JPS62191765A - 凝集性結合試薬を用いた不均一系特異的結合試験方法及び不均一系イムノアツセイ法並びにその試験キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 本発明は、液状試験媒体中の分析対象物の測定に有用な
特異的結合試験（例えばイムノアッセイ）に関する。特
に、本発明は、標識試薬の「結合」体及び「遊離」体を
生成した後、それらを互いに物理的に分離して試験を完
了することを伴う、水性試験媒体中に存在すると思われ
る分析対象物の量を測定するための不均一系特異的結合
試験に関する。

（先行技術の説明） 結合試験反応において結合に関与する物質の１つを直接
固定化するための固定化された又は固足止され得る材料
、例えば固定化抗原又は抗体を用いて、標識試薬の結合
体及び１６体の所望の分離を行なう各種の結合試験が、
今まで提案されている。特に、多数のそのような結合試
験が述べられており、そこでは、検出される抗原に対す
る抗体が試験管の内壁又はプラスチックビーズのような
固定用材料に結合せしめられている。

例えば、米国特許第４．２４３．７４９号には競合的結
合試験が開示されており、そこでは、測定すべきハプテ
ンに対する特異的抗体を管内壁に不溶化又は固定化して
具備する試験管内で反応が行われる。上記反応には標識
化ハプテン複合体が関与する（ここにおいて試験管の壁
に結合する標識化ハプテン複合体の量が測定すべきハプ
テンの量と反比例する）。

そのような結合試験は別に、米国特許第４．２３０，６
８３号に記載され、抗原又は抗体が結合している６ｙａ
Ｉ１１のポリスチレンビーズを用いる方法を開示してい
る。ここにおいては、抗原又は抗体を該抗原又は抗体に
対するハプテン結合抗体と反応させ、結合したハプテン
結合抗体を、更に標識された抗ハプテン抗体と反応させ
、試験試料中の抗原又は抗体の量を測定する。

そのような結合試験はまた別に、米国特許第４．２２８
，２３７号に記載され、これは特異的結合工程に酵素標
識アビジン及びビオチン標識試薬を用いて、液体媒体中
のリガンドの検出及び測定を行うための方法を開示して
いる。この方法では、検出すべきリガンドが、そのリガ
ンドに対する特異的結合性物質を含有する不溶性の相と
接触せしめられる。

上記の直接固定化技術に加えて、結合試験反応に関与す
る固定化すべき物質を第１の結合性物質によってマーキ
ング又は？ｉ識し、次に固定化された第２の結合性物質
を加える間接固定化が提案されている。

例えば、米国特許第４．２９８．６８５号は酵素イムノ
アッセイを開示しており、そこでは測定すべき生物学的
物質を含有する試料を、ビオチンで標識された、該生物
学的物質に対する抗体並びに、測定すべき上記物質の酵
素標識体と混合する。次にアビジンの固定化体を添加し
、そこでアビジンがビオチン標識抗体に結合して酵素標
識試薬の抗体結合フラクションを固定化する。同様に、
英国特許願第２，０８４，３１７号は固体材料に結合し
たアビジン及びビオチン標識抗原を用いる抗原と連結し
た競合的酵素イムノアッセイを開示している。

したがって、本発明の目的は、遠心工程や、上記のよう
な、分析対象物の量を測定する前に固定化複合体を反応
溶液から分離するための同様に複雑で煩雑な分離技術を
必要としない１滴状試験媒体中の分析対象物を測定する
ための特異的結合試験法を提供することである。

更に、本発明の目的は、固定化され得る成分を析出せし
めるに必要な結合物質の砥が最少となるように、測定す
べき結合相手の分子を２個以上それ自体に結合せしめて
有する固定化され得る成分を提供することである。

本発明の別の目的は、表面積が拡張されたすなわち結合
相手の結合可能性が増大された特異的結合試験反応用の
固定化され得る成分を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、特異的結合反応が起きた後
さらなるすすぎ又は洗浄工程の必要がなく反応容器内で
行なうことができ、試験媒体中の分析対象物の量の測定
に反応溶液の少量のアリコートしか必要としない特異的
結合試験を提供することである。

［発明の概要］ 本発明は、液状試験媒体中の種々の生物学的物質の検出
に応用することができ、最少数の工程で行なうことがで
きる。簡易化された不均一系特異的結合試験法を提供す
る６本発明の試験法は遠心工程又はそれと同様の複雑な
工程を感型とせず、単一の反応容器内で行なわれる。反
応混合物は試験媒体と本発明の試験試薬を一緒にするこ
とにより形成されるが、本発明の試験試薬は、（１）試
験媒体中の分析対象物の量の関数としての標識試薬の遊
離種及び結合種を形成する、標識抗分析対象物のような
標識試薬、並びに（ｉｉ）標識試薬の遊離種又は結合種
のどちらか一方に結合することにより最終的に固定化標
識試薬を形成し、それによって固定化標識試薬を固定化
されていない標識試薬から分離することができる、固定
化され得る成分を含んでいる。

本発明では、固定化され得る試薬を使用したことが改良
点であり、上記試薬は固定化される標識試薬の遊離種又
は結合種のどちらか一方の結合相手と第１の結合性物質
の両方をそれ自体に結合せしめて有する水分散性の凝集
性支持材料からなる。

固定化標識試薬は反応混合物に第２の結合性物質を添加
することにより形成される（ここにおいて、第２の結合
性物質は第１の結合性物質に対し結合性親和力を有する
）。このようにして第２の結合性物質が、第１の結合性
物質と第２の結合性物質との結合の結果として支持材料
を凝集させ、それによって支持材料の沈殿した複合体を
含む１つのフラクション及び固定化されていない標識試
薬を含む別のフラクションが生じる。どちらかのフラク
ションの標識試薬における標識の量を測定し、試験媒体
中の分析対象物の量に関係づけられる。

本発明はまた、多量の標識試薬、固定化され得る試薬、
固定化され得る試薬に対する特異的結合性物質及び必要
に応じて、試験媒体中の分析対象物の量に比例して検知
可能な信号を与える指示薬を含む試験キットを提供する
。

［好ましい実施態様の説明〕 本発明の特異的結合試験方法は、ラジオイムノアッセイ
及び不均一系酵素イムノアッセイのような従来の不均一
系特異的結合試験法に適用される。そのような試験を行
なうための試験試薬は種々に異なる形態を取ってよいが
、一般的には、（１）検出される分析対象物、（２）分
析対象物に対する特異的結合相手及び（３）分析対象物
の結合相手と同一でも異なっていてもよい標識試薬から
なっている。一般に試験試薬は、同時に又は逐次混合さ
れるが、ここにおいて結合度が、存在する分析対象物の
量の関数であるように、標識試薬がそれに対応する結合
相手に結合する。通常、結合種と遊離種が互いに物理的
に分離され、そのいずれかのフラクションに存在する標
識の量は、使用される特定の標識の活性を測定すること
により決定される。

結合反応系を形成する当業界で利用できる種々の方法に
従って、本発明の方法を実施することができる。そのよ
うな方法としては競合的結合技法、「サンドイッチ」技
法及びイムノアッセイ法（免疫学的測定方法：　ｉｍｍ
ｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）として知ら
れているものが挙げられる。これらすべての不均一系に
よるイムノアッセイ法において、標識試薬の遊離種及び
結合種の分離は通常そのような種のどちらか一方を固定
化することにより行なわれる。したがって、本発明の改
善された固定化工程をそのような公知方法に有利に適用
することができる。

本発明に適用される際、競合的結合技法の反応混合物を
形成する試験試薬は、（１）検出すべき分析対象物、（
２）通常、検出すべき分析対象物又はその特異的結合類
縁体の標識体である標識試薬及び（３）検出すべき分析
対象物の固定化され得る凝集性結合相手を含む。特に、
第１図によると、検出すべき分析対象物（ｒＡｎＪとし
て示す）及び標識試薬（ｒＡｎ攻」で示す）は凝集性結
合相手［Ａ　ｂ−Ｂ１（ａｇｇｒ、　）　Ｊとして示す
］への結合について競合し、ここにおいて凝集性結合相
手に結合しない標識試薬はいずれも「遊離」種であり、
凝集性結合相手に結合した標識試薬は「競合」種［ｒＡ
ｎ零：Ａｂ−Ｂ。

（ａｇｇｒ、　）　Ｊとして示す］である。以下で更に
詳しく説明するように、凝集性結合相手を、第２の結合
性物質（「Ｂ２Ｊとして示す）に結合性親和力を有する
第１の結合性物質（ｒＢＩＪとして示す）と会合せしめ
て、第２の結合性物質を反応混合物に添加した時に、第
１の結合性物質と第２の結合性物質との結合の結果「結
合３種が凝集することにより、ｒｉｆｉ［」種より容易
に分離できる固定化沈殿物（ｒ　Ａ　ｎよ：　Ａ　ｂ−
Ｂｌ（ａｇｇｒ、）　　：Ｂ２Ｊ　として示す）か形成
される。

「サンドイッチ」技法に用いられる試験試薬は、標識試
薬の性質を除いては、競合的結合技法に用いる試薬と同
様のものである・特に・　ここで第２ｒＡによると、標
識試薬は検出される分析対象物のための第２の結合相手
の標識体（ｒＡｂ＊Ｊとして表わす）であり、ここにお
いて第１の固定化され得る結合相手［ｒＡ　ｂ−Ｂ＋　
　（ａｇｇｒ、　）　Ｊとして示す］及び第２の標識結
合相手、更にその間に「サンドイッチ状」に挟まれた検
出すべき分析対象物（ｒＡｎ４として示す）とからなる
複合体［ｒＡｂ攻：Ａｎ：Ａｂ　　Ｂ１　（ａｇｇｒ、
）として示す］が形成される。複合体になる第２の標識
結合相手は「結合」種と呼ばれ、この「サンドイッチ状
」複合体の一部分ではない第２の標識結合相手は、「遊
離」種である。第２の結合性物質（ｒＢ２Ｊ　として示
す）を反応混合物に加えると、「結合」種が凝集し、そ
れによって固定化沈殿物（ｒＡｂ＆　：Ａｎ：Ａｂ−Ｂ
、−（ａｇｇｒ、）二Ｂ２」として示す）となった後、
「遊離」種より分離される。

ここで第３図によると、特に好ましい免疫学的７１＋１
定技法では、標識試薬（ｒＡｂ＊Ｊとして示す）は、抗
分析対象物（例えば検出すべき分析対象物に対する抗体
又はそのフラグメント）の標識体であり、検出される分
析対象物に加えて、検出すべき分析対象物の固定化可能
体［ｒＡｎ　　Ｂ１（ａｇｇｒ、　）　Ｊとして示す）
が結合反応系に含まれる。一般に、標識抗体（Ａｂｔ）
は検出すべき分析対象物又は検出すべき分析対象物の固
定化可能体のいずれか一方に結合し、固定化され得る複
合体［’Ａ　ｂ”　：　Ａ　ｎ−１３，（ａｇｇｒ、　
）　Ｊとして示す）を形成する。ここで分析対象物に結
合した標識抗体を「結合」種と呼び、固定化され得る複
合体を「遊離」種と呼ぶ。第２の結合性物質（ｒＢｚ　
Ｊとして示す）を添加すると、「遊離」種が凝集し、そ
れによって固定化沈殿物（ｒＡ　ｂ本：　Ａ　ｎ−Ｂ１
　　（ａｇｇｒ、　）　：　Ｂ２　Ｊとして示す）とな
った後、「結合」種から容易に分離される。

免疫学的測定技法では、本発明に適用する際、標識試薬
又は標識抗分析対象物が、試験媒体中に存在すると思わ
れる分析対象物の推定量又は推定濃度に対し、過剰量、
反応混合物中に存在する。標識試薬が試験媒体中に存在
すると思われる分析対象物に結合するので、過剰量の標
識試薬が、試験媒体中に存在すると思われる分析対象物
に充分な数の結合相手を用意し、そのため存在すると思
われる実質的にすべての分析対象物に標識試薬が結合す
る、即ち「結合」種となる。過剰の標識試薬が結合する
ことにより、試験媒体中に存在すると思われる実質的に
すべての分析対象物を検出可能にするので、正確で、感
度の高い、分析対象物の測定が行なわれることがわかる
。

同様に、検出される分析対象物の固定化可能体は、標識
試薬が結合しておろず、反応混合物中でｒＭＩｉ１種と
して残存する標識抗分析対象物の「遊離」体の量に対し
過剰量１反応混合物中に存在する。したがって、分析対
象物の固定化可能体の過剰量は、＠終的な固定化及び「
結合１種からの実質的にすべてのｒＮＬ＃」種の分離の
ために、標識抗分析対象物の実質的にすべてのｒ：ａｆ
ｌｌ」種と結合するに十分な量が存在することである。

因に、固定化を行うことにより実質的にすべての「遊離
」種を「結合」種から分離するために、十分な量の第２
の結合性物質を存在せしめて実質的にすべての「遊離」
種の、凝集された固定化体が形成されるように第２の結
合性物質を反応混合物に加える。

過剰量の試薬の使用により、動力学的及び平衡状態にお
ける利点が良好に得られる。特に過剰量の試薬が結合反
応の動力学を促進し、それによって反応の平衡が移動し
て、分析対象物の温度が低くても結合種の形成を助ける
。対照的に、競合的試験の方式は特定の試薬抗体を必要
とする。免疫学的測定の方式では、試験の特定の試薬は
抗原（又はハプテン）それ自体になる。したがって、試
験試薬が過剰量であるため、試験性能についてのその濃
度変化による影響は、従来の競合的試験の方式で見られ
るものとｉｔ　較して小さく、それによって試薬添加の
誤差限界は、少なくとも過剰量で添加された場合には許
容される。

上記のように平衡を移動することにより、背景信号、そ
して更には試験の感度に影響を与える非結合標識の量を
低減させることもできる。同様に、単一抗体の免疫学的
測定方法を用いる場合、非特異的結合の存在により、２
つの抗体結合反応が伴い、固定死相に結合した標識を測
定するサンドイツト型イムノアッセイで見られるような
試験の感度を低下させる背景信号が生じない、単一抗体
の免疫学的測定方法は、サンドイツト型試験では実用不
可能な単−二ビトープ（ｅｐｉｔａｐｅ　）を有する分
析対象物の検出に用いることも可能である。更にまた、
過剰量の一価のモノクローナル抗体を過剰量のその他の
試験試薬とともに試験に使用する場合、そのような試験
方式の、好都合な検量過程への適用を容易にする用量応
答直線が得られる。

本発明の教示により、以下に更に詳細に述べるように、
添加の順序が異なりまた結合反応方式が異なる操作技法
を１本発明の教示から逸脱しない範囲で不均一系による
特異的結合試験を行なうために開発し得ることがわかる
。

更にまた、本発明は特異的結合相手が存在するいかなる
分析対象物の検出に適用でき、また逆に液状媒体の分析
対象物の結合能（通常媒体中の分析対象物の結合相手の
存在によって）の測定にも適用できる０分析対象物は通
常ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、炭水化物、糖蛋白
質、ステロイド、核酸又はその他の有機分子であり、そ
れらの特異的結合相手は生物系に存在するか又は合成す
ることができる。相関的に言うと、分析対象物は通常、
抗原とそれに対する抗体；ハプテンとそれに対する抗体
；並びにホルモン、ビタミン、代謝物質及び薬剤とそれ
らの受容体及び結合性物質からなる群より選ばれる。特
異的結合相手が存在するその他の分析対象物及び／又は
結合対成分としては、炭水化物とレクチン；金属とキレ
ート化剤；蛋白質Ａに対し無損傷結合部位を有する抗体
又はそのフラグメントと蛋白質Ａ：相補的な一本鎖オリ
ゴヌクレオチド配列とポリヌクレオチド配列；補因子又
は補欠分子族とアポプロティン（ａｐｏｐｒｏｔｓｉｎ
）　；効果器分子（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌ
ｅ）／受容体対；疎水性の相互作用性物質の対；酵素補
因子と酵素：高分子酸と塩基；染料と蛋白質結合剤；ペ
プチドと特異的蛋白質結合剤；　（例えばりボヌクレア
ーゼ、Ｓ−ペプチド及びリボヌクレアーゼＳ蛋白質）；
酵素抑制剤（可逆性及び不可逆性）と酵素等が挙げられ
る０分析対象物は通常、抗体、抗原性ポリペプチドもし
くは蛋白質のような、分子量が１．０００からｔｏ、ｏ
ｏｏ、ｏｏｏの免疫学的に活性なポリペプチド、蛋白質
、炭水化物もしくは核酸、又は分子量が１００から１，
５００のパブテンである。

更にまた、標識試薬としては従来の検出可能な化学基が
挙げられる。そのような検出可能な化学基は、検知可能
な物理的又は化学的性質を有していればいかなる材料で
もよい。そのような材料はイムノアッセイの分野では十
分開発されており、一般にそのような方法に有用であれ
ばいかなる標識も本発明に適用することができる。

酵素［臨床化学（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｒｒ、　）　　（
１９７６）２２：１２４３参照］、酵素基質（米国特許
第４．４９２，７５１号参照）、補欠分子群又は補酵素
（米国特許第４．２３０．７９７号及び４．２３８，５
６５号参照）、及び酵素抑制剤（米国特許第４，１３４
，７９２号参照）；スピン標識；蛍光体（臨床化学（１
９７９）２５　：　３５３参照）−発色団；化学発光体
及び生物発光体のような発光体（米国特許第４．３８０
，５８０号参照）；特異的結合性リガンド（例えば、ビ
オチン及びハプテン）；電子活性種；並びに３Ｈ１３５
Ｓ、３２ｐ、１２５工及び１４ｃノようなラジオアイソ
トープのような酵素的に活性な基が特に有用である。そ
のような標識及び標識対は、それら自体の物理的性質（
例えば、蛍光体、発色団及びラジオアイソトープの）又
はそれらの反応性又は結合性（例えば、酵素、基質、補
酵素及び抑制剤の）に基づいて検知される。

本発明の教示によると、結合試験の反応混合物は試験媒
体と、標識試薬及び固定化され得る試薬を含む試験試薬
とを合わせることにより形成される。標識試薬、好まし
くは標識抗分析対象物、又は更に具体的には検出される
分析対象物の抗体の標識された一価の抗体フラグメント
は、試験媒体中の分析対象物の量の関数として遊離種及
び結合種を形成する。

更に具体的には、固定化され得る試薬としては、固定化
される標識試薬の遊離種及び結合種のどちらか一方の結
合相手と、固定化され得る試薬がそれによって標識試薬
のＴＬ遊離種び結合種のどちらか一方に結合する第１の
結合性物質の両者が挙げられる。このようにして、以下
で更に詳しく述べるように、固定化され得る標識試薬が
形成され、これは固定化されなかった標識試薬から最終
的に分離される。

固定化標識試薬は、第２の、二価又は多価の結合性物質
を反応混合物に加えることにより形成され、ここにおい
て、第２の結合性物質は第１の結合性物質に対する結合
性親和力を有する。したがって、第２の結合性物質は、
第１の結合性物質と第２の結合性物質との分子間又は粒
子間の結合の結果として支持材料を凝集させ、ここにお
いて、非固定化標識試薬を含むフラクションと固定化標
識試薬からなる、沈殿した支持材複合体を含むフラクシ
ョンが形成される。

ウ　され・　−・ 本発明の固定化され得る成分又は試薬は、水分散性で凝
集性の支持材であり、反応溶液中で凝集又は沈殿するよ
うになっており、それによって標識試薬の結合種及び遊
離種の所望のどちらか一方を分離する役割を果たしてい
る。支持材は水溶性材料でも水懸濁性の不溶性の材料で
あってもよい。

水懸濁性の不溶性材料の場合、高分子微粒子、好ましく
はプラスチックビーズを使用する。木発明者らは、米国
特許第４．２３０．６８３号に開示されている６ＩＩＩ
１１ビーズのような巨大粒子を使用すると、混合が必要
となる可能性と同様に表面積が限られるという問題が生
じることを見出した。

一方では、表面積の増大及び支持材料との相互作用の増
強は、小型の、即ち直径５０ミクロン未満のビーズによ
り達成されるが、依然として、特に直径３ミクロン未満
の粒子では、凝集を生ゼしぬるために遠心工程を必要と
する分離工程が必要である。同様に、ラテックス凝集試
験において、従来の分析対象物／抗体結合反応では、分
離を行なうために凝集せしめることが必要である。した
がって、本発明は、好ましい実施態様において、遠心又
は同様に複雑な分離技法の必要がなく結合種と遊離種と
が分離されるように、適切な第２の結合性物質の添加時
にビーズの沈殿性を増強する、本発明の第１の結合性物
質をそれ自体に結合せしめて有する、直径が５０ミクロ
ン未満のプラスチックビーズ又は微小球を提供すること
により、この問題を解消する。

好ましくは、本発明に従って用いられるビーズの性質は
、乳化重合又は懸ｒＡ重合により製造される。各粒子の
大きさがそれぞれ直径が５ミクロン未満又は直径が５ミ
クロンより大きい均一なラテックス粒子である。また、
直ｆＭ　２−２０ミクロンの粒径は「膨潤乳化重合」［
し、パンゲス（Ｂａｎｇｓ）著、「均一ラテックス粒子
（Ｕｎｉｆｏｒｍｌａｔｅｘ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、
セラゲン社（Ｓｅｒａｇｅｎ　Ｉｎｃ）。

１９８４年］により効果的に得られる。

また、その他の粒子材料を凝集性支持材料として使用す
ることができ、例えば架橋デキストラン又はアガロース
のような多糖類、ゴム、ガラス、ナイロン及びポリアク
リレートで作られた粒子材料が挙げられる。同様に、カ
ルボキシル化されたポリスチレン、ポリビニルトルエン
又はスチレンブタジアミンの共重合体、ポリアクロレイ
ン微小球、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）
粒子、花粉粒子、及びメタクリル酸ポリグリシジル、微
結晶質セルロース又はそれらの混合物の皮殻で囲まれた
ポリアクリルアミド、スポロポレニン、ポリスチレン又
はポリビニルナフタレン等の核から粒子を製造すること
ができる。

本発明に従って使用されるビーズ又は微小球は上記のよ
うに製造することができるが、直径０．３８〜２０ミク
ロンの広範囲な微小球が市販されており、それらは微小
球の表面に試薬を共有結合させるための多数の官能基、
例えばアミン。

カルボキシ、イミノ等を有している。

水溶性材料の場合には、適切な重合体が使用される。同
様に、上記重合体は遠心又は同様に複雑な分離技法の必
要がなく結合種と遊離種とが分離されるように、適切な
第２の結合性物質の添加時に重合体の沈殿性を増強する
、本発明の第１の結合性物質をそれ自体に結合せしめて
有する。

好ましくは、そのような重合体材料はポリアラニン、ポ
リリシン等のようなポリアミノ酸の共重合体である。そ
の他の重合体としては、デキストラン及びその他の多糖
類、蛋白質、ポリ核酸（一本領のＲＮＡ又はＤＮＡ）、
二本鎖のＤＮＡ及びポリエチレンアミンが挙げられる。

更に誘導体化可能な重合体としては、ポリビニルアルコ
ール、ポリアリルアルコール、ヒドロキシエチルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルセルロース及びその他の天然
及び合成の水溶性重合体が挙げられる。

アガロース及びポリアクリルアミド類へのハプテン及び
その他の生物分子のカップリングの具体例は、クアトレ
カサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）による、”Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　”　２４５巻、３０５９−３
０６５頁（１９７０）；並びに讐、Ｂ、ヤコビ−（Ｊａ
ｃｏｂ２）及びに、ウィルチｘ　’７り（Ｗｉ　１ｃｈ
ｅｋ）による、“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　”　、　３４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ、ニューヨーク、１９７４に記載されている。これ
らの方法を用いて、分析対象物（ハプテン）又は結合相
手を重合体又はビーズの試薬に共有結合させることがで
きる。更に、例えばガラス及びプラスチックのビーズに
よる不溶性キャリアへの物理的吸着を用いることができ
る。

固定化され得る成分に結合した、標識試薬の遊離種及び
結合種のどちらか一方の結合相手は、好ましくは検出さ
れる分析対象物又は結合性類縁体又はその結合相手であ
ることがわかる。したがって、固定化され得る結合相手
は標識試薬に対し結合性親和力を有し、それにより、結
合相手への標識試薬の結合の結果、標識試薬の遊離種及
び結合種の所望のどちらか一方の固定化可能体が生じる
。このようにして、固定化され得る成分の沈殿時に、所
望の種がその結合相手を介して固定化され得る成分に結
合した結果として、遊離種及び結合種の所望のどちらか
一方が他方の種から分離される。

更にまた、固定化され得る支持材の利点の１つは、第１
の結合性物質の複数の分子と同様に複数の結合相手の分
子がそれに結合することができることであることがわか
る。その結果、標識試薬の遊離種及び結合種の所望のど
ちらか一方の種の複数の分子を固定化して大量処理効果
の結果、結合反応を促進することができる。同様に、支
持材に結合した第１の結合性物質の複数の分子は、反応
溶液への第２の結合性物質の添加時に１つの支持材料が
多数の支持材料と結合することを可能にすることによっ
て、支持材複合体の凝集及び沈殿を促進する。

止叉ｍ潴澄ｊＩ と記のように、本発明の固定化され得る成分又は支持材
料は、反応溶液への第２の結合性物質の添加後の支持材
複合体の凝集及びそれに続く沈殿にとって必須部分であ
る第１の結合性物質を含む。第１の結合性物質に対し二
価又は多価の結合性親和力を有する第２の結合性物質は
、第１及び第２の結合性物質の間の相互作用の結果とし
て、複数の支持材料を互いに結合させ、それによって支
持材料の沈殿可能な複合体を形成する。

本発明の教示によると、第１及び第２の結合性物質の性
質は結合性物質のいかなる特定の対にも限定されないこ
とがわかる。因に、多数の結合性物質の対を支持材料の
凝集に使用することができる。そのような結合性材料対
としては、ビオチンとアビジン、ハプテン又は抗原と抗
体の対、レクチンと炭水化物の対、−末鎖ポリヌクレオ
チドの相補鎖多酸及び多塩基の対等が挙げられる。適切
な対の選択により、支持材料に結合した結合相手に結合
する標識試薬の凝集反応に対する特異的結合（例えば免
疫化学的）反応の割合を部分的に制（２１することがで
きる。

本発明の第２の結合性物質は、可溶体でも不溶体であっ
てもよい。第２の結合性物質が不溶体である場合、第２
の結合性物質は、プラスチックビーズ又はポリスチレ試
験管の内壁のような固体支持構造上に不溶化又は固定化
される。このようにして、反応混合物からの凝集性支持
材料の除去が増強される。

跨験まユニ 本発明の試験試薬は市販用に包装された形で、試験具の
構成中の、試薬としての相溶性の許す範囲の組成物もし
くは添加物として、又は試験キット、即ち必要な試薬を
入れた１つ以上の容器を組み合わせた包装品として供さ
れる。試験試薬には所望の結合反応系に適する試薬が含
まれる。試験試薬としては更に、緩衝剤、稀釈剤、標準
物質等のような、使用者の見地から試験に有用であるこ
とが知られているその他の材料が挙げられる。特に好ま
しいものは、（１）標識抗分析対象物、（２）プラスチ
ックビーズ又は水溶性重合体のような支持材料に第１の
結合性物質及び分析対象物又はその結合性類縁体を結合
せしめてなる水分散性の凝集性試薬、及び（３）特定の
第１の結合性物質に結合性親和力を有する第２の結合性
物質からなる、本発明の不均一系特異的結合試験用の試
験キットである。好ましい試験キットで使用される特異
的標識は上文で述べたように、用いる方法により決定さ
れる。好ましい実施態様において、標識は酵素であり、
試験キットは更にそのような酵素の活性に応答して色変
化を示す指示薬を含む。そのような指示薬は、試験片（
試験片を反応混合物の上澄に浸漬するか又は試験片に上
澄のアリコートを施すことができる）の形における固体
キャリアマトリックスに包含せしめることにより標識試
薬の非固定化種の検出に好都合な手段を提供することが
できる。

ここで、次の実施例により本発明を説明するが、本発明
はそれらにより制限されるものではない。

実］ｌ随ユ 酵素標識抗体の調製 抗ジゴキシン抗体（約６　ｒａｇ／　ｍＬ）を含有する
腹水症液を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３、５）で５
倍に希釈し、１　：　５０　（ｗ／ｗ）のペプシン／抗
体溶液により３７°Ｃで４８時間インキュベートした。

アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＰＭ　３０膜［米国、マサ
チューセッツ州、ダンバースのアミコン社（Ａｍｉｃａ
ｎ　Ｃａｒｐ、）　］を用いた限外濾過により約５−に
濃縮後、試料をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　）
Ｓ−３００［米国、ニューシャーシー州、ビスキャタウ
ェイのファルマシア社（Ｐｈａｒ＋５ａｃｉａＩｎｃ、
）　］　カラム（２、４Ｘ９０ｃｍ）−ヒでゲル４濾過
し、１０ｍＭリン酸ナトリウムと０．１５Ｍ塩化すトリ
ウム（ｐＨ７、２）で平衡化せしめ、抗体のＦ（ａｂ’
）２フラグメントを単離した。抗体を１１０ｆｆ１のジ
チオトレイトールで還元し、Ｇ６ＰＤポリアクリルアミ
ドゲル上で脱塩した後、活性化されたβ−ガラクトシダ
ーゼとの反応の直前に蛋白質ピークをプールした。β−
ガラクトシダーゼ［ＩＸ型、米国、ミズーリ州、セント
ルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、）　］を５０Ｈのリン酸すトリウム（ｐＨ
７、４）に対し透析した。１０ｍｇ／ｍＬの溶液を、複
素二官能性架橋剤、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジルと室温で
２時間反応すせ、ｌＸ６０ｃｍのＧＢＰＤカラムにこの
材料を通過させた。活性化されたβ−ガラクトシダーゼ
を抗体と１：１の比で混合し、４°Ｃで２００時間反応
せた。この材料をアミコンＰＭ３０膜を用いた限外ｔｐ
過で濃度が約１０倍となるように濃縮した。この濃縮物
を１．５Ｘ１１０ｃｌＩｌのＡＣＡ２２樹脂［米国、メ
リーランド州、ガイサースバーグのＬＫＢインスッルメ
ンツ社（ＬＫＢＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、）］
を通過せしめ、Ｌｉｌ＆抗体フラグメント（Ｆａｂ）、
及びＦａｂとβ−ガラクトシダーゼとの高置換オリゴマ
ーからＦａｂ−β−ガラクトシダーゼを分離した。主要
な酵素／抗体フラクションをプールし、固定化されたウ
アバインを含有するアフィニティーカラム北を通過させ
た。固定化ウアバインカラムを調製するために、スミス
（Ｓｍｉｔｈ）等［Ｂｉｏｃｈｅ！１．９　＋　３３１
−３３７　（１９７０月によって記載されている方法と
同様にして、ウアバインを牛血清アルブミンに連結させ
た。先に述べた方法［Ｎ、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）
及びナカネ、Ｐ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２，１７１−１８１．（１９７６）
］による過ヨウ票酸酸化後、ウアバイン−ＢＳＡをセフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ＠　）　Ｇ　−２５［米
国、ニューシャーシー州、ビスキャタウェイのファルマ
シア社］に連結させた。親和性樹脂の１×１０ｅ１ｍカ
ラムにＦａｂ−β−ガラクトシダーゼを含有する試料を
通過させた。遊離β−ガラクトシダーゼをカラムから溶
離し、次に２０ｍＭのウアバインを含有する溶離溶液に
よりカラムより抗体−酵素複合体を放出せしめた。５本
のカラムの内容物を洗浄し、プールした。プールを２Ｉ
ＩＬに濃縮し、リン酸ｊｎ食塩緩衝液（５０ｍＭリン酸
ナトリウム、０．１Ｍ１ｆ！化ナトリウム、ＰＨ７，４
）を１０回交換しながら２０時間透析した。

笈癒誇」 ビオチニル化された（ジゴキシン）−ポリスチレン微小
球の製造 （ａ）アミン誘導体化されたポリスチレンビーズ［０，
５−のポリビーズ−アミノ微小球、米国、ペンシルバニ
ア州、ウアーリントンのポリサイエンシス社（Ｐｏｌｙ
ｓｃｉｅｃｅｓ　Ｉｎｃ、）　］の懸濁液（２，５％固
体）と０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐ）１７　、４）中
の６−（ビオチンアミド）へキサン酸スルホスクシンイ
ミジル［米国、イリノイ州、ロックフォードのピアスケ
ミカル社（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅＩＩｉｃａｌ　Ｃｏ、）
　］とを２−３℃で２時間反応させて、ビーズ１個につ
き約１０個のビオチンを結合させた。０．２Ｍのリン酸
ナトリウム（ｐＨ７，４）を含有する透析物緩衝液を５
回交換してポリスチレンビーズを透析した。

（ｂ）共有結合したジゴキシン誘導体を製造するにあた
っては、１００ｍｇのジゴキシンをモル当量１：１にて
ｌｏｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム中で３０分反応さ
せた。次にこの試薬の１部分を（ａ）で得られたビオチ
ニル化されたビーズに加え、室温で２時間反応させた。

次にこの反応のシック塩基生成物を２倍の過剰量のシア
ノポロハイドライドで還元し、得られた生成物を０．０
５Ｍリン酸ナトリウム及び０．１Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ７、４）で緩衝液を変えながら１２時間かけて透析し
た。

笈亙皇」 酵素検出試薬片の製造及び試験具の組立ホワットマン（
Ｗｈａｔｍａｎ）　５４ン戸紙［米国、ニューシャーシ
ー州、クリ７トンのホワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ　
Ｃｏ、　）　］を１１５ｍの基質、０−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトースを含有する溶液に短時間浸した
後、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する０、３Ｍビシン（ｂ
ｉｃｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７、８）中に浸漬し、５０°
Ｃで１５分間乾乾燥た。基質を包含する乾燥したか紙を
両面接着テープ［米国、ミネソタ州、七ンＩ・ポールの
スリーエム社（３ＭＣｏｍｐａｎｙ　）　］　　ヒに積
層し、幅１ｃｌｌ＋、長さ１２．７０ｆｆｌのリボン状
に裁断した。リボンを、次に、幅８．３ｃｍ長さ１２．
７ｃｍの透明なポリスチレン支持体〔トリサイト（Ｔｒ
ｙｃｉｔｅ■〕、米国、ミシカン州、ミツトランドのダ
ウケミカル社（ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製］
の片面の長手方向に沿って端部よりｈインチ（０、６３
５ｃｍ）のところに積層し、検出層をその端部に固定さ
れて有する幅０．５ｃｍ長さ８．３ｃｍの試薬片に切断
した。

火玉■」 試験の性能及び試験具の操作 （ａ）試験を開始するにあたっては、 ０．０５Ｍビシン（ｐＨ７、６）中の抗−ジゴキシン（
Ｆ　ａ　ｂ）−β−ガラクトシダーゼ複合体（０，５ｎ
Ｍ）のアリコート０．２５ｍＬを未知量のジゴキシンを
含有する血清試料０．０５ｍＬに加え、混合し、２３°
Ｃで５分間インキュベートした。次に、Ｏ，１Ｍビシン
及び０．１ＭＮ　ａＣ１（ｐＨ７、６）中のビオチニル
化された（ジゴキシン）−ポリスチレン（１０％固体）
の０．２ｍＬのアリコートを加え、混合し、２３°Ｃで
７分間インキュベートした。Ｏ，１Ｍビシン及び０　、
　ＩＭｃｒ＋ＮａＣ１（ｐＨ７、８）中の３０ｍｇ／Ｌ
のアビジン（卵白より入毛、米国、ミズーリ州。

セントルイスのシグマケミカル社製）からなるアビジン
溶液の０．２ｍＬのアリコートを添加した後５分間イン
キュベートした。

（ｂ）（ａ）で得られた上澄の３０ｇ、ｌのアリコート
を上記実施例３で述べた試験具の試薬片に施し、試験具
を４２０　ｎｍ干渉フィルターを用いて反射光度計［セ
ラライザー（ＳＥＲＡＬＹＺＥＲ＠　）　、米国、イン
ヂアナ州、エルクハートのエイムズ部（Ａｍｅｓ　Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ　）製］に載置して、３７℃の反射率の変
化を測定した（ここにおいて変化の割合は血清試料中の
ジゴキシンの濃度に関連していた）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の特異的結合試験方法に適用される、
従来の競合的結合反応系の概略図である。 第２図は、本発明の特異的結合試験方法に適用される、
従来のサンドイッチ状結合反応系の概略図である。 第３図は、本発明の特異的結合試験方法に適用される。 従来の免疫学的結合反応系の概略図である。 競＋的Ｂ会 固定化ハ＋銀 十 Ａｎ：Ａｂ−Ｂｌ　（Ｑｇｇ’）　：５２）ＦＩＧ、１ 寸ソドイッ＋汰 Ａｎ ＋ Ａｂ　　５ＡｎＳＡｂ−８１（Ｑ（Ｊ９ｒ）−巳２）固
友化純合謄 ＦＩＧ、２ イムノアッｔイ広 Ａｎ ＋ Ａｂ”：Ａｎ−Ｂｌ（ＱｇＯｒ）：　Ｂ２會固梵化嘲り
をユ ＦＩＧ、３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、反応混合物を、試験媒体と、試験媒体中の分析対象
   物の量の関数として、反応混合物中に標識試薬の遊離種
   と結合種とを形成する標識試薬を含有する試験試薬とを
   一緒に合わせることにより形成し；標識試薬の遊離種及
   び結合種のどちらか一方を固定化し、固定化された標識
   試薬を、固定化されなかった標識試薬から分離し、分離
   されたフラクションのどちらか一方における標識試薬中
   の標識の量を測定し試験媒体中の分析対象物の量に関連
   づける、水性試験媒体中に存在すると思われる分析対象
   物の量を測定するための不均一系特異的結合試験方法に
   おいて、（ｉ）固定化される遊離種及び結合種のどちら
   か一方の結合相手及び（ｉｉ）第１の結合性物質の両方
   をそれ自体に結合せしめた、水分散性の凝集性支持材料
   からなる固定化され得る成分を加えることにより該標識
   試薬の遊離種及び結合種のどちらか一方を固定化し、第
   ２の結合性物質（該第１の結合性物質に結合して該支持
   材料を凝集せしめ、それによって該支持材料の沈殿した
   複合体を形成する）を加えることにより該固定化標識試
   薬を形成することを特徴とする方法。 ２、該固定化され得る成分が、該結合相手と、該第１の
   結合性物質とをそれ自体に結合せしめて有する水溶性の
   重合体からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該第２の結合性物質が水溶性物質の形態をとってい
   る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、該第２の結合性物質が水不溶性物質の形態をとって
   いる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、該固定化され得る成分が、該結合相手と、該第１の
   結合性物質とをそれ自体に結合せしめて有する水懸濁性
   の不溶性支持材料からなる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ６、該第２の結合性物質が水溶性物質の形態をとってい
   る特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、該第２の結合性物質が水不溶性物質の形態をとって
   いる特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８、該水懸濁性の不溶性支持材料が重合体の微粒子であ
   る特許請求の範囲第５項記載の方法。 ９、該重合体の微粒子がプラスチック製の微小球である
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、該第１の結合性物質がビオチンの場合は該第２の
   結合性物質がアビジンであり、該第１の結合性物質がハ
   プテンの場合は、該第２の結合性物質が抗体である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １１、該結合相手が該分析対象物もしくは結合性類縁体
   又はその結合相手である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １２、水性試験媒体中に存在すると思われる分析対象物
   の量を測定するための不均一系イムノアッセイ法であっ
   て、 （ａ）該水性試験媒体を： （ｉ）存在すると思われる該分析対象物より多量に、該
   反応混合物中に存在することにより該標識抗分析対象物
   の遊離種及び結合種を生成する標識抗分析対象物、 （ｉｉ）該分析対象物又はその結合性類縁体及び第１の
   結合性物質をそれ自体に結合せしめて有する支持材料か
   らなり、支持材料に結合した該分析対象物又はその結合
   性類縁体が、該標識抗分析対象物の遊離種体より多量に
   反応混合物中に存在する水懸濁性の凝集性試薬、並びに （ｉｉｉ）該反応混合物中に存在することにより該支持
   材料を凝集せしめて該支持材料の沈殿した複合体を形成
   する、該第１の結合性物質に特異的に結合する第２の結
   合性物質 と一緒に合わせることにより水性反応混合物を形成し； （ｂ）該試験媒体中に存在すると思われる該分析対象物
   の量の関数として該沈殿複合体又は上澄中の標識抗分析
   対象物を測定する 工程を含む方法。 １３、該支持材料が、該分析対象物又は類縁体及び該第
   １の結合性物質をそれ自体に結合せしめて有する水溶性
   の重合体からなる特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、該第２の結合性物質が水溶性物質の形態をとって
   いる特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、該第２の結合性物質が水不溶性物質の形態をとっ
   ている特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １６、該支持材料が、該分析対象物又は類縁体及びそれ
   に結合した該第１の結合性物質を有する水懸濁性の不溶
   性支持材料からなる特許請求の範囲第１２項記載の方法
   。 １７、該第２の結合性物質が水溶性物質の形態をとって
   いる特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、該第２の結合性物質が水不溶性物質の形態をとっ
   ている特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １９、該水懸濁性の不溶性支持材料が重合体の微粒子で
   ある特許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２０、該重合体微粒子がプラスチック製の微小球である
   特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、該水性試験媒体と該標識抗分析対象物からなる第
   １の混合物を形成し、所定のインキュベーション期間の
   後に該第１の反応溶液と該水分散性の凝集性試薬からな
   る第２の混合物を形成し、所定のインキュベーション期
   間の後に、該第２の反応溶液と該第２の結合性物質から
   なる第３の混合物を形成することにより、該反応混合物
   を形成する特許請求の範囲第１２項記載の方法。 ２２、上澄のアリコートを、遠心を行なうことなく該水
   性反応混合物から取り出し、その中に存在する該標識抗
   分析対象物を測定する特許請求の範囲第１２項記載の方
   法。 ２３、該標識抗分析対象物が標識された一価の抗体フラ
   グメントである特許請求の範囲第１２項記載の方法。 ２４、該抗分析対象物が酵素で標識されており、沈殿複
   合体又は上澄となる該酵素標識抗分析対象物の酵素活性
   が該水性試験媒体中の分析対象物の量に比例する特許請
   求の範囲第１２項記載の方法。 ２５、該第１の結合性物質がビオチンの場合は、該第２
   の結合性物質がアビジンであり、該第１の結合性物質が
   ハプテンの場合は、該第２の結合性物質が抗体である特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 ２６、水性試験媒体中に存在すると思われる分析対象物
   の量を測定するための不均一系イムノアッセイ用の試験
   キットであって、 （ａ）標識抗分析対象物、 （ｂ）該分析対象物又ほその結合性類縁体及び第１の結
   合性物質をそれ自体に結合せしめて有する支持材料から
   なる水分散性の凝集性試薬、及び（ｃ）該第１の結合性
   物質に特異的に結合して、該支持材料の沈殿した複合体
   を形成することができる第２の結合性物質 からなる試験キット。 ２７、該支持材料が、該分析対象物又は類縁体及び該第
   １の結合性物質をそれ自体に結合せしめて有する水溶性
   の重合体からなる特許請求の範囲第２６項記載の試験キ
   ット。 ２８、該第２の結合性物質が水溶性物質の形態をとって
   いる特許請求の範囲第２７項記載の試験キット。 ２９、該第２の結合性物質が水不溶性物質の形態をとっ
   ている特許請求の範囲第２７項記載の試験キット。 ３０、該支持材料が、該分析対象物又は類縁体及び該第
   １の結合性物質をそれ自体に結合せしめて有する水懸濁
   性の不溶性支持材料からなる特許請求の範囲第２６項記
   載の試験キット。 ３１、該第２の結合性物質が水溶性物質の形態をとって
   いる特許請求の範囲第３０項記載の試験キット。 ３２、該第２の結合性物質が水不溶性物質の形態をとつ
   ている特許請求の範囲第３０項記載の試験キット。 ３３、該水懸濁性の不溶性支持材料が重合体の微粒子で
   ある特許請求の範囲第３０項記載の試験キット。 ３４、該重合体の微粒子がプラスチック製の微小球であ
   る特許請求の範囲第３３項記載の試験キット。 ３５、該標識抗分析対象物が標識された一価の抗体フラ
   グメントである特許請求の範囲第２６項記載の試験キッ
   ト。 ３６、該抗分析対象物が酵素で標識されている特許請求
   の範囲第２６項記載の試験キット。 ３７、該酵素の活性に応答して色変化を呈する指示薬を
   さらに含む特許請求の範囲第３６項記載の試験キット。 ３８、該指示薬が、試験片の形状における固体キャリア
   マトリックスに包含せしめられている特許請求の範囲第
   ３７項記載の試験キット。 ３９、該第１の結合性物質がビオチンの場合は、該第２
   の結合性物質がアビジンであり該第１の結合性物質がハ
   プテンの場合は、該第２の結合性物質が抗体である特許
   請求の範囲第２６項記載の試験キット。