las proteínas de la envoltura (ORF 2 a 6) y la proteína de la nucleocápside (ORF 7) (Meulenberg et al. 1993a). Los ORFs 2 a 7 se expresan a partir de seis ARN subgenómicos, que se sintetizan durante la replicación (Meng et al., 1994, 1996). Estos ARN subgenómicos forman un conjunto anidado 3' coterminal y se componen de un líder común, derivado del extremo 5' del genoma viral (Meulenberg et al. 1993b). Aunque los ARN son estructuralmente policistrónicos, la traducción se limita a las únicas secuencias 5' que no están presentes en el siguiente ARN más pequeño del conjunto. Dos grandes marcos de lectura abiertos (ORFs) solapantes, designados ORF 1a y ORF 1b ocupan más de dos tercios del genoma. El segundo ORF, ORF 1b sólo se expresa después de una lectura de la traducción a través de un cambio de marco -1 medida por una estructura pseudoknot (Brierley 1995). Los polipéptidos codificados por estos ORFs se escinden proteolíticamente por proteasas codificadas por virus para producir las proteínas implicadas en la síntesis de ARN.

[0004] ORF 2 codifica una proteína estructural N-glicosilada de 29-30 kDa (GP2 o GS) que muestra las características de glicoproteínas de mebrana integral de clase 1 (Meulenberg y Petersen-den Besten, 1996 usando la cepa Ter Huurne del virus Lelystad). La proteína ORF2 muestra un 63% de homología de aminoácidos cuando el aislado VR-2332 americano se compara con el virus de Lelystad (Murtaugh et al., 1995). ORF 3 codifica una proteína menor estructural N-glicosilada de 45-50 kDa denominada GP3 (van Nieuwstadt et al., 1996). ORF 4 codifica un proteína de membrana menor N-glicosilada de 31-35 kDa denominada GP4 (van Nieuwstadt et al., 1996). ORF 5 codifica GP5 o GL, que es una glicoproteína de la envoltura mayor de 25 kDa (Meulenberg et al., 1995). ORF 6 codifica una proteína de membrana (M) integral no glicosilada de clase III de 18 kDa (Meulenberg et al, 1995). ORF 7 codifica una proteína básica no glicosilada de 15 kDa. El ORF del genoma del virus de la arteritis equina (EAV) se denominó 2a y codifica una proteína estructural de 8kDa esencial llamada "E" (Snijder et al, 1999). En VSRRP, el ORF homólogo ha sido designado como 2b, el ORF 2 que codifica GP2 (ver arriba) se ha renombrado como ORF 2a (Snijder et al., 1999).

[0005] Dos grupos principales de signos clínicos están asociados con la aparición de PRRS aunque ahora se ha reconocido que los efectos clínicos varían mucho entre los rebaños infectados y en muchos casos, la infección es subclínica y la productividad está dentro de parámetros aceptables. Los dos grupos son: (1) los signos reproductivos que incluyen nacimientos prematuros, abortos tardíos, lechones nacidos débiles y un aumento de mortinatos y momificaciones (Dado y Paton, 1995). (2) Los signos de enfermedad respiratoria también son importantes en cerdos neonatales, siendo la dificultad para respirar y tos las características más dominantes. Los síntomas generalmente se presentan en cerdos de tres semanas de edad, a pesar de que todas las edades son susceptibles. En contraste con los fracasos reproductivos, las enfermedades respiratorias clínicamente evidentes son más difíciles de reproducir experimentalmente (Zimmermann et al. 1997). Estos signos clínicos varían considerablemente y pueden estar influidos por la cepa del virus (Halbur et al., 1995), la edad de la infección y las diferencias en la susceptibilidad genética (Halbur et al., 1992), infecciones concurrentes (Galina et al., 1994), densidad de cerdos, los movimientos de cerdo y los sistemas de alojamiento (Listo et al., 1996) y el estado inmunitario, incluyendo la presencia de niveles bajos de anticuerpos específicos del virus de PRRS que puede mejorar (Yoon et al., 1994).

[0006] Parece que hay tres vías de transmisión: (1) de nariz a nariz o contacto cercano (Done et al, 1996), (2) los aerosoles (Le Potier et al, 1995), y (3) extendido a través de la orina, heces y semen. La transmisión a través de la inseminación con semen contaminado está bien documentado (Yeager et al, 1993; Albina, 1997). En cuanto a la patogénesis, el cambio más significativo inducido por VSRRP es el daño severo a los macrófagos alveolares, que se destruyen en gran número (revisado en Done y Paton, 1995; Rossow, 1998). La inducción de la apoptosis en un gran número de células mononucleares en los pulmones y ganglios linfáticos podría ser una explicación de una reducción dramática en el número de macrófagos alveolares y los linfocitos y monocitos circulantes en cerdos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

infectados con VSRRP (Sirinarumitr et al, 1998; Sur et al., 1998). Junto con la destrucción de linfocitos circulantes y la destrucción del sistema de aclaramiento mucociliar, esto puede suprimir la inmunidad y hacer que los cerdos sean más susceptibles a una infección secundaria. Una mayor tasa de infecciones secundarias bacterianas se ha documentado después de la infección por VSRRP (Galina et al, 1994; Dado y Paton, 1995; Nakamine et al 1998). La severidad de la infección por VSRRP también puede aumentar por infección bacteriana o micoplasma (Thacker et al. 1999). Además, se ha encontrado un número de infecciones virales asociado con PRRS (Carlson, 1992; Brun et al, 1992; Halbur et al, 1993; Done et al, 1996; Heinen et al, 1998).

[0007] La infección con VSRRP suele inducir respuestas inmunitarias anti-virales lentas y débiles, lo que lleva a la infección persistente y la inmunosupresión en los pulmones de cerdos infectados. Las estrategias de evasión inmunitaria por VSRRP descritas incluyen la inhibición de las respuestas inmunitarias innatas, la inducción de citoquinas inmunosupresoras sistémicas; IL-10 y Tregs porcinos (linfocitos CD4+CD25+Foxp3+) que dieron como resultado inmunosupresión generalizada durante una fase temprana de la infección. La inmunidad adaptativa contra VSRRP es a menudo lenta e ineficiente, con evidencia de la activación de células B policlonales y la inducción de ADE en la siguiente exposición. Los solicitantes han generado recientemente una evidencia experimental que sugiere que las propiedades inmunomoduladoras del virus pueden depender de la interacción de la proteína estructural y las células inmunitarias (S. Suradhat, observación no publicada). En general, la infección por VSRRP no mata a los cerdos infectados, sino que más bien provoca varias complicaciones de salud relacionadas con la función inmunitaria subóptima. Varios informes demuestran que las actividades inmunomoduladoras inducidas por VSRRP podrían resultar en inmunodeficiencia secundaria causando infección persistente, complicaciones secundarias y el fracaso de la vacuna en los cerdos infectados.

[0008] Aunque hay varias vacunas comerciales están disponibles en el mercado, el beneficio de la inmunidad inducida por la vacuna en los cerdos vacunados no ha sido satisfactoria. La vacuna de virus vivo modificado (MLV) ha demostrado ser más eficaz que la vacuna inactivada debido a su capacidad para inducir una inmunidad relativamente más amplia. La evidencia también sugiere un papel para la inmunidad mediada por células en la limitación de la infección por VSRRP y la difusión dentro de cerdos infectados. Sin embargo, la inducción de la inmunidad específica por MLV ha demostrado ser retardada e ineficiente Además, la inmunidad inducida por MLV proporciona sólo una protección parcial contra la infección por VSRRP heterólogo. En algunos casos, el uso de MLV ha planteado preocupaciones respecto a la seguridad y la inducción de inmunotolerancia.

[0009] En general, el desarrollo de la vacuna contra la infección viral se basa en la inducción de la inmunidad mediada humoral y celular protectora específica viral. El desarrollo de una vacuna eficaz contra SRRP ha sido costosamente desafiante con la alta variabilidad antigénica del virus (cuasiespecies) y su capacidad para controlar el sistema inmunitario a través de varias actividades inmunomoduladoras. Por lo tanto, a pesar de estar adecuadamente preparado antes de la infección, las células efectoras/de memoria específicas de VSRRP inducidas por la vacuna podrían no ser capaces de funcionar bien durante una fase temprana de la infección. Dado que VSRRP solo no mata a los cerdos infectados, se postuló que si se eliminan/reducen los efectos inmunomoduladores inducidos por VSRRP, el sistema inmunitario del huésped infectado debe ser capaz de limitar/aclarar la infección viral por sí mismo. Esto también ayudará a minimizar la infección persistente y complicaciones secundarias en la etapa tardía de la infección.

[0010] Una vacuna que podría inducir una fuerte inmunidad celular con reactividad cruzada anti-VSRRP debe tener un beneficio en la reducción de la viremia, los signos clínicos inducidos por VSRRP y mejora de la condición general de salud mediante la reducción de las complicaciones secundarias relacionadas con la inmunodeficiencia inducida por VSRRP. Además, evitar la activación innecesaria de células B por el antígeno de la vacuna sería ideal para la aplicación de estrategias de la diferenciación de los animales infectados y vacunados (DIVA) en las granjas. Se ha propuesto el uso de inyectores sin aguja en el campo veterinario (Wo-A-98/03659, WO-A-92/15330, WO-A- 98/03658; Van Rooij et al, Vet Immunol Immunopathol., 1998, 66 (2), 113-126;US-A-6.451.770; Schrijver et al, Vaccine, 1998, 16 (2-3), 130-134), pero la técnica anterior contiene resultados inconsistentes y contradictorios (McKercher PD et al, Can J. Comp Med, 1976, 40, 67-74; Epstein, Hum gene Ther, 2002, 13 (13), 275-280; Haensler, Vaccine, 1999, 17 (7-8), 628-638). Por lo tanto, una persona experta no puede predecir si la administración sin aguja será eficaz para una combinación huésped/vacuna no probada.

[0011] El documento US 2008/299141 A1 describe un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de VSRRP truncada, una vacuna en la que dicho vector expresa una proteína antigénica codificada por un marco de lectura abierto, preferiblemente y una composición inmunológica que comprende dicho vector, un adyuvante y un portador farmacéutica o veterinariamente adecuado.

[0012] El documento US 5998601 A describe la SEQ ID NO: 4 de la presente solicitud y un vector que comprende ORF7 utilizado en una vacuna.

[0013] El documento WO 2007/040876 A2 decribe un kit de vacunación que comprende un inyector sin aguja de líquido y un vial de vacuna que contiene un VSRRP, operativamente ensamblado para llevar a cabo la administración de la vacuna a un animal de la familia de los suidos y para provocar una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0014] La cita o identificación de cualquier documento en esta solicitud no es una admisión de que dicho documento está disponible como técnica anterior a la presente invención.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0015] La presente invención proporciona:

una composición inmunológica que comprende un vector, en el que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína ORF7 truncada del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) que consiste en SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 85% de homología a la misma, para usar en un procedimiento para provocar en un animal una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP, comprendiendo el procedimiento administrar por vía transdérmica una cantidad eficaz de la composición usando un inyector sin aguja a chorro de líquido.

una composición para usar de acuerdo con la invención en la que la proteína ORF7 está codificada por una secuencia que tiene al menos un 70% de homología con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3. una composición para usar de acuerdo con la invención que además comprende un adyuvante y un portador farmacéutica o veterinariamente adecuado.

una composición para usar de acuerdo con la invención en el que el inyector sin aguja a chorro de líquido se

selecciona entre el dispositivo DERMAVAC® y otros inyectores sin aguja.

una composición para usar de acuerdo con la invención, en la que el vector es un plásmido.

una composición para usar de acuerdo con la invención, en la que el plásmido es un plásmido de ADN, en particular,

el plásmido de la SEQ ID NO: 8.

una composición para usar de acuerdo con la invención, en al que el animal es de la familia de los suidos.

una composición para usar de acuerdo con la invención, en la que dicha composición se formula para la

administración como una sola dosis a porcinos.

una composición para usar de acuerdo con la invención que comprende además un adyuvante, que es TS6.

una composición para usar de acuerdo con la invención, en la que el porcino es un lechón destetado de

aproximadamente 11 a aproximadamente 24 días de edad.

[0016] El objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo procedimiento de vacunación de un animal de la familia de los suidos, que sea eficiente, fácil y menos costosa de usar, y que conduzca a una mayor seguridad.

[0017] Este objetivo se cumple mediante la administración de una vacuna con ADN del virus del síndrome reproductor y respiratorio (VSRRP) porcino con la ayuda de un inyector sin aguja a chorro de líquido, asegurando una distribución de la vacuna esencialmente en la dermis y la hipodermis del animal.

[0018] Se describe en este documento un procedimiento de vacunación contra el VSRRP, que puede comprender la etapa administrar esencialmente en la dermis y la hipodermis de un animal de la familia de los suidos una cantidad eficaz de una vacuna con ADN de VSRRP utilizando un inyector sin aguja a chorro de líquido, cuya administración provoca una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP.

[0019] También se describe en el presente documento un kit o conjunto de vacunación que puede comprender dicho inyector sin aguja a chorro de líquido y al menos un vial de vacuna que contiene una vacuna con ADN de VSRRP, operativamente ensamblados para llevar a cabo la administración de la vacuna esencialmente en la dermis y la hipodermis de un animal de la familia de los suidos y para provocar una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP.

[0020] También se describe en el presente documento el uso de un vector de ADN que puede codificar y expresar al menos un inmunógeno de VSRRP y de un vehículo o diluyente aceptable, para la preparación de una vacuna líquida diseñada para ser administrada esencialmente en la dermis y la hipodermis de animales de la familia de los suidos utilizando un inyector sin aguja a chorro de líquido, y que provoca una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP.

[0021] Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos, tales como "comprende" "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no citados de manera explícita, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.

[0022] A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0023] Estas y otras realizaciones se describen o son evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y son abarcadas por la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0024] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, puede entenderse junto con las figuras adjuntas incorporadas en este documento por referencia, en las que:

La figura 1 ilustra el esquema de clonación para la producción de pORF7 (SEQ ID NO: 10) y pORF7t (SEQ ID NO: 11); se incluye un mapa de pBAD-ORF7 (SEQ ID NO: 13) y pMASIA (SEQ ID NO: 9);

la figura 2 presenta alineamientos de secuencias de aminoácidos de proteínas de la nucleocápside 1) US pMA C2 (SEQ ID NO: 15), pBAD (SEQ ID NO: 16), 01NP1.2 (SEQ ID NO: 17); y 2) 01NP1 (SEQ ID NO: 18) y ORF7t (SEQ ID NO: 4);

la figura 3 es una imagen en gel de agarosa que muestra la presencia o ausencia de productos de amplificación por PCR de genes de la nucleocápside de VSRRP (ORF7) para el gen de la nucleocápside de VSRRP (ORF7) en PBMC porcinas transfectadas con cualquiera de los plásmidos pORF7, pORF7t o pMASIA;

la figura 4 presenta un análisis de transferencia Western de las proteínas recombinantes producidas a partir del vector de expresión que contiene un fragmento de gen de ORF7 u ORF7t;

la figura 5 es una imagen en gel de agarosa que representa el análisis de restricción con NcoI de pMASIA, pORF7, y pORF7t;

la figura 6 presenta el plan de estudio de la vacunación con VSRRP, incluyendo la cronología de los eventos y la recogida de datos;

la figura 22A es una imagen que representa la técnica de inmunización de ADN intradérmica;

la figura 22B es una imagen que representa los sitios inyectados después de la inyección intradérmica;

la figura 23A es una imagen de gel que indica la presencia de VSRRp en las muestras de suero agrupadas durante

el experimento de los cerdos experimentales inmunizados con PBSA (P), el plásmido nulo (N), pORF7 (F), y pORF7t

(T);

la figura 23B es una imagen de gel indica la presencia de VSRRP en las muestras de tejido pulmonar agrupadas a los 10 días después de la infección de los cerdos experimentales inmunizados con PBSA (P), plásmido nulo (N), pORF7 (F), y pORF7t (T);

la figura 9A es un gráfico del número de IFNg+ específicos de VSSRP en las PBMC; la figura 9B es un gráfico del números de células IL-10+ en las PBMC; la figura 10A es un gráfico del número de CD4+CD25+ específicas de VSSRP en las PBMC; la figura 10B es un gráfico del número de células CD4+cD25+Foxp3+ (B) en las PBMC; la figura 11A presenta una visión general del plan experimental descrito en el Ejemplo 3; la figura 11B presenta pruebas clínicas realizadas durante el estudio;

la figura 12A es un gráfico del número de células IL-10+ específicas de VSRRP en las PBMC; la figura 12B es un gráfico del número de células IL-10+ específicas de VSRRP en la población de linfocitos; la figura 12C es un gráfico del número de células IFNg+ específicas de VSRRP en las PBMC; la figura 12D es un gráfico del número de células IFNg+ específicas de VSRRP en la población de linfocitos; los datos de la figura 12 representa un porcentaje promedio (± SEM) de las células productoras de citoquinas, obtenido mediante el porcentaje de las células productoras de citoquinas de las células cultivadas con VSRRP - el porcentaje de células productoras de citoquinas de las células cultivadas con lisado simulado. "a" indica la diferencia estadística de otros grupos, a p <0,05. "b" indica la diferencia estadística entre el plásmido pORF7t y el plásmido null, a p <0,05. "c" indica la diferencia estadística entre pORF7t y PBSA, a p <0,05. "d" indica la diferencia estadística entre nulo y PBSA, a p <0,05.

la figura 13A es un gráfico del número de células Foxp3+ específicas de VSRRP en las PBMC de los cerdos experimentales;

la figura 13B es un gráfico del número de células Foxp3+ específicas de VSRRP en la subpoblación de linfocitos CD4+CD25+ de las PBMC de los cerdos experimentales; los datos de las figuras 13 representan un porcentaje promedio (± SEM) de las células Foxp3+, obtenido mediante el porcentaje de las células Foxp3+ de las células cultivadas con VSRRP - el porcentaje de células Foxp3+ de las células cultivadas con lisado simulado. ("a" indica la diferencia estadística de otros grupos, a p <0,05. "b" indica la diferencia estadística entre el pORF7t y el plásmido nulo, a p <0,05.)

la figura 14A es un gráfico del número de células IL-10+ específicas de VSRRP en las PBMC;

la figura 14B es un gráfico del número de células IL-10+ específicas de VSRRP en la población de linfocitos (B);

la figura 14C es un gráfico del número de células IFNg+ específicas de VSRRP en las PBMC;

la figura 14D es un gráfico del número de células IFNg+ específicas de VSRRP en la población de linfocitos; los cerdos fueron vacunados con pORF7t, plásmido nulo o PBSA en d35, y se trasladaron a la unidad de acabado. Las muestras de PBMC porcinas recién aisladas se cultivaron con 0,1 m.o.i. de US-VSRRP (cepa 01NP1), lisado MARC- 145 infectado de forma simulada durante 48 horas antes de la tinción fluorescente y el análisis de citometría de flujo. Los datos representan el porcentaje promedio (± SEM) de las células productoras de citoquinas, obtenido mediante el porcentaje de las células productoras de citoquinas de las células cultivadas con VSRRP - el porcentaje de células productoras de citoquinas de las células cultivadas con lisado simulado. ("a" indica la diferencia estadística de otros

grupos, a p <0,05. "b" indica la diferencia estadística entre el pORF7t y el plásmido nulo, a p <0,05. "c" indica la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

diferencia estadística entre el pORF7t y PBSA, a p <0,05. d indica la diferencia estadística entre el nulo y PBSA, a p <0,05);

la figura 15A es un gráfico del número de células Foxp3+ específicas de VSRRP en las PBMC de los cerdos experimentales;

la figura 15B es un gráfico del número de células Foxp3+ específicas de VSRRP en la subpoblación de linfocitos CD4+CD25+ de las PBMC de los cerdos experimentales; los datos son el porcentaje promedio (± SEM) de las células Foxp3+, obtenido mediante el porcentaje de las células Foxp3+ de las células cultivadas con VSRRP - el porcentaje de células Foxp3+ de las células cultivadas con lisado simulado. (a indica la diferencia estadística de otros grupos, a p <0,05. b indica la diferencia estadística entre el pORF7t y el plásmido nulo, a p <0,05.) la figura 16 es un gráfico de respuestas de anticuerpos específicos de VSRRP, medidas por IDEXX ELISA la figura 17 es un gráfico de la carga viral de VSRRP en el suero de los cerdos experimentales en d43 la figura 18 son imágenes de los inyectores sin aguja que se utiliza en los cerdos;

la figura 19 son gráficos que representan el número de células Treg y IL-10+ de subpoblaciones de linfocitos en PBMC, aisladas de cerdos inmunizados con ORF7t-500 mg, ORF7t-200 mg, o Nulo-500 mg vía intradérmica, Pulse50, o Dermavac;

la figura 20 son gráficos que representan el número de células IFNg+ y CD8+IFNg+ de subpoblaciones de linfocitos en PBMC, aisladas de cerdos inmunizados con ORF7t-500 mg, ORF7t-200 mg, o Nulo-500 mg vía intradérmica, Pulse50, o Dermavac;

la figura 21 es una tabla resumen de la lista de identificación de secuencia;

la figura 22 Número de células CD4+CD25+FoxP3+ específicas de VSRRP (A), células IL-10+ (B), células CD4+CD25+ (C) y células IFNg+ (D) en una ventana de linfocitos, el números de IL-10+ específicos de VSRRP (E), IFNg+ (F) células de la subpoblación de linfocitos CD4+CD8+ de cerdos criados en el sistema de producción de VSRRP positivo. Los cerdos se inmunizaron con PBSA, plásmido nulo o pORF7t en d0 (VI) y d21 (V2), y a continuación se trasladaron al sitio de engorde en d35 (Movimiento). Las PBMC se cultivaron con VSRRP (01NP1) o lisado simulado durante 48 h antes del análisis citométrico de flujo. Los datos son el promedio ± SEM del % de las subpoblaciones de linfocitos activados con VSRRP, restado con el fondo obtenido a partir de las células cultivadas con lisado MARC-145. * Indica la diferencia estadística entre el grupo de vacunados con ADN y los grupos de control (p <0,05, ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey); la figura 23 es un gráfico que muestra la relación S/P entre el control y cerdos vacunados con pORF7t; la figura 24 es un gráfico de las puntuaciones de pulmón obtenidas de los cerdos experimentales; la figura 25 son gráficos que indican el número de células CD4+CD25+FoxP3+ espcíficas de VSRRP (A), células CD4+CD25+FoxP3+IL-10+ (B), células CD4+CD25+ (C) y célelas IFNg+ (D) en una ventana de linfocitos, el número de células IFNg+ específicas de VSRRP en las células CD4+CD8+ (E) subpoblaciónde CD8+ de cerdos criados en un sistema de producción de VSRRP negativo - ** indica la diferencia estadística entre el grupo de vacunados con ADN y los grupos de control (p <0,05 , ANOVA de una vía seguido de comparación múltiple de Tukey); la figura 26A es un gráfico que muestra el número de células FoxP3+ de los cerdos expuestos; los cerdos fueron vacunados con PBSA, el plásmido nulo, o pORF7t en d0 (V1) y d21 (V2), y estimulados (estim.) a d35. Los datos son la media ± SEM del % de las subpoblaciones de linfocitos activados con VSRRP, restados con el fondo obtenido a partir de las células cultivadas con lisado MARC-145. La media de las diferencias se consideraron significativas si p <0.05, utilizando ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Tukey (para la figura 22A, las medias de pORF7t y PBSA fueron significativamente diferentes).

la figura 26B es un gráfico que muestra el número de células CD4+CD25+FoxP3+ de los cerdos expuestos (pORF7t difería significativamente de cualquiera de los grupos inmunizados con plásmido nulo (pMASIA) o PBSA); la figura 26C es un gráfico que muestra el número de células CD4+CD25+FoxP3+IL-10+ de cerdos expuestos (pORF7t y el plásmido nulo diferían significativamente);

la figura 26D es un gráfico que muestra células IL-10+ en una ventana de linfocitos de cerdos expuestos; la figura 27A es un gráfico que muestra el % de células CD4+CD25+ en una ventana de linfocitos; Los cerdos fueron vacunados con PBSA, el plásmido nulo o pORF7t en d0 (VI) y d21 (V2), y estimulados (estim.) En d35 los datos son la media ± SEM del % de subpoblaciones de linfocitos activados por VSRRP, restados con el fondo obtenido a partir de las células cultivadas con lisado MARC-145;

la figura 27B es un gráfico que muestra el % de células productoras de IFNg en una ventana de linfocitos;

la figura 27C es un gráfico que muestra el % de células productoras de IFNg en una población de CD4+CD8+;

la figura 27D es un gráfico que muestra el % de células productoras de IFNg en una población de CD8+;

la figura 28A es un gráfico que muestra los niveles de carga viral en las muestras de suero; los cerdos fueron

vacunados con PBSA, plásmido nulo, pORF7 o pORF7t en d0 y d21 y se estimularon con US-VSRRP (cepa 01NP1)

en d35 (0 dpi). Se recogieron muestras de suero, pulmón y ganglios linfáticos traqueobronquiales en los días

indicados y se sometieron a la determinación de la cantidad de genoma de VSRRP mediante RT-PCR cuantitativa

(como se describe por Egli et al, 2001. J. Virol Methods 98: 63-75);

la figura 28B es un gráfico que muestra los niveles de carga viral en los pulmones;

la figura 28C es un gráfico que muestra el nivel de virus en los ganglios linfáticos traqueobronquiales;

la figura 29A es un gráfico de la carga viral después de la vacunación;

la figura 29B es un gráfico de la carga viral en el pulmón a las 10 y 21 ppp;

la figura 29C es un gráfico de la carga viral en los ganglios linfáticos a las 10 y 21 ppp.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0025] Se describe en el presente documento un procedimiento de vacunación contra el VSRRP, que comprende la etapa de administración, esencialmente en la dermis y la hipodermis de un animal de la familia de los suidos, de una cantidad eficaz de una vacuna de ADN de VSRRP utilizando un inyector sin aguja a chorro de líquido, cuya administración provoca una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP. "Esencialmente" significa que una parte de la vacuna también se puede encontrar en la epidermis o en los músculos.

[0026] Una respuesta inmunitaria protectora se caracteriza por una reducción significativa de la antigenemia después de la estimulación o por títulos significativos de anticuerpos neutralizantes. Una respuesta inmunitaria seguro se caracteriza por la limitación de los efectos secundarios relacionados con la administración de la vacuna, en particular por una reducción significativa o por la ausencia de reacción en el sitio de inyección local y por una reducción significativa o por la ausencia de síntomas, como la anorexia y la depresión después de la administración de la vacuna.

[0027] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cerdo" se refiere a un animal de origen porcino, en otras palabras, un animal de la familia de los suidos. El término "verraco" se refiere a un cerdo macho entero de unos seis meses de edad destinado como semental. El término "cerda joven" se refiere a una cerda hembra joven que no ha producido primera camada hasta el primer parto. El término "puerco" se refiere a un cerdo macho castrado. El término "lechones" se refiere a un cerdo joven. El término "cerdito" se refiere a una raza de raza de cerdos para buenos cortes de carne de cerdo. El término "stores" se refiere a un cerdo que puede ser de aproximadamente 10-12 semanas de edad. El término "cerda" se refiere a una hembra en edad reproductiva y la capacidad o una cerda después de que ha tenido su primera camada. El término "lechones destetados" o "destete" se refiere a un cerdo joven que puede ser alrededor de 11 a alrededor de 24 días de edad, alrededor de dos a tres semanas de edad, de tres a cinco semanas de edad o alrededor de cinco a ocho semanas de edad.

[0028] Tal como se utiliza en este documento, el término "virulenta" significa un aislado que mantiene su capacidad de ser infeccioso en un animal huésped.

[0029] Tal como se utiliza en este documento, el término "vacuna inactivada" significa una composición de vacuna que contiene un organismo infeccioso o patógeno que ya no es capaz de replicación o crecimiento. El patógeno puede ser bacteriano, viral, de protozoo o fúngico en origen. La inactivación se puede realizar mediante una variedad de procedimientos, incluyendo congelación-descongelación, tratamiento químico (por ejemplo, tratamiento con timerosal o formalina), sonicación, radiación, calor o cualquier otro medio de convención suficiente para evitar la replicación o crecimiento del organismo mientras se mantiene su inmunogenicidad.

[0030] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "respuesta inmunitaria" se refiere a una respuesta provocada en un animal. Una respuesta inmunitaria se puede referir a inmunidad celular (CMI); inmunidad humoral o puede implicar a ambos. La presente invención también contempla una respuesta limitada a una parte del sistema inmunológico. Por ejemplo, una composición de vacuna de la presente invención puede inducir específicamente una mayor respuesta de interferón gamma.

[0031] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "antígeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un polinucleótido que codifica un inmunógeno, capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentación a un animal huésped; una proteína, un polipéptido, un péptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos.

[0032] Tal como se utiliza en este documento, el término "multivalente" significa una vacuna que contiene más de un antígeno de diferentes géneros o especies de microorganismos (por ejemplo, una vacuna que comprende antígenos de Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus y Clostridium).

[0033] Tal como se utiliza en este documento, el término "adyuvante" significa una sustancia añadida a una vacuna para aumentar la inmunogenicidad de una vacuna. El mecanismo de cómo opera un adyuvante no se conoce por completo. Algunos adyuvantes se cree que aumentan la respuesta inmunitaria mediante la liberación lenta del antígeno, mientras que otros adyuvantes presentan el inmunógeno al sistema inmunitario del huésped de manera más eficiente o efectiva o estimulan la producción de citoquinas específicas.

[0034] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "portador farmacéuticamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable" son intercambiables y se refieren a un vehículo fluido para contener antígenos de vacuna que se pueden inyectar en un huésped sin efectos adversos. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, agua estéril, solución salina, glucosa, dextrosa o soluciones tamponadas. Los portadores pueden incluir agentes auxiliares que incluyen, pero no se limitan a, diluyentes, estabilizantes (es decir, azúcares y aminoácidos), conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes tamponantes del pH, aditivos potenciadores de la viscosidad, colores y similares.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0035] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "composición de vacuna" incluye al menos un antígeno o inmunógeno en un vehículo farmacéuticamente aceptable útil para inducir una respuesta inmunitaria en un huésped. Las composiciones de vacuna se pueden administrar en dosis y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las técnicas médica o veterinaria, teniendo en cuenta factores, tales como edad, sexo, peso, especie y condición del animal receptor, y la vía de administración. La vía de administración puede ser percutánea por ejemplo, intradérmica, intramuscular, subcutánea. Las composiciones de vacuna se pueden administrar solas, o se pueden administrar conjuntamente o se puedne administrar secuencialmente con otros tratamientos o terapias. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, adyuvantes o aditivos potenciadores de la viscosidad, conservantes, colores y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. Pueden consultarse textos farmacéuticos estándar, tales como "Remingtons Pharmaceutical Sciences", 1990 para preparar preparaciones adecuadas, sin gran experimentación.

[0036] La presente invención abarca además una proteína ORF7 de VSRRP truncada que consiste en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 85% de homología de la misma contenida en una molécula de vector o un vector de expresión y unida operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un promotor para usar en un procedimiento para provocar en un animal una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP, comprendiendo el procedimiento administrar por vía transdérmica una cantidad eficaz de la composición que comprende el vector utilizando un inyector sin aguja a chorro de líquido. En una realización, el vector es pMASIA.

[0037] En una realización, el promotor es el promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV). En otra realización ventajosa, los elementos promotores y/o potenciadores son inducibles con oxígeno. Ejemplos de promotores y/o potenciadores inducibles con oxígeno que se pueden utilizar en los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, promotor de respuesta de crecimiento temprano 1 (Egrl) (véase, por ejemplo, Park et al., J Clin Invest 2002 Aug; 110 (3): 403-1), potenciadores inducibles por el factor inducible por hipoxia (HIF) (véase, por ejemplo, Cuevas et al, Cancer Res 2003 Oct 15; 63 (20): 6877-84) y promotores de Mn- superóxido dismutasa (Mn-SOD) (véase, por ejemplo, Gao et al, Gene 17 Oct 1996; 176 (1-2): 269-70).

[0038] En otra realización, los potenciadores y/o promotores incluyen diversos promotores específicos de células o tejidos (por ejemplo, músculo, células endoteliales, hígado, células somáticas o células madre), diversos promotores y potenciadores virales y diversas secuencias de inmunógeno de VSRRP isogénicamente específico para cada especie animal. Los ejemplos de promotores y potenciadores específicos de músculo que han sido descritos son conocidos para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Li et al, Gene Ther 1999 Dec; 6 (12): 2005-11; Li et al, Nat Biotechnol 1999 Mar; 17 (3): 241-5 y Loirat et al, Virology 1999 Jul 20; 260 (1): 74-83).

[0039] Los promotores y potenciadores que se pueden emplear en la presente invención incluyen, pero no se limitan a LTR o el virus del sarcoma de Rous, TK de HSV-1, promotor temprano o tardío de SV40, promotor mayor tardío de adenovirus (MLP), fosfoglicerato quinasa, metalotioneína, a-1 antitripsina, albúmina, colagenasa, elastasa I, b- actina, b-globina, g-globina, a-fetoproteína, creatina quinasa muscular.

[0040] Un "vector" se refiere a un plásmido o virus de ADN o ARN recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo a liberar en una célula diana, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para los propósitos de terapia, y opcionalmente puede estar en forma de un casete de expresión. Tal como se utiliza en este documento, un vector no tiene que ser capaz de replicación en la célula o sujeto diana final. El término incluye vectores de clonación. También se incluyen vectores virales.

[0041] El término "recombinante" significa un polinucleótido de origen semisintético o sintético que, o bien no se produce en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.

[0042] "Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido, se puede colocar mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0043] Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificación adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o un promotor diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier constructo que pueda ser deseable para proporcionar realizaciones de esta invención.

[0044] La presente invención abarca un vector que expresa una proteína ORF7 de VSRRP truncada que consiste en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos 85% de homología a la misma para su uso en un procedimiento para provocar en un animal una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

comprendiendo el procedimiento administrar por vía transdérmica una cantidad eficaz de la composición que comprende el vector utilizando un inyector sin aguja a chorro de líquido. Elementos para la expresión de un inmunógeno de VSRRP están ventajosamente presentes en un vector de la invención. De una manera mínima, comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un codón de iniciación (ATG), un codón de parada y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores, tales como plásmidos, y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos de los virus de la viruela. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de poliproteína, por ejemplo, un inmunógeno de VSRRP, ventajosamente, en el vector, un ATG se coloca en 5' del marco de lectura y un codón de parada se coloca en 3'. Otros elementos de control de la expresión pueden estar presentes, tales como secuencias potenciadoras, secuencias estabilizantes, tales como secuencias de intrones y señal que permiten la secreción de la proteína.

[0045] Los procedimientos para fabricar y/o administrar un vector o recombinantes o plásmido para la expresión de

productos génicos de genes, ya sea in vivo o in vitro, pueden ser cualquier procedimiento deseado, por ejemplo, un procedimiento que es por o análogo a los procedimientos descritos o dados a conocer en los documentos citados en: patentes de Estados Unidos Nos. 4.603.112; 4.769.330; 4.394.448; 4.722.848; 4.745.051; 4.769.331; 4.945.050; 5.494.807; 5.514.375; 5.744.140; 5.744.141; 5.756.103; 5.762.938; 5.766.599; 5.990.091; 5.174.993; 5.505.941;

5.338.683; 5.494.807; 5.591.639; 5.589.466; 5.677.178; 5.591.439; 5.552.143; 5.580.859; 6.130.066; 6.004.777;

6.130.066; 6.497.883; 6.464.984; 6.451.770; 6.391.314; 6.387.376; 6.376.473; 6.368.603; 6.348.196; 6.306.400;

6.228.846; 6.221.362; 6.217.883; 6.207.166; 6.207.165; 6.159.477; 6.153.199; 6.090.393; 6.074.649; 6.045.803;

6.033.670; 6.485.729; 6.103.526; 6.224.882; 6.312.682; 6.348.450 y 6.312.683; la solicitud de patente US No. de serie 920.197, presentada el 16 de octubre de 1986; WO 90/01543; WO91/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0370573; Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 11313-11.318; Ballay et al, EMBO J. 1993; 4: 3861-65; Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994; 269: 2550-2561; Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 11371-11377; Graham, Tibtech 1990; 8: 85-87; Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992; 3: 237-52; Ju et al, Diabetologia 1998; 41: 736-739; Kitson et al., J. Virol. 1991; 65: 3068-3075; McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 11414-11420; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 11341-11348; Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 11.349-11.353; Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984; 4: 399-406; Richardson (Ed), Methods in molecular biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols", Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3: 2156-2165; Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 11334-11340; Robinson et al., Sem. Immunol. 1997; 9: 271; y Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 11307-11312. Por lo tanto, el vector de la invención puede ser cualquier virus recombinante o vector de virus adecuado, tal como un virus de la viruela (por ejemplo, virus vaccinia, virus de la viruela ave de corral, virus de la viruela del canario, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.), adenovirus (por ejemplo, adenovirus humano, adenovirus canino), virus herpes (por ejemplo, virus herpes canino), baculovirus, retrovirus, etc.; o el vector puede ser un plásmido. Los documentos citados en este documento, además de proporcionar ejemplos de vectores útiles en la práctica de la invención, pueden también proporcionar fuentes de inmunógenos no de VSRRP, por ejemplo, inmunógenos no VSRRP, péptidos no inmunógenos de VSRRP o fragmentos de los mismas, citoquinas, etc. a expresar por el vector o vectores en, o incluidos en, las composiciones de la invención.

[0046] Se describen en el presente documento preparaciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresión, por ejemplo, composiciones terapéuticas. Las preparaciones pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en (y que expresan ventajosamente) uno o más de los inmunógenos de VSRRP. Ventajosamente, el vector contiene y expresa un polinucleótido que incluye, consiste esencialmente en, o consiste en una región codificante que codifica una o más inmunógenos de VSRRP, un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. Por lo tanto, el otro vector o vectores en la preparación comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polinucleótido que codifica, y bajo circunstancias apropiadas, el vector expresa una o más de otras proteínas de un inmunógeno de VSRRP o un fragmento del mismo.

[0047] El vector o vectores en la preparación comprenden, o consisten esencialmente en, o consisten en un polinucleótido o polinucleótidos que codifican una o más proteínas o fragmento o fragmentos de las mismas de un inmunógeno de VSRRP, el vector o vectores tienen la expresión del polinucleótido o polinucleótidos. La preparación ventajosamente comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, al menos dos vectores que comprenden, consisten esencialmente en, o consiste en, y ventajosamente también expresan, ventajosamente in vivo bajo condiciones apropiadas o condiciones adecuadas o en una célula huésped adecuada, los polinucleótidos de diferentes aislados de VSRRP que codifican las mismas proteínas y/o proteínas diferentes, pero ventajosamente las mismas proteínas. Las preparaciones contienen uno o más vectores que contienen, consisten esencialmente en o consiste en los polinucleótidos que codifican, y ventajosamente expresan, ventajosamente in vivo, el péptido de VSRRP, proteína de fusión o un epítopo del mismo.

[0048] De acuerdo con una realización de la invención, el vector de expresión es un vector de ADN, en particular un vector de expresión in vivo.

[0049] En una realización particular, el vector viral es un virus de la viruela, por ejemplo, un virus vaccinia o un virus de vaccinia atenuado, (por ejemplo, MVA, una cepa de Ankara modificada obtenida después de más de 570 pasajes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de la cepa de la vacuna de Ankara sobre fibroblastos de embrión de pollo; ver Stickl y Hochstein-Mintzel, Munch Med Wschr, 1971, 113, 1149-1153; Sutter et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89, 10847-10851; disponible como ATCC VR-1508; o NYVAC, véase la patente de Estados Unidos No. 5.494.807, por ejemplo, los Ejemplos 1 a 6 y la secuencia de la patente de Estados Unidos No. 5.494.807 que discuten la construcción de NYVAC, así como las variaciones de NYVAC con ORFs adicionales eliminados del genoma del virus vaccinia de cepa de Copenhagen, así como la inserción de moléculas de ácidos nucleicos codificantes heterólogas en los sitios de este recombinante, y también, el uso de promotores emparejados; véase también el documento WO96/40241), un virus de la viruela aviar o un virus de la viruela aviar atenuado (por ejemplo, viruela del canario, viruela de ave de corral, viruela de tórtola, viruela de la paloma, viruela de codorniz, ALVAC o TROVAC; véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5505941, 5494807), viruela porcina, viruela de mapache, viruela del camello o virus de mixomatosis.

[0050] De acuerdo con otra realización de la invención, el vector de virus de la viruela es un vector de virus de viruela del canario o un vector de virus de la viruela de ave de corral, ventajosamente un virus de la viruela del canario o virus de la viruela de ave de corral atenuados. En este respecto, se hace referencia a la viruela del canario disponible en la ATCC bajo el número de acceso VR-111. El virus de canario atenuado se describe en la patente de Estados Unidos N° 5.756.103 (ALVAC) y el documento WO01/05934. Las numerosas cepas de vacunación del virus de la viruela de aves de corral también están disponibles, por ejemplo, la cepa DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL y la vacuna NOBILIS VARIOLE comercializadas por INTERVET; y, también se hace referencia a la patente de Estados Unidos N° 5.766.599 que se refiere a la cepa de la viruela de ave de corral atenuada TROVAC.

[0051] Para obtener información sobre el procedimiento para generar recombinantes del mismo y cómo administrar recombinantes del mismo, el experto puede referirse a los documentos citados en el presente documento y a WO90/12882, por ejemplo, en cuanto al virus vaccinia se hace mención de las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807, y 5.762.938, entre otras; en cuanto a la viruela de ave de corral, se hace mención de las patentes de Estados Unidos Nos. 5.174.993, 5.505.941 y US-5.766.599, entre otras; en cuanto a la viruela del canario se hace mención de la patente de Estados Unidos No. 5.756.103, entre otras; en cuanto a la viruela porcina se hace mención de la patente de Estados Unidos No. 5.382.425, entre otras; y, en cuanto al mapache, se hace mención del documento WO00/03030, entre otros.

[0052] Cuando el vector de expresión es un virus vaccinia, los sitio o sitios de inserción para el polinucleótido o polinucleótidos a expresar están ventajosamente en el gen o sitio de inserción de la timidina quinasa (TK), el gen o sitio de inserción de la hemaglutinina (HA), la región que codifica el cuerpo de inclusión de tipo A (ATI); véanse también los documentos citados en este documento, especialmente los relacionados con el virus vaccinia. En el caso de la viruela del canario, ventajosamente el sitio o sitios de inserción son el ORF u ORFs C3, C5 y/o C6; véanse también los documentos citados en el presente documento, especialmente aquellos relativos al virus de la viruela del canario. En el caso de la viruela de ave de corral, ventajosamente el sitio o sitios de inserción son los ORF F7 y/o F8; véanse también los documentos citados en el presente documento, especialmente aquellos relativos al virus de la viruela de ave de corral. El sitio o sitios de inserción para el virus MVA son ventajosamente como en varias publicaciones, incluyendo Carroll MW et al, Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394.; Stittelaar KJ et al, J. Virol, 2000, 74 (9), 4.236-4.243; Sutter G. et al, 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040.; y, en este sentido también se observó que el genoma de MVA completo se describe en Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, que permite al experto en la técnica usar otros sitios de inserción u otros promotores.

[0053] Ventajosamente, el polinucleótido que se expresa se inserta bajo el control de un promotor de virus de la viruela específico, por ejemplo, el promotor de vaccinia de 7,5 kDa (Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), el promotor de vaccinia i3l (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), el promotor de vaccinia HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), el promotor de la viruela de vaca ATI (Funahashi et al., J. Gen. Virol, 1988, 69, 3547), el promotor de vaccinia H6 (Taylor J. et al, Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al J. Virol, 1989, 63 , 41894198; Perkus M. et al, J. Virol, 1989, 63, 3829-3836), entre otros.

[0054] En una realización, el vector viral es un adenovirus, tal como un adenovirus humano (HAV) o un adenovirus canino (CAV).

[0055] En una realización, el vector viral es un adenovirus humano, en particular un adenovirus de serotipo 5, que resultó incompetente para la replicación por una deleción en la región E1 del genoma viral, en particular desde aproximadamente el nucleótido 459 hasta aproximadamente el nucleótido 3510 por referencia a la secuencia de hAd5 descrita en Genbank con el número de acceso M73260 y en la publicación de referencia J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285. El adenovirus suprimido se propaga en 293 que expresa E1 (F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72) o células PER, en particular PeR.c6 (F. Falloux et al Human Gene Teraphy 1998, 9, 19091917). El adenovirus humano puede ser suprimido en la región E3, en particular desde aproximadamente el nucleótido 28592 hasta aproximadamente el nucleótido 30470. La deleción en la región E1 se puede realizar en combinación con una deleción en la región E3 (véase, por ejemplo J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol: 7 Gene transfer y expression protocols, editado por E. Murray, The Human Press Inc, 1991, pág. 109-128; Y. Ilan et al Proc Natl Acad Sci 1997, 94, 2587-2592; US 6133028; US 6692956; S. Tripathy et al Proc Natl Acad Sci 1994, 91, 11.557-11561; B. Tapnell Adv. Drug Deliv Rev.1993, 12, 185-199; X Danthinne et al Gen Therapy 2000, 7, 1707-1714; K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629; K.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Berkner et al Nucí Acid Res. 1983, 11, 6003-6020; C. Chavier et al J. Virol 1996, 70, 4805-4810). Los sitios de inserción pueden ser los locus (región) E1 y/o E3 opcionalmente después de una supresión parcial o completa de las regiones E1 y/o E3. Ventajosamente, cuando el vector de expresión es un adenovirus, el polinucleótido que va a expresarse se introduce bajo el control de un promotor funcional en células eucariotas, tal como un promotor fuerte, preferentemente un promotor del gen inmediato temprano de citomegalovirus (promotor CMV-IE), en particular la región potenciadora/promotora desde aproximadamente el nucleótido -734 hasta aproximadamente el nucleótido +7 en M. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530 o la región potenciadora/promotora del vector pCI de Promega Corp. El promotor CMV-IE es ventajosamente de origen murino o humano. También se puede utilizar el promotor del factor 1a de elongación. En una realización particular, se puede utilizar un promotor regulado por la hipoxia, por ejemplo, el promotor HRE se describe en K. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208). También se puede utilizar un promotor específico de músculo (X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245). También se discuten en este documento promotores fuertes en relación con vectores plasmídicos. En una realización, una secuencia de empalme puede estar situada en dirección 3' de la región potenciadora/promotora. Por ejemplo, el intrón 1 aislado del gen de CMV-IE (R. Stenberg et al J. Virol. 1984, 49, 190), el intrón aislado del gen de b-globina humana o de conejo, en particular, el intrón 2 del gen b-globina, el intrón aislado del gen de inmunoglobulina, una secuencia de corte y empalme del gen temprano de SV40 o la secuencia de intrón quimérica aislada del vector pCI de Promega Corp. que comprende la secuencia donante de b-globina humana fusionada a la secuencia aceptora de inmunoglobulina de ratón (desde aproximadamente el nucleótido 890 hasta aproximadamente el nucleótido 1022 en el Genbank con el número de acceso CVU47120). Se pueden insertar una secuencia de poli (A) y secuencia terminadora en dirección 3' del polinucleótido a expresar, por ejemplo, una señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovina, en particular desde aproximadamente el nucleótido 2339 hasta aproximadamente el nucleótido 2550 en el Genbank bajo el número de acceso BOVGHRH, del gen de b-globina de conejo o de genes tardíos de SV40.

[0056] En otra realización, el vector viral es un adenovirus canino, en particular un CAV-2 (véase, por ejemplo, L. Fischer et al Vaccine, 2002, 20, 3.485-3.497; Patente de Estados Unidos N° 5.529.780; Patente de Estados Unidos No. 5.688.920; solicitud PCT No. WO95/14102). Para CAV, los sitios de inserción pueden ser en la región E3 y/o en la región situada entre la región E4 y la región ITR derecha (véase la patente de Estados Unidos No. 6.090.393; patente de Estados Unidos No. 6.156.567). En una realización, el inserto está bajo el control de un promotor, tal como un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (promotor CMV-IE) o un promotor ya descrito para un vector de adenovirus humano. Se pueden insertar una secuencia de poli(A) y terminadora en dirección 3' del polinucleótido que se expresa, por ejemplo, una señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovino o del gen de -globina de conejo.

[0057] En otra realización particular, el vector viral es un virus del herpes, tal como un virus del herpes canino (CHV) o un virus del herpes porcino (FHV). Para CHV, los sitios de inserción pueden ser en particular en el gen de timidina quinasa, en el oRF3, o en el ORF UL43 (véase la patente de Estados Unidos No. 6.159.477). En una realización, el polinucleótido que va a expresarse se introduce bajo el control de un promotor funcional en células eucariotas, ventajosamente un promotor CMV-IE (murino o humano). En una realización particular, se puede utilizar un promotor regulado por hipoxia, por ejemplo, el promotor HRE se describe en K. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208). Se pueden insertar una secuencia de poli(A) y terminadora en dirección 3' del polinucleótido que se expresa, por ejemplo, una señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovino o del gen de - globina de conejo.

[0058] Según una realización adicional de la invención, el vector de expresión es un vector plásmido o un vector plásmido de ADN, en particular un vector de expresión in vivo. En un ejemplo no limitativo específico, se puede utilizar el plásmido pVR1020 o 1012 (VICAL Inc.; Lucas C. et al, Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al, Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.846.946 y 6.451.769) como vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El plásmido pVR1020 deriva de pVR1012 y contiene la secuencia de señal tPA humana. En una realización, la señal tPA humana comprende desde el aminoácido M(1) al aminoácido S(23) en el Genbank bajo el número de acceso HUMTPA14. En otro ejemplo no limitativo específico, el plásmido utilizado como vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos puede contener la secuencia de péptido señal de IGF1 equino desde el aminoácido M(24) al aminoácido A(48) en el Genbank con el número de acceso U28070. Información adicional sobre plásmidos de ADN que pueden ser consultados o empleados en la práctica se encuentran, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 y 6.221.362.

[0059] El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o diana deseada; y, en este sentido, se observa que un plásmido circular, superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal, se pretende que estén dentro del alcance de la invención.

[0060] Cada plásmido comprende o contiene o consiste esencialmente en, además del polinucleótido que codifica el inmunógeno de VSRRP o una variante, análogo o fragmento del mismo, unido operativamente a un promotor o bajo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en células eucariotas. El promotor fuerte preferido es el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o murino, o que tiene opcionalmente otro origen, tal como rata o cobaya. El promotor CMV-IE puede comprender la parte del promotor real, que puede o no estar asociada con la parte potenciadora. Se puede hacer referencia a EP-A-260 148, EP-A-323 597, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.168.062, 5.385.839, y 4.968.615, así como a la solicitud PCT No WO87/03905. El promotor CMV-IE es ventajosamente un CMV-IE humano (Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530) o CMV-IE murino.

[0061] En términos más generales, el promotor tiene un origen viral o un origen celular. Un promotor fuerte viral distinto del CMV-IE que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor fuerte celular que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344), o el promotor de actina (Miyazaki J. et al., gene, 1989, 79, 269-277).

[0062] Los fragmentos subfuncionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantienen una actividad promotora adecuada, se incluyen dentro de la presente invención, por ejemplo promotores CMV-IE truncados, según la solicitud de PCT No. WO98/00166 o la patente de Estados Unidos N° 6.156.567, se pueden utilizar en la práctica de la invención. Un promotor en la práctica de la invención incluye, por consiguiente, derivados y subfragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y por lo tanto funcionan como un promotor, promoviendo preferentemente una actividad sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud completa del que deriva el derivado o subfragmento, por ejemplo, similar a la actividad de los promotores CMV-IE truncados de la patente de Estados Unidos N° 6.156.567 o la actividad de promotores de CMV-IE longitud completa. Por lo tanto, un promotor CMV-IE en la práctica de la invención puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en la porción de promotor del promotor de longitud completa y/o la porción potenciadora del promotor de longitud completa, así como los derivados y subfragmentos.

[0063] Preferiblemente, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente en otros elementos de control de expresión. Es particularmente ventajoso incorporar una secuencia o secuencias de estabilización, por ejemplo, una secuencia o secuencias intrón, preferiblemente el primer intrón del hCMV-IE (Solicitud PCT N. WO89/01036), el intrón II del gen de la b-globina de conejo (van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344).

[0064] En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de los virus de la viruela, se pueden utilizar más la señal de poli (A) del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (ver patente de Estados Unidos No. 5.122.458) o la señal de poli (A) del gen de b-globina de conejo o la señal de poli (A) del virus SV40.

[0065] De acuerdo con otra realización de la invención, los vectores de expresión son vectores de expresión usados para la expresión in vitro de proteínas en un sistema celular apropiado. Las proteínas expresadas pueden recogerse en o del sobrenadante de cultivo después, o no después, de la secreción (si no hay secreción, normalmente se produce o se lleva a cabo una lisis celular), opcionalmente se concentran mediante procedimientos de concentración, tales como ultrafiltración, y/o se purifican mediante medios de purificación, tales como procedimientos de cromatografía de tipo afinidad, intercambio iónico o filtración en gel.

[0066] Las células huésped que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células musculares, queratinocitos, mioblastos, células de ovario de hámster chino (CHO), células vero, BHK21, células Sf9, y similares. Se entiende por un experto en la técnica que las condiciones para cultivar una célula huésped varían según el gen particular y que la experimentación de rutina es necesaria a veces para determinar las condiciones óptimas para el cultivo de un VSRRP dependiendo de la célula huésped. Por ejemplo, el vector que codifica un inmunógeno de VSRRP puede ser transformado en mioblastos (que pueden obtenerse a partir de tejido muscular del animal en necesidad de tratamiento) y los mioblastos transformados puede ser trasplantados al animal. En otro ejemplo, los queratinocitos también pueden transformarse con un vector que codifica un inmunógeno de VSRRP y se trasplantan en el animal, lo que resulta en la secreción de un inmunógeno de VSRRP en circulación.

[0067] Una "célula huésped" se refiere a una célula procariota o eucariota que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente modificadas, el término se refiere tanto a la célula alterada originalmente como a la progenie de la misma.

[0068] Los polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada pueden ser insertados en un vector de clonación o expresión adecuado, y el vector a su vez se puede introducir en una célula huésped adecuada para la replicación y amplificación. Los polinucleótidos pueden introducirse en células huésped mediante cualquier medio conocido en la técnica. Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquiera de una serie de medios adecuados, incluyendo captación directa, endocitosis, transfección, f-apareamiento, electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE dextrano, u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (cuando el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

vector es infeccioso, por ejemplo, un vector retroviral). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula huésped.

[0069] En el presente documento se describe la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para el suministro y expresión de un inmunógeno de VSRRP en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es experimentación rutinaria para un experto ordinario en la técnica. La composición para usar según la presente invención puede comprender un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un inmunógeno de VSRRP y un vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable y un adyuvante. En una realización ventajosa, el portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección y/o mejora la conservación del vector o proteína.

[0070] Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0,9% (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otros portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden utilizar para los procedimientos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilitan la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro); ventajosamente, el portador, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y volúmenes de dosis se describen en el presente documento en la descripción general y también pueden ser determinadas por el experto en la materia a partir de esta descripción en relación con el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0071] Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son ventajosamente, pero no exclusivamente, adecuados para plásmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente fórmula:

CH,

| +

R—O-CH—CH-CH—N—R—X

OR ChL

1 á

en la que R1 es una radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo, DMRIE. En otra realización, el lípido catiónico puede estar asociado con un lípido neutro, por ejemplo, DOPE.

[0072] Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)- 1-propano amonio; WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil- fosfatidil-etanol amina; Behr JP, 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), para formar DMRIE-DOPE.

[0073] Ventajosamente, la mezcla de plásmido con el adyuvante se forma de manera extemporánea y ventajosamente simultáneamente con la administración de la preparación o poco antes de la administración de la preparación; por ejemplo, poco antes o antes de la administración, se forma la mezcla de plásmido-adyuvante, de manera ventajosa a fin de dar tiempo suficiente antes de la administración de la mezcla para formar un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración.

[0074] Cuando DOPE está presente, la relación molar DMRIE:DOPE es ventajosamente de aproximadamente 95:aproximadamente 5 a aproximadamente 5:aproximadamente 95, más ventajosamente de aproximadamente 1:aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.

[0075] La proporción en peso de adyuvante:plásmido DMRIE o DMRIE-DOPE puede ser de entre aproximadamente 50:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 5, y ventajosamente aproximadamente 1:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2.

[0076] Los polímeros de ácido acrílico o metacrílico son preferiblemente reticulados, en particular con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, No. 2, junio de 1996). Los expertos en la técnica también pueden hacer referencia a US-A- 2.909.462 que describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, siendo los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos reemplazados por radicales alifáticos insaturados que tiene al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

vendidos bajo el nombre Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alil sacarosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos, pueden mencionarse el CARBOPOL® 974P, 934P y 971P.

[0077] Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo, se prefieren los copolímeros EMA® (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, que son lineales o reticulados, por ejemplo, reticulados con divinil éter. Se hace referencia a J. Fields et al, Nature, 186: 778-780, 4 Jun 4 1960.

[0078] Las proporciones de adyuvante que son útiles son bien conocidas y están fácilmente disponibles para el experto en la técnica. A modo de ejemplo, la concentración de los polímeros de ácido acrílico o metacrílico o de copolímeros de ácido maleico y alquenilo en la composición de vacuna final será de 0,01% a 1,5% p/v, más particularmente de 0,05 a 1% p/v, preferiblemente de 0,1 a 0,4% p/v.

[0079] Opcionalmente, la vacuna utilizada de acuerdo con el procedimiento de la invención puede contener una citoquina. La citoquina puede estar presente como una proteína o como un gen que codifica esta citoquina insertado en un vector viral recombinante. Las citoquinas pueden seleccionarse entre las citoquinas porcinas, por ejemplo, interleucina 18 porcina (fIL-18) (Taylor S. et al., DNA Seq., 2000, 10 (6), 387-394), fIL-16 (Leutenegger cM et al, DNA Seq, 1998, 9 (1), 59-63), fIL-12 (Fehr D. et al, DNA Seq, 1997, 8 (1-2), 77-82; Imamura T. et al., J. Vet. Med. Sci., 2000, 62 (10), 1079-1087) y GM-CSF porcino (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos) (GenBank AF053007).

[0080] En una realización específica, la composición farmacéutica se administra directamente in vivo, y el producto codificado se expresa por el vector en el huésped. Los procedimientos de liberación in vivo de un vector que codifica un inmunógeno de VSRRP pueden modificarse para liberar el inmunógeno de VSRRP de la presente invención a un animal porcino. La liberación in vivo de un vector que codifica el inmunógeno de VSRRP descrito en este documento puede llevarse a cabo por un experto en la técnica según las enseñanzas de las referencias mencionadas anteriormente.

[0081] Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas y/o terapéuticas y/o formulaciones según la invención comprenden o consisten esencialmente en o consisten en una cantidad eficaz para provocar una respuesta terapéutica de uno o más vectores de expresión y/o polipéptidos descritos en el presente documento; y, puede determinarse una cantidad eficaz a partir de esta descripción y el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0082] En el caso de composiciones terapéuticas y/o farmacéuticas a base de un vector de plásmido, una dosis puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en, en términos generales, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2000 mg, ventajosamente de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 1000 mg y más ventajosamente de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 800 mg de plásmido que expresa un inmunógeno de VSRRP. Cuando las composiciones terapéuticas y/o farmacéuticas a base de un vector de plásmido se administran con la electroporación, la dosis de plásmido es generalmente entre aproximadamente 0,1 mg y 1 mg, ventajosamente entre aproximadamente 1 mg y 100 mg, ventajosamente entre aproximadamente 2 mg y 50 mg. Los volúmenes de dosis pueden estar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2 ml, ventajosamente entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1 ml. Estas dosis y los volúmenes de dosis son adecuados para el tratamiento de felinos y otras especies de mamíferos diana, tales como equinos y caninos.

[0083] La composición terapéutica y/o farmacéutica contiene por dosis de aproximadamente 104 a aproximadamente 1011, ventajosamente de aproximadamente 105 a aproximadamente 1010 y más ventajosamente de aproximadamente 106 a aproximadamente 109 partículas virales del adenovirus recombinante que expresa un inmunógeno de VSRRP. En el caso de composiciones terapéuticas y/o farmacéuticas a base de un virus de la viruela, una dosis puede estar entre aproximadamente 102 pfu y aproximadamente 109 pfu. La composición farmacéutica contiene por dosis de aproximadamente 105 a 109, ventajosamente de aproximadamente 106 a 108 pfu de virus de la viruela o recombinante herpesvirus que expresa un inmunógeno de VSRRP.

[0084] El volumen de dosis de composiciones de las especies diana que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de dosis de composiciones de porcino, basadas en vectores virales, por ejemplo, composiciones basadas en vectores virales no virus de la viruela, es generalmente de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2,0 ml, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0 ml, y más preferiblemente entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 1,0 ml.

[0085] Se debe entender por un experto en la técnica que la presente descripción se proporciona a modo de ejemplo y la presente invención no se limita a ésta. A partir de la descripción de este documento y el conocimiento en la técnica, el experto puede determinar el número de administraciones, la vía de administración, y las dosis a utilizar para cada protocolo de inyección, sin gran experimentación.

[0086] La presente invención contempla al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica fabricada de acuerdo con la invención. El animal puede ser macho, hembra, hembra embarazada y recién nacido. Esta administración puede ser a través de diversas rutas incluyendo, pero no limitado

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

a, intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o mediante administración intranasal o por vía oral. La composición terapéutica de acuerdo con la invención también se puede administrar mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo, con un aparato Pigjet, Biojector o Vitajet (Bioject, Oregon, EE.UU.)). Otro enfoque para administrar composiciones de plásmido es usar electroporación (véase, por ejemplo S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen et al. Scand J. Immunol, 2003, 57, 229-238; S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3.399-3.408; Solicitud PCT No. WO99/01158). Tal como se describe en el presente documento el plásmido puede administrarse al animal mediante pistola de genes o bombardeo de partículas de oro. En una realización ventajosa, el animal es un vertebrado. En una realización más ventajosa, el vertebrado es un gato.

[0087] Los inyectores sin aguja a chorro de líquido son dispositivos que realizan inyecciones de una cierta cantidad de líquido a alta presión a través de un orificio diminuto. Las especificaciones mecánicas del inyector pueden ajustarse o seleccionarse a fin de controlar la profundidad de penetración en los tejidos. Las administraciones de un líquido usando una jeringa o un inyector sin aguja terminan en una distribución diferente del líquido en los tejidos. Usando una jeringa terminan en un bolo o área localizada. Usando un inyector terminan en una distribución difusa en las capas de los tejidos diana, tal como se ilustra en el documento WO-A-01/13975.

[0088] La profundidad de penetración está controlada principalmente por la presión del líquido. Esta presión del líquido depende de las especificaciones mecánicas del inyector, tales como la fuerza de resorte o cualquier otro medio de propulsión y el diámetro del pistón y el orificio de la boquilla. Esto está fácilmente disponible para el experto en la técnica.

[0089] La profundidad de la inyección se puede determinar fácilmente mediante la disección del tejido en el sitio de inyección (que corresponde preferiblemente a la ubicación donde va a administrarse la vacuna y la prueba se lleva a cabo ventajosamente en un animal de la misma especie y edad de la población a vacunar) después de la administración de un líquido coloreado que tiene preferiblemente la misma viscosidad que la vacuna pretendida. Esta prueba puede llevarse a cabo directamente con la vacuna pretendida que contiene adicionalmente un colorante. Esta prueba permite al experto en la técnica ajustar las especificaciones mecánicas de un inyector.

[0090] El inyector sin aguja puede estar equipado con un cabezal que comprende una o varias boquillas. El uso de varias boquillas permite aumentar el patrón de dispersión de la vacuna sobre un área mayor. Puede haber de 1 a 10 boquillas, preferiblemente de 1 a 6.

[0091] Existen varios inyectores disponibles en el mercado. El Vitajet® 3 (Bioject Inc.) está particularmente adaptado para el procedimiento según la invención.

[0092] Es ventajoso utilizar un inyector equipado con medios que permiten ajustar en el inyector directamente un vial o ampolla estándar. Además, el vial de la vacuna puede comprender varias dosis de vacuna que permiten varias inyecciones de la vacuna y/o la vacunación de varios animales utilizando el inyector y el mismo vial. Por lo tanto, el inyector es preferiblemente capaz de realizar inyecciones sucesivas desde un mismo vial.

[0093] Se describe en el presente documento un procedimiento para estimular la respuesta inmunitaria de un vertebrado. En una realización, el vertebrado es un pájaro, gato, vaca, perro, pez, cabra, caballo, humano, ratón, mono, cerdo, rata u oveja. En una realización más ventajosa, el vertebrado es un gato.

[0094] En un aspecto de la invención, la vacunación contra VSRRP se puede asociar con una vacunación contra otra enfermedad porcina. La vacuna comprende el vector de ADN de acuerdo con la invención y un componente de la vacuna capaz de proteger contra otros patógenos porcinos incluyendo, pero no exclusivamente, Mycoplasma hyopneumoniae y PCV2.

[0095] El volumen de la dosis inyectada puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 1,0 ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 0,8 ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,2 ml a aproximadamente 0,5 ml, y en un uso preferido, el volumen de dosis inyectado puede ser de 0,25 ml. Por definición, el volumen de una dosis significa el volumen total de vacuna administrada a la vez a un animal.

[0096] La vacuna puede contener de aproximadamente 1045 a aproximadamente 1080 TCID50/dosis (50% de la dosis infectiva de cultivo de tejidos por dosis de vacuna) y preferiblemente de aproximadamente 1055 a aproximadamente 1065 TCID50/dosis.

[0097] Opcionalmente, la administración se puede repetir, como administración de refuerzo, a intervalos adecuados si es necesario o deseable, por ejemplo de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 semanas después de la primera administración, y preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 semanas después de la primera administración. Una administración de refuerzo también se puede repetir cada año.

[0098] Se describe en el presente documento es el uso de una cantidad eficaz de un vector de ADN que codifica y expresa al menos un inmunógeno de VSRRP como se describió anteriormente y de un vehículo o diluyente aceptable, para la preparación de una vacuna de vector de ADN líquida diseñado para ser administrada

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

esencialmente en la dermis y la hipodermis de un animal de la familia de los suidos utilizando un inyector sin aguja a chorro de líquido como se describió anteriormente, y que da lugar a la obtención de una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP.

[0099] También se describe en el presente documento un kit o conjunto de vacunación, que comprende dicho inyector sin aguja a chorro de líquido y al menos un vial de vacuna que contiene una vacuna contra VSRRP basada en un vector de ADN como se describió anteriormente, operativamente montado para realizar la administración de la vacuna a un animal de la familia de los suidos. La distribución de la vacuna se realiza esencialmente en la dermis y la hipodermis.

[0100] Dicho kit o conjunto de vacunación es capaz de provocar una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP.

[0101] La eficacia a largo plazo y la seguridad de una nueva formulación específicamente diseñado para ser administrada por vía transdérmica usando el sistema vacunador transdérmico Derma-Vac® se presenta en el Ejemplo 4. La administración sin aguja tiene el potencial para hacer frente a los aspectos de seguridad y calidad de estos objetivos, así como para proporcionar una presentación optimizada de la vacuna al sistema inmunitario (véase, por ejemplo, Charreyre C., F. Milward, R. Nordgren y G. Royer, 2005, Demonstration of efficacy in pigs of Mycoplasma hyopneumoniae experimental vaccines by an innovative needle-free route, Proceedings of the American Association of Swine Veterinarians).

Referencias adicionales:

[0102]

Albina, E. 1997. Epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): An overview. Veterinary Microbiology 55: 309-316.

Bautista, E.M., Morrison, R.B., Goyal, S.M., Collins, J.E. and Annelli, J.F. 1993. Seroprevalence of PRRS virus in the United States. Swine Health Prod. 1(6): 4-7.

Bautista, E.M., Suarez P., Molitor T.W. 1999. T cell response to the structural polypeptides of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Arch. Virol. 144:117-134.

Benfield, D.A., Nelson, E.A., Collins, J.E., Harris, L., Goyal, S.M., Robinson, D., Christianson, W.T., Morrison, R.B., Gorcyca, D. and Chladek, D. 1992. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332). J. Vet. Diagn. Invest. 4: 127-133.

Brierley, I. 1995. Ribosomal frameshifting on viral RNAs. J. Gen. Virol. 76: 1885-1892.

Brun A., Vaganay, A., Tardy, M.C., Noe, T., Vandeputte, J., Schirvel, C. and Lacoste, F. 1992. Evaluation of etiological elements in the "P.R.R.S." in pigs. In Proceedings of the 12*" Congress of the International Pig Veterinary Society, The Hague, Netherlands, 17-20 August, p. 108.

Carlson, J. 1992. Encephalomyocarditis virus (EMCV) as a cause of reproductive and respiratory disease in swine. American Association of Swine Practitioners Newsletter. 4: 23.

Cavanagh, D. 1997. Nidovirales: a new order comprisong Coronaviridae and Arteriviridae. Arch Virol. 142 (3): 629633.

Cho, S.H., Freese, W.R., Yoon, I.J., Trigo, A.V. and Joo, H.S. 1993. Seroprevalence of indirect fluorescent antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in selected swine herds. J. Vet. Diagn. Invest. 5: 259-260. Collins, J.E., Benfield, D.A., Christianson, W.T., Harris, L., Hennings, J.C., Shaw, D.P., Goyal, S.M., McCulloygh, S., Morrisson, R.B., Joo, H.S., Gorcyca, D. and Chladek, D.W. 1992. Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. J. Vet. Diagn. Invest. 4: 117-126.

Conzelmann, K.K., Visser, N., van Woensel, P. and Tiel, H.J. 1993. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the Arterivirus group. Virology 193: 329-339.

Den Boon, J.A., Snijder, E.J., Chirnside, E.D., de Vries, A.A.F., Horzinek, M.C. and Spaan, W. 1991. Equine arteritis virus is not a togavirus but belongs to the coronavirus superfamily. J. Virol. 65: 2910-2920.

De Vries, A.A.F., Horzinek, M.C, Rottier, P.J.M. and de Groot, R.J. 1997. The genome organization of the Nidovirales: Similiarities and differences between Arteri-, Toro-, and Coronaviruses. Seminars in Virology 8: 33-47. Dewey CE, Wilson S, Buck P, Leyenaar JK. 1999. The reproductive performance of sows after PRRS vaccination depends on stage of gestation. Prev Vet Med 40:233-241.

Done, S.H. and Paton, D.J. 1995. Porcine reproductive and respiratory syndrome: clinical disease, pathology and immunosuppression. Veterinary Record 136: 32-35.

Done, S.H., Paton, D.J. and White, M.E.C. 1996. Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome (PRRS): A review, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects. British Veterinary Journal 152 (2): 153- 174.

Drew, T.W., Meulenberg, J.J.M., Sands, J.J. and Paton, D.J. 1995. Production, characterization and reactivity of monoclonal antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 76: 1361-1369.

Edbauer, C, R. Weinberg, J. Taylor, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, P. Desmettre and E. Paoletti, Virology 179, 901-904 (1990).

Faaberg, K.S. and Plagemann, P.G.W. 1995. The envelope proteins of lactate dehydrogenase-elevating virus and their membrane topography. Virology 212: 512-525.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Faaberg, K.S., Even, C, Palmer, G.A. and Plagemann, P.G.W. 1995. Disulfide bonds between two envelope proteins of lactate dehydrogenase-elevating virus are essential for viral infectivity. J. Virol. 69: 613-617. 1. Galina, L., Pijoan, C, Sitjar, M., Christianson, W.T., Rossow, K. and Collins, J.E. 1994. Interaction between Streptococcus suis serotype 2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus in specific pathogen-free piglets. Vet. Record. 134: 60-64. Godeny, E.K., Chen, L., Kumar, S.N., Methven, S.L., Koonin, E.V., and Brinton, M.A. 1993. Complete genomic sequence and phylogenetic analysis of the lactate dehydrogenase elevating virus (LDV). Virology 192: 585-596. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, E. Paoletti, Virology 179,247-266, 517-563 (1990).

Gonin P, Mardassi H., Gagnon CA, Massie B., Dea S. 1999. A nonstructural and antigenic glycoprotein is encoded by ORF3 of the IAF-Klop strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Arch. Virol. 143:1927- 1940. Gonin P, Pirzadeh B, Gagnon CA, Dea S. 1999. Seroneutralization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus correlates with antibody response to the GP5 major envelope glycoprotein. J Vet Diagn Invest 11 :20-26. Gorcyca, D., Schlesinger, K., Chladek, D. and Behan, W. 1995. RespPRRS: a new tool for the prevention and control of PRRS in pigs. In Proceedings of the American Association of Swine Practitioners, ppl-22

Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 41894198 (1989).

Halbur, P.G., Paul, P.S., Meng, X. and Andrews, J.J. 1992. Comparative pathology of porcine reproductive and respiratory syndrome in SPF pigs. Iowa State University Swine Research Reports, p137. Cooperative Extension Service, Iowa State University, Ames, IA, 50011.

Halbur, P.G., Paul, P.S. and Janke, B.H. 1993. Viral contributors to the porcine respiratory disease complex. In Proceedings of the 24tn Annual meeting of the American Association of Swine Practitioners, Kansas City, Missouri, USA, pp343-350.

Halbur, P.G., Paul, P.S., Frey, M.L.,Landgraf, J., Eernisse, K., Meng, X.-J., Lum, M.A., Andrews, J.J. and Rathje, J.A. 1995. Comparison of the pathology of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with the Lelystad virus. Vet. Pathol. 32:648-660.

Heinen E, Herbst W, Schmeer N. 1998. Isolation of a cytopathogenic virus from a case of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) and its characterization as parainfluenza virus type 2. Arch Virol 143:2233-2239 Hill, H. 1990. Overview and history of mystery swine disease (swine infertility and respiratory syndrome). In. Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, Denver, CO, 1990. Livestock Conservation Institute, Madison, WI, pp 29-30.

Kwang J, Zuckermann F, Ross G, Yang S, Osorio F, Liu W, Low S. 1999. Antibody and cellular immune responses of swine following immunisation with plasmid DNA encoding the PRRS virus ORF's 4, 5, 6 and 7. Res Vet Sci 67:199- 201.

Lager KM, Mengeling WL, Brockmeier SL. 1999. Evaluation of protective immunity in gilts inoculated with the NADC- 8 isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and challenge-exposed with an antigenically distinct PRRSV isolate. Am J Vet Res 60:1022-1027.

Le Potier, M.F., Blanquefort, P., Morvan, E. and Albina, E. 1995. Results of a control program for PRRS in the French area 'Pays de Loire'. Proc. of the 2ncA Int. Symposium on PRRS, Copenhagen, Denmark, 9-10 August, p34.

Mardassi, H., Mounir, S. and Dea, S. 1995. Molecular analysis of the ORFs 3 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus , Quebec reference strain. Arch. Virol. 140: 1405-1418.

Mardassi, H., Massie, B. and Dea, S. 1996. Intracellular synthesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome. Virology 221: 98-112.

Meng, X.-J., Paul, P.S., Halbur, P.G. and Lunn, M.A. 1995a. Phylogenetic analysis of the putative M (ORF6) and N(ORF7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implications for the existence of two genotypes of pRrSV in the USA and Europe. Arch. Virol. 140: 745-755. 39. Meng, X.-J., Paul, P.S., Halbur,

P.G. and Morozov, I. 1995b. Sequence comparison of open reading frames 2 to 5 of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 76: 3181-3188.

Meng, X.-J., Paul, P.S. , Morozov, I. And Halbur, P.G. 1996. A nested set of six or seven subgenomic mRNAs is formed in cells infected with different isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 77; 1265-1270.

Mengeling WL, Vorwald AC, Lager KM, Clouser DF, Wesley PJD. 1999a. Identification and clinical assessment of suspected vaccine-related field strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Am J Vet Res 60:334- 340.

Mengeling WL, Lager KM, Vorwald AC. 1999b. Safety and efficacy of vaccination of pregnant gilts against porcine reproductive and respiratory syndrome. Am J Vet Res 60:796-801.

Mengeling WL, Lager KM, Vorwald AC. 1998. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS. Am J Vet Res 59:1540-1544.

Meulenberg, J.J.M., Hulst, M.M., de Meijer, E.J., Moonen, P.J.L.M., den Besten, A., de Kluyver, E.P., Wensvoort, G. and Moormann, RJ.M. 1993a. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV. Virology 192: 62-72.

Meulenberg, J.J.M., de Meijer, E.J. and Moormann, RJ.M. 1993b. Subgenomic RNAs of Lelystad virus contain a conserved junction sequence. J. Gen. Virol. 74: 1697-1701.

Meulenberg, J.J.M., den Besten, A.P.., De Kluyver, E.P., Moormann, R.J.M., Schaaper, W.M.M. and Wensvoort, G. 1995. Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus. Virology 206: 155-163.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Meulenberg, J.J.M. and Petersen-Den Besten, P.-D. 1996. Identification and characterization of a sixth structural protein of Lelystad virus: The glycoprotein GP2 encoded by ORF 2 is incorporated in virus particles. Virology 225: 4451.

Murtaugh, M.P., Elam, M. and Kakach, L.T. 1995 Comparison of the structural protein coding sequences of the VR- 2332 and Lelystad virus strains of PRRS virus. Arch. Virol. 140: 1451-1460.

Nakamine M, Kono Y, Abe S, Hoshino C, Shirai J, Ezaki T. 1998. Dual infection with enterotoxigenic Escherichia coli and porcine reproductive and respiratory syndrome virus observed in weaning pigs that died suddenly. J Vet Med Sci 60:555-561.

Nelsen CJ, Murtaugh MP, Faaberg KS. 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents. J Virol 73:270-280.

Nelson, E.A., Christopher-Hennings, Drew, T., Wensvoort, G., Collins, G. and Benfield, D.A. 1993. Differentiation of US and European isolates of porcine reproductive nad respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies. J. Clin. Micro. 31 : 3184-3189.

Ohlinger, V., Haas, B., Saalmuller, A., Beyer, J., Teuffert, J., Visser, N. and Weiland, F. 1992. In vivo and in vitro studies on the immunobiology of PRRS. Proc. of American Assoc. Swine Practitioners - 1 st Int. PRRS Symp., 4(4): 24.

Ohlinger VF. 1995. The respiratory syndrome: studies on PRRSV-replication and immune response. Int. Symp. PRRS 2:12.

Panicali, D. and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).

Pirzadeh B, Dea S. 1998a. Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Gen Virol 79:989-999.

Pirzadeh B, Gagnon CA, Dea S. 1998b. Genomic and antigenic variations of porcine reproductive and respiratory syndrome virus major envelope GP5 glycoprotein. Can J Vet Res 62:170-177

Paoletti, E., B.R. Lipinskaks, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 193-197 (1984). 58. Paton, D.J., Brown, I.H., Edwards, S. and Wensvoort, G. 1991. Blue ear disease of pigs. Vet. Rec. 128: 617.

Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).

Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, In Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R, and Grossman, L., (Academic Press) pp. 545-563 (1987).

Pirzadeh, B. and Dea, S. 1997. Monoclonal antibodies to the ORF5 product of porcine reproductive and respiratory syndrome virus define linear neutralizing determinants. J. Gen. Virol. 78: 1867-1873.

Plagemann, P.G.W. 1996. Lactate dehydrogenase-elevating virus and related viruses. In "Virology" (B.N. Fields, D.M. Knipe and P.M. Howley, Eds.) 3rd ed., ppl 105-1120. Raven Press, New York.

Plana-Duran J, Bastons M, Urniza A, Vayreda M, Vila X, Mane H. 1997. Efficacy of an inactivated vaccine for prevention of reproductive failure induced by porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet Microbiol 55:361-370.

Plana Duran, J., Climent, I., Sarraseca, J., Urniza, A., Cortes, E., Vela, C. and Casal, I. 1997. Baculovirus expression of proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain Olot/91. Involvement of ORF3 and ORF5 proteins in protection. Virus Genes 14: 19-29.

Rossow K.D. 1998. Porcine reproductive and respiratory syndrome (review article). Vet Pathol. 35:1-20.

Sirinarumitr T, Zhang Y, Kluge JP, Halbur PG, Paul PS. 1998. A pneumo- virulent United States isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces apoptosis in bystander cells both in vitro and in vivo. J Gen Virol 79:2989-2995.

Snijder E., van Tol H., Pedersen K.W., Raamsman M.J.B., and de Vries A.A.F. 1999. Identification of a novel structural protein of arteri viruses. J. Virol. 73, 6335-6345.

Suarez, P., Diaz-Guerra, M., Prieto, C, Esteban, M., Castro, J.M., Nieto, A. and Ortin, J. 1996. Open reading frame 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a cause of virus-induced apoptosis. J. Virol. 70: 28762882. 69. Sur JH, Doster AR, Osorio Fa. 1998. Apoptosis induced in vivo during acute infection by porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet Pathol 35:506-514.

Thacker EL, Halbur PG, Ross RF, Thanawongnuwech R, Thacker B J. 1999. Mycoplasma hyopneumoniae potentiation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus- induced pneumonia. J Clin Microbiol 37:620-627. Van Nieuwstadt, A.P., Meulenberg, J.J.M., van Essen-Zandbergen, A., Petersen-den Besten, A., Bende, R.J., Moorman, RJ.M. and Wensvoort, G. 1996. Proteins encoded by open reading frames 3 and 4 of the genome of Lelystad virus (Arteriviridae) are structural proteins of the virion. J. Virol. 70: 4767-4772.

van Woensel PA, Liefkens K, Demaret S . 1998a. Effect on viraemia of an American and a European serotype PRRSV vaccine after challenge with European wild-type strains of the virus. Vet Rec 142:510-512. 81. van Woensel PA, Liefkens K, Demaret S. 1998b. European serotype PRRSV vaccine protects against European serotype challenge whereas an American serotype vaccine does not. Adv Exp Med Biol 440:713-718.

Weiland E, Wieczorek-Krohmer M, Kohl D, Conzelmann KK, Weiland F. 1999. Monoclonal antibodies to the GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus are more effective in virus neutralization than monoclonal antibodies to the GP4. Vet Microbiol 66:171-186

Wensvoort, G.C., Terpstra, J.M.A., Pol, E.A., ter Laak, M., Bloemraad, E.P., de Kluyver, C, Kragten, C, van Buiten, A., den Besten, F., Wagenaar, J.M., Broekhuysen, P.L.J.M., Moonen, T., Zetstra, E.A., de Boer, H J., TibbenM.F., de Jong, P., van't Veld, G.J.R., Greenland, .A.., van Gennep, M.T., Voets, J.H.M., Verheyden, J.H.M. and Braamskamp, J. 1991. Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Vet Q. 13: 121-130.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Wensvoort, G., de Kluyver, E.P., Luijtze, E.A., den Besten, A., Harris, L., Collins, J.E., Christianson, J.E. and Chladek, D. 1992. Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus. J. Vet. Diagn. Invest. 4: 134-138.

Yeager, M.J., Prieve, T., Collins, J., Christopher-Hennings, J., Nelson, E. and Benfield, D. 1993. Evidence for the transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in boar semen. Swine Health Prod. 1(5): 7- 9.

Yoon, K.-J., Zimmermann, J.J., Swenson, S.L., Wills, R.W., Hill, H.T. and Platt, K.B. 1994. Assessment of the biological significance of antibody dependent enhancement (ADE) of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS) virus infection in passively immunized pigs. Proc. 13a Int. Pig Vet. Soc. Congress, p69.

Yoon, K.-J., Zimmerman, J.J., Swenson, S.L., McGinley, M.J., Eernisse, K.A., Brevik, A., Rhinehart, L.L., Frey, M.L., Hill, H.T. and Platt, K.B. 1995. Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection. J. Vet. Diagn. Invest. 7: 305- 312. Zimmermann, J.J., Yoon, K.-J., Wills, R.W. and Swenson, S.L. 1997. General Overview of PRRSV: A perspective from the United States. Veterinary Microbiology 55: 187-196.

[0103] La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLO 1: Construcción y caracterización de los plásmidos que codifican el gen de nucleocápside (ORF7)

[0104] El gen ORF7 de VSRRP (SEQ ID NO: 1) y el gen de ORF7 truncado modificado genéticamente (ORF7t) (SEQ ID NO: 3), con un codón de terminación después del aminoácido 112, se amplificaron por PCR a partir del vector pBAD-ORF7 (SEQ ID NO: 13) que contenía el gen de la nucleocápside (OrF7) del aislado de VSRRP tailandés del genotipo de EE.UU (01NP1), usando los conjuntos de cebadores indicados en la tabla 1.

Tabla 1. Cebadores de clonación de los genes deORF7 de VSRRP y ORF7 truncado (ORF7t)

Nombre

Secuencia Diana Longitud de amplicón (pb) SEQ ID NO

ORF7 US-F

5'-AAAAAAGAATTCAT GCCAAAT AACAACGGCAAG-3' 1-21 384 5

ORF7 US-R

5' AAAAAAGAATTCTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG 3' 372-351 6

ORF7 US-F

5' AAAAAAGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG 3' 1-21 351 5

US-11R

5' AAAAAAGAATTCTCACACAGTATGATGCGTAGGC 3' codón de parada 336-318 7

Nota: las letras en cursiva indican los sitios de restricción EcoRI

[0105] Los fragmentos de ORF7 y ORF7t se cortaron a continuación con EcoRI y se clonaron en el vector pMASIA cortado por EcoRI (SEQ ID NO: 8). Los plásmidos clonados se transformaron en las células competentes, E. coli cepa JM109. Los constructos obtenidos fueron referidos como pORF7 (SEQ ID NO: 9) y pORF7t (SeQ ID NO: 10), respectivamente (figura 1). La orientación de los genes de ORF insertados se confirmó inicialmente por análisis de PCR, usando los conjuntos de cebadores indicados en la Tabla 2. Los plásmidos seleccionados se sometieron adicionalmente a análisis de secuencias del gen de ORF7. Todos los análisis de secuencias confirmaron la inserción correcta del gen de ORF7, con secuencias idénticas a las secuencias de ORF7 originales del vector original (pBAD- RF7) y 01NP1-VSRRP (Genbank, Q056373, SEQ ID NO: 13), (Figura 2).

Tabla 2. Los cebadores utilizados para el análisis de la orientación de los genes de ORF7 insertados

Nombre

Secuencia Diana Longitud de amplicón (pb) SEQ ID NO:

pMASIA F

5'-CAGTGTAGTCTGAGCAGTACT-3 ' 4100-4120 564 11

ORF7 US-F

5'-AAAAAAGAATTCAT GCCAAAT AACAACGGCAAG-3' 1-21 5

pMASIA F

5 'CAGT GTAGT CT GAGCAGTACT-3' 4100-4120 564 11

ORF7 US-R

5'-AAAAAAGAATTCTCAT GCT GAGGGTGAT GCT GT G-3' 372-351 6

pMASIA F

5'-CAGT GT AGT CT GAGCAGTACT-3' 4100-4120 531 11

US-11R

5'-AAAAAAGAATTCTCACACAGTATGATGCGTAGGC-3' 336-318 7

[0106] La expresión de los genes de ORF7 por los constructos de plásmidos, se verificó mediante la transfección in vitro de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) porcinas recién aisladas con pORF7 o pORF7t. Brevemente, las PBMC fueron transfectadas con pORF7 o pORF7t, utilizando el reactivo Effectene Transfection (Qiagen, Alemania), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se incubaron adicionalmente durante 48 horas, en una incubadora de CO2 al 5%. Después de la incubación, se recogieron las muestras de PBMC y se sometieron al aislamiento del ARN total usando el kit de extracción de ARN comercial (Macherey-Nagel, Alemania). El ADN contaminado se estrajo mediante la adición de ADNasa I suministrada con el kit. La expresión del gen de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

ORF7 en las PBMC transfectadas se determinó mediante la síntesis de ADNc usando hexámeros aleatorios, seguido de la reacción de PCR, utilizando los conjuntos de cebadores descritos anteriormente (Tabla 1). El resultado confirmó la expresión del ARNm de ORF7 a partir de pORF7 y pORF7t, tal como se muestra en la figura 3.

[0107] Además, cuando se subclonó en un vector de expresión (pQE31, SEQ ID NO: 18), los genes de ORF7 y ORF7t pudieron producir correctamente las proteínas recombinantes con un peso molecular correcto (aproximadamente 15 kDa.) y pudieron ser detectados usando suero hiperinmune anti-VSRRP porcino (Figura 4). Las proteínas recombinantes se sometieron a SDS-PAGE al 15% y se transfirieron a la membrana de PVDF. La presencia de proteína VSRRP se determinó utilizando suero hiperinmune anti-VSRRP porcino. (U; proteína sin purificar, P; proteína purificada, +; con IPTG, -; sin IPTG; M; marcador de peso molecular).

[0108] Para la preparación de la vacuna de ADN, los transformantes de E. coli se propagaron y se sometieron a purificación del plásmido utilizando la columna de purificación de plásmido comercial (NucleoBond endotoxinfree plasmid purification, Macherey-Nagel). La confirmación de los plásmidos purificados se realizó mediante análisis de restricción utilizando la enzima de restricción NcoI (Figura 5). La concentración del plásmido se determinó por espectrofotómetro. Las proporciones DO260/DO280 obtenidas a partir de cada preparación osciló entre 1,625 y 1,69.

EJEMPLO 2: Los efectos inmunomoduladores de la vacuna de ADN contra VSRRP en el modelo estimulado

[0109] Diseño experimental (Figura 6). Para determinar los efectos inmunomoduladores de la vacuna de ADN de VSRRP, se inmunizaron cerdos cruzados de cuatro semanas de edad, seronegativos de VSRRP (4-6 cerdos/grupo) con 500 pg de pORF7t o pORF7 diluido en 200 pl de PBS libre de Ca2+, Mg2+ (referido como PBSA), de los plásmidos dos veces en un intervalo de 4 semanas (d0, d28). El plásmido se inyectó por vía intradérmica en la piel de los dos oídos (2x50 pl/lado), utilizando una jeringa de tuberculina (Figura 7). También se incluyeron los grupos de control que recibieron la misma cantidad de pBs o plásmido nulo (pMASIA) en el estudio. Cuatro semanas después de la segunda vacunación (d56), los cerdos fueron estimulados intranasalmente con 5 ml (2,5 ml/ventana de la nariz) del VSRRP virulento (01NP1) a la concentración de 1055 TCID50/ml. Los parámetros inmunológicos y signos clínicos fueron controlados cada 2 semanas ya los 0, 5 y 10 días después de la infección (dpi). Los cerdos fueron sacrificados a los 10 dpi y se sometieron a examen patológico y estudios virológicos.

[0110] Estudios virológicos y patológicos. No hubo signos clínicos, ni reacciones adversas observadas después del proceso de inmunización con ADN. Tras la estimulación, se determinó inicialmente la presencia de VSRRP en las muestras combinadas mediante RT-PCR usando el conjunto de cebadores específicos de ORF1. El VSRRP se detectó en las muestras de los grupos inmunizados con pORF7, el plásmido Nulo y PBSA, a 5 dpi (suero), y 10 dpi (tejidos pulmonares). Sin embargo, el VSRRP no se detectó en el grupo inmunizado con pORF7t en cualquier momento de este estudio (Figura 8). Además, la presencia de VSRRP en los tejidos pulmonares de los cerdos individuales se evaluó mediante RT-PCR. La presencia de genoma de VSRRP se determinó mediante RT-PCR utilizando los conjuntos de cebadores específicos de ORF1, lo que daría el producto de PCR de 107 pb en la muestra positiva (Gilbert et al, J Clin Microbiol 1997 35: 264-7). + ve; control positivo (genotipo US-VSrRp), -ve; control negativo (ddH20), L; escalera de 100 pb. Consistente con los resultados de muestras combinadas, el VSRRP podría ser detectado en todos los grupos excepto el grupo inmunizado con pORF7t (Tabla 3).

Tabla 3. Grupos de vacunación y resultados que indican la presencia de VSRRP en las muestras de tejido pulmonar de los cerdos a 10 dpi

Grupo

ID muestra Resultados % de muestras positivas

pORF7t

H4811 - 0

H4831

-

H4841

-

H4853

-

H4849

-

H4809

-

pORF7

H4843 + 33

H4875

+

H4871

-

H4827

-

H4823

-

H4813

-

Plásmido nulo

H4867 - 50

H4923

+

H4893

-

H4859

+

H4897

+

H4861

-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

H4863 +

PBSA

H4865 - 50

H4895

-

H4869 +

Tabla 4: Porcentaje de cerdos en cada grupo que presentan cambios patológicos en el tracto respiratorio a 10 dpi.

Lesiones patológicas

Grupo experimental

PBSA3

Nulob pORF7b pORF7tlb

Pneumonia

75,0 33,2 33,2 50,0

Linfadenopatía (Ln. Traqueobronquial)

50,0 16,6 0 16,6

Pleuritis fibrinosa

0 16,6 16,6 0

an=4; bn=6

Sin embargo, no hubo diferencias significativas en el número de cerdos experimentales con cambios patológicos en el tracto respiratorio a 10 dpi (Tabla 4). Los datos sugirieron que la inmunización con pORF7t podría mejorar la eliminación del virus en los cerdos estimulados experimentalmente.

[0111] Estudio de las respuestas inmunitarias humorales. La respuesta de anticuerpos específicos de VSRRP fue determinada por el kit de prueba ELISA comercial (HerdChek PRRS, IDEXX, Alemania). Debe señalarse que la proteína de la nucleocápside es el principal epítopo reconocido por el anticuerpo anti-VSRRP determinado por el ensayo ELISA IDEXX HerdChek (Plagemann, 2006. J Virol Methods 134: 99-118). Los cerdos eran seronegativos de VSRRP al inicio del experimento. La seroconversión sólo se observó en el grupo que recibió pORF7 en el día de la estimulación (1 cerdo), y a 10 dpi (3 cerdos), lo que sugiere el cebado de la respuesta de anticuerpos anti-VSRRP mediante la inmunización con pORF7. Sin embargo, no se observó seroconversión en los cerdos inmunizados con pORF7t o los controles durante todo el experimento (Tabla 5).

Tabla 5. Respuestas de anticuerpos anti-VSRRP en los cerdos experimentales durante el experimento

Relación S/P promedio (% de seroconversión3)

Grupo

d0 d56 (0 dpi) d61 (5 dpi) d66 (10 dpi)

ORF7t

0,08 (0) 0,02 (0) 0,02 (0) 0,03 (0)

ORF7

0,07 (0) 0,15 (16,6) 0,04 (0) 0,46 (50)

Nulo

0,11 (0) 0,04 (0) 0,01 (0) 0,02 (0)

PBSA

0,06 (0) 0,03 (0) 0,02 (0) 0,01 (0)

arelación S/P > 0,4

= positiva

[0112] Estudio de la producción de citoquinas específicas virales en PBMC. No hubo diferencias significativas en las células productoras de IFNg IL-10 específicas de VSRRP entre los grupos antes de la estimulación. Tras la estimulación, se observó un mayor número de células productoras de IFNg e IL-10 específicas de VSRRP en todos los grupos (Figura 9). Los cerdos se inmunizaron con la vacuna indicada en la leyenda dos veces en d0 y d28, y recibieron inoculación de VSRRP en d56. Las PBMC porcinos recién aisladas se cultivaron in vitro con 0,08 m.o.i. del US-VSRRP (cepa 01NP1) o lisado de MARC-145 infectado simulado durante 48 horas antes de la recogida para la tinción fluorescente y análisis de citometría de flujo. Los datos representan el porcentaje promedio (± SEM) de las células productoras de citoquinas de los cerdos en el mismo grupo, que se calculó a partir del % de células productoras de citoquinas obtenidos a partir de las PBMC cultivadas con VSRRP -% de células productoras de citoquinas obtenidas de las PBMC cultivadas de forma simulada.

[0113] Estudio de las células CD4+CD25+ y CD4+CD25+Foxp3+ específicas virales en las PBMC. Después de la primera inmunización, los cerdos inmunizados con pORF7t exhibieron un número significativamente mayor de las células CD4+C25+ específicas de VRRSP (linfocitos Th activados) que los otros grupos (p <0,05, ANOVA seguido de el test de Newman Keuls), (figura 10 A). También se observó un mayor número de CD4+CD25+ en el grupo inmunizado pORF7t después de la estimulación (d66). Curiosamente, el número de células CD4+CD25+Foxp3+ específicas de VSRRP (células T reguladoras; Treg) en el grupo que recibió pORF7t y pORF7 fue significativamente menor que los grupos de control (p <0,05, ANOVA seguido de Newman Keuls) en d28. Tras la estimulación viral, todos los grupos mostraron mayores cantidades de células CD4+CD25+Foxp3+ en las PBMC (Figura 10B). Los datos representan el porcentaje promedio (± SEM) de la subpoblación de linfocitos de los cerdos en el mismo grupo, que se calculó a partir del % de la subpoblación de linfocitos obtenida a partir del PBMC cultivadas con VSRRP - % de la subpoblación de linfocitos obtenida a partir de las PBMC cultivadas de forma simulada. "a" indica la diferencia significativa con los otros tratamientos. "b" indica una diferencia significativa entre los grupos que recibieron la vacuna de ADN (pORF7t o pORF7) y los controles (nulos o PBSA). Además, los datos indicaron que los 2 plásmidos podrían modular las respuestas inmunitarias contra VSRRP, mediante reducción de Treg específicas virales, y que pORF7t podría mejorar las cantidades de células Th respondedoras específicas virales en los cerdos después de la inmunización y la estimulación.

5

10

15

20

25

30

35

40

[0114] Conclusión. Los datos de este experimento de estimulación indica que la inmunización con ADN con el plásmido que codifica ORF7 (pORF7t o pORF7) podría modular significativamente la inmunidad anti-VSRRP. El pORF7t, pero no pORF7, indujo por un mayor número de células Th respondedoras específicas virales y la eliminación del virus después de la estimulación, sin la evidencia de cebado de la respuesta de anticuerpos anti- VSRRP. Aunque pORF7 podría cebar los cerdos de la respuesta de anticuerpos anti-VSRRP, el plásmido no mejoró la inmunidad anti-viral o eliminación viral en los cerdos inmunizados (Tabla 6). El resultado puso de relieve la importancia del papel de la inmunidad mediada por células anti-VSRRP sobre la inmunidad anti-VSRRP. Además, los datos de este experimento sugieren los efectos inmunomoduladores superiores del pORF7t en comparación con el pORF7, por lo tanto, se seleccionó el plásmido pORF7t para el experimento posterior.

Tabla 6. Resumen de los efectos de la inmunización del plásmido en inmunidad anti-VSRRP

IFN- gamma IL-10 linfocitos CD4+CD25+ células CD4+CD25+FoxP3+ Seroconversión Eliminación viral mejorada

Preestimulación Nulo pORF7t pORF7 Postestimulación Nulo pORF7t pORF7

- - Ta Ta Tb Tb sí nac na na sí

a diferencia significativa con los otros tratamientos (p <0,05)

b diferencia significativa entre los grupos que recibieron la vacuna con ADN (pORF7t o pORF7) y los controles (nulo o PBSA), (p <0,05) c no aplicable

EJEMPLO 3: Los efectos inmunomoduladores de pORF7t en los cerdos de la granja comercial (estudio a largo plazo)

[0115] El objetivo fue estudiar los efectos inmunomoduladores de pORF7t en la granja comercial con VSRRP positivo. Objetivos específicos: 1. Investigar el efecto inmunomodulador de la vacuna con ADN en la inmunidad anti- VSRRP, cuando se inmunizó antes de la infección; (cebado exp.) 2. Investigar los efectos inmunomoduladores de la vacuna con ADN en la inmunidad anti-VSRRP, cuando se inmunizó en el momento de la infección (tratamiento exp.); 3. Investigar el efecto de la inmunización con ADN en el crecimiento y el rendimiento de los cerdos inmunizados

[0116] Diseño experimental - La granja seleccionada para el estudio a largo plazo fue una granja con VSRRP positivo con el estado serológico del VSRRP conocido durante los últimos 2 años. La granja se encontraba a unos 160 km de Bangkok. Tenía aproximadamente 3.000 cerdas y empleaba un sistema de cría de flujo continuo. Generalmente, los lechones se destetaron a las 4 semanas de edad, y se mantuvieron en el vivero en el mismo sitio (unidad 1) hasta las 11 semanas de edad y, posteriormente, se trasladaron a la unidad de acabado (unidad 2), situado aproximadamente a 20 km del vivero. Es durante este tiempo (es decir, 4-11 semanas) que la mayoría de los cerdos se infectaron con VSRRP. Los cerdos se mantuvieron en el acabador (unidad 2) hasta 26-28 semanas de edad.

[0117] Cerdo experimental: Se agruparon al azar cerdos destetados macho de seis semanas de edad en 5 grupos (30 cerdos/grupo) según el esquema presentado en la Tabla 7. Los detalles adicionales del experimento se ilustran en la figura 11 A.

Tabla 7. Los detalles de los grupos experimentales

Grupo

Edad de vacunación No. al inicio Sacrificados a 8 dpm No esperado en el matadero

1. Control (PBSA)

6,11 semanas 30 6 24

2. Cebado con

6 semanas 30 6 24

pORF7t 3. Cebado con nulo

6 semanas 30 6 24

4. pRF7t-Tx

11 semanas 30 30

5. Nulo-Tx

11 semanas 30 30

[0118] Cebado de ADN (ADN-P): los cerdos fueron inmunizados por vía intradérmica con 500 ug de pORF7t a las 6 semanas de edad (d0). Los cerdos que recibieron la misma cantidad de plásmido nulo (pMASIA) o PBSA se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

incluyeron como los controles. A los 8 días después de movimiento (8 dpm, d43), los cerdos (6/grupo) se sacrificaron y se sometieron a estudios patológicos y virológicos - El tratamiento con ADN (ADN-T): Los cerdos se inmunizaron con 500 ug de pORF7t en el momento de movimiento (semana 11, d35). Los grupos de control incluyeron el grupo inmunizado con el plásmido nulo o PBSA. - Las muestras de sangre se recogieron cada 2 semanas. El número de células productoras de Treg, IL-10 e IFNg específicas de VSRRP en las PBMC se determinó por citometría de flujo. Se recogieron muestras de suero para la determinación del anticuerpo anti-VSRRP y la presencia de VSRRP. Los signos clínicos y los índices de rendimiento fueron controlados hasta el final de un período de acabado (Figura 11B).

[0119] Efectos inmunomoduladores de la vacuna con ADN cuando se inmunizaron antes de la exposición a VSRRP (experimento de cebado) Todos los grupos tenían niveles comparables de células productoras de citoquinas en el comienzo del experimento. Después de mover a la unidad de acabado (d43), todos los grupos mostraron cantidades de células de IL-10+ específicas de VSRRP aumentardas significativamente, posiblemente debido a la exposición natural a VSRRP en el acabador. Los niveles de las cantidades de células productoras de IL- 10+ disminuyeron gradualmente después de d56. Curiosamente, los grupos que recibieron pORF7t o el plásmido nulo tenían significativamente un menor número de células de IL-10+ específicas de VSRRP que el PBSA de control en d70 (p <0,05, ANOVA seguido por pruebas de comparación múltiple de Tukey). Sin embargo, sólo el grupo inmunizado con pORF7t exhibió una gradual disminución de las células IL-10+ específicas de VSRRP hasta el final del período de observación. Antes de d112, los cerdos vacunados con pORF7t tenían significativamente un menor número de linfocitos IL-10+ que los otros grupos (p <0,05, ANOVA seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey), (Figuras 12A, B). Después de la vacunación con ADN (d14), los cerdos que recibieron pORF7t mostraron un aumento significativo en el número de linfocitos IFNg+ específicos de VSRRP. El número de las células de IFNg+ específicas de VSRRP se mantuvo mayor que otros grupos hasta d70 (Figuras 12C, D). Los cerdos fueron vacunados con pORF7t, plásmido nulo o PBSA en d0, y se movieron a la unidad de acabado en d35. Las muestras de PBMC recién aisladas porcinas habían sido cultivadas con 0,1 m.o.i. de US-VSRRP (cepa 01NP1) o lisado de MARC-145 infectado de forma simulada durante 48 horas antes de la tinción fluorescente y el análisis de citometría de flujo. Todos los grupos tenían números comparables de células CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) específicas de VSRRP al comienzo del experimento. Después de la vacunación, los cerdos que recibieron pORF7t exhibieron números significativamente más bajos de la Treg específicas de VSRRP que los otros grupos de control (p <0,05, ANOVA seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey). Después del movimiento (d43), el número de Treg específica de VSRRP aumentó en todos los grupos, posiblemente debido a la exposición a VSRRP. Sin embargo, el número de las Treg específicas de VSRRP en el grupo vacunado con pORF7t se mantuvo por debajo de los otros grupos durante todo el experimento (Figuras 13A, B). El resultado de este experimento indicó que la vacuna con ADN podría modular las respuestas inmunitarias de anti-VSRRP en los cerdos mediante la mejora de la producción de IFNg específica viral y la reducción de la producción de IL-10 y Treg específica viral en los cerdos vacunados después de la exposición viral.

[0120] Efecto inmunomodulador de la vacuna con ADN cuando se inmuniza en el momento de la exposición a VSRRP (experimento de tratamiento). Todos los cerdos mostraron un aumento de células IL-10+ específicas de VSRRP en las PBMC después del movimiento en la unidad de acabado (d43). Sin embargo, los cerdos que recibieron pORF7t exhibieron una reducción más rápida de las células IL-10+ específicas de VSRRP y tenían niveles más bajos de células IL-10+ específicas de VSRRP que los otros grupos de control hasta el final del período de observación (Figuras 14A, B). La inmunización con pORF7t dio lugar a una inducción mejorada de células IFNg+ específicas de VSRRP. Además, el número de las células IFNg específicas de VSRRP en el grupo pORF7t se mantuvo más alto que los otros grupos hasta el final de los experimentos (Figuras 14C, D). Además, los cerdos que recibieron pORF7t exhibieron números significativamente más bajos de células CD4+CD25+Foxp3+ específicas de VSRRP que los grupos de control durante todo el experimento (Figuras 15A-B). Los resultados sugirieron que pORF7t podría modular la respuesta inmunitaria específica de VSRRP que debe ser beneficioso para la inmunidad anti-VSRRP.

[0121] El efecto de la inmunización con ADN en las respuestas de anticuerpos. Algunos de los cerdos contenían anticuerpo específico de VSRRP derivado maternal en su suero al inicio del experimento. El nivel de MDA se redujo gradualmente hasta 8 semanas de edad (d14). Sin embargo, el 80-100% de los cerdos en cada grupo mostró una seroconversión en el momento de movimiento (d35), lo que sugiere que la infección natural en realidad se produjo al final del período de vivero. No hubo diferencia significativa en el patrón de respuestas de anticuerpos, medidas por ELISA, entre los grupos experimentales (Tabla 8, Figura 16).

Tabla 8. Anticuerpo específico de VSRRP determinado por IDEXX ELISA

Grupo

Relación S/P promedio (% de cerdos seropositivosb)

d0

d14 d35 d43 d56 d70 d82 d112

PBSA

0,25 (33,3) 0,21 (33,3) 1,31 (100) 2,28 (100) 1,99 (80) 2,29 (100) 1,42 (100) 1,36 (100)

pORF7t-P

0,17 (16,7) 0,09 (0) 1,24 (100) 1,35 (100) 1,15 (100) 1,26 (80) 1,02 (100) 1,26 (100)

Nulo-P

0,30 0,24 (0) 1,22 (100) 0,93 (100) 2,16 (100) 1,36 (100) 1,01 (80) 1,00 (60)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(33,3)

pORF7t-T

nd nd 1,19 (80) 1,29 (100) 1,16 (100) 1,09 (100) 1,65 (100) 1,29 (100)

Nulo-T

nd nd 0,96 (80) 1,07 (80) 0,98 (80) 1,72 (80) 0,83 (100) 1,21 (100)

avalores DO promedio de 5 cerdos/grupo b relación S/P > 0,4 = seropositivo

[0122] Los estudios virológicos. Los estudios virológicos por RT-PCR y RT-PCR cuantitativa confirmaron la presencia del genotipo US de VSRRP en las muestras de pulmón de los cerdos experimentales que fueron sacrificados a los 8 dpm (d43), la Tabla 9. Sin embargo, no hubo diferencias en el número de carga viral en el suero a d43 (Figura 17). Los estudios patológicos de las vías respiratorias en d43 revelaron infección viral con complicación secundaria en los pulmones de los cerdos.

Tabla 9. El número de cerdos experimentales con VSRRP positivo en el pulmón a d43

Tratamiento

Animal positivo/totales examinados (%a)

1) Control (PBSA)

3/6 (50)

2) pORF7t-cebador

3/6 (50)

3) Plásmido nulo

5/6 (83,33)

a% de muestras positivas de 6 cerdos/grupo

EJEMPLO 4: Los efectos inmunomoduladores de la vacuna con ADN de VSRRP suministrada utilizando tecnología transdérmica

[0123] Los inventores han observado el resultado inesperado y sorprendente que se logró una eficacia mejorada significativamente cuando los plásmidos de la invención fueron administrados utilizando tecnologías transdérmicos, específicamente el dispositivo DERMAVAC®. En los ejemplos anteriores, la nueva vacuna VSRRP-ADN fue desarrollada y probada por su inmunoprofilaxis y propiedades inmunoterapéuticas contra VSRRP. Los resultados indicaron que la vacuna de ADN prototipo, cuando se inmuniza por vía intradérmica en los cerdos experimentales, era capaz de modular respuestas inmunitarias anti-VSRRP y la mayor eliminación viral en los cerdos estimulados vacunados. Dado que la técnica de inyección intradérmica no se practicó de forma rutinaria en las granjas de cerdos, los inventores exploraron el uso potencial de un dispositivo sin aguja para el suministro de la vacuna con ADN de la invención en cerdos. Se contempla por los inventores que las vacunas de la invención deberían demostrar adicionalmente la eficacia en, por ejemplo, pero no exclusivamente, cerdos de engorde y cerdas jóvenes de reemplazo.

[0124] Materiales y Procedimientos. Inmunización de plásmido. La vacuna VSRRP-ADN (pORF7t) que contenía el gen de ORF7 modificado genéticamente, que codificaba la proteína N linealizada, derivado del genotipo US, el aislado de VSRRP tailandés (01 NP1) y el plásmido nulo (pMASIA) se utilizaron para la inmunización de ADN. Los inyectores sin aguja; Pulse50 (Sistema sin aguja Pulse, EE.UU.), y Dermavac (Merial, Francia) fueron probados y optimizados para la inoculación intradérmica antes del experimento con animales (Figura 18). Experimento con animales. Se inmunizaron xerdos cruzados de cuatro semanas de edad (8 cerdos/grupo) con 200 ug o 500 ug del plásmido indicado en el día 0 (DO) mediante inyección intradérmica convencional, inyector sin aguja Dermavac o Pulse50. Los parámetros inmunológicos se monitorizaron cada 2 semanas, en el día 0, 14, 28, 42 y 56 después de la inmunización. Los cerdos se mantuvieron en la granja comercial en todo el experimento. Activación in vitro con VSRRP. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) porcinas recién aisladas se cultivaron in vitro en presencia del aislado tailándés, genotipo US de VSRRP (cepa 01 NP1) o el control, lisado de células infectadas MARC-145 durante 48 horas antes de la recogida y marcajes fluorescentes. El número de células productoras de Treg, IL-10 e IFNg específicas de VSRRP en diferentes subpoblaciones de linfocitos se determinó mediante citometría de flujo.

[0125] Resultados. Ambos inyectores sin aguja proporcionaron una inmunización con ADN eficaz en cerdos de 4 semanas de edad. Después de una sola inmunización plásmido (d0), el cerdo inmunizado con Dermavac exhibió significativamente mejores patrones de parámetros inmunoinhibidores específicos de VSRRP controlados (Treg y IL- 10), y parámetros inmunoestimulantes específicos de VSRRP mejorados (producción de IFNg), (Figura 19). Curiosamente, la inmunización con los dos inyectores, a la dosis de 500 ug podía aumentar el número de células CDS+IFN-y+ específicas de VSRRP, en comparación con la inyección intradérmica convencional (Figura 20).

EJEMPLO 5: Estudio de la estimulación de vacuna VSRRP-ADN (granja positiva de VSRRP)

[0126] Objetivo. Este estudio fue diseñado para evaluar la eficacia de la vacuna de ADN prototipo en los cerdos de engorde criados en granja positivas de VSRRP

[0127] Procedimientos. Se agruparon al azar cerdos de cuatro semanas de edad de una granja comercial con VSRRP positivo (30 cerdos/grupo) y se inmunizaron dos veces, a las 4 (d0) y 7 semanas (d21) de edad con el sistema DERMAVAC. Los cerdos fueron trasladados al sitio de engorde con VSRRP positivo a las 9 semanas de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

edad (d35). El grupo 1 recibió PBSA (500 ul/dosis); el grupo 2 recibió plásmido Nulo (pMASIA) a 500 ug/500 ul/dosis); y el grupo 3 recibió la vacuna con ADN (pORF7t) a 500 ug/500 ul/dosis. Se recogieron muestras de sangre heparinizada (6 cerdos/grupo) para el aislamiento de las PBMC y el análisis de células productoras de IL-10 e IFNg específicas de VSRRP y el número de linfocitos CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) específicas de VSRRP en d0, 21, 35, 49, 84, 112 y 147. Se recogieron muestras de suero para la determinación de anticuerpo específico de VSRRP (IDEXX ELISA) al mismo tiempo de la recogida de la sangre entera. La monitorización de los signos clínicos y la evaluación de la puntuación de pulmón se realizaron en el matadero.

[0128] Resultados. No se observó ninguna reacción adversa a la vacuna después de la inmunización con ADN. Los cerdos que recibieron la vacuna con ADN tendían a tener un menor número de Treg CD4+CD25+Foxp3+ específicas de VSRRP que los grupos de control, particularmente después de trasladarse al sitio de engorde. Se observaron aumentos en el número de Treg en ambos grupos de control después del traslado (movimiento) (d49), pero no en el grupo vacunado con ADN (Figura 22A). No hubo diferencias estadísticas en el número de células productoras de IL-10 en todo el experimento.

[0129] Se produjo un aumento en el número de de linfocitos CD4+CD25+ específicos de VSRRP (células T efectoras activadas) en el grupo vacunado con ADN después del movimiento, (Figura 22C), en consonancia con un aumento en el número de células que producen IFNg específicas de VSSRP. El número de células productoras de IFNg específicas de VSRRP en el grupo vacunado con ADN fue significativamente mayor que los grupos de control en d84 (Figura 22D). El número de células T de memoria productoras de IFNg (células CD4+CD8+IFN-y +) del grupo vacunado con ADN se mantuvo en un nivel más alto, en comparación con los controles, hasta el final del período observatorio (Figura 22F). Cabe señalar que la variación de datos dentro de los grupos de estudio fue bastante alta en este experimento. Además, también se observaron efectos inmunomoduladores del plásmido nulo.

[0130] En el día 84, todos los grupos mostraron seroconversión de VSRRP después del movimiento en el sitio de engorde VSRRP positivo. En d112, todos los cerdos se seroconvirtieron con el patrón similar de relaciones S/P (figura 23). No hubo diferencia significativa en el signo clínico entre los grupos durante el período de engorde. Curiosamente, el grupo que recibió la vacuna con ADN mostró puntuaciones pulmonares inferiores que el grupo de control (p <0,05, prueba t de Student), (Figura 24).

[0131] Resumen. La vacuna con ADN moduló las respuestas inmunitarias específicas de VSRRP, tal como se muestra por los parámetros inmunoestimulantes mejorados y la reducción de los parámetros inmunoinhibidores durante el periodo de engorde (Tabla 10). No hubo diferencias significativas en los patrones de respuestas humorales anti-VSRRP entre los grupos experimentales. Además, los cerdos de vacunación con ADN mostraron significativamente menores cambios patológicos pulmonares que los cerdos de control.

Tabla 10. Resumen para el % de animales seropositivos

Grupo _______% de seropositivos* (No. de positivos/animales probados)

d0 d 21 d49 d84 d112

PBSA

0(0/7) 0 (0/7) 0 (0/7) 57,14 (4/7) 100 (8/8)

Nulo

0 (0/7) 0 (0/7) 0 (0/7) 100 (6/6) 100 (7/7)

pORF7t

0 (0/7) 0 (0/7) 0 (0/7) 100 (6/6) 100 (8/8)

*Proporción S/P > 0,4

EJEMPLO 6: Estudio de estimulación con vacuna de VSRRP-ADN (granja negativa de VSRRP)

[0132] Procedimientos. Se agruparon al azar cerdos de cuatro semanas de edad de una granja comercial seronegativos en VSRRP (30 cerdos/grupo) y se vacunaron a las 4 semanas (d0) y 7 semanas de edad (d21), utilizando el sistema de Dermavac. Los cerdos fueron todos trasladados al sitio de engorde con VSRRP negativo aproximadamente a las 9 semanas de edad. Los grupos de tratamiento fueron los siguientes: Grupo 1 (PBSA, 500 ul/dosis); grupo 2 (plásmido nulo, 500 ug/500 ul/dosis); y grupo 3 (vacuna de ADN 500 ug/500 ul/dosis). Se recogieron muestras de sangre heparinizada (6 cerdos/grupo) para el aislamiento de las PBMC y el análisis de las células productoras de IL-10 y IFNg específicas de VSRRP y el número de linfocitos CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) específicos de VSRRP en d0, 21, 35, 49, y 63. Se recogieron muestras de suero para la determinación de anticuerpos específicos de VSRRP (IDEXX ELISA) al mismo tiempo de la recogida de la sangre entera.

[0133] Resultados. No se observó ninguna reacción adversa de la vacuna durante todo el experimento. Los efectos inmunomoduladores de la vacuna de ADN prototipo fueron representados en la Figura 25. Después de la segunda vacunación, el grupo vacunado con pORF7t mostró significativamente parámetros inmunoinhibidores más bajos que los grupos de control, y la cantidad de linfocitos CD4+CD25+Foxp3+ y CD4+CD25+Foxp3+IL-10+ específicos de VSRRP era más baja que los grupos de control durante todo el experimento, especialmente en el día 35 (Figuras 25A y 25B). Además, el grupo inmunizado con ADN tendía a tener un mayor número de parámetros inmunoestimulantes que los grupos de control. Hubo variaciones de datos bastante altos dentro de los grupos experimentales. Sin embargo, el grupo que recibió la vacuna con ADN tenía un número significativamente mayor de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

linfocitos (CTL) CD8+IFNg+ que los grupos de control en d35 (Figura 25F). Además, los efectos inmunomoduladores del plásmido nulo también se observaron en este estudio. No se observó seroconversión en los cerdos durante todo el experimento y no hubo ninguna diferencia obvia en los signos clínicos entre los grupos. En resumen, los cerdos inmunizados mostraron significativamente mejores respuestas inmunitarias mediadas por células específicas de VSRRP y parámetros inmunoinhibidores más bajos, sin evidencia de mejorar la respuesta de anticuerpos anti- VSRRP.

Ejemplo 7. Estudio de estimulación (granja seronegativa de VSRRP)

[0134] Procedimientos. Se agruparon al azar cerdos de cuatro semanas de edad en una granja seronegativa en VSRRP (10-12 cerdos/grupo) y se vacunaron a las 4 semanas (d0) y 7 semanas de edad (d21) utilizando Dermavac: Grupo 1 (PBSA, 500 pl/dosis); Grupo 2 (plásmido nulo, 500 pg/500 pl/dosis); Grupo 3 (pORF7t, 500 pg/500 pl/dosis); y grupo 4 (pORF7, 500 pg/ 500 pl/dosis). Antes de las 9 semanas de edad, los cerdos fueron trasladados a la unidad de aislamiento, y después de la aclimatación, los cerdos fueron estimulados intranasalmente con 5 ml (2,5 ml/ventana de la nariz) de 1055 TCID50/ml del genotipo US virulento de VSRRP (cepa 01NP1). Los signos clínicos se monitorizaron tras la estimulación hasta el final del experimento. Los cerdos (5-6 cerdos/grupo) se sometieron a eutanasia a los 10 días después de la infección (dpi) y 21 dpi, y se sometieron a estudios virológicos y patológicos. Se recogieron muestras de sangre heparinizada (5 cerdos/grupo) para el aislamiento de las PBMC y el análisis de las células productoras de IL-10 e IFNg específicas de VSRRP y el número de linfocitos CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) específicos de VSRRP en los días de vacunación (d0, d21) y a los 0, 7, 14, y 21 dpi.

[0135] Resultados. El grupo pORF7t vacunado exhibió significativamente un menor número de la Treg específicas de VSRRP, mientras que hubo aumentos en el número de células Foxp3+ en los grupos de control durante todo el período observatorio (Figura 26). En el día de la estimulación (0 dpi), el número de linfocitos Foxp3+ del grupo vacunado con ADN fue inferior al de los controles (Figuras 26B-C). Tras la estimulación, el número de células Foxp3+ en el grupo vacunado con pORF7t permaneció más bajo que el de los grupos de control durante todo el experimento. Al final del período observatorio (21 dpi), el grupo vacunado con pORF7t tenía un número significativamente menor de Treg que los grupos de control (Figuras 26A-C). Tras la estimulación, hubo aumentos en el número de células productoras de IL-10 en cada grupo experimental. Sin embargo, el grupo vacunado con pORF7t exhibió un aumento más lento y una reducción más rápida en el número de células productoras de IL-10 (figuras 26D). El grupo vacunado con pORF7t tendía a tener parámetros inmunoestimulantes más altos que los grupos de control. Todos los cerdos de la estimulación mostraron signos clínicos de infección por VSRRP incluyendo la disminución en el apetito, fiebre, inflamación de los ojos, tos. Los animales del grupo pORF7t exhibieron un menor número de signos clínicos y respondieron a estímulos externos mejor que los otros grupos.

[0136] Tras la estimulación, VSRRP se detectó a partir 3dpi, alcanzó el máximo a 7-10 dpi y disminuyó gradualmente hasta el final del experimento (Figura 29). El grupo vacunado pORF7t era menos virémico y se recuperó más rápido que los grupos de control (Figura 29A). Hubo una tendencia de niveles más bajos de genoma viral en los pulmones y ganglios linfáticos traqueobronquiales de los cerdos vacunados con ADN (Figura 29B). Sin embargo, debido a la gran variación de datos dentro del grupo, no hubo diferencia estadística entre los grupos experimentales. La seroconversión de VSRRP se pudo detectar 2 semanas después de la estimulación. Hubo más animales seroconvertidos en el grupo vacunado pORF7t a los 21 dpi, sin embargo, no se observó diferencia significativa en los niveles de proporción S/P entre el grupo. Además, no se detectó ningún anticuerpo neutralizante específico de VSRRP en ningún grupo, a 21 dpi.

[0137] Los estudios patológicos a 10 dpi revelaron que VSRRP indujo cambios patológicos en los pulmones de todos los grupos (Tabla 12). Hubo un mayor grado de cambios patológicos macroscópicos en los pulmones y ganglios linfáticos de los grupos de control. A 21 dpi, los cambios patológicos observados fueron comparables entre los grupos (Tabla 13).

[0138] Resumen. Este estudio demostró que la vacuna prototipo de VSRRP-ADN podría modular las respuestas inmunitarias específicas de VSRRP en los cerdos estimuladaso vacunados como se esperaba. Se observaron un número reducido de Treg y un aumento de los parámetros inmunoestimulantes en el grupo vacunado con ADN, en particular, tras la estimulación. A 10 dpi, los cerdos vacunados pORF7t eran menos virémicos, mostraron mejores signos clínicos y menos cambios patológicos que los grupos de control.

Tabla 11. Porcentaje de seropositivos

Grupo

% de seropositivos* (No. de positivos/animales probados)

0 dpi

7 dpi 14 dpi 21 dpi

PBSA

0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 40 (2/5)

Nulo

0(0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5)

pORF7t

0 (0/5) 0 (0/5) 20 (1/5) 60 (3/5)

*positivo: Proporción S/P > 0,4

Tabla 12. Hallazgos patológicos hallazgos en cerdos estimulados vacunados a 10 dpi

Hallazgos macroscópicos

No. de cerdo

Grupo de tratamiento Fecha de la necropsia (DPI) Puntuación del pulmón Pleuritis Notas

A1

Nulo 10 0 Neg. -

A6

Nulo 10 1% Neg. pneumonía cranioventral

A20

Nulo 10 0 Neg. ampliación de 1,5 veces de los ganglios linfáticos inguinales superficiales

A29

Nulo 10 3% Neg. pneumonía cranioventral

A30

Nulo 10 0 Neg. -

A40

Nulo 10 0 Neg. -

B17

PBSA 10 0 Neg. pneumonía intersticial y hemorragia subcapsular en ganglios infáticos mediastinales

B30

PBSA 10 0 Neg. pneumonía intersticial y ampliación de 1,5 veces de los ganglios linfáticos inguinales superficiales

B35

PBSA 10 0 Neg. -

B37

PBSA 10 0 Neg. pneumonía intersticial leve y ampliación de los ganglios linfáticos inguinales superficiales y edema

B39

PBSA 10 14% Neg. pneumonía cranioventral y ampliación de 1,5 veces de los ganglios linfáticos inguinales superficiales

D8

pORF7t 10 0 Neg. -

D17

pORF7t 10 0 Neg. ampliación de 2 veces de los ganglios linfáticos inguinales superficiales

D21

pORF7t 10 0 Neg. -

D24

pORF7t 10 0 Neg. -

D34

pORF7t 10 0 Neg. -

No. de cerdo

Grupo de tratamiento Fecha de la necropsia (DPI) Lesión M. hyo Lesión VSSRP Dx patológica

A1

Nulo 10 1 1 pneumonía broncointersticial multifocal leve

A6

Nulo 10 1 1 pneumonía broncointersticial multifocal leve

A20

Nulo 10 1 1 pneumonía broncointersticial multifocal leve

A29

Nulo 10 0 2 pneumonía intersticial multifocal leve

A30

Nulo 10 1 1 pneumonía intersticial leve con congestión leve

A40

Nulo 10 1 1 pneumonía broncointersticial multifocal leve

B17

PBSA 10 1 1 pneumonía broncointersticial multifocal leve

B35

PBSA 10 1 1 pneumonía intersticial leve

B37

PBSA 10 1 1 pneumonía broncointersticial

multifocal leve

B39

PBSA 10 2 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

D8

pORF7t 10 1 2 pneumonía intersticial difusa moderada

D17

pORF7t 10 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

D21

pORF7t 10 0 1 pneumonía intersticial multifocal leve

D24

pORF7t 10 1 2 pneumonía intersticial difusa moderada

D34

pORF7t 10 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

P 0 1 2 3 P 0 1 2 3

untuación de la lesión SRRP : sin lesión pneumonía intersticial leve pneumonía intersticial multifocal moderada pneumonía intersticial multifocal severa untuación de la lesión M hyo sin lesión grado leve grado moderado grado severo

Tabla 13. Hallazgos patológicos en los cerdos estimulados vacunados a 21 dpi

Hallazgos microscópicos (no signos macroscópics indicados)

Cerdo No.

Grupo de Fecha de Lesión Lesión Dx patológica

tratamiento necropsia (DPI) M hyo VSSRP

A9

Nulo 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

A18

Nulo 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal leve

A19

Nulo 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

A22

Nulo 21 3 2 pneumonía broncointersticial multifocal severa

A36

Nulo 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

B1

PBSA 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

B6

PBSA 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal leve

B13

PBSA 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

B15

PBSA 21 1 1 pneumonía broncointersticial multifocal leve

B23

PBSA 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

D4

pORF7t 21 2 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

D16

pORF7t 21 2 1 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

D28

pORF7t 21 1 1 pneumonía broncointersticial multifocal leve

D36

pORF7t 21 2 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

D37

pORF7t 21 1 2 pneumonía broncointersticial multifocal moderada

Puntuación de la lesión SRRP

0: sin lesión

1: pneumonía intersticial leve

2: pneumonía intersticial multifocal moderada

3: pneumonía intersticial multifocal severa

Puntuación de la lesión M hyo

0: sin lesión

1: grado leve

2: grado moderado

3: grado severo

Ejemplo 8. Eficacia de la vacuna en cerdas jóvenes de sustitución en la granja positiva en VSRRP

[0139] Procedimientos. Se agruparon al azar cerdas de reemplazo de diecinueve semanas de edad de una granja 5 comercial con VSRRP negativo (30 cerdos/grupo) y se inmunizaron dos veces, a las 20 (d0) y 23 semanas (d21) de

edad con el sistema Dermavac. Los cerdos fueron trasladados al centro de fabricación con VSRRP positivo a las 9 semanas de edad (d35). Los grupos de inmunización fueron los siguientes; Grupo 1 PBSA (500 ul/dosis); Grupo 2 plásmido Nulo (pMASIA, 500 ug/500 ul/dosis); Grupo 3. vacuna de ADN (pORF7t, 500 ug/500 ul/dosis. A las 25 semanas de edad, las cerdas jóvenes se trasladaron a la granja con VSRRP positivo en la que estarían expuestas a 10 la cepa VSRRP local durante la aclimatación en la granja de recepción. La granja de recepción tiene un bajo nivel de pérdidas de PRDC y VSRRP. Se recogieron muestras de sangre heparinizada (6 cerdos/grupo) para el aislamiento de las PBMC y el análisis de las células productoras de IL-10 e IFNg específicas de VSRRP y el número de linfocitos CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) específicos de VSRRP en d0, 21, 35, 42, 49, 56, 70, y 98. Los procedimientos se llevaron a cabo en general como en el ejemplo anterior.

15

[0140] Resultados. No se observaron evidenciaa de reacción adversa a la vacuna en las cerdas jóvenes vacunadas. Después de la vacunación, las cerdas jóvenes vacunadas mostraron una tendencia de reducción de células productoras Treg CD4+CD25+Foxp3+ y productoras de IL-10 específicas de VSRRP y un aumento de células T efectoras de memoria y células productoras de IFNg específicas de VSRRP en comparación con los controles a lo

20 largo del experimento. Las cerdas jóvenes vacunadas con ADN contenían cantidades significativamente más bajas de linfocitos CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) y un mayor número de células productoras de IFNg específicas de VSRRP que los cerdos que recibieron PBSA en el día que se trasladaron (movieron) a la planta de producción positiva. Cabe señalar que hubo una variación bastante alta de datos dentro de los grupos experimentales.

25 [0141] Antes de moverse, los niveles basales de genoma de VSRRP en todos los grupos eran comparables, pero

después del movimiento, la infección por VSRRP se hizo evidente en todos los grupos, tal como se indica por el aumento de cargas virales de VSRRP en el suero. Se observaron las etapas virémicas a partir de 3 días después de movimiento (dpm), alcanzó su punto máximo alrededor de 10-14 dpm y duró aproximadamente 2 semanas. Las cerdas jóvenes vacunadas con pORF7t tendían a tener un aumento más lento en las cargas virales y un número de 30 copias inferior de genoma de VSRRP detectado en sus muestras de suero.

[0142] Resumen. La vacuna de ADN pORF7t exhibió actividades inmunomoduladoras como en estudios previos. Después de la exposición a VSRRP en la granja, hubo una tendencia de menor nivel de viremia de VSRRP y menos sacrificio en las cerdas jóvenes vacunadas con ADN, en comparación con los controles.

35

Tabla 14. Resultados reproductivos de cerdas jóvenes de recambio experimentales

Grupo

Cerda joven Apareamiento Número de lechones

No. Lote Nacidos Muertos Momificados Anomalia Semana Aplastado Vivo

congénita por la cerda

PBSA

78

1

5056 M 16 13 13

2

5363 M 21 20 20

3

5312 M 15 14 1 13

4

5220 M 17 13 1 12

5

4951 M 16 10 10

6

5273 Sacrificado 10/4

7

5245 M 17 10 10

Nulo

38

1

5071 Sacrificado 20/8

2

5293 M 26 en

3

5054 M 17 gestación* 15 1 2 12

4

5248 M 12 9 9

5

5083 Sacrificado 3/7

6

5131 M 18 5 5

7

4987 M 12 12 12

pORF7t

64

1

5077 M 18 9

2

5159 M 18 7

3

4978 M 22 11

4

5152 M 18 14

5

5062 M 18 12

6

4952 M 12 11

7

5368 Muerto 7/1 (durante aclimatación)

* al final del período de observación. Esta cerda joven requiere más de dos ciclos de apareamiento para ser productiva.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0143]

5

<110> Merial Limited

Chulalongkorn University Audonnet, Jean-Christophe Charreyre, Catherine 10 Suradhat , Sanipa

<120> Vacuna de PRRS con ADN transdérmico

15

<130> MER 10-164P

<150>

USSN 61/491,955

<151> 2011-06-01

<160> 18

20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 372

25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> ORF7 de PRRSV

30

<400> 1

atgccaaata acaacggcaa gcagcagaag agaaagaagg gggatggcca gccagtcaat 60

cagctgtgcc agatgctggg taagatcatc gctcagcaaa accagtccag aggcaaggga 120

35

ccgggaaaga aaaataagaa gaaaaacccg gagaagcccc attttcctct agcgactgaa 180

gatgatgtca gacatcactt tacccctagt gagcggcaat tgtgtctgtc gtcaatccag 240

40

accgccttta atcaaggcgc tgggacttgc accctgtcag attcagggag gataagttac 300

actgtggagt ttagtttgcc tacgcatcat actgtgcgcc tgatccgcgt cacagcatca 360

ccctcagcat ga 372

45

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> tradución de ORF7 de PRRSV

55

<400> 2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Met

Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly

1

5 10 15

Gln

Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala

Gln

20 25 30

Gln

Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys

35 40 45

Asn

Pro Glu Lys Pro Hi s Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg

50 55 60

Hi s

Hi s

Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln

65

70 75 80

Thr

Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly

85 90 95

Arg

Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr Hi s Hi s Thr Val

100 105 110

Arg

Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala

115 120

<210> 3

<211> 339

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> ORF7 truncado modificado de PRRSV (ORF7t)

<400> 3

atgccaaata acaacggcaa gcagcagaag agaaagaagg gggatggcca gccagtcaat cagctgtgcc agatgctggg taagatcatc gctcagcaaa accagtccag aggcaaggga ccgggaaaga aaaataagaa gaaaaacccg gagaagcccc attttcctct agcgactgaa

gatgatgtca gacatcactt tacccctagt gagcggcaat tgtgtctgtc gtcaatccag

accgccttta atcaaggcgc tgggacttgc accctgtcag attcagggag gataagttac

actgtggagt ttagtttgcc tacgcatcat actgtgtga

<210> 4

<211> 112 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> traducción de ORF7t de PRRSV <400> 4

Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Gln

Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala

Gln

20 25 30

Gln

Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys

35 40 45

Asn

Pro Glu Lys Pro Hi s Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg

50 55 60

Hi s

Hi s

Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln

65

70 75 80

Thr

Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly

85 90 95

Arg

Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr Hi s Hi s Thr Val

100 105 110

<210> 5

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador US-F de ORF7 <400> 5

aaaaaagaat tcatgccaaa taacaacggc aag

<210> 6 <211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador US-R de ORF7 <400> 6

aaaaaagaat tctcatgctg agggtgatgc tgtg

<210> 7

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador US-11R <400> 7

aaaaaagaat tctcacacag tatgatgcgt aggc

<210>

8

<211>

4283

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

pl ásmi do pMASIA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

<400> 8

gaattcgagc

cgctgatcag

gtgccttcct

attgcatcgc

agcaaggggg

gcgtaatcat

aacatacgag

tcacattaat

tgcattaatg

cttcctcgct

actcaaaggc

gagcaaaagg

ataggctccg

acccgacagg

ctgttccgac

cgctttctca

tgggctgtgt

gtcttgagtc

ggattagcag

acggctacac

gaaaaagagt

ttgtttgcaa

tttctacggg

gctgtcgttg

ttctgattag

atcaatacca

gttccatagg

acaacctatt

gacgactgaa

aggccagcca

tgattgcgcc

aatcgaatgc

aggatattct

tcccgggtac

cctcgactgt

tgaccctgga

attgtctgag

aggattggga

ggtcatagct

ccgcggaagc

tgcgttgcgc

aatcggccaa

cactgactcg

ggtaatacgg

ccagcaaaag

cccccctgac

actataaaga

cctgccgctt

tagctcacgc

gcacgaaccc

caacccggta

agcgaggtat

tagaagaaca

tggtagctct

gcagcagatt

gtctgacgct

tgtcgtcaag

aaaaactcat

tatttttgaa

atggcaagat

aatttcccct

tctggtgaga

ttacgctcgt

tgagcgagac

aaacgtctca

tctaatacct

catggcatgc

gccttctagt

aggtgccact

taggtgtcat

agacaatagc

gtttcctgtg

ataaagtgta

tcactgcccg

cgcgcgggga

ctgcgctcgg

ttatccacag

gccaggaacc

gagcatcaca

taccaggcgt

accggatacc

tgtaggtatc

cccgttcagc

agacacgact

gtaggcggtg

gtatttggta

tgatccggca

acgcgcagaa

cagtggaacg

tcagcgtaat

cgagcatcaa

aaagtcgttt

cctggtatcg

cgtcaaaaat

atggcaaaag

catcaaaatc

gaaatacgcg

ggaacactgc

ggaatgctgt

atcgatagat

tgccagccat

cccactgtcc

tctattctgg

aggcatgctg

tgaaattgtt

aagcctgggg

ctttccagtc

gaggcggttt

tcgttcggct

aatcagggga

gtaaaaaggc

aaaatcgacg

ttccccctgg

tgtccgcctt

tcagttcggt

ccgaccgctg

tatcgccact

ctacagagtt

tctgcgctct

aacaaaccac

aaaaaggatc

aaaactcacg

gctctgccag

atgaaactgc

ctgtaatgaa

atctgcgatt

aaggttatca

tttatgcatt

actcgcatca

atcgctgtta

cagcgcatca

ttttccaggg

ctcgagtcta

ctgttgtttg

tttcctaata

ggggtggggt

gggaaggcct

atccgctcac

tgcctaatga

gggaaacctg

gcgtattggg

gcggcgagcg

taacgcagga

cgcgttgctg

ctcaagtcag

aagctccctc

tctcccttcg

gtaggtcgtt

cgccttatcc

ggcagcagcc

cttgaagtgg

gctgaagcca

cgctggtagc

tcaagaagat

ttaagggatt

tgttacaacc

aatttattca

ggagaaaact

ccaactcgtc

agtgagaaat

tctttccaga

accaaaccat

aaaggacaat

acaatatttt

atcgcagtgg

gactagagct

cccctccccc

aaatgaggaa

ggggcaggac

cggactagtg

aattccacac

gtgagctaac

tcgtgccagc

cgctcttccg

gtatcagctc

aagaacatgt

gcgtttttcc

aggtggcgaa

gtgcgctctc

ggaagcgtgg

cgctccaagc

ggtaactatc

actggtaaca

tggcctaact

gttaccttcg

ggtggttttt

cctttgatct

ttggtcatga

aattaaccaa

tatcaggatt

caccaaggca

caacatcaat

caccatgagt

cttgttcaac

tattcattcg

tacaaacagg

cacctgaatc

tgagtaacca

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

tgcatcatca

ccagtttagt

cagaaacaac

ccctacatta

tcgtggcctc

gtaagcagac

gagattttga

aggcgtatca

gccattcagg

ccagctggcg

ccagtcacga

attggggatc

tgattattga

atggagttcc

ccccgcccat

cattgacgtc

tatcatatgc

tatgcccagt

atcgctatta

gactcacggg

caaaatcaac

ggtaggcgtg

actgcttact

gtgccaagag

tgcatgctat

atggtatagc

tgacgatact

ctatatgcca

ggtcccattt

ttttattaaa

ctcttctccg

tcatggtcgc

atgcccacca

gagctcggag

ggagtacgta

ctgaccatct

tctggcgcat

tcgcgagccc

gacgtttccc

agttttattg

gacacaacgt

cgaggcccta

ctgcgcaact

aaagggggat

cgttgtaaaa

gatccactag

ctagttatta

gcgttacata

tgacgtcaat

aatgggtgga

caagtacgcc

acatgacctt

ccatggtgat

gatttccaag

gggactttcc

tacggtggga

ggcttatcga

tgacgtaagt

actgtttttg

ttagcctata

ttccattact

atactctgtc

attatttaca

catagcgtgg

gtagcggcgg

tcggcagctc

ccaccagtgt

attgggctcg

taaaatgctt

catctgtaac

ctggcttccc

atttataccc

gttgaatatg

ttcatgatga

ggctttcccc

ttttaaattc

gttgggaagg

gtgctgcaag

cgacggccag

ttctagatcc

atagtaatca

acttacggta

aatgacgtat

gtatttacgg

ccctattgac

atgggacttt

gcggttttgg

tctccacccc

aaaatgtcgt

ggtctatata

aattgcggcc

accgcctata

gcttggggcc

ggtgtgggtt

aatccataac

cttcagagac

aattcacata

gatctccacg

agcttccaca

cttgctccta

gccgcacaag

caccgtgacg

gatggtggga

atcattggca

atacaagcga

atataaatca

gctcataaca

tatattttta

ccccccccca

gaaagtactg

gcgatcggtg

gcgattaagt

tgaattgtaa

gatgtacggg

attacggggt

aatggcccgc

gttcccatag

taaactgccc

gtcaatgacg

cctacttggc

cagtacatca

attgacgtca

aacaactccg

agcagagctc

gggaacggtg

gactctatag

tatacacccc

attgaccatt

atggctcttt

tgacacggac

tacaacaacg

cgaatctcgg

tccgagccct

acagtggagg

gccgtggcgg

cagatggaag

agaggcataa

acgctacctt

tagattgtcg

gcatccatgt

ccccttgtat

tcttgtgcaa

tgacattaac

gacctgttaa

cgggcctctt

tgggtaacgc

tacgactcac

ccagatatac

cattagttca

ctggctgacc

taacgccaat

acttggcagt

gtaaatggcc

agtacatcta

atgggcgtgg

atgggagttt

ccccattgac

tctggctaac

cattggaacg

gcacacccct

cgctccttat

attgaccact

gccacaacta

tctgtatttt

ccgtcccccg

gtacgtgttc

ggscccatgc

ccagacttag

tagggtatgt

acttaaggca

attctgtcag

tgccatgttt

cacctgattg

tggaatttaa

tactgtttat

tgtaacatca

ctataaaaat

cacgccattc

cgctattacg

cagggttttc

tatagggcga

gcgttgacat

tagcccatat

gcccaacgac

agggactttc

acatcaagtg

cgcctggcat

cgtattagtc

atagcggttt

gttttggcac

gcaaatgggc

tagagaaccc

cggattcccc

ttggctctta

gctataggtg

cccctattgg

tctctattgg

tacaggatgg

tgcccgcagt

cggacatggg

ctccagcggc

gcacagcaca

gtctgaaaat

gcggcagaag

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

4080

4140

4200

4260

4283

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

aagatgcagg

cagctgagtt gttgtattct gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg

ttctgttaac

ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca

ccagacataa

tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc

accgtcgtcg

acacgtgtga tcagatgact ctctagacca ggcgcctgga tccatatgac

gtcgacgcgt

ctgcagaagc ttc

<210> 9 <211> 4655 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <22 3> plásmido pORF7

<400> 9 gaattcatgc

caaataacaa cggcaagcag cagaagagaa agaaggggga tggccagcca

gtcaatcagc

tgtgccagat gctgggtaag atcatcgctc agcaaaacca gtccagaggc

aagggaccgg

gaaagaaaaa taagaagaaa aacccggaga agccccattt tcctctagcg

actgaagatg

atgtcagaca tcactttacc cctagtgagc ggcaattgtg tctgtcgtca

atccagaccg

cctttaatca aggcgctggg acttgcaccc tgtcagattc agggaggata

agttacactg

tggagtttag tttgcctacg catcatactg tgcgcctgat ccgcgtcaca

gcatcaccct

cagcgtgaga gctcccgggt accatggcat gcatcgatag atctcgagtc

tagactagag

ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt

tgcccctccc

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa

taaaatgagg

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg

gtggggcagg

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggaaggc

ctcggactag

tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc

acaattccac

acaacatacg agccgcggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat

gagtgagcta

actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc

tgtcgtgcca

gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg

ggcgctcttc

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag

cggtatcagc

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag

gaaagaacat

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc

tggcgttttt

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc

agaggtggcg

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc

tcgtgcgctc

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt

cgggaagcgt

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg

ttcgctccaa

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat

ccggtaacta

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

ccactggtaa

ggtggcctaa

cagttacctt

gcggtggttt

atcctttgat

ttttggtcat

ccaattaacc

catatcagga

ctcaccaagg

tccaacatca

atcaccatga

gacttgttca

attattcatt

attacaaaca

ttcacctgaa

ggtgagtaac

aaattctgtc

tttgccatgt

cgcacctgat

gttggaattt

attactgttt

aatgtaacat

acctataaaa

aacacgccat

ttcgctatta

gccagggttt

actatagggc

acgcgttgac

catagcccat

ccgcccaacg

atagggactt

gtacatcaag

cccgcctggc

tacgtattag

caggattagc

ctacggctac

cggaaaaaga

ttttgtttgc

cttttctacg

gagctgtcgt

aattctgatt

ttatcaatac

cagttccata

atacaaccta

gtgacgactg

acaggccagc

cgtgattgcg

ggaatcgaat

tcaggatatt

catgcatcat

agccagttta

ttcagaaaca

tgccctacat

aatcgtggcc

atgtaagcag

cagagatttt

ataggcgtat

tcgccattca

cgccagctgg

tcccagtcac

gaattgggga

attgattatt

atatggagtt

acccccgccc

tccattgacg

tgtatcatat

attatgccca

tcatcgctat

agagcgaggt

actagaagaa

gttggtagct

aagcagcaga

gggtctgacg

tgtgtcgtca

agaaaaactc

catatttttg

ggatggcaag

ttaatttccc

aatctggtga

cattacgctc

cctgagcgag

gcaaacgtct

cttctaatac

caggagtacg

gtctgaccat

actctggcgc

tatcgcgagc

tcgacgtttc

acagttttat

gagacacaac

cacgaggccc

ggctgcgcaa

cgaaaggggg

gacgttgtaa

tcgatccact

gactagttat

ccgcgttaca

attgacgtca

tcaatgggtg

gccaagtacg

gtacatgacc

taccatggtg

atgtaggcgg

cagtatttgg

cttgatccgg

ttacgcgcag

ctcagtggaa

agtcagcgta

atcgagcatc

aaaaagtcgt

atcctggtat

ctcgtcaaaa

gaatggcaaa

gtcatcaaaa

acgaaatacg

caggaacact

ctggaatgct

tataaaatgc

ctcatctgta

atctggcttc

ccatttatac

ccgttgaata

tgttcatgat

gtggctttcc

tattttaaat

ctgttgggaa

atgtgctgca

aacgacggcc

agttctagat

taatagtaat

taacttacgg

ataatgacgt

gagtatttac

ccccctattg

ttatgggact

atgcggtttt

tgctacagag

tatctgcgct

caaacaaacc

aaaaaaagga

cgaaaactca

atgctctgcc

aaatgaaact

ttctgtaatg

cgatctgcga

ataaggttat

agtttatgca

tcactcgcat

cgatcgctgt

gccagcgcat

gtttttccag

ttgatggtgg

acatcattgg

ccatacaagc

ccatataaat

tggctcataa

gatatatttt

cccccccccc

tcgaaagtac

gggcgatcgg

aggcgattaa

agtgaattgt

ccgatgtacg

caattacggg

taaatggccc

atgttcccat

ggtaaactgc

acgtcaatga

ttcctacttg

ggcagtacat

ttcttgaagt

ctgctgaagc

accgctggta

tctcaagaag

cgttaaggga

agtgttacaa

gcaatttatt

aaggagaaaa

ttccaactcg

caagtgagaa

tttctttcca

caaccaaacc

taaaaggaca

caacaatatt

ggatcgcagt

gaagaggcat

caacgctacc

gatagattgt

cagcatccat

caccccttgt

tatcttgtgc

catgacatta

tggacctgtt

tgcgggcctc

gttgggtaac

aatacgactc

ggccagatat

gtcattagtt

gcctggctga

agtaacgcca

ccacttggca

cggtaaatgg

gcagtacatc

caatgggcgt

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

4380

4440

4500

4560

4620

4655

60

120

180

240

300

360

420

480

540

ggatagcggt

ttgttttggc

acgcaaatgg

actagagaac

cgcggattcc

ctttggctct

atgctatagg

ctcccctatt

tatctctatt

tttacaggat

cgtgcccgca

tccggacatg

gcctccagcg

aggcacagca

gtgtctgaaa

cagcggcaga

ctcccgttgc

ccgcgcgcgc

ttttctgcag

gatccatatg

ttgactcacg

accaaaatca

gcggtaggcg

ccactgctta

ccgtgccaag

tatgcatgct

tgatggtata

ggtgacgata

ggctatatgc

ggggtcccat

gtttttatta

ggctcttctc

gctcatggtc

caatgcccac

atgagctcgg

agaagatgca

ggttctgtta

caccagacat

tcaccgtcgt

acgtcgacgc

gggatttcca

acgggacttt

tgtacggtgg

ctggcttatc

agtgacgtaa

atactgtttt

gcttagccta

ctttccatta

caatactctg

ttattattta

aacatagcgt

cggtagcggc

gctcggcagc

caccaccagt

agattgggct

ggcagctgag

acggtggagg

aatagctgac

cgacacgtgt

gtctgcagaa

agtctccacc

ccaaaatgtc

gaggtctata

gaaattgcgg

gtaccgccta

tggcttgggg

taggtgtggg

ctaatccata

tccttcagag

caaattcaca

gggatctcca

ggagcttcca

tccttgctcc

gtgccgcaca

cgcaccgtga

ttgttgtatt

gcagtgtagt

agactaacag

gatcagatga

gcttc

cagaagagaa

atcatcgctc

aacccggaga

cctagtgagc

acttgcaccc

catcatactg

actagagctc

ccctcccccg

aatgaggaaa

ccattgacgt

gtaacaactc

taagcagagc

ccgggaacgg

tagactctat

cctatacacc

ttattgacca

acatggctct

actgacacgg

tatacaacaa

cgcgaatctc

catccgagcc

taacagtgga

aggccgtggc

cgcagatgga

ctgataagag

ctgagcagta

actgttcctt

ctctctagac

agaaggggga

agcaaaacca

agccccattt

ggcaattgtg

tgtcagattc

tgtgagagct

gctgatcagc

tgccttcctt

ttgcatcgca

caatgggagt

cgccccattg

tctctggcta

tgcattggaa

aggcacaccc

cccgctcctt

ttattgacca

ttgccacaac

actctgtatt

cgccgtcccc

gggtacgtgt

ctggscccat

ggccagactt

ggtagggtat

agacttaagg

tcagaggtaa

ctcgttgctg

tccatgggtc

caggcgcctg

tggccagcca

gtccagaggc

tcctctagcg

tctgtcgtca

agggaggata

cccgggtacc

ctcgactgtg

gaccctggaa

ttgtctgagt

<210> 10 <211> 4622

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<22 3> plásmido pORF7t <400> 10

gaattcatgc caaataacaa cggcaagcag gtcaatcagc tgtgccagat gctgggtaag aagggaccgg gaaagaaaaa taagaagaaa actgaagatg atgtcagaca tcactttacc atccagaccg cctttaatca aggcgctggg agttacactg tggagtttag tttgcctacg atggcatgca tcgatagatc tcgagtctag ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

aggtgtcatt

gacaatagca

tttcctgtgt

taaagtgtaa

cactgcccgc

gcgcggggag

tgcgctcggt

tatccacaga

ccaggaaccg

agcatcacaa

accaggcgtt

ccggatacct

gtaggtatct

ccgttcagcc

gacacgactt

taggcggtgc

tatttggtat

gatccggcaa

cgcgcagaaa

agtggaacga

cagcgtaatg

gagcatcaaa

aagtcgtttc

ctggtatcga

gtcaaaaata

tggcaaaagt

atcaaaatca

aaatacgcga

gaacactgcc

gaatgctgtt

aaaatgcttg

atctgtaaca

tggcttccca

tttataccca

ctattctggg

ggcatgctgg

gaaattgtta

agcctggggt

tttccagtcg

aggcggtttg

cgttcggctg

atcaggggat

taaaaaggcc

aaatcgacgc

tccccctgga

gtccgccttt

cagttcggtg

cgaccgctgc

atcgccactg

tacagagttc

ctgcgctctg

acaaaccacc

aaaaggatct

aaactcacgt

ctctgccagt

tgaaactgca

tgtaatgaag

tctgcgattc

aggttatcaa

ttatgcattt

ctcgcatcaa

tcgctgttaa

agcgcatcaa

tttccaggga

atggtgggaa

tcattggcaa

tacaagcgat

tataaatcag

gggtggggtg

ggaaggcctc

tccgctcaca

gcctaatgag

ggaaacctgt

cgtattgggc

cggcgagcgg

aacgcaggaa

gcgttgctgg

tcaagtcaga

agctccctcg

ctcccttcgg

taggtcgttc

gccttatccg

gcagcagcca

ttgaagtggt

ctgaagccag

gctggtagcg

caagaagatc

taagggattt

gttacaacca

atttattcat

gagaaaactc

caactcgtcc

gtgagaaatc

ctttccagac

ccaaaccatt

aaggacaatt

caatattttc

tcgcagtggt

gaggcataaa

cgctaccttt

agattgtcgc

catccatgtt

gggcaggaca

ggactagtgg

attccacaca

tgagctaact

cgtgccagct

gctcttccgc

tatcagctca

agaacatgtg

cgtttttcca

ggtggcgaaa

tgcgctctcc

gaagcgtggc

gctccaagct

gtaactatcg

ctggtaacag

ggcctaacta

ttaccttcgg

gtggtttttt

ctttgatctt

tggtcatgag

attaaccaat

atcaggatta

accaaggcag

aacatcaata

accatgagtg

ttgttcaaca

attcattcgt

acaaacagga

acctgaatca

gagtaaccat

ttctgtcagc

gccatgtttc

acctgattgc

ggaatttaat

gcaaggggga

cgtaatcatg

acatacgagc

cacattaatt

gcattaatga

ttcctcgctc

ctcaaaggcg

agcaaaaggc

taggctccgc

cccgacagga

tgttccgacc

gctttctcat

gggctgtgtg

tcttgagtcc

gattagcaga

cggctacact

aaaaagagtt

tgtttgcaag

ttctacgggg

ctgtcgttgt

tctgattaga

tcaataccat

ttccatagga

caacctatta

acgactgaat

ggccagccat

gattgcgcct

atcgaatgca

ggatattctt

gcatcatcag

cagtttagtc

agaaacaact

cctacattat

cgtggcctcg

ggattgggaa

gtcatagctg

cgcggaagca

gcgttgcgct

atcggccaac

actgactcgc

gtaatacggt

cagcaaaagg

ccccctgacg

ctataaagat

ctgccgctta

agctcacgct

cacgaacccc

aacccggtaa

gcgaggtatg

agaagaacag

ggtagctctt

cagcagatta

tctgacgctc

gtcgtcaagt

aaaactcatc

atttttgaaa

tggcaagatc

atttcccctc

ctggtgagaa

tacgctcgtc

gagcgagacg

aacgtctcag

ctaatacctg

gagtacgtat

tgaccatctc

ctggcgcatc

cgcgagccca

acgtttcccg

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

4380

4440

4500

4560

4620

ttgaatatgg

tcatgatgat

gctttccccc

tttaaattcg

ttgggaaggg

tgctgcaagg

gacggccagt

tctagatccg

tagtaatcaa

cttacggtaa

atgacgtatg

tatttacggt

cctattgacg

tgggactttc

cggttttggc

ctccacccca

aaatgtcgta

gtctatataa

attgcggccg

ccgcctatag

cttggggcct

gtgtgggtta

atccataaca

ttcagagact

attcacatat

atctccacgc

gcttccacat

ttgctcctaa

ccgcacaagg

accgtgacgc

ttgtattctg

gtgtagtctg

ctaacagact

cagatgactc

ctcataacac

atatttttat

ccccccccat

aaagtactgg

cgatcggtgc

cgattaagtt

gaattgtaat

atgtacgggc

ttacggggtc

atggcccgcc

ttcccatagt

aaactgccca

tcaatgacgg

ctacttggca

agtacatcaa

ttgacgtcaa

acaactccgc

gcagagctct

ggaacggtgc

actctatagg

atacaccccc

ttgaccatta

tggctctttg

gacacggact

acaacaacgc

gaatctcggg

ccgagccctg

cagtggaggc

ccgtggcggt

agatggaaga

ataagagtca

agcagtactc

gttcctttcc

tctagaccag

cccttgtatt

cttgtgcaat

gacattaacc

acctgttaac

gggcctcttc

gggtaacgcc

acgactcact

cagatatacg

attagttcat

tggctgaccg

aacgccaata

cttggcagta

taaatggccc

gtacatctac

tgggcgtgga

tgggagtttg

cccattgacg

ctggctaact

attggaacgc

cacacccctt

gctccttatg

ttgaccactc

ccacaactat

ctgtattttt

cgtcccccgt

tacgtgttcc

gscccatgcc

cagacttagg

agggtatgtg

cttaaggcag

gaggtaactc

gttgctgccg

atgggtcttt

gcgcctggat

actgtttatg

gtaacatcag

tataaaaata

acgccattcg

gctattacgc

agggttttcc

atagggcgaa

cgttgacatt

agcccatata

cccaacgacc

gggactttcc

catcaagtgt

gcctggcatt

gtattagtca

tagcggtttg

ttttggcacc

caaatgggcg

agagaaccca

ggattccccg

tggctcttat

ctataggtga

ccctattggt

ctctattggc

acaggatggg

gcccgcagtt

ggacatgggc

tccagcggct

cacagcacaa

tctgaaaatg

cggcagaaga

ccgttgcggt

cgcgcgccac

tctgcagtca

ccatatgacg

taagcagaca

agattttgag

ggcgtatcac

ccattcaggc

cagctggcga

cagtcacgac

ttggggatcg

gattattgac

tggagttccg

cccgcccatt

attgacgtca

atcatatgcc

atgcccagta

tcgctattac

actcacgggg

aaaatcaacg

gtaggcgtgt

ctgcttactg

tgccaagagt

gcatgctata

tggtatagct

gacgatactt

tatatgccaa

gtcccattta

tttattaaac

tcttctccgg

catggtcgct

tgcccaccac

agctcggaga

agatgcaggc

tctgttaacg

cagacataat

ccgtcgtcga

tcgacgcgtc

gttttattgt

acacaacgtg

gaggccctat

tgcgcaactg

aagggggatg

gttgtaaaac

atccactagt

tagttattaa

cgttacataa

gacgtcaata

atgggtggag

aagtacgccc

catgacctta

catggtgatg

atttccaagt

ggactttcca

acggtgggag

gcttatcgaa

gacgtaagta

ctgtttttgg

tagcctatag

tccattacta

tactctgtcc

ttatttacaa

atagcgtggg

tagcggcgga

cggcagctcc

caccagtgtg

ttgggctcgc

agctgagttg

gtggagggca

agctgacaga

cacgtgtgat

tgcagaagct

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

4622

21

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

tc

<210> 11 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<22 3> cebador F de pMASIA <400> 11

cagtgtagtc tgagcagtac t

<210> 12 <211> 4840

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<22 3> plásmido pBAD-ORF7 <400> 12

aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac tctcgctaac caaaccggta accccgctta aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag attattcatc tgactgatga ttcttttgat ctggttgatt tctgggcaca ctggtgcggt gaaatcgctg acgaatatca gggcaaactg ccgggcactg cgccgaaata tggcatccgt ggtgaagtgg cggcaaccaa agtgggtgca gacgctaacc tggccggctc tggatccggt ttcaccatgc caaataacaa cggcaagcag gtcaatcagc tgtgccagat gctgggtaag aagggaccgg gaaagaaaaa taagaagaaa actgaagatg atgtcagaca tcactttacc atccagaccg cctttaatca aggcgctggg agttacactg tggagtttag tttgcctacg gcatcaccct cagcgaaggg cgagctcaag ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat tccagcttgg ctgttttggc ggatgagaga aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt

attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca tctataatca cggcagaaaa gtccacattg ccatagcatt tttatccata agattagcgg ctactgtttc tccatacccg tttttttggg gagatataca tacccatggg atctgataaa actgatgtac ttaaggcaga tggtgcaatc ccgtgcaaaa tgatcgctcc gattctggat accgttgcaa aactgaacat cgatcacaac ggtatcccga ctctgctgct gttcaaaaac ctgtctaaag gtcagttgaa agagttcctc gatgacgatg acaagctggg aattgatccc cagaagagaa agaaggggga tggccagcca atcatcgctc agcaaaacca gtccagaggc aacccggaga agccccattt tcctctagcg cctagtgagc ggcaattgtg tctgtcgtca acttgcaccc tgtcagattc agggaggata catcatactg tgcgcctgat ccgcgtcaca cttgaaggta agcctatccc taaccctctc catcaccatc accattgagt ttaaacggtc agattttcag cctgatacag attaaatcag tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

ctgaccccat

cccatgcgag

tgggcctttc

ccgggagcgg

ccataaactg

tttctacaaa

acaataaccc

tttccgtgtc

agaaacgctg

cgaactggat

aatgatgagc

gcaagagcaa

agtcacagaa

aaccatgagt

gctaaccgct

ggagctgaat

aacaacgttg

aatagactgg

tggctggttt

agcactgggg

ggcaactatg

ttggtaactg

ttaatttaaa

acgtgagttt

agatcctttt

ggtggtttgt

cagagcgcag

gaactctgta

cagtggcgat

gcagcggtcg

caccgaactg

aaaggcggac

tccaggggga

gcgtcgattt

gccgaactca

agtagggaac

gttttatctg

atttgaacgt

ccaggcatca

ctcttttgtt

tgataaatgc

gcccttattc

gtgaaagtaa

ctcaacagcg

acttttaaag

ctcggtcgcc

aagcatctta

gataacactg

tttttgcaca

gaagccatac

cgcaaactat

atggaggcgg

attgctgata

ccagatggta

gatgaacgaa

tcagaccaag

aggatctagg

tcgttccact

tttctgcgcg

ttgccggatc

ataccaaata

gcaccgccta

aagtcgtgtc

ggctgaacgg

agatacctac

aggtatccgg

aacgcctggt

ttgtgatgct

gaagtgaaac

tgccaggcat

ttgtttgtcg

tgcgaagcaa

aattaagcag

tatttttcta

ttcaataata

ccttttttgc

aagatgctga

gtaagatcct

ttctgctatg

gcatacacta

cggatggcat

cggccaactt

acatggggga

caaacgacga

taactggcga

ataaagttgc

aatctggagc

agccctcccg

atagacagat

tttactcata

tgaagatcct

gagcgtcaga

taatctgctg

aagagctacc

ctgtccttct

catacctcgc

ttaccgggtt

ggggttcgtg

agcgtgagct

taagcggcag

atctttatag

cgtcaggggg

gccgtagcgc

caaataaaac

gtgaacgctc

cggcccggag

aaggccatcc

aatacattca

ttgaaaaagg

ggcattttgc

agatcagttg

tgagagtttt

tggcgcggta

ttctcagaat

gacagtaaga

acttctgaca

tcatgtaact

gcgtgacacc

actacttact

aggaccactt

cggtgagcgt

tatcgtagtt

cgctgagata

tatactttag

ttttgataat

ccccgtagaa

cttgcaaaca

aactcttttt

agtgtagccg

tctgctaatc

ggactcaaga

cacacagccc

atgagaaagc

ggtcggaaca

tcctgtcggg

gcggagccta

cgatggtagt

gaaaggctca

tcctgagtag

ggtggcgggc

tgacggatgg

aatatgtatc

aagagtatga

cttcctgttt

ggtgcacgag

cgccccgaag

ttatcccgtg

gacttggttg

gaattatgca

acgatcggag

cgccttgatc

acgatgcctg

ctagcttccc

ctgcgctcgg

gggtctcgcg

atctacacga

ggtgcctcac

attgatttaa

ctcatgacca

aagatcaaag

aaaaaaccac

ccgaaggtaa

tagttaggcc

ctgttaccag

cgatagttac

agcttggagc

gccacgcttc

ggagagcgca

tttcgccacc

tggaaaaacg

gtggggtctc

gtcgaaagac

gacaaatccg

aggacgcccg

cctttttgcg

cgctcatgag

gtattcaaca

ttgctcaccc

tgggttacat

aacgttttcc

ttgacgccgg

agtactcacc

gtgctgccat

gaccgaagga

gttgggaacc

tagcaatggc

ggcaacaatt

cccttccggc

gtatcattgc

cggggagtca

tgattaagca

aacttcattt

aaatccctta

gatcttcttg

cgctaccagc

ctggcttcag

accacttcaa

tggctgctgc

cggataaggc

gaacgaccta

ccgaagggag

cgagggagct

tctgacttga

ccagcaacgc

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 3420

atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 3480

cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg 3540

gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac 3600

aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg 3660

gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 3720

ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 3780

ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagcagatca attcgcgcgc gaaggcgaag 3840

cggcatgcat aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac 3900

tccgtcaagc cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca 3960

ttcacttttt cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta 4020

aatacccgcg agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata 4080

ggcatccggg tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag 4140

cttaagacgc taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag 4200

caaacatgct gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg 4260

tactgacaag cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct 4320

tccatgcgcc gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc 4380

ccttcccctt gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc 4440

gcttcatccg ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca 4500

tgccagtagg cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga 4560

tgacgaccgt agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa 4620

acaaattctc gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata 4680

taacctttca ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc 4740

ggcgttaaac ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt 4800

tgcgcttcag ccatactttt catactcccg ccattcagag 4840

<210> 13

<211> 15412

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> 01NP1-PRRSV - Número de acceso de Genbank Q056373 - ilustrado en

FIG. 2 <400> 13

atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg gcatttgtat tgtcgggagc tgtgaccatt 60

ggcacagccc aaaacttgct gcacagaaac acccttctgt gatagcctcc ttcaggggag 120

cttagggttt gtccctagca ccttgcttcc ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc 180

cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt 240

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

atggcggagg

aacctccaag

cggtggacgt

ctttctgcaa

atggtacggg

gctctacaag

gtggccgttt

gtgttgacca

tgtgctatgg

aaaatctcct

ttgaagttga

tctaagttcg

ggctgccttc

cttccactgg

aagcatggtg

gtaactgacc

cgccatttga

agggttgagc

agtcacaagt

acagtcgctg

gccggcgcca

ggttggcact

cttcccgaaa

atccaaatcc

tacgtactta

tctttgctcc

ccagatgcag

atgcacctgc

cgttcggctt

ggagggaatc

gaggactgct

aagattgacc

aaagcgcgcc

gttgaggcgg

gccaagtcta

tttctgagct

tgccacgtgc

tctttccaat

tcgcagctga

tttatgaacg

tcgccaattc

acctgccgct

ctactgtcta

gggcccctcg

ttgcgaaccg

ccttcacagc

ccgctgacac

aagttcagaa

tctctggcaa

taaacggacc

aactggcggg

ctaacacgtc

ggtacggcgc

gccgcgcttt

acaaggctga

gcatttccgc

gagtgagacc

tcagactccc

agctggaagg

ctcttgaatg

tcgaggtctc

ctagcagtgc

ctccggtcac

accctgacca

gctgttccca

tgtacctccg

cgccacgcgt

caacccagac

ctgcacacga

cggggtgcta

attccccact

cgcacgaatg

gctttacaga

gggttgccgc

cctacatgtg

cccgcagaga

tgacattggt

tggcggggat

gctccgcacc

ccctgggtgt

tgtccctgaa

caaagaaatt

gtacctacag

tatcgtcgta

agaacccagc

gccattggct

tggaaagaga

gtccgttcgt

gcacctcaaa

catcgccaac

tccagatgac

tgcggcctta

tgagcattgg

tgttcagggc

cggatttgac

tatcccagcc

caccgtgtgg

agtgcgctta

gaacaaaacc

tggtgcaaca

aatcgacacc

gatcaagctg

tgcctcagtg

ggcctattct

gttgagtgct

accagtggaa

gccggccagc

tggtacccca

agtgataaac

cccaagcctg

catgacgccg

gaagtgaaat

tccttcccgc

ggtgtttcta

ggcaactgct

cgccatgcta

cggaggctgc

cagtacttct

tactctgggt

gacaaggaag

gcaagaaaag

gaaacccggc

cactactccc

cggatggtga

tgggctactg

gacaggaacg

actgtcactg

tgttgtgggc

cctgcctgcc

gctctggccg

actgtttcgc

gggaaaatta

aaccgggtca

aatcttgaag

ttctttgatt

ccccaggtca

cacggtctct

acaggcccga

cccccgccgg

acctgaactt

tcacccctgc

ttgttggacc

ctttcccggg

aagacttttg

tcatgtatgt

ttgaagctgt

cccaccacac

tgcgggtcga

ggtggagctt

accaatttgg

aagttaatgg

tcgttaagga

ttgaggacct

aaaaaatttt

cacgctcttg

aggccaagga

cgcctgccga

attccaaatt

acgaggatct

gtgcttgtac

tgacccctgg

acaagggcgg

ttgaccggct

aaatgtctgg

agttctttgc

tcagcctttg

ccccggagga

aatgcttggc

gggatgttgt

accagtgtcg

ccttcccctg

agagccactc

ggcctgctgg

ccaacaaaga

agtcttgaag

tgtccctgga

agcaactcac

cccctttgag

ggccgaaagg

ccccggggag

agtggacatg

acgccaacac

gtttgacttg

ctaccagacc

tctccgagca

gagttggatc

cctcagaata

ccggtttggc

tgcgactgct

gcacgaggtt

agggaattgt

tgaaaccacc

tgtgaatgcc

tagcgccaag

gatgtcccct

tcttggttcc

ggctgaggtg

cgattccgat

ccgtcacagc

tcaggtgatt

ggtcgcagca

caggcttgag

gctccctggg

tgctctggtc

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

cctgttgtga

gctaactact

gtgctctcca

ggtccacggc

ttgctgaaac

gttgacctaa

aaagttcagc

gccccgcgca

cctaacagtt

ccggcaacac

gcgacaccct

gtgacaccct

aaaagattga

gcttcctcac

ctgggagtag

aacattaaac

ccaaaatact

gaggtaaagg

gaccctgcta

cgcaacacgt

aaaatgatac

cctgcacctt

gttccacgca

gccttctccg

cggaggcctg

accgatttgc

aaaagaaaag

catctccctg

tggggttttg

ggtattgctc

tttggctgct

gctgcttgtg

aaaccttggg

cttggcaggt

ctcaaaagtc

actaccgtgc

agttggaaaa

ccacactgcc

tggctaacgc

aaacttgggt

ctcgaaaaac

ggaaggttgg

gggaagattt

cttcaagtga

tgagtgagcc

tgagtgagcc

gttcggcggc

agactgaata

aggggcatga

ctgcgtccgt

cagctcaagc

aaacatgcct

cgcaggaatg

ctgtttacca

tcgagacacc

ccgtaggtgc

tcctcgagaa

aggataaacc

acgagagcac

cgccttcaga

ctgaaaggct

ttttcttctc

cagcttttac

ccctcttggg

ggttggcttt

agtttgactc

accctgttcg

tactgggcgg

cttggacaac

gcaaggtgac

ggttgttcga

acgcgggctc

ccagacgact

caagaactac

gaagcctgtc

gtccgattgt

ggctgttagt

gctggtgatt

ggctccaatt

gatccctgtg

ggcaatccca

tgaggcctct

agctgaggaa

gtcatcaagc

catcatcgac

tagtgtcatg

gctttctcgc

ggcgatttgc

gccgccctat

ggagagcgac

aatagaaaat

ggtagatgac

atcagctccg

tggcgcggat

ctttgaccaa

acgccttttc

tctattgtgc

tgtgttttct

tgctgttggt

gccagagtgt

cagccttgtt

ggcacgctgc

aactcggtcc

gaagttcgtc

gaagaatatg

gacgaactca

tcggacatga

ccgcggtgga

aagagcttgc

ggcagcccgg

agcccctttg

gtgtcctcac

cccgcacctc

cccgcaccgc

ccgtaccaga

cccccagcac

accctgagtg

agctccttgt

tcgggcgggc

cgcgaggcat

atgtgggatc

accttagatg

ccgtgtgagt

cttaccattg

gtcggcgaga

caacttgtca

tccgcaggca

gcggacgggg

ctgagccgtc

taccctggcg

ctctttttat

gggtcttctc

ctgttcaagc

agaaacatcc

gtgggccccg

atctggcact

ccctgaccgc

accgtgaaag

ggctcatgcc

aagcccagat

tggcctgggc

caccaccacc

cggagagaaa

tttcattagg

atctcccgac

cgcaatgcat

gcggaactgt

ggcgtaagtt

acgagcccct

cgccgcagag

aaatctcgga

ccagcgtgag

cctgcagtgg

gtgatgcgac

gggtggacat

gcaggttaaa

ttgtgatgat

gctcagttgc

tggccaacca

acgacccccg

caggtggcgc

gggggccgtt

aggtttttga

gtggttattc

gttacagtta

ggcgcgttcg

ctgtgtccga

ttcattcttt

tcggtctcgg

ttttgcttag

cttttcactg

actaaccgcc

aaccgagcct

ggaggaggac

agtcgagcag

ccctccgcca

gcctgtcccc

cggcgatgtc

cccacctgag

cttcaggccg

gtctcgaccg

tcagcaggtg

ggatttgtct

cgggggcgtt

catgtcgggt

aatcacacgc

gcatctccaa

taagcttgat

gctgacttgg

gttcctccca

gcctcacacg

tactgaagat

gggacccttg

gatatcgtcg

cggctctttt

tcggacggta

cctcgtctcc

tccgggtgat

cccagccttt

aatgggggtt

cccagtcggc

tgagcttctc

tcttgccatt

gcttggcatt

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

4380

4440

4500

4560

4620

4680

4740

4800

4860

4920

4980

5040

5100

5160

5220

5280

5340

5400

5460

5520

5580

5640

5700

5760

5820

5880

5940

6000

6060

6120

6180

6240

6300

6360

gttgcagact

tggggatctt

cgtgcgacca

gaccccattt

caaccctctg

actgtggtcg

gcgggtgggg

ttccgagccc

gaccctgaca

ggtgtagggg

gggggaggcc

cttgctggga

tgcgctaacc

tgcatttacc

caagaaattg

agctgtaagg

cttacctggt

accatcctat

atggtgttgt

accccctacg

gcaccagatg

ctgtttaccc

tcactgaaca

gacgggaaag

tccggggtcg

gattgcccga

ggccgtgcct

gccttctgct

cttgtcggcg

ggccagtttt

cctaaggtcc

gtgccttcag

accgtccaac

cccttggttg

gtatcttggc

gtataagaac

ggtcgtcact

ttctcgccac

aaaaacccat

cccagcctta

cgatggtggc

ccttctttcc

ctttcactgc

actttgccca

cacatctcat

tttatgtgac

cgtttgccgt

aacacggcct

ccttggtcgt

ctgacatgct

tgctttgtgt

ggttggtgtt

tggtttctct

acattcatca

ggacctactt

cgtcccagct

ccgtcaatgt

tcaagtgcgt

gcttcaatca

attggcaagg

attggctaac

tcaccgcatg

ttcacacggg

gtaatgtggc

cgctcggtga

atctttgtgc

ttctttgtgt

ctgtgagttt

tggagcttac

tgctcctaat

tatcgacctg

tgggtggcgc

cgcgtttgcc

tgaccccaac

taaggcggtc

cactggagtg

agctctccgg

gctgaatgga

ggctgccctg

tgcggtgggt

ccctggctac

taccctgccc

tttgattttt

gtgtgttttg

gtttccttgc

tttcttgatt

ttggcttctt

ttacaccagt

ggccgctgtc

tgggtctctt

gatcgggtcc

aactgccgca

aatgcttgac

ggctgccccc

atcctctggc

tggcgattcc

atcgaataaa

acccatcaag

tgtgaaggtc

cttgcttgct

gttttttctc

ctttattttg

gtgctttctc

gaggtcgctt

tgcgatcggt

gggtgctggg

caattggatg

caagccgtaa

ccaaaagtgg

aaagttgacc

tctggctact

ttaaaaatca

catgttgcct

tcttgcggca

ggacctggct

ttgacagcac

gtttccatcg

cttgcaattg

tggttgcgct

tctgtgaata

ggtcgttata

ggcccccgcg

cgccgcgctg

cttgagggtg

tccatgggct

catgtcctta

tttgacgtaa

aagacccaat

gtcgaacccg

gggtccccag

caaggggggg

ctaagcgaat

ggcagccaca

gccaaacctg

ctgtggagaa

aatgaggttc

aaggtaggtg

ttaacgtgtt

tttgtgcgcc

ccggccgaag

aaaagaagat

agtgcttgcg

tcaaggtttc

ctgattgcag

ccaccacaaa

ggcaaatttc

gctcgatggc

ccggcaccaa

ctctctgcac

ttgtggcggg

gaggcatggc

ccagctatgt

gtttttcttt

tgccttcagg

ctaatgttgc

gtgttgccgc

cgttgactgg

ctttcagaac

ctggcggggt

cgggcaattc

agggagattt

tctgcacgga

gcgtcattgg

tgatcaccga

gcattgttac

taagtgaatt

taattaaaga

aactggaagg

tgatgggaca

tcccagccgt

taaaaagtgc

tcctttcaca

aaaaggaatg

ccccattgag

tacggctagg

ggtattgcag

cgctgttcca

ggtcgtggtt

cctcgtcctt

caagccttca

tctgcacatg

cgacccgtgg

gtccagattg

attcggtatt

tcataggttg

ttgggtacct

gcaccccctc

aatcttggcc

tggccttgtc

cttggctacc

ccgcaccatg

tcgaaagccc

gtttaccatc

agctcgggtt

cgctatagct

tggatggact

aaaaggattc

ggccggtgag

gcgcccctca

ctttgctggg

cataagcgag

aggcctctcc

tgcctggacg

cctggtccgg

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

6420

6480

6540

6600

6660

6720

6780

6840

6900

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

agtgttttct

ctgatgatca

agcctcggtg

caggcagtga

ccagtcccag

aagtaccgtg

ttgagatact

catgagtctc

atgaaatgga

caatttatcg

gttgataaag

caactctcgc

gacctaaagg

gggtccaaaa

gtgcccatcc

gaccgtttga

gggaaaaagt

cataataaca

gagaagggaa

tccccatctg

gaagctgcaa

actgccaaag

gagcagtgtt

ttgttactga

ctgtgaattt

acccggttgc

ttatagacgt

cgggaaacac

aagtcgcact

aaattggtct

ttctgcagaa

cagtgcacgc

tcttggccac

tccttgatta

cctttggaat

ggcttctaac

cagtgaccgg

tgaatttgag

tgatcacgtg

gcctgcacca

ttgccgaggg

tgactggtgc

ctgattttaa

aggctgccta

ttcgaggtac

ccggtgacat

ttggtatcac

tgaccgtggc

ccctcccacc

ataagaagaa

accagaaatt

cagatgagtg

ctctgtgtgg

gtaagaagtt

agctttccgt

aactggagaa

taaactgcta

aacagcggta

aaaagtggcc

gagaccgatc

cttgatctcc

tgggatcgat

cagtgcgcaa

cccttacaag

tacaaggttt

ggctgcctgc

gaccatgccc

ccttgactct

gtttgtgctc

agcagctctt

ttttgtcgca

cacctatgca

tggtgtcgtg

tatccttgtt

aaagttgagg

cctcgctatg

gtgctttgtt

tgctaaagca

tttggccaaa

tgttgtcgct

caagcatacc

gcgcgtcgtc

gaaagttctg

gaggcgcagg

ttgggacaag

ggagtgtctc

acatgtcacc

cttggtcccc

ggagcaggcc

actgaaaaga

gccgccagcg

aaaatagtca

agtgaggttg

gatggtggag

ggtgctgatg

ggcacgctct

ataatacagg

ctgcaccctg

ggagacatac

cttacgccca

cccgggtttg

aggcctgact

tcctggctca

aacaggaaca

gatcttgcgg

ttcctgcctc

cacctacttg

ggcgatggag

gaaggggtgt

agactcaatg

tctgcgtcca

cttagagtag

cttgaagctt

ctccgccaca

ctccaagcca

gacccgaccc

gagaatggcc

atggaagccc

aattccggtg

agagttggcg

attgaaaaca

gtcaacccag

ctaggtatga

ataattgaca

acttgacccg

aatttcacaa

agctaaaaga

ttgtgctcct

catctcccaa

gggattttga

cttgtgacat

ttaggggtaa

cttacaaaac

acgccactcc

agttatatgt

gccctaaact

cgccatggtc

gatggtcact

ccactcaggg

ggatgatggt

ccatcatttt

tgttctctgc

cgcaatcctg

acgaggactt

acatgaggaa

aactggccca

ttgctgatac

cgcctgtggg

ttgagaccag

ccacgccccc

ccaacgcttg

tcggcatcta

atgtgtttta

accctgccga

aggcttacca

agaatggaag

tgaatgtcga

aactccaggg

ctgtggtcgc

ccggaccttc

cgcggttgag

gcgttccgcg

gttacttgcc

gtccgaagcc

taggcgcggc

ccctgagcgg

ccccagtgac

ggtgactgat

accgaccata

gctgacagag

tgcgcaagtt

tgcctttttc

gcatccgttg

tgtgacctca

gtacttgttt

ggctttcttc

cggaatgaat

ggatttcctt

tgcagcgggt

gttggtgcag

cgtggcacct

cagtatcttc

agtccttgct

acccgcaccc

gggggatgag

tgttatgggc

tgaggaggtc

ctttgaccct

tgtttacacc

agttcaatgg

cggcgaactg

cctgactaag

ggcggcttgg

accctgggac

cacaaccaac

gttccttcgc

catcacgggc

actaaagagg

gacgctcctg

gtgaaaggag

actggaagcc

gggcgctccg

ccagcgtctg

cacggctgca

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8820

8880

8940

9000

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

9480

9540

9600

9660

9720

9780

9840

9900

9960

10020

10080

10140

10200

10260

10320

10380

10440

aagatgccgc

ctggagttct

ttcatcggcc

tcccaaccaa

gagaaaactg

agactaggac

gtggtgttac

acaagtttaa

cctgcgatcg

ttgcctgtgc

tcacgcagtc

ctgtgtctaa

tcaaaagtgg

tgctcaaggt

ccaccatgcc

cggacccaaa

atgggcgcca

aggcgagtaa

cttgtttgga

cccgcaagga

tcaggtccaa

cgtacgctac

gtccagtcac

cccctgtagg

ccccacggac

accaaactcg

taccagacgg

tcgctgtcgc

aaacatactg

agaccatgct

caacgctgca

gttggtgtcc

ttttgaggct

cagtgggttt

actgaaagac

tcgccttgtg

ttctacttac

ggacattcag

gcaaactgtc

catactcggc

ccagggcttc

ggagctacag

atccacgcct

tgaagagcat

cggcgcagtg

caccatttat

tcacccccat

tcaacccctg

aaactatcac

gaagacagca

gctagtcccc

tgtttctgaa

gtatgatcct

cggctacagc

ttatgagggg

tgcctgtggc

aatctggtgt

gaaaggcaca

cgttatcatg

ccgcggatta

tgattatgct

ttccaatgta

gctccttcaa

tgacatgatt

attccccgtc

tggcaagaat

tcttagtaaa

tgattctcat

ctctctaaat

cggaaatacc

cctgctaaga

agcgtccctg

accccttgta

accaataact

atgaaaaagg

actccggtcc

gcaattgtcc

ctaccgtcgt

actaagagag

agtttggtga

ggccttctgt

atcgtctatt

tggtgggttg

ataacagact

aaccgtgaca

tactatgcct

gaatggtttg

tttcccggca

aagaagtcga

ctcgacgtct

ggccatccag

agccctttag

catgtggagc

gtctctgtca

agcaccgcct

ttgcgcagca

caggtccagg

agggctttgg

ccctcccgca

tccttcctag

actaccctca

tgctatgttt

atgacttgtc

tgtttgccca

attctatggc

aaatcgacgt

ctcttaagaa

tcatcgcact

cgtttaactc

tgggcaggtg

gctggtttgc

acgtgctgaa

gtggcctgtc

tctatgcaca

tcttacaaga

cggacgacct

aacatctgaa

cgccatcatt

ggatcctcgc

cagcggctgc

aagaacttgt

cgccgttctt

gagtgtgcgg

gcatttacca

cgggttctgg

acgaggtgct

agggtctcac

ggcgtggaat

tgctccctac

ggttcatcat

atggtgatgt

ggacgtgccg

ccggtccgtg

atgaagcagc

cctgtctagg

ttgacatcat

cacccaaggc

tgtaggtaag

tggaataaat

tctgtgcgca

acagtattgc

agcccaccga

gcccatcgcc

ccttgaagct

cgccaacctt

ctgctgccac

gtctggcgac

gcatatggtg

ccagctaaag

cgtgctgtat

tttgatgctg

tctaggctgt

ggccctcgcc

aatactcatg

agttggaata

catgtccatg

gtactgcggg

cacccacttc

ttcttgtagt

ggaacaagtc

cccccttgat

taggggaaat

ctgcaaagag

cggcccaccc

tatttacaca

gttcaacgtc

ggttcgcatc

gtattgcaat

agacttcaag

gcctcaaact

tttgttttac

tgcccacccg

gggaacaggt

caggctgtgc

gggaagaaga

gcagtgttga

ctcggaaaga

gatctcgcat

ctttatgaac

gacttactgg

ccgatcacct

cttagttact

tttgaggaca

gccgagtctc

gggtttcaga

agaataataa

tatcacatga

gacagctgtg

gcgcagtgcg

tgggaaaaac

gccccggccc

caccagcatt

gagtgcaaat

ccgtataagc

ccaggtagat

gaagttgaac

atcaacatgg

ggtgctggga

ccaactcacc

ccggcaggca

ctagccggcg

caccttgatg

caactccacc

caactgaaga

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

10500

10560

10620

10680

10740

10800

10860

10920

10980

11040

11100

11160

11220

11280

11340

11400

11460

11520

11580

11640

11700

11760

11820

11880

11940

12000

12060

12120

12180

12240

12300

12360

12420

12480

ccatctggag

tcatgtccat

aggtcctcac

aaggcgccac

aaagagccct

ggcagctgca

accgcgacgg

ctctaggcaa

ccatttgtgc

gattttattt

actggcccgt

ttcgccctat

cggtgtttct

aggctcaatt

aatatcttga

acgtcaaagg

tccttcccaa

cattgtgcac

cccagtccaa

aagacaaaac

gctatgcctc

gccccgccct

tcacccctta

cccccggata

aacatacctg

aggactggga

ccactgccac

gcctgaattg

ttgtggatgc

ttttgtttgg

ccgcgatact

gcctttcttt

atgctttggc

cgcatcatgg

gtttggacag

ggtcaacaca

cccctaccac

attcgatgtg

tgttgccatc

gggcttgttt

gcagctgatc

cggggataaa

tgatctagaa

ctcacctgat

ggtgacaacc

ccataaatac

aggcactcct

gcttccggag

tgatcgggag

cactaccgtt

ggaatcagtt

actgacagat

gtgctggaaa

agcctatttc

gtacatccgt

ttgcaacagg

tgattacggc

caaaattctg

ggggtttgaa

ggattacaat

cagcttgaag

aaatgaaatg

tttcacggag

cttcaccatc

ccgtacgcgc

cccagtgcca

accataaggt

aaaaagcagg

aatatctgtg

acccgtgtga

agggaccgag

gttacattgc

accagggcaa

gatcttcctg

gtgctggata

tttagggcca

gggtcgagct

ttaacacagt

cagaacaatg

agccgcgcgt

ggggtcgtgt

acggttttca

cgagaagttg

ggaggatgtc

gcggtagtcg

gtgtacctcc

atgatgttgg

caacttgaag

gttcctgtca

agagtcgtcg

gctaaaatta

gcgtgcgcgg

tcggatacag

gatgcgtttc

ttttattttc

gggtccatgc

ttcttggtgt

gccggttggc

tctgccattc

agtggacatt

gtcaaccctg

gcaggctgcc

atgccattca

cccacgtgga

aggacgacgc

atttgcccac

gacacgctat

caaaaggcac

gaaataacaa

cagataagcg

ctccgctccc

ttgctaaact

aaaagtggcc

gcatcggtgc

catactatct

gcaccggccg

ctgcgtccct

atcatgtcac

gggtttcaag

cagatcttga

acttcaaaga

gtcgctattt

actctacggt

ggtccaccca

tcctgtctag

agttctcgtt

cgtatctgta

gtgcgcgcca

ccccgggccc

aaagcctttt

ccattgttga

tggtggtctt

actctgagca

cccacctggg

attgatgaaa

tggaaacagg

gccagattac

aaaacctgtc

catcactatt

taaagattca

ctttgtgtat

acccgtcaac

agaatgcacg

tgttgtagat

caaggtcgca

cccagtagaa

agatcggctg

cggctatatg

cacaaaattt

aattgaggta

cccacacgct

ctccagatac

ccccggaaaa

agcctatctc

agttcgacta

cacctggtat

gtacttggac

ctggggggct

cgcgtaccat

ggatgaccca

tgagttcacc

ggaagggaaa

tgtcattgaa

ttacaaaatt

tatcattata

ttgcatcaga

attacagaag

gaactaaaca

tggtgtcgcg

tggtgagcga

agggacaaac

aggtatgggc

gactccagtc

ctcaacaggc

gacccacaca

ctcgcagtgc

gttgctcagg

tctctccgcg

cacaacttgg

cttgcacctc

gttgccagcc

gtgggccctt

gttaagggcg

gactgccggg

ttcattggcg

ctcccgcgcg

gccgcgaaag

cacccggaga

atggtctgga

cagcttgcca

ccctgcatgg

gacctcgcgg

ggtgaaatgc

gttaagtaca

gggaacggtg

atttacaagg

ccaactttag

ggccaacttt

tttttggcca

ttggtttgct

atcttatgag

tcctttgggg

tcgaatgtac

ggctacgctg

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

12540

12600

12660

12720

12780

12840

12900

12960

13020

13080

13140

13200

13260

13320

13380

13440

13500

13560

13620

13680

13740

13800

13860

13920

13980

14040

14100

14160

14220

14280

14340

14400

14460

14520

tctcgcatta

gagacctgta

tcaaatgtaa

cctggttccc

atattttcct

atactacgta

tgaattacac

ccggtaggtc

agctagggtt

cctggttggc

tagggaatgt

acgggcagaa

accaacatca

cctcgtggtt

cagttcgagt

ccaagacatc

tcagtgccgt

tgagaattat

tgagatgagt

gtgtgtcaat

ggtcgaccat

tttagcctgt

gcttgaccgc

ttgctgtgct

tgacgctatg

agagttttgt

gccatttcct

ggtatgtcct

ttaggtttgc

ttctggacac

gcaaagttga

tggcaacccc

tcatgatagc

gatgatatat

gtagtttgga

aatatttggc

ccatagtgta

ggccaaagct

ctgttgcagc

ctgtttttgg

ggtgtgtcca

tctttggtgc

tatggtaccg

gttcttgtcc

gagtcgagtt

caccaccttg

agtcgacggc

ggttttaaat

cttgcagata

agttgcctta

acggcgatag

ttacattctt

gaaaagggat

tttaccagct

gtgcggttgc

ctttttgcca

gggctgttgc

cgccaacgcc

tgagctgaat

catctttccc

tgacacagtc

aagtagcatc

aaagaattgc

taagggcgga

ggtcgaaggt

tataaccaga

acggctccag

gccctaaagg

tgtggtggct

ctcccggctg

taatagcact

tcatgatttt

ttcttgtact

tttccgctgg

ccttgcctca

aggatagggt

cctggcctct

ttcagctaca

tatgttgaca

cctcgtcatg

ggcaattggt

gtctcttggt

ttaagaccaa

ggcatcgcga

ggacacccgt

ctgatctcct

ttaaggtggt

acgtccaaca

tccatttcat

ttctgttggc

tcgcaattgc

agcaacgaca

ggcacagact

gttttgactc

gctttagtca

tacgcggtct

atgtcctggc

ctctatcgtt

catctgatcg

gtttcagcgg

aaaaggtgct

tgagtcgcgg

cattttcagc

cccatgctac

ttgaatcagg

cagcaatggt

ctttttgttg

ttaggggcaa

cccggcaagc

atgaccgatg

ccagcgaagg

cggcccagtt

tcaaacatca

acaacatttc

ttcacctaga

ttctcaggcg

caccaccgca

ctcggcctct

gtatgttacc

catgctttct

atttggcaat

tgtcaaggag

gacacctgag

aatttgaatg

tttctttgtg

gcagctccca

ggctagctaa

acattgtctc

ctgtgtctac

gtgccctggc

gctacgcgtg

ggcggtcgcc

acctcaaaag

aacaatgggg

tttggcgttt

ccgactgcta

atctagccgc

acaacctgcg

tgtttgctat

taatagctgt

tgctgtggtt

tttttctttc

agccacagag

tgaggaggat

ccacttgact

ccatcccgag

actcatctgc

agccgtgttt

atggcttcgt

ttcgcctgca

gcggcaggct

gaggcgattc

atcacagcca

tcttgccttt

gtgtcaggca

tttacccaac

accatgaggt

tttaagtatg

gtgtatcgtg

tctacagctg

caaatttgat

ctatggtgcc

cgccgggttt

tgcgttgact

taccagatat

tgtcatcata

agttgtgctt

tcgtccttag

tctattacct

gggcttctgc

cattgaagcc

catgacaggt

ttttccaacc

acattcctcc

gcgggttcca

gaactcacag

atctacgaac

gatcatgacg

agtgtttacg

atattcggga

gccgaacatg

cagacctatt

cccttctttt

aaccatgttt

ttgctgtcct

gcaaaatccc

atgtgacaga

tctatgcttc

tcgtggctgt

gctccctggt

gggcaactgt

ttggagaaat

ccgttctgtt

atttacaact

tgggcagtgg

ctcactacca

gttcacgggc

tgcttcgtca

accaactttc

gagaaaaggg

gatggttccg

atgacttctg

acacgccagt

accttttgat

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

14580

14640

14700

14760

14820

14880

14940

15000

15060

15120

15180

15240

15300

15360

15412

cttcctgaat tgtgcttkca ccttcgggta catgactttc gcgcactttc agagtacaaa taaggtcgcg ctcactatgg gagcagtagt tgcactcctt tggkgggtgt actcagccat agaaacctgg aaattcatca cctccagatg ccgtttgtgc ttgctaggcc gcaagtacat tctggcccct gcccaccacg ttgaaagtgc cgcagggttt catccgattg cggcaaatga taaccacgca tttgtcgtcc ggcgtcccgg ctccactacg gtcaacggca cattggtgcc cgggttaaaa agcctcgtgt tgggtggcag aaaagctgtt aaacagggag tggtaaacct tgtcaaatat gccaaataac aacggcaagc agcagaagag aaagaagggg gatggccagc cagtcaatca gctgtgccag atgctgggta agatcatcgc tcagcaaaac cagtccagag gcaagggacc gggaaagaaa aataagaaga aaaacccgga gaagccccat tttcctctag cgactgaaga tgatgtcaga catcacttta cccctagtga gcggcaattg tgtctgtcgt caatccagac cgcctttaat caaggcgctg ggacttgcac cctgtcagat tcagggagga taagttacac tgtggagttt agtttgccta cgcatcatac tgtgcgcctg atccgcgtca cagcatcacc ctcagcatga tgggctggca ttcttgaggc atctcagtgt atgaattgga agaatgtatg gtgaatggca ctgattgaca ttgtgcctct aagtcaccta ttcaattagg gcgaccgtgt gggggtgaga tttaattggc gagaaccatg cggccgaaat ta

<210> 14

<211> 123

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> US pMA C2 <400> 14

Met

Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly

1

5 10 15

Gln

Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala

Gln

20 25 30

Gln

Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys

35 40 45

Asn

Pro Glu Lys Pro Hi s Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg

50 55 60

Hi s

Hi s

Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln

65

70 75 80

Thr

Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly

85 90 95

Arg

Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr Hi s Hi s Thr Val

100 105 110

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Arg Leu

Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala

115

120

<210>

15

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

r^. LL O -pBAD

<400>

15

Met Pro

Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly

1

5 10 15

Gln Pro

Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln

20 25 30

Gln Asn

Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys

35 40 45

Asn Pro

Glu Lys Pro Hi s Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg

50

55 60

His His

Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln

65

70 75 80

Thr Ala

Phe Asn Gln Gly Ala S_ -E |- > Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly

85 90 95

Arg Ile

Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr Hi s Hi s Thr Val

100 105 110

Arg Leu

Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala

115 120

<210> 16 <211> 123

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> 01NP1.2

<400> 16

Met

Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly

1

5 10 15

Gln

Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala

Gln

20 25 30

Gln

Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asn Pro

Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg

50

55 60

His His

Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln

65

70 75 80

Thr Ala

Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly

85 90 95

Arg Ile

Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr Hi s Hi s Thr Val

100 105 110

Arg Leu

Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala

115

120

<210>

17

<211>

12 3

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

01NP1

<400>

17

Met Pro

Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly

1

5 10 15

Gln Pro

Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln

20 25 30

Gln Asn

Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys

35 40 45

Asn Pro

Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg

50

55 60

His His

Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln

65

70 75 80

Thr Ala

Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly

85 90 95

Arg Ile

Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr Hi s Hi s Thr Val

100 105 110

Arg Leu

Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala

115

120

<210> 18 <211> 3463

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20-C

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

<220>

<22 3> pQE31

<400> 18

ctcgagaaat

attgtgagcg

ggatctcacc

ctgcagccaa

agaactccat

gaatccaagc

tcactggata

ttcagtcagt

taaagaccgt

gcctgatgaa

gggatagtgt

tctggagtga

cgtgttacgg

tctcagccaa

acttcttcgc

tgccgctggc

ttaatgaatt

gttattggtg

cgaaaggctc

ctcctgagta

aaaacctctg

ggagcagaca

tgacccagtc

gattgtactg

ataccgcatc

gctgcggcga

ggataacgca

ggccgcgttg

acgctcaagt

tggaagctcc

ctttctccct

ggtgtaggtc

cataaaaaat

gataacaatt

atcaccatca

gcttaattag

ctggatttgt

tagcttggcg

taccaccgtt

tgctcaatgt

aaagaaaaat

tgctcatccg

tcacccttgt

ataccacgac

tgaaaacctg

tccctgggtg

ccccgttttc

gattcaggtt

acaacagtac

cccttaaacg

agtcgaaaga

ggacaaatcc

acacatgcag

agcccgtcag

acgtagcgat

agagtgcacc

aggcgctctt

gcggtatcag

ggaaagaaca

ctggcgtttt

cagaggtggc

ctcgtgcgct

tcgggaagcg

gttcgctcca

ttatttgctt

tcacacagaa

ccatacggat

ctgagcttgg

tcagaacgct

agattttcag

gatatatccc

acctataacc

aagcacaagt

gaatttcgta

tacaccgttt

gatttccggc

gcctatttcc

agtttcacca

accatgggca

catcatgccg

tgcgatgagt

cctggggtaa

ctgggccttt

gccctctaga

ctcccggaga

ggcgcgtcag

agcggagtgt

atatgcggtg

ccgcttcctc

ctcactcaaa

tgtgagcaaa

tccataggct

gaaacccgac

ctcctgttcc

tggcgctttc

agctgggctg

tgtgagcgga

ttcattaaag

ccgcatgcga

actcctgttg

cggttgccgc

gagctaagga

aatggcatcg

agaccgttca

tttatccggc

tggcaatgaa

tccatgagca

agtttctaca

ctaaagggtt

gttttgattt

aatattatac

tttgtgatgg

ggcagggcgg

tgactctcta

cgttttatct

gctgcctcgc

cggtcacagc

cgggtgttgg

atactggctt

tgaaataccg

gctcactgac

ggcggtaata

aggccagcaa

ccgcccccct

aggactataa

gaccctgccg

tcatagctca

tgtgcacgaa

taacaattat

aggagaaatt

gctcggtacc

atagatccag

cgggcgtttt

agctaaaatg

taaagaacat

gctggatatt

ctttattcac

agacggtgag

aactgaaacg

catatattcg

tattgagaat

aaacgtggcc

gcaaggcgac

cttccatgtc

ggcgtaattt

gcttgaggca

gttgtttgtc

gcgtttcggt

ttgtctgtaa

cgggtgtcgg

aactatgcgg

cacagatgcg

tcgctgcgct

cggttatcca

aaggccagga

gacgagcatc

agataccagg

cttaccggat

cgctgtaggt

ccccccgttc

aatagattca

aactatgaga

ccgggtcgac

taatgacctc

ttattggtga

gagaaaaaaa

tttgaggcat

acggcctttt

attcttgccc

ctggtgatat

ttttcatcgc

caagatgtgg

atgtttttcg

aatatggaca

aaggtgctga

ggcagaatgc

ttttaaggca

tcaaataaaa

ggtgaacgct

gatgacggtg

gcggatgccg

ggcgcagcca

catcagagca

taaggagaaa

cggtcgttcg

cagaatcagg

accgtaaaaa

acaaaaatcg

cgtttccccc

acctgtccgc

atctcagttc

agcccgaccg

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

20-C

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3463

ctgcgcctta

actggcagca

gttcttgaag

tctgctgaag

caccgctggt

atctcaagaa

acgttaaggg

ttaaaaatga

ccaatgctta

tgcctgactc

tgctgcaatg

gccagccgga

tattaattgt

tgttgccatt

ctccggttcc

tagctccttc

ggttatggca

gactggtgag

ttgcccggcg

cattggaaaa

ttcgatgtaa

ttctgggtga

gaaatgttga

ttgtctcatg

gcgcacattt

aacctataaa

tccggtaact

gccactggta

tggtggccta

ccagttacct

agcggtggtt

gatcctttga

attttggtca

agttttaaat

atcagtgagg

cccgtcgtgt

ataccgcgag

agggccgagc

tgccgggaag

gctacaggca

caacgatcaa

ggtcctccga

gcactgcata

tactcaacca

tcaatacggg

cgttcttcgg

cccactcgtg

gcaaaaacag

atactcatac

agcggataca

ccccgaaaag

aataggcgta

atcgtcttga

acaggattag

actacggcta

tcggaaaaag

tttttgtttg

tcttttctac

tgagattatc

caatctaaag

cacctatctc

agataactac

acccacgctc

gcagaagtgg

ctagagtaag

tcgtggtgtc

ggcgagttac

tcgttgtcag

attctcttac

agtcattctg

ataataccgc

ggcgaaaact

cacccaactg

gaaggcaaaa

tcttcctttt

tatttgaatg

tgccacctga

tcacgaggcc

gtccaacccg

cagagcgagg

cactagaagg

agttggtagc

caagcagcag

ggggtctgac

aaaaaggatc

tatatatgag

agcgatctgt

gatacgggag

accggctcca

tcctgcaact

tagttcgcca

acgctcgtcg

atgatccccc

aagtaagttg

tgtcatgcca

agaatagtgt

gccacatagc

ctcaaggatc

atcttcagca

tgccgcaaaa

tcaatattat

tatttagaaa

cgtctaagaa

ctttcgtctt

gtaagacacg

tatgtaggcg

acagtatttg

tcttgatccg

attacgcgca

gctcagtgga

ttcacctaga

taaacttggt

ctatttcgtt

ggcttaccat

gatttatcag

ttatccgcct

gttaatagtt

tttggtatgg

atgttgtgca

gccgcagtgt

tccgtaagat

atgcggcgac

agaactttaa

ttaccgctgt

tcttttactt

aagggaataa

tgaagcattt

aataaacaaa

accattatta

cac

acttatcgcc

gtgctacaga

gtatctgcgc

gcaaacaaac

gaaaaaaagg

acgaaaactc

tccttttaaa

ctgacagtta

catccatagt

ctggccccag

caataaacca

ccatccagtc

tgcgcaacgt

cttcattcag

aaaaagcggt

tatcactcat

gcttttctgt

cgagttgctc

aagtgctcat

tgagatccag

tcaccagcgt

gggcgacacg

atcagggtta

taggggttcc

tcatgacatt

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Composición inmunológica que comprende un vector, en la que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ORF7 truncada del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) que consiste en la SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 85% de homología con la misma, para usar en un procedimiento para provocar en un animal una respuesta inmunitaria segura y protectora contra VSRRP, comprendiendo el procedimiento por administrar vía transdérmica una cantidad eficaz de la composición usando un inyector sin aguja a chorro de líquido.
2. 2. Composición para usar, según la reivindicación 1, en la que la proteína ORF7 está codificada por una secuencia que tiene al menos un 70% de homología con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3.
3. 3. Composición para usar, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además un adyuvante y un portador farmacéutica o veterinariamente adecuado.
4. 4. Composición para usar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el inyector sin aguja a chorro de líquido se selecciona entre el dispositivo DERMAVAC® y otros inyectores sin aguja.
5. 5. Composición para usar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el vector es un plásmido.
6. 6. Composición para usar, según la reivindicación 5, en la que el plásmido es un plásmido de ADN, en particular, el plásmido de la SEQ ID NO: 8.
7. 7. Composición para usar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el animal es de la familia de los suidos.
8. 8. Composición para usar, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha composición se formula para la administración como una sola dosis a animales porcinos.
9. 9. Composición para usar, según la reivindicación 8, que comprende además un adyuvante, que es TS6.
10. 10. Composición para usar, según la reivindicación 8 o 9, en la que el animal porcino es un lechón destetado de aproximadamente 11 a aproximadamente 24 días de edad.