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JPWO2012176779A1 - 抗ｅｒｂＢ３抗体 - Google Patents

抗ｅｒｂＢ３抗体 Download PDF

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JPWO2012176779A1
JPWO2012176779A1 JP2013521589A JP2013521589A JPWO2012176779A1 JP WO2012176779 A1 JPWO2012176779 A1 JP WO2012176779A1 JP 2013521589 A JP2013521589 A JP 2013521589A JP 2013521589 A JP2013521589 A JP 2013521589A JP WO2012176779 A1 JPWO2012176779 A1 JP WO2012176779A1
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Abstract

本発明は、ｅｒｂＢ３の細胞外領域を認識し、ＥＧＦ様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体および該抗体断片、該抗体および該抗体断片をコードするＤＮＡ、該抗体および該抗体断片の製造方法、該抗体および該抗体断片を含む治療薬および該抗体および該抗体断片を用いた治療用途に関する。

Description

本発明は、ｅｒｂＢ３の細胞外領域を認識し、ＥＧＦ様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体および該抗体断片、該抗体および該抗体断片をコードするＤＮＡ、該抗体および該抗体断片の製造方法、該抗体および該抗体断片を含む治療薬並びに該抗体および該抗体断片を用いた治療用途に関する。
ｅｒｂＢ３は上皮細胞増殖因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）ファミリーに属する１回膜貫通型タンパク質である（非特許文献１、２および３）。ｅｒｂＢ３の立体構造は、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２およびｅｒｂＢ４に類似しており、細胞外領域は、Ｎ末端側からドメイン１、２、３および４の４つのドメイン構造から構成される。ｅｒｂＢ３以外のＥＧＦＲファミリー分子は、細胞内にキナーゼドメインを保有しており、受容体の活性化によりキナーゼ活性を発揮するが、ｅｒｂＢ３の細胞内ドメインはキナーゼ活性を有していない。
ｅｒｂＢ３の活性化については、１．ｅｒｂＢ３の特異的リガンドであるヘレグリンがｅｒｂＢ３に結合し、ｅｒｂＢ３とヘテロダイマーを形成した他のＥＧＦＲファミリーによってｅｒｂＢ３がリン酸化された後、ホスファチジルイノシトール−３−リン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｉｎｏｓｉｔｏｌ−３ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ；ＰＩ３キナーゼ）、Ａｋｔを活性化するシグナルカスケード、２．リガンドの結合または過剰発現により、ｅｒｂＢ３以外のＥＧＦＲファミリー（ＥＧＦＲまたはＨｅｒ２など）が活性化し、この結果ｅｒｂＢ３がリン酸化された後、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔを活性化するシグナルカスケードの２通りが知られている。
ＥＧＦＲファミリー分子の細胞内ドメインとシグナル伝達タンパク質との親和性を、たんぱく質アレイを用いて網羅的に解析した結果では、ｅｒｂＢ３はＥＧＦＲファミリー分子の中で、特にＰＩ３キナーゼへの親和性が高く、ＰＩ３キナーゼの活性化に重要であることが強く示唆されている（非特許文献４）。最近になって、癌のＥＧＦＲ阻害剤耐性化にｅｒｂＢ３が関与していることが報告された（非特許文献５、６）。
薬剤耐性の腫瘍では、肝細胞増殖因子受容体（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＧＦＲまたはＭｅｔ）が、ｅｒｂＢ３のリン酸化を引き起こした結果（非特許文献５）、またはＭｅｔがｅｒｂＢ３の発現を増加させた結果（非特許文献６）、薬剤存在下での腫瘍細胞増殖が維持されていることが明らかになっている。
ｅｒｂＢ３の発現と癌の予後の関連性については、いくつか報告されている。Ｃｈｅｎら（非特許文献７）は、肺がんにおいてアレイ解析の結果をもとに予後と関連性が高い５つの遺伝子（ＤＵＳＰ６、ＭＭＤ、ＳＴＡＴ１、ＥＲＢＢ３およびＬＣＫ）を選択しているが、この中にｅｒｂＢ３は含まれている。
免疫組織学的解析においても、ｅｒｂＢ３の発現は肺がんにおける予後不良因子であると報告されている（非特許文献８）。Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗら（非特許文献９）は、肺がんにおいて転移に関連するキナーゼをアレイ解析により調べた結果、ｅｒｂＢ３は、ＩＮＳＲ、ＮＴＲＫ１に続いて３番目に遠隔転移リスクとの関連性が高い遺伝子として同定された。肺がん以外でも、乳がん（非特許文献１０）および卵巣がん（非特許文献１１）で、ｅｒｂＢ３の発現は予後不良因子であると報告されている。
ｅｒｂＢ３に対する抗体に関しては、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）のｅｒｂＢ３への結合を阻害する抗体（非特許文献１２）、ｅｒｂＢ１およびｅｒｂＢ２には反応せずｅｒｂＢ３特異的に反応する抗体（特許文献１）、ヘレグリン依存的ｅｒｂＢ２−ｅｒｂＢ３の相互作用を阻害するｅｒｂＢ３抗体（特許文献２）、ｅｒｂＢ３細胞外ドメインに反応する抗体（特許文献３）およびｅｒｂＢ３のドメイン１に結合しヘレグリン依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体（特許文献４）が報告されている。
米国特許第５，４８０，９６８号明細書 米国特許第５，９６８，５１１号明細書 国際公開第２００７／０７７０２８号 国際公開第２００８／１００６２４号
Ｈａｒａｒｉ Ｐ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ．２００４，１１，６８９−７０８． Ｎａｇｙ Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ．１９９９，５，２５５−７１． Ｈｙｎｅｓ Ｎ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００５，５，３４１−５４． Ｊｏｎｅｓ Ｒ．Ｂ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６，４３９，１６８−７４． Ｅｎｇｅｌｍａｎ Ｊ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７，３１６，１０３９−４３． Ｓｅｒｇｉｎａ Ｎ．Ｖ．ｅｔ．ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ．２００７，４４５，４３７−４１． Ｃｈｅｎ Ｈ．Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００７，３５６，１１−２０ Ｈｉｌｂｅ Ｗ．ｅｔ．ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．２００３，５６，７３６−４１ Ｍuｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ Ｃ．Ｅｔ．Ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５，６５，１７７８−８２ Ｂｉeｃｈｅ Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００３，１０６，７５８−６５． Ｔａｎｎｅｒ Ｂ．ｅｔ．，ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００６，２４，４３１７−２３ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ １９９６，２７１，７６２０−７６２９，１９９６．
ｅｒｂＢ３発現細胞が関与する疾患の治療薬が求められている。本発明により、ＥＧＦ様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体および該抗体断片、該抗体および該抗体断片をコードするＤＮＡ、該抗体および該抗体断片の製造方法、該抗体および該抗体断片を用いた治療方法並びに該抗体および該抗体断片を含む治療薬を提供することができる。また、本発明により、抗ｅｒｂＢ３抗体を用いた併用療法を提供することができる。
本発明は、以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）ｅｒｂＢ３の細胞外領域に特異的に結合し、上皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体および該抗体断片。
（２）ｅｒｂＢ３の細胞外領域に特異的に結合し、かつｅｒｂＢ３特異的リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化およびｅｒｂＢ３特異的リガンド非依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化の両方を阻害する抗体。
（３）ｅｒｂＢ３のリン酸化が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、エピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＢ−ＥＧＦ）およびヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）から選ばれる少なくとも２つのリガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化である（１）または（２）に記載の抗体および該抗体断片。
（４）ｅｒｂＢ３の細胞外領域が、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２０番から１７９番のアミノ酸配列からなるドメイン１、１８０番から３２８番のアミノ酸配列からなるドメイン２、３２９番から４８７番のアミノ酸配列からなるドメイン３および４８８番から６４３番のアミノ酸配列からなるドメイン４から選ばれる少なくとも１つのドメインを含む細胞外領域である（１）〜（３）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片。
（５）抗体が下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体である（１）〜（４）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片。
（ａ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
（ｂ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（ｃ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（６）抗体が、配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域（以下、ＶＨともいう）および配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域（以下、ＶＬともいう）を含む抗体、配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、ならびに配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体から選ばれるいずれか１つの抗体である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片。
（７）（１）〜（６）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（８）（７）に記載のＤＮＡを含むベクターを細胞へ導入して得られる形質転換体を培地内で培養し、培養液中に（１）〜（６）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片を生成蓄積させ、培養液から抗体および該抗体断片を精製することを特徴とする（１）〜（６）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片を製造する方法。
（９）ｅｒｂＢ３の細胞外領域が、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２０番から１７９番のアミノ酸配列からなるドメイン１、１８０番から３２８番のアミノ酸配列からなるドメイン２、３２９番から４８７番のアミノ酸配列からなるドメイン３および４８８番から６４３番のアミノ酸配列からなるドメイン４から選ばれる少なくとも１つのドメインに反応する第１抗体または該抗体断片と、第１抗体が反応するドメインと異なるドメインに反応する第２抗体または該抗体断片とを含む抗体組成物。
（１０）第１抗体または該抗体断片が、ｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン２またはドメイン４に反応する抗体または該抗体断片である（９）に記載の抗体組成物。
（１１）第２抗体または該抗体断片が、ｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン１またはドメイン３に反応する抗体または該抗体断片である（９）または（１０）のいずれか１に記載の抗体組成物。
（１２）第１抗体または該抗体断片が、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体または該抗体断片である（９）〜（１１）のいずれか１に記載の抗体組成物。
（ａ）１１２６抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
（ｂ）１１２６抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（ｃ）１１２６抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（１３）第２抗体または該抗体断片が、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体または該抗体断片である（９）〜（１２）のいずれか１に記載の抗体組成物。
（ａ）１１５３抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
（ｂ）１１５３抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（ｃ）１１５３抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（１４）（９）〜（１３）のいずれか１に記載の抗体組成物を用いたｅｒｂＢ３発現細胞が関与する疾患の治療方法。
（１５）ｅｒｂＢ３発現細胞が関与する疾患が癌である（１４）に記載の治療方法。
（１６）（９）〜（１３）のいずれか１に記載の抗体組成物を含むｅｒｂＢ３発現細胞が関与する疾患の治療薬。
本発明によれば、ｅｒｂＢ３の細胞外領域を認識し、ＥＧＦ様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体および該抗体断片、該抗体および該抗体断片をコードするＤＮＡ、該抗体および該抗体断片の製造方法、該抗体および該抗体断片を含む医薬および該抗体および該抗体断片を用いた治療用途を提供することができる。
図１（ａ）は、抗ヒトｅｂＢ３抗体による、ヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１におけるヘレグリンα（ＨＲＧα）を示す。図１（ｂ）は、抗ヒトｅｂＢ３抗体による、ヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１におけるヘレグリンβ（ＨＲＧβ）依存的ｅｒｂＢ３リン酸化およびＡｋｔリン酸化の阻害効果を示す。左側がヘレグリンα依存的リン酸化、右側がヘレグリンβ依存的リン酸化を示し、上からリン酸化ｅｒｂＢ３、全ｅｒｂＢ３タンパク質、リン酸化Ａｋｔおよび全Ａｋｔタンパク質を示す。また、左右最上段に使用した抗体を示す。 図２（ａ）および（ｂ）は、抗ヒトｅｒｂＢ３抗体による、ヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１におけるＥＧＦ様リガンド依存的ｅｒｂＢ３リン酸化の阻害効果を示す。図２（ａ）はアンフィレギュリンまたはベータセルリン依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化、図２（ｂ）はエピレグリンまたはＴＧＦα依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化および図２（ｃ）はＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦ依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化を示す。各図の上段がリン酸化ｅｒｂＢ３、下段が全ｅｒｂＢ３タンパク質を示す。また、各図の最上段に使用した抗体を示す。 図３（ａ）および（ｂ）は、抗ヒトｅｒｂＢ３抗体による、ヒト乳癌細胞株Ｔ４７ＤにおけるＥＧＦ様リガンド依存的ｅｒｂＢ３リン酸化の阻害効果を示す。図３（ａ）はエピレグリン依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化、図３（ｂ）ＴＧＦα依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化、図３（ｃ）はＨＢ−ＥＧＦ依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化および図３は（ｄ）ヘレグリンβ依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化を示す。各図の上段がリン酸化ｅｒｂＢ３、下段が全ｅｒｂＢ３タンパク質を示す。また、各図の最上段に使用した抗体を示す。 図４はヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ移植マウスモデルにおける抗ヒトｅｒｂＢ３抗体の抗腫瘍効果を示す。横軸に腫瘍を移植してからの日数、縦軸に腫瘍体積を示す。□はコントロールの抗ＤＮＰ抗体、◆は１１５３抗体、○は１２５１１抗体、×は９２０１０４抗体、△は１１２６抗体、および●はＵ１−５９抗体を示す。 図５は、ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ移植マウスモデルにおける抗ヒトｅｒｂＢ３抗体の併用効果を示す。×はコントロールの抗ＤＮＰ抗体、□１１５３抗体、◆は１１２６抗体および○は１１５３＋１１２６併用抗体（１１５３抗体および１１２６抗体の併用抗体）を示す。横軸に腫瘍を移植してからの日数、縦軸に腫瘍体積を示す。 図６は、ヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１移植マウスモデルにおける抗ヒトｅｒｂＢ３抗体の併用効果を示す。□は、コントロールの抗ＤＮＰ抗体、◆は１１５３＋１２５１１併用抗体（１１５３抗体および１２５１１抗体の併用抗体）、○は１２５１１＋１１２６併用抗体（１２５１１および１１２６抗体の併用抗体）および×は１１５３＋１１２６併用抗体（１１５３抗体および１１２６抗体の併用抗体）を示す。横軸に腫瘍を移植してからの日数、縦軸に腫瘍体積を示す。
本発明の抗体は、ｅｒｂＢ３の細胞外領域（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ，ＥＣＤと略記する場合もある）に特異的に結合し、ＥＧＦ様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体および該抗体断片に関する。
ｅｒｂＢ３はチロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）型受容体ファミリーである上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリー（ＨＥＲファミリー、ｅｒｂＢファミリーともいう）の１つであり、ｅｒｂＢ３受容体、上皮細胞増殖因子受容体３（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３；ＥＧＦＲ３）、ＨＥＲ３受容体、Ｈｅｒ３受容体または単に、ＨＥＲ３、Ｈｅｒ３とも呼ばれる。
ｅｒｂＢ３は、１回膜貫通型の膜タンパク質であり、細胞外領域にはリガンド結合ドメイン、ダイマー形成ドメインを含みかつ細胞内にはチロシンリン酸化ドメインを含む。ｅｒｂＢ３は、特異的リガンドであるヘレグリンが細胞外領域のリガンド結合ドメインに結合することで、ダイマー化を引き起こし、細胞増殖シグナルを流すことが知られている。
特に、ｅｒｂＢ３と他のＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーであるｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ１またはＨＥＲ１）、ｅｒｂＢ２（ＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２またはＮｅｕ）またはｅｒｂＢ４（ＥＧＦＲ４またはＨＥＲ４）とのヘテロダイマーが細胞増殖に関与することが知られている。
本発明において、ｅｒｂＢ３とは、Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６： ９１９３−９１９７，１９８９．）により示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、具体的には配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む膜タンパク質および配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む膜タンパク質をいう。
また、ｅｒｂＢ３のアミノ酸配列情報は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などの公知のデータベースから取得することができ、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むヒトｅｒｂＢ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１９７３．２）、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むマウスｅｒｂＢ３（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３４２８３．１）などが挙げられる。
本発明においてｅｒｂＢ３としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｅｒｂＢ３の機能を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％および９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつｅｒｂＢ３の機能を有するポリペプチドも本発明のｅｒｂＢ３に包含される。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列ををコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
ｅｒｂＢ３をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１９８２．３）で表される塩基配列の２７７番目〜４３０５番目に示されるヒトｅｒｂＢ３の塩基配列、配列番号４（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０１５３．１）に示されるマウスｅｒｂＢ３の塩基配列が挙げられる。
配列番号１で表される２７７番目〜４３０５番目の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつｅｒｂＢ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号１で表される２７７番目〜４３０５番目の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは７０％、８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつｅｒｂＢ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号１で表される２７７番目〜４３０５番目のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつｅｒｂＢ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のｅｒｂＢ３をコードする遺伝子に包含される。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１で表される２７７番目〜４３０５番目のＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（１９９５）］を行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１で表される２７７番目〜４３０５番目の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％または８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のｅｒｂＢ３をコードする遺伝子に包含される。
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ ｂｌａｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）が１５および−Ｚ（ｆｉｎａｌ Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎ の場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
配列番号２で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２で表されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、または配列番号２で表されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法またはｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明におけるｅｒｂＢ３の細胞外領域としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ）、ＴＭＨＭＭ ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）またはＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／Ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）などを用いて予測された領域などが挙げられる。具体的には、例えば、ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒにおいて予測される細胞外ドメインが挙げられる。
ｅｒｂＢ３の細胞外領域（ＥＣＤ）は、ドメイン１〜４（Ｄ１〜Ｄ４）に分かれており、他のＥＧＦＲファミリーと同様に、ドメイン１とドメイン３がリガンド結合に、ドメイン２がダイマー形成に重要であることが知られている。具体的には、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２０番から１７９番のアミノ酸配列がドメイン１、１８０番から３２８番のアミノ酸配列がドメイン２、３２９番から４８７番のアミノ酸配列がドメイン３および４８８番から６４３番のアミノ酸配列がドメイン４である。
ＥＧＦ様リガンドとは、ＥＧＦＲファミリーに結合するＥＧＦリガンドファミリーという。具体的には、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン、ベータセルリン、エピレグリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ＮＴＡＫおよびヘレグリン［ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）］が挙げられる。
本発明において、ｅｒｂＢ３の機能としては、ヘレグリンの結合に依存したｅｒｂＢ３のホモダイマー化およびヘテロダイマー化を誘導し、ｅｒｂＢ３がリン酸化された結果、細胞増殖・細胞分化を促進させる機能が挙げられる。このようなｅｒｂＢ３の機能は、当該目的のタンパク質を宿主細胞へ導入してタンパク質発現細胞を作製し、適当な細胞培養条件においてリガンド依存的な効果を確認することができる。
本発明の抗体としては、ｅｒｂＢ３の細胞外領域に特異的に結合し、かつＥＧＦ様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体、ｅｒｂＢ３の細胞外領域に特異的に結合し、かつｅｒｂＢ３特異的リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化およびｅｒｂＢ３特異的リガンド非依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化の両方を阻害する抗体が挙げられる。
本発明においてｅｒｂＢ３特異的リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化とは、ｅｒｂＢ３特異的なリガンドとして知られているヘレグリンがｅｒｂＢ３の細胞外領域に結合した結果、ｅｒｂＢ３の細胞内ドメインのチロシン残基がリン酸化されることをいう。
本発明においてｅｒｂＢ３特異的リガンド非依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化とは、ｅｒｂＢ３特異的リガンドであるヘレグリンを含むＥＧＦ様リガンドが、ｅｒｂＢ３以外のｅｒｂＢファミリーの細胞外領域に結合した結果、ｅｒｂＢ３とのヘテロダイマーを形成しｅｒｂＢ３の細胞内ドメインのチロシン残基がリン酸化されることをいう。または、ｅｒｂＢ３特異的リガンド非依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化とは、ＥＧＦ様リガンド依存的に引き起こされる間接的なｅｒｂＢ３のリン酸化ということができる。
本発明の抗体は、上述のｅｒｂＢ３特異的リガンド依存的／非依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を同時に阻害することができる。
具体的には、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン、ベータセルリン、エピレグリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ＮＴＡＫおよびヘレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）から選ばれる少なくとも２、３、４、５または６つのリガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体、好ましくは全てのＥＧＦ様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体が挙げられる。
本発明の抗体としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２０番から１７９番のアミノ酸配列からなるドメイン１、１８０番から３２８番のアミノ酸配列からなるドメイン２、３２９番から４８７番のアミノ酸配列からなるドメイン３および４８８番から６４３番のアミノ酸配列からなるドメイン４から選ばれる少なくとも１つのドメインを含む細胞外領域に結合する抗体、好ましくはドメイン２またはドメイン４の少なくとも１つのドメインを含む細胞外領域に結合する抗体、より好ましくはドメイン２を含む細胞外領域に結合する抗体およびドメイン４を含む細胞外領域に結合する抗体が挙げられる。
また、本発明の抗体としては、ｅｒｂＢ３の細胞外領域中のＤ１からＤ４の各ドメインに存在するエピトープに結合する抗体が挙げられる。
更に、本発明の抗体としては、ｅｒｂＢ３のダイマー化を阻害できる抗体、ｅｒｂＢ３と他のｅｒｂＢファミリー（ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ４）とのヘテロダイマー化を阻害できる抗体が挙げられる。具体的には、ｅｒｂＢ３−ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ３−ｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３−ｅｒｂＢ４から選ばれる少なくとも１組の相互作用を阻害することができる抗体が挙げられる。
更に、本発明の抗体としては、ｅｒｂＢ３と相互作用する増殖因子受容体依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体も含まれる。具体的には、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）受容体（ｃ−Ｍｅｔ）依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体が挙げられる。
本発明の抗体には、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれの抗体も含まれる。
本発明においてモノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一である。オリゴクローナル抗体、ポリクローナル抗体とは、モノクローナル抗体が２つ以上含まれる抗体混合物である。
エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し結合する、単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。立体構造は、天然に存在するタンパク質が有する３次元立体構造であり、細胞内または細胞膜上に発現しているタンパク質が構成する立体構造をいう。
本発明の抗体が認識するエピトープとしては、例えば、細胞膜上に発現しているｅｒｂＢ３上に存在するエピトープであって、かつｅｒｂＢ３のアミノ酸配列からなる一次構造、ｅｒｂＢ３のアミノ酸配列からなる立体構造、ｅｒｂＢ３のアミノ酸配列に糖鎖が結合した立体構造、およびＥＧＦＲファミリータンパク質の結晶構造解析の結果によって規定される３次元立体構造上のアミノ酸残基等が挙げられる。
抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと表記する）とも称され、ヒト抗体は、分子構造の違いに応じて、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の相同性が比較的高いＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を総称してＩｇＧともいう。
抗体分子は重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。
ＣＨは各サブクラスごとに、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。
ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを併せてＦｃ領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖が知られている。
本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックス［Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］により、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。
具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８〜２１５番のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６〜２３０番のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１〜３４０番のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１〜４４７番のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。
本発明の抗体としては、特にヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体とも略記する）、ヒト化抗体［相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ； ＣＤＲ）移植抗体ともいう］およびヒト抗体などの遺伝子組換え抗体も含まれる。
キメラ抗体とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体を意味する。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスターまたはラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマとは、非ヒト動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。したがって、ハイブリドーマが産生する抗体を構成する可変領域は、非ヒト動物抗体のアミノ酸配列からなる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体をいう。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。
ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保持するマウス（Ｔｏｍｉｚｕｋａ Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９７，７２２−７，２０００．）に所望の抗原を免疫することにより、取得することが出来る。また、ヒト由来のＢ細胞から抗体遺伝子を増幅したＰｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙライブラリーを用いることにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を選択することで、免疫を行わずにヒト抗体を取得することができる（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５．１９９４）。さらに、ＥＢウイルスを用いてヒトＢ細胞を不死化することにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を生産する細胞を作製し、ヒト抗体を取得することができる（Ｒｏｓｅｎ Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６７，５２-５４．１９７７）。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血から単離したリンパ球を、ＥＢウイルス等を感染させることによって不死化した後、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物の染色体内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、または非ヒト動物抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワークに移植したヒト化抗体のアミノ酸配列のいずれでもよい。具体的には、ハイブリドーマが産生する非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の抗体のＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のアミノ酸配列のＣκまたはＣλが好ましい。
本発明の抗体のＣＨとしては、イムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはＩｇＧクラスに属するサブクラス、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）またはγ４（ＩｇＧ４）のいずれも用いることができる。
エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＣＤＣ活性）、またはマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＰ活性）などが知られている。本発明においてＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は、公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］を用いて測定することができる。
ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が、抗体のＦｃ領域を介して免疫細胞のＦｃ受容体と結合することで免疫細胞（ナチュラルキラー細胞など）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。
Ｆｃ受容体（以下、ＦｃＲと記すこともある）とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体であり、抗体の結合によりさまざまなエフェクター活性を誘導する。ＦｃＲは抗体のサブクラスに対応しており、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭはそれぞれＦｃγＲ、ＦｃεＲ、ＦｃαＲ、ＦｃμＲに特異的に結合する。
更にＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のサブタイプが存在し、ぞれぞれＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢのアイソフォームが存在する。これらの異なるＦｃγＲは異なる細胞上に存在している［Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）］。
ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球に特異的に発現しており、ＦｃγＲＩＩＩＡは、単球、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ細胞（ＮＫ細胞）および一部のＴ細胞に発現している。ＦｃγＲＩＩＩＡを介した抗体の結合は、ＮＫ細胞依存的なＡＤＣＣ活性を誘導する。
ＣＤＣ活性とは標的細胞上の抗原に結合した抗体が血液中の補体関連タンパク質群からなる一連のカスケード（補体活性化経路）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。また、補体の活性化により生じるタンパク質断片により免疫細胞の遊走、活性化を誘導することができる。ＣＤＣ活性のカスケードは、抗体のＦｃ領域との結合ドメインを有するＣ１ｑが、Ｆｃ領域に結合し、２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと結合することでＣ１複合体を形成することで開始する。
本発明の抗体としては、具体的には配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、ならびに配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、それぞれ配列番号５９〜６１で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号６２〜６４で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体、それぞれ配列番号７１〜７３で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号７４〜７６で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体、それぞれ配列番号８３〜８５で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号８６〜８８で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体ならびにそれぞれ配列番号９５〜９７で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号９８〜１００で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体などが挙げられる。
本発明の抗体としては、それぞれ配列番号５９〜６１で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号６２〜６４で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む１１５３抗体クローン、それぞれ配列番号７１〜７３で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号７４〜７６で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む９２０１０４抗体クローン、それぞれ配列番号８３〜８５で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号８６〜８８で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む１１２６抗体クローンならびにそれぞれ配列番号９５〜９７で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号９８〜１００で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む１２５１１抗体クローンが挙げられる。
本発明の遺伝子組み換え抗体としては、それぞれ配列番号５９〜６１で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号６２〜６４で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体、それぞれ配列番号７１〜７３で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号７４〜７６で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体、それぞれ配列番号８３〜８５で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号８６〜８８で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体ならびにそれぞれ配列番号９５〜９７で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３およびそれぞれ配列番号９８〜１００で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体などが挙げられる。
本発明の抗体としては、下記（ａ）〜（ｃ）に記載の抗体が挙げられる。
（ａ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
（ｂ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（ｃ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
また本発明の抗体としては、上述の抗体と競合してｅｒｂＢ３の細胞外領域に結合する抗体、上述の抗体が反応するｅｒｂＢ３の細胞外領域に存在するエピトープを含むエピトープに反応する抗体、および上述の抗体が反応するｅｒｂＢ３の細胞外領域に存在するエピトープと同じエピトープに反応する抗体が挙げられる。
本発明において、「１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体」とは、１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれる第１抗体が反応する第１エピトープを含む第２エピトープに結合する第２抗体のことをいう。
本発明の抗体としては、Ｆｃと抗体断片とが結合したＦｃ融合タンパク質、Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も本発明に包含される。また、抗体のエフェクター活性を増強または欠損させるため、抗体を安定化させるためおよび血中半減期を制御するためにアミノ酸残基改変を行ったアミノ酸残基改変を含むＦｃ領域も本発明の抗体に用いることができる。
本発明の抗体としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン１〜ドメイン４から選ばれる少なくとも２つのドメインに反応する抗体および該抗体断片が挙げられる。具体的には、ドメイン１とドメイン２、ドメイン１とドメイン３、ドメイン１とドメイン４、ドメイン２とドメイン３、ドメイン２とドメイン４およびドメイン３とドメイン４から選ばれるいずれか１つの組み合わせに反応する抗体が挙げられる。これらの中でも、ドメイン１とドメイン２、ドメイン１とドメイン４、ドメイン２とドメイン３およびドメイン３とドメイン４から選ばれるいずれか１つの組み合わせに反応する抗体が好ましく、ドメイン１とドメイン４に反応する抗体がより好ましい。
ｅｒｂＢ３の細胞外領域の２つのドメインに反応する抗体は、既存のバイスペシフィック抗体、多価抗体（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）作製技術（国際公開第１９９８／０５０４３１号、国際公開第２００１／７７３４号、国際公開第２００２／００２７７３号、国際公開第２００９／１３１２３９号）により作製することができる。
本発明において抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる２種類の抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明の改変抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体組成物としては、上述に記載の抗体または該抗体断片の２つ以上を含む抗体組成物（または混合物）などが挙げられる。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン１〜ドメイン４から選ばれる少なくとも１つのドメインを含む細胞外領域に反応する第１抗体または該抗体断片と、第１抗体と異なるドメインに反応する第２抗体または該抗体断片とを含む抗体組成物などが挙げられる。中でも、第１抗体がｅｒｂＢ３のドメイン４またはドメイン２に反応する抗体であり、かつ第２抗体がｅｒｂＢ３のドメイン１またはドメイン３に反応する抗体である抗体組成物が好ましく、第１抗体がｅｒｂＢ３のドメイン４に反応する抗体であり、かつ第２抗体がｅｒｂＢ３のドメイン１に反応する抗体である抗体組成物などがより好ましい。
前記第１抗体は、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体または該抗体断片であることが好ましい。
（ａ）１１２６抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
（ｂ）１１２６抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（ｃ）１１２６抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
また、前記第２抗体は、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体または該抗体断片であることが好ましい。
（ａ）１１５３抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
（ｂ）１１５３抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（ｃ）１１５３抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
本発明の抗体組成物は、ｅｒｂＢ３特異的リガンドのｅｒｂＢ３への結合を阻害すると同時に、ｅｒｂ３とｅｒｂＢファミリーとのダイマー化（ホモダイマーおよびヘテロダイマー）を阻害することができる。
本発明の抗体には、本発明のｅｒｂＢ３の細胞外領域を特異的に認識し、かつＥＧＦ様リガンド依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体またはその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、タンパク質若しくは抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明における、抗体の誘導体は、本発明のｅｒｂＢ３の細胞外領域を特異的に認識し、かつＥＧＦ様リガンド依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体またはその抗体断片のＨ鎖若しくはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基若しくは側鎖、さらには抗体またはその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、タンパク質または抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門，地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
また、本発明における、抗体の誘導体は、本発明のｅｒｂＢ３の細胞外領域を特異的に認識し、かつＥＧＦ様リガンド依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたいタンパク質または抗体医薬をコードするＤＮＡとを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
放射性同位元素としては、例えば、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、または２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学，癌と化学療法社（１９９６）］、ハイドロコーチゾン若しくはプレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン若しくはインドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド若しくはアザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、またはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法，医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３；Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｏｔｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサ、タルセバなどの上皮細胞増殖因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール−トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ−ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、メイタンシノイドまたはその誘導体、などが挙げられる。
低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマーまたはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的または生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失または抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。
ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、例えば、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、例えば、リジンのε−アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６−２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２−１１７９２０号公報）などが挙げられる。
免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、例えば、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
タンパク質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージ若しくは好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカインまたは増殖因子、あるいは毒素タンパク質などが挙げられる。
サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）などが挙げられる。毒素タンパク質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシン、またはＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｃｌａｓｓ ＩＩ、または上皮細胞増殖因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＧＦＲ）などが挙げられる。
腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、またはＢ７−Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、またはＢＴＬＡ）、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、またはＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ＮＦκＢ活性化受容体リガンド（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ｌｉｇａｎｄ；ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体、サイトカイン［ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）β、またはＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、またはＣＴＡＣＫなど）、またはこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、繊維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）、ＥＧＦ、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＩＧＦ）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）、ＳＤＦ−１、またはこれらの受容体などが挙げられる。
タンパク質または抗体医薬との融合抗体は、モノクローナル抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡにタンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬または診断薬として使用する場合に、本発明のｅｒｂＢ３の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片に結合する薬剤としては、例えば、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。
標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
本発明において、腫瘍、悪性腫瘍および癌としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起膠腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫およびウィルムス腫瘍からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
以下、本発明の抗体の作製方法、抗体を用いたｅｒｂ３の測定方法、診断方法および治療方法について具体的に記載する。
１．抗体の作製方法
本発明において、モノクローナル抗体の製造にあたっては、下記の作業工程を包含する。
すなわち、（１）免疫原として使用する、生体高分子の精製および／または抗原タンパク質を細胞表面に過剰に発現している細胞の作製、（２）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓等の摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、（３）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、（４）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、（５）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（６）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、（７）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、（８）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性およびその認識特異性の検討、または標識試薬としての特性の検定、等である。
以下、本発明の抗ｅｒｂＢ３抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。またヒト抗体産生トランスジェニック動物血清由来の抗体を用いることも可能である。
（１）抗原の精製
抗原となるｅｒｂＢ３またはｅｒｂＢ３を発現させた細胞は、ｅｒｂＢ３全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ｅｒｂＢ３を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などからｅｒｂＢ３を精製し、得ることが出来る。また、該腫瘍培養細胞または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりｅｒｂＢ３の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
本発明で用いられるｅｒｂＢ３は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ｅｒｂＢ３をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
ｅｒｂＢ３をコードする完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、部分ポリペプチドをコードする適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ｅｒｂＢ３を生産する形質転換体を得ることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、ｅｒｂＢ３をコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ｅｒｂＢ３をコードするＤＮＡおよび転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
また、該ｅｒｂＢ３をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするｅｒｂＢ３の生産率を向上させることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９８）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターまたはＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、またはｌｅｔＩプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、またはｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、またはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、またはＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）などが挙げられる。
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
以上のようにして得られるｅｒｂＢ３をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、または動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ｅｒｂＢ３を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ｅｒｂＢ３を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたｅｒｂＢ３を得ることができる。誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
ｅｒｂＢ３をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、例えば、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］が挙げられる。
ｅｒｂＢ３の生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法が挙げられ、使用する宿主細胞または生産させるｅｒｂＢ３の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
例えば、細胞外領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡ、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするＤＮＡ、ＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡまたはＨｉｓｔｉｄｉｎｅタグをコードするＤＮＡなどを連結したＤＮＡを作製して、発現・精製することで抗原融合タンパク質を作製することができる。
具体的には、ｅｒｂＢ３の細胞外領域をヒトＩｇＧのＦｃ領域を結合させたＦｃ融合タンパク質（以下、ｅｒｂＢ３−ｈＦｃと記す）、ｅｒｂＢ３の細胞外領域とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質（以下、ｅｒｂＢ３−ＧＳＴと記す）が挙げられる。
ｅｒｂＢ３が宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５−３３６９６３号公報、または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ｅｒｂＢ３を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２−２２７０７５号公報）を利用してｅｒｂＢ３の生産量を上昇させることもできる。
得られたｅｒｂＢ３は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
ｅｒｂＢ３が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
ｅｒｂＢ３が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ｅｒｂＢ３の不溶体を回収する。回収した該ｅｒｂＢ３の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ｅｒｂＢ３を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
ｅｒｂＢ３またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ｅｒｂＢ３またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明において用いられるｅｒｂＢ３は、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。更に、ｅｒｂＢ３の一次構造は公知であるので（Ｋｒａｕｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，９１９３−９１９７，１９８９．）、当業者に周知の方法により、ペプチド等を作製することができ、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル−ベガ社製、パーセプチブ社製、または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）抗体産生細胞の調製工程
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、動物としては、富塚らの文献（Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，Ｖｏｌ ９７：７２２、２０００）に記載されているヒト由来の抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウス、または免疫原性を高めるためにｅｒｂＢ３コンディショナルノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
免疫は、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射などいずれでもよいが、腹腔内注射、足蹠注射または静脈内注射が好ましい。抗原が部分ペプチドである場合には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃若しくは末梢血またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾臓細胞が最も一般的に用いられる。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることが出来る。一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば、ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、またはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］などが用いられる。
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシンおよびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地に８−アザグアニンを加えた培地］ 、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地（例えば、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
（４）細胞融合
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５：１〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地（ＨＡＴ培地）中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
また、以下の方法でも細胞融合を行うことができる。脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＤＭＥＭ）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「リン酸緩衝液」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。
上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。
再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のＨＡＴ液およびヒトインターロイキン−２（以下「ＩＬ−２」という）を含むＨＡＴ培地中に懸濁して培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
（５）ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞同士の融合細胞、または、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞同士の融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。その後、培養上清の一部を採取し後述する抗体価測定法を用いて抗体を生産するハイブリドーマを選択することができる。
抗体価の測定方法としては、例えば、放射性同位元素免疫定量法（以下「ＲＩＡ法」という）、固相酵素免疫定量法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）、蛍光抗体法および受身血球凝集反応法など種々の公知技術が挙げられる。中でも、検出感度、迅速性、正確性および操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法が好ましい。
抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、例えば、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個ずつの細胞を取り出し培養する方法、およびセルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便であり、よく用いられる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗ヒトｅｒｂＢ３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（６）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（５）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。
前記マウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。また、同系統のマウス（例えばＢＡＬＢ／ｃ）若しくはＮｕ／Ｎｕマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明の抗ｅｒｂＢ３抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
（５）で得られるたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、ＧＩＴ培地、５％ダイゴＧＦ２１を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ培地等に懸濁し、フラスコ培養、スピナー培養、バック培養などにより３〜７日間培養する。
得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ−カラムまたはプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩキット；アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を利用することもできる。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ］より算出する方法により行うことができる。
（７）抗ｅｒｂＢ３モノクローナル抗体の結合アッセイ
本発明の抗ｅｒｂＢ３モノクローナル抗体の結合活性は、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）または表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）などのバインディングアッセイ系で、確認することができる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。
一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
精製または部分精製した組換えヒトｅｒｂＢ３をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と記す）によりブロッキングを行う。
ＥＬＩＳＡプレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むｐｈｏｓｐｈａｔａ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと略記する）（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと略記する）などで洗浄後、段階希釈した１次抗体（例えばマウス血清、培養上清等）を反応させ、プレートに固定化された抗原へ抗体を結合させる。
次に、第２抗体としてビオチン、酵素（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ，ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰなど）、化学発光物質または放射性化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して、プレートに結合した１次抗体に２次抗体を反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
ＦＣＭ法は、抗原発現細胞に対する目的抗体の結合活性を測定することができる［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］。目的の抗体が細胞膜上に発現している膜タンパク質に結合することは、目的抗体が天然に存在する抗原の立体構造を認識する抗体であるといえる。
ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）によるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析が挙げられる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。
抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、更に濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
または、ヒトｅｒｂＢ３タンパク質をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
また、本発明の抗ｅｒｂＢ３抗体と競合してｅｒｂＢ３に結合する抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時に抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ｅｒｂＢ３細胞外領域への結合について、取得した抗体と競合する抗体を取得することができる。
（８）抗ｅｒｂＢ３モノクローナル抗体のエピトープの同定
本発明において、抗体の認識エピトープの同定は以下のようにして行なうことができる。例えば、抗原の部分欠損体、種差で異なるアミノ酸残基を改変したアミノ酸改変体またはドメインを改変した改変体を作製し、該欠損体またはアミノ酸改変体に対する目的抗体の反応性が低下すれば、欠損部位またはアミノ酸改変部位が目的抗体のエピトープであることが明らかになる。抗原の部分欠損体およびアミノ酸改変体は、適当な宿主細胞（大腸菌、酵母、植物細胞、哺乳動物細胞など）を用いて分泌タンパク質として取得してもよいし、宿主細胞の細胞膜上に発現させて抗原発現細胞を作製することもできる。膜型抗原の場合は、抗原の立体構造を保持したまま発現させるために、宿主細胞膜上へ発現させることが好ましい。また、抗原の１次構造または立体構造を模倣した合成ペプチドを作製し、目的の抗体の反応性を確認することもできる。合成ペプチドは、公知のペプチド合成技術を用いてその分子の様々な部分ペプチドを作製する方法等が挙げられる。
本発明の抗ｅｒｂＢ３抗体については、ヒトおよびマウスｅｒｂＢ３の細胞外領域について、各ドメイン１〜４をそれぞれ、組み合わせたキメラタンパク質を作製し、目的の抗体の反応性を確認することで抗体のエピトープを同定することができる。
その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチドまたは該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、該ペプチドに対する目的の抗体の反応性を確認することでエピトープを限定することができる。多種のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット［例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等］を利用することもできる。
本発明のｅｒｂＢ３の細胞外領域に結合する抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインディングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、エピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチドまたは組換えタンパク質等を作製し、免疫することで取得することができる。
例えば、膜タンパク質であれば全細胞外領域または一部の細胞外ドメインを適当なタグ（ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅタグ、ＧＳＴタンパク質、抗体Ｆｃ領域など）に連結した組換えタンパク質を作製し、該組換えタンパク質を免疫することでより効率的なエピトープ特異的な抗体を作製することができる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳおよびＪ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳなどに概説されているが、以下にヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。
例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０）］、またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３）］、ＩＮＰＥＰ４，（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社製）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などを用いる。動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）〕、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号明細書）または免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］などを用いる。
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８）］、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などを用いる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、またはラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、またはＲＮＡ ｅａｓｙ（登録商標） ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、またはＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（登録商標） ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ（登録商標） ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（登録商標） ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、またはＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］、またはｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］などが挙げられる。
ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］、またはＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］などが挙げられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］を行うことよりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列の解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列の解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。
また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴまたはＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列の新規性を確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００〜１５０塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも４〜６本の合成ＤＮＡを設計する。また、可変領域全長の合成ＤＮＡを合成して用いることもできる。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターに容易にヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体Ｖ領域の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］またはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し行うことで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト化抗体を取得できる。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、（４）および（５）で得られるヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）および（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ−７細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１］を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ（１９９１）］、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などを用いる。
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の所得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）および（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、カルシウムイオン方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、マイクロインジェクション法、ＥＳ細胞にエレクトロポレーション若しくはリポフェクション法を使用して遺伝子を導入する方法、または核移植法などが挙げられる。
遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５（１９８６）］、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質あるいはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質、または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下または欠失した宿主細胞（国際公開第２００３／８５１０２号）、例えばα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２−２５７８９１号公報）。
動物細胞培養用培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ３２５培地（ＪＲＨ社製）ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などが挙げられる。
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２−２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ−カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などのタンパク質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］、またはウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
３．精製モノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
ｅｒｂＢ３発現細胞株に対する結合活性は、前述の１−（７）記載のバインディングアッセイ系を用いて測定することができる。抗原陽性細胞株に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］により測定することができる。
ＥＧＦ様リガンド依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化およびｅｒｂＢ３特異的リガンド依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化は以下のようにして測定することができる。
ｅｒｂＢ３発現細胞をＰＢＳまたは無血清培地等で洗浄し、無血清培地で２４ ｈｒ程度培養する。次に、数ｎｇ／ｍＬ〜数１０ｎｇ ／ｍＬのｅｒｂＢ３受容体リガンドを含む培地中に目的の抗体を添加した培地を用いてｅｒｂＢ３発現細胞を数分〜数１０分細胞を培養した後、該細胞抽出液を調製し、ｅｒｂＢ３特異的抗体およびｈｏｕｓｅ ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ（アクチンなど）特異的抗体を用いて各タンパク質を免疫沈降させる。
前記沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、ｅｒｂＢ３特異的抗体およびリン酸化チロシン特異的抗体を用いて、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行なうことで、ｅｒｂＢ３のリン酸化阻害活性を測定することができる。
また、抗体添加後の培養細胞を、ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅおよびサポニンによりタンパク質の固定化および細胞膜透過処理を行ない、ｅｒｂＢ３特異的抗体およびリン酸化チロシン特異的抗体を用いたＦＣＭ解析を行うことでも、ｅｒｂＢ３のリン酸化を確認することができる。
また、ｅｒｂＢ３のダイマー化について上述リン酸化検出実験と同様にして培養、細胞抽出液の調製を行なった後に、抗ｅｒｂＢ３抗体を用いてｅｒｂＢ３タンパク質の免疫沈降を行い、該沈降タンパク質を各ｅｒｂＢファミリータンパク質に対する抗体で検出することで、ｅｒｂＢ３のダイマー化またはヘテロダイマー化について検出することができる。
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
本発明の抗ｅｒｂＢ３抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα−１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００３／８５１０２号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、または抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変する方法などが挙げられる。本発明の抗ｅｒｂＢ３抗体はいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。
エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（ＣＤＣ活性）、またはマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＰ活性）などが知られている。
抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加または低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。
一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。Ｆｃ領域のアミノ酸残基改変を行うことで、ＦｃγＲへの結合活性を増加させるあるいは低下させることによりＡＤＣＣ活性を制御することができるし、Ｆｃ領域のアミノ酸残基改変を行うことで、補体の結合活性を増加させるあるいは低下させることによりＣＤＣ活性を制御することができる。
例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書、米国特許第７，３１７，０９１号明細書または国際公開第２００５／０７０９６３号に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
更に、上述の糖鎖を制御する方法とＦｃ領域のアミノ酸残基改変を行う方法を組み合わせることにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
５．本発明の抗ｅｒｂＢ３抗体またはその抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のｅｒｂＢ３の細胞外領域を特異的に認識し、かつＥＧＦ様リガンド依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体またはその抗体断片は、ｅｒｂＢ３が関与する癌などの過増殖性疾患（ｈｙｐｅｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）の治療に用いることができる。
ｅｒｂＢ３が関与する疾患としては、例えば、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、グリオーマ、悪性黒色腫（メラノーマ）、甲状腺癌、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起膠腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫およびウィルムス腫瘍などが挙げられる。
また、本発明の抗ｅｒｂＢ３抗体の少なくとも２つ以上を用いて、上述の疾患の治療を行なうことができる。具体的には、ｅｒｂＢ３の１〜４ドメインの各ドメインの抗体を組み合わせて用いることが挙げられるが、好ましくはｅｒｂＢ３のドメイン１または３に結合する抗体と、ドメイン２または４に結合する抗体とを投与することを含む治療方法、最も好ましくはｅｒｂＢ３のドメイン１に結合する抗体と、ドメイン４に結合する抗体とを投与することを含む治療方法が挙げられる。
本発明の抗体またはその抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
投与経路としては、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内あるいは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。
各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤または安定化剤などを用いて常法により製造することができる。
賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロース、滅菌水、エタノール、グリセロール、生理食塩水および緩衝液などが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウムおよび合成ケイ酸マグネシウムなどが挙げられる。
結合剤としては、例えば、メチルセルロースまたはその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールおよび硬化植物油などが挙げられる。
安定化剤としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニンなどのアミノ酸、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン４０、メチルセルロース、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
その他の添加剤としては、例えば、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダおよびリン酸ナトリウムなどがそれぞれ挙げられる。
経口投与に適当な製剤は、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などである。
乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤または噴霧剤などが挙げられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。
噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明の抗体の有効量と適切な希釈剤および薬理学的に使用し得るキャリアとの組合せとして投与される有効量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇであり、２日から８週間間隔で投与される。
６．本発明の抗ｅｒｂＢ３モノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた疾患の診断方法
本発明の抗体または該抗体断片を用いて、ｅｒｂＢ３またはｅｒｂＢ３が発現した細胞を検出または測定することにより、ｅｒｂＢ３が関連する疾患を診断することができる。
ｅｒｂＢ３が関連する疾患の一つである癌の診断は、例えば、以下のようにｅｒｂＢ３の検出または測定して行うことができる。
まず、複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、ｅｒｂＢ３の検出または測定を行い、健常者の生体試料中のｅｒｂＢ３の存在量を調べる。次に、被験者の生体試料中についても同様にｅｒｂＢ３の存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。被験者の該ポリペプチドの存在量が健常者と比較して増加している場合には、癌が陽性であると診断される。
免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射性標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法，医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識またはビオチン標識などが挙げられる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識しておく。
上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞若しくはその破砕液、組織若しくはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水または眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片との組み合わせでもよい。
蛍光免疫測定法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法，ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどが挙げられる。
発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光 臨床検査４２，廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、例えば、アクリジニウムエステルまたはロフィンなどが挙げられる。
ウェスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞または組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１〜３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１〜１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５〜０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ（登録商標） Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。
ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
物理化学的手法としては、例えば、抗原であるｅｒｂＢ３と本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、該凝集体を検出することにより行う方法が挙げられる。この他に物理化学的手法として、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要，金原出版（１９９８）］などが挙げられる。
ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１〜１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
一方、ｅｒｂＢ３が発現している細胞の検出または測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いる。
免疫沈降法は、ｅｒｂＢ３を発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。
または以下のような方法によっても行なうことができる。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによりブロッキングする。
抗体が、例えば、ハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン−Ａまたはプロテイン−ＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。
次に、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ｅｒｂＢ３を発現している細胞または組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤またはメタノールなどで処理した後、本発明のモノクローナル抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。
また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ−サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。特に、本発明のｅｒｂＢ３の細胞外領域に結合する抗体またはその抗体断片は、蛍光抗体染色法により細胞膜上に発現しているｅｒｂＢ３を検出することができる。
また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体−抗原複合体と、抗体−抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ ｅｒｂＢ３抗原の作製
１．ヒトｅｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質発現ベクター
ヒトｅｒｂＢ３の細胞外領域（配列番号３）にヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域を結合させたＦｃ融合タンパク質（以下、ｅｒｂＢ３−Ｆｃと記す）のｃＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。ヒトｅｒｂＢ３の細胞外領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片は、配列番号７および配列番号８のプライマーを用いて、Ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型として、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて、９４℃ １５秒間、６０℃ ３０秒間、６８℃ ２分間、３５サイクルのＰＣＲ反応を行い増幅した。このｅｒｂＢ３遺伝子断片を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含むＩＮＰＥＰ４ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社製）の適切な部位に挿入し、ｅｒｂＢ３−Ｆｃ発現ベクターを作製した。
２．ヒトｅｒｂＢ３−ＧＳＴタンパク質発現ベクターの作製
以下の実験において、別途記載が無い限り、１．のＰＣＲ条件および制限酵素処理を行い、各発現ベクターを作製した。
ヒトｅｒｂＢ３の細胞外領域（配列番号３）とグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと記す）を結合させたＧＳＴ融合タンパク質（以下、ｈｅｒｂＢ３−ＧＳＴと記す）のｃＤＮＡ断片は、以下のようにして作製した。
ヒトｅｒｂＢ３細胞外領域のｃＤＮＡ断片は、配列番号９のプライマーおよび配列番号１０のプライマーを用いて、Ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型として、９４℃ １５秒間、６０℃ １５秒間、６８℃ ２分間、３５サイクルのＰＣＲ反応を行い、増幅した。この遺伝子断片を制限酵素ＫｐｎＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＧＳＴを含むＩＮＰＥＰ４ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社製）の適切な位置にに挿入し、ｈｅｒｂＢ３−ＧＳＴ発現ベクターを作製した。
３．マウスｅｒｂＢ３−ＧＳＴタンパク質発現ベクターの作製
マウスｅｒｂＢ３の細胞外領域（配列番号６）にＧＳＴを結合させたＧＳＴ融合タンパク質（以下、ｍｅｒｂＢ３−ＧＳＴ）のｃＤＮＡ断片は、Ｍｏｕｓｅ ｌｕｎｇ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型として、配列番号１１のプライマーおよび配列番号１２のプライマーを用いて９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ ２分間、３５サイクルのＰＣＲ反応を行い増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片は、制限酵素ＭｕＩおよびＢｇｌＩＩを用いて消化した。以下の操作は［実施例１］１．と同様にしてマウスｅｒｂＢ３−ＧＳＴ発現ベクターを作製した。
４．ヒト−マウスキメラｅｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質発現ベクターの作製
抗ｅｒｂＢ３抗体の結合領域を調べるため、ヒトｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン２〜４をマウスｅｒｂＢ３のドメイン２〜４に置換したキメラタンパク質（以下、ｈＤ１／ｍＤ２３４と記す）、ヒトｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン３〜４をマウスｅｒｂＢ３のドメイン３〜４に置換したキメラタンパク質（以下、ｈＤ１２／ｍＤ３４と記す）およびヒトｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン４をマウスｅｒｂＢ３のドメイン４に置換したキメラタンパク質（以下、ｈＤ１２３／ｍＤ４と記す）の発現ベクターを、以下のようにして作製した。
（１）ｈＤ１／ｍＤ２３４発現ベクターの作製
ヒトｅｒｂＢ３−Ｄ１のｃＤＮＡ断片は、ヒトｅｒｂＢ３ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１３のプライマーと配列番号１４のプライマーとを用いて、９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ ３０秒間、３５サイクルのＰＣＲ反応を行ない増幅した。一方、マウスｅｒｂＢ３−Ｄ２３４のｃＤＮＡ断片は、マウスｅｒｂＢ３ ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１５のプライマーと配列番号１６のプライマーとを用いて、９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ ９０秒間、３５サイクルのＰＣＲを行い増幅した。
ｈＤ１／ｍＤ２３４のｃＤＮＡ断片は、ヒトｅｒｂＢ３−Ｄ１のｃＤＮＡ断片およびマウスｅｒｂＢ３−Ｄ２３４のｃＤＮＡ断片を精製し、混合したものを鋳型として、９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ ２分間、５サイクルのＰＣＲ反応を行なった後、配列番号１７のプライマーおよび配列番号１８のプライマーをを添加して、更に９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ ２分間、３５サイクルのＰＣＲ反応を行い、増幅した。この遺伝子断片を制限酵素ＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＧＳＴを含むＩＮＰＥＰ４ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社製）に挿入し、ｈＤ１／ｍＤ２３４発現ベクターを作製した。
（２）ｈＤ１２／ｍＤ３４発現ベクターの作製
ヒトｅｒｂＢ３−Ｄ１２のｃＤＮＡ断片は、ヒトｅｒｂＢ３ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１９のプライマーおよび配列番号２０のプライマーを用いて、９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ １分間、３５サイクルのＰＣＲを行い、増幅した。
一方、マウスｅｒｂＢ３−Ｄ３４のｃＤＮＡ断片は、マウスｅｒｂＢ３ｃＤＮＡを鋳型として配列番号２１のプライマーおよび配列番号２２のプライマーを用いて、９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ ９０秒間、３５サイクルのＰＣＲ反応を行い増幅した。これら増幅した２つのｃＤＮＡ断片と、配列番号２３のプライマーおよび配列番号２４のプライマーを用いて、上述（ａ）と同様にして、ｈＤ１２／ｍＤ３４発現ベクターを作製した。
（３）ｈＤ１２３／ｍＤ４発現ベクターの作製
ヒトｅｒｂＢ２−Ｄ１２３のｃＤＮＡ断片は、ヒトｅｒｂＢ３ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２５のプライマーおよび配列番号２６のプライマーを用いて、９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ ２分間、３５サイクルのＰＣＲを行い増幅した。
一方、マウスｅｒｂＢ３−Ｄ４のｃＤＮＡ断片は、マウスｅｒｂＢ３ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２７のプライマーおよび配列番号２８のプライマーを用いて、９４℃ ３０秒間、６５℃ １５秒間、６８℃ ９０秒間、３５サイクルのＰＣＲ反応を行い増幅した。これら増幅した２つのｃＤＮＡ断片と、配列番号２９のプライマーおよび配列番号３０のプライマーを用いて、上述（ａ）と同様にして、ｈＤ１２３／ｍＤ４発現ベクターを作製した。
５．ｅｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質およびｅｒｂＢ３−ＧＳＴタンパク質の作製
上述１．〜４．で作製したｅｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質発現ベクターおよびｅｒｂＢ３−ＧＳＴタンパク質発現ベクターは、それぞれＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて、添付説明書に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞へ導入した。ベクター導入後５日目の培養上清を回収し、０．２μｍのフィルター（ミリポア社製）処理を行った。
ｅｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）、アマシャム社製）を用いてアフィニティー精製した。洗浄液としてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、溶出緩衝液として２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７）を用いた。溶出画分は２００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加してｐＨ６．０付近に調整した。
ｅｒｂＢ３−ＧＳＴタンパク質は、培養上清１２５ｍＬに対しＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャム社製）樹脂懸濁液１ｍＬを添加し、４℃で４時間反応させた。その後、リン酸緩衝液で洗浄し、溶出緩衝液として１０ｍＭ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて各ドメインペプチドをアフィニティー精製した。
溶出された融合タンパク溶液は、透析膜（１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてリン酸緩衝液に置換し、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌し、ｅｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質およびｅｒｂＢ３−ＧＳＴタンパク質を作製した。
ｅｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質およびｅｒｂＢ３−ＧＳＴタンパク質の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、０．８６ Ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｎｓｉｔｙを示す融合タンパク質溶液の濃度を１ｍｇ／ｍＬとして算出した。
［実施例２］ 抗ヒトｅｒｂＢ３抗体の作製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。被免疫動物は、日本ＳＬＣ社で市販されているＣ３Ｈ／Ｈｅｊ ｊｍｓ Ｓｌｃ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスを用いた。
ｅｒｂＢ３-Ｆｃ等の抗原タンパク質と、ＭＰＬ＋ＴＤＭ ＥＭＵＬＳＩＯＮ（ＲｉＢｉ：シグマ社製Ｃａ．Ｎｏ５２−０１７７−００）とを１：１で混合し、２０μｇ／匹でマウスの右腹腔内に初回免疫した。初回免疫以降は、１０〜２０μｇ／匹の抗原を７−９日間毎に複数回マウスに免疫した。さらに、細胞融合のために、脾臓およびリンパ節を取得する３日前に、同抗原を右腹腔内に免疫した。抗原免疫２回目以降から抗体価の測定を開始し、以降は経時的に抗体価の測定をおこない、脾臓等の摘出時期を判断した。
抗原を免疫したマウスから外科的に切除した脾臓およびリンパ節に、３５０ｍｇ／ｍＬ 炭酸水素ナトリウム、５０単位／ｍＬ ペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）（以下、無血清ＤＭＥＭ培地と記す）１０ｍＬを加え、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上で、スパーテルを用いてつぶした。メッシュを通した細胞懸濁液を、遠心分離して細胞を沈澱させた後、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄してから、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。
一方、１０％ ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと略記する）（シグマ社製）およびＬ−Ｇｌｕを含むＤＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）（以下、血清入りＤＭＥＭ培地と記す）を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２存在下で、８−アザグアニン耐性マウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）を１×１０８細胞／ｍＬ以下の細胞濃度で継代培養した。
培養したマウスミエローマ細胞は、上述と同様にして無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。回収したマウス脾臓およびリンパ節由来の細胞懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを、細胞数５：１の割合で混合した。この細胞混合液を遠心分離し、その後上清を完全に除去した。
このぺレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社製） １ｍＬを、ピペットの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地 １ｍＬを２回に分けてゆっくり添加し、さらに７ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地を添加した。遠心分離後、上清を除去して得られた融合細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニングに供した。
ハイブリドーマは、１０％ＦＣＳおよびヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）ならびにチミジン（Ｔ）（以下「ＨＡＴ」という。：シグマ社製）を含有するＤＭＥＭ培地（ＨＡＴ培地）で培養することで選択した。
さらに、ＨＴ（シグマ社製）含有ＤＭＥＭ培地（ＨＴ培地）を用いた限界希釈法により、ハイブリドーマをシングルクローンにした。培養は、９６穴マイクロタイタープレート（ベクトンディッキンソン社製）中で行った。
抗ヒトｅｒｂＢ３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマスクリーニングおよび各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の反応特異性解析は、後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）アッセイで行なった。
その結果、抗ヒトｅｒｂＢ３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ１１２６、１１５３、９２０１０４および１２５１１を確立した。
［実施例３］ 抗ｅｒｂＢ３抗体の結合ドメインの決定
本発明で取得した抗ヒトｅｒｂＢ３モノクローナル抗体の結合ドメインは、ｅｒｂＢ３の細胞外領域をＧＳＴに融合させたＧＳＴ融合タンパク質に対するｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡにより決定した。
５０ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９）（以下、ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと記す）にて１μｇ／ｍＬに調製したａｎｔｉ−Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｓｃｈｉｓｔｓｏｍａ−ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（Ｇｏａｔ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製 ｃａ．Ｎｏ．１６９７９）（以下ａｎｔｉ−ＧＳＴと記す）を、５０μＬ／ｗｅｌｌでマキシソープＰｌａｔｅ（ＮＵＮＣ；ｃａ．Ｎｏ．４４２４０４）に添加し、３７℃、１時間（または４℃、ＯＮ）インキュベートし、固相化した。
Ｂｕｆｆｅｒを廃棄した後、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を２５０〜３００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で５〜１０分間インキュベートし、ブロッキングした。ブロッキング試薬を廃棄した後、１０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（登録商標）（大日本住友製薬社製）、０．１％ ｔｗｅｅｎ２０を含むトリスバッファー生理食塩水（以下、アッセイ希釈液と記す）で５μｇ／ｍＬに希釈したｈｅｒｂＢ３−ＧＳＴ融合タンパク質、ｍｅｒｂＢ３−ＧＳＴ融合タンパク質、ｈＤ１／ｍＤ２３４融合タンパク質、ｈＤ１２／ｍＤ３４融合タンパク質およびｈＤ１２３／ｍＤ４融合タンパク質を、それぞれ抗原ごとのｐｌａｔｅに５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間インキュベートして固相化した。
抗原溶液を廃棄し、プレートを０．１％ ｔｗｅｅｎ２０を含むトリスバッファー生理食塩水（以下、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと記す）にて３回洗浄した後、アッセイ希釈液で希釈した免疫血清サンプル（終濃度１００、１０００、１００００倍希釈）、マウス血清サンプル（終濃度１００、１０００、１００００倍希釈）、陽性コントロールとしてａｎｔｉ−ｃ−ＥｒｂＢ３ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂ−４）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＯＰ１１９）（終濃度１〜１０００ｎｇ／ｍＬ）および陰性コントロールとしてｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．０１０２０１）（終濃度１〜１０００ｎｇ／ｍＬ）を、５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１次抗体を添加した後、室温にて３０分間インキュベーションした。
Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて３回洗浄後、アッセイ希釈液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０３０−０５）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＣＡＬＴＡＧ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ３０１０７）およびＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２０−０５）を各ウェルに５０μＬ加え、室温にて３０分間反応させた。
Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて４回洗浄後、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）発色基質液（ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに５０μＬ加え、暗所にて室温でインキュベートし、発色させた（約３分間程度）。発色の進行具合を観察しながら、０．５Ｍ硫酸（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、反応を停止した。
波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００；コロナ電気社製）で測定した。Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡの結果、各クローンの各種抗原に対する反応性を表１に示す。
Figure 2012176779
表１に示すように、本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３モノクローナル抗体１１５３は、ｅｒｂＢ３細胞外領域のドメイン１を認識し、抗ヒトｅｒｂＢ３モノクローナル抗体９２０１０４はドメイン３を認識し、抗ヒトｅｒｂＢ３モノクローナル抗体１１２６はドメイン４を認識することが明らかになった。一方、本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３モノクローナル抗体１２５１１はヒトｅｒｂＢ３およびマウスｅｒｂＢ３の両方に反応することが明らかになった。
［実施例４］ 遺伝子組換え抗体の作製
１．各抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングとｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ ｃｈｉｍｅｒａ モノクローナル抗体発現ベクターの作製
ハイブリドーマを血清入りＤＭＥＭで培養し、遠心分離（１５００ｒｐｍ ３分間）により細胞を集めた後、５ｍＬのＩＳＯＧＥＮ（登録商標）（ニッポンジーン社製）を添加し、添付のプロトコールにしたがってＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。１μＬのｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ（登録商標） ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クロンテック社製）の添付のプロトコールにしたがって１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作製し、作製されたｃＤＮＡ ２．５μＬを鋳型として軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）および重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）をＫＯＤ ｐｌｕｓ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて増幅した。
ＶＬの増幅には、ＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに含まれる）とｍｋ−ＲｖＰ１（配列番号３１）プライマーを用いて、９４℃ ５秒間、７２℃ ３分間、５サイクルのＰＣＲを行い、続いて９４℃ ５秒間、７０℃ １０秒間、７２℃ ３分間、５サイクルの反応を行ない、さらに９４℃ ５秒間、６８℃ １０秒間、７２℃ ３分間、２５サイクルのＰＣＲを行なった。
次に、５倍希釈液したこの反応液１μＬを鋳型として、ＮＵＭＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ（登録商標） ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに含まれる）とｍｋ−ＲｖＰ２プライマー（配列番号３２）を用いて、９４℃ １５秒間、６０℃ ３０秒間、６８℃ １分間、２５〜３０サイクルのＰＣＲを行なった。
ＶＨの増幅には、キットに付属のＵＭＰとｍＨ−Ｒｖ１プライマー（配列番号３３）とを用いたＰＣＲ、およびキットに付属のＮＵＭＰとｍＨ−Ｒｖ２プライマー（配列番号３４）を用いたＰＣＲを上述と同じように行なった。
増幅したＶＨおよびＶＬのＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標） ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製した。精製されたＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロジェン社製）に連結し、添付説明書に従いサブクローニングした。次に、キットに含まれるＴ３プライマーおよびＴ７プライマーを用いて塩基配列の決定を行い、各クローン特異的プライマーを設計した。
以下に各クローンのキメラ抗体発現ベクター作製手順を示す。なお、全てのＰＣＲ反応はＫＯＤ ｐｌｕｓ （登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて行なった。また、発現ベクター挿入後のｓｅｑｕｅｎｃｅ解析は、重鎖はＳＥＱ４６１８プライマー（配列番号３５）、軽鎖はＳＥＱ１７８３プライマー（配列番号３６）を用いて確認した。
（１）１１５３抗体発現ベクターの作製
サブクローニングされた１１５３重鎖遺伝子を鋳型として１１５３Ｈｃ−ＳａｌＩＵ（配列番号３７）と１１５３Ｈｃ−ＮｈｅＩＬ（配列番号３８）を用い、９４℃ １５秒間、５５℃ ３０秒間、６８℃ １分間、３０サイクルのＰＣＲを行なった。この反応液を２％ アガロースゲル電気泳動に供し、約４５０ｂｐの断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標） ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
１１５３ＶＨ増幅断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩで消化し、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域およびＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片を含むＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｌａｒｋベクター（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社製）のＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトに導入した。挿入部分のＤＮＡ配列を確認し、１１５３抗体のＶＨのＤＮＡを有するＮ５ＫＧ１／１１５３Ｈベクターを作製した。
サブクローニングされた１１５３軽鎖遺伝子を鋳型として１１５３Ｌｃ−ＢｇｌＩＩプライマー（配列番号３９）と１１５３Ｌｃ−ＢｓｉＷＩプライマー（配列番号４０）を用いて、ＶＨと同様のＰＣＲ反応を行い、約４００ｂｐの断片を精製した。抽出した１１５３ＶＬ増幅断片を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、Ｎ５ＫＧ１／１１５３ＶＨベクターのＢｇｌＩＩおよびＢｓｉＷＩへ挿入した。挿入部分のＤＮＡ配列を確認し、１１５３抗体ＶＨおよびＶＬのＤＮＡを含むＮ５ＫＧ１／１１５３発現ベクター作製した。
（２）９２０１０４抗体発現ベクターの作製
９２０１０４抗体発現ベクターは、ＶＨ増幅用の９２０１０４Ｈｃ−ＳａｌＩＵプライマー（配列番号４１）と９２０１０４Ｈｃ−ＮｈｅＩＬプライマー（配列番号４２）を用い、ＶＬ増幅用の９２０１０４Ｌｃ−ＢｇｌＩＩプライマー（配列番号４３）と９２０１０４Ｌｃ−ＢｓｉＷＩプライマー（配列番号４４）とを用いた以外は、１−（１）と同様にして行い９２０１０４抗体のＶＨおよびＶＬのＤＮＡを有するＮ５ＫＧ１／９２０１０４発現ベクターを作製した。
（３）１１２６抗体発現ベクターの作製
１１２６抗体発現ベクターは、ＶＨ増幅用の１１２６Ｈｃ−ＳａｌＩＵプライマー（配列番号４５）と１１２６Ｈｃ−ＮｈｅＩＬプライマー（配列番号４６）を用い、ＶＬ増幅用の１１２６Ｌｃ−ＰｍｅＩＵプライマー（配列番号４７）と１１２６Ｌｃ−ＢｓｉＷＩプライマー（配列番号４８）とを用い、ＶＬの制限酵素としてＰｍｅＩを用いた以外は、１−（１）と同様にして行い１１２６抗体のＶＨおよびＶＬのＤＮＡを含むＮ５ＫＧ１／１１２６発現ベクターを作製した。
（４）１２５１１抗体発現ベクターの作製
１２５１１抗体発現ベクターは、ＶＨ増幅用の１２５１１Ｈｃ−ＳａｌＩＵプライマー（配列番号４９）と１２５１１Ｈｃ−ＮｈｅＩＬプライマー（配列番号５０）を用い、ＶＬ増幅用の１２５１１Ｌｃ−ＢｇｌＩＩＵプライマー（配列番号５１）と１２５１１Ｌｃ−ＢｓｉＷＩプライマー（配列番号５２）とを用いた以外は、上述１−（１）と同様にして行い１２５１１抗体のＶＨおよびＶＬのＤＮＡを含むＮ５ＫＧ１／１２５１１発現ベクターを作製した。
以上（１）〜（４）に記載の抗体発現ベクターに含まれるＤＮＡの塩基配列、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列および抗体のアミノ酸配列を以下に示す。
１１５３抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５３および配列番号５５、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号５４および５６に示す。また、分泌された１１５３抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号５７および５８に示す。更に、ＶＨのＣＤＲ１〜３およびＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５９〜６１および配列番号６２〜６４に示す。
９２０１０４抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号６５および配列番号６７、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号６６および６８に示す。また、分泌された９２０１０４抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号６９および７０に示す。更に、ＶＨのＣＤＲ１〜３およびＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７１〜７３および配列番号７４〜７６に示す。
１１２６抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号７７および配列番号７９、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号７８および８０に示す。また、分泌された１１２６抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号８１および８２に示す。更に、ＶＨのＣＤＲ１〜３およびＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８３〜８５および配列番号８６〜８８に示す。
１２５１１抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号８９および配列番号９１、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号９０および９２に示す。また、分泌された１２５１１抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号９３および９４に示す。更に、ＶＨのＣＤＲ１〜３およびＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９５〜９７および配列番号９８〜１００に示す。
（５）コントロール抗体発現ベクターの作製
ポジティブコントロール抗体として国際公開第２００７／０７７０２８号（特許文献３）に記載の抗ヒトｅｒｂＢ３ヒト抗体Ｕ１−５９を用いた。抗ヒトｅｒｂＢ３ヒト抗体Ｕ１−５９の発現ベクターは、国際公開第２００７／０７７０２８号（特許文献３）に記載の配列番号７０および７２で表されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを全合成し（タカラバイオ社）、Ｎ５ＫＧ１発現ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社製）に組み込み作製した。
ネガティブコントロール抗体として抗ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ（ＤＮＰ）抗体は、Ｍｏｔｏｋｉ Ｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１，３１２６−３１３５，２００５に記載のものを用いた。
２．遺伝子組換え抗体の発現と精製
上述実施例４−１．で作製した遺伝子組換え抗体発現ベクターは、それぞれＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて、添付説明書に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞へ導入し、数日間培養を行った。取得した上清は、０．２μｍのフィルター（ミリポア社製）に供し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞等の雑排物を除去した。
次に、フィルター処理した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）、アマシャム社製）へ添加し、遺伝子組換え抗体のアフィニティー精製を行った。洗浄液としてリン酸緩衝液、溶出緩衝液として２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）を用いた。
溶出画分は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加してｐＨ６．０付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてリン酸緩衝液に置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌し、精製された抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体を作製した。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４５ Ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｎｓｉｔｙとして算出した。
［実施例５］ 抗ｅｒｂＢ３抗体によるヘレグリン依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化阻害効果
ヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１ ５×１０４個を、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、血清入り ＲＰＭＩと記す）で懸濁し、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ｍＬ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、６．５％ ＣＯ２の培養条件で一晩培養した。
培養上清を除き、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、ＲＰＭＩと記す）で１回洗浄後、ＲＰＭＩを１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、一晩培養した。培養上清を除き、ＲＰＭＩで１回洗浄後、ＲＰＭＩで５０μｇ／ｍＬに調製した各抗体を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、６．５％ ＣＯ２、３０分間、細胞を培養した。
次に、ＲＰＭＩで希釈した２００ｎｇ／ｍＬ ＮＲＧ１−α／ＨＲＧ１−αＥＧＦ Ｄｏｍａｉｎ（Ｒ＆Ｄ社製、２９６−ＨＲ−０５０／ＣＦ）または４０ｎｇ／ｍＬ ＮＲＧ１−β１／ＨＲＧ１−β１ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ（Ｒ＆Ｄ社製、３７７−ＨＢ−０５０／ＣＦ）を、それぞれ２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、６．５％ ＣＯ２、１０分間培養した。
培養後、氷上において上清を除き、ＲＰＭＩで１回洗浄後、タカラ３９０００ Ｌａｎｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、細胞を回収した。次に、ＤＮＡを破砕し、９５℃、５分間加熱してウェスタンブロッティングのサンプルとした。
次に、３０ｍＡ／ゲル、６０分間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、３０ｍＡ／ゲルで９０分間、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦメンブレンには、ｅｒｂＢ３、リン酸化ｅｒｂＢ３およびＡｋｔの検出には、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（登録商標）（大日本住友製薬社製）を使用し、リン酸化Ａｋｔの検出には、５％ ＢＳＡおよび０．１％ ｔｗｅｅｎ２０を含むトリスバッファー生理食塩水（以下、５％ ＢＳＡ−ｔＴＢＳと記す）をブロッキングバッファーとして使用し、それぞれ室温、１時間ブロッキングを行なった。
ブロッキングバッファーを除いた後、５％ ＢＳＡ−ｔＴＢＳで調製した抗ｅｒｂＢ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗リン酸化ｅｒｂＢ３抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＡＫＴ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）および抗リン酸化ＡＫＴ抗体（プロメガ社）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。
０．１％ ｔｗｅｅｎ２０を含むトリスバッファー生理食塩水（以下、ＴＴＢＳ）でＰＶＤＦ膜を洗浄した後、抗ウサギイムノグロブリンヤギポリクローナル抗体／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）、室温で１時間インキュベートした。ＴＴＢＳでＰＶＤＦ膜を洗浄し、ＥＣＬ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｈｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を反応させ、ルミノイメージアナライザー（ＬＡＳ−１０００富士フィルム）を用いて蛍光を検出した。
その結果、図１に示したように、ヘレグリンαおよびβいずれもヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１細胞のｅｒｂＢ３のリン酸化および下流シグナルのＡｋｔのリン酸化を誘導した。また、抗ヒトｅｒｂＢ３ヒト抗体Ｕ１−５９および本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体は何れも、ヘレグリンαおよびβ依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害し、かつ下流シグナルのＡｋｔのリン酸化も阻害した。
［実施例６］ 抗ｅｒｂＢ３抗体によるアンフィレギュリン、ベータセルリン、エピレグリン、ＴＧＦ−α、ＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦ依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化阻害
実施例５と同様にしてヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１の前処理を行い、次に各リガンドを添加した。無血清ＲＰＭＩで希釈した１００ｎｇ／ｍＬ アンフィレギュリン（Ｒ＆Ｄ ２６２−ＡＲ／ＣＦ）、１００ｎｇ／ｍＬ ベータセルリン（Ｒ＆Ｄ ２６１−ＣＥ／ＣＦ）、１００ｎｇ／ｍＬ エピレグリン（Ｒ＆Ｄ １１９５−ＥＰ／ＣＦ）、２００ｎｇ／ｍＬ ＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ２５９−ＨＥ／ＣＦ）および２００ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−α（Ｒ＆Ｄ ２３９−Ａ）を、それぞれ２５０μＬ／ｗｅｌｌで培地に添加し、３７℃、６．５％ ＣＯ２、１０分間培養した。以降は、実施例５と同様にして全ｅｒｂＢ３タンパク質量とリン酸化ｅｒｂＢ３タンパク質量を解析した。
その結果、図２に示したように、ヘレグリン以外のＥＧＦ様リガンドであるアンフィレギュリン、ベータセルリン、エピレグリン、ＴＧＦ−α、ＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦ何れのリガンドとも、ヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１のｅｒｂＢ３をリン酸化した。
抗ヒトｅｒｂＢ３ヒト抗体Ｕ１−５９および本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１１５３、９２０１０４、１１２６および１２５１１は何れも、全てのＥＧＦ様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害した。特に、本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１１２６は、全てのリガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を最も強く阻害した。
［実施例７］ 抗ｅｒｂＢ３抗体によるエピレグリン、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦおよびヘレグリン依存的ｅｒｂＢ３のリン酸化阻害
ヒト乳がん細胞株Ｔ４７Ｄ １×１０５個を、血清入りＲＰＭＩで懸濁し、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ｍＬ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、６．５％ ＣＯ２の培養条件で一晩培養した。培養上清を除き、ＲＰＭＩで１回洗浄後、ＲＰＭＩを１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、一晩培養した。培養上清を除き、ＲＰＭＩで１回洗浄後、ＲＰＭＩで５０μｇ／ｍＬに調製した各抗ヒトｅｒｂ３抗体を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、６．５％ ＣＯ２、３０分間、細胞を培養した。
次に、ＲＰＭＩで希釈した４０ｎｇ／ｍＬ ＮＲＧ１−β１／ＨＲＧ１−β１Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ（Ｒ＆Ｄ社製、３７７−ＨＢ／ＣＦ）、１００ｎｇ／ｍＬ エピレグリン（Ｒ＆Ｄ社製、１１９５−ＥＰ／ＣＦ）、２００ｎｇ／ｍＬ ＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、２５９−ＨＥ／ＣＦ）および２００ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−α（Ｒ＆Ｄ社製、２３９−Ａ）を、それぞれ２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、６．５％ ＣＯ２条件下、１０分間培養した。
培養後、氷上において上清を除き、ＲＰＭＩで１回洗浄後、タカラ３９０００ Ｌａｎｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、細胞を回収した。次に、ＤＮＡを破砕し、９５℃、５分間加熱してウエスタンブロッティングのサンプルとした。以降は、実施例５と同様にして全ｅｒｂＢ３タンパク質量とリン酸化ｅｒｂＢ３タンパク質量を解析した。
その結果、図３に示すとおり、本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１１２６抗体は、ネガティブコントロール抗体と比べて、ヒト乳癌細胞Ｔ４７Ｄのエピレグリン、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦおよびＨＲＧ１β依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害した。また、本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１１２６抗体は、ポジティブコントロール抗体と比べて、ヒト乳癌細胞Ｔ４７ＤのＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦ依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化に対する阻害効果が高かった。
また、本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１２５１１は、ポジティブコントロール抗体（Ｕ１−５９）と比べて、ヒト乳癌細胞Ｔ４７ＤにおけるＨＲＧ１βおよびＨＢ−ＥＧＦ依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を完全に抑制した。
さらに、本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体９２０１０４は、ポジティブコントロール抗体（Ｕ１−５９）と比べて、ヒト乳癌細胞Ｔ４７ＤにおけるＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦ依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化に対する阻害効果が高かった。
また、本発明の抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１１５３は、ネガティブコントロール抗体と比べて、ヒト乳癌細胞Ｔ４７ＤにおけるＴＧＦ−α依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害した。
［実施例８］ 抗ｅｒｂＢ３抗体のｉｎ ｖｉｖｏ薬効評価
ＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ−ｎｕ／ｎｕ ｆｅｍａｌｅ（日本クレア社）６ｗｅｅｋｓを入荷し、１週間の予備飼育を行なった。１０％ ＲＰＭＩ培地を用いて、３７℃、６．５％ ＣＯ２条件下で培養したヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄを、ＲＰＭＩを用いて１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
調製した細胞懸濁液を、マウス７２個体に、１００μＬ／ｈｅａｄで皮下移植した。Ｔ４７Ｄのマウスへの生着を確認し、腫瘍体積（長径×短径×短径／２）が５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３になった時点で、腫瘍体積の平均値が同等になるようにマウスを選択し、６個体／１群、計６群に分けた。
ＰＢＳで希釈した１ｍｇ／ｍＬ 抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１１５３、１２５１１、９２０１０４、１１２６、１ｍｇ／ｍＬ 抗ヒトｅｒｂＢ３ヒト抗体Ｕ１−５９およびネガティブコントロールの抗ＤＮＰ抗体は、群分け時点より、２００μＬ／ｈｅａｄでマウス腹腔内投与を開始し、２回／ｗｅｅｋ、計８回行なった。
その結果、図４に示すように、コントロールの抗ＤＮＰ抗体に比べて、抗ヒトｅｒｂＢ３ヒト抗体Ｕ１−５９および抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体は何れもヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄの腫瘍増殖を阻害した。
［実施例９］ 複数の抗ｅｒｂＢ３抗体を用いたｉｎ ｖｉｖｏ薬効評価
実施例８と同様にしてヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄを皮下移植したｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスまたはヒト偏平上皮癌細胞株Ａ４３１を皮下移植したｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスを準備し、腫瘍塊が１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３になった時点で、腫瘍体積の平均値が同等になるように マウスを選択し、６個体／１群、計４群に分けた。
ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬ抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１１５３、１２５１１、１１２６および抗ＤＮＰ抗体溶液を調製した。１１５３抗体、１２５１１抗体および１１２６抗体溶液を、それぞれ１：１で混合し、１１５３＋１２５１１併用抗体溶液（１１５３抗体および１２５１１抗体の併用抗体溶液）、１１５３＋１１２６併用抗体溶液（１１５３抗体および１１２６抗体の併用抗体溶液）および１２５１１＋１１２６併用抗体溶液（１２５１１抗体および１１２６抗体の併用抗体溶液）を調製した。抗体は、群分け時点より１００μＬ／ｈｅａｄで腹腔内投与で投与を行い、２回／ｗｅｅｋ、計１０回行った。
その結果、図５に示すように、抗ヒトｅｒｂＢ３遺伝子組換え抗体１１５３および１１２６は、コントロールの抗ＤＮＰ抗体と比べて、ヒト乳癌細胞Ｔ４７Ｄの腫瘍増殖を阻害した。また、１１５３抗体および１１２６抗体の併用投与は、１１５３抗体または１１２６抗体単独投与に比べて、更に強力に腫瘍増殖を阻害した。
更に、図６に示すように、１１５３抗体および１２５１１抗体の併用、１２５１１抗体および１１２６抗体の併用、並びに１１５３抗体および１１２６抗体の併用のいずれの抗体併用も、コントロールの抗ＤＮＰ抗体と比べて、ヒト偏平上皮癌細胞Ａ４３１の細胞増殖を阻害した。また、１２５１１抗体および１１２６抗体の併用、並びに１１５３抗体および１１２６抗体の併用投与は、１１５３抗体および１２５１１抗体の併用投与と比べて更に強力に腫瘍増殖を阻害した。
以上の結果から、ｅｒｂＢ３の細胞外ドメインのドメイン４を認識する抗体１１２６と、ドメイン４以外のｅｒｂＢ３細胞外ドメインに結合する抗体１１５３または１２５１１との併用投与は抗腫瘍活性を増強させることが明らかになった。
本願は、平成１８年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 「新機能抗体創製技術開発プロジェクト」「新機能抗体創製技術開発／系統的な高特異性抗体創製技術の開発／オリゴクローナル抗体創製技術開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願である。
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１１年６月２０日付けで出願された米国仮出願（６１／４９８７３２号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号３：ヒトｅｒｂＢ３細胞外領域のアミノ酸配列
配列番号６：マウスｅｒｂＢ３細胞外領域のアミノ酸配列
配列番号７：ｒｈｅｒｂＢ３プライマー１の塩基配列
配列番号８：ｒｈｅｒｂＢ３プライマー２の塩基配列
配列番号９：ｒｈｅｒｂＢ３−ＧＳＴプライマー１の塩基配列
配列番号１０：ｒｈｅｒｂＢ３−ＧＳＴプライマー２の塩基配列
配列番号１１：マウスｅｒｂＢ３−ＧＳＴプライマー１の塩基配列
配列番号１２：マウスｅｒｂＢ３−ＧＳＴプライマー２の塩基配列
配列番号１３：ｈＤ１／ｍＤ２３４プライマー１の塩基配列
配列番号１４：ｈＤ１／ｍＤ２３４プライマー２の塩基配列
配列番号１５：ｈＤ１／ｍＤ２３４プライマー３の塩基配列
配列番号１６：ｈＤ１／ｍＤ２３４プライマー４の塩基配列
配列番号１７：ｈＤ１／ｍＤ２３４プライマー５の塩基配列
配列番号１８：ｈＤ１／ｍＤ２３４プライマー６の塩基配列
配列番号１９：ｈＤ１２／ｍＤ３４プライマー１の塩基配列
配列番号２０：ｈＤ１２／ｍＤ３４プライマー２の塩基配列
配列番号２１：ｈＤ１２／ｍＤ３４プライマー３の塩基配列
配列番号２２：ｈＤ１２／ｍＤ３４プライマー４の塩基配列
配列番号２３：ｈＤ１２／ｍＤ３４プライマー５の塩基配列
配列番号２４：ｈＤ１２／ｍＤ３４プライマー６の塩基配列
配列番号２５：ｈＤ１２３／ｍＤ４プライマー１の塩基配列
配列番号２６：ｈＤ１２３／ｍＤ４プライマー２の塩基配列
配列番号２７：ｈＤ１２３／ｍＤ４プライマー３の塩基配列
配列番号２８：ｈＤ１２３／ｍＤ４プライマー４の塩基配列
配列番号２９：ｈＤ１２３／ｍＤ４プライマー５の塩基配列
配列番号３０：ｈＤ１２３／ｍＤ４プライマー６の塩基配列
配列番号３１：ｍｋＲｖＰ１プライマーの塩基配列
配列番号３２：ｍｋＲｖＰ２プライマーの塩基配列
配列番号３３：ｍＨ−Ｒｖ１プライマーの塩基配列
配列番号３４：ｍＨ−Ｒｖ２プライマーの塩基配列
配列番号３５：ＳＥＱ４６１８プライマーの塩基配列
配列番号３６：ＳＥＱ１７８３プライマーの塩基配列
配列番号３７：１１５３Ｈｃ−ＳａｌＩＵプライマーの塩基配列
配列番号３８：１１５３Ｈｃ−ＮｈｅＩＬプライマーの塩基配列
配列番号３９：１１５３Ｌｃ−ＢｇｌＩＩプライマーの塩基配列
配列番号４０：１１５３Ｌｃ−ＢｓｉＷＩプライマーの塩基配列
配列番号４１：９２０１０４Ｈｃ−ＳａｌＩＵプライマーの塩基配列
配列番号４２：９２０１０４Ｈｃ−ＮｈｅＩＬプライマーの塩基配列
配列番号４３：９２０１０４Ｌｃ−ＢｇｌＩＩプライマーの塩基配列
配列番号４４：９２０１０４Ｌｃ−ＢｓｉＷＩプライマーの塩基配列
配列番号４５：１１２６ Ｈｃ−ＳａｌＩＵプライマーの塩基配列
配列番号４６：１１２６ Ｈｃ−ＮｈｅＩＬプライマーの塩基配列
配列番号４７：１１２６Ｌｃ−ＰｍｅＩＵプライマーの塩基配列
配列番号４８：１１２６Ｌｃ−ＢｓｉＷＩプライマーの塩基配列
配列番号４９：１２５１１Ｈｃ−ＳａｌＩＵプライマーの塩基配列
配列番号５０：１２５１１Ｈｃ−ＮｈｅＩＬプライマーの塩基配列
配列番号５１：１２５１１Ｌｃ−ＢｇｌＩＩプライマーの塩基配列
配列番号５２：１２５１１Ｌｃ−ＢｓｉＷＩプライマーの塩基配列

Claims (16)

  1. ｅｒｂＢ３の細胞外領域に特異的に結合し、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体および該抗体断片。
  2. ｅｒｂＢ３の細胞外領域に特異的に結合し、かつｅｒｂＢ３特異的リガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化およびｅｒｂＢ３特異的リガンド非依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化の両方を阻害する抗体。
  3. ｅｒｂＢ３のリン酸化が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン、ベータセルリン、エピレグリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）およびヘレグリンから選ばれる少なくとも２つのリガンド依存的なｅｒｂＢ３のリン酸化である請求項１または２に記載の抗体および該抗体断片。
  4. ｅｒｂＢ３の細胞外領域が、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２０番から１７９番のアミノ酸配列からなるドメイン１、１８０番から３２８番のアミノ酸配列からなるドメイン２、３２９番から４８７番のアミノ酸配列からなるドメイン３および４８８番から６４３番のアミノ酸配列からなるドメイン４から選ばれる少なくとも１つのドメインを含む細胞外領域である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。
  5. 抗体が下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。
    （ａ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
    （ｂ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
    （ｃ）１１５３抗体クローン、１２５１１抗体クローン、９２０１０４抗体クローンおよび１１２６抗体クローンから選ばれるいずれか１つの抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
  6. 抗体が、配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体、ならびに配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体から選ばれるいずれか１つの抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片をコードするＤＮＡ。
  8. 請求項７に記載のＤＮＡを含むベクターを細胞へ導入して得られる形質転換体を培地内で培養し、培養液中に請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片を生成蓄積させ、培養液から抗体および該抗体断片を精製することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片を製造する方法。
  9. ｅｒｂＢ３の細胞外領域が、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２０番から１７９番のアミノ酸配列からなるドメイン１、１８０番から３２８番のアミノ酸配列からなるドメイン２、３２９番から４８７番のアミノ酸配列からなるドメイン３および４８８番から６４３番のアミノ酸配列からなるドメイン４から選ばれる少なくとも１つのドメインに反応する第１抗体または該抗体断片と、第１抗体が反応するドメインと異なるドメインに反応する第２抗体または該抗体断片とを含む抗体組成物。
  10. 第１抗体または該抗体断片が、ｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン２またはドメイン４に反応する抗体または該抗体断片である請求項９に記載の抗体組成物。
  11. 第２抗体または該抗体断片が、ｅｒｂＢ３の細胞外領域のドメイン１またはドメイン３に反応する抗体または該抗体断片である請求項９または１０に記載の抗体組成物。
  12. 第１抗体または該抗体断片が、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体または該抗体断片である請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗体組成物。
    （ａ）１１２６抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
    （ｂ）１１２６抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
    （ｃ）１１２６抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
  13. 第２抗体または該抗体断片が、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる抗体または該抗体断片である請求項９〜１２のいずれか１項に記載の抗体組成物。
    （ａ）１１５３抗体クローンと競合反応する抗体および該抗体断片。
    （ｂ）１１５３抗体クローンが反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
    （ｃ）１１５３抗体クローンが反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
  14. 請求項９〜１３のいずれか１項に記載の抗体組成物を用いたｅｒｂＢ３発現細胞が関与する疾患の治療方法。
  15. ｅｒｂＢ３発現細胞が関与する疾患が癌である請求項１４に記載の治療方法。
  16. 請求項９〜１３のいずれか１項に記載の抗体組成物を含むｅｒｂＢ３発現細胞が関与する疾患の治療薬。
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