JPS62115289A - 組換えプラスミドの構築方法 - Google Patents
組換えプラスミドの構築方法Info
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- JPS62115289A JPS62115289A JP61107431A JP10743186A JPS62115289A JP S62115289 A JPS62115289 A JP S62115289A JP 61107431 A JP61107431 A JP 61107431A JP 10743186 A JP10743186 A JP 10743186A JP S62115289 A JPS62115289 A JP S62115289A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はシャトルベクターの構築方法、さらに詳しくは
酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制
性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホ
スファターゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺
伝子という）を担ってなる酵母と大腸菌の両方で増殖し
うるシャトルベクターの構築方法に関する。
酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制
性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホ
スファターゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺
伝子という）を担ってなる酵母と大腸菌の両方で増殖し
うるシャトルベクターの構築方法に関する。
最近、遺伝子工学の研究が活発に行なわれており、各種
の組換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら組換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を組み込むためのベクターが用いられるが
、そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例え
ば大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以上の
微生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例えば
大腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシャ
トルベクターが用いられる。例えば、ごく最近において
、大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクターと
して、インターフェロンの酵母による産生に使用されて
いるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）のプロモ
ーターを利用したものが報告されており、これにＢ型肝
炎ウィルスの表面抗原（以下、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓＡｇ
もしくは単にＳ抗原という）の蛋白をコードする遺伝子
を接続する方法が採用されている（Ｎａｔｒｕｅ、 ２
９８巻、３４７〜３５０頁（２２Ｊｕｌｙ、 １９ ｇ
２）を参照）。
の組換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら組換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を組み込むためのベクターが用いられるが
、そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例え
ば大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以上の
微生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例えば
大腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシャ
トルベクターが用いられる。例えば、ごく最近において
、大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクターと
して、インターフェロンの酵母による産生に使用されて
いるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）のプロモ
ーターを利用したものが報告されており、これにＢ型肝
炎ウィルスの表面抗原（以下、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓＡｇ
もしくは単にＳ抗原という）の蛋白をコードする遺伝子
を接続する方法が採用されている（Ｎａｔｒｕｅ、 ２
９８巻、３４７〜３５０頁（２２Ｊｕｌｙ、 １９ ｇ
２）を参照）。
しかしながら、この方法で用いられるシャトルベクター
はＡＤＨ１プロモーターを担ったものであリ、しかもそ
のＨＢｓ遺伝子を組み込んで得られる組換えＤＮＡを用
いた形質転換体では産生されるＨＢｓ蛋白の量が低い。
はＡＤＨ１プロモーターを担ったものであリ、しかもそ
のＨＢｓ遺伝子を組み込んで得られる組換えＤＮＡを用
いた形質転換体では産生されるＨＢｓ蛋白の量が低い。
本発明者らは、各種の遺伝子を組み込み、さらにそれを
発現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクター
を得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵
母の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファタ「ゼプ
ロモーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示
し、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の
遺伝子を組み込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さら
にその組換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種
々の形質転換酵母が得られることを見出し、本発明を完
成するに至った。
発現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクター
を得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵
母の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファタ「ゼプ
ロモーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示
し、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の
遺伝子を組み込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さら
にその組換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種
々の形質転換酵母が得られることを見出し、本発明を完
成するに至った。
すなわち、本発明は酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子を含
みかつ酵母の制御性酸性ホスファターゼプロモーターを
担ったシャトルベクターの構築方法を提供するものであ
る。
みかつ酵母の制御性酸性ホスファターゼプロモーターを
担ったシャトルベクターの構築方法を提供するものであ
る。
本発明のシャトルベクターは、酵母と大腸菌の両方の遺
伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモー
ターを有することを特徴とし、このプラスミドベクター
は酵母と大腸菌との両方で増殖することができ、これを
用いて組換えＤＮＡ。
伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモー
ターを有することを特徴とし、このプラスミドベクター
は酵母と大腸菌との両方で増殖することができ、これを
用いて組換えＤＮＡ。
さらに形質転換酵母を調製する場合に、大腸菌を用いて
組換えプラスミドを調製し、これを酵母の形質転換に利
用し、該形質転換酵母の増殖によって所望の遺伝子産物
の示度を図ることができる。
組換えプラスミドを調製し、これを酵母の形質転換に利
用し、該形質転換酵母の増殖によって所望の遺伝子産物
の示度を図ることができる。
なお、この場合、酵母の形質転換を行なう段階では大腸
菌の遺伝子は除去されてもかまわない。
菌の遺伝子は除去されてもかまわない。
本発明のシャトルベクターにおける酵母の遺伝子として
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なりＮＡ配列、例えば、酵母の自律増殖
に必要なりＮＡ配列（ａｒｓ Ｉ ）と２μｍＤＮＡの
複製に必要なりＮＡ配列（２μｏｒｉ）があり、所望に
より、さらに形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子
が含まれる。この選択マーカーとしては、ロイシン産生
遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺
伝子、ウラシル産生遺伝子、アデニン産生遺伝子などが
含まれ、これらの１種または２種以上が用いられる。
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なりＮＡ配列、例えば、酵母の自律増殖
に必要なりＮＡ配列（ａｒｓ Ｉ ）と２μｍＤＮＡの
複製に必要なりＮＡ配列（２μｏｒｉ）があり、所望に
より、さらに形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子
が含まれる。この選択マーカーとしては、ロイシン産生
遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺
伝子、ウラシル産生遺伝子、アデニン産生遺伝子などが
含まれ、これらの１種または２種以上が用いられる。
大腸菌側の遺伝子としては大腸菌体内においてプラスミ
ドが増殖するために必要なりＮＡ配列、例えばＣｏ１Ｅ
Ｉ系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好ま
しくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝
子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはアンピシ
リン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイ
クリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子な
どが挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種以上が
用いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアンピシリ
ン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するｐ
ＢＲ３２２が一般に汎用されている。
ドが増殖するために必要なりＮＡ配列、例えばＣｏ１Ｅ
Ｉ系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好ま
しくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝
子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはアンピシ
リン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイ
クリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子な
どが挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種以上が
用いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアンピシリ
ン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するｐ
ＢＲ３２２が一般に汎用されている。
本発明で用いるシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホ
スファターゼプロモーターを担っていることが特徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０゜０００ダルトンのポリペプチ
ド（ｐ６０）のプロモーターである。
スファターゼプロモーターを担っていることが特徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０゜０００ダルトンのポリペプチ
ド（ｐ６０）のプロモーターである。
このようなシャトルベクターの代表的な例は、酵母側の
遺伝子としてａｒｓ １ 、２μｏｒｉおよびロイシン
産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を有する酵母ＤＮＡと大腸菌プ
ラスミドｐＢＲ３２２とを組み合わせたシャトルベクタ
ーｐＡＴ７７であり、これはつぎのようにして構築され
る。
遺伝子としてａｒｓ １ 、２μｏｒｉおよびロイシン
産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を有する酵母ＤＮＡと大腸菌プ
ラスミドｐＢＲ３２２とを組み合わせたシャトルベクタ
ーｐＡＴ７７であり、これはつぎのようにして構築され
る。
酵母８２８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホ
スファターゼを構成する６ ０，０００ダルトンのポリ
ペプチド（ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオ
チド対（８Ｋｂ）の制限酵素Ｅｃ。
スファターゼを構成する６ ０，０００ダルトンのポリ
ペプチド（ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオ
チド対（８Ｋｂ）の制限酵素Ｅｃ。
Ｒ１断片（ＰＮＡＳ、７７巻、６５４１〜６５４５頁、
１９８０およびＰＮＡＳ、７９巻、２１５７〜２１６１
頁、１９８２を参照）を公知の大腸菌プラスミドｐＢＲ
３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｃ、Ｊ、Ｇ、。
１９８０およびＰＮＡＳ、７９巻、２１５７〜２１６１
頁、１９８２を参照）を公知の大腸菌プラスミドｐＢＲ
３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｃ、Ｊ、Ｇ、。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ、 ４３巻、７７〜９０頁、１９７９を参照）の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入して得られるプラスミドを出発材
料とする。
ｉｕｍ、 ４３巻、７７〜９０頁、１９７９を参照）の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入して得られるプラスミドを出発材
料とする。
なおこの８ＫｂＤＮＡ断片は制限酵素５ａｌＩの認識部
位を約２．８Ｋｂと約５．２Ｋｂに分ける位置に１箇所
有し、２．８Ｋｂ側がＩ）ＢＲ３２２のアンピシリン耐
性遺伝子側になるように挿入されている。
位を約２．８Ｋｂと約５．２Ｋｂに分ける位置に１箇所
有し、２．８Ｋｂ側がＩ）ＢＲ３２２のアンピシリン耐
性遺伝子側になるように挿入されている。
このプラスミドを制限酵素５ａｌＩで切断し、さらにＴ
４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３２２
の５ａｌＩ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の５
．２Ｋｂ側を失ったプラスミドを得、これをｐＡＴ２５
と称する。このｐＡＴ２５はｐＢＲ３２２のアンピシリ
ン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩ部位から５ａｉ１部位ま
での約３．７Ｋｂの断片と酵母の酸性ホスファターゼ遺
伝子のＥｃｏＲＩ部位から５ａ１１部位までの約２．８
Ｋｂの断片がそれぞれ対応する末端同士で結合したプラ
スミドである。
４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３２２
の５ａｌＩ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の５
．２Ｋｂ側を失ったプラスミドを得、これをｐＡＴ２５
と称する。このｐＡＴ２５はｐＢＲ３２２のアンピシリ
ン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩ部位から５ａｉ１部位ま
での約３．７Ｋｂの断片と酵母の酸性ホスファターゼ遺
伝子のＥｃｏＲＩ部位から５ａ１１部位までの約２．８
Ｋｂの断片がそれぞれ対応する末端同士で結合したプラ
スミドである。
つぎに、上記ｐＡＴ２５のＥｃｏＲＩ部位に、酵母の自
律増殖に必要なりＮＡ配列（ａｒｓ １ ）および酵母
のＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４ＫｂのＥｃｏＲＩ断片（
ＰＮＡＳ、７６巻、１０３５〜１０３９頁、１９７９を
参照）を挿入する。得られたプラスミドをｐＡＴ２６と
称するなお、このａｒｓｌ −Ｔｒｐｌを含む断片は、
そのＴｒｐｌ遺伝子内に制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［の認識
部位を１箇所有する。
律増殖に必要なりＮＡ配列（ａｒｓ １ ）および酵母
のＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４ＫｂのＥｃｏＲＩ断片（
ＰＮＡＳ、７６巻、１０３５〜１０３９頁、１９７９を
参照）を挿入する。得られたプラスミドをｐＡＴ２６と
称するなお、このａｒｓｌ −Ｔｒｐｌを含む断片は、
そのＴｒｐｌ遺伝子内に制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［の認識
部位を１箇所有する。
上記ｐＡＴ２６のＨｉｎｄｌＩ［部位に酵母のロイシン
産生遺伝子（Ｌｅｕ２）と２μｘＤＮＡの複製に必要な
りＮＡ配列（２７ｚｏｒｉ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ断片
（Ｔｏｈｅ。
産生遺伝子（Ｌｅｕ２）と２μｘＤＮＡの複製に必要な
りＮＡ配列（２７ｚｏｒｉ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ断片
（Ｔｏｈｅ。
Ａ、、 Ｇｕｅｒｒｙ、 Ｐ、、 Ｗｉｃｈｅｎｅｒ、
Ｒ，Ｂ、； Ｊ。
Ｒ，Ｂ、； Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４１ 、４１３〜４１６．
１９８０を参照）を挿入する。このようにして得られる
プラスミドがシャトルベクターｐＡＴ７７である。
１９８０を参照）を挿入する。このようにして得られる
プラスミドがシャトルベクターｐＡＴ７７である。
このｐＡＴ７７およびのちに説明するようにそれから誘
導されるｐＡＭ８２の構造は第１図に示すとおりである
。すなわち、このｐＡＴ７７は、大腸菌の遺伝子として
ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子（ＡｐＱを含む
ＥｃｏＲ１部位から５ａ１１部位までを有し、一方酵母
の遺伝子として、ｐＢＲ３２２と結合したＥｃｏＲＩ部
位よりａｒｓ １ 。
導されるｐＡＭ８２の構造は第１図に示すとおりである
。すなわち、このｐＡＴ７７は、大腸菌の遺伝子として
ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子（ＡｐＱを含む
ＥｃｏＲ１部位から５ａ１１部位までを有し、一方酵母
の遺伝子として、ｐＢＲ３２２と結合したＥｃｏＲＩ部
位よりａｒｓ １ 。
２μｏｒｉ、Ｌｅｕ２遺伝子の順に位置し、さらにその
つぎに酸性ホスファターゼ遺伝子の上流から５ａｌ１部
位までを有する。そしてそのＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩ
部位でこれら大腸菌遺伝子と酵母遺伝子が結合した構造
となっている。このｐＡＴ７７は大腸菌内においてはｐ
ＢＲ３２２により増殖し、また酵母内においてはａｒｓ
１および２μｏｒｉにより増殖可能となる。さらにこ
のプラスミドによる形質転換体の選択マーカーとして大
腸菌側にアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を、酵母菌
側にはロイシン産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を有しており、
シャトルベクターとしての条件を充分に満たしている。
つぎに酸性ホスファターゼ遺伝子の上流から５ａｌ１部
位までを有する。そしてそのＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩ
部位でこれら大腸菌遺伝子と酵母遺伝子が結合した構造
となっている。このｐＡＴ７７は大腸菌内においてはｐ
ＢＲ３２２により増殖し、また酵母内においてはａｒｓ
１および２μｏｒｉにより増殖可能となる。さらにこ
のプラスミドによる形質転換体の選択マーカーとして大
腸菌側にアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を、酵母菌
側にはロイシン産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を有しており、
シャトルベクターとしての条件を充分に満たしている。
このシャトルベクターｐＡＴ７７の酸性ホスファターゼ
プロモーター付近の遺伝子地図は第２図に示すとおりで
あり、ここに示されるＢｓｔＥ ＩＩ −８ａｌＩ領域
の塩基配列は本発明者らにより決定されており、第３図
に示すような配列である。第２図および第３図に示され
るＡＴＧコドン（メチオニン）が酸性ホスファターゼの
開始コドンである。
プロモーター付近の遺伝子地図は第２図に示すとおりで
あり、ここに示されるＢｓｔＥ ＩＩ −８ａｌＩ領域
の塩基配列は本発明者らにより決定されており、第３図
に示すような配列である。第２図および第３図に示され
るＡＴＧコドン（メチオニン）が酸性ホスファターゼの
開始コドンである。
つまり、このベクターの抑制性酸性ホスファターゼ遺伝
子断片（約２．８Ｋｂ）には、構造遺伝子の約２．７Ｋ
ｂ上流から構造遺伝子２８ヌクレオチド対（８２ｂｐ）
までが含まれる。
子断片（約２．８Ｋｂ）には、構造遺伝子の約２．７Ｋ
ｂ上流から構造遺伝子２８ヌクレオチド対（８２ｂｐ）
までが含まれる。
このようなシャトルベクターｐＡＴ７７を公知の制限酵
素５ａｉｌで処理して開裂させ、ついでこれをエキソヌ
クレアーゼＢＡＬ３１で処理することにより第２図およ
び第３図に示す酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部ま
たは全部と所望によりさらにそのそ上流の種々の部分ま
で除去する。この除去は酸性ホスファターゼプロモータ
ー領域と思われるＴ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ （Ｈｏ
ｇｎｅｓｓ ｂｏｘ）、すなわち−１００ｂｐの前まで
の適当な部位まで行なわれ、エキソヌクレアーゼ処理条
件により適宜調節されるが、通常＋１〜−１００ ｂｐ
、好ましくは＋１〜−５０ｂｌ）までである。この際、
除去が上流まで行きすぎると酸性ホスファターゼプロモ
ーターの制御が困難となり、形質転換酵母菌の培養の際
、所望の蛋白質などの収量が低下する。一方、除去が不
充分で酸性ホスファターゼ構造遺伝子が一部残存すると
産生される蛋白質などがホスファターゼペプチドと合い
の子となるため好ましくない。
素５ａｉｌで処理して開裂させ、ついでこれをエキソヌ
クレアーゼＢＡＬ３１で処理することにより第２図およ
び第３図に示す酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部ま
たは全部と所望によりさらにそのそ上流の種々の部分ま
で除去する。この除去は酸性ホスファターゼプロモータ
ー領域と思われるＴ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ （Ｈｏ
ｇｎｅｓｓ ｂｏｘ）、すなわち−１００ｂｐの前まで
の適当な部位まで行なわれ、エキソヌクレアーゼ処理条
件により適宜調節されるが、通常＋１〜−１００ ｂｐ
、好ましくは＋１〜−５０ｂｌ）までである。この際、
除去が上流まで行きすぎると酸性ホスファターゼプロモ
ーターの制御が困難となり、形質転換酵母菌の培養の際
、所望の蛋白質などの収量が低下する。一方、除去が不
充分で酸性ホスファターゼ構造遺伝子が一部残存すると
産生される蛋白質などがホスファターゼペプチドと合い
の子となるため好ましくない。
上記のようにして酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部
または全部もしくはさらにその上流部分を除去したのち
、この部位に合成または天然のリンカ−１例えば５ａｌ
ｌリンカ−またはＸｈｏＩリンカ−を組み込み再び環状
プラスミドに戻すことにより、酸性ホスファターゼプロ
モーターの制御下に外来性遺伝子を純粋な形で発現させ
得るシャトルベクターが得られる。このシャトルベクタ
ーは、通常の制限酵素５ａｌＩまたはＸｈｏＴで処理す
ることにより容易にその組み込み部位を開裂させること
ができるため、所望の遺伝子を組み込むのに好適である
。
または全部もしくはさらにその上流部分を除去したのち
、この部位に合成または天然のリンカ−１例えば５ａｌ
ｌリンカ−またはＸｈｏＩリンカ−を組み込み再び環状
プラスミドに戻すことにより、酸性ホスファターゼプロ
モーターの制御下に外来性遺伝子を純粋な形で発現させ
得るシャトルベクターが得られる。このシャトルベクタ
ーは、通常の制限酵素５ａｌＩまたはＸｈｏＴで処理す
ることにより容易にその組み込み部位を開裂させること
ができるため、所望の遺伝子を組み込むのに好適である
。
上述のとおり、本発明のシャトルベクターはその酸性ホ
スファタ１ゼプロモーターの下流に種々の遺伝子を組み
込むことにより各種の組換えプラスミドを調製すること
ができ、それをさらに酵母に作用させて種々の形質転換
酵母が得られるため遺伝子工学の分野において広範囲の
利用が図れるものであって産業上利用価値が極めて高い
。例えば、本発明のシャトルベクターにＨＢｓ遺伝子を
組み込んで得られる組換えプラスミドを酵母に作用させ
て調製される形質転換酵母は、培養によって大量のＨＢ
ｓ抗原を産生ずることができ、しかもかかるＨＢｓ抗原
は免疫学的にヒト血清から得られるものと全く同一であ
るため、Ｂ型肝炎ウィルスワクチンとして有用である。
スファタ１ゼプロモーターの下流に種々の遺伝子を組み
込むことにより各種の組換えプラスミドを調製すること
ができ、それをさらに酵母に作用させて種々の形質転換
酵母が得られるため遺伝子工学の分野において広範囲の
利用が図れるものであって産業上利用価値が極めて高い
。例えば、本発明のシャトルベクターにＨＢｓ遺伝子を
組み込んで得られる組換えプラスミドを酵母に作用させ
て調製される形質転換酵母は、培養によって大量のＨＢ
ｓ抗原を産生ずることができ、しかもかかるＨＢｓ抗原
は免疫学的にヒト血清から得られるものと全く同一であ
るため、Ｂ型肝炎ウィルスワクチンとして有用である。
っぎに実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。
的に説明する。
実施例
シャトルベクターｐＡＭ８１．８２．８３および８４の
調製 酵母５２８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホ
スファターゼを構成する６ ０，０００ダルトンのポリ
ペプチド（ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオ
チド対（８Ｋｂ）の制限酵素Ｅｃ。
調製 酵母５２８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホ
スファターゼを構成する６ ０，０００ダルトンのポリ
ペプチド（ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオ
チド対（８Ｋｂ）の制限酵素Ｅｃ。
Ｒ１断片を大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃ。
Ｒ１部位に挿入して得られるプラスミドを出発材料とし
、これを制限酵素５ａｌＩで切断し、さらにＴ４．ＤＮ
Ａリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３２２の５ａ
ｌｌ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の５．２Ｋ
ｂ側を失ったプラスミドｐＡＴ２５（これはｐＢＲ３２
２のアンピシリン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩ部位から
５ａｌｌ部位までの約３゜７Ｋｂの断片と酵母菌の酸性
ホスファターゼ遺伝子のＥｃｏＲｒ部位から５ａｌｌ部
位までの約２．８Ｋｂの断片がそれぞれ対応する末端同
士で結合したプラスミドである）を得る。
、これを制限酵素５ａｌＩで切断し、さらにＴ４．ＤＮ
Ａリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３２２の５ａ
ｌｌ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の５．２Ｋ
ｂ側を失ったプラスミドｐＡＴ２５（これはｐＢＲ３２
２のアンピシリン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩ部位から
５ａｌｌ部位までの約３゜７Ｋｂの断片と酵母菌の酸性
ホスファターゼ遺伝子のＥｃｏＲｒ部位から５ａｌｌ部
位までの約２．８Ｋｂの断片がそれぞれ対応する末端同
士で結合したプラスミドである）を得る。
つぎに、このｐＡＴ２５のＥｃｏＲＩ部位に、プラスミ
ドＹＲＰ７をＥｃｏＲＩ処理することによって得られる
ａｒｓ １およびＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４ＫｂのＥ
ｃｏＲＩ断片を挿入してプラスミドｐＡＴ２６を得る（
このａｒｓｌ−Ｔｒｐｌを含む断片は、そのＴｒｐｌ遺
伝子内に制限酵素ＨｊｎｄＩＩ［の認識部位を１個有す
る）。
ドＹＲＰ７をＥｃｏＲＩ処理することによって得られる
ａｒｓ １およびＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４ＫｂのＥ
ｃｏＲＩ断片を挿入してプラスミドｐＡＴ２６を得る（
このａｒｓｌ−Ｔｒｐｌを含む断片は、そのＴｒｐｌ遺
伝子内に制限酵素ＨｊｎｄＩＩ［の認識部位を１個有す
る）。
上記ｐＡＴ２６のＨｉｎｄｌＩＩ部位に、プラスミドｐ
ｓＬＥ１をＨｉｎｄｌｌＩで処理して得られる酵母のＬ
ｅｕ２および２μｏｒｉを含むＨｉｎｄＩＩＩ断片を挿
入してシャトルベクターｐＡＴ７７を得る。
ｓＬＥ１をＨｉｎｄｌｌＩで処理して得られる酵母のＬ
ｅｕ２および２μｏｒｉを含むＨｉｎｄＩＩＩ断片を挿
入してシャトルベクターｐＡＴ７７を得る。
上記の方法で得られたｐＡＴ７７（１μｇ）を５ａｌｌ
で開裂したのち、２０ｍＭ）リス−ＨＣ１２（ｐＨ８。
で開裂したのち、２０ｍＭ）リス−ＨＣ１２（ｐＨ８。
２）、１２ ｍＭ ＯＡ ＯＬ、１２ｍＭ ＭｇＣ（２
２，０゜２Ｍ ＮａＣＱ、ＩｍＭ ＥＤＴＡ溶液５０μ
ρ中で０゜ＩＵのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を３０
秒〜１分間作用させる。゛ついでフェノール抽出、エタ
ノール沈澱を行ったのち、ＸｈｏＩリンカ−１ｐｍｏｌ
とＴ４ＤＮＡリガーゼの反応条件下で１２時間結合を行
なう。この反応溶液で大腸菌ｘ１７７６を形質転換し、
得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラスミド
ＤＮＡを調製し、各ＤＮＡについてマキサム−ギルバー
トの方法（Ｍａｙａｍ、 Ａ 。
２，０゜２Ｍ ＮａＣＱ、ＩｍＭ ＥＤＴＡ溶液５０μ
ρ中で０゜ＩＵのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を３０
秒〜１分間作用させる。゛ついでフェノール抽出、エタ
ノール沈澱を行ったのち、ＸｈｏＩリンカ−１ｐｍｏｌ
とＴ４ＤＮＡリガーゼの反応条件下で１２時間結合を行
なう。この反応溶液で大腸菌ｘ１７７６を形質転換し、
得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラスミド
ＤＮＡを調製し、各ＤＮＡについてマキサム−ギルバー
トの方法（Ｍａｙａｍ、 Ａ 。
＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、； ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、
７４，５６０〜５６４を参照）に従い、塩基配列を調べ
、ＢＡＬ３１処理により除去された酸性ホスファターゼ
遺伝子領域を決定する。これら中からホスファターゼ構
造遺伝子領域が完全に除去されたプラスミドｐＡＭ８１
、ｐＡＭ８２、ｐＡＭ８３およびｐＡＭ８４を得る。
７４，５６０〜５６４を参照）に従い、塩基配列を調べ
、ＢＡＬ３１処理により除去された酸性ホスファターゼ
遺伝子領域を決定する。これら中からホスファターゼ構
造遺伝子領域が完全に除去されたプラスミドｐＡＭ８１
、ｐＡＭ８２、ｐＡＭ８３およびｐＡＭ８４を得る。
ホスファターゼ構造遺伝子の産物ｐ６０の最初のアミノ
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、ｐＡＭ８１は＋２まで、ｐＡＭ８２は−３３
まで、ＭＭ８３は−５０まで、ｐＡＭ８４は−５１まで
、それぞれ除去されたものである。
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、ｐＡＭ８１は＋２まで、ｐＡＭ８２は−３３
まで、ＭＭ８３は−５０まで、ｐＡＭ８４は−５１まで
、それぞれ除去されたものである。
なお、このＭＭ８２をサツカロミセス・セレビシェＡＨ
２２に組み込んだものは、サツカロミセス・セレビシェ
Ａｌ２２／Ｔ）ＡＭ８２（ｆｉ工研菌寄第６６６８号：
微工研条寄第３１３号）として寄託している。
２２に組み込んだものは、サツカロミセス・セレビシェ
Ａｌ２２／Ｔ）ＡＭ８２（ｆｉ工研菌寄第６６６８号：
微工研条寄第３１３号）として寄託している。
つぎに、上記の方法で得られたシャトルベクターｐＡＭ
８２を用い、これｉ： ＨＢ Ｖ Ｄ Ｎ Ａを組み込
む場合を参考例として示す。
８２を用い、これｉ： ＨＢ Ｖ Ｄ Ｎ Ａを組み込
む場合を参考例として示す。
参考例
（］、）ＨＢＶＤＮＡの調製
（ｉ）ウィルスＤＮＡの調製
ＨＢｓＡｇ陽性かっＨＢｅＡｇ陽性の供血者（血清型ａ
ｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７００１を５．
００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除去する
。これを４℃にて１８．００Ｏｒｐｍで８時間遠心分離
し、得られた沈澱を緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣＬ
Ｏ，ＩＭ ＮａＣ（２，１ｍＭ ＥＤＴＡ；１）Ｈ７
，５）］Ｏｘρに再溶解させ、３０％の蔗糖を含有する
遠沈管の頂部に重層させる。これを４°Ｃにて３９．０
０Ｏｒｐｍで４時間遠心分離し、得られた沈査を」二記
と同じ緩衝液に再溶解させる。
ｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７００１を５．
００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除去する
。これを４℃にて１８．００Ｏｒｐｍで８時間遠心分離
し、得られた沈澱を緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣＬ
Ｏ，ＩＭ ＮａＣ（２，１ｍＭ ＥＤＴＡ；１）Ｈ７
，５）］Ｏｘρに再溶解させ、３０％の蔗糖を含有する
遠沈管の頂部に重層させる。これを４°Ｃにて３９．０
０Ｏｒｐｍで４時間遠心分離し、得られた沈査を」二記
と同じ緩衝液に再溶解させる。
ついで、のちの操作を容易にするために、ＨＢＶのもつ
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７ｍＭトリス−Ｈ
ＣＱ（ｐＨ７，５）、８０ｍＭ ＮＨ４Ｃρ、２５ｍＭ
Ｍｇ０Ｌ、０．５％（ｗ／ ｖ％、以下同じ）タージ
トールＮＰ−４０，０，１％２−メルカプトエタノール
、３３０μＭのｄｃＴＰ（デオキシシヂジントリホスフ
ェート）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリホスフェ
ート）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリホスフェー
ト）、０．５μＭα−［３２Ｐ］ｄＴ Ｔ Ｐ （デオ
キシチアミントリホスフェートの混合液５００μρ中で
３７℃にて３０分間行なう。これにざらにｄＴＴＰを最
終濃度３３０μＭになるように加え、３７℃で３時間反
応させ、これに同容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加
える。
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７ｍＭトリス−Ｈ
ＣＱ（ｐＨ７，５）、８０ｍＭ ＮＨ４Ｃρ、２５ｍＭ
Ｍｇ０Ｌ、０．５％（ｗ／ ｖ％、以下同じ）タージ
トールＮＰ−４０，０，１％２−メルカプトエタノール
、３３０μＭのｄｃＴＰ（デオキシシヂジントリホスフ
ェート）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリホスフェ
ート）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリホスフェー
ト）、０．５μＭα−［３２Ｐ］ｄＴ Ｔ Ｐ （デオ
キシチアミントリホスフェートの混合液５００μρ中で
３７℃にて３０分間行なう。これにざらにｄＴＴＰを最
終濃度３３０μＭになるように加え、３７℃で３時間反
応させ、これに同容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加
える。
このＤＮＡポリメラーゼ反応により、ＤＮＡ中の一本鎖
部分が修複され、［ｊｌｐ］ラベル化された材料をえ、
これを蔗糖の３０％、２０％および１０％水溶液を段階
的に重層した遠心管の頂部に重層し、４℃にて３９．０
０Ｏｒｐｍで４．５時間遠心分離する。 、 ついでＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られた沈査を１Ｍｙ／ｘｃプロナーゼＥお
よび０，２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００μ
ｒ中で３７℃にて２時間処理したのち、ＤＮＡをフェノ
ール２００μρで２回抽出し、ついでエーテルを振って
フェノール溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る。
部分が修複され、［ｊｌｐ］ラベル化された材料をえ、
これを蔗糖の３０％、２０％および１０％水溶液を段階
的に重層した遠心管の頂部に重層し、４℃にて３９．０
０Ｏｒｐｍで４．５時間遠心分離する。 、 ついでＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られた沈査を１Ｍｙ／ｘｃプロナーゼＥお
よび０，２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００μ
ｒ中で３７℃にて２時間処理したのち、ＤＮＡをフェノ
ール２００μρで２回抽出し、ついでエーテルを振って
フェノール溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る。
このＤＮＡは２．５ ｘ １０６ｃｐｍ／μ９の比放射
活性を示し、制限酵素消化に充分使用し得る。
活性を示し、制限酵素消化に充分使用し得る。
（ｉｉ）ＨＢＶＤＮＡのクローン化
前記の方法で調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、
下記のようにしてまずλフアージシャロン１６ＡＤＮＡ
をベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラスミ
ドＩ）ＡＣＹＣ１７７をベクターとして再クローン化を
行なう。
下記のようにしてまずλフアージシャロン１６ＡＤＮＡ
をベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラスミ
ドＩ）ＡＣＹＣ１７７をベクターとして再クローン化を
行なう。
（Ａ）λフアージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系によ
るクローン化： ＨＢＶＤＮＡ２Ｏｎ！？を１０ｍＭ）リス−ＨＣρ（ｐ
Ｈ７，４）、７ｍＭ ＭｇＣρ３．１００ｍＭ ＮａＣ
（２，７ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液２０μｅ
中にて制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌにより３７℃に
て２時間処理したのち、フェノール２０μρに一１６＝ て抽出１７、抽出液をエーテルで洗浄し、その水層に２
倍容量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させる。こ
の混液を一７０℃で１時間保持したのち１０．ＯＯＯｒ
ｐｍにて５分間遠心分離して沈澱するＤＮＡを回収する
。分離した沈査を１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ２（ｐＨ７、
４）および１ｍＭＥＤＴＡの混液５μＱに溶解させる。
るクローン化： ＨＢＶＤＮＡ２Ｏｎ！？を１０ｍＭ）リス−ＨＣρ（ｐ
Ｈ７，４）、７ｍＭ ＭｇＣρ３．１００ｍＭ ＮａＣ
（２，７ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液２０μｅ
中にて制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌにより３７℃に
て２時間処理したのち、フェノール２０μρに一１６＝ て抽出１７、抽出液をエーテルで洗浄し、その水層に２
倍容量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させる。こ
の混液を一７０℃で１時間保持したのち１０．ＯＯＯｒ
ｐｍにて５分間遠心分離して沈澱するＤＮＡを回収する
。分離した沈査を１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ２（ｐＨ７、
４）および１ｍＭＥＤＴＡの混液５μＱに溶解させる。
ついで、このＨＢＶＤＮＡと等モル量の前記と同様にし
て制限酵素Ｘｈ。
て制限酵素Ｘｈ。
■により開裂されたλフアージシャロン１６ＡＤＮＡ（
ＸｈｏＩ認識部位を１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（５０ｍＭ）リス−ＨＣＣ（ｐＨ７，４）、１０
ｍＭ Ｍｇ ＣＱ２．１０ｍＭジヂオスレイトール、１
００ ｕ９／ｒｒｔＱ牛血清アルブミン、０．５ｍＭＡ
ＴＰおよび０．５μＱ酵素調製物との混液）１０μρを
用いて４℃で１８時間反応させ、この反応混合液を前記
と同様にしてフェノール抽出、エーテル処理およびエタ
ノール沈澱に付し、得られた沈査を１０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃρ（ｐＨ７、４）および１ｍＭＥＤＴＡ混液１０μρ
中に溶解させる。
ＸｈｏＩ認識部位を１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（５０ｍＭ）リス−ＨＣＣ（ｐＨ７，４）、１０
ｍＭ Ｍｇ ＣＱ２．１０ｍＭジヂオスレイトール、１
００ ｕ９／ｒｒｔＱ牛血清アルブミン、０．５ｍＭＡ
ＴＰおよび０．５μＱ酵素調製物との混液）１０μρを
用いて４℃で１８時間反応させ、この反応混合液を前記
と同様にしてフェノール抽出、エーテル処理およびエタ
ノール沈澱に付し、得られた沈査を１０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃρ（ｐＨ７、４）および１ｍＭＥＤＴＡ混液１０μρ
中に溶解させる。
上記のようにしてアニールさせたＤＮＡより、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６８巻、２９９〜３０９を参
照）によりλファージを形成させ、さらに大腸菌ＤＰ５
０−Ｓ ｕｐＦ指示指示口てＬ−寒天平板（２３Ｃπ×
２３ａｍ）上に〜１０４個のプラークを形成させる。こ
れらのプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持している
ファージにより形成されたプラークを選び出すために、
前記で調製した３２Ｐ−ラベルされたＨＢＶＤＮＡをプ
ローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行ない
（Ｓｃｉｅｎｃｅ、 １９６巻、１８０頁、ｌ９７７
を参照）、目的とするファージを複数分離する。
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６８巻、２９９〜３０９を参
照）によりλファージを形成させ、さらに大腸菌ＤＰ５
０−Ｓ ｕｐＦ指示指示口てＬ−寒天平板（２３Ｃπ×
２３ａｍ）上に〜１０４個のプラークを形成させる。こ
れらのプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持している
ファージにより形成されたプラークを選び出すために、
前記で調製した３２Ｐ−ラベルされたＨＢＶＤＮＡをプ
ローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行ない
（Ｓｃｉｅｎｃｅ、 １９６巻、１８０頁、ｌ９７７
を参照）、目的とするファージを複数分離する。
（Ｂ）プラスミドｐＡｃＹｃＩ７７をベクターとした再
クローン化： 上記（Ａ）で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージ
について「生化学実験講座、核酸の化学ＩＪ５４〜６５
頁に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５０−ＳｕｐＦ
を感染菌としてファージＤＮＡを調製する。得られたＤ
ＮＡを前記の制限酵素ＸｈｏＩの反応条件下で２時間消
化したのち、この反応液を０．７５％アガロースゲル電
気泳動にかけ、分離した３、２ＫｂのＨＢＶＤＮＡをＤ
ＥＡ’Ｅ紙（東洋１紙製）に吸着させてベクターＤＮＡ
と分離し、ついでＩＭ ＮａＣρ溶液にて溶出し、両端
がＸｈ。
クローン化： 上記（Ａ）で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージ
について「生化学実験講座、核酸の化学ＩＪ５４〜６５
頁に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５０−ＳｕｐＦ
を感染菌としてファージＤＮＡを調製する。得られたＤ
ＮＡを前記の制限酵素ＸｈｏＩの反応条件下で２時間消
化したのち、この反応液を０．７５％アガロースゲル電
気泳動にかけ、分離した３、２ＫｂのＨＢＶＤＮＡをＤ
ＥＡ’Ｅ紙（東洋１紙製）に吸着させてベクターＤＮＡ
と分離し、ついでＩＭ ＮａＣρ溶液にて溶出し、両端
がＸｈ。
Ｉ末端となったＨ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａを得る。
つぎにプラスミドｐＡＣＹＣＩ ７７ ［Ｃｈａｎｇ、
Ａ。
Ａ。
Ｃ，Ｙ 、、 Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ 、Ｎ、、 Ｊ 、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １３４ 。
ａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １３４ 。
１１４１−１１５６（１９７８）］ （このものはｘｈ
ｏｒ切断部位を１個所有し、それはカナマイシン耐性遺
伝子の中に存在する）を同様にＸｈｏｌにて消化し、そ
の生成物をフェノール抽出、エーテル処理およびエタノ
ール沈澱により精製する。ついで、Ｘｈｏｌ開裂された
ｐＡｃＹｃ１７７とＸｈｏＩ末端−ＨＢ Ｖ Ｄ Ｎ
Ａとを分子比Ｉ：５で混合し、前記Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
の反応条件下に１８時間アニールさせる。
ｏｒ切断部位を１個所有し、それはカナマイシン耐性遺
伝子の中に存在する）を同様にＸｈｏｌにて消化し、そ
の生成物をフェノール抽出、エーテル処理およびエタノ
ール沈澱により精製する。ついで、Ｘｈｏｌ開裂された
ｐＡｃＹｃ１７７とＸｈｏＩ末端−ＨＢ Ｖ Ｄ Ｎ
Ａとを分子比Ｉ：５で混合し、前記Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
の反応条件下に１８時間アニールさせる。
大腸菌ｘ１７７６の培養液を高木康敬編著「遺伝子操作
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０
、１ ｍＱに、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μ
ρを加えてよく混合させ、０℃で２５分間放置したのち
、アンピシリン（２０μ９／１１Ｑ）、α−ビオチン（
１μｇ／ｍ（１）、ジアミノピメリン酸（１００ｔｔ９
／Ｍ（１）、チシン（２０Ｐ９／ｍのを含有するし一寒
天プレート上に塗沫して３７℃で一夜培養する。出現し
たコロニーについて、のカナマイシン（２０Ｐｇ／ｍの
を含む寒天プレートとアンピシリン（２０Ｐ９／ｍ（１
）を含む寒天プレートにそれぞれ対応させて塗沫し、ア
ンピシリンを含むプレートでのみ増殖したコロニーを選
択する。ｐＡＣＹＣｌ ７７はアンピシリン耐性遺伝子
とカナマイシン耐性遺伝子を有するが、カナマイシン耐
性遺伝子中にあるＸｈＯ■部位にＨＢＶＤＮＡが挿入さ
れることによりカナマイシン耐性が消失される。すなわ
ち選択されたコロニーはｐＡｃＹｃ１７７−ＨＢＶＤＮ
Ａの組換えＤＮＡを保持シティる。得られたコロニー数
個について、「代謝ｊ第１７巻、第４「リパーゼ」第８
１〜８９頁（１９８０）に記載される方法に従いプラス
ミドを調製する。
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０
、１ ｍＱに、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μ
ρを加えてよく混合させ、０℃で２５分間放置したのち
、アンピシリン（２０μ９／１１Ｑ）、α−ビオチン（
１μｇ／ｍ（１）、ジアミノピメリン酸（１００ｔｔ９
／Ｍ（１）、チシン（２０Ｐ９／ｍのを含有するし一寒
天プレート上に塗沫して３７℃で一夜培養する。出現し
たコロニーについて、のカナマイシン（２０Ｐｇ／ｍの
を含む寒天プレートとアンピシリン（２０Ｐ９／ｍ（１
）を含む寒天プレートにそれぞれ対応させて塗沫し、ア
ンピシリンを含むプレートでのみ増殖したコロニーを選
択する。ｐＡＣＹＣｌ ７７はアンピシリン耐性遺伝子
とカナマイシン耐性遺伝子を有するが、カナマイシン耐
性遺伝子中にあるＸｈＯ■部位にＨＢＶＤＮＡが挿入さ
れることによりカナマイシン耐性が消失される。すなわ
ち選択されたコロニーはｐＡｃＹｃ１７７−ＨＢＶＤＮ
Ａの組換えＤＮＡを保持シティる。得られたコロニー数
個について、「代謝ｊ第１７巻、第４「リパーゼ」第８
１〜８９頁（１９８０）に記載される方法に従いプラス
ミドを調製する。
得られたプラスミドをＩ）ＨＢＶと称す。このｐＨＢＶ
を制限酵素ＸｈｏＩで処理すると３．２Ｋｂの全Ｈ２Ｏ
− ＢＶＤＮＡフラグメントが得られ、またＸｈｏＩとＢａ
ｍＨＩで処理するとＨＢｓＡｇ遺伝子を含む約１゜３Ｋ
ｂのフラグメントが得られる。
を制限酵素ＸｈｏＩで処理すると３．２Ｋｂの全Ｈ２Ｏ
− ＢＶＤＮＡフラグメントが得られ、またＸｈｏＩとＢａ
ｍＨＩで処理するとＨＢｓＡｇ遺伝子を含む約１゜３Ｋ
ｂのフラグメントが得られる。
（２）ＨＢｓＡｇ遺伝子発現プラスミドの調製（ｉ）Ｈ
Ｂｓ遺伝子全体が組み込まれたプラスミドの調製 プラスミドｐＨＢＶをＸｈｏｒで処理して得られるＨＢ
ＶＤＮＡと、Ｘｈｏｌで開裂されたシャトルベクターｐ
ＡＭ８２を分子比５：１にてＴ４ＤＮＡリガーゼにより
アニールさせたのち、この反応溶液で大腸菌χ１７７６
を形質転換する。得られたアンピシリン耐性の形質転換
体至りプラスミドＤＮＡを調製し、これらについて制限
酵素ＸｈｏＩ、Ｘ ｂａ Ｉ ％ ＨｔｎｄｌＩ［で分
析することにより、ベクターへのＨＢＶＤＮＡの組み込
みおよびその方向を確認する。
Ｂｓ遺伝子全体が組み込まれたプラスミドの調製 プラスミドｐＨＢＶをＸｈｏｒで処理して得られるＨＢ
ＶＤＮＡと、Ｘｈｏｌで開裂されたシャトルベクターｐ
ＡＭ８２を分子比５：１にてＴ４ＤＮＡリガーゼにより
アニールさせたのち、この反応溶液で大腸菌χ１７７６
を形質転換する。得られたアンピシリン耐性の形質転換
体至りプラスミドＤＮＡを調製し、これらについて制限
酵素ＸｈｏＩ、Ｘ ｂａ Ｉ ％ ＨｔｎｄｌＩ［で分
析することにより、ベクターへのＨＢＶＤＮＡの組み込
みおよびその方向を確認する。
選び出されたプラスミドはベクターのホスファターゼプ
ｏモーターの下流にＨＢＶＤＮＡＩＪ（ＨＢＳ遺伝子、
ＨＢｃ遺伝子の順に並ぶ向きに挿入されたものであり、
これらがＨＢｓＡｇ遺伝子発現プラスミドであって、こ
のものをＭＨ２０３と称する。
ｏモーターの下流にＨＢＶＤＮＡＩＪ（ＨＢＳ遺伝子、
ＨＢｃ遺伝子の順に並ぶ向きに挿入されたものであり、
これらがＨＢｓＡｇ遺伝子発現プラスミドであって、こ
のものをＭＨ２０３と称する。
（ｉｉ）ＨＢｓＡｇ遺伝子フラグメントが組み込まれた
プラスミドの調製 プラスミドｐＨＢＶをＢａｍＨＩで処理して切断し、そ
のＨＢｓＡｇ遺伝子フラグメント３μ９に対し、２００
μＭのαＡＴＰ、 αＣＴＰ、 αＴＴＰおよびα
ＧＴＰを含む６７ｍＭトリス−ＨＣｌ２（１）Ｈ８，６
）、６．７ｍＭＭｇＣρ７．１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、６．７）ｔＭ ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭＡｍ
ＳＯ，溶液１００μ（２中で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
０．２Ｕを３０分間作用させ、ＢａｍＨＩ切断末端を埋
める。ついでフェノール抽出、エタノール沈澱を行なっ
たのち、これとＸｈｏＩリンカ−とを１：１０の分子比
でＴ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行なう。フェノ
ール抽出、エタノール沈澱ののち、これをさらにＸｈｏ
ｌで処理すると両端がＸｈｏＩ切断末端となった約１．
３ＫｂのＨＢｓＡｇ遺伝子フラグメントが得られる。こ
のフラグメントとＸｈｏＩで開裂されたシャトルベクタ
ーｐＡＭ８２とを分子比５：１にてＴ４ＤＮＡリガーゼ
によりアニールさせたのち、前記（ｉ）と同様にして大
腸菌ｘ１７７６を形質転換してプラスミドＤＮＡを調製
する。得られたプラスミドは、ベクターｐＡＭ８２のホ
スファターゼプロモーターの下流にＨＢｓＡｇ遺伝子が
正しい向きに挿入されたものであり、これをｐＡｓｌｏ
ｌと称する。
プラスミドの調製 プラスミドｐＨＢＶをＢａｍＨＩで処理して切断し、そ
のＨＢｓＡｇ遺伝子フラグメント３μ９に対し、２００
μＭのαＡＴＰ、 αＣＴＰ、 αＴＴＰおよびα
ＧＴＰを含む６７ｍＭトリス−ＨＣｌ２（１）Ｈ８，６
）、６．７ｍＭＭｇＣρ７．１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、６．７）ｔＭ ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭＡｍ
ＳＯ，溶液１００μ（２中で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
０．２Ｕを３０分間作用させ、ＢａｍＨＩ切断末端を埋
める。ついでフェノール抽出、エタノール沈澱を行なっ
たのち、これとＸｈｏＩリンカ−とを１：１０の分子比
でＴ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行なう。フェノ
ール抽出、エタノール沈澱ののち、これをさらにＸｈｏ
ｌで処理すると両端がＸｈｏＩ切断末端となった約１．
３ＫｂのＨＢｓＡｇ遺伝子フラグメントが得られる。こ
のフラグメントとＸｈｏＩで開裂されたシャトルベクタ
ーｐＡＭ８２とを分子比５：１にてＴ４ＤＮＡリガーゼ
によりアニールさせたのち、前記（ｉ）と同様にして大
腸菌ｘ１７７６を形質転換してプラスミドＤＮＡを調製
する。得られたプラスミドは、ベクターｐＡＭ８２のホ
スファターゼプロモーターの下流にＨＢｓＡｇ遺伝子が
正しい向きに挿入されたものであり、これをｐＡｓｌｏ
ｌと称する。
（３）形質転換酵母の調製
酵母としてサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２［ａ
（２ｅｕ２ ｈｉｓ４ ｃａｎｔ （Ｃｉｒつ］（微
工研菌寄第６６６７号：微工研条寄第３１２号）を用い
、これをＹＰＤ培地（２％ポリペプトン、１％イースト
エキス、２％グルコース）１００ｉσに接種し、３０℃
で一晩培養したのち、遠心して集菌する。
（２ｅｕ２ ｈｉｓ４ ｃａｎｔ （Ｃｉｒつ］（微
工研菌寄第６６６７号：微工研条寄第３１２号）を用い
、これをＹＰＤ培地（２％ポリペプトン、１％イースト
エキス、２％グルコース）１００ｉσに接種し、３０℃
で一晩培養したのち、遠心して集菌する。
滅菌水２０ｍＱにて菌体を洗浄し、ついで１．２Ｍソル
ビトールおよび１００μｇ／ｍσチリモリアーゼ６０，
０００（生化学工業製）の溶液５ｉ（２に懸濁させ、３
０℃モ約３０分間保ち、スフェロプラスト化する。つい
で、スフェロプラストを１．２Ｍソルビトール溶液で３
回洗浄したのち、２Ｍツルビトール、Ｉ ＯｍＭ Ｃａ
Ｃ（ｔおよび１０ｍＭ）リス−ＨＣｆ２（ｐＨ７，５）
の溶液０．６Ｈに懸濁させ、その６０μσずつを小試験
管に分注する。これに前記（３）で調製した組換えプラ
スミドｐＡＨ２０３溶液３０μσを加え、充分混合し、
さらに０．ＩＭＣａＣｆＬ（３ｕＱ）を加えて最終濃度
１０ ｍＭ Ｃａ Ｃ（ｂとし、室温に５〜１０分間放
置する。ついでこれに、２０％ポリエチレングリコール
４０００．１０ｍＭ ＣａＣ（！２および１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）溶液１次ρずつを加えて混
合し、室温に約２０分間放置する。この混合液０．２村
ずつを４５℃に保温された再生培地（２２％ソルビトー
ル、２％グルコース、０，７％イーストニトロゲンベー
スアミノ酸、２％ＹＰＤ、２０μ９／肩ρヒスチジン、
３％肩入ヒスチジン１１２に加え、軽く混合させ、予め
準備された１、２Ｍソルビトール含有最小培地（０，７
％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％グルコース
、２０μｇ／ｍρヒスチジン、２％寒天）プレートに重
層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシン非要
求性酵母のコロニーを得る。このコロニーを２０μ９／
Ｍ（ｌヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメディ
ウム（Ｔｏｈｅ。
ビトールおよび１００μｇ／ｍσチリモリアーゼ６０，
０００（生化学工業製）の溶液５ｉ（２に懸濁させ、３
０℃モ約３０分間保ち、スフェロプラスト化する。つい
で、スフェロプラストを１．２Ｍソルビトール溶液で３
回洗浄したのち、２Ｍツルビトール、Ｉ ＯｍＭ Ｃａ
Ｃ（ｔおよび１０ｍＭ）リス−ＨＣｆ２（ｐＨ７，５）
の溶液０．６Ｈに懸濁させ、その６０μσずつを小試験
管に分注する。これに前記（３）で調製した組換えプラ
スミドｐＡＨ２０３溶液３０μσを加え、充分混合し、
さらに０．ＩＭＣａＣｆＬ（３ｕＱ）を加えて最終濃度
１０ ｍＭ Ｃａ Ｃ（ｂとし、室温に５〜１０分間放
置する。ついでこれに、２０％ポリエチレングリコール
４０００．１０ｍＭ ＣａＣ（！２および１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）溶液１次ρずつを加えて混
合し、室温に約２０分間放置する。この混合液０．２村
ずつを４５℃に保温された再生培地（２２％ソルビトー
ル、２％グルコース、０，７％イーストニトロゲンベー
スアミノ酸、２％ＹＰＤ、２０μ９／肩ρヒスチジン、
３％肩入ヒスチジン１１２に加え、軽く混合させ、予め
準備された１、２Ｍソルビトール含有最小培地（０，７
％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％グルコース
、２０μｇ／ｍρヒスチジン、２％寒天）プレートに重
層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシン非要
求性酵母のコロニーを得る。このコロニーを２０μ９／
Ｍ（ｌヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメディ
ウム（Ｔｏｈｅ。
Ａ、ｅｔ ａｌ；Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １１３
，７２７〜７３８（１９７３）を参照］にて培養して形
質転換酵母サツカロミセス・セレビシェｐＡＨ２０３を
得る。
，７２７〜７３８（１９７３）を参照］にて培養して形
質転換酵母サツカロミセス・セレビシェｐＡＨ２０３を
得る。
上記の方法において、組換えプラスミドｐＡＨ２０３の
代わりにｐＡｓｌｏｌを用いてサツカロミセス・セレビ
シェｐＡｓ１０１を得る。
代わりにｐＡｓｌｏｌを用いてサツカロミセス・セレビ
シェｐＡｓ１０１を得る。
（４）形質転換酵母によるＨＢｓＡｇの製法前記（３）
で得られた形質転換酵母の各コロニーをさらに２０μｇ
／ｙｔｒρヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメ
ディウムの寒天プレート上に塗布し、３０℃にて培養し
てコロニーを形成させる（ロイシン非要求性となった形
質転換体の再確認のため）。ついでこのコロニーから菌
体を分離し、２０μｇ／好ヒスチジンを含むバルクホル
ダーミニマルメディウム１０３１１２に接種し、３０℃
にて培養を行なう。約２４時間後、対数増殖期による菌
体を遠心して集菌し、これをリン酸を含まない最小培地
（バルクホルダーミニマルメディウムに含まれるＫＨ２
ＰＯ，をＫＣＱで置換し、さらに２０μｇ／ｍρヒスチ
ジンを加えたもの）１０ｍρに菌数的４ Ｘ １０８ｃ
ｅｌｌｓ／ｍ［になるように懸副し、３０℃にて約２４
時間培養を続けたのち、４，０００回転、１０分間の遠
心により菌体を集める。この菌体を１．２Ｍソルビトー
ル、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、２）、１４ｍＭ２
−メルカプトエタノール、ｌｏ ｏ ｕ ｌ？／ｙｔｕ
：イモリエース６０，０００の溶液３ｍρに懸副させ、
３０℃にて３０分間ゆるやかに振盪してスフェロプラス
ト化し、遠心分離によりこれを集める。このスフェロプ
ラストを０゜１％トリトンＸ−１００，５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）１πσに充分懸濁し、数回激しく
攪拌し１、 ７０００回転にて１０分間遠心して得ら
れる上清液を酵母溶菌液としてとる。
で得られた形質転換酵母の各コロニーをさらに２０μｇ
／ｙｔｒρヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメ
ディウムの寒天プレート上に塗布し、３０℃にて培養し
てコロニーを形成させる（ロイシン非要求性となった形
質転換体の再確認のため）。ついでこのコロニーから菌
体を分離し、２０μｇ／好ヒスチジンを含むバルクホル
ダーミニマルメディウム１０３１１２に接種し、３０℃
にて培養を行なう。約２４時間後、対数増殖期による菌
体を遠心して集菌し、これをリン酸を含まない最小培地
（バルクホルダーミニマルメディウムに含まれるＫＨ２
ＰＯ，をＫＣＱで置換し、さらに２０μｇ／ｍρヒスチ
ジンを加えたもの）１０ｍρに菌数的４ Ｘ １０８ｃ
ｅｌｌｓ／ｍ［になるように懸副し、３０℃にて約２４
時間培養を続けたのち、４，０００回転、１０分間の遠
心により菌体を集める。この菌体を１．２Ｍソルビトー
ル、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、２）、１４ｍＭ２
−メルカプトエタノール、ｌｏ ｏ ｕ ｌ？／ｙｔｕ
：イモリエース６０，０００の溶液３ｍρに懸副させ、
３０℃にて３０分間ゆるやかに振盪してスフェロプラス
ト化し、遠心分離によりこれを集める。このスフェロプ
ラストを０゜１％トリトンＸ−１００，５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）１πσに充分懸濁し、数回激しく
攪拌し１、 ７０００回転にて１０分間遠心して得ら
れる上清液を酵母溶菌液としてとる。
この溶菌液２０μρをＨＢｓ抗原ＲＩＡキット（アボッ
ト社製）によりＨＢｓ抗原活性を測定した。その結果を
第１表に示す。
ト社製）によりＨＢｓ抗原活性を測定した。その結果を
第１表に示す。
第１表
＊）このベクターはＨＢＶまたはＨＢｓ遺伝子を含んで
いない陰性対照である。
いない陰性対照である。
（なお、ＲＩＡ測定キットの陰性コントロールは３１０
ｃｐｍ、陽性コントロールは７゜５００ ｃｐｍであっ
た）
ｃｐｍ、陽性コントロールは７゜５００ ｃｐｍであっ
た）
第１図は本発明のシャトルベクターの具体例、ｐＡＴ７
７およびｐＡＭ８２の構造、第２図は該シャトルベクタ
ーの酸性ホスファターゼプロモーター付近の遺伝子地図
、第３図はそのＢｓｔＥ ＩＩＩ −５ａｌＩ領域の塩
基配列を示す。
７およびｐＡＭ８２の構造、第２図は該シャトルベクタ
ーの酸性ホスファターゼプロモーター付近の遺伝子地図
、第３図はそのＢｓｔＥ ＩＩＩ −５ａｌＩ領域の塩
基配列を示す。
Claims (1)
- （１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且つ酵母
の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域を担った
組換えプラスミドにエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１処理
を施すことにより、前記酸性ホスファターゼの構造遺伝
子と該構造遺伝子の上流の所定部位までを除去すること
を特徴とするシャトルベクターの構築方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57145093A JPS5936699A (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | シヤトルベクタ− |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57145093A Division JPS5936699A (ja) | 1982-08-16 | 1982-08-20 | シヤトルベクタ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62115289A true JPS62115289A (ja) | 1987-05-26 |
| JPH0665308B2 JPH0665308B2 (ja) | 1994-08-24 |
Family
ID=15377210
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57145093A Granted JPS5936699A (ja) | 1982-08-16 | 1982-08-20 | シヤトルベクタ− |
| JP61107431A Expired - Lifetime JPH0665308B2 (ja) | 1982-08-20 | 1986-05-10 | 組換えプラスミドの構築方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57145093A Granted JPS5936699A (ja) | 1982-08-16 | 1982-08-20 | シヤトルベクタ− |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5707862A (ja) |
| JP (2) | JPS5936699A (ja) |
| KR (1) | KR840005740A (ja) |
| AU (1) | AU562633B2 (ja) |
| CA (1) | CA1270453A (ja) |
| DK (1) | DK381483A (ja) |
| ES (1) | ES8602935A1 (ja) |
| SU (1) | SU1393317A3 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0811074B2 (ja) * | 1987-10-30 | 1996-02-07 | 財団法人化学及血清療法研究所 | プレアルブミンをコードする遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよびこれを用いたプレアルブミンの製法 |
| JPH0291660U (ja) * | 1988-12-28 | 1990-07-20 | ||
| US20020142337A1 (en) * | 2001-03-29 | 2002-10-03 | Edwards David N. | Hybrid gene libraries and uses thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5948082A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-03-19 | チバ−ガイギ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 酵母発現ベクター系 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2441659A1 (fr) * | 1978-11-14 | 1980-06-13 | Anvar | Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant |
| JPS5931799A (ja) * | 1982-08-16 | 1984-02-20 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
| IL69202A (en) * | 1982-09-08 | 1991-08-16 | Smith Kline Rit | Surface antigen polypeptides of hbv virus produced in yeast and the preparation thereof |
| CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
| JPH0655146B2 (ja) * | 1985-12-27 | 1994-07-27 | 財団法人化学及血清療法研究所 | シヤトルベクタ− |
-
1982
- 1982-08-20 JP JP57145093A patent/JPS5936699A/ja active Granted
-
1983
- 1983-08-15 AU AU18003/83A patent/AU562633B2/en not_active Expired
- 1983-08-18 KR KR1019830003854A patent/KR840005740A/ko not_active Application Discontinuation
- 1983-08-19 DK DK381483A patent/DK381483A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-08-19 CA CA000435007A patent/CA1270453A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-08-19 SU SU833635251A patent/SU1393317A3/ru active
- 1983-08-19 ES ES525065A patent/ES8602935A1/es not_active Expired
-
1986
- 1986-05-10 JP JP61107431A patent/JPH0665308B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-11-29 US US07/622,344 patent/US5707862A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5948082A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-03-19 | チバ−ガイギ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 酵母発現ベクター系 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK381483A (da) | 1984-02-21 |
| US5707862A (en) | 1998-01-13 |
| SU1393317A3 (ru) | 1988-04-30 |
| DK381483D0 (da) | 1983-08-19 |
| JPS6155951B2 (ja) | 1986-11-29 |
| ES525065A0 (es) | 1985-12-01 |
| JPH0665308B2 (ja) | 1994-08-24 |
| ES8602935A1 (es) | 1985-12-01 |
| AU1800383A (en) | 1984-02-23 |
| KR840005740A (ko) | 1984-11-16 |
| CA1270453A (en) | 1990-06-19 |
| AU562633B2 (en) | 1987-06-18 |
| JPS5936699A (ja) | 1984-02-28 |
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