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JPS63209579A - 冬虫夏草の培養法 - Google Patents

冬虫夏草の培養法

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Publication number
JPS63209579A
JPS63209579A JP4339087A JP4339087A JPS63209579A JP S63209579 A JPS63209579 A JP S63209579A JP 4339087 A JP4339087 A JP 4339087A JP 4339087 A JP4339087 A JP 4339087A JP S63209579 A JPS63209579 A JP S63209579A
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JP
Japan
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cordyceps sinensis
culture
carbon source
germ
extract
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Pending
Application number
JP4339087A
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English (en)
Inventor
Ryosuke Toyama
遠山 良介
Shigeo Sasaki
重夫 佐々木
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Taito Co Ltd
Original Assignee
Taito Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は天然冬虫夏草〔コルダイセブス シネンシス(
Cordyceps 5inensis) ]とほぼ同
等の有効成分及び生理活性を有する液体培養産生物を得
ることができる、冬虫夏草菌糸体の新規な液体培養法に
関する。
〔従来の技術〕
天然冬虫夏草は、優れた生薬であることが知られている
。例えば、動物の気管支の拡張作用、マウスに対する鎮
静作用、抗菌作用等の生理活性を有する。又、主に病後
の身体の調整補益用等として臨床応用もされている。
ところが天然冬虫夏草は、虫に寄生、その子実体を形成
するもので天然には極(希にしか生育せずしかも原産地
が中国であることから、我国で不染にしかも安価に入手
することは難しい。そのため、天然冬虫夏草に含まれて
いる生理活性物質を病理薬として利用したり、あるいは
病後の身体の調整補益用として、広く用いられるには到
っていない。
そこで、近年、冬虫夏草群の菌糸体を人工培養する方法
〔特公昭61−53033:l及び人工培養物から生理
活性物質を採取する方法〔特開昭5’l−193415
1が提案されている。
しかるに、特公昭61−53033に記載の方法は、冬
虫夏草の人工増殖法にすぎず、冬虫夏草を培養すること
によって有用な生理活性物質を産生ずる方法ではなかっ
た。又特開昭57−193415に記載の方法は、特定
の冬虫夏草を用いて抗@瘍性物質を製造する方法であっ
て、冬虫夏草を人工培養することによって天然冬虫夏草
が有する有効成分及び生理活性とほぼ同等の有効成分及
び生理活性を有する産生物を得るものではなかった。
そこで本発明の目的は、天然冬虫夏草が有する有効成分
及び生理活性とほぼ同等の有効成分及び生理活性を有す
る液体培養産生物を常時、多量かつ安価に供給する方法
を提供することにある。
〔問題点を解決するだめの手段〕
本発明は、炭素源と穀類胚芽上を含有する液体培地中で
冬虫夏草菌糸体を培養することを特徴とする冬虫夏草の
培養法に関する。
以下本発明について説明する。
本発明において、培地成分としては、「炭素源」および
「穀類胚芽」を用いる。炭素源および穀類胚芽は、培地
成分として通常入手しうるちのであればいずれでもよい
「炭素源」の例とし°Cは、グルコース、フラクトース
、マルトース、シュークロース、でんぷん、糖蜜などが
挙げられる。
「穀類胚芽」の例としては、小麦胚芽、大麦胚芽、ライ
麦胚芽などが挙げられ、特に小麦胚芽が好ましい。又、
あわ、えん麦、きびそば、トウモロコシ、ひえ、なども
穀類胚芽として使用できる。
本発明においては、液体培地成分として、前記炭素源及
び穀類胚芽を含有する培地を用いることによって、天然
冬虫夏草とほぼ同等の有効成分及び生理活性を有する培
養物を得ることができる。
本発明においては、産生物の収率及び培地成分単位重量
当りの産生量を高めるという観点から、前記炭素源0.
2〜10wハ%、好ましくは4〜8w/v%及び前記穀
類胚芽0.2〜5.0W#%、好ましくは0.5〜3、
Ov/ν%を含有する液体培地を用いることが好ましい
。さらに、本発明においては、液体培地中の穀類胚芽と
炭素源の重量比を穀類胚芽1に対して炭素源1〜8とす
ることが好ましい。
より高収量で産生物を得ることができるからである。所
望により、本発明に用いる液体培地には、前記2成分に
加えて、リン、マンガン、マグネシウム、カルシウム、
鉄などの一般にカビ類の培養に用いられるミネラル成分
、ビタミン類、核酸類、アミノ酸類、澱粉、酵母エキス
、ペプトンなどのごとき他の栄養成分を適宜添加しても
良い。
本発明に用いる液体培地は、常法に従って調整すること
ができ、例えば、所定の各成分を水に添加し分散、溶解
させることによって得ることができる。得られた培地は
、常法に従って121tにて滅菌処理を施した後、冬虫
夏草菌糸体の培養に用いる。
本発明においては、不完全菌類に属する冬虫夏草、子の
う菌類に属するバラカフ菌目、バラカフ歯科冬虫夏草の
菌糸体を用いることができ、例えば表1に示す黍虫夏草
の菌糸体を用いることができる。
冬虫夏草菌糸体の培養は、前記液体培地に適当量の種菌
系を接種し、好気的条件下に行なう。通常、種菌糸の接
種量は2〜10m1/100ml培地が適当であり、1
00〜300r、p、m、の撹拌下、温度20〜30℃
、通気1110.5〜3. Ovvmの条件下で4〜l
O日間培養を行なう。
培養終了後、得られた培養物(菌糸体と培養液)は白色
〜褐色の粘性を示す液体である。味はやや甘く、不快な
風味はなく小麦胚芽等の香ばしい風味を有している。又
、得られた培養物は、天然冬虫夏草とほぼ同等の多糖類
、核酸系物質、アミノ酸等を含有する。又生理活性につ
いても抗腫瘍活性、ヒスタミンに対する作用、筋収縮力
抑制作用、利尿作用、鎮痛作用、冠拡張作用及び安全性
において、天然冬虫夏草と同等もしくはそれ以上の作用
を示す。
本発明の培養法により得られた産生物は、天然冬虫夏草
の代替物として、そのまま医薬品あるいは健康食品等と
して用いることができるほか、さらに分画等して生理活
性を有する物質を得るために用いる製造原料として用い
ることもできる。
以下本発明を実施例によりさらに説明する。
〔実施例〕
実施例1 グルコース60g1小麦胚芽15 g 5KI12P0
゜0.3  g S K2)IFO40,3g S M
gSO4・ 7H200,3gを水1βに混合溶解し、
液体培地(pH5,5)を得た。該培地を5001T1
1容の首長振盪フラスコに100mRづつ分注し、オー
トクレーブで120t30分間滅菌した。次いでポテト
デキストロース寒天培地上で成育したイサリア フエI
Jす(Isaria  felina )(^TCCN
a 26680 )及びコルダイセプス ミリタリス(
Cordyceps m1ltaris )(IFON
a 30377 )の菌糸体の約1 cdをそれぞれ滅
菌した各フラスコ中の培地に接種し、25℃7日間往復
振盪培養(145rpm 、損復幅8cm)を行った。
得られた培養産生物を常法にしたがい、乾燥菌糸体量、
残存グルコース量、菌体外生産物量、総培養生産物量を
測定しその結果を表2に示した。
表  2 菌体外生産物量=溶存固形分−残存グルコース量総培養
生産物量=乾燥閑体量−菌体外生産物量参考例1 (培
養産生物含有核酸成分の比較)市販の天然冬虫夏草を乾
燥後粉砕して得られた粉末及び実施例1で■、フェリナ
及びC,ミIJタリスを用いて得た培養産生物を凍結乾
燥し、粉砕して得られた粉末をそれぞれサンプルとした
サンプル3gを水150+nj!に浸漬し80℃、1時
間撹拌抽出を行なった。抽出濾液を常法にしたがって、
活性炭吸着処理及びアンモニア・エタノール溶液による
溶出処理を行なった。得られた溶液を下記条件の高速液
体クロマトグラフィーにより、核酸成分及びその含有量
について分析した。
結果を第1図及び表3に示した。その結果、本発明の培
養法による培養産生物中には、天然冬虫夏草と同様に5
’  IMF、5’ AMP、ウリジン、イノシン、ヒ
ポキサンチン、アデノシン、アデニンが含まれておりか
つ両者のクロマトパターン第1図及び各核酸成分の含有
率(表3)が類似していた。これらの結果は、本発明の
培養法により得られた培養産生物が天然冬虫夏草の成分
とほぼ同等であることを示す。
表  3 〔高速液体クロマトグラフィーの条件〕使用機種:島津
製作所製LC−6A カラム 5hodex Pak B−8045ma+X
500 mll+溶出液 Ao、01M  クエン酸 80.03M  リン酸二水素アンモ ニウム A→B リニアグラジェント (60分)流速  1m
β/mβ /旧型 UV(260nm) 参考例2 培養冬虫夏草の多糖成分の比較天然冬虫夏草
の乾燥粉砕物25.6 gをクロロホルト・メタノール
1:1の混液で脱脂した。次いでクロロホルム・メタノ
ールを除去後、250mβの水にけん濁させ、2時間じ
ゃ線抽出を2度行ったく抽出固形公約5g)。得られた
抽出液にエタノールを濃度36%になるまで加え、析出
した沈殿を遠心分離によって除去し、さらにエタノール
を濃度44%になるまで加えた。この時析出した沈殿を
遠心分離によって集め、再び水に溶解し、分画分子量3
.500の透析膜を用いて透析後、凍結乾燥して試料約
280 mgを得た。
一方、実施例1でC,ミリタリスを用いて得た培養ブロ
スを遠沈し、菌体を除去した。得られた上澄200m1
にエタノールを濃度23%になるまで加え、析出した沈
澱を遠心分離によって集めた。集めた沈殿を再び水に溶
解し、分画分子量3.500の透析膜を用いて透析後、
凍結乾燥して試料約100mgを得た。
各試料をそれぞれ約2 mgとり3N−硫酸で100℃
6時間加水分解した後、炭酸バリウムで中和し、遠心分
離により得た上澄をアンバーライ) I R−120B
で脱塩した。次に脱塩物を水素化ホウ禦ナトリウムで還
元し、アンバーライトIR−120Bを用いて過剰の水
素化ホウ素ナトリウムを除去しa縮乾固した。さらに乾
固物を無水酢酸−ピリジンでアセチル化し、溶媒を留去
後クロロホルト、に溶解しガスクロマトグラフィーを行
った。結果を第2図に示す。その結果、天然冬虫夏草及
び実施例10C,ミリタリスについてのタロマドグラム
は、非常に類似しており、両者の構成糖がほぼ同一であ
ることを示した。ガスクロマトグラフィーはヤナコG−
3800、水素炎イオン化検出器を用い、396ECN
SS−Mを充填したガラスカラム(3,4mmX 2.
5 rn)を使用し、キャリアガスとして窒素を50m
1/ m i nの割合で流して行った。
実施例2 グルコース3〜lO%及び小麦胚芽0.5〜2%を適宜
組合せた組成をもつ液体培地を実施例1に準じて作成し
、滅菌した。次いでポテトデキストロース寒天培地上で
成育した冬虫夏草である■。
フェリナ(l5aria felina )  及びC
,ミリタリス(Cordyceps m1ltaris
 )の菌糸体の約1 cdを、それぞれ滅菌した各フラ
スコ中の培地に接種し、25℃7日間往復振盪培養(1
45rpm %振復幅8ca+)を行った口 得られた培養産生物を常法にしたがい乾燥菌糸体量、菌
体外生産物量、総培養生産物量を測定した。■、フエリ
ナの結果を表4に、C,ミリタリスの結果を表5に示し
た。
比較例1 グルコース30g、ペプトン5g1酵素エキス5 gS
KN2PO40,3g、 K21(PO40,3gSM
gSO4・7■200.3gを水1βに混合溶解し、液
体培地(pH5,5)を得た。該培地をを用いて実施例
1と同様にして1、フエリナ及びC,ミリタリスを培養
した。培養産生物中のの乾燥菌糸体量等を表6に示す。
参考例3 実施例1に準じて液体培養を行ない、得られた培養産生
物と天然冬虫夏草の生理活性の比較を以下に示す。
実施例1と同様の方法で得た冬虫夏草培養液を10、0
00rpmで15分間遠心分離して菌体と上清に分けた
。菌体はさらに適当量の水を加え、沸騰水中で2時間抽
出を行なった。菌体熱水抽出液と培養上清を合し、濾過
後これを減圧下40℃にてロータリーエバポレーターで
濃縮し、さらに凍結乾燥を行ない試料を得た。
尚、冬虫夏草として1.アタイビコラ(I。
atypicola )  を用いた培養は、培地成分
中のグルコースを6%とし、小麦胚芽を1.5%とした
他は、実施何1に従って行った。
市販の天然冬虫夏草をミキサーで粉砕後適当璽の水を加
え沸騰水中で2時間抽出した。抽出液を濾過後前述した
方法に従い、濃縮、凍結乾燥を行な一1試料を得た。
これらの試料を用いて種々の生理活性試験を行った。
(1)  モルモット心筋に対する作用(負の変力作用
)ヘ−x メh −ヲ有t ルバートレー系モルモット
(400−450g)左心房を34℃に保温し95%酸
素、5%炭炭酸ガス台ガスを通気1、タクレlx溶ti
、 (NaC16,92g、KCi、35  g−、C
aCCO,5g、NaHCO32゜1  g S KI
I2PO<0、16 glMgSo、 178200.
29 gSGlucose2、0 g 、水lβ>10
+nj7を含むオルガンバス中に0.5gの静止張力を
与え懸垂し、発現する収縮反応が一定になった後、被験
試料を0.1%投与した。反応はフォース トランスジ
ューサー(Force transducer )(日
本光電社製)で等尺的に測定した。
収縮抑制率は、被験試料投与前の収縮に対する百分率で
算出し、表7に示す。培養抽出物はいずれも天然冬虫夏
草抽出物と同程度の作用を示した。
表  7 (2)モルモット回腸の電気刺激による収縮力抑制作用 モルモット回腸を前記(1)と同様に懸垂し、簡易型電
気刺激装置(日本光電社製)で周波数0.1Hz、時間
Q、 5m secの条件で電気刺激を与えその収縮反
応が一定するまで安定させた。その後、被験試料を0.
003%投与しその反応を測定した。反応はアイソトニ
ック トランスジコ・−サー(l5otonic tr
ansducer )(日本光電社製)により等張的に
測定した。
収縮抑制率は被験試料投与前の収縮に対する百分率で算
出し、表8に示す。培養抽出物は、いずれも天然冬虫夏
草抽出物と同程度の活性を示した。
表  8 (3)  血管に対する作用 ラットより摘出した血管(大動脈)を34℃に保温し、
95%酸素、5%炭酸ガス混合ガスを通気しtモ生理溶
液(Na1l!  6.92 g、 KCfo、35g
、NatlCO32,1g5KLPL  O,16g。
MgSO4・7H2Q O,29g、グルコース2.0
 g 。
水1fり10mβを含むオルガンバス中に懸垂後、Ca
″−1,4mMを添加し組織内へC「°の流入j=よっ
て収縮させておいた血管に被験試料載03%を作用させ
た。その時のパターンを第3図に示す。本発明の培養法
によって得られた培養物からの抽出物は、天然冬虫夏草
抽出物と同様にわずかに血管を拡張させるものであった
(4) ヒスタミンに対する作用 ハートレー系モルモット(体! 400〜450 g 
)より摘出した回腸あるいは気管連鎖標本を34υに保
温し95%酸素、5%炭酸ガス混合ガスを通気したタイ
ロード液(CaCj!20.2 glにC10,2g、
MgC1’20.1gS NaCβ8.0g、〜at(
COa 1. Og 5NaHzPOs 0.005 
g−グルコース1. Og 、水1jり20+r+7’
を含むオーガン・バス中に懸垂後、適当な濃度のヒスタ
ミンを添加した。その収縮が安定した後、被験試料0.
2%を投与しその反応を測定した。第4図に回腸を用い
たときの結果を、第5図に気管を用いたときの結果をそ
れぞれ示す。本発明の培養法によって得られた培養物か
らの抽出物は、天然冬虫夏草抽出物と同様に回腸、気管
でのヒスタミンの作用を抑えるものであった。
(5)抗腫瘍活性 試験動物は、ICR−JCL、5週齢雌性マウス(体重
20〜25g)を採用した。ザルコマ(Sarcoma
) 180 @癌細胞はマウスの腹腔内に復水型で1週
間毎に継代しているものを用いた。試験に当っては、接
種後−週間目の腹水中の腫瘍細胞をとり出し、約2X1
0’個を含有する生理食塩水0.1mj!を試験マウス
の右脇腹下部皮下に移植した。移植して24時間後に被
験試料を生理食塩水に1%の濃度になるように溶解し1
21℃15分間滅菌した溶液0.05m1をマウスの筋
肉内に投与した。対照マウスは滅菌生理食塩水を0.0
5m1同様に投与した。
@瘍移植後、30日経過してマウスを解剖し、増殖した
固型@瘍を摘出してその重量を測定することで対照群と
の比較を行なった。尚マウスは10匹を一群とした。
その結果天然冬虫夏草抽出物の抗腫瘍活性は、わずかで
あったのに対し、コルダイセブス メロラビリス(Co
dyceps memorabilis)  を用いた
培養産生物からの培養抽出物は、腫瘍抑制率71.0%
の抗腫瘍活性を示した。腫瘍抑制率は次式を用いて算出
した。
C5:対照群の平均腫瘍重量 TS:試験群   /1 (6)  マウス利尿作用 ddY雄性マウスを21時間絶食、絶水した後、0.9
%生理食塩水に懸濁した被験試料を経口投与後(50m
 l /kg) 2匹を1群として尿採取装置に入れ、
2時間内に排泄された尿をろ紙に吸着させ、尿重量を測
定した。尿重量の増加率は、次式を用いて算出した(表
9)。
A:対照群の平均尿重量 B:被験試料の 〃 この結果、本発明により得られた培養抽出物には、いず
れも天然冬虫夏草と同様の利尿作用が認められた。
表  9 (7)鎮痛作用〈フェニルキノン法) ヘンダーシElットらの方法(J、 Pharmaco
l。
εXp、 Ther、、 125,273 (1957
):l 1.:従った。
体重20g前後の雄性ddY マウス(1群6匹)に被
験試料を経口投与し、1時間後に0.02%フェニルキ
ノン溶液0.2mj!/20gを腹腔的投与し、その際
生じるストレッチ症状の回数を20分間測定した。
抑制率は次式を用いて算出したく表10)。
し C:対照群のストレッチ症状の平均回数D:被験試料群
の     〃 その結果、本発明の培養法により得られた培養抽出物は
、天然冬虫夏草抽出物、と同等かそれより高い鎮痛抑制
作用が認められた。
表  1O (8)麻酔犬冠血流増加作用 雑種成犬に30mg/kgのベンドパルビタールを静脈
内に投与して麻酔し、先後らの方法〔日本薬理学雑誌、
57巻、380ページ(1961) )に従って、左冠
動脈を潅流しその血液潰を測定した。
結果は、3μgのニフェジピン投与時の血流増加量を1
00とした時の被験試料の血流増加量の割合で示した。
また、効果の持続時間を半減期(Tl/2分)で求めた
(表11)。
その結果、本発明の培養法により(尋られた培養抽出物
は、天然冬虫夏草抽出物、とほぼ同様の弱い冠拡張作用
を示した。
表    11 ()は持続時間 (9)簡易急性毒性 ddY系雄性マウスを1群5匹とし、被験試料を30m
g/kg、100mg/kg、 300mg/kg[腔
内投与、及び100mg/kg、 300mg/kg、
1000mg/kg経口投与し、2日5日目の致死を調
べた。
結果は、表12に示す通り本発明の培養法により得られ
た培養抽出物は、天然冬虫夏草抽出物と同様に毒性は認
められなかった。
表 12 αO血小板凝集抑制活性 健康な人の血(9容量)に3.8%クエン酸ソーダ(l
容量)を混和し1000rpmで10分間遠心分離し、
上澄としてPPP (多血小板血漿)を採取した。この
PRPと被験試料を混和し、惹起物質としてADPを用
いその凝集反応をアグリブダ(東京第−科学製)で測定
した。凝集抑制率はADPのみによる凝集率に対する百
分率で算出した。
結果は表13に示す通り、本発明の培養法により得られ
た培養抽出物は、天然冬虫夏草抽出物と同程度の作用を
示した。
表  13 〔発明の効果〕 本発明によれば、天然冬虫夏草とほぼ同等の、成分及び
生理活性を有する冬虫夏草培養産生物を効率良く得るこ
とが出来る。本発明により得られた産生物は、天然冬虫
夏草の代替物としてそのままであるいは分画、又何らか
の処理をほどこして、食品、医薬品、香粧品等利用する
ことができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明の培養法により得られた培養産生物(
A図):1.フェリナ、(B図):C。 ミリタリス〕及び天然冬虫夏草(0図)の核酸成分の高
速液体クロマトグラムを示す。第2図は、本発明の培養
法により得られた培養産生物(B図)及び天然冬虫夏草
(A図)の多糖成分のガスクロマトグラムを示す。第3
図は、本発明の培養法により得られた培養産生物からの
抽出物((B図):■、アクイピコラ、(0図)二〇、
ミリタリス〕及び天然冬虫夏草抽出物(A図)の血管(
ラット大動脈)に対する拡張作用を示す。第4図は、本
発明の培養法により得られた培養産生物からの抽出物[
(B図):1.フェリナ〕及び天然冬虫夏草抽出物(A
図)のモルモット回腸におけるヒスタミン収縮に対する
作用を示す。第5図は、本発明の培養法により得られた
培養産生物からの抽出物((B図):■、フエリナ〕及
び天然冬虫夏草抽出物(A図)のモルモット気管におけ
るヒスタミン収縮に対する作用を示す。 第3図 ’C””1.4m+M

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)炭素源と穀類胚芽とを含有する液体培地中で冬虫
    夏草菌糸体を培養することを特徴とする冬虫夏草の培養
    法。
  2. (2)炭素源がグルコースである特許請求の範囲第1項
    記載の培養法。
  3. (3)穀類胚芽が小麦胚芽である特許請求の範囲第1項
    記載の培養法。
  4. (4)冬虫夏草菌糸体がコルダイセプス(Cordyc
    eps)属に属する菌の菌糸体である特許請求の範囲第
    1項記載の培養法。
  5. (5)冬虫夏草菌糸体がイサリア(Isaria)属に
    属する菌の菌糸体である特許請求の範囲第1項記載の培
    養法。
  6. (6)液体培地中の炭素源の含有量が0.2〜10w/
    v%であり、かつ液体培地中の穀類胚芽の含有量が0.
    2〜5w/v%である特許請求の範囲第1項記載の培養
    法。
  7. (7)穀類胚芽と炭素源の重量比が穀類胚芽1に対して
    炭素源1〜8である特許請求の範囲第1項記載の培養法
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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SG129276A1 (en) * 2003-04-10 2007-02-26 Auric Pacific Nutritech Pte Lt Large-scale production method for cordyceps and ganoderma
CN104350942A (zh) * 2014-10-21 2015-02-18 广西平果利华茧丝绸有限公司 一种用桑枝蚕蛹粉制备虫草菌丝体的方法

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