JPH02228561A - 免疫学的に検出可能の物質を測定する方法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、免疫学的に検出可能の物質を不均質免疫検定
法の原理に従って、少なくとも２種類の受容体Ｒ１およ
びＲ２（このうちＲ１は固相への結合を媒介し、Ｒ２は
被測定物質に結合できるリガンドおよび標識から取る抱
合体である）と一緒に、特異的結合性反応成分がそこに
結合されている固相への使用下にインキュベートし、液
相から固相を分離しかつ両相の一方で標＃を測定するこ
とによって前記の免疫学的に検出可能の物質を測定する
方法および同方法に適当な試薬に関する。

従来の技術 臨床的に重要な多数のパラメーターは、免疫学的検出方
法で測定される。免疫検定法の場合には、多数の均質的
および不均質的変法がある。

サンドイッチ原理による方法またはそれから誘導された
変法も頻用される。通常は、試料溶液を、被検出物質に
結合することができかつ標識を有する受容体および固相
に結合された受容体または固相への結合を媒介し、被検
出物質に特異的に結合できる受容体と一緒にインキュベ
ートする。この際固相への結合を媒介する受容体を介し
て固相に結合された、被検物質と標識受容体との複合体
が形成される。固相を液相から分離することによって、
結合され九標識を、未結合標識から容易に分離し、両相
の一つで検出することができる。標識の量が被検出物質
の含分の尺度である。

ところで、一つのテストのみならず、異なる幾つかのテ
ス）４並行的に行なわなければならない様々な状況があ
る。これは例えば、特定のウィルスを標的とする抗体、
例えば抗−ＨＩ”／抗体または肝炎抗ｉｔ標的とする抗
体の診断法の場合である。一般に身体の抗原またはハプ
テンに対抗して多数の毘なる抗体、すなわち種々のエピ
トープに結合しうる抗体が形成される。若干のウィルス
は、不断にその表面全変化させるので、信頓できる抗原
の検出を許す抗体を見出すか、または特定ウィルスに対
抗して形成されたすべての抗体を捕捉しうるモデル物質
を見出すことが極めて困難である、という特性を有して
いる。この理由から種々のウィルス抗原と結合しうる種
々の抗体を使用するか、または検出精度を高める種々の
抗原決定基を使用して並行テストで試験を行なう。また
、多くの病橡の場合、例えば腫瘍診断法において腫瘍標
識を検出する場合またはアレルデンまたは抗−アレルデ
ン抗体を検出するためのアレルザー患者の診察の場合に
、種々のパラメーターを並行的に検出することも重要で
ある。また輸血用血液の検査の場合にも、血液がなんら
かの危険因子、つまりＨＩＶ抗体、肝炎病原体等を含有
しているかどうかを確認するために、株々のテストヲ並
行して行なうことが心安である。

従来は、種々の抗原または抗体を並行的に検出すること
は極めて費用がかかった。それというのも個々の各物質
に関して別個のテスト２行なわねばならず、これは時間
的および作業的に費用がかかるからである。ま念すでに
、種々の抗＠を固相に固定することによって幾つかの抗
体を並行的に同時に測定することも提案された。

しかしこの方法は、一般には満足すべき効果をもたらさ
ない、それというのも一つには妨害反応が惹起するし、
二つにはこのようなテストの場合には固相の結合容量が
小さいために感度が実際の要求に追いつかないからであ
る。

発明が解決しようとする課題 そこで本発明の課題は、幾つかのパラメーターを高い精
度と小さい時間消費で同時に測定することのできる方法
全提供することであった。

課題を解決するための手段 前記課題は、免疫学的に検出可能の物質を不均質免疫検
定法の原理に従って、少なくとも２種類の受容体Ｒ１お
よびＲａ　（このうちＲ１は固相への結合を媒介し、Ｒ
２は被測定物質に結合できるリガンドおよび標識から成
る抱合体である）と一緒に、特異的結合性反応成分がそ
こに結合されている固相の使用下にインキュベートする
ことによって前記の免疫学的に検出可能の物質を測定す
る方法において、固相として、特異的結合性パートナ−
がその表面に結合されている物質を使用しかつ試料溶液
を数種の異なる受容体Ｒ１と一緒にインキュベートし、
この際それぞれのＲ１，ｄ（固相に結合される特異的結
合性パートナーの結合位置ならびに被測定物質の一つの
結合位置を有することを特徴とする免疫学的に検出可能
の物質の測定方法によって解決される。

意外にも、本発明による方法を用いると、種々の物質を
同時に測定することができる。所望のパラメーターの全
スペクトルが単純にして僅かな時間消費でカバーされう
る。

本発明による方法は不均質免疫検定法のすべての変法に
対して好適である。

該方法の場合、特異的結合性パートナ−がその表面に結
合されている固相を使用する。固相としては自体公知の
物質、すなわちプラスチック、がラス、紙キャリヤー　
セラミック、ラテックス、磁気粒子等を使用する。固相
は例えば、反応管、試薬担体バンドまたは球の形で存在
していてよい。有利な実施、帳様の場合には、固相は反
応容器の形で、極めて有利には、内表面が少なくとも部
分的に特異的結合性パートナ−で被覆されている壁を有
するキュベツトとして存在している。反応容器の材料と
しては全知材料が適当であって、ポリスチロール、ポリ
スチロールコポリマー　ポリカーざネート、ポリアクリ
レートおよびポリメタクリレートが有利である。

固相材料を物見的結合性パートナ−で被覆する作業は、
固相材料上に直接性なうかまたはスペーサーを介して行
う。例えばｓ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ以上の分子ｉｌを有
する可溶性タンパク質へのパートナ−の結合が適当であ
り、この場合には該タンパク質は反応容器の内表面に吸
着されている。

−様に、官能基金倉して反応容器の表面に共有結合また
は吸着結合されうるスペーサー全弁するハードナーの結
合も適当である。このための方法手段は公知である。有
利な実施態様の場合には、固相として西独国Ｉ＃杆出願
公開第３６４０４１２．８号明細書に記載された方法に
より製造された固相材料を使用する。他の有利な実１ｓ
態様の場合には、固相は、セルロース／合成繊維混合物
から成る不織布を過沃素酸塩で処理して活性化しかつ予
め酸性処理されたｔ＃異的結合性パートナ−ｔｔｓすこ
とによって得られた試薬キャリヤーである。このような
試薬キャリヤーの製造方法は西独国特許出願公開第３５
４３７４９号明細書に記載されている。

固相の表面には特異的結合性パートナーが結合すれる。

このパートナ−は受容体Ｒ１の一部と結合できなければ
ならない。固相に結合され九パートナ−と受容体Ｒ１と
の間の結合は、受容体Ｒ１と被検出物質との結合能力を
妨害してはならないので、Ｒ１が抗体である場合には、
同抗体のＦｃ部分を標的とする抗体またはタンパク’ｊ
ｆＡｔ使用するか１九は物心的に結合する対のパートナ
−Ｐｌに固？する。物心的に結合する対としては、例え
ば抗坤−抗体、ノ・ブテン−抗体、レクチン−炭水化物
、ビオチン−抗げオチン抗体、ビオチン−ストレプトア
ビジンおよびビオチン−アビジンが適当である。有利に
は固相に、ビオチンに結合しつるパートナ−特にストレ
プトアビジンまたはアビジンが固定される。Ｐｌまたは
Ｒ２としてタンパク質Ａｋ使用する場合には、免疫検定
法において受容体Ｒ１のみが完全な抗体でなければなら
ず、他方ｍ１定結果の狂いを生じるおそれのある、標識
受容体と固相との非特異的結合ｔ−惹起させないために
は、標識受容体としてＦａｂ−またはＦ（ａｂ’）２フ
ツグメントを使用しなければならない。

試料溶液ｔ一種々の受容体Ｒ１と一緒にインキュベート
する。受容体Ｒ１としては、固相に結合されるパートナ
−の結合位媛および１種の被検出物質の結合位置金有す
る受容体を使用する。

受容体Ｒ１としては、１ｍの被検出物質に結合しうる全
血類の完全抗体を使用することができる。この場合には
、固相の表面に、Ｒ１として使用された抗体のＦｃ部分
を標的とする抗体ま九はタンパクＷＡが結合される。後
者の場合には標識受容体は、測定結果を狂わせるおそれ
のある固相での非特鴨的結合′５！：惹起させないため
に、完全抗体であってはならない。

他の実施態様の場合には受容体Ｒ１として、固相に結合
されたパートナ−Ｐｌに相補的なパートナ−Ｒ２および
１種の被検出物質に結合しつるすがンドから成る抱合体
を便用する。パートナーＰ１と結合するパートナ−Ｒ２
上に固定化がもたらされる。受容体Ｒ１は有利にはパー
トナ−Ｐｌとしてハブテン丁なわちＦＩＴＣ，ｐ−二ト
ロフェノール、サポニン、シイキシン、極めて有利には
ビオチンｔ−有する。リガンドは１種の被検出物質に結
合する。リガンドは、被検出物質に応じて、抗体、抗体
フラグメント、抗原、ハプテンまたは結合タンパク質で
あってよい。抗原としては、病原体例えば細菌性抗原、
原生動物抗原、アレルｒ７まｔはウィルス抗原の全部分
または精製部分全使用することができる。抗原は、天然
物質、組換え物質、または化学的に合成されたまた味質
性されたペプチドまたは炭水化物であってよい。すなわ
ち例えば、ＨＩＶ抗体抗体量検出場合の受容体Ｒ１のリ
ガンドとしては、棹々の抗原決定基ｐ２４、ｇｐ４１お
よびｇｐ　３２　ｋ使用する。例えば肝炎発症の本性お
よび経過を検証しようとする場合には、受容体Ｒ１のリ
ガンドとして、種々のウィルス抗原、ＨＢｃＡｇ　、　
ＨＢｓＡｇ　、　ＨＢｅＡｇ　１ＨＡＶ　ｈ４に使用す
ることができる。該方法をアレルゼー検出のために使用
する場合には、リガンドとして種々のアレルＣンを使用
して相応の抗体の存在を検出する。Ｍ瘍標識を検出する
ためには、受容体Ｒ１として適当な種々の抗体全使用す
る、例えば受容体Ｒ１としてＣＥＡ、　ＡＦＰ、　ＯＡ
　１５．３に対する抗体を並列的に使用することができ
る。ホルモン測定の之めには、Ｔ８Ｈ、ＬＨ、Ｆ８Ｈ、
コルチンル、グロラクチン等に対する抗体が適当である
。同様に疾病の検出のためには、１々のウィルス−１細
菌−または原生動物抗原に対する抗体を使用してもよい
。もちろん抗体の代りに１それらの７ラグメント、つま
Ｆ）　ｔａｂ−、Ｆａｂ’−またはｔ（ａｂ’）２フラ
グメントを使用してもよい。抗体はポリクロナールまた
はモノクロナールであってもよい。

本発明による方法で使用する第２の受容体Ｒ２は、１種
の被測定物質に結合しつるリガンドおよび標識から成る
抱合体である。標識のためには多数の手段が公知であっ
て、本発明方法にも適する。例えば、放射性同位元素：
　１２５１．１３１１　、　５１Ｃｒ、　３１Ｊ３およ
び３Ｈ１酵素：ペルオキシダーゼ、β−がラクトシダー
ゼまたはアルカリ性ホスファターゼ、螢光性または化学
的発光性物質または他の方式で検出可能の物質を便用す
ることができる。またはＲ２のために使用されるリガン
ドは、例えば特定の抗体、例えばＨＩＶの検出のために
欅々の抗原を使用する場合には、すべての被検出物質と
結合できる成分であってもよい。この場合にはまた標識
もすべての受容体Ｒ２に関して同じである。種々のアレ
ルＣンのＩｇＥ抗体の同時測定の場合にも同様なことが
いえる。種々のパラメーターを並列的に測定しようとす
る場合には、個々の被検出物質に特質的に結合しうる、
それぞれ鴇なるリガンドを受容体Ｒ２について使用する
ことができる。

個々のパラメーターの並列的測定は２種類の別法で行な
うことができる。

第一の別法の場合には方法を多相的に実施する。この場
合には、それぞれ同−標ａを有する昆なる受容体Ｒ２を
頑次に加える。各受容体Ｒ２はそれぞれ１ｆｌの被検出
物質とのみ反応するＣとができるので、受容体を加えた
後その都度、結合されたまたは結合されなかった標識の
童を測定することができ、このｆかそれぞれの被検出物
質の尺度である。

第二の別法の場合には、方法を単相的に実施する。この
別法は、自動分析装置でも行なうことができるので優先
され名。０の場合には、種々の受容体Ｒ２は、同時測定
を可能にするそれぞれ異なる標識、例えば区別できる放
射能を有する異なる同位元素または踵なる波長で螢光を
発する化合物を有する。同様に種々の酵素を用いる標識
も適当である。この場合には、評価のために種々の基質
を加える。該基質はそれぞれの酵素が作用すると、種々
の波長で最大吸光度を有る色を発する。

受容体Ｒ２のリガンドとしては、受容体Ｒ工のリガンド
と同一のものが適当である。受容体Ｒ２に関して使用し
たリガンドは、実施すべき測定に依存して受容体Ｒ１に
関して使用したリガンドと同一であってもよいしまたは
昂なっていてもよい。抗原を検出する場合には、リガン
ドとして該抗原全標的とする抗体またはそのフラグメン
トおよび結合タンパク質を使用することができる。

抗体を検出する場合には、例えばＩｇＧ　、　　ＩｇＡ
　。

ＩｇｌＬ　　ＩｇＥを標的とする抗体またはそのフラグ
メント、ま几は被検出抗体に結合しうる抗原ま九はハプ
テンを使用することができる。受容体Ｒ２は混合物の形
または架橋された生成物の形であってもよい。架橋は、
自体公知の方法で、例えば二官能性または多官能性リン
カ−を使用して行なうことができる。このための方法は
当業者に周知であって、詳述は不要である。

試料溶液は、全受容体と一緒に同時にインキュベートし
てもよいしまたは先づ受容体Ｒ１と共にインキュベート
し、矢に種々の受容体Ｒ２と共にインキュベートするこ
ともできる。他の別法も可能であって、当業者には知ら
れている。

この場合２種の受容体Ｒ１によびＲ２との反応は均質相
で行われる。

本発明による方法を用いると多数の鴨なるパラメーター
の同時測定を行なうことができる。

単純な方法操作は自動分析装置での同時測定を可能にす
る。

本発明により、％鴨的に結合しうる対の一方のパートナ
−で被覆された表面を使用することによって、十分な結
合容量が提供されるので、すべてのパラメーター金精密
にして再現可能に検出することができる。

また本発明による方法は急速診断にも好適である。ＨＩ
Ｖ抗体およびＨＢｓＡｇの同時検出によって、これらの
危険要因を含有する血液試料は即時に除去することがで
き、より精密な診断を要しない。他方１急速テストで検
査する場合には、危険要因が存在するかどうかを予め調
べることができ、次いでより精密な診断を続けてもよい
。

従って本発明によれば、ある疾病に対する特定の指示が
存在するかどうかを極めて迅速に確認することができ、
この指示によって引続き行なわれる診断が簡素化される
。

矢に本発明全図面により説明する。

第１図は、ＨＩＶ抗体およびＨＢｓＡｇの同時測定の方
法を示す模式図である。固相には、フルオレセインイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）　ｔ’ｌＡ的とする抗体が
固定されている。試料溶液を、すべてのＦＩＴＣおよび
ＨＩＶ抗体に結°合しうるエピトープないしＨＢＳＡｇ
に対する抗体を含む受容体Ｒ１としての種々の抱合体と
一緒にインキュベートする。洗浄段階後に試料を、受容
体Ｒ２としての標識したヒ）ＩｇＣ）に対する抗体およ
びＨａｓＡｇに対する抗体と共にインキュベートとする
。標識は放射性沃素である。この場合には受容体Ｒ１、
Ｈ工ｖ抗体ないしはＨＢＳＡｇおよび受容体Ｒ２から榎
合体が形成され、同複合体は固定化されたＦＩＴＣ抗体
へのＦＩＴＣの結合によって固相に結合される。

第２図は腫瘍抗原の同時測定の模式図である。

この場合には固相にＦ。、に対する抗体が固定化される
。受容体Ｒ１としては、それぞれ＠瘍抗原を標的とする
抗体を使用する。受容体Ｒ２としては、＠瘍抗原を標的
とする抗体のｔａｂフラグメント２有する架橋ペルオキ
シダーゼを使用する。インキュベーションの際に抗−確
瘍抗原−抗体が試料中に存在する腫瘍抗原を結合する。

さらに、架橋されたペルオキシダーゼ（ＰＯＤ　）が相
応のＦａｂ抗体を介して同様に＠瘍抗原に結合する。固
定化はＦ。γに対する抗体による結合によって行なわれ
る。

例　　１ 抗ＨＸｖテスト ＨＩＶ抗体は２段階サンドイッチ免疫検定法で測定する
。検出のためには、次の組成を有する試薬を使用する。

試薬１： １種以上のビオチニル化ＨＩｖ抗／Ｊｊ　各１０−フｍ
ｏｌ／を 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７−０）４０ｍｍｏｌ／を食塩０．
９重量係 ウシ血清１０容量幅 抗原としては矢のものを使用する： 遺伝子工学的に製造されたＨＩＶ抗原：　ＨＩＶ　１−
ｇｐ４１　（ｇｐ　４１−　ｒｅｋＢ　Ｃｅｎｔｏｃｏ
ｒＴＭ−ｐ１２１）およびＨＩＶ　１−１）　２４　（
ｐ２４−　ｒｅｋ、、　Ｃｅｎｔｏ−ｃｏｒＴＭ−ｐｇ
　２　）　％化学的に合成されたペプチド：　ＨＩＶ　
１−　ｇｐ　４１　（ｇｐ　４１−　ｐｅｐ、　ｗａｎ
ａ等、ＰＮＡ８．８３　、６１５９　、１９８６　）ｂ
ヨ０ａＩｖ２−　ｇｐ　３２　（ｇｐ　３２−　ｐｅｐ
、　Ｇｎａｎｎ、　Ｊ、Ｗ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３
７　、１３４６．１９８７　）ｏこれらの抗原は、リア
リー（Ｌｅａｒｙ　）等（ＰＮＡ８゜試薬２＝ ヒト免疫グロブリンに対するヒツジ抗体およびＰＯＤか
ら成る抱合体２０ｍσ／１ 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）　４０ｍｍｏｌ／ｌトウイ
ーｙ　（Ｔｖｅｅｎ　）　２００．０５重量幅ウシ血清
アルデミン０．２４ ウシのＸｇＧ　Ｃ１，２幅 ポリスチロール管 熱的に凝集し＆　Ｒ８Ａ　（以下にはＴｈｅｒｍｏ−Ｒ
８Ａと記載する）を次のようにして製造し念：　Ｒ８Ａ
ｔＲ８Ａｔ−５Ｑ燐酸カルシウム溶液１００ａ中にｐＨ
７，０で溶かし、７０°Ｃに加熱し、軽く攪拌しながら
この温度で４時間保った。この溶液を冷却し、濾過し、
５０η／ゴの濃度に調節した。

久に３０倍の容積の蒸留水に対して透析した。

ストレプトアビジンとＴｈｅｒｍｏ−Ｒ８Ａとから成る
抱合体の製造： ストレプトきセス・アビジニー（８ｔｒｅ　ｐ　ｔｏｍ
ｙ−ｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉ　）から得られ之ストレ
プトアビジンをマレイミド−ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロ
中シースクシニイミドと反応させ、このようにしてマレ
イはド基を有するストレプトアビジンが得られた。Ｔｈ
ｅｒｍｏ−Ｒ８Ａ　ｆ　８−アセチルメルカプトコハク
酸無水物と反応させ、次に保循された５ａｆ＝ｔヒドロ
キシルアミンを加えて遊離した。ストレプトアぎジンを
含むマレイミド基′ｆＩ：久に８Ｈ基を有するＴｈｅｒ
ｍｏ−Ｒ８Ａと混合すると所望の抱合体が形成された。

次にポリスチロールから成るグラスチック管にストレプ
トアげジンーＴｈｅｒｍｏ−Ｒ８Ａ抱合体を負荷させた
。この負荷はストレプトアビジン−Ｔｈｅｎｍｏ−Ｒ８
Ａ溶液１．５ｊＬｌ？用いて行なツタ、コの際燐酸ナト
リウム緩衝液（ＰＨ７，４）　４０　ｍｍｏｌ　／　ｌ
中の同成分のモル比は、２０℃で１８〜２４時間の間１
．８　：　１　（１０μｐ／１）であった。

次に管を吸引しｔ後、サッカロース２係、塩化ナトリウ
ム０．９幅およびＲ８Ａ　０．３４の溶液１．８１Ｊ’
ｔ−２０℃で３０分間負荷させた。乾燥（２０℃、相対
湿度４０１１で２４時間）後に核管は使用状態にあり、
保存可能であった。

ストレプトアビジン−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｒ８Ａ−抱合体の
施されたポリスチロール管で、試薬１　１１１ｕおよび
ヒト血清または一血漿１０μｔを室温で１時間インキエ
ベートした。次に水道水で３回洗浄し、試薬２　１＋１
１７を室温で１時間インキエペートした。再び水道水で
３回洗浄し、検出反応のためにＡＢＴ８基質溶液を加え
た。６０分後に４２２　ｎｍでの吸光度全測光的に測定
し友。

抗ＨＩＶテストを、個々のＩＨＶ抗原および組合せ抗原
の使用下に行なった。この際ストレプトアビジン−Ｔｈ
ｅｒｍｏ−Ｒ８Ａ−抱合体の施されたポリスチロール管
でのテスト操作が幾つかの抗体または抗体群の同時測定
にとって適当であり（選別テスト：表１）、これらの抗
体等がそれらのウィルスまたは教程のウィルスないしは
有利な抗原を標的としているかどうかは重要ではない。

例　　２ 試料溶液について肝炎Ｓ抗原およびＨＩＶ抗体金、２段
階サンドイッチ免疫検定法で測定した。

試薬１： 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）　４０　ｍ　ｍｏｌ　／　
ｔ　％トウイーン２００．１ｅ４、 ＮａＣ２０−９％、 フェノール　０．０１係、 ウシ血清アルブミン　０．２　％、 ＨＢｓＡｇに対するＦＩＴＣ１３ａモノクロナール抗体
３００ｎＦ／Ｍ％ ＨＩＶ　（Ｄ　ＦＩＴＣ標識ｐ２４およびｇｐ　４１抗
原各６０　Ｏｎ、！ｉ’　／　”ａ （ＦＩ’ｒＣ−フルオレセインインチオシアネート）試
薬２： 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）４０ｍｍｏｌ／ｌ。

トウイー７２００．１幅、 酒石酸ナトリウム　０．２　　ｍｏｌ　／　６％フェノ
ール　０．０１憾、 ウシ血清アルブミン　０．２係、 ヒ）ＩｇＧ抗体に対する１２５１標識ポリクロナ一ルヒ
ツジ抗体およびＨＢｓＡｇに対するモノクロナール抗体
各５０００ｃｐｍ０ ポリスチロール管に、ＦＩＴＣに対するヒツジ抗体１μ
（炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）　０．１ｍｏｌ　Ｚｔ中
の５０μｇ／α）ｔ″室温１８時間被グし、ウシ血清ア
ルブミン１ｒＩＬｔ（燐酸塩緩衝液０．１ｍｏｌ　／　
を中の１０ｒＩＩ９７Ｍ）全室温で１時間被覆し念。

試料５０μｔを、試薬１１１と共に室温で２時間インキ
ュベートした。水で６回洗浄した後、試薬２１ｒＩＬｌ
と共に室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した
後、該ｆｔ−がンマー計数器で測定した。測定結果を表
２に示す。

ＢｓＡｇ 試料　Ｃｒｈ９ｙａｔ） ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ ＜０．２ 表　　　２ 抗ＨＩＶ （ウェスターンプロット） 陽性 陰性 陽性 陰性 Ｉ場 性 陰 性 同時テストでの 測定値 ２１２５　　ｃｐＭ ２　ｃｐＭ Ｎ５９　　ｃｐＭ ３０４１　　ｃｐＭ ７　ｃｐＭ ８３０　ｃｐＭ １１０２　　ｃｐＭ ９　ｃｐＭ ２９　　ｃｐＭ ５８　　ｃｐＭ ２５５２　ｃｐＭ ５４　　ｃｐＭ ４７２　ｃｐＭ ３９　　ｃｐＭ ４３　　ｃｐＭ 例　　３ 試料溶液において、腫＠標識ＣＥＡシよびＣＡ１５．３
ｔ−１段階サンドイッチ免疫検定法で同時に測定した。

使用した試薬は矢の組成を有していた： ＰＯＤおよび咋喜凛識ＣＥＡおよびＣＡ　１５．３に対
するモノクロナール抗体それぞれのＦａｂフラグメント
１２０ｍＵ／ｍｊ、 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）　４０　ｍｍｏｌ／ｌ。

プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　）　Ｆ　６８　０．
５　％、酒石酸ナトリウム　０．２　ｍａ１／　４％フ
ェノール　０．０１憾、 ウシ血清アルデはン　０．２％、 ＣＥＡ　ｂよびＣＡ１５．３に対するビオチニル化モノ
クロナール抗体各３００　ｎ９／　”。

ＣＥＡおよびＣ’　Ａ　Ｉ　５．３に対するモノクロナ
ール抗体に関しては、ＰｏＤ抱合体におけるＦａｂフラ
グメントがそれぞれ、ビオチニル化抗体とは異なるエヒ
トープ金標的としていることのみが要求される。

ポリスチロール管に、ヒツジの抗−マウスＦ’ｃｒ抗体
１ｒｎｌ　（炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）　０．１ｍａ
１／　ｌ中の５０μｇ／ゴ）全室温で１８時間施し、ウ
シ血清アルブミン１Ｍ（燐酸塩緩衝液Ｑ、１ｍｏｌ　／
　ｌ中の１０〜／　ｍｌ　）を室温で１時間瘤した。前
記試薬１Ｍおよび試料１００μｔを室温で２時間インキ
ュベートした。次に水道水で３回洗浄し念。次に検出反
応のためにＡＢｒＰＢｒ法液１　ｍｔを加えた。１Ｑ間
後に４０５　ｎｍでの吸光度を測光により測定した。測
定結果は表３かられかる。

表　　　３ 線傷標識の同時測定 含分 ＣＥＡ （ｎｐ／ｒｆＬｌ） ＜０．５ 同時テストにおける 測定値 ６　ｍＥ ３５８０　ｍＫ ８　ｍｇ ２９５０　ｍＥ ６　ｍＥ ３ｍＦ ９３　ｍｇ ２　ｍＦ ５０　ｍＥ ３　ｍｌ ５９絽 １４８３　ｍＥ ６３Ｉ！ｌＥ １　ｍｇ

【図面の簡単な説明】

第１図はＨｒＶ抗体およびＨＢ８Ａｇの同時測定を示す
模式図であり、第２図は堕瘍抗厚の同時測定を示す模式
図である。 ＦＩＧ、１ 固相に固定さ れたＦｉＴＣ抗体 セ ◇丁Ｃ Ｄ−罰■抗体 ○　１ｆｌｓＡＧ 〉＝噺 〉ツ晰 ヒトＦＣγに対する抗体 籠ｓＡｇに対する抗体 ＦＩＧ、２ （／ＥＡ ＣＡ１５．３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫学的に検出可能の物質を不均質免疫検定法の原
   理に従つて少なくとも２種類の受容体Ｒ＿１およびＲ＿
   ２（このうちＲ＿１は固相への結合を媒介し、Ｒ＿２は
   被測定物質に結合できるリガンドおよび標識から成る抱
   合体である）と一緒に、特異的結合性反応成分がそこに
   結合されている固相の使用下にインキュベートし、液相
   から固相を分離しかつ両相の一方で標識を測定すること
   によつて前記の免疫学的に検出可能の物質を測定する方
   法において、固相として、特異的結合性パートナーがそ
   の表面に結合されている物質を使用しかつ試料溶液を数
   種の異なる受容体Ｒ＿１と一緒にインキュベートとし、
   この際各Ｒ＿１が固相に結合される特異的結合性パート
   ナーの結合位置および１種の被測定物質の結合位置を有
   することを特徴とする免疫学的に検出可能の物質の測定
   方法。 ２、特異的結合性パートナーがその表面に結合されてい
   る固相、それぞれ１種の被検出物質の結合位置および固
   相に結合される特異的結合性パートナーの結合位置を有
   する種々の受容体および１種の被測定物質に結合できる
   リガンドおよび標識から成る抱合体である受容体Ｒ＿２
   から成る免疫学的に検出可能の物質の測定試薬。