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JP7311425B2 - ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体 - Google Patents

ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体 Download PDF

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Description

本発明は、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインおよびＥｐｉｔｈｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断剤、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定試薬に関する。
抗体は、あらゆる哺乳動物の血清や組織体液中に存在する糖タンパク質であり、生体内において外来抗原を認識する。抗体は、補体系の活性化や、細胞表面に存在するレセプター（ＦｃＲ）への結合を介して、ＦｃＲ発現細胞の貪食能、抗体依存性細胞傷害能、メディエーターの遊離能、及び抗原提示能といったエフェクター機能を活性化し、生体防御に関与する。
１分子の抗体は、２本の相同な軽鎖（Ｌ鎖）と２本の相同な重鎖（Ｈ鎖）とから成り、２つの抗原結合部位を備える。抗体のクラス及びサブクラスはＨ鎖によって決定され、各クラス及びサブクラスは異なる固有の機能を有する。ヒトの抗体には、５つの異なるクラス、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する。ＩｇＧはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスに各々分類される（Charles A. J. et. al., Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.）。
多価抗体は、１分子内に複数の抗原結合部位を備えた抗体である。多価抗体の例としては、まず、ハイブリッドハイブリドーマを用いて、二種類の異なる抗体由来のＨ鎖およびＬ鎖を１つの細胞で発現させることにより、異なる二種類の抗原にそれぞれ一価で結合する二価抗体を作製したことが報告された。（非特許文献１）。しかしながら、本法では、抗体のＨ鎖とＬ鎖との組み合わせが１０通り程度生じる。そのため、所望のＨ鎖とＬ鎖との組み合わせを有する多価抗体の生成量は低く、またそのような多価抗体を選択的に単離精製することも難しいため、所望の抗体の収量は減少する。
この問題点を克服するため、複数の抗原結合部位を連結して単一のポリペプチド鎖として発現することにより、サブユニット間の組み合わせのバリエーションを減らし、所望の組み合わせを有する抗体を生産する試みが報告されている。
一例として、Ｈ鎖とＬ鎖の抗原結合部位を１つのポリペプチドで連結したｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む抗体（非特許文献２）が知られている。さらに、ＩｇＧ１のＨ鎖定常領域のＣＨ１ドメインもしくは該ドメインの部分断片及びＬ鎖定常領域、又はフレキシブルリンカー（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）を用いて、二つの抗原結合部位を連結させた抗体などが報告されている（非特許文献４、特許文献１、特許文献２）。
これらの従来の多価抗体は、凝集し易く、安定性や生産性が低いという欠点を有していた。しかし一方で、単一のＨ鎖ポリペプチド中に複数の抗原結合部位を有し、抗体重鎖可変領域がイムノグロブリンドメインまたはその断片のアミノ酸配列を有するリンカーを介して結合している多価抗体は、安定性が高く、生産性も良いことが見出されている（特許文献３）。
ＣＤ４０は、ヒトＢ細胞表面に発現する抗原として同定され（非特許文献４）、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーの１つとして知られる。ＴＮＦ受容体ファミリー分子は、細胞外ドメインのシステインリッチリピートの存在により定義される。ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーとしては、ＣＤ４０の他に、例えば低親和性ＮＧＦレセプター、ＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＯＸ４０およびＣＤ３０などが知られている。
ＴＮＦ受容体ファミリーを介したシグナルは、ホモ三量体のＴＮＦファミリー分子が３つのＴＮＦ受容体ファミリーに結合することにより誘導されるが、ＴＮＦ受容体ファミリー分子に特異的な抗体同士を架橋（クロスリンク）することによっても、細胞内にシグナルが伝達されることから、シグナル伝達にはＴＮＦ受容体ファミリー分子の会合が必要であると考えられている（非特許文献５、６）。
ＣＤ４０はタイプＩの膜型糖タンパク質であり、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球上皮細胞および線維芽細胞などの多様な細胞タイプや、腫瘍性のヒトＢ細胞などのある種の腫瘍細胞にも発現していることが知られている。ＣＤ４０欠損マウスでは、胸腺依存の免疫グロブリンのクラススイッチや胚中心の形成が損なわれることが確認されており、細胞性と液性免疫反応でのＣＤ４０の重要な役割が実証されている（非特許文献７）。
ＣＤ４０のシグナルは免疫グロブリンのクラススイッチやＣＴＬの誘導に関与することから、腫瘍免疫の活性化やがんワクチンのアジュバントとしての医薬品への応用も期待されている（非特許文献８）。
既存のＣＤ４０を標的とした抗体としては、Ｃｈｉ－Ｌｏｂ ７／４、ＨＣＤ－１２２、ＡＰＸ００５Ｍ、ＳＥＡ－ＣＤ４０およびＣＰ８７０，８９３（２１．４．１）等を挙げることができる（非特許文献９）。その中で、ＣＰ８７０，８９３は強力なＣＤ４０シグナル誘導能をもっており、固形腫瘍に対して全身性の免疫活性化を薬効メカニズムとする臨床試験が実施された。しかし、有効性を示すことができておらず、サイトカインシンドローム、血栓マーカーの上昇、肝臓パラメータの上昇など全身的な免疫活性化に由来する毒性の発現が報告されている（非特許文献１０）。
ＣＤ４０の生理学的リガンドはＣＤ４０ Ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ１５４、ｇｐ３９）である。活性化したＴリンパ球にはＣＤ４０ Ｌｉｇａｎｄが発現しておりＢリンパ球の表面上のＣＤ４０との結合を介してＢリンパ球の分化や増殖、胚中心のＢリンパ球の自発的アポトーシスからの回避など重要な調節機構を担っている（非特許文献１１）。
ＣＤ４０のシグナル誘導能をもつ分子として、ＣＤ４０ Ｌｉｇａｎｄに抗体のＦｃ領域を融合させた分子が報告されている。さらに、腫瘍での効率的なＣＤ４０シグナルの誘導を目指してＣＤ４０ Ｌｉｇａｎｄとがん抗原に対する一本鎖抗体ｓｃＦｖの融合抗体が作製され、ＣＤ４０ Ｌｉｇａｎｄよりも２０倍程度低用量でＣＤ４０シグナルを誘導すると報告されている（非特許文献１２）。
ＣＤ４０を認識するバイスペシフィック抗体として、ヘテロ二量化した重鎖を有するＩｇＧ型抗ヒトＧＰＣ３／抗マウスＣＤ４０バイスペシフィック抗体が知られている（特許文献４）。また、ｎｅｃｔｉｎ－４、ＰＳＭＡまたはＥＧＦＲなどのがん抗原およびＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０を活性化させるバイスペシフィックタンパク質が知られている（特許文献５）。さらに、ＣＤ４０およびがん細胞表面抗原に特異性を有するｄｉａｂｏｄｙなどのバイスペシフィック分子により、がん細胞近傍でＣＤ４０発現細胞を活性化させる方法が知られている（特許文献６）。
Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ （ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６、ＧＡ７３３－２、ＨＥＡ１２５、ＫＳ１／４、ＭＫ－１、ＭＨ９９、ＭＯＣ３１、３２３／Ａ３、１７－１Ａ、ＣＯ－１７Ａ、ＥＳＡ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ３４、ＥＧＰ４０、ＫＳＡ、ＫＳ１／４、ＴＲＯＰ－１、ＴＡＣＳＴ－１）は、細胞接着や細胞増殖、腫瘍の進行に関与する４０ｋＤａの膜貫通型膜糖タンパク質で、ホモタイプの細胞接着因子として機能する。
ＥｐＣＡＭは上皮由来の多くのがん細胞で高発現していることから、がん抗原として知られており、がん分子標的医薬品の標的分子や診断マーカー、がんワクチン標的として期待されている（非特許文献１３、１４）。
ＥｐＣＡＭを標的とする医薬の例としては、ＥｐＣＡＭタンパク質や抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原認識部位に結合する抗イディオタイプ抗体を用いたワクチン療法、Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ（ＭＴ２０１）、ＩＮＧ－１、３６２２Ｗ９４等の抗ＥｐＣＡＭ抗体が報告されている（非特許文献１５）。
さらに、抗ＥｐＣＡＭ抗体による細胞傷害活性を高める目的で、抗ＥｐＣＡＭ抗体と緑膿菌外毒素を融合させたＰｒｏｘｉｎｉｕｍｓ Ｖｉｖｅｎｄｉｕｍｓ （ＶＢ４－８４５）や、ＩＬ－２と融合させたＥＭＤ ２７３ ０６６（ｈｕＫＳ－ＩＬ２）が開発されている。抗ＣＤ３抗体を有することでＴ細胞とＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞を架橋して腫瘍細胞を傷害するバイスペシフィック抗体Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｒｅｍｏｖａｂ）は、欧州で承認されている（非特許文献１４、１６）。
米国特許出願公開第２００７／００７１６７５号明細書 国際公開第２００１／０７７３４２号 国際公開第２００９／１３１２３９号 国際公開第２０１５／１５６２６８号 国際公開第２０１７／２０５７３８号 国際公開第９９／６１０５７号
Suresh et. al., Methods Enzymol. 121, 210-228, 1986 Kranz et. al., J. Hematother. 5, 403-408, 1995 Wu et. al., Nat. Biothech. 25, 1290-1297, 2007 Clark et. al., PNAS USA 1986; 83:4494-4498 Chuntharapai A et. al., J. Immunol. 166(8), 4891, 2001 Ashkenazi A et. al., Nat Rev Cancer 2, 420, 2002 Kawabe et. al., Immunity 1994; 1:167-168 Diehl L et. al.、Nat Med. 1999 Jul;5(7):774-9. Beatty GL et. al., Expert Rev Anticancer Ther. 2017 Feb;17(2):175-186. Vonderheide RH et. al., Oncoimmunology. 2013 Jan 1;2(1):e23033. Bridges et. al., J Immumol 1987; 139:4242-4549 1541376565889_0 et. al., Mol Cancer. 2014 Apr 17;13:85 van der Gun BTet. al., Br J Cancer. 2011 Jul 12;105(2):312-9. Chaudry MA et. al., Br J Cancer. 2007 Apr 10;96(7):1013-9. Markus M et. al., Cancer Cell Int. 2010 Nov 2;10:44. Linke R et. al., MAbs. 2010, Vol.2(2), pp.129-136.
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに対するバイスペシフィック抗体とその抗腫瘍効果は知られていない。したがって、本発明は、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインおよびＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断剤、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定試薬を提供することを目的とする。
上記課題を解決するための手段として、本発明はＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインおよびＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片などを提供する。
すなわち本発明は、以下の（１）～（３５）に関する。
（１）ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインおよびＥｐｉｔｈｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体。
（２）ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ二価で結合する（１）記載のバイスペシフィック抗体。
（３）ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインがＣＤ４０に特異的に結合する抗体（抗ＣＤ４０抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインがＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体（抗ＥｐＣＡＭ抗体）のＶＨおよびＶＬを含む（１）または（２）記載のバイスペシフィック抗体。
（４）Ｎ末端から順にＶＨ１－Ｘ－ＶＨ２－Ｙの式
｛式中、
ＶＨ１は第一の抗体のＶＨを表し、
ＶＨ２は第二の抗体のＶＨを表し、
ＸおよびＹはそれぞれ抗体のＣＨ１を含むポリペプチド（ここでＸおよびＹの少なくとも一方はさらに抗体のヒンジ領域を含む）を表す｝
で表されるポリペプチドを含む同一の２本の重鎖、
および同一のＶＬを含む４本の軽鎖を有し、
該第一の抗体および該第二の抗体のいずれか一方が抗ＣＤ４０抗体であり、もう一方が抗ＥｐＣＡＭ抗体である（１）～（３）のいずれか１記載のバイスペシフィック抗体。
（５）軽鎖がκ鎖である（４）記載のバイスペシフィック抗体。
（６）前記式におけるＸがヒトＩｇＧのＣＨ１からなるポリペプチドであり、ＹがヒトＩｇＧのＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３からなるポリペプチドである（４）または（５）記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
（７）前記式におけるＸが配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、Ｙが配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである（４）または（５）記載のバイスペシフィック抗体。
（８）前記式におけるＸがヒトＩｇＧのＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含むポリペプチドであり、ＹがヒトＩｇＧのＣＨ１を含むポリペプチドである（４）または（５）記載のバイスペシフィック抗体。
（９）前記式におけるＸが配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、Ｙが配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである（４）または（５）記載のバイスペシフィック抗体。
（１０）ＶＬが、それぞれ配列番号２３～２５で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を含むＶＬである（３）～（９）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１１）ＶＬが、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬである（３）～（１０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１２）ＣＤ４０アゴニスト活性を有する、（１）～（１１）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１３）ＥｐＣＡＭを発現する細胞の非存在下ではＣＤ４０アゴニスト活性を示さず、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の存在下でのみＣＤ４０アゴニスト活性を示す、（１）～（１２）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１４）抗ＣＤ４０抗体がアゴニスト活性を有していない抗ＣＤ４０抗体である（３）～（１３）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１５）第一の抗体が抗ＣＤ４０抗体であり、第二の抗体が抗ＥｐＣＡＭ抗体である（４）～（１４）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１６）第一の抗体が抗ＥｐＣＡＭ抗体であり、第二の抗体が抗ＣＤ４０抗体である（４）～（１４）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１７）抗ＣＤ４０抗体が、以下の（１ａ）～（１ｄ）からなる群から選ばれるいずれか１つの重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗ＣＤ４０抗体である、（３）～（１６）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１ａ）それぞれ配列番号２８～３０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
（１ｂ）それぞれ配列番号３３～３５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
（１ｃ）それぞれ配列番号３８～４０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、および
（１ｄ）それぞれ配列番号４３～４５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ。
（１８）抗ＣＤ４０抗体が、配列番号２７、３２、３７および４２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ４０抗体である（３）～（１７）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（１９）抗ＥｐＣＡＭ抗体が、以下の（２ａ）～（２ｄ）からなる群から選ばれるいずれか１つのＶＨを含む抗ＥｐＣＡＭ抗体である、（３）～（１８）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（２ａ）それぞれ配列番号５２～５４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
（２ｂ）それぞれ配列番号５７～５９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
（２ｃ）それぞれ配列番号６２～６４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、および
（２ｄ）それぞれ配列番号６７～６９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ。
（２０）抗ＥｐＣＡＭ抗体が、配列番号５１、５６、６１および６６のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＥｐＣＡＭ抗体である（３）～（１９）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体。
（２１）（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体のバイスペシフィック抗体断片。
（２２）Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片またはＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片である（２１）に記載のバイスペシフィック抗体断片
（２３）（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）または（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ。
（２４）（２３）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（２５）（２４）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（２６）（２５）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）もしくは（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片を生産蓄積させ、該培養物から該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を採取することを特徴とする（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）もしくは（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片の製造方法。
（２７）（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）もしくは（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断剤。
（２８）ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患ががんである（２７）に記載の剤。
（２９）（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）もしくは（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片を用いる、ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくともいずれか一方が関係する疾患の治療および／または診断方法。
（３０）ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患ががんである（２９）に記載の方法。
（３１）ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断に使用するための、（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）もしくは（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片。
（３２）ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患ががんである（３１）に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）もしくは（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片。
（３３）ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断剤の製造のための、（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）もしくは（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片の使用。
（３４）ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患ががんである（３３）に記載の使用。
（３５）（１）～（２０）のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または（２１）もしくは（２２）に記載のバイスペシフィック抗体断片を含む、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４０の少なくとも一方を検出または測定するための試薬。
本発明により、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインおよびＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断剤、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定試薬を提供することができる。
図１は、本発明のバイスぺシフィック抗体の構造の一例を示す。図１（Ａ）はＮ末端型バイスペシフィック抗体を表す。図１（Ｂ）はＣ末端型バイスペシフィック抗体を表す。 図２（Ａ）はＲａｍｏｓ細胞、図２（Ｂ）はＣｏｌｏ２０５細胞、図２（Ｃ）はＨＥＫ２９３細胞、図２（Ｄ）はヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞について、それぞれの細胞におけるＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現をフローサイトメーターで評価した結果を示す。縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を表す。破線は抗ＣＤ４０抗体２１．４．１の結合性、点線は抗ＥｐＣＡＭ抗体３６２２Ｗ９４の結合性、白抜きで示された線はコントロール抗体の抗ＤＮＰ抗体の結合性を表す。 図３（Ａ）および図３（Ｂ）は、抗ＣＤ４０抗体モノクローナル抗体のＣＤ４０シグナル誘導活性を、Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５発現誘導を指標として評価した結果を示す。縦軸は、蛍光強度を示し、それぞれの抗体を１０、１または０．１μｇ／ｍＬ添加したときの、抗ＣＤ９５抗体のＲａｍｏｓ細胞に対する結合性を表す。比較対象にはネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体を、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１を用いた。 図４はＨＥＫ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体によるＣＤ４０シグナル誘導活性を示す。縦軸は蛍光強度を示し、それぞれの抗体を１０、１または０．１μｇ／ｍＬ添加したときの、抗ＣＤ９５抗体のＲａｍｏｓ細胞に対する結合性を表す。比較対象にはネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１、抗ＥｐＣＡＭ抗体として３６２２Ｗ９４を用いた。 図５はヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体によるＣＤ４０シグナル誘導活性を示す。縦軸は蛍光強度を示し、それぞれの抗体を１０、１または０．１μｇ／ｍＬ添加したときの、抗ＣＤ９５抗体のＲａｍｏｓ細胞に対する結合性を表す。比較対象にはネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１、抗ＥｐＣＡＭ抗体として３６２２Ｗ９４を用いた。 図６はＣｏｌｏ２０５細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体によるＣＤ４０シグナル誘導活性を示す。縦軸は蛍光強度を示し、それぞれの抗体を１０、１または０．１μｇ／ｍＬ添加したときの、抗ＣＤ９５抗体のＲａｍｏｓ細胞に対する結合性を表す。比較対象にはネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１、抗ＥｐＣＡＭ抗体として３６２２Ｗ９４を用いた。 図７（Ａ）はＥｐＣＡＭ陽性細胞存在下での、ＣＤ４０陽性細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の作用の模式図である。ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体はＥｐＣＡＭ陽性細胞とＣＤ４０陽性細胞の両方に結合すると、ＣＤ４０陽性細胞にＣＤ４０シグナルを誘導する。その結果、ＣＤ４０陽性細胞上にＣＤ９５の発現が誘導される。図７（Ｂ）はＥｐＣＡＭ陽性細胞非存在下での、ＣＤ４０陽性細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の作用の模式図である。ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体はＣＤ４０陽性細胞にのみ結合したときにはＣＤ４０シグナルを誘導しない。 図８（Ａ）はＡｌｅｘａ６４７により蛍光標識したＨＥＲ２抗体によりＲａｍｏｓ細胞およびＣｏｌｏ２０５細胞を蛍光免疫染色した結果、図８（Ｂ）はＡｌｅｘａ４８８により蛍光標識したＣｔＲ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３によりＲａｍｏｓ細胞およびＣｏｌｏ２０５細胞を蛍光免疫染色した結果、図８（Ｃ）はこれらの重ね合わせを示す。矢印は強い蛍光が観察された箇所を示す。 図９（Ａ）～（Ｃ）はマウスを用いた毒性試験の結果を表す。図９（Ａ）の縦軸はマウスの体重（ｇ）を表す。図９（Ｂ）の縦軸はマウスの末梢血中のＡＳＴ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）を表す。図９（Ｃ）の縦軸はマウスの末梢血中のＡＬＴ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）を表す。それぞれの図中で灰色の棒グラフは投与前、黒色の棒グラフは投与２４時間後における測定値を示す。Ｒ１０９０（Ｎ）、Ｒ１０９０（Ｃ）およびＥｐｃ１１２（Ｃ）は、それぞれ、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３およびＣｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６を意味する。ネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１を用いた。２１．４．１は１ｍｇ／ｋｇ、その他の抗体は１０ｍｇ／ｋｇを投与した。 図１０（Ａ）～（Ｄ）はマウスを用いた毒性試験の結果を示す。図１０（Ａ）は抗体投与２４時間後のマウスの白血球数を表す。図１０（Ｂ）は抗体投与２４時間後のマウスのリンパ球数を表す。図１０（Ｃ）は抗体投与２４時間後のマウスの単球数を表す。図１０（Ｄ）は抗体投与２４時間後のマウスの血小板数を表す。それぞれの図中においてグラフの縦軸はそれぞれの細胞の個数（１×１０３個）を表す。Ｒ１０９０（Ｎ）、Ｒ１０９０（Ｃ）およびＥｐｃ１１２（Ｃ）は、それぞれ、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３およびＣｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６を意味する。ネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１を用いた。２１．４．１は１ｍｇ／ｋｇ、その他の抗体は１０ｍｇ／ｋｇを投与した。 図１１（Ａ）はｍＥｐＣＡＭ／Ｂ１６Ｆ１０を移植したマウスにおける、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の抗腫瘍効果を評価した結果を示す。図１１（Ｂ）はＢ１６Ｆ１０を移植したマウスにおける、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の抗腫瘍効果を評価した結果を示す。それぞれの図において縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）、横軸は投与日を０日とする日数を示す。ネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１を用いた。２１．４．１は１ｍｇ／ｋｇ、その他の抗体は１０ｍｇ／ｋｇを投与した。 図１２（Ａ）はヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体の構造を表す。図１２（Ｂ）はＦａｂ型バイスペシフィック抗体断片の構造を表す。図１２（Ｃ）はＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体を表す。 図１３は、ヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体によるＣＤ４０シグナル誘導活性を示す。横軸は蛍光強度を示し、それぞれの抗体を１μｇ／ｍＬ添加したときの、抗ＣＤ９５抗体のＲａｍｏｓ細胞に対する結合性を表す。比較対象にはネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１を用いた。 図１４は、Ｅｘｐｉ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体によるＣＤ４０シグナル誘導活性を示す。横軸は蛍光強度を示し、それぞれの抗体を１μｇ／ｍＬ添加したときの、抗ＣＤ９５抗体のＲａｍｏｓ細胞に対する結合性を表す。比較対象にはネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１を用いた。 図１５（Ａ）は、ヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体断片によるＣＤ４０シグナル誘導活性を示す。図１５（Ｂ）は、Ｅｘｐｉ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞に対する、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体断片によるＣＤ４０シグナル誘導活性を示す。それぞれの図において、横軸は抗体濃度を示す。また縦軸は蛍光強度を示し、それぞれの抗体を添加したときの、抗ＣＤ９５抗体のＲａｍｏｓ細胞に対する結合性を表す。比較対象にはネガティブコントロール抗体として抗ＤＮＰ抗体、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体として２１．４．１を用いた。
本発明は、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインおよびＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片（以下、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片と記載する）に関する。
本発明におけるＣＤ４０は、ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５（ＴＮＦＲＳＦ５）、Ｂｐ５０、ＣＤＷ４０、ＭＧＣ９０１３およびｐ５０と同義として使用される。ＣＤ４０としては例えば、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）においてＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ４０、およびＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿００５５６９２７４または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むサルＣＤ４０などが挙げられる。また、例えば、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿００５５６９２７４に示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＤ４０の機能を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１ またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿００５５６９２７４に示されるアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％および９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＣＤ４０の機能を有するポリペプチドも本発明のＣＤ４０に包含される。
配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿００５５６９２７４に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons （1987-1997）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 （1982）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 （1982）、Gene, 34, 315 （1985）、Nucleic Acids Research, 13, 4431（1985）、Proceeding of the National Academy of Sciences in USA, 82, 488 （1985）］などを用いて、例えば、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿００５５６９２７４に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
ＣＤ４０をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２５０に示されるヒトＣＤ４０の塩基配列、および配列番号７またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＭ＿０１１７６６９２２に示されるサルＣＤ４０の塩基配列などが挙げられる。また、例えば配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２５０に示される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつＣＤ４０の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２５０に示される塩基配列と好ましくは６０％以上の相同性を有する塩基配列、より好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＣＤ４０の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、並びに配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２５０に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつＣＤ４０の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のＣＤ４０をコードする遺伝子に包含される。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２５０に示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃にてハイブリダイゼーション［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons （1987-1997）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University （1995）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２５０に示される塩基配列と好ましくは６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子内に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＣＤ４０をコードする遺伝子に包含される。
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Research,25, 3389 （1997）、Genome Research, 7, 649 （1997）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ ｂｌａｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html）。
ＣＤ４０のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿００５５６９２７４に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、例えば、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿００５５６９２７４に示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。さらに、ＣＤ４０のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、またはＣＤ４０のアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明におけるＣＤ４０の細胞外領域としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１に示されるヒトＣＤ４０のアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）、ＴＭＨＭＭ ｖｅｒ．２（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）またはＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ（http://Ca.expasy.org/）などを用いて予測された領域などが挙げられる。具体的には、配列番号６またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１の２１番目～１９４番目に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
ＣＤ４０の機能としては、ＣＤ４０リガンドやアゴニストが結合したときにＣＤ４０シグナルを誘導し、種々の作用を引き起こすことが挙げられる。例えばがん細胞にＣＤ４０シグナルが誘導されると、該がん細胞の細胞死や増殖阻害などを引き起こす。Ｂリンパ球にＣＤ４０シグナルが誘導されると、例えば該Ｂリンパ球の活性化、ＣＤ９５の発現促進、クラススイッチ組換えおよびｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎなどを惹起し、抗原高親和性抗体産生などを誘導する。樹状細胞にＣＤ４０シグナルが誘導されると、例えば該樹状細胞の成熟化やＩＬ－１２産生を引き起こす。マクロファージにＣＤ４０シグナルが誘導されると、例えばＭ２マクロファージの表面マーカーの減少とＭ１マクロファージの表面マーカーの発現の誘導やｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙサイトカイン産生を引き起こす。
本発明におけるＥｐＣＡＭは、ＣＤ３２６、ＧＡ７３３－２、ＨＥＡ１２５、ＫＳ１／４、ＭＫ－１、ＭＨ９９、ＭＯＣ３１、３２３／Ａ３、１７－１Ａ、ＣＯ－１７Ａ、ＥＳＡ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ３４、ＥＧＰ４０、ＫＳＡ、ＫＳ１／４、ＴＲＯＰ－１およびＴＡＣＳＴ－１と同義として用いられる。
ＥｐＣＡＭとしては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＨ１４７８５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むヒトＥｐＣＡＭ；Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３５１１８若しくは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むサルＥｐＣＡＭ；またはＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３２５５８ 若しくは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むマウスＥｐＣＡＭなどが挙げられる。また、例えば、配列番号１６、ＡＡＨ１４７８５、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３５１１８またはＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３２５５８に示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｐＣＡＭの機能を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号１６、ＡＡＨ１４７８５、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３５１１８またはＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３２５５８に示されるアミノ酸配列と好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％および９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥｐＣＡＭの機能を有するポリペプチドも本発明のＥｐＣＡＭに包含される。
配列番号１６、ＡＡＨ１４７８５、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３５１１８またはＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３２５５８に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前述の部位特異的変異導入法などを用いて、例えば配列番号１６、ＡＡＨ１４７８５、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３５１１８またはＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３２５５８に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
本発明におけるＥｐＣＡＭをコードする遺伝子としては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２３５４若しくは配列番号１５に示される塩基配列を含むヒトＥｐＣＡＭの遺伝子；Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＭ＿０１５４３３６８５若しくは配列番号１７に示される塩基配列を含むサルＥｐＣＡＭの遺伝子；またはＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８５３２若しくは配列番号１９に示される塩基配列を含むマウスＥｐＣＡＭの遺伝子が挙げられる。
また、例えば、配列番号１５、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２３５４、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＭ＿０１５４３３６８５またはＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８５３２に示される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつＥｐＣＡＭの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号１５、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２３５４、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＭ＿０１５４３３６８５またはＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８５３２に示される塩基配列に示される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＥｐＣＡＭの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、及び配列番号１５、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２３５４、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＭ＿０１５４３３６８５またはＧｅｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８５３２に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつＥｐＣＡＭの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のＥｐＣＡＭをコードする遺伝子に含まれる。
本発明におけるＥｐＣＡＭの細胞外領域としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＨ１４７８５に示されるヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）、ＴＭＨＭＭ ｖｅｒ．２（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）またはＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ（http://Ca.expasy.org/）などを用いて予測された領域などが挙げられる。具体的には、配列番号１０またはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＨ１４７８５の２２番目～２６５番目に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
ＥｐＣＡＭの機能としては、例えばカルシウム非依存的な細胞と細胞の接着および、がん細胞におけるＣ－ＭｙｃやＣｙｃｌｉｎ Ａ／Ｅなどのアップレギュレーションを介した増殖促進などが挙げられる。
抗体とは、イムノグロブリンを構成する重鎖の可変領域および重鎖の定常領域、並びに軽鎖の可変領域および軽鎖の定常領域の全部または一部をコードする遺伝子（「抗体遺伝子」と称する）に由来するタンパク質である。本発明の抗体は、いずれのイムノグロブリンクラスおよびサブクラスを有する抗体または抗体断片をも包含する。
重鎖（Ｈ鎖）とは、イムノグロブリン分子を構成する２種類のポリペプチドのうち、分子量が大きい方のポリペプチドを指す。重鎖は抗体のクラスとサブクラスを決定する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭは、それぞれα鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖およびμ鎖を重鎖として有し、重鎖の定常領域は異なるアミノ酸配列で特徴付けられる。軽鎖（Ｌ鎖）とは、イムノグロブリン分子を構成する２種類のポリペプチドのうち、分子量が小さい方のポリペプチドを指す。ヒトの抗体の場合、軽鎖にはκ鎖とλ鎖の２種類が存在する。
可変領域（Ｖ領域）とは、通常は、イムノグロブリンのＮ末端側のアミノ酸配列内に存在する多様性に富んだ領域を指す。可変領域以外の部分は多様性の少ない構造をとることから、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。重鎖と軽鎖の各可変領域は会合して抗原結合部位を形成し、抗原への抗体の結合特性を決定する。
ヒトの抗体の重鎖では、可変領域はＫａｂａｔらのＥＵインデックス（Kabat et. al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition）における１番目から１１７番目までのアミノ酸配列に該当し、定常領域は１１８番目以降のアミノ酸配列に該当する。ヒトの抗体の軽鎖ではＫａｂａｔらによる番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）における１番目から１０７番目までのアミノ酸配列が可変領域に該当し、１０８番目以降のアミノ酸配列が定常領域に該当する。以下、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を、ＶＨまたはＶＬと略記する。
抗原結合部位は、抗体において抗原を認識し結合する部位であり、抗原決定基（エピトープ）と相補的な立体構造を形成する部位を指す。抗原結合部位は、抗原決定基との間に強い分子間相互作用を生じる。抗原結合部位は、少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨおよびＶＬにより構成される。ヒトの抗体の場合、ＶＨおよびＶＬはそれぞれ３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲを、それぞれＮ末端側から順番にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称する。
定常領域のうち、重鎖定常領域または軽鎖定常領域は、それぞれＣＨまたはＣＬと表記される。ＣＨは、重鎖のサブクラスであるα鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖およびμ鎖によって分類される。ＣＨは、Ｎ末端側より順に整列したＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインから構成され、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを併せてＦｃ領域という。一方、ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖とよばれる２つのサブクラスに分類される。
本発明において、抗ＣＤ４０抗体とは、ＣＤ４０の細胞外領域を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体をいう。また、本発明において、抗ＥｐＣＡＭ抗体とは、ＥｐＣＡＭの細胞外領域を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体をいう。また、本発明において抗体とは、ポリクローナル抗体およびオリゴクローナル抗体をも包含する。
本発明において、抗体または該抗体断片がＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方に結合することは、例えば、公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法等を用いて、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を発現した細胞と抗体との結合性を確認する方法により確認することができる。また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies - Principles and Practice, Third Edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを組み合わせて用いることもできる。
モノクローナル抗体は、単一性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を保持した抗体産生細胞が分泌する抗体であり、単一のエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識する。モノクローナル抗体分子同士は同一のアミノ酸配列（１次構造）を有し、単一の構造をとる。ポリクローナル抗体とは、異なるクローンの抗体産生細胞が分泌する抗体分子の集団をいう。オリゴクローナル抗体とは、複数の異なるモノクローナル抗体を混合した抗体分子の集団をいう。
エピトープは、抗体が認識し、結合する抗原の構造部位をいう。エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
本発明におけるモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
ハイブリドーマは、例えば、抗原を調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体産生細胞を取得し、さらに、該抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させることによって、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、または該ハイブリドーマを動物に投与して該ハイブリドーマを腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより、所望のモノクローナル抗体を取得することができる。抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなどが好適に用いられる。また、このような被免疫動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを作製することもできる。
本発明における遺伝子組換え抗体としては、例えば、組換えマウス抗体、組換えラット抗体、組換えハムスター抗体、組換えラビット抗体、ヒト型キメラ抗体（キメラ抗体ともいう）、ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体ともいう）およびヒト抗体などの、遺伝子組換え技術により製造される抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体においては、対象とする動物種や目的に応じて、どの動物種由来の重鎖および軽鎖の可変領域並びに定常領域を適用するかを決定することができる。例えば、対象とする動物種がヒトの場合には、可変領域をヒトまたはマウスなどの非ヒト動物由来とし、定常領域およびリンカーをヒト由来とすることができる。
キメラ抗体とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体を指す。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物由来のハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してキメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることによって、製造することができる。
ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体を指す。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることによって、製造することができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球にＥＢウイルスなどを感染させて不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養し、該培養上清より該抗体を精製することにより取得することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として、所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組み込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、個体を発生させることにより、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物由来のヒト抗体は、通常の非ヒト動物で行われているハイブリドーマ作製法を用いてハイブリドーマを取得し、培養することで、培養上清中に抗体を産生、蓄積させることにより調製できる。
遺伝子組換え抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ｈＩｇＧ）クラスのものが好ましい。さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３およびｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、遺伝子組換え抗体のＣＬとしては、ヒトイムノグロブリンに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
本発明において、バイスぺシフィック抗体とは、特異性が異なる２種類の抗原結合ドメインを有し、イムノグロブリンを構成する重鎖の可変領域および重鎖の定常領域、並びに軽鎖の可変領域および軽鎖の定常領域の全部または一部を含むタンパク質をいう。バイスぺシフィック抗体のそれぞれの抗原結合ドメインは、単一の抗原の異なるエピトープに結合してもよいし、異なる抗原に結合してもよい。
本発明において、ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインは、ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭを特異的に認識し、結合するものであればいかなるものでもよい。例えば、抗体、リガンド、受容体、および天然に存在する相互作用分子など遺伝子組換え技術によって作製可能なポリペプチド、タンパク質分子およびその断片、並びに該タンパク質分子の低分子または天然物とのコンジュゲート体などいずれの形態であってもよい。
また、抗原結合ドメインとしては、抗体、リガンドおよび受容体など既知の結合分子の結合ドメインを利用して組換えた結合タンパク質でもよく、具体的には各抗原に結合する抗体のＣＤＲを含む組換えタンパク質、ＣＤＲを含む抗体可変領域、抗体可変領領域および各抗原に結合するリガンドの結合ドメインを含む組換えタンパク質などが挙げられる。なかでも、本発明においては、抗原結合ドメインは抗体の可変領域であることが好ましい。
本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、同一細胞上に発現しているＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに結合してもよいし、異なる細胞上に発現しているＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに結合してもよい。
ＣＤ４０を発現する細胞は例えば、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージおよび単球などの抗原提示細胞や、Ｒａｍｏｓ細胞などのがん細胞などが挙げられる。
ＥｐＣＡＭを発現する細胞は例えば、頭頸部癌、肺癌、消化器癌、乳癌、泌尿器癌などのがん細胞が挙げられる。
本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、例えばＣＤ４０アゴニスト活性を有するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、ＥｐＣＡＭ分子またはＥｐＣＡＭを発現する細胞の非存在下ではＣＤ４０アゴニスト活性を示さず、ＥｐＣＡＭ分子またはＥｐＣＡＭを発現する細胞の存在下でのみＣＤ４０アゴニスト活性を示すバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が好ましい。このようなバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、ＥｐＣＡＭを発現する細胞が存在する、がんなどの病変部でのみＣＤ４０を活性化するため、全身的なＣＤ４０の活性化に伴う副作用を生じない点で好ましい。
本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が有するＣＤ４０アゴニスト活性は、細胞上のＣＤ４０にバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が結合することにより、該ＣＤ４０を介したシグナルを惹起し、抗原提示細胞の活性化を誘導する活性、腫瘍細胞の細胞死を誘導する活性などをいう。
ＣＤ４０アゴニスト活性は、例えばＲａｍｏｓ細胞などのＣＤ４０を発現する細胞上のＣＤ９５発現量増加を評価することにより確認することができる。
すなわち、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片として、具体的には、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の存在下で、ＥｐＣＡＭとＣＤ４０に結合したときに、ＣＤ４０を発現する抗原提示細胞の活性化および／または腫瘍細胞の細胞死を誘導するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片などが挙げられる。
本発明において、ＣＤ４０アンタゴニスト活性は、ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０アゴニストによるＣＤ４０の活性化を阻害する活性などをいう。例えばＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０アゴニストのＣＤ４０への結合によるシグナル誘導を阻害する活性などをいう。
抗体のＣＤ４０アンタゴニスト活性は、例えばＣＤ４０リガンドによる、Ｒａｍｏｓ細胞などのＣＤ４０を発現する細胞へのＣＤ９５発現誘導が、抗体の添加により阻害されることにより確認することができる。
一分子のバイスペシフィック抗体が有する、ある抗原に対する結合ドメインの数を、結合の価数と呼ぶ。例えば、本発明において、一分子のバイスペシフィック抗体が、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインおよびＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインを二つずつ有する場合、かかるバイスペシフィック抗体は、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに、それぞれ二価で結合する。
本発明において、一分子あたりのバイスペシフィック抗体が、ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに何価で結合してもよいが、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに、少なくともそれぞれ二価で結合することが好ましい。
また、イムノグロブリンドメインまたはその断片を含むリンカーなど、適切なリンカーを介して結合させた複数の抗原結合ドメインを含む抗体も本発明のバイスぺシフィック抗体に含まれる。
本発明のバイスペシフィック抗体において、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインとＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインの位置は適宜選択することができる。
本発明のバイスぺシフィック抗体は、既存の作製技術（［Nature Protocols, 9, 2450-2463 (2014)］、国際公開第１９９８／０５０４３１号、国際公開第２００１／７７３４号、国際公開第２００２／００２７７３号および国際公開第２００９／１３１２３９号）などにより作製することができる。
本発明のバイスペシフィック抗体において、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインよりもＮ末端側に位置していてもよいし、Ｃ末端側に位置していてもよい。
本発明のバイスペシフィック抗体としては、抗原結合ドメインとして抗体のＶ領域を用いることができ、例えば、一つの重鎖に複数のＶＨを含む重鎖を含む抗体、および一つのＶＨを含む重鎖を二つ含む抗体などが挙げられる。以下では一つの重鎖に複数のＶＨを含む重鎖を含む抗体のＮ末端から１番目のＶＨをＶＨ１、２番目のＶＨをＶＨ２、ｎ番目のＶＨをＶＨｎのように表すこともある。一つの重鎖に２つのＶＨを含む重鎖を含む抗体の場合、Ｎ末端側から１番目に位置するＶＨはＶＨ１、２番目に位置するＶＨはＶＨ２と表される。
一つの重鎖に複数のＶＨを含む重鎖を含むバイスぺシフィック抗体として、より具体的には、イムノグロブリンドメインまたはその断片を含むリンカーを用いて結合させた２つ以上のＶＨを含む重鎖を含む抗体が挙げられる。
３つ以上のＶＨを結合させる場合には、リンカーとして、異なるイムノグロブリンドメインまたはその断片を用いてもよいし、同じイムノグロブリンドメインまたはその断片を用いてもよい。また、２つ以上のＶＨを連結させる場合には、各ＶＨが特異的に抗原に結合できるようにイムノグロブリンドメインまたはその断片の長さや種類を変えることができる。
本発明のバイスぺシフィック抗体は、具体的には、下記（ａ）～（ｅ）に示される少なくとも１の特徴を有する。
（ａ）１つの重鎖ポリペプチドに複数（例えば２～５個）の異なるＶＨを含み、ＶＨは互いに近接していないこと、
（ｂ）ＶＨが１０アミノ酸以上のポリペプチドリンカーを介してタンデム（縦列）に連結されていること、より具体的には、ＶＨが、例えばイムノグロブリンドメインの全部または一部のアミノ酸配列を含むリンカーを用いて連結されていること、
（ｃ）軽鎖と重鎖とが会合し、抗原結合部位を形成していること、
（ｄ）図１（Ａ）または図１（Ｂ）に示されるように２本の重鎖ポリペプチドと少なくとも４本の軽鎖ポリペプチドとからなる構造を有し、かつ２本の重鎖ポリペプチド間はヒンジ領域でジスルフィド結合により連結され、軽鎖ポリペプチドと重鎖ポリペプチドとの間もジスルフィド結合で連結されていること、および
（ｅ）重鎖の定常領域は、例えば天然型抗体重鎖の定常領域の全部または一部（例えば、ＣＨ１断片、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ１－ヒンジ、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２およびＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３など）からなること。
本発明において、バイスペシフィック抗体に含まれる、抗ＣＤ４０抗体のＶＨ（抗ＣＤ４０抗体由来のＶＨを意味する）と抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨ（抗ＥｐＣＡＭ抗体由来のＶＨを意味する）の位置は、適宜選択することができる。例えば、図１（Ａ）または図１（Ｂ）に示される構造のバイスペシフィック抗体については、抗ＣＤ４０抗体のＶＨは、抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨよりもＮ末端側に位置していてもよいし、Ｃ末端側に位置していてもよいが、Ｎ末端側に位置していることが好ましい。
本発明において、バイスぺシフィック抗体に含まれるＶＬは、同一のＶＬであっても、異なるＶＬであってもいずれでもよい。同一のＶＬを有するバイスペシフィック抗体であって、かつ二つの異なる抗原または同一抗原上の異なる二つのエピトープに結合することができるバイスぺシフィック抗体のＶＨは、各可変領域がそれぞれの特異的な抗原またはエピトープに結合できるように、最適化または改変されたＶＨであればよく、例えば、アミノ酸改変によるスクリーニング、またはファージディプレイなどの方法を用いて適切なＶＨを選択することができる。
本発明のバイスペシフィック抗体に含まれるＶＬは抗ＣＤ４０抗体または抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＬであればどのようなものでもよいが、それぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬおよび配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬが好ましい。
本発明において、リンカーとは、複数の抗原結合ドメインを結合させる化学構造を指し、好ましくはポリペプチドである。本発明のバイスぺシフィック抗体に用いられるリンカーとしては、例えば、イムノグロブリンドメインの全部または一部のアミノ酸配列を含むリンカー、および複数のイムノグロブリンドメインからなるポリペプチドの全部または一部のアミノ酸配列を含むリンカーなどが挙げられる。
本発明において、Ｃ末端側ポリペプチドとは複数の抗原結合ドメインのうち最もＣ末端側の抗原結合ドメインのＣ末端に結合するポリペプチド鎖を指す。本発明のバイスぺシフィック抗体はＣ末端側ポリペプチドを有していても有していなくてもよいが、Ｃ末端側ポリペプチドを有しているバイスペシフィック抗体が好ましい。Ｃ末端側ポリペプチドとして、例えば、イムノグロブリンドメインの全部または一部のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および複数のイムノグロブリンドメインからなるポリペプチドの全部または一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドなどが挙げられる。
イムノグロブリンドメインの一部のアミノ酸配列を含むリンカーまたはＣ末端側ポリペプチドとして、イムノグロブリンから選ばれるアミノ酸配列は、断続的でも連続的でもよいが、連続するアミノ酸配列が好ましい。また、該アミノ酸配列は、ヒンジ領域を含んでいてもよい。
本発明において、イムノグロブリンドメインとは、イムノグロブリンに類似したアミノ酸配列を持ち、少なくとも２個のシステイン残基が存在する約１００個のアミノ酸残基からなるペプチドを最小単位とする。本発明において、イムノグロブリンドメインは、上記の最小単位のイムノグロブリンドメインを複数含むポリペプチドをも包含する。イムノグロブリンドメインとしては、例えば、イムノグロブリン重鎖のＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、並びにイムノグロブリン軽鎖のＶＬおよびＣＬなどが挙げられる。
イムノグロブリンの動物種は特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。また、イムノグロブリン重鎖の定常領域のサブクラスは、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＥのいずれでもよく、好ましくは、ＩｇＧ由来およびＩｇＭ由来が挙げられる。また、イムノグロブリン軽鎖の定常領域のサブクラスは、κおよびλのいずれでもよい。
また、イムノグロブリンドメインはイムノグロブリン以外のタンパク質にも存在し、例えば主要組織適合抗原（ＭＨＣ）、ＣＤ１、Ｂ７およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などのイムノグロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質が含むイムノグロブリンドメインが挙げられる。本発明のバイスぺシフィック抗体に用いるイムノグロブリンドメインとしては、いずれのイムノグロブリンドメインも適用することができる。
ヒトの抗体の場合、ＣＨ１は、ＥＵインデックスで示される１１８番目から２１５番目のアミノ酸配列を有する領域を指す。同様に、ＣＨ２はＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される２３１番目から３４０番目のアミノ酸配列を有する領域を、ＣＨ３はＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される３４１番目から４４６番目のアミノ酸配列を有する領域を各々指す。ＣＨ１とＣＨ２の間には、ヒンジ（蝶番）領域（以下ヒンジと記載することもある）と呼ばれる柔軟性に富んだアミノ酸領域が存在する。ヒンジ領域は、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される２１６番目から２３０番目のアミノ酸配列を有する領域を指す。
ＣＬは、ヒトの抗体のκ鎖の場合には、Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで示される１０８番目から２１４番目のアミノ酸配列を有する領域を、λ鎖の場合には、１０８番目から２１５番目のアミノ酸配列を有する領域を各々指す。
本発明のバイスぺシフィック抗体に用いられるリンカーおよびＣ末端側ポリペプチドとしては、Ｎ末端からＣ末端への方向に順に整列したＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３からなるイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２からなるイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１－ヒンジからなるイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１からなるイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１のＮ末端側の断片、１４番目のアミノ酸残基がＣｙｓである１４アミノ酸残基からなるＣＨ１断片およびＣＨ１のＮ末端から１～１４番目のアミノ酸残基からなるＣＨ１断片、並びにこれらイムノグロブリンドメイン断片のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が改変されたものを挙げることができるが、これらに限定されない。
また、本発明において、リンカーおよびＣ末端側ポリペプチドの一例として、抗体のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるアミノ酸配列の、全部または一部の断片を適宜組み合わせて用いることができる。また、それらのアミノ酸配列を部分的に欠損、または順番を入れ替えて使用することもできる。また、リンカーおよびＣ末端側ポリペプチドに使用する抗体のサブクラスは特に限定されないが、ＩｇＭまたはＩｇＧ４もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２８番目のＳｅｒ残基をＰｒｏに、２３５番目のＬｅｕ残基をＡｓｎに、および４０９番目のＡｒｇ残基をＬｙｓにそれぞれ置換したＩｇＧ４変異体（以下、ＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋと記載する）であることが好ましく、ＩｇＧ４およびＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋがより好ましい。
本発明において、リンカーおよびＣ末端側ポリペプチドの例としては、配列番号７５で表わされるＩｇＧ４のＣＨ１の、Ｎ末端の１～１４番目の１４アミノ酸残基からなるポリペプチド、配列番号７５で表わされるＩｇＧ４のＣＨ１からなるポリペプチドならびに配列番号７７で表されるＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＣＨ（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）からなるポリペプチドなどが挙げられ、配列番号７５で表わされるＩｇＧ４のＣＨ１からなるポリペプチドおよび配列番号７７で表されるＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＣＨからなるポリペプチドがより好ましい。
本発明のバイスペシフィック抗体に含まれるリンカーとＣ末端側ペプチドの組み合わせとしてはどのようなものでもよい。本発明のバイスペシフィック抗体として配列番号７５で表わされるアミノ酸配列を含むＩｇＧ４のＣＨ１からなるリンカーを含みかつ配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＣＨ（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）からなるＣ末端側ペプチドを含むバイスペシフィック抗体、および配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＣＨからなるリンカーを含みかつ配列番号７５で表わされるアミノ酸配列を含むＩｇＧ４のＣＨ１からなるＣ末端側ペプチドを含むバイスペシフィック抗体が好ましい。
本発明のバイスペシフィック抗体のうち、図１（Ａ）に示すように、Ｎ末端側から順に、ＶＨ１、ＣＨ１、ＶＨ２、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３のアミノ酸配列を含む２本の重鎖ならびに４本の軽鎖からなる抗体をＮ末端型バイスペシフィック抗体と称する。また、図１（Ｂ）に示すように、Ｎ末端側から順にＶＨ１、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ２およびＣＨ１のアミノ酸配列を含む２本の重鎖ならびに４本の軽鎖からなる抗体をＣ末端型バイスペシフィック抗体と称する。
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述のバイスペシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片と同様な活性を有するバイスペシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片も、本発明のバイスぺシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片に包含される。
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、Molecular Cloning, The Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Willy & Sons（1987-1997）、Nucleic Acids Research, 10, 6487（1982）、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409（1982）、Gene, 34, 315 （1985）、Nucleic Acids Research, 13, 4431（1985）、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488（1985）などに記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換、挿入若しくは付加できる程度の数である。例えば、通常１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個である。
上記の本発明のバイスペシフィック抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、次のことを示す。同一配列中の任意、かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンおよびＬ－システインなどが挙げられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、翻訳後修飾されたいかなるアミノ酸残基を含む抗体をも包含する。翻訳後修飾としては、例えば、Ｈ鎖のＣ末端におけるリジン残基の欠失［リジン・クリッピング（ｌｙｓｉｎｅ ｃｌｉｐｐｉｎｇ）］およびポリペプチドのＮ末端におけるグルタミン残基のピログルタミン（ｐｙｒｏＧｌｕ）への置換などが挙げられる［Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736(2013)］。
本発明のバイスぺシフィック抗体として具体的には、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる、いずれか一つのバイスペシフィック抗体などが挙げられる。
（１）抗ＣＤ４０抗体のＶ領域（抗ＣＤ４０抗体由来のＶ領域を意味する）および抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶ領域（抗ＥｐＣＡＭ抗体由来のＶ領域を意味する）を含むバイスペシフィック抗体、
（２）抗ＣＤ４０抗体のＶＨのＣＤＲ１～３およびＶＬのＣＤＲ１～３、並びに抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨのＣＤＲ１～３およびＶＬのＣＤＲ１～３を含むバイスペシフィック抗体、並びに
（３）抗ＣＤ４０抗体のＶＨおよびＶＬ、並びに抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨおよびＶＬを含むバイスペシフィック抗体。
上記（２）に記載のバイスペシフィック抗体は、抗ＣＤ４０抗体のＶＬのＣＤＲ１～３と抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＬのＣＤＲ１～３とがそれぞれ同一であってもよいし、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
また、上記（３）に記載のバイスペシフィック抗体は、抗ＣＤ４０抗体のＶＬと抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＬとが同一であってもよいし、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
本発明の抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０アゴニスト活性を有していても有していなくてもよいが、ＣＤ４０アゴニスト活性を有していない抗ＣＤ４０抗体が好ましい。また、本発明のＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０アンタゴニスト活性を有していても有していなくてもよいが、ＣＤ４０アンタゴニスト活性を有していない抗ＣＤ４０抗体が好ましい。
本発明の抗ＣＤ４０抗体の一例として、それぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに以下の（１ａ）～（１ｄ）から選ばれるいずれか１つのＶＨを含む抗ＣＤ４０抗体が挙げられる。
（１ａ）それぞれ配列番号２８、２９および３０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、
（１ｂ）それぞれ配列番号３３、３４および３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、
（１ｃ）それぞれ配列番号３８、３９および４０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、および
（１ｄ）それぞれ配列番号４３、４４および４５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ。
本発明の抗ＣＤ４０抗体は、上記（１ａ）～（１ｄ）のいずれか１つに示されるＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２３～２５で示されるＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相同である、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ４０抗体をも包含する。
本発明の抗ＣＤ４０抗体は、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載される抗体をも包含する。
（ｉ）それぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに上記（１ａ）～（１ｄ）のいずれか１つに示されるＶＨを含む抗ＣＤ４０抗体と、競合してＣＤ４０に結合する抗体。
（ｉｉ）それぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに上記（１ａ）～（１ｄ）のいずれか１つに示されるＶＨを含む抗ＣＤ４０抗体と同じエピトープに結合する抗体。
本発明の抗ＣＤ４０抗体の他の一例として、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬおよび配列番号２７、３２、３７または４２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ４０抗体が挙げられる。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の一例として、それぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに以下の（２ａ）～（２ｄ）から選ばれるいずれか１つのＶＨを含む抗ＥｐＣＡＭ抗体が挙げられる。
（２ａ）それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、
（２ｂ）それぞれ配列番号５７、５８および５９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、
（２ｃ）それぞれ配列番号６２、６３および６４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、
（２ｄ）それぞれ配列番号６７、６８および６９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、上記（２ａ）～（２ｄ）のいずれか１つに示されるＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２３～２５で示されるＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相同である、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含む抗ＥｐＣＡＭ抗体をも包含する。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載される抗体をも包含する。
（ｉ）それぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに上記（２ａ）～（２ｄ）のいずれか１つに示されるＶＨを含む抗ＥｐＣＡＭ抗体と、競合してＥｐＣＡＭに結合する抗体。
（ｉｉ）それぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに上記（２ａ）～（２ｄ）のいずれか１つに示されるＶＨを含む抗ＥｐＣＡＭ抗体と同じエピトープに結合する抗体。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の他の例として、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬおよび配列番号５１、５６、６１または６６で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含むバイスペシフィック抗体が挙げられる。
本発明のバイスペシフィック抗体としてより具体的には、それぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに以下の（ｉ）または（ｉｉ）で表されるＶＨ１およびＶＨ２を含むバイスペシフィック抗体が挙げられる。
（ｉ）配列番号２８、２９および３０；配列番号３３、３４および３５；配列番号３８、３９および４０；または配列番号４３、４４および４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、ＣＤ４０に結合するＶＨ１、
ならびに配列番号５２、５３および５４；配列番号５７、５８および５９；配列番号６２、６３および６４；または配列番号６７、６８および６９でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、ＥｐＣＡＭに結合するＶＨ２。
（ｉｉ）配列番号５２、５３および５４；配列番号５７、５８および５９；配列番号６２、６３および６４；または配列番号６７、６８および６９でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、ＥｐＣＡＭに結合するＶＨ１、
ならびに配列番号２８、２９および３０；配列番号３３、３４および３５；配列番号３８、３９および４０；または配列番号４３、４４および４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、ＣＤ４０に結合するＶＨ２。
本発明のバイスペシフィック抗体の別の具体的な例として、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬおよび以下の（ｉ）または（ｉｉ）で表されるＶＨ１およびＶＨ２を含むバイスペシフィック抗体が挙げられる。
（ｉ）配列番号２７、３２、３７または４２で示されるアミノ酸配列を含む、ＣＤ４０に結合するＶＨ１、
および配列番号５１、５６、６１または６６で示されるアミノ酸配列を含む、ＥｐＣＡＭに結合するＶＨ２。
（ｉｉ）配列番号５１、５６、６１または６６で示されるアミノ酸配列を含む、ＥｐＣＡＭに結合するＶＨ１、
および配列番号２７、３２、３７または４２で示されるアミノ酸配列を含む、ＣＤ４０に結合するＶＨ２。
本発明の一態様として、Ｎ末端から順にＶＨ１－Ｘ－ＶＨ２－Ｙの式｛式中、ＶＨ１は第一の抗体のＶＨ（第一の抗体由来のＶＨを意味する）を表し、ＶＨ２は第二の抗体のＶＨ（第２の抗体由来のＶＨを意味する）を表し、ＸおよびＹはそれぞれポリペプチド（ここでＸおよびＹの少なくとも一方はさらに抗体のヒンジ領域を含む）を表す；以下式（Ｉ）と記載する｝で表されるポリペプチドからなる重鎖を含み、該第一の抗体および第二の抗体のいずれか一方は抗ＣＤ４０抗体であり、もう一方は抗ＥｐＣＡＭ抗体であるバイスペシフィック抗体が挙げられる。
前記式（Ｉ）におけるＸおよびＹとして、例えば、それぞれ抗体のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジのいずれか１を含むポリペプチド（ここでＸおよびＹの少なくとも一方はさらに抗体のヒンジ領域を含む）が挙げられる。
本発明の一態様として、前記式（Ｉ）におけるＸおよびＹのいずれか一方がＣＨ１であり、もう一方がＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジを含むポリペプチドが挙げられる。具体的には、例えば、ＸはヒトＩｇＧ４またはヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含むポリペプチドであり、かつＹはヒトＩｇＧ４またはヒトＩｇＧ１のＣＨ１を含むポリペプチド；ＸはヒトＩｇＧ４の定常領域において２２８番目がＰｒｏ、２３５番目がＧｌｕおよび４０９番目がＬｙｓである定常領域を含むポリペプチドであり、かつＹはヒトＩｇＧ４またはヒトＩｇＧ１のＣＨ１を含むポリペプチド；ＸはヒトＩｇＧ４またはヒトＩｇＧ１のＣＨ１を含むポリペプチドであり、かつＹはヒトＩｇＧ４またはヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含むポリペプチド；ＸはヒトＩｇＧ４またはヒトＩｇＧ１のＣＨ１を含むポリペプチドであり、かつＹはヒトＩｇＧ４の定常領域において２２８番目がＰｒｏ、２３５番目がＧｌｕおよび４０９番目がＬｙｓである定常領域を含むポリペプチド；Ｘは配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、Ｙは配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；Ｘは配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、Ｙは配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
本発明の一態様として、式（Ｉ）で表されるポリペプチドからなる２本の同一の重鎖を含むバイスペシフィック抗体がより好ましく、式（Ｉ）で表されるポリペプチドからなる２本の同一の重鎖および同一の４本の軽鎖または２種類の軽鎖を２本ずつ含むバイスペシフィック抗体がさらに好ましく、式（Ｉ）で表されるポリペプチドからなる２本の同一の重鎖および同一の４本の軽鎖を含むバイスペシフィック抗体が一層好ましい。
前記の好ましい態様において同一の２本の重鎖はヒンジ領域のシステイン残基を介してジスルフィド結合し、重合体を形成することが好ましい。また、１本の重鎖はＣＨ１のシステイン残基を介し、軽鎖の定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合し、重合体を形成することが好ましい。したがって、本発明のバイスペシフィック抗体は２本の重鎖と４本の軽鎖が重合した、ヘテロヘキサマー構造を有することが好ましい。
本発明の好ましい一態様として、式（Ｉ）｛Ｎ末端から順にＶＨ１－Ｘ－ＶＨ２－Ｙの式｛式中、ＶＨ１は第一の抗体のＶＨを表し、ＶＨ２は第二の抗体のＶＨを表し、Ｘは配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを表し、Ｙは配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを表す｝で表されるポリペプチドからなる２本の重鎖ならびにそれぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬを含む４本の軽鎖を含むバイスペシフィック抗体であって、該ＶＨ１およびＶＨ２が下記の（ｉ）または（ｉｉ）に示されるＶＨであるバイスペシフィック抗体が挙げられる。
（ｉ）ＶＨ１が、配列番号２８、２９および３０；配列番号３３、３４および３５；配列番号３８、３９および４０；または配列番号４３、４４および４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであり、
ＶＨ２が、配列番号５２、５３および５４；配列番号５７、５８および５９；配列番号６２、６３および６４；または配列番号６７、６８および６９でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである。
（ｉｉ）ＶＨ１が、配列番号５２、５３および５４；配列番号５７、５８および５９；配列番号６２、６３および６４；または配列番号６７、６８および６９でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨであり、
ＶＨ２が、配列番号２８、２９および３０；配列番号３３、３４および３５；配列番号３８、３９および４０；または配列番号４３、４４および４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨである。
ここで、軽鎖はλ鎖であってもκ鎖であってもよいが、κ鎖であることが好ましい。
またここで、ＶＨ１がそれぞれ配列番号３３、３４および３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであり、ＶＨ２がそれぞれ配列番号５７、５８および５９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである、バイスペシフィック抗体の一例として、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３が挙げられる。
本発明のさらに好ましい一態様として、式（Ｉ）｛Ｎ末端から順にＶＨ１－Ｘ－ＶＨ２－Ｙの式｛式中、ＶＨ１は第一の抗体のＶＨを表し、ＶＨ２は第二の抗体のＶＨを表し、Ｘは配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを表し、Ｙは配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを表す｝で表されるポリペプチドからなる２本の重鎖および配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む４本の軽鎖を含むバイスペシフィック抗体であって、該ＶＨ１およびＶＨ２が下記の（ｉ）または（ｉｉ）に示されるＶＨであるバイスペシフィック抗体が挙げられる。
（ｉ）ＶＨ１が配列番号２７、３２、３７または４２で表されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであり、
ＶＨ２が配列番号５１、５６、６１または６６で表されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである。
（ｉｉ）ＶＨ１が配列番号５１、５６、６１または６６で表されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨであり、
ＶＨ２が配列番号２７、３２、３７または４２で表されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨである。
ここで、軽鎖はλ鎖であってもκ鎖であってもよいが、κ鎖であることが好ましい。
またここで、ＶＨ１が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであり、ＶＨ２が配列番号５６で示されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである、バイスペシフィック抗体の一例として、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３が挙げられる。
本発明の好ましい一態様として、式（Ｉ）｛Ｎ末端から順にＶＨ１－Ｘ－ＶＨ２－Ｙの式｛式中、ＶＨ１は第一の抗体のＶＨを表し、ＶＨ２は第二の抗体のＶＨを表し、Ｘは配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを表し、Ｙは配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを表す｝で表されるポリペプチドからなる２本の重鎖ならびにそれぞれ配列番号２３、２４および２５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬを含む４本の軽鎖を含むバイスペシフィック抗体であって、該ＶＨ１およびＶＨ２が下記の（ｉ）または（ｉｉ）に示されるＶＨであるバイスペシフィック抗体が挙げられる。
（ｉ）ＶＨ１が、配列番号２８、２９および３０；配列番号３３、３４および３５；配列番号３８、３９および４０；または配列番号４３、４４および４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであり、
ＶＨ２が、配列番号５２、５３および５４；配列番号５７、５８および５９；配列番号６２、６３および６４；または配列番号６７、６８および６９でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである。
（ｉｉ）ＶＨ１が、配列番号５２、５３および５４；配列番号５７、５８および５９；配列番号６２、６３および６４；または配列番号６７、６８および６９でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨであり、
ＶＨ２が、配列番号２８、２９および３０；配列番号３３、３４および３５；配列番号３８、３９および４０；または配列番号４３、４４および４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む、抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨである。
ここで、軽鎖はλ鎖であってもκ鎖であってもよいが、κ鎖であることが好ましい。
またここで、ＶＨ１がそれぞれ配列番号３３、３４および３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであり、ＶＨ２がそれぞれ配列番号５７、５８および５９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである、バイスペシフィック抗体の一例として、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３が挙げられる。
また、ＶＨ１がそれぞれ配列番号６７、６８および６９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨであり、ＶＨ２がそれぞれ配列番号２８、２９および３０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであるバイスペシフィック抗体の一例として、Ｃｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６が挙げられる。
本発明のさらに好ましい一態様として、式（Ｉ）｛Ｎ末端から順にＶＨ１－Ｘ－ＶＨ２－Ｙの式｛式中、ＶＨ１は第一の抗体のＶＨを表し、ＶＨ２は第二の抗体のＶＨを表し、Ｘは配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを表し、Ｙは配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを表す｝で表されるポリペプチドからなる２本の重鎖および配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む４本の軽鎖を含むバイスペシフィック抗体であって、該ＶＨ１およびＶＨ２が下記の（ｉ）または（ｉｉ）に示されるＶＨであるバイスペシフィック抗体が挙げられる。
（ｉ）ＶＨ１が配列番号２７、３２、３７または４２で表されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであり、
ＶＨ２が配列番号５１、５６、６１または６６で表されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである。
（ｉｉ）ＶＨ１が配列番号５１、５６、６１または６６で表されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨであり、
ＶＨ２が配列番号２７、３２、３７または４２で表されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨである。
ここで、軽鎖はλ鎖であってもκ鎖であってもよいが、κ鎖であることが好ましい。
またここで、ＶＨ１が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨであり、ＶＨ２が配列番号５６で示されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである、バイスペシフィック抗体の一例として、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３が挙げられる。
またＶＨ１が配列番号６６で示されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体のＶＨであり、ＶＨ２が配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＣＤ４０抗体のＶＨである、バイスペシフィック抗体の一例として、Ｃｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６が挙げられる。
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片には、エフェクター活性を有する抗体または該バイスペシフィック抗体断片も包含される。
エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の細胞傷害活性を指し、例えば、抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ＣＤＣ活性）、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性貪食活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＰ活性）およびオプソニン効果などが挙げられる。
本発明においてＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は、公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］を用いて測定することができる。
ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が、抗体のＦｃ領域を介して免疫細胞のＦｃ受容体と結合することで免疫細胞（ナチュラルキラー細胞など）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体であり、抗体の結合によりさまざまなエフェクター活性を誘発する。各ＦｃＲは抗体のサブクラスに対応し、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭはそれぞれＦｃγＲ、ＦｃεＲ、ＦｃαＲ、ＦｃμＲに特異的に結合する。さらにＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のサブタイプが存在し、それぞれのサブタイプにはＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢのアイソフォームが存在する。これらの異なるＦｃγＲは異なる細胞上に存在する［Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991)］。ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球に特異的に発現しており、ＦｃγＲＩＩＩＡは単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージおよび一部のＴ細胞に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡへの抗体の結合を介して、ＮＫ細胞依存的なＡＤＣＣ活性が誘発される。
ＣＤＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が血液中の補体関連タンパク質群からなる一連のカスケード（補体活性化経路）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。また、補体の活性化により生じるタンパク質断片により、免疫細胞の遊走および活性化が誘導される。ＣＤＣ活性のカスケードは、まずＣ１ｑがＦｃ領域に結合し、次に２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと結合することで、Ｃ１複合体を形成し開始される。
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の抗原発現細胞に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は、公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］により評価することができる。
本発明のバイスぺシフィック抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる定常領域）の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ－結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα－１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号および国際公開第００／６１７３９号）や、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基の改変により制御する方法（国際公開第００／４２０７２号）などが知られている。
バイスぺシフィック抗体に付加するフコースの量を制御することで、抗体のＡＤＣＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、抗体のＦｃに結合しているＮ－結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法として、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損した宿主細胞を用いてバイスぺシフィック抗体を発現することで、高いＡＤＣＣを有するバイスぺシフィック抗体を取得することができる。一方、バイスぺシフィック抗体のＦｃに結合しているＮ－結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法として、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、低いＡＤＣＣ活性を有するバイスぺシフィック抗体を取得することができる。
また、バイスぺシフィック抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、バイスぺシフィック抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書または米国特許第７，３１７，０９１号明細書などに記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
さらに、上述の方法を組み合わせることにより、エフェクター活性が制御されたバイスぺシフィック抗体を取得してもよい。
本発明のバイスぺシフィック抗体の安定性は、精製過程や一定条件下で保存されたサンプルにおいて形成される凝集体（オリゴマー）量を測定することによって評価することができる。すなわち、同一条件下で凝集体量が低減する場合を、抗体の安定性が向上したものと評価する。凝集体量は、ゲルろ過クロマトグラフィーを含む適当なクロマトグラフィーを用いて凝集した抗体と凝集していない抗体とを分離することによって測定することができる。
本発明のバイスぺシフィック抗体の生産性は、抗体産生細胞から培養液中に産生される抗体量を測定することによって評価することができる。より具体的には、培養液から産生細胞を除いた培養上清に含まれる抗体の量をＨＰＬＣ法やＥＬＩＳＡ法などの適当な方法で測定することによって評価することができる。
本発明において、抗体断片とは、抗原結合ドメインを含み、該抗原に対する結合活性を有するタンパク質である。本発明において抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖまたはＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬまたはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片であり、同じ抗原に対する二価の抗原結合活性、または異なる抗原に対し各々特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中の各１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のＳ－Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることで作製することができる。ＣＤＲを含むペプチドは、本発明のバイスペシフィック抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明のバイスペシフィック抗体断片は、本質的にバイスペシフィック抗体の構造の一部からなり、バイスペシフィック抗体の抗原結合部位特異性が異なる２種類の抗原結合ドメインを含み、該２種類の抗原のいずれに対しても結合活性を有するタンパク質である。
本発明のバイスペシフィック抗体断片としては、例えば図１２（Ｂ）に示されるＦａｂ型バイスペシフィック抗体断片、図１２（Ｃ）に示されるＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
抗体のエフェクター活性の増強または欠損、抗体の安定化、および血中半減期の制御を目的としたアミノ酸残基改変を含むＦｃ領域も、本発明のバイスペシフィック抗体に用いることができる。
本発明のバイスぺシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片としては、本発明のバイスペシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、タンパク質または抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明における抗体の誘導体は、本発明のバイスペシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、該バイスペシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片中の適当な置換基或いは側鎖、さらには該バイスペシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、タンパク質または抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることで製造することができる。
また、本発明における抗体の誘導体は、本発明のバイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡと、所望のタンパク質または抗体医薬をコードするＤＮＡとを連結させて、発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し発現させる、遺伝子工学的手法により製造することができる。
放射性同位元素としては、例えば、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕまたは２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、ハイドロコーチゾン若しくはプレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン若しくはインドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート若しくはペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド若しくはアザチオプリンなどの免疫抑制剤またはマレイン酸クロルフェニラミン若しくはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｏｔｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ブシラミン、ミゾリビン、シクロスポリン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート若しくはメイタンシノイドまたはその誘導体などが挙げられる。
低分子の薬剤と本発明のバイスペシフィック抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と該抗体のアミノ基間を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と該抗体のカルボキシル基とを結合させる方法などが挙げられる。
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を本発明のバイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的若しくは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、または（３）免疫原性の消失若しくは抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
例えば、ＰＥＧと本発明のバイスペシフィック抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。
免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（例えば、レンチナンまたはシゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
タンパク質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージまたは好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子または毒素タンパク質などが挙げられる。
サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などが挙げられる。
毒素タンパク質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシンまたはＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
タンパク質または抗体医薬との融合抗体は、本発明のバイスぺシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片をコードするｃＤＮＡにタンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬または診断薬として使用する場合に、本発明のバイスぺシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ（登録商標） Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（Ｒ－ＰＥ）などの蛍光物質などが挙げられる。
本発明には、ＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性などの細胞傷害活性を有するバイスぺシフィック抗体およびそのバイスペシフィック抗体断片が包含される。本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の抗原発現細胞に対するＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 （1993）］により評価することができる。
また、本発明は、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭを特異的に認識し結合するバイスぺシフィック抗体若しくはそのバイスペシフィック抗体断片を含む組成物、または該バイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現細胞が関与する疾患の治療薬に関する。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患としては、例えば、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係している疾患であればいかなるものでもよく、例えば、悪性腫瘍およびがんなどが挙げられる。
本発明において、悪性腫瘍およびがんとしては、例えば、大腸がん、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、グリオーマ、悪性黒色腫（メラノーマ）、甲状腺がん、腎細胞がん、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、頭頚部がん、皮膚がん、尿路がん、膀胱がん、前立腺がん、絨毛がん、咽頭がん、喉頭がん、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫およびウィルムス腫瘍などが挙げられる。
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内などの非経口投与が挙げられる。中でも、静脈内投与が好ましい。
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
さらに、本発明は、本発明のバイスぺシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片を含有する、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の免疫学的検出用若しくは測定用試薬、またはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現細胞が関与する疾患の診断薬に関する。また、本発明は、本発明のバイスペシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片を用いた、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の免疫学的検出用若しくは測定用方法、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現細胞が関与する疾患の治療方法、またはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現細胞が関与する疾患の診断方法に関する。
本発明においてＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などが挙げられる。
免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いてＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が発現した細胞を検出または測定することにより、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現細胞が関与する疾患を診断することができる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、例えば、免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などが挙げられる。また、例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども挙げられる。
本発明においてＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を検出または測定する対象となる生体試料としては、例えば、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液または培養液など、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
本発明のバイスぺシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的とする診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、例えば、緩衝剤、塩などが挙げられる。
検出用試薬としては、例えば、前記バイスぺシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体に結合する標識された二次抗体、または標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
以下、本発明のバイスぺシフィック抗体の作製方法、該バイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の活性評価方法、並びに該バイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた疾患の治療方法および診断方法について具体的に記載する。
１．モノクローナル抗体の作製方法
本発明におけるモノクローナル抗体の製造方法は、下記の作業工程を包含する。すなわち、（１）免疫原として使用する抗原の精製および細胞表面に抗原が過剰発現した細胞の作製の少なくとも一方、（２）抗原を動物に免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓などを摘出する時期を決定し、抗体産生細胞を調製する工程、（３）骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製、（４）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、（５）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（６）ハイブリドーマ群からの単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）細胞の分離（クローニング）、（７）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、（８）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性およびその抗原結合特異性の検討、または標識試薬としての特性の検定、などである。
以下、本発明におけるＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体を作製するために使用する、ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体およびＥｐＣＡＭに結合するモノクローナル抗体の作製方法を上記の工程に沿って詳述する。該抗体の作製方法はこれに制限されず、例えば脾臓細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。
（１）抗原の精製
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を発現させた細胞は、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞またはヒト組織などからＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を精製し、抗原として使用することができる。また、該腫瘍培養細胞または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
本発明で用いられるＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方は、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)やCurrent Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることで製造することができる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を生産する形質転換体を得ることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、かつＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をコードするＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものであれば、いずれも用いることができる。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であるとともに、プロモーター、リボソーム結合配列、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をコードする部分を含むＤＮＡ、並びに転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターは、プロモーターを制御する遺伝子を含んでもよい。
該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば、６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
また、該ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の生産率を向上させることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669（1984）］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277（1989）］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306（1985）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４，６８６，１９１号明細書、米国特許第４，９３９，０９４号明細書、米国特許第５，１６０，７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J. Bacteriol., 172, 2392 （1990）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（東洋紡社製）などが挙げられる。
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターまたはＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、またはｌｅｔ Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども挙げられる。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110（1972）、Gene, 17, 107（1982）、Molecular & General Genetics, 168, 111（1979）］が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Cytotechnology, 3, 133 （1990）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature, 329, 840 （1987）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 （1987）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３またはｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターまたはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、例えば、ヒトバーキットリンパ腫細胞Ｎａｍａｌｗａ、アフリカミドリザル腎臓由来細胞ＣＯＳ、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ、またはヒト白血病細胞ＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413（1987）］などが挙げられる。
以上のようにして得られるＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、または動物細胞などに由来する形質転換体を培地中で培養し、培養物中に該ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を製造することができる。該形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を得ることができる。
誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する際には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを、各々培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519（1967）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501 （1952）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地[Virology, 8, 396（1959）］、199培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中に、必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）］を用いることができる。ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法が挙げられ、使用する宿主細胞や、生産させるＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
例えば、細胞外領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするＤＮＡ、またはＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡまたはＨｉｓｔｉｄｉｎｅタグをコードするＤＮＡなどを連結したＤＮＡを作製して、発現し精製することで抗原融合タンパク質を作製することができる。具体的には、例えば、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の細胞外領域をヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合させたＦｃ融合タンパク質、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の細胞外領域とグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質が挙げられる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989）］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 （1989）、Genes Develop., 4, 1288（1990）］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の生産量を上昇させることもできる。
生産したＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離して得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、すなわち溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を、単独でまたは組み合わせて用いることで、精製タンパク質を得ることができる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の不溶体を回収する。回収した該ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製タンパク質を得ることができる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方、またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養上清を上記と同様に遠心分離などの手法を用いて処理することにより、可溶性画分を取得し、該可溶性画分から上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製タンパク質を得ることができる。
また、本発明において用いられるＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方は、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。具体的には、例えば、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製、または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することができる。
（２）抗体産生細胞の調製工程
３～２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節または末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、動物としては、例えば、富塚らの文献［Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 97、722,（2000）］に記載されているヒト由来抗体を産生するトランスジェニックマウス、免疫原性を高めるためにＣＤ４０またはＥｐＣＡＭのコンディショナルノックアウトマウスなどが被免疫動物として挙げられる。
免疫は、フロイントの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射などいずれでもよいが、腹腔内注射、足蹠注射または静脈内注射が好ましい。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とのコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し上記の血清が十分な抗体価を示した動物を、融合用抗体の産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。
抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は、形質細胞およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾臓細胞が最も一般的に用いられる。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断してほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去することにより、融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることが出来るが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1（1978）］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology, 6, 511 （1976）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature, 276, 269（1978）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548 （1979）］、またはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495（1975）］などが用いられる。該細胞株は、適当な培地、例えば８－アザグアニン培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ＦＣＳおよび８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地で継代培養する。細胞融合の３～４日前に上記の細胞株を正常培地（例えば、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合を行う当日に２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られるミエローマ細胞を、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、融合用抗体産生細胞：ミエローマ細胞＝５：１～１０：１になるように混合し、遠心分離した後、上清を除く。沈澱した細胞集塊をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混合液を、３７℃にて攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除き、沈澱した細胞集塊を緩やかにほぐした後、ＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた正常培地］中に緩やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７～１４日間培養する。
また、以下の方法でも細胞融合を行うことができる。脾臓細胞とミエローマ細胞とを無血清培地（例えばＤＭＥＭ）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「リン酸緩衝液」という）でよく洗浄し、脾臓細胞とミエローマ細胞の細胞数の比が５：１～１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞集塊をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００～４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液およびヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む正常培地（以下、ＨＡＴ培地という）中に懸濁して培養用プレート（以下、プレートという）の各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃にて２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
（５）ハイブリドーマ群の選択
融合に用いたミエローマ細胞が８－アザグアニン耐性株である場合、すなわちヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合は、融合しなかったミエローマ細胞およびミエローマ細胞同士の融合細胞は、ＨＡＴ培地中では生存することができない。一方、抗体産生細胞同士の融合細胞および抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは、ＨＡＴ培地中で生存することができるが、抗体産生細胞同士の融合細胞はやがて寿命に達する。したがって、ＨＡＴ培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを取得することができる。
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下、ＨＴ培地という）への培地交換を行う。その後、培養上清の一部を採取し、後述する抗体価測定法を用いて、抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。抗体価の測定方法としては、例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法および受身血球凝集反応法など種々の公知技術が挙げられるが、検出感度、迅速性、正確性および操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法が好ましい。
抗体価を測定することにより、所望の抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、例えば、プレートの１ウェルに１個の細胞が含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個の細胞を単離する方法、セルソーターによって１個の細胞を単離する方法などが挙げられる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２～４回繰り返し、安定して抗体価の認められたものを、ヒトＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
（６）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（５）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡカラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行い、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。また、同系統のマウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）若しくはＮｕ／Ｎｕマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに結合するモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
（５）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、ＧＩＴ培地、または５％ダイゴＧＦ２１を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ培地等に懸濁し、フラスコ培養、スピナー培養またはバック培養などにより３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩキット；アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を利用することもできる。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ］より算出する方法により行うことができる。
（７）ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体の結合アッセイ
ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体の結合活性は、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）または表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）などのバインディングアッセイ系により測定することができる。
オクテルロニー法は簡便ではあるが、抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定すると共に、抗体の結合活性を測定することが可能である。
手順の具体例としては、精製または部分精製した組換えＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりブロッキングを行う。ＥＬＩＳＡプレートをｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ）などで洗浄後、段階希釈した第１抗体（例えばマウス血清、培養上清など）を反応させ、プレートに固定化された抗原へ抗体を結合させる。次に、第２抗体としてビオチン、酵素（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰなど）、化学発光物質または放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して、プレートに結合した第１抗体に第２抗体を反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行い、標的抗原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
ＦＣＭ法では、抗体の抗原発現細胞に対する結合活性を測定することができる［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)］。抗体が細胞膜上に発現している膜タンパク質抗原に結合することは、当該抗体が天然に存在する抗原の立体構造を認識し、結合することを意味する。
ＳＰＲ法としては、Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析が挙げられる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を用い、抗原と被験物との間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。手順の具体例としては、抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を流して適当量を結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流して、結合および解離を測定する。次に、得られたデータについて、機器付属のソフトウエアを用いて１：１バインディングモデルによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。または、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流して、結合および解離を測定する。得られたデータについて、機器付属のソフトウエアを用いてバイバレントバインディングモデルによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
また、本発明において、ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに対する抗体と競合してＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系に被検抗体を共存させて反応させることにより、選択することができる。すなわち、被検抗体を加えた時に抗原との結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭへの結合について、前記で取得した抗体と競合する抗体を得ることができる。
（８）ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体のエピトープの同定
本発明において、抗体が認識し結合するエピトープの同定は以下のようにして行うことができる。
例えば、抗原の部分欠損体、種間で異なるアミノ酸残基を改変した変異体、または特定のドメインを改変した変異体を作製し、該欠損体または変異体に対する抗体の反応性が低下すれば、欠損部位またはアミノ酸改変部位が該抗体のエピトープであることが明らかになる。このような抗原の部分欠損体および変異体は、適当な宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、植物細胞または哺乳動物細胞などを用いて、分泌タンパク質として取得してもよいし、宿主細胞の細胞膜上に発現させて抗原発現細胞として調製してもよい。膜型抗原の場合は、抗原の立体構造を保持したまま発現させるために、宿主細胞の膜上に発現させることが好ましい。また、抗原の１次構造または立体構造を模倣した合成ペプチドを作製し、抗体の反応性を確認することもできる。合成ペプチドは、公知のペプチド合成技術を用いて、その分子の様々な部分ペプチドを作製する方法等が挙げられる。
例えば、ヒトおよびマウスのＣＤ４０またはＥｐＣＡＭの細胞外領域について、各領域を構成するドメインを適宜組み合わせたキメラタンパク質を作製し、該タンパク質に対する抗体の反応性を確認することで、抗体のエピトープを同定することができる。その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、または該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、該ペプチドに対する抗体の反応性を確認することでエピトープを特定することができる。多種類のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット［例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等］を利用することもできる。
ＣＤ４０またはＥｐＣＡＭに結合する抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で得た抗体のエピトープを同定し、該エピトープの部分的な合成ペプチド、該エピトープの立体構造を模した合成ペプチド、または該エピトープの組換え体等を作製し、免疫することで取得することができる。
例えば、エピトープが膜タンパク質であれば、全細胞外領域または一部の細胞外ドメインを、適当なタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅタグ、ＧＳＴタンパク質または抗体Ｆｃ領域などに連結した組換え融合タンパク質を作製し、該組換えタンパク質を免疫することで、より効率的に該エピトープ特異的な抗体を作製することができる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P. Shepherd and C. Dean. Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESSおよびJ. W. Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESSなどに概説されているが、以下にキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体の作製方法を示す。また、遺伝子組換えマウス、ラット、ハムスターおよびラビット抗体についても、同様の方法で作製することができる。
（１）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得は、例えば以下のようにして行うことができる。
まず、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。次に、合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用いて、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。単離した組換えファージまたは組換えプラスミド内のＶＨまたはＶＬの全塩基配列を決定し、当該塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ハイブリドーマの作製に用いる非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどを用いるが、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
ハイブリドーマからの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 （1987）］、またはＲＮＡ ｅａｓｙ ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）］、またはＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いて、ｍＲＮＡを調製することもできる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons（1987-1997）］またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）若しくはＺＡＰ－ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際に、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58（1992）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494（1989）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49（1985）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280（1983）］またはｐＵＣ１８［Gene, 33, 103（1985）］などを用いる。
ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［Strategies, 5, 81（1992）］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440（1954）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science, 222, 778（1983）］、ＮＭ５２２［J. Mol. Biol., 166, 1（1983）］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118（1966）］、またはＪＭ１０５［Gene, 38, 275（1985）］などを用いる。
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ若しくは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）］などを用いる。
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons（1987-1997）］を行うことにより、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463（1977）］などの反応を行った後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いて解析する。
決定した全塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが、分泌シグナル配列を含めて抗体のＶＨおよびＶＬ各々の完全なアミノ酸配列をコードしているか否かを確認する。
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬ各々の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定することができ、さらにそれらが属するサブグループを同定することができる。
また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列は、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することによって推定することができる。
また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列について、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴまたはＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースを用いてＢＬＡＳＴ法［J. Mol. Biol., 215, 403（1990）］などによる相同性検索を行うことで、当該ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものであるか否かを確認することができる。
（２）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬの少なくとも一方をコードするＤＮＡをクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができ、例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いることができる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組み込んで発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができ、例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol., 3, 133 （1990）］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307（1987）］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 （1984）］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 （1981）］、pSG1bd2-4［Cytotechnol., 4, 173 （1990）］、またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Cytotechnol., 13, 79 （1993）］、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）、Ｎ５ＫＧ２ベクター（国際公開第２００３／０３３５３８号に記載）、トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などを用いることができる。
動物細胞用発現ベクターのプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307 （1987）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987）］、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号明細書）または免疫グロブリンH鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 （1985）］とエンハンサー［Cell, 33, 717（1983）］などを用いることができる。
遺伝子組換え抗体の発現には、ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、細胞内における抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量の均衡性などの観点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の両遺伝子を搭載したベクター（タンデム型ベクター）［J. Immunol. Methods, 167, 271 （1994）］を用いるが、抗体Ｈ鎖とＬ鎖の各遺伝子を別々に搭載した複数のベクター（セパレート型ベクター）を組み合わせて用いることもできる。
タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559（1998）］、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）、Ｎ５ＫＧ２ベクター（国際公開第２００３／０３３５３８号に記載）、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などを用いる。
（３）キメラ抗体発現ベクターの構築
（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の各々の上流に、（１）で得られる非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを各々クローニングすることで、キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
まず、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。次に、作製したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の各々の上流に、それらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、キメラ抗体発現ベクターを構築する。
また、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることで、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの作製
ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして作製することができる。まず、（１）で得られる非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。
選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであればいずれのものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるために、元の非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（６０％以上）を有するヒトＦＲのアミノ酸配列を選択する。
次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、元の非ヒト抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を、抗体遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］を考慮してＤＮＡ配列に変換することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのｃＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
設計したｃＤＮＡ配列に基づき、１００～１５０塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応における反応効率および合成可能なＤＮＡ長の観点から、好ましくはＨ鎖およびＬ鎖に対し各々４～６本の合成ＤＮＡを設計する。また、可変領域全長の合成ＤＮＡを合成して用いることもできる。
さらに、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターに、容易にヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（１）に記載の方法と同様の方法により塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266（1991）］。そのため、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下したヒト化抗体の抗原結合活性を上昇させることができる。
抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol., 112, 535（1977）］またはコンピューターモデリング［Protein Engineering, 7, 1501（1994）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで、必要な抗原結合活性を有する改変ヒト化抗体を取得できる。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変することができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について、（１）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的とする改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築したヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、（４）および（５）で得られるヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする各遺伝子の上流に、それらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）ヒト抗体発現ベクターの構築
ヒト抗体を産生する動物を被免疫動物として用いて、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した場合には、（１）において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列を得ることができる。そこで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、（１）で得たヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることで、ヒト抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）、（６）および（７）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体を一過性に発現させ、得られた多種類の遺伝子組換え抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞［American Type Culture Collection（ATCC）番号：CRL1651］を用いる。ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press（1991）］、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413（1987）］などを用いる。
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性を、酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
（９）遺伝子組換え抗体の安定的発現株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）、（６）および（７）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定的に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入としては、例えば、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Cytotechnology, 3, 133（1990）］、カルシウムイオン方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションやリポフェクション法を用いて遺伝子を導入する方法、および核移植法などが挙げられる。
遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、チャイニーズハムスターＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．１１６１９）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216（1980）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３細胞［Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55（1986）］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質、Ｎ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質、または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定的に発現する形質転換株を、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０２培地（ジェイアールエイチ社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３２５培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）若しくはＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれらの培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。得られた形質転換株を培地中で培養することで、培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現、蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定することができる。また、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株の産生する遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過など、タンパク質の精製で用いられる方法を組み合わせて精製することもできる。
精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680（1970）］、またはウェスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］など用いて測定することができる。
３．バイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の作製
本発明のバイスぺシフィック抗体は、例えば、まず、異なるエピトープに結合する複数のモノクローナル抗体を上記１．に記載の方法を用いて取得し、次に、各抗体のＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡ配列を上記２．に記載の方法を用いて決定し、各抗体の抗原結合部位を連結したバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を設計することによって作製することができる。
具体的には、各抗体の抗原結合部位とリンカーとを適宜組み合わせたＤＮＡを合成し、上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに組み込み、当該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を発現させることで、作製することができる。より具体的には、リンカーを介して各抗体のＶＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを合成すると共に、各抗体のＶＬをコードするＤＮＡを合成し、これらのＤＮＡを上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに組み込み、当該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を発現させることで、作製することができる。また、２．（２）のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の代わりに、任意のポリペプチド鎖をコードする遺伝子を導入した動物細胞用発現ベクターを用いることにより、最もＣ末端に近い抗原結合部位のＣ末端側に任意のポリペプチド鎖（Ｃ末端側ポリペプチド）を有するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を作製することができる。任意のポリペプチド鎖をコードする遺伝子はリンカーを介して各抗体のＶＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡと結合した上で動物細胞用発現ベクターに組み込んでも良いし、リンカーを介して各抗体のＶＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡとは別々に動物細胞用発現ベクターに組み込んでもよい。
抗原結合部位は、上記１．に記載のハイブリドーマを用いた方法の他、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ法、Ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ法などの技術により単離し、取得することが出来る［Emmanuelle Laffy et. al., Human Antibodies 14, 33-55, （2005）］。
上記のリンカーおよびＣ末端側ポリペプチドとして例えばポリペプチド鎖が挙げられる。具体的には例えば複数の抗原結合ドメインを結合させたポリペプチドを指す。例えばＮ末端からＣ末端への方向に順に整列したＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３からなるイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２からなるイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１－ヒンジからなるイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１からなるイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１のＮ末端側の断片、１４番目のアミノ酸残基がＣｙｓである１４アミノ酸残基からなるＣＨ１断片およびＣＨ１のＮ末端から１～１４番目のアミノ酸残基からなるＣＨ１断片、並びにこれらイムノグロブリンドメイン断片のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が改変されたものを挙げることができる。
上記のリンカーおよびＣ末端側ポリペプチドとしてさらに具体的には、例えば、配列番号７５で表わされるＩｇＧ４のＣＨ１のＮ末端の１～１４番目の１４アミノ酸残基からなるポリペプチド、配列番号７５で表わされるＩｇＧ４のＣＨ１からなるポリペプチドならびに配列番号７７で表されるＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＣＨ（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）からなるポリペプチドなどが挙げられる。
また、複数のＶＨと単一のＶＬから成るバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を作製する場合には、バイスぺシフィック抗体に含まれる各抗原結合部位が各々の特異的抗原に反応するように、ファージディスプレイ法等を用いたスクリーニングを行い、単一のＶＬに最も適した各々のＶＨを選択する。
具体的には、まず、上記１．に記載の方法を用いて、第１の抗原で動物を免疫してその脾臓からハイブリドーマを作製し、第１の抗原結合部位をコードするＤＮＡ配列をクローニングする。次に、第２の抗原で動物を免疫して、その脾臓からｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーからＰＣＲによりＶＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを取得する。
続いて、第２の抗原の免疫で得られたＶＨと第１の抗原結合部位のＶＬとを連結したｓｃＦｖを発現するファージライブラリーを作製し、該ファージライブラリーを用いたパニングにより、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを選択する。選択したファージから、第２の抗原結合部位のＶＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をクローニングする。
さらに、第１の抗原結合部位のＶＨと第２の抗原結合部位のＶＨとを上述のリンカーを介して連結したポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計し、該ＤＮＡ配列と単一のＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とを、例えば上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに挿入することにより、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の発現ベクターを構築することができる。また２．（２）のＣＨをコードする遺伝子の代わりに、任意のポリペプチド鎖をコードする遺伝子を導入した動物細胞用発現ベクターを用いることにより、第二の抗原結合部位のＶＨのＣ末端側に任意のポリペプチド鎖（Ｃ末端側ポリペプチド）を有するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を作製することができる。。
４．本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の活性評価
精製したバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を発現した細胞株に対する本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の結合活性は、前述の１．（７）記載のバインディングアッセイ系を用いて測定することができる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を発現した細胞に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］により測定することができる。
本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の細胞死誘導活性は次の方法で測定することができる。例えば、細胞を９６穴プレートに播種し、抗体を添加して一定期間培養した後に、ＷＳＴ－８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を反応させ、プレートリーダーにより４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を測定する。
５．本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現細胞が関与する疾患の治療に用いることができる。ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患としては、例えば、悪性腫瘍およびがんなどが挙げられる。
悪性腫瘍およびがんとしては、例えば、大腸がん、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、グリオーマ、悪性黒色腫（メラノーマ）、甲状腺がん、腎細胞がん、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、頭頚部扁平上皮がん、皮膚がん、尿路がん、膀胱がん、前立腺がん、絨毛がん、咽頭がん、喉頭がん、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫およびウィルムス腫瘍などが挙げられる。
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
投与経路としては、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造することができる。
賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロース、滅菌水、エタノール、グリセロール、生理食塩水および緩衝液などが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウムおよび合成ケイ酸マグネシウムなどが挙げられる。
結合剤としては、例えば、メチルセルロースまたはその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールおよび硬化植物油などが挙げられる。
安定化剤としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニンなどのアミノ酸、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン４０、メチルセルロース、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
その他の添加剤としては、例えば、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダおよびリン酸ナトリウムなどが挙げられる。
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などが挙げられる。
乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造される。
カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造される。
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤または噴霧剤などが挙げられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造される。噴霧剤は、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造される。担体としては、例えば、乳糖またはグリセリンなどが挙げられる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明のバイスぺシフィック抗体の有効量と適切な希釈剤および薬理学的に使用し得るキャリアとの組合せとして投与される有効量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ～１００ｍｇであり、２日から８週間間隔で投与される。
６．本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた疾患の診断方法
本発明のバイスぺシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いて、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が発現した細胞を検出または測定することにより、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現細胞が関与する疾患を診断することができる。
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患である悪性腫瘍またはがんの診断は、例えば、以下のようにＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を検出または測定して行うことができる。
まず、複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明のバイスぺシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の検出または測定を行い、健常者の生体試料中のＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の存在量を調べる。
次に、被験者の生体試料中についても同様にＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。被験者のＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方の存在量が健常者と比較して増加している場合には、該被験者はがんであると診断される。その他のＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患の診断についても、同様の方法で診断できる。
免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
放射性物質標識免疫抗体法としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法が挙げられる。
酵素免疫測定法としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法が挙げられる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知の酵素標識［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、またはビオチン標識などを用いる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原に結合する抗体または抗体断片であって、抗原結合部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片をあらかじめプレート（例えば、９６穴プレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された細胞若しくはその破砕液、組織若しくはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、または眼液などを反応させた後、標識した抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）２などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープに結合するモノクローナル抗体または該抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体またはその抗体断片との組み合わせでもよい。
蛍光免疫測定法としては、例えば、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition,Academic Press（1996）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の蛍光標識［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。
発光免疫測定法としては、例えば、文献［生物発光と化学発光 臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、例えば、アクリジニウムエステルまたはロフィンなどを用いる。
ウェスタンブロット法としては、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ［Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原に結合する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識などを施した抗ＩｇＧ抗体またはその抗体断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
まず、所望のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。次に、泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。ここで本発明のバイスペシフィック抗体を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いて該抗体が結合したバンドを検出することにより、抗原を検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
物理化学的手法としては、例えば、抗原であるＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方と本発明のバイスぺシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片とを結合させることにより、凝集体を形成させて、該凝集体を検出する。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。
ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより、被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
一方、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方が発現している細胞の検出または測定には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いる。
免疫沈降法としては、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を発現した細胞などを本発明のバイスペシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片と反応させた後、プロテインＧセファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて、抗原抗体複合体を沈降させる。
または、以下のような方法によっても行なうことができる。まず、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに本発明のバイスぺシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。次に、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより、免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
免疫細胞染色法または免疫組織染色法とは、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の透過性を良くするために界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明のバイスぺシフィック抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ―サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition,Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。特に、本発明のバイスぺシフィック抗体またはそのバイスペシフィック抗体断片は、蛍光抗体染色法により、細胞膜上に発現しているＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの少なくとも一方を検出することができる。
また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定することができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］可溶性ヒトおよびサルＣＤ４０抗原ならびに可溶性ヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭ抗原の調製
１．ヒトＣＤ４０およびサルＣＤ４０の可溶性抗原の調製
Ｃ末端端にＦＬＡＧ－Ｆｃが付加されたヒトおよびサルＣＤ４０の細胞外ドメインタンパク質をそれぞれ以下に記載する方法で作製した。ヒトＣＤ４０細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号１に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に、サルＣＤ４０細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号３に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。
（１）ヒトおよびサルＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃベクターの作製
ヒトＣＤ４０遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１２５０、配列番号５；該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号６に示す）を基に配列番号１で示される塩基配列からなるヒトＣＤ４０の細胞外ドメインの遺伝子断片を作製した。
ＦＬＡＧ－ｔａｇおよびヒトＩｇＧのＦｃ領域を含むＩＮＰＥＰ４ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、配列番号１で示される塩基配列の１～６０番目の塩基配列からなるヒトＣＤ４０シグナル配列コード領域を加えた該細胞外ドメインの遺伝子断片を適切な部位に挿入して、ヒトＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃ発現ベクターを作製した。
同様の方法で、サル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からクローニングしたサルＣＤ４０遺伝子配列（配列番号７；該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号８に示す）を基に、配列番号３で示される塩基配列からなるサルＣＤ４０の細胞外ドメインの遺伝子断片を含むサルＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃ発現ベクターを作製した。
（２）ヒトおよびサルＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃタンパク質の作製
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、１－（１）で作製したヒトＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃ発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させた。ベクター導入５日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で濾過した。
この培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社製）を用いてアフィニティー精製を行った。プロテインＡに吸着させた抗体を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水［Ｄ－ＰＢＳ（－） ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃａ ａｎｄ Ｍｇ，ｌｉｑｕｉｄ；以下Ｄ－ＰＢＳ（－）と記載する。ナカライテスク社製］にて洗浄し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．４）により溶出して、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含むチューブに回収した。
次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いた限外ろ過により、Ｄ－ＰＢＳ（－）に置換した後、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターＭｉｌｌｅｘ－Ｇｖ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過滅菌し、ヒトＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃタンパク質を作製した。同様の方法で、１－（１）で作製したサルＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃ発現ベクターを用い、サルＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃタンパク質を作製した。取得したタンパク質の濃度は、波長２８０ｎｍの吸光度を測定して、各タンパク質のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用いて算出した。
（３）ヒトおよびサルＣＤ４０－ＧＳＴベクターの作製
ＧＳＴ領域を含むＮ５ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩで消化して、１－（１）記載の配列番号１で示される塩基配列からなるヒトＣＤ４０の細胞外ドメインの遺伝子断片を適切な部位に挿入し、ヒトＣＤ４０－ＧＳＴ発現ベクターを作製した。同様の方法で、配列番号３で示される塩基配列からなる細胞外ドメインの遺伝子断片を含むサルＣＤ４０－ＧＳＴ発現ベクターを作製した。
（４）ヒトおよびサルＣＤ４０－ＧＳＴタンパク質の作製
１－（３）で作製したヒトＣＤ４０－ＧＳＴベクターを、１－（２）と同様の方法でＨＥＫ２９３細胞に導入し、該細胞を培養後、培養上清をメンブランフィルターでろ過した。この培養上清をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）に反応させ、Ｄ－ＰＢＳ（－）で洗浄して、溶出緩衝液として１０ｍＭ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ（ｐＨ８．０）を用いてアフィニティー精製した。
溶出された融合タンパク溶液に対し１－（２）と同様の方法で限外ろ過およびメンブレンフィルターによるろ過滅菌を行い、ヒトＣＤ４０－ＧＳＴタンパク質を得た。また、サルＣＤ４０－ＧＳＴベクターを用い、同様の方法でサルＣＤ４０－ＧＳＴタンパク質を得た。取得したタンパク質の濃度は、波長２８０ｎｍの吸光度を測定して、各タンパク質のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用いて算出した。
２．ヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭの可溶性抗原の調製
Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＦｃまたはＧＳＴが付加されたヒト、サルまたはマウスＥｐＣＡＭの細胞外ドメインタンパク質をそれぞれ以下に記載する方法で作製した。ヒトＥｐＣＡＭ細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号９に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１０に、サルＥｐＣＡＭ細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号１１に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１２に、マウスＥｐＣＡＭ細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号１３に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
配列番号１５に示すヒトＥｐＣＡＭ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００２３５４、該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１６に示す）、配列番号１７に示すサルＥｐＣＡＭ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＸＭ＿０１５４３３６８５、該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１８に示す）および配列番号１９に示すマウスＥｐＣＡＭ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００８５３２、該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号２０に示す）を基に、１－（１）および（２）に記載の方法と同様にして、ヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭ－ＦＬＡＧ－Ｆｃタンパク質をそれぞれ得た。
なお、ＥｐＣＡＭ－ＦＬＡＧ－Ｆｃ発現ベクターには、シグナル配列コード領域として、配列番号１５に示す塩基配列の１～６３番目からなる塩基配列を組み込んだ。また、１－（３）および（４）に記載の方法と同様にして、ヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴタンパク質をそれぞれ得た。取得したタンパク質の濃度は、波長２８０ｎｍの吸光度を測定して、各タンパク質のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用い算出した。
［実施例２］膜発現ヒトＥｐＣＡＭ発現ＨＥＫ２９３細胞の作製
ｐＥＦ６／Ｖ５－Ｈｉｓ ＴＯＰＯ ＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて配列番号１５に示すヒトＥｐＣＡＭの遺伝子をＴＯＰＯクローニングし、順方向にヒトＥｐＣＡＭ遺伝子が挿入されているクローンを選択することにより、膜発現用ヒトＥｐＣＡＭ発現ベクターｐＥＦ６－ヒトＥｐＣＡＭ ｆｕｌｌを得た。
取得した発現ベクターｐＥＦ６－ヒトＥｐＣＡＭ ｆｕｌｌを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させた。遺伝子導入後、２４時間振とう培養し、遠心分離によりヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞を得た。
［実施例３］抗ＣＤ４０抗体の取得
１．ＣＤ４０免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーの作製
ヒト抗体産生マウス［Ishida & Lonberg, IBC’s 11th Antibody Engineering, Abstract 2000; Ishida, I. et al., Cloning & Stem Cells 4, 85-96 (2002)および石田 功（２００２）実験医学２０，６，８４６－８５１］に、免疫原として、実施例１で作製したヒトＣＤ４０－ＦＬＡＧ－Ｆｃを計４回腹腔内投与した。初回免疫時のみ、アジュバントとしてＡｌｕｍゲル（２ｍｇ／匹）および百日咳ワクチン（１×１０９個／匹）を添加した。
初回免疫から２週間後に２回目免疫、その１週間後に３回目免疫、３回目免疫から１０日後に最終免疫を行い、最終免疫から４日後に解剖して脾臓を外科的に摘出した。摘出した脾臓をセルストレイナー（ファルコン社製）上に乗せてシリコン棒で軽く潰しながら細胞をチューブへ移し、遠心分離して細胞を沈殿させた後、赤血球除去試薬（シグマアルドリッチ社製）と氷中で３分間反応させ、更に遠心分離を行った。
得られた脾臓細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にてｃＤＮＡを増幅し、さらにＰＣＲにてＶＨ遺伝子断片を増幅させた。該ＶＨ遺伝子断片およびヒトの抗体ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ配列であり、配列番号２１で示される塩基配列からなるＬ６配列を含むＶＬ遺伝子断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に挿入し、大腸菌ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）を形質転換してプラスミドを得た。
なお、Ｌ６配列は配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなる、ヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードしており、該ＶＬのＣＤＲ１、２および３（それぞれＬＣＤＲ１、２および３とも表す）のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２３、２４および２５で示される。
得られたプラスミドをＶＣＳＭ１３ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｐｈａｇｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に感染させることで、Ｌ６配列からなるＶＬ遺伝子を有し、ＶＨ遺伝子がライブラリー化されたＣＤ４０免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを得た。
２．抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の取得
このＣＤ４０免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを用いて、下記のファージディスプレイ法により、Ｌ６にコードされるＶＬを有する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を取得した。実施例１で取得したヒトＣＤ４０－ＧＳＴを固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてヒトＣＤ４０－ＧＳＴが結合していない部位をブロックしたＭＡＸＩＳＯＲＰ ＳＴＡＲＴＵＢＥ（ＮＵＮＣ社製）と、ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを室温下で１～２時間反応させ、Ｄ－ＰＢＳ（－）および０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳ－Ｔと記載する。和光純薬工業社製）でそれぞれ３回洗浄後に０．１ＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）でファージを溶出した。
溶出したファージは、ＴＧ１コンピテントセルに感染させ、ファージを増幅し、再度ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＳＴＡＲＴＵＢＥに固相化したヒトＣＤ４０－ＧＳＴと反応させて、Ｄ－ＰＢＳ（－）およびＰＢＳ－Ｔでそれぞれ５回洗浄後に０．１ＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）によるファージの溶出を行った。
この操作を２回または３回繰り返し、ヒトＣＤ４０に特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを濃縮した。濃縮されたファージをＴＧ１に感染させ、ＳＯＢＡＧプレート（２．０％ トリプトン、０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．０５％ ＮａＣｌ、２．０％ グルコース、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、１．５％ アガー）に播種してコロニーを形成させた。
コロニーを植菌して培養後、ＶＣＳＭ１３ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｐｈａｇｅを感染させて、再度培養することで単クローンのファージを得た。得られた単クローンのファージを用いて、ＥＬＩＳＡにてヒトおよびサルＣＤ４０－ＧＳＴのいずれにも結合するクローンを選択した。
ＥＬＩＳＡには、実施例１のヒトまたはサルＣＤ４０－ＧＳＴを各ウェルに固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてヒトまたはサルＣＤ４０－ＧＳＴが結合していない部位をブロックしたＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＮＵＮＣ社製）を用いた。各ウェルに各々のファージクローンを加え、室温下で３０分間反応させた後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。
次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗Ｍ１３抗体（ＧＥヘルスケア社製）を１０％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有ＰＢＳ－Ｔで５０００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬずつ加え、室温下３０分間インキュベートした。マイクロプレートを、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄後、ＴＭＢ発色基質液（ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに５０μＬずつ加え、室温下で１０分間インキュベートした。各ウェルに２Ｎ ＨＣｌ溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて発色反応を止め、波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をプレートリ－ダ－（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で測定した。
ヒトおよびサルＣＤ４０のいずれにも結合したクローンについて、配列解析を行い、Ｌ６にコードされるＶＬを有する抗ＣＤ４０抗体Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ、Ｒ２０８９およびＲ２１７８を取得した。表１に、取得したそれぞれのＣＤ４０抗体のＶＨをコードする全塩基配列および当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列、ならびにＶＨのＣＤＲ１～３（以下ではＨＣＤＲ１～３と記載することもある）のアミノ酸配列を示す。
Figure 0007311425000001
取得した抗ＣＤ４０抗体Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ、Ｒ２０８９およびＲ２１７８の遺伝子が組み込まれた可溶性ＩｇＧの発現ベクターをそれぞれ作製した。まず、Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ、Ｒ２０８９およびＲ２１７８の共通のＶＬをコードするＬ６遺伝子をＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）のＢｇｌＩＩ－ＢｓｉＷＩサイトにサブクローニングした。
その後、Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ、Ｒ２０８９およびＲ２１７８のそれぞれのＶＨ遺伝子をＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＳａｌＩ－ＮｈｅＩサイトへサブクローニングして、ヒトＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋの定常領域をもつ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ、Ｒ２０８９およびＲ２１７８の発現ベクターであるＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ＿Ｒ１０６６、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ＿Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ＿Ｒ２０８９およびＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ＿Ｒ２１７８をそれぞれ得た。
また、国際公開第２００３／０４０１７０号に記載された抗ＣＤ４０モノクローナル抗体２１．４．１を抗ＣＤ４０抗体の陽性コントロール抗体として作製するため、発現ベクターを作製した。２１．４．１のＶＨの塩基配列を配列番号４６に、該配列から推定されたＶＨのアミノ酸配列を配列番号４７に、それぞれ示す。また、２１．４．１のＶＬの塩基配列を配列番号４８、該配列から推定されたＶＬのアミノ酸配列を配列番号４９にそれぞれ示す。
２１．４．１のＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を合成し、Ｎ５ＫＧ２ベクター（国際公開第２００３／０３３５３８号に記載）のＳａｌＩ－ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ－ＢｓｉＷＩサイトにそれぞれサブクローニングして、ヒトＩｇＧ２の定常領域をもつ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体２１．４．１の発現ベクターＮ５ＫＧ２＿２１．４．１を得た。
［実施例４］抗ＥｐＣＡＭ抗体の取得
１．ＥｐＣＡＭ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーの作製
実施例１のヒトＥｐＣＡＭ－Ｆｃを用い、実施例３の１と同様の方法により、Ｌ６配列からなるＶＬ遺伝子を有しＶＨ遺伝子がライブラリー化されたＥｐＣＡＭ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを得た。
２．抗ＥｐＣＡＭ抗体の取得
実施例１で取得したマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴを固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴが結合していない部位をブロックしたＭＡＸＩＳＯＲＰ ＳＴＡＲＴＵＢＥ（ＮＵＮＣ社製）と、ＥｐＣＡＭ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを用い、実施例３の２と同様の方法によりマウスＥｐＣＡＭに特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを単クローン化した。
なお、一部実験ロットでは、２回目以降のマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴを用いたバイオパニング操作の代わりに、溶出したファージを、実施例２のヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３をＣＦＳＥ染色した細胞とＥｐＣＡＭ陰性のＨＥＫ２９３細胞に添加し、氷中で１時間反応後に洗浄し、ＣＦＳＥ陽性細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ社製）にてｓｏｒｔｉｎｇし、０．１ＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）でファージを溶出する操作によりヒトＥｐＣＡＭに特異的に結合するファージの濃縮を行った。単クローン化したファージから、ＥＬＩＳＡにてヒト、サル、およびマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴへの結合性を有するクローンを選択した。
ＥＬＩＳＡは、実施例１のヒト、サル、またはマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴを固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてヒト、サル、またはマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴが結合していない部位をブロックしたＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＮＵＮＣ社製）を用い、実施例３の２と同様の方法により行った。
ヒト、サル、およびマウスＥｐＣＡＭのいずれにも結合したクローンについて、配列解析を行い、Ｌ６にコードされるＶＬを有する抗ＥｐＣＡＭ抗体Ｅｐ５９、Ｅｐ２０３、Ｅｐｃ０５１およびＥｐｃ１１２を取得した。表１と同様の表示方法で、各ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨの配列情報を表２に示す。

Figure 0007311425000002
また、抗ＥｐＣＡＭ抗体の陽性コントロール抗体として、国際公開第２００３／０４０７２５号に記載された抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体３６２２Ｗ９４の可変領域をもつ抗体を作製した。３６２２Ｗ９４のＶＨの塩基配列を配列番号７０に、該配列から推定されたＶＨのアミノ酸配列を配列番号７１に、それぞれ示す。また、３６２２Ｗ９４のＶＬの塩基配列を配列番号７２、該配列から推定されたＶＬのアミノ酸配列を配列番号７３にそれぞれ示す。
３６２２Ｗ９４のＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を合成し、国際公開第２０１０／１４３６９８号に記載されているＴｏｌ２トランスポゾン発現ベクターｐＫＴＡＢＥＸ－ＴＣ２６の制限酵素サイトＢｇｌＩＩ－ＢｓｉＷＩにＶＬを、制限酵素サイトＳａｌＩ－ＮｈｅＩにＶＨをそれぞれサブクローニングし、ヒトＩｇＧ１の定常領域をもつ抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体３６２２Ｗ９４の発現ベクターｐＫＴＡＢＥＸ－ＴＣ２６＿３６２２Ｗ９４を得た。
［実施例５］ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに結合するバイスぺシフィック抗体の発現ベクターの構築
図１（Ａ）および図１（Ｂ）に記載する構造を有する、ヒトおよびサルＣＤ４０の少なくとも一方ならびにヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭの少なくともいずれか１つに結合するバイスペシフィック抗体を以下の方法で作製した。バイスペシフィック抗体の形状には国際公開第２００９／１３１２３９号に記載の形状を採用した。
当該バイスペシフィック抗体のうち、Ｎ末端側から順に、ＶＨ１、ＣＨ１、ＶＨ２、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３のアミノ酸配列を含む２本の重鎖ならびに４本の軽鎖からなる抗体をＮ末端型バイスペシフィック抗体と称する。また、Ｎ末端側から順にＶＨ１、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ２およびＣＨ１のアミノ酸配列を含む２本の重鎖ならびに４本の軽鎖からなる抗体をＣ末端型バイスペシフィック抗体と称する。ＶＨ１およびＶＨ２は抗ＣＤ４０抗体のＶＨまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨのいずれかであり、片方が抗ＣＤ４０抗体のＶＨ、もう一方が抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである。
以下の記載では、ＶＨ１とＶＨ２の間をつなぐポリペプチドをリンカーと称し、リンカーのアミノ酸配列をコードする遺伝子をリンカー遺伝子と称する。また、ＶＨ２のＣ末端側に結合するポリペプチドをＣ末端側ポリペプチドと称し、Ｃ末端側ポリペプチドをコードする遺伝子をＣ末端側配列遺伝子と称する。
以下の工程で作製されるＮ末端型バイスペシフィック抗体はリンカーとして、ＩｇＧ４のＣＨ１（塩基配列を配列番号７４、アミノ酸配列を配列番号７５で示す）を有する。またＶＨ２のＣ末端側ポリペプチドとして国際公開第２００６／０３３３８６号記載のＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＣＨ（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）からなるポリペプチド（塩基配列を配列番号７６、アミノ酸配列を配列番号７７で示す）を有する。
Ｃ末端型バイスペシフィック抗体はリンカーとして、ＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＣＨからなるポリペプチド（塩基配列を配列番号７６、アミノ酸配列を配列番号７７で示す）を有する。また、Ｃ末端側ポリペプチドとしてＩｇＧ４のＣＨ１（塩基配列を配列番号７４、アミノ酸配列を配列番号７５で示す）を有する。また、以下の工程で作成されるバイスペシフィック抗体は、Ｌ６にコードされるＶＬを含む軽鎖を有する。
当該バイスペシフィック抗体の名称、当該バイスペシフィック抗体の構造、当該バイスペシフィック抗体作製に使用した抗ＣＤ４０抗体のクローンおよび抗ＥｐＣＡＭ抗体のクローンを表３に示す。なお以下では、Ｎ末端型バイスペシフィック抗体の名称にＮｔと付記することもある。

Figure 0007311425000003
１．Ｎ末端型バイスペシフィック抗体の発現ベクターの作製
表３に記載されたバイスペシフィック抗体のうち、Ｎ末端型バイスペシフィック抗体について、発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
実施例３で取得したＲ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ、Ｒ２０８９およびＲ２１７８ならびに実施例４で取得したＥｐ５９、Ｅｐ２０３、Ｅｐｃ０５１およびＥｐｃ１１２の共通のＶＬをコードするＬ６遺伝子（配列番号２１）をＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）のＢｇｌＩＩ－ＢｓｉＷＩサイトにサブクローニングした。
その後、リンカーであるヒトＩｇＧ４のＣＨ１と同じアミノ酸配列をコードし、使用コドンを変更したリンカー遺伝子（配列番号７４）を合成した。このリンカー遺伝子および実施例３で取得した抗ＣＤ４０抗体または実施例４で取得した抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨ遺伝子を鋳型とし、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりリンカー遺伝子およびＶＨ２部分の遺伝子断片を増幅させた。増幅させた遺伝子断片を、ＮｈｅＩで開裂させたＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋに連結することにより、Ｎ末端型バイスペシフィック抗体発現プラスミドベクターを得た。
２．Ｃ末端型バイスペシフィック抗体の発現ベクターの作製
表３に記載されたバイスペシフィック抗体のうち、Ｃ末端型バイスペシフィック抗体について、発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
実施例３で取得した抗ＣＤ４０抗体Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ、Ｒ２０８９およびＲ２１７８ならびに実施例４で取得した抗ＥｐＣＡＭ抗体Ｅｐ５９、Ｅｐ２０３、Ｅｐｃ０５１およびＥｐｃ１１２の共通のＶＬをコードするＬ６遺伝子（配列番号２１）をＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）のＢｇｌＩＩ－ＢｓｉＷＩサイトにサブクローニングした。
その後、Ｃ末端側ポリペプチドであるヒトＩｇＧ４のＣＨ１と同じアミノ酸配列をコードし、使用コドンを変更した、停止コドンを含むＣ末端側配列遺伝子（配列番号７８）を合成した。実施例３で取得した抗ＣＤ４０抗体、または実施例４で取得した抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨ遺伝子および合成したＣ末端側配列遺伝子を鋳型とし、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＶＨ２およびＣ末端側配列遺伝子断片を増幅させた。
さらに、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋを鋳型として、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりリンカー遺伝子断片を増幅させた。増幅させた遺伝子断片を、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで開裂させたＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋに連結することにより、表３に記載するＣ末端型バイスペシフィック抗体発現プラスミドベクターを得た。
［実施例６］ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体、ＥｐＣＡＭに結合するモノクローナル抗体およびＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体の調製
実施例３から実施例５で抗体発現プラスミドベクターＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫおよびＮ５ＫＧ２のいずれかにサブクローニングした抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体、ならびにＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの各結合部位を有するバイスペシフィック抗体（ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体）をそれぞれ発現させ、精製した。
１．抗ＣＤ４０モノクローナル抗体およびＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の作製
抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の発現ベクターをＥｘｐｉ２９３（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）によりＥｘｐｉ２９３細胞に共遺伝子導入し、１６時間後にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加して、一過性発現系で抗体を発現させた。
ベクター導入４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）で濾過した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて抗体をアフィニティー精製した。洗浄液としてＤ－ＰＢＳ（－）を用いた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに吸着させた抗体を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出し、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含むチューブに回収した。
次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いて濃縮し、Ｎａｐ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＤ－ＰＢＳ（－）へ緩衝液を置換した。さらに、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社製）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、該抗体溶液より単量体画分を分取した。ＡＫＴＡシステム孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌することにより精製抗体を得た。
抗体溶液の波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、各抗体のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用いて、精製抗体の濃度を算出した。ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体も同様の方法で作製した。
２．抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体の作製
実施例４で作製した抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体３６２２Ｗ９４発現ベクターｐＫＴＡＢＥＸ－ＴＣ２６＿３６２２Ｗ９４をＴｏｌ２トランスポゼース発現ベクターと共に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にエレクロポレーション法によりｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。３μｇ／ｍｌ シクロヘキシミド（シグマアルドリッチ社製）を添加した培地で耐性株を選択した。１４－２１日後に可溶性ＩｇＧ ＦｃサンドウィッチＥＬＩＳＡにより、抗体産生ｗｅｌｌを選択した。
抗体産生量の多いｗｅｌｌは、拡大培養を行い、さらに抗体量を再度測定して、発現量の多い株を３６２２Ｗ９４発現株として樹立した。樹立した３６２２Ｗ９４発現株は、ＥＸＣＥＬ３０２培地（シグマアルドリッチ社製）で培養して、上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で濾過した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて抗体をアフィニティー精製した。洗浄液としてＤ－ＰＢＳ（－）を用いた。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに吸着させた抗体を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出し、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含むチューブに回収した。次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いて濃縮し、Ｎａｐ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＤ－ＰＢＳ（－）へ緩衝液を置換した。
さらに、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社製）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、該抗体溶液より単量体画分を分取した。孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌を行うことにより精製抗体を得た。抗体溶液の波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、各抗体のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用いて、精製抗体の濃度を算出した。
［実施例７］フローサイトメーターによる細胞株のＣＤ４０およびＥｐＣＡＭ発現評価
バーキットリンパ腫細胞Ｒａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ-１５９６）、ヒト大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ-２２２）、ヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ-１５７３）および実施例２で得たヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞の細胞表面上のＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの発現を、以下の手順に従いｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法により評価した。評価には実施例６で得た抗ＣＤ４０抗体２１．４．１および抗ＥｐＣＡＭ抗体３６２２Ｗ９４を用いた。
Ｒａｍｏｓ細胞を、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で０．１％ ＮａＮ３、１％ ＦＢＳ含有Ｄ－ＰＢＳ（－）のＳｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に懸濁し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６穴丸底プレート（ファルコン社製）に分注した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットへ実施例６で得た１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０抗体２１．４．１及び抗ＥｐＣＡＭ抗体３６２２Ｗ９４を５０μＬ／ｗｅｌｌ加えて懸濁した後、氷温下で３０分間静置した。
さらに遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）して上清を除去し、ペレットを２００μＬ／ｗｅｌｌのＳＢで３回洗浄した後に、１μｇ／ｍＬのＧｏａｔ Ｆ（ａｂ’）２ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（γ ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ） Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（Ｒ－ＰＥ） Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、２００μＬ／ｗｅｌｌのＳＢに懸濁し、フローサイトメーターＦＡＣＳＣＡＮＴＯ ＩＩ、（ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。
同様にして、Ｃｏｌｏ２０５細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞をそれぞれ評価した。陰性コントロールにはMol Immunol. 1996 Jun;33(9):759-68.に記載の２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）抗体のＶＬおよびＶＨ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．：ＶＬ Ｕ１６６８８、ＶＨ Ｕ１１６６８７）をコードするベクターを用い、国際公開第２００６／０３３３８６号の実施例５記載の方法に準じて作製したＩｇＧ４抗体Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｒ４０９Ｋ変異体（以下抗ＤＮＰ抗体と記載する）を使用した。
図２（Ａ）にはＲａｍｏｓ細胞、図２（Ｂ）にはＣｏｌｏ２０５細胞、図２（Ｃ）にはＨＥＫ２９３細胞、図２（Ｄ）にはヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞に対して測定した結果を示した。
図２（Ａ）に示すように、Ｒａｍｏｓ細胞に対しては、抗ＣＤ４０抗体である２１．４．１が結合活性を示し、抗ＥｐＣＡＭ抗体である３６２２Ｗ９４は結合活性を示さなかった。一方で、図２（Ｂ）および図２（Ｄ）に示すように、Ｃｏｌｏ２０５細胞およびヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞に対しては、２１．４．１は結合活性を示さず、３６２２Ｗ９４は結合活性を示した。また、図２（Ｃ）に示すように、ＨＥＫ２９３細胞に対しては、２１．４．１および３６２２Ｗ９４はいずれも結合活性を示さなかった。
これにより、Ｒａｍｏｓ細胞はＣＤ４０陽性でＥｐＣＡＭ陰性、Ｃｏｌｏ２０５細胞およびヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞はＣＤ４０陰性でＥｐＣＡＭ陽性、ＨＥＫ２９３細胞はＣＤ４０およびＥｐＣＡＭのいずれも陰性であることが確認できた。
［実施例８］フローサイトメトリーによるＣＤ９５発現量解析によるＣＤ４０モノクローナル抗体のＣＤ４０シグナル誘導活性の評価
Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量増加を指標として、実施例６で得られたＣＤ４０モノクローナル抗体のＣＤ４０シグナル誘導能を以下のようにＦＣＭ法で評価した。
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＲａｍｏｓ細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌでＵ底９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で希釈した０．２、２または２０μｇ／ｍｌ（終濃度０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の被験抗体を５０μｇ／ｍＬ添加し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で１６時間培養した。
遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットを２００μＬ／ｗｅｌｌのＳＢで３回洗浄した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットへＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ９５（ベクトンディッキンソン社製）抗体を加えて懸濁した後、氷温下で３０分間静置した。
さらに遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）して上清を除去し、ペレットを２００μＬ／ｗｅｌｌのＳＢで３回洗浄した後、１００倍希釈した７－アミノアクチノマイシン（７ＡＡＤ）（ベクトンディッキンソン社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌのＳＢに懸濁し、フローサイトメーターＦＡＣＳＣＡＮＴＯ ＩＩ（ベクトンディッキンソン社製）でＲａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の蛍光強度を測定した。陰性コントロールには抗ＤＮＰ抗体を使用した。
図３（Ａ）には抗ＣＤ４０抗体２１．４．１、Ｒ１０６６、Ｒ２０８９およびＲ２１７８、図３（Ｂ）には抗ＣＤ４０抗体２１．４．１、Ｒ１０６６およびＲ１０９０Ｓ５５Ａならびに抗ＥｐＣＡＭ抗体３６２２Ｗ９４の評価結果を示す。
これらの評価結果より、被験抗体２１．４．１、Ｒ１０６６、Ｒ２０８９、Ｒ２１７８、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａおよび３６２２Ｗ９４の内、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体２１．４．１を添加した時のみ、Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現が上昇することがわかった。
すなわち、２１．４．１のみがＣＤ４０のシグナルを誘導するアゴニスト抗体であり、実施例３において取得された抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｒ１０６６、Ｒ２０８９、Ｒ２１７８およびＲ１０９０Ｓ５５Ａは、ＣＤ４０へのシグナルを誘導しない非アゴニスト抗体であることが示された。また、ＣＤ４０リガンドの存在下で同様の試験を行ったところ、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｒ１０６６、Ｒ２０８９、Ｒ２１７８およびＲ１０９０Ｓ５５ＡはいずれもＣＤ４０リガンドによるＲａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現を阻害しなかった（データ記載なし）。すなわち、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｒ１０６６、Ｒ２０８９、Ｒ２１７８およびＲ１０９０Ｓ５５Ａはいずれも、ＣＤ４０リガンドによるＣＤ４０へのシグナル誘導を阻害しない、非アンタゴニスト抗体であることが示された。
［実施例９］ビアコアによるＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のＥｐＣＡＭに対する結合性の評価
実施例６で得られたＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭそれぞれに対する結合活性と種交差性を確認することを目的として、実施例１で作製したヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴを用いて、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）による結合性試験を実施した。測定機器として、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケア社製）を使用した。
Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、添付文書に従いＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア社製）に固定化した。フローセルに、１～３μｇ／ｍＬに調製した被験抗体を１０μＬ／ｍｉｎの流速で１０秒間添加した。
次いで、アナライトとして１０または１００ｎＭより５段階に２倍希釈したヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭ－ＧＳＴタンパク質溶液（０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア社製）で希釈）をそれぞれ３０μＬ／ｍｉｎの流速で添加し、各抗体とアナライトとの結合反応を２分間、解離反応を１０分間測定した。
測定はシングルサイクルカイネティクス法で行った。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。
算出された各バイスペシフィック抗体のヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭそれぞれに対する解離定数［ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ］ならびにヒトＥｐＣＡＭに対する解離定数をサルＥｐＣＡＭまたはマウスＥｐＣＭに対する解離定数で割った値を表４に示す。

Figure 0007311425000004
表４に示す通り、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のヒト、サルおよびマウスＥｐＣＡＭに対するＫＤ値は、マウスＥｐＣＡＭに対するＲ２１７８－Ｅｐ５９およびＲ２１７８－Ｅｐ２０３の結合を除き、１０－８Ｍオーダー以下の強い結合を示した。
ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体は、Ｒ１０６６－Ｅｐ５９、Ｒ１０６６－Ｅｐｃ０５１およびＲ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐｃ０５１以外はサルＥｐＣＡＭに対するＫＤ値がヒトＥｐＣＡＭに対するＫＤ値の１／５～５倍の間にあり、高いヒト－サルＥｐＣＡＭの種交差性があることが示された。
また、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体は、Ｒ２１７８－Ｅｐ５９およびＲ２１７８－Ｅｐ２０３以外はマウスＥｐＣＡＭに対するＫＤ値がヒトＥｐＣＡＭに対するＫＤ値の１／５～５倍の間にあり、高いヒト－マウスＥｐＣＡＭの種交差性があることが示された。
［実施例１０］ビアコアによるＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のＣＤ４０に対する結合性の評価
実施例６で得られたＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のヒトおよびサルＣＤ４０それぞれに対する結合活性ならびに種交差性を確認することを目的として、実施例１で作製したヒトおよびサルＣＤ４０－ＧＳＴを用いて、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）による結合性試験を実施した。測定機器として、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケア社製）を使用した。
Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、添付文書に従いＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア社製）に固定化した。フローセルに、１～３μｇ／ｍＬに調製した被験抗体を１０μＬ／ｍｉｎの流速で１０秒間添加した。
次いで、アナライトとして１．２５ｎＭより５段階に２倍希釈したヒトおよびサルＣＤ４０－ＧＳＴタンパク質溶液（０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳ－ＥＰ＋で希釈）をそれぞれ３０μＬ／ｍｉｎ分の流速で添加し、各抗体とアナライトとの結合反応を２分間、解離反応を１０分間測定した。測定はシングルサイクルカイネティクス法で行った。
得られたセンサーグラムを、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。算出された各バイスペシフィック抗体のヒトおよびサルＣＤ４０それぞれに対する解離定数［ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ］ならびにヒトＣＤ４０に対する解離定数をサルＣＤ４０に対する解離定数で割った値を表５に示す。

Figure 0007311425000005
 ＮＣ：Ｎｏｔ Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ
表５に示す通り、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体Ｒ１０６６－Ｅｐ５９、Ｒ１０６６－Ｅｐ２０３、Ｒ１０６６－Ｅｐｃ０５１、Ｒ１０６６－Ｅｐｃ１１２、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ５９、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐｃ０５１、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐｃ１１２、Ｒ２０８９－Ｅｐ５９、Ｒ２０８９－Ｅｐ２０３、Ｒ２０８９－Ｅｐｃ０５１、Ｒ２０８９－Ｅｐｃ１１２、Ｒ２１７８－Ｅｐ２０３、Ｒ２１７８－Ｅｐｃ０５１、Ｒ２１７８－Ｅｐｃ１１２、Ｅｐ５９－Ｒ２０８９、Ｅｐ５９－Ｒ２１７８、Ｅｐ２０３－Ｒ２０８９、Ｃｔ Ｒ１０６６－Ｅｐ５９、Ｃｔ Ｒ１０６６－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ５９およびＣｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３それぞれの、ヒトＣＤ４０およびサルＣＤ４０に対するＫＤ値はいずれも、１０－９Ｍオーダー以下の強い結合を示した。
また、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体Ｒ１０６６－Ｅｐ５９、Ｒ１０６６－Ｅｐ２０３、Ｒ１０６６－Ｅｐｃ１１２、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ５９、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐｃ０５１、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐｃ１１２、Ｒ２０８９－Ｅｐ５９、Ｒ２０８９－Ｅｐ２０３、Ｒ２０８９－Ｅｐｃ０５１、Ｒ２０８９－Ｅｐｃ１１２、Ｒ２１７８－Ｅｐｃ０５１、Ｒ２１７８－Ｅｐｃ１１２、Ｅｐ５９－Ｒ２０８９、Ｅｐ５９－Ｒ２１７８、Ｃｔ Ｒ１０６６－Ｅｐ５９、Ｃｔ Ｒ１０６６－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ５９およびＣｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３それぞれのサルＣＤ４０に対するＫＤ値は、ヒトＣＤ４０に対するＫＤ値の１／５～５倍の間にあり、高いヒト－サルＣＤ４０の種交差性があることが示された。
［実施例１１］フローサイトメトリーによるＣＤ９５発現量解析によるＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のＣＤ４０シグナル誘導活性の評価
Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量増加を指標として、実施例６で得られたＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のＥｐＣＡＭ陽性または陰性細胞共存下におけるＲａｍｏｓ細胞へのＣＤ４０シグナル誘導活性を以下のようにＦＣＭ法で評価した。
４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＲａｍｏｓ細胞を２５μＬ／ｗｅｌｌでＵ底９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で希釈した０．２、２または２０μｇ／ｍＬ（終濃度０．１、１または１０μｇ／ｍＬ）の被験抗体を５０μｇ／ｍＬ添加し、さらにＥｘｐｉ２９３細胞、ヒトＥｐＣＡＭ発現ＨＥＫ２９３細胞またはＣｏｌｏ２０５細胞４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを２５μＬ／ｗｅｌｌで加え、３７℃、５．０％炭酸ガス下で１６時間培養した。
遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットを２００μＬ／ｗｅｌｌのＳＢで３回洗浄した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットへＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ９５抗体（ベクトンディッキンソン社製）およびＦＩＴＣ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２０を加えて懸濁した後、氷温下で３０分間静置した。
さらに遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）して上清を除去し、ペレットを２００μＬ／ｗｅｌｌのＳＢで３回洗浄した後、１００倍希釈した７ＡＡＤ（ベクトンディッキンソン社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌのＳＢに懸濁し、フローサイトメーターＦＡＣＳＣＡＮＴＯ ＩＩ（ベクトンディッキンソン社製）でＣＤ２０陽性画分に存在するＲａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の蛍光強度を測定した。陰性コントロールには抗ＤＮＰ抗体を使用した。
ＨＥＫ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞の結果を図４に、ヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞の結果を図５に、Ｃｏｌｏ２０５細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞の結果を図６に示す。
図４に示すように、実施例３で作製した抗ＣＤ４０抗体２１．４．１存在下で、ＨＥＫ２９３細胞、ヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞およびＣｏｌｏ２０５細胞のいずれかの１つの細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合、Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量が増加し、ＣＤ４０のシグナルが誘導されていることがわかった。
また、図４～６に示すように、実施例４で作製した抗ＥｐＣＡＭ抗体３６２２Ｗ９４存在下で、ヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞またはＣｏｌｏ２０５細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合、Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量はネガティブコントロールと同等であり、ＣＤ４０シグナルが誘導されていないことが示された。
一方で、図４に示すようにＥｐＣＡＭ陰性のＨＥＫ２９３細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養下では、いずれのＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体クローンもＣＤ４０のシグナルを誘導しなかったが、図５および６に示すようにＥｐＣＡＭ陽性のヒトＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ２９３細胞またはＣｏｌｏ２０５細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合には、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体がＲａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量を増加させ、ＣＤ４０のシグナルを誘導していることが示された。
これらの結果は、図７（Ｂ）に示すようにＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体がＲａｍｏｓ細胞上のＣＤ４０に単独で結合したときにはＣＤ４０シグナルを誘導せず、図７（Ａ）に示すようにＥｐＣＡＭ陽性細胞が共存する時にのみ、ＣＤ４０シグナルを誘導することを示唆している。
親抗体である抗ＣＤ４０抗体および抗ＥｐＣＡＭ抗体はいずれもＥｐＣＡＭ陽性細胞の共存下でＲａｍｏｓ細胞にＣＤ４０シグナルを誘導しないことが確認されている［抗ＣＤ４０抗体については図３（Ａ）および（Ｂ）に記載。抗ＥｐＣＡＭ抗体についてのデータは省略］が、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体は、親抗体が有していないＣＤ４０シグナル誘導活性を有することが分かった。
これにより、本発明のＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体は、腫瘍など、ＥｐＣＡＭが発現する細胞が存在する病変部位特異的に、免疫細胞や腫瘍細胞などのＣＤ４０陽性細胞にシグナルを誘導することが示唆された。
また、図５に示す通り、ｈＥｐＣＡＭ／ＨＥＫ細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した際のＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のＣＤ４０シグナル誘導活性はＶＨ１が抗ＣＤ４０抗体のＶＨからなり、ＶＨ２が抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨからなるＣ末端型バイスペシフィック抗体、ＶＨ１が抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨからなり、ＶＨ２が抗ＣＤ４０抗体のＶＨからなるＣ末端型バイスペシフィック抗体、ＶＨ１が抗ＣＤ４０抗体のＶＨからなり、ＶＨ２が抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨからなるＮ末端型バイスペシフィック抗体の順に強かった。
図６に示す通り、Ｃｏｌｏ２０５細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合もほぼ同様の傾向が確認できた。一方、ＶＨ１が抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨからなり、ＶＨ２が抗ＣＤ４０抗体のＶＨからなるＮ末端型バイスペシフィック抗体は、ＣＤ４０シグナル誘導活性を有しないことが示された。
すなわち、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のもつ、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の存在に依存したＣＤ４０アゴニスト活性の強さは、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の形状および抗ＣＤ４０抗体のＶＨおよび抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨの配置に依存しており、Ｃ末端型バイスペシフィック抗体の活性はＮ末端型バイスペシフィック抗体よりも強かった。すなわち、ＶＨ１が抗ＣＤ４０抗体のＶＨからなり、ＶＨ２が抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨからなるバイスペシフィック抗体の活性はＶＨ１が抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨからなり、ＶＨ２が抗ＣＤ４０抗体のＶＨからなるバイスペシフィック抗体よりも強いことが示された。
［実施例１２］蛍光標識抗体の作製
ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の細胞表面上での局在を蛍光免疫染色法により解析するために、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体および細胞表面マーカー抗体の蛍光標識を行った。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用い、添付文書に記載の方法に従って、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３にＡｌｅｘａ４８８を標識した蛍光標識抗体を作製した。
また、Ｒａｍｏｓ細胞に発現しておらずＣｏｌｏ２０５細胞に発現している表面マーカーとしてＨＥＲ２を選択し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用い、添付文書に記載の方法に従って、公知の抗ＨＥＲ２抗体（国際公開第１９９２／０２２６５３号に記載）にＡｌｅｘａ６４７を標識した抗体を作製した。
［実施例１３］ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体によるＥｐＣＡＭ陽性細胞及びＣＤ４０陽性細胞の架橋部位への集積の確認
ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体がＲａｍｏｓ細胞とＥｐＣＡＭ陽性細胞に結合する様子を確認するため、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３－Ａｌｅｘａ ４８８を用い、蛍光免疫染色法による評価を行った。
１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＲａｍｏｓ細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで平底９６ｗｅｌｌプレート（グライナー社製）に播種し、実施例１３で調製したＣｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３－Ａｌｅｘａ ４８８およびＨＥＲ２ Ａｂ－Ａｌｅｘａ ６４７をフェノールレッド不含のＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で希釈し、それぞれ２μｇ／ｍｌ（終濃度１μｇ／ｍｌ）および１００μｇ／ｍｌ添加した。
さらにＣｏｌｏ２０５細胞１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５０μＬ／ｗｅｌｌで加えて、３７℃、５．０％炭酸ガス下で１４時間培養し、ＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ６０００（ＧＥヘルスケア社製）にて観察した。
図８（Ａ）にＨＥＲ２抗体に標識したＡｌｅｘａ６４７によりＣｏｌｏ２０５細胞を検出した結果を、図８（Ｂ）にＣｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３に標識したＡｌｅｘａ４８８を検出した結果を示し、それらの重ね合わせ図８（Ｃ）を示す。
ＨＥＲ２はＲａｍｏｓ細胞には発現しておらずＣｏｌｏ２０５細胞には発現しているため、図８（Ａ）ではＣｏｌｏ２０５細胞のみから蛍光が観察されている。したがって、図８（Ａ）で観察された細胞がＣｏｌｏ２０５細胞であり、図８（Ｂ）で観察されて図８（Ａ）で観察されていない細胞がＲａｍｏｓ細胞である。
図８（Ｂ）においてＣｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３－Ａｌｅｘａ ４８８は、Ｒａｍｏｓ細胞およびＣｏｌｏ２０５細胞の両細胞から蛍光が観察されている。これにより、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３が細胞表面上でもＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに結合することが確認できた。
図８（Ｂ）および図８（Ｃ）に示す通り、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３－Ａｌｅｘａ ４８８は、Ｃｏｌｏ２０５細胞とＲａｍｏｓ細胞の接触面に集積し、強く蛍光を発している様子が観察された（矢印部分）。この結果から、ＣＤ４０陽性細胞とＥｐＣＡＭ陽性細胞が架橋され、その接触面にＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体が集積していることが示された。
ＣＤ４０を含むＴＮＦＲＳＦは３量体以上の会合体を形成するとシグナルを誘導することが知られており、細胞の接触面においてＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体が集積することにより、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体が結合したＣＤ４０も集積したため、ＣＤ４０のシグナルが誘導されたのだと考えられる。
また、細胞接触面に集積したＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体は細胞内へ内在化していることも観察されており、これはＣＤ４０シグナルが誘導されたことにより、ＣＤ４０の内在化が促進されていることを示唆している。
［実施例１４］抗体のマウスにおける毒性試験
ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３および抗ＣＤ４０アゴニスト抗体２１．４．１はいずれもマウスＣＤ４０に対する交差反応性を有しないため、マウスモデルを用いた検討では、Ｃ１７ＢＬ／６Ｊ ＪｃｌマウスにヒトＣＤ４０を含むＢＡＣベクターを導入した、ヒトＣＤ４０ ＢＡＣ Ｔｇマウス（以下、ｈＣＤ４０Ｔｇマウスと称する）を用いた。
ｈＣＤ４０ＴｇマウスはＢＡＣ ｃｌｏｎｅ（ＣＴＤ－２５３２Ｉ１９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を精製後に受精卵に導入して作製した。作製したｈＣＤ４０ＴｇマウスはＣ１７ＢＬ／６Ｊ Ｊｃｌマウスと交配し、ヒトＣＤ４０遺伝子を有する事をＰＣＲ法で確認した後に試験に供した。
ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体２１．４．１およびコントロール抗体である抗ＤＮＰ抗体をｈＣＤ４０Ｔｇマウス各群５匹にそれぞれ尾静脈から投与し、投与前と投与２４時間後の体重、投与２４時間後の末梢血液細胞数、血漿中アスパラギンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度を測定した。抗体投与量は、２１．４．１以外は１０ｍｇ／ｋｇ、２１．４．１については毒性により１０ｍｇ／ｋｇでの投与は困難なため、１ｍｇ／ｋｇとした。
その結果、図９（Ａ）～（Ｃ）および図１０（Ａ）～（Ｄ）に示すように、２１．４．１を投与した群では、投与後に体重の減少、肝逸脱酵素であるＡＳＴおよびＡＬＴの上昇ならびに末梢血中白血球、リンパ球、単球および血小板の減少が認められたが、Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６およびＲ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３を投与した群は、陰性コントロールであるＤＮＰ抗体を投与した群と同様、変化は認められなかった。
以上より、本発明のＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体が先行抗体に比べ、全身性の毒性を顕著に低減していることが示された。
［実施例１５］抗体のマウスシンジェニックモデルにおける抗腫瘍効果
ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３および抗ＣＤ４０アゴニスト抗体２１．４．１のマウスにおける抗腫瘍効果を検討するため、マウスシンジェニックモデルを用い、検討を行った。
１．腫瘍細胞ｍＥｐＣＡＭ／Ｂ１６Ｆ１０の作製
移植する腫瘍細胞として、以下の方法によりマウスＥｐＣＡＭを発現していないマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６－Ｆ１０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６４７５）とＢ１６－Ｆ１０にマウスＥｐＣＡＭを発現させたｍＥｐＣＡＭ／Ｂ１６Ｆ１０を作製した。
配列番号１９に示すマウスＥｐＣＡＭ遺伝子を用いて、実施例２と同様の方法により作製した、膜発現用マウスＥｐＣＡＭ発現ベクターｐＥＦ６－マウスＥｐＣＡＭ ＦｕｌｌからｍＥｐＣＡＭ（９４５ｂｐ）をＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで切り出し、同じくＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで処理したｐｃＤＮＡ３．１（＋）にｌｉｇａｔｉｏｎしｐｃＤＮＡ３－マウスＥｐＣＡＭ ｆｕｌｌを得た。
取得した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－マウスＥｐＣＡＭ ｆｕｌｌを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＢ１６Ｆ１０細胞に導入して培養し、翌日より３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８でセレクションを行った。セルソーターにより、高発現画分のソーティングを３回繰り返し、マウスＥｐＣＡＭを高発現するＢ１６Ｆ１０細胞を得た。
２．マウスシンジェニックモデルを用いた抗腫瘍試験
Ｂ１６－Ｆ１０またはｍＥｐＣＡＭ／Ｂ１６Ｆ１０をｈＣＤ４０Ｔｇマウス皮下に１ｘ１０６細胞移植（Ｄａｙ－８）した。Ｄａｙ０、３および７に各抗体を各群５匹に尾静脈から投与した。抗体投与量は、２１．４．１以外は１０ｍｇ／ｋｇ、２１．４．１については毒性により１０ｍｇ／ｋｇでの投与は困難なため、１ｍｇ／ｋｇとした。ノギスを用いて腫瘍の長径、短径を測定し、短径×短径×長径／２の式により腫瘍体積を算出した。結果を図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示す。
図１１（Ａ）に示すように、ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体Ｃｔ Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３、Ｃｔ Ｅｐｃ１１２－Ｒ１０６６およびＲ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３はいずれも、ｍＥｐＣＡＭ／Ｂ１６Ｆ１０に対しては、顕著な薬効を示した。一方、図１１（Ｂ）に示すように、ＥｐＣＡＭを発現しないＢ１６－Ｆ１０に対しては薬効を示さなかった。以上より、作製したＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体はＥｐＣＡＭ依存的な薬効を有する事が示された。
［実施例１６］ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体または抗体断片の発現ベクターの構築
１．バイスペシフィック抗体または抗体断片の設計
（１）ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体の設計
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ１価で結合するバイスペシフィック抗体として、図１２（Ａ）に記載する構造を有するバイスペシフィック抗体（以下、ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体と記載する）を設計した。ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体のＦｃ領域には国際公開第２０１６／０７１００４号に記載のＦｃ領域を採用した。
ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体は、異なる２つの重鎖定常領域（ＣＨ）を有しており、それぞれを以下ではＣＨａおよびＣＨｂと記載する。ＣＨａの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号７９および８０で示す。またＣＨｂの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号８１および８２で示す。ＣＨａおよびＣＨｂのＮ末端側にはそれぞれ抗体の重鎖可変領域が結合し、重鎖を形成する。以下ではＣＨａおよびＣＨｂに結合する重鎖可変領域をそれぞれＶＨａおよびＶＨｂと記載する。ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体はＮ末端側よりＶＨａおよびＣＨａが連結してなる１本の重鎖、Ｎ末端側よりＶＨｂおよびＣＨｂが連結してなる１本の重鎖ならびに同一の２本の軽鎖からなる。
（２）Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片の設計
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ１価で結合するバイスペシフィック抗体断片として、図１２（Ｂ）に記載する構造を有する抗体断片（以下ではＦａｂ型バイスペシフィック抗体断片と記載する）を設計した。Ｆａｂ型バイスペシフック抗体断片の構造には、国際公開第２００９／１３１２３９号に記載の抗体のＮ末端からヒンジの途中までの構造を採用し、重鎖のＣ末端側にＦＬＡＧ－Ｔａｇを連結させた。すなわち、Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片は、Ｎ末端側から順に、ＶＨ１、ＣＨ１、ＶＨ２、ＣＨ１、ヒンジの一部およびＦＬＡＧ－Ｔａｇが連結してなる１本の重鎖ならびに２本の軽鎖からなる。Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片のＶＨ２のＣ末端側に結合するＣＨ１からＦＬＡＧ－Ｔａｇまでの遺伝子配列を配列番号８３に、アミノ酸配列を配列番号８４に記載する。
（３）Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片の設計
ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ二価で結合するバイスペシフィック抗体断片として、図１２（Ｃ）に記載する構造を有する抗体断片（以下ではＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片と記載する）を設計した。Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片の構造には、国際公開第２００９／１３１２３９号に記載の抗体のＮ末端からヒンジまでの構造を採用し、重鎖のＣ末端側にＦＬＡＧ－Ｔａｇを連結させた。すなわち、Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片は、Ｎ末端側から順に、ＶＨ１、ＣＨ１、ＶＨ２、ＣＨ１、ヒンジおよびＦＬＡＧ－Ｔａｇが連結してなる２本の重鎖ならびに４本の軽鎖からなる。Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片のＶＨ２のＣ末端側に結合するＣＨ１からＦＬＡＧ－Ｔａｇまでの遺伝子配列を配列番号８５に、アミノ酸配列を配列番号８６に記載する。
以下の工程で作製されるヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体のＶＨａは抗ＣＤ４０抗体のＶＨであり、ＶＨｂは抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである。またＦａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片のＶＨ１は抗ＣＤ４０抗体のＶＨであり、ＶＨ２は抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨである。
以下の工程で作製されるＦａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体はＶＨ１とＶＨ２の間のリンカーとして、ＩｇＧ４のＣＨ１（塩基配列を配列番号７４、アミノ酸配列を配列番号７５で示す）を有する。
また、以下の工程で作製されるヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体、Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片およびＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片は、Ｌ６にコードされるＶＬを含む軽鎖を有する。
当該バイスペシフィック抗体／抗体断片の名称、バイスペシフィック抗体／抗体断片の構造、当該抗体／抗体断片作製に使用した抗ＣＤ４０抗体のクローンおよび抗ＥｐＣＡＭ抗体のクローンを表４に示す。
Figure 0007311425000006
２．バイスペシフィック抗体または抗体断片の発現ベクターの作製
（１）ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体の発現ベクターの作製
表４に記載されたヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体について、発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
実施例３で取得したＲ１０６６、Ｒ１０９０Ｓ５５ＡまたはＲ２０８９のＶＨをコードする塩基配列に、配列番号７９で表される、ＣＨａをコードする塩基配列を連結した遺伝子を合成し、ｐＣＩ－Ｈｙｇｒｏ２．０１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｐＣＩベクターを基に合成）のＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩサイトに連結した。
また、実施例４で取得したＥｐ５９、Ｅｐ２０３およびＥｐｃ１１２のそれぞれのＶＨ遺伝子を実施例３で取得したＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ＿Ｒ１０６６のＳａｌＩ－ＮｈｅＩサイトへサブクローニングした。その後、ＶＬをコードするＬ６遺伝子（配列番号２１）からＶＨの領域までの遺伝子断片をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ反応により増幅し、配列番号８１で表されるＣＨｂをコードする合成塩基配列を、ｐＣＩ－Ｈｙｇｒｏ２．０１のＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトにサブクローニングしたプラスミドのＸｂａＩ－ＮｈｅＩサイトに連結することにより、表４に記載するヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体発現プラスミドベクターを得た。
（２）Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片の発現ベクターの作製
表４に記載された、Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片について、発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
実施例５－１で作製したＮ末端型バイスペシフィック抗体Ｒ１０６６－Ｅｐ２０３およびＲ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３発現ベクターを鋳型とし、ＶＬからヒンジ領域のＮ末端側の４残基までの配列にＦＬＡＧ－Ｔａｇを付加した遺伝子断片をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ反応により増幅し、ｐＣＩ－Ｈｙｇｒｏ２．０１のＸｂａＩ－ＢａｍＨＩサイトに連結することにより、表４に記載するＦａｂ型バイスペシフィック抗体断片発現プラスミドベクターを得た。Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片のＶＨ２のＣ末端側に結合するＣＨ１からＦＬＡＧ－Ｔａｇまでの遺伝子配列を配列番号８３に、アミノ酸配列を配列番号８４に記載する。
（３）Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片の発現ベクターの作製
表４に記載されたＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片について、発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
実施例５－１で作製したＮ末端型バイスペシフィック抗体Ｒ１０６６－Ｅｐ２０３およびＲ１０９０Ｓ５５Ａ－Ｅｐ２０３発現ベクターを鋳型とし、ＶＬからヒンジの配列にＦＬＡＧ－Ｔａｇを付加した遺伝子断片をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ反応により増幅し、ｐＣＩ－Ｈｙｇｒｏ２．０１のＸｂａＩ－ＢａｍＨＩサイトに連結することにより、表４に記載するＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片発現プラスミドベクターを得た。Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片のＶＨ２のＮ末端側に結合するＣＨ１からＦＬＡＧ－Ｔａｇまでの遺伝子配列を配列番号８５に、アミノ酸配列を配列番号８６に記載する。
［実施例１７］ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体の調製
実施例１６で作製した抗体発現プラスミドベクターｐＣＩ－Ｈｙｇｒｏ２．０１にサブクローニングしたＣＤ４０およびＥｐＣＡＭの各結合部位を有するバイスペシフィック抗体または抗体断片を、以下の方法によりそれぞれ発現させ、精製した。
１．ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体の作製
実施例１６－２（１）で作製したＶＨａおよびＣＨａからなる重鎖をコードする発現ベクターならびにＶＨｂおよびＣＨｂからなる重鎖をコードする発現ベクターをＥｘｐｉ２９３（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）によりＥｘｐｉ２９３細胞に共遺伝子導入し、１６時間後にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加して、一過性発現系で抗体を発現させた。
ベクター導入４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）で濾過した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて抗体をアフィニティー精製した。洗浄液としてＤ－ＰＢＳ（－）を用いた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに吸着させた抗体を、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．５）により溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を含むチューブに回収した。
次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いて濃縮し、Ｎａｐ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＤ－ＰＢＳ（－）へ緩衝液を置換した。さらに、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社製）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、該抗体溶液より単量体画分を分取した。ＡＫＴＡシステム孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌することにより精製抗体を得た。
抗体溶液の波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、各抗体のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用いて、精製抗体の濃度を算出した。また、調製したヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体の糖鎖を酵素消化した上で、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２（Ｗａｔｅｒｓ社製）による質量分析を行い、ＶＨａおよびＣＨａからなる重鎖ならびにＶＨｂおよびＣＨｂからなる重鎖をそれぞれ１本ずつ有するヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体になっていることを確認した。
２．Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片およびＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片の作製
実施例１６－２（２）で作製したＦａｂ型バイスペシフィック抗体断片発現ベクターをＥｘｐｉ２９３（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）によりＥｘｐｉ２９３細胞に遺伝子導入し、１６時間後にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加して、一過性発現系で抗体断片を発現させた。
ベクター導入４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）で濾過した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ樹脂（プロテイン・エクスプレス社製）を用いて抗体断片をアフィニティー精製した。洗浄液としてＤ－ＰＢＳ（－）を用いた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌに吸着させた抗体断片を、１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）により溶出し、１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を含むチューブに回収した。
次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いて濃縮し、Ｎａｐ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、緩衝液をＤ－ＰＢＳ（－）に置換した。さらに、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社製）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、該抗体断片溶液よりそれぞれＦａｂ型バイスペシフィック抗体断片の分子量に溶出する画分を分取した。ＡＫＴＡシステム孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌することにより精製抗体断片を得た。
また、実施例１６－２（３）で作製したＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片発現ベクターを用い、上記と同様の方法でＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片を得た。精製されたＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価し、重鎖の間のジスルフィド結合が還元されたＦａｂ’体の含量が低いことを確認した。
抗体断片溶液の波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、各抗体断片のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用いて、精製抗体断片の濃度を算出した。
［実施例１８］ヒトＥｐＣＡＭ発現Ｅｘｐｉ２９３細胞の作製
実施例２で得られた膜発現用ヒトＥｐＣＡＭ発現ベクターｐＥＦ６－ヒトＥｐＣＡＭ ｆｕｌｌを、Ｅｘｐｉ２９３（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）によりＥｘｐｉ２９３細胞に遺伝子導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させた。遺伝子導入後、２４時間振とう培養し、遠心分離により、細胞膜上にヒトＥｐＣＡＭが発現したＥｘｐｉ２９３細胞（以下ヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞と記載する）を得た。
［実施例１９］フローサイトメトリーによるＣＤ９５発現量解析によるヘテロバイスペシフィック抗体のＣＤ４０シグナル誘導活性の評価
Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量増加を指標として、実施例１７－１で得られたヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体の、ＥｐＣＡＭ陽性または陰性細胞共存下におけるＲａｍｏｓ細胞へのＣＤ４０シグナル誘導活性を以下のようにＦＣＭ法で評価した。
添加する被験抗体濃度を２μｇ／ｍＬ（終濃度１μｇ／ｍＬ）にし、さらにＲａｍｏｓ細胞と共培養する細胞株をＥｘｐｉ２９３細胞または実施例１８で得られたヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞に変更した以外は実施例１１と同様の方法で評価を行った。
ヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞の結果を図１３に、Ｅｘｐｉ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞の結果を図１４に示す。
図１３および図１４に示すように、実施例３で作製した抗ＣＤ４０抗体２１．４．１存在下で、Ｅｘｐｉ２９３細胞およびヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞のいずれか１つの細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合、Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量が増加しており、ＣＤ４０のシグナルが誘導されていることが確認された。
図１４に示すようにＥｐＣＡＭ陰性のＥｘｐｉ２９３細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合、ヘテロＩｇＧ型、Ｎ末端型およびＣ末端型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のいずれのクローンもＣＤ４０のシグナルを誘導しなかった。
一方で、図１３に示すようにＥｐＣＡＭ陽性のヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合には、ほとんどのＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体によりＲａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量が増加しており、ＣＤ４０のシグナルを誘導していることが示された。そのシグナル誘導活性の強さは抗ＣＤ４０抗体のＶＨおよび抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨの組み合わせにより異なるものの、同じ抗ＣＤ４０抗体のＶＨおよび抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨの組み合わせのバイスペシフィック抗体の中ではＣ末端型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体、Ｎ末端型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体、ヘテロＩｇＧ型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の順であった。
これにより、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ二価で結合するＣ末端型およびＮ末端型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体は、ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ１価で結合するヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体よりも強いＥｐＣＡＭ依存的なＣＤ４０シグナル誘導活性を有することが示された。
［実施例２０］フローサイトメトリーによるＣＤ９５発現量解析によるＦａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片のＣＤ４０シグナル誘導活性の比較
Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量増加を指標として、実施例１７－２で得られたＦａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片のＥｐＣＡＭ陽性または陰性細胞共存下におけるＲａｍｏｓ細胞へのＣＤ４０シグナル誘導活性を以下のようにＦＣＭ法で評価した。
添加する被抗体を１３３．３ｎＭ（終濃度６６．７ｎＭ）から３倍希釈系列で６点の濃度でデータを取得した以外は、実施例１９と同様の方法で評価を実施した。ヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞の結果を図１５（Ａ）に、Ｅｘｐｉ２９３細胞と共培養したＲａｍｏｓ細胞の結果を図１５（Ｂ）に示す。
図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示すように、実施例３で作製した抗ＣＤ４０抗体２１．４．１存在下で、Ｅｘｐｉ２９３細胞およびヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞のいずれかの１つの細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合、Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量が増加し、ＣＤ４０のシグナルが誘導されていることが確認された。
図１５（Ｂ）に示すようにＦａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体断片の存在下、ＥｐＣＡＭ陰性のＥｘｐｉ２９３細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合、いずれのクローンもＣＤ４０のシグナルを誘導しなかった。一方で、図１５（Ａ）に示すようにＥｐＣＡＭ陽性のヒトＥｐＣＡＭ／Ｅｘｐｉ２９３細胞とＲａｍｏｓ細胞を共培養した場合には、いずれのＦａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体断片もＲａｍｏｓ細胞上のＣＤ９５の発現量を増加させ、ＣＤ４０のシグナルを誘導していることが示された。そのシグナル誘導活性は、抗ＣＤ４０抗体のＶＨおよび抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨの組み合わせにより異なるものの、Ｆ（ａｂ’）２型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体断片の方がＦａｂ型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体断片よりも強かった。
Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片は、ヒンジ領域に含まれるシステインによるジスルフィド結合によりＦａｂ型バイスペシフィック抗体断片が２量体化した構造に類似した形状をしている。ＶＨ１とＶＨ２の組み合わせが同じ場合、Ｆａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片のアミノ酸配列は、ヒンジを除き、同一である。Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体の方が長いヒンジを有しているが、ヒンジ領域は２量体化以外に直接的な抗原への結合などの機能は有していない。そのため、ＶＨ１とＶＨ２の組み合わせが同じ場合、Ｆａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体のＥｐＣＡＭ依存的ＣＤ４０シグナル誘導活性の違いは、結合価数の違いによるものであると考えられる。
Ｆａｂ型およびＦ（ａｂ’）２型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体のＥｐＣＡＭ依存的ＣＤ４０シグナル誘導活性を比較すると、Ｆ（ａｂ’）２型ＣＤ４０－ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体の方が強かったことから、ＥｐＣＡＭ依存的ＣＤ４０シグナル誘導活性はＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ１価で結合する抗体断片よりもＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ二価で結合する抗体断片の方が強力な活性をもつことが示唆される。
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１７年１１月８日付けで出願された日本特許出願（特願２０１７－２１５８３４号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号２３－人工配列の説明：Ｌ６ ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２４－人工配列の説明：Ｌ６ ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２５－人工配列の説明：Ｌ６ ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２８－人工配列の説明：Ｒ１０６６ ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２９－人工配列の説明：Ｒ１０６６ ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３０－人工配列の説明：Ｒ１０６６ ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３３－人工配列の説明：Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３４－人工配列の説明：Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３５－人工配列の説明：Ｒ１０９０Ｓ５５Ａ ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３８－人工配列の説明：Ｒ２０８９ ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３９－人工配列の説明：Ｒ２０８９ ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４０－人工配列の説明：Ｒ２０８９ ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４３－人工配列の説明：Ｒ２１７８ ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４４－人工配列の説明：Ｒ２１７８ ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４５－人工配列の説明：Ｒ２１７８ ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５２－人工配列の説明：Ｅｐ５９ ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５３－人工配列の説明：Ｅｐ５９ ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５４－人工配列の説明：Ｅｐ５９ ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７０－人工配列の説明：３６２２Ｗ９４ ＶＨの塩基配列
配列番号７１－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号７２－人工配列の説明：３６２２Ｗ９４ ＶＬの塩基配列
配列番号７３－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号７４－人工配列の説明：ＩｇＧ４ ＣＨ１の塩基配列
配列番号７５－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号７６－人工配列の説明：ＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ ＣＨの塩基配列
配列番号７７－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号７８－人工配列の説明：停止コドンを含むＩｇＧ４ ＣＨ１の塩基配列
配列番号７９－人工配列の説明：ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体 ＣＨａの塩基配列
配列番号８０－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号８１－人工配列の説明：ヘテロＩｇＧ型バイスペシフィック抗体 ＣＨｂの塩基配列
配列番号８２－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号８３－人工配列の説明：Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体のＣＨ１－ｔａｇの塩基配列
配列番号８４－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号８５－人工配列の説明：Ｆ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体のＣＨ１－ｔａｇの塩基配列
配列番号８６－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列

Claims (30)

  1. ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインおよびＥｐｉｔｈｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体であって、
    ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインがＣＤ４０に特異的に結合する抗体（抗ＣＤ４０抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインがＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体（抗ＥｐＣＡＭ抗体）のＶＨおよびＶＬを含み、
    ＶＬが、それぞれ配列番号２３～２５で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を含むＶＬであり、
    抗ＣＤ４０抗体が、以下の（１ａ）～（１ｄ）からなる群から選ばれるいずれか１つの重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗ＣＤ４０抗体であり、
    抗ＥｐＣＡＭ抗体が、以下の（２ａ）～（２ｄ）からなる群から選ばれるいずれか１つのＶＨを含む抗ＥｐＣＡＭ抗体である、バイスペシフィック抗体。
    （１ａ）それぞれ配列番号２８～３０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
    （１ｂ）それぞれ配列番号３３～３５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
    （１ｃ）それぞれ配列番号３８～４０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、および
    （１ｄ）それぞれ配列番号４３～４５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
    （２ａ）それぞれ配列番号５２～５４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
    （２ｂ）それぞれ配列番号５７～５９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、
    （２ｃ）それぞれ配列番号６２～６４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、および
    （２ｄ）それぞれ配列番号６７～６９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ。
  2. ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ二価で結合する請求項１記載のバイスペシフィック抗体。
  3. Ｎ末端から順にＶＨ１－Ｘ－ＶＨ２－Ｙの式
    ｛式中、
    ＶＨ１は第一の抗体のＶＨを表し、
    ＶＨ２は第二の抗体のＶＨを表し、
    ＸおよびＹはそれぞれ抗体のＣＨ１を含むポリペプチド（ここでＸおよびＹの少なくとも一方はさらに抗体のヒンジ領域を含む）を表す｝
    で表されるポリペプチドを含む同一の２本の重鎖、
    および同一のＶＬを含む４本の軽鎖を有し、
    該第一の抗体および該第二の抗体のいずれか一方が抗ＣＤ４０抗体であり、もう一方が抗ＥｐＣＡＭ抗体である請求項１または２記載のバイスペシフィック抗体。
  4. 軽鎖がκ鎖である請求項３記載のバイスペシフィック抗体。
  5. 前記式におけるＸがヒトＩｇＧのＣＨ１からなるポリペプチドであり、ＹがヒトＩｇＧのＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３からなるポリペプチドである請求項３または４記載のバイスペシフィック抗体。
  6. 前記式におけるＸが配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、Ｙが配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項３または４記載のバイスペシフィック抗体。
  7. 前記式におけるＸがヒトＩｇＧのＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含むポリペプチドであり、ＹがヒトＩｇＧのＣＨ１を含むポリペプチドである請求項３または４記載のバイスペシフィック抗体。
  8. 前記式におけるＸが配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、Ｙが配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項３または４記載のバイスペシフィック抗体。
  9. ＶＬが、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬである請求項１～８のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体。
  10. ＣＤ４０アゴニスト活性を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体。
  11. ＥｐＣＡＭを発現する細胞の非存在下ではＣＤ４０アゴニスト活性を示さず、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の存在下でのみＣＤ４０アゴニスト活性を示す、請求項１～１０のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体。
  12. 第一の抗体が抗ＣＤ４０抗体であり、第二の抗体が抗ＥｐＣＡＭ抗体である請求項３～１1のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体。
  13. 第一の抗体が抗ＥｐＣＡＭ抗体であり、第二の抗体が抗ＣＤ４０抗体である請求項３～１1のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体。
  14. 抗ＣＤ４０抗体が、配列番号２７、３２、３７および４２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ４０抗体である請求項１～１３のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体。
  15. 抗ＥｐＣＡＭ抗体が、配列番号５１、５６、６１および６６のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＥｐＣＡＭ抗体である請求項１～１４のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体。
  16. ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ二価で結合し、
    前記第一の抗体が抗ＣＤ４０抗体であり、前記第二の抗体が抗ＥｐＣＡＭ抗体であり、ＶＬが配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬであり、
    前記抗ＣＤ４０抗体のＶＨが配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨであり、
    前記抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨが配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨであり、
    前記式におけるＸがヒトＩｇＧのＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含むポリペプチドであり、
    ＹがヒトＩｇＧのＣＨ１を含むポリペプチドである請求項３記載のバイスペシフィック抗体。
  17. ＣＤ４０およびＥｐＣＡＭにそれぞれ二価で結合し、
    前記第一の抗体が抗ＣＤ４０抗体であり、前記第二の抗体が抗ＥｐＣＡＭ抗体であり、ＶＬが配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬであり、
    前記抗ＣＤ４０抗体のＶＨが配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨであり、
    前記抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨが配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨであり、前記式におけるＸが配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
    Ｙが配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項３記載のバイスペシフィック抗体。
  18. 請求項１～１７のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体のバイスペシフィック抗体断片。
  19. Ｆａｂ型バイスペシフィック抗体断片またはＦ（ａｂ’）２型バイスペシフィック抗体断片である請求項１８に記載のバイスペシフィック抗体断片。
  20. 請求項１～１７のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または請求項１８もしくは１９に記載のバイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ。
  21. 請求項２０に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  22. 請求項２１に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  23. 請求項２２に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１～１７のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または請求項１８もしくは１９に記載のバイスペシフィック抗体断片を生産蓄積させ、該培養物から該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を採取することを特徴とする請求項１～１７のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または請求項１８もしくは１９に記載のバイスペシフィック抗体断片の製造方法。
  24. 請求項１～１７のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または請求項１８もしくは１９に記載のバイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断剤。
  25. ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患ががんである請求項２４に記載の剤。
  26. ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断に使用するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または請求項１８もしくは１９に記載のバイスペシフィック抗体断片。
  27. ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患ががんである請求項２６に記載のバイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片。
  28. ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患の治療剤および／または診断剤の製造のための、請求項１～１７のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または請求項１８もしくは１９に記載のバイスペシフィック抗体断片の使用。
  29. ヒトＣＤ４０およびヒトＥｐＣＡＭの少なくとも一方が関係する疾患ががんである請求項２８に記載の使用。
  30. 請求項１～１７のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または請求項１８もしくは１９に記載のバイスペシフィック抗体断片を含む、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４０の少なくとも一方を検出または測定するための試薬。
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