JPS61502655A

JPS61502655A - 酵母クロ−ニングビヒクル

Info

Publication number: JPS61502655A
Application number: JP50324385A
Authority: JP
Inventors: ベツク，アントン・ケイ; シル，グレゴリー・ピー; バーンステイン，エドワード・ジー; レモント，ジエフリー・エフ
Original assignee: インテグレ−テッド・ジェネティックス・インコ−ポレ−テッド
Priority date: 1984-07-09
Filing date: 1985-07-09
Publication date: 1986-11-20
Also published as: EP0188555A1; EP0188555A4; DK103886A; DK103886D0; WO1986000637A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵母クローニングビヒクルｖｅｈｉｃｌｅ　）に関する。（本明細書において使用する”タン・ξり質″という語はサイズが不特定のＲプチド類を包含する。）酵母のような真核細胞を、遺伝子または特定タン・ξり質の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コーディング配列の発現用宿主として使用することは次第に関心をもたれてきている。一般Ｋ、真核細胞から放出されるタンパク質は、前駆体タンパク質（アミン末端”シグナル” ペプチド領域を含む）の合成、小胞体膜を横切る輸送、その後の特異的シグナルペプチドの切断、炭水化物付加（グリコジル化）を含むプロセッシング、最後に細胞からの成熟生産物の分泌をともなう分泌経路においてプロセッシングを受ける。酵母サツカロミセス・セレビシェ（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃθｅＣｅｒｅＶｉ８１ａＱ　）はこのような分泌経路を有することが知られてング・ハーバ−研究所、１９８２年におけるシェフマン（Ｓｃｈｅｋ−ｍａｎ　）およびノビツク（Ｎｏｖｉｃｋ　）の”分泌過程および酵母細胞表面アセンブリー（Ｔｈｅ　５ｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ａｎｄ　ｙｅａｓｔｃｅｌｌ　−Ｉｌ］ｕｒｆａｃｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　）　”を参照されたい〕。さらに、いくつかの原核生物種に存在する類似の分泌経路と異なって、酵母の分泌機構はタンパク質をグリコジル化しうる成分を与える。

ヒツツ？　７　（Ｈｉｔｚｓｍａｎ　）らのニエ王ヱ２２１９　：　６２０〜６２５（１９８３）は、インターフェロンシグナル配列を含むコーディング領域に基づくヒトインターフェロンの酵母による発現および分泌を報告している。ヒララマンらが報告した分泌成熟タンツク質はシグナルＲプチドの不正確な切断を示した。

ヒネン（Ｈｌｎｎｅｎ　）らは国際微生物学会議（マサチューセッツ州ボストン、　１９８２年）において、酵母サツカロミセス・車上。

ビシエのＰＨ０ｓ遺伝子からのＤＮＡ断片（プロモーターおよびＰＨ０５シグナル配列の５′末端の８０％を含む）の、成熟タン・ξり質配列をコート９するｃＤＮＡ断片およびヒトα−インターフェロンのシグナル配列の３′末端の一部への融合を報告した。ＰＨ０５はこの酵母の分泌酵素である酸性ホスファターゼ（リン酸基により抑制される）をコードする。この構成物はＰＨ０５シグナルＯフチドの最後の３個のアミノ酸のだめのＤＮＡコーディング配列を欠き、その代わりに・・イブリッドシグナルの最後の３個のアミノ酸はヒトｃＤＮＡ配列によりコードされるもの・・・すなわちプレーインターフェロンシグナル情報のアミノ酸である。ヒネンらにより作製されたプラスミＶはサツカロミセス・セレビシェの細胞を形質転換するのに用いられた。この形質転換細胞はリン酸基の制御下にインターフェロン活性を発現すると報告された。インターフェロン活性の分布（細胞内対細胞外）は論じられなかった。

発明の概要第一の面において、本発明は一般にタンパク質の発現および分泌のために微生物を形質転換する際に使用できるクローニングビヒクルは転写の順に、酵母転写調節ＤＮＡ配列、酵母シグナルはプチドをコードするＤＮＡ配列、および目的タンパク質をコードする外来性ＤＮＡ配列を含有する。

第二の面において、本発明は酵母ＰＨ０５転写調節配列と実質的に同一のシグナル配列；完全ＰＨ０５シグナルにプチドと実質的に同一であり、且つＰＨ０５シグナルＲプチト見同じ３個のカルボキシ末端アミノ酸を有するシグナルズプチドをコードする配列；および該シグナル配列のカルボキシ末端に隣接する制限エンドヌクレアーゼ切断部位；を含むＤＮＡ断片を提供する。

第三の面において、本発明は自然界に存在するＰＨ０５転写調節配列およびシグナル配列を準備し、そしてＤＮＡシグナル配列によりコート藩れる３個のカルボキシ末端アミノ酸の同一性を変えることなくシグナル配列の３′末端に１つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を作ることによりそれらを修飾することから成る上記プラスミドの作製方法を提供する。

外来性ＤＮＡ配列を含むクローニングビヒクルは酵母宿主を形質転換するのに使用でき、形質転換宿主を培養して目的タンパク質を分泌させることができる。

７酵母転写調節ＤＮＡ配列”という用語は、ＤＮＡの転写を開始するのに有効な酵母内に自然界で存在するＤＮＡ配列を意味する。”酵母シグナルＤＮＡ配列° という用語は、酵母内に自然界で存在するシグナルはプチド配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。”外来性ＤＮＡ“は本発明ビヒクルの酵母転写調節ＤＮＡ配列および酵母シグナルＤＭＡ配列と関連して自然界では見出せないＤＮＡを意味する。

好適な実施態様において、転写調節ＤＮＡ配列は自然界に存在する酵母遺伝子の転写調節ＤＮＡ配列と同一であシ、酵母シグナルＤＮＡ配列は該遺伝子により生産されるシグナルベプチビと同一の×ゾチドをコードする。酵母遺伝子は大きな抑制酵素（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　）の酸性ホスファターゼをコート９するＰＨ０５遺伝子である。ＰＨ０５はサツカロミセス・セレビシェ内の染色体２のゲノムＤＮＡの８キロ塩基（Ｋｂ）　ＥｃｏＲ工領域に含まれる。

この遺伝子の転写調節配列および隣接シグナルＤＮＡ配列は双方とも、この領域のより小さな６００塩基対（ｂｐ）のＢａｍＨＩ−Ｋｐｎ工部分に含まれる。外来性ＤＮＡは非分泌（または分泌）酵母タンパク質をコードする酵母ＤＮＡでありうるが、好ましくは非酵母タン・ξり質をコードするＤＮＡ配列に相当する。

上記のクローニングビヒクルは酵母内での外来性ＤＮＡの発現を可能にし、こうしてタンパク質産物が酵母から周囲の培地中に分泌される。さらに、タンパク質はプロセッシング（すなわち酵母シグナル配列の除去）後にその成熟体で回収される。

後述するように、シグナル配列の配置および間隔を制御すると、目的の外来性タンパク質が宿主生物により発現およびプロセッシングされ、それによりシグナル配列の切断が正確な部位で起こって、成熟体のタンパク質が分泌されるであろう。

成熟タン・々り質の正確なプロセッシングを行うために必要とされる情報は酵母シグナルＤＮＡ配列に含まれ、外来性タンパク質をコードするＤＮＡ配列の性質には無関係である。上記のクローニンブイフタ−は分泌および非分泌外来性タンパク質をコート９するどのようなりＮＡ配列の発現および分泌に対しても有用である。

第１図はプラスミ）’　９９　ＮＭｌｕ−アルファを示す模式図である。

第２図はプラスミｌ−＃９９Ｎを示す模式図である。

第３図はプラスミド９９　ＮＭｌｕを示す模式図である。

第４図はプラスミ）’９９Ｎ−アルファを示す模式図である。

第５図は成熟アルファｈＣＧの最初の３０ヌクレオチドのためのコーディング配列を含む、ｐＢＲ３２２内でクローニングされたＤＮＡ断片の制限エンドヌクレアーゼによる切断地図の一部クローニングベクターまたはビヒクルの諸成分は第１図のプラスミド’ｇｇＮＭ１ｕ−アルファ、または第４図のｐ９９Ｎ−アルファにより例示される。このプラスミドは機能的プロモーター領域および転写開始部位から成る酵母転写調節配列を含む。

機能的酵母プロモーター領域は他のプラスミド成分から上流に転写を開始させるのに十分な配列、例えば自然界に存在する完全な酵母プロモーターを含むべきである（自然界に存在し且つ３′末端にある種の欠失を含む酵母転写調節ＤＮＡ配列もまた機能的プロモーターである。）。ＢａｍＨ工部位（−５５３）からＡＴＧ　）リプレツ）　（＋１　、＋２．＋３と定める）に先行するヌクレオチドゞまでの５’−３’ＤＮＡ配列は、転写を開始させるのに十分な上流配列を有する機能的ＰＨ０５プロモーター領域を表わす。ＰＨ０５転写調転写域の３′末端にある種の欠失を含むものも機能的プロモーターである。

９９９８Ｍ１ｕ−アルファはシグナルはブチＰ（ＰＨ０５シグナルペプチドと同一）をコードシ、このはゾチドは次のアミノ酸配夕ＩＩ：Ｍｅ　ｔ−Ｐｈｅ　− Ｌｙｓ　−３ｅｒ　−Ｖａｌ−Ｍａｌ−Ｔｙｒ　−３ｅｒ−Ｉ　ｌｅ　−Ｌｅｕ −Ａｌａ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａを有する。ｐ９９ＮＭｌｕ−アルファに含まれるシグナルはプチドをコードするＤＮＡ配列はＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＴＴＧＴＩＴＡＴＴＣＡＡＴｒＩ’ＴＡＧＣＣＡＡＣＧＣＧである。

上記の酵母ＤＮＡ配列は目的とする外来性タンパク質をコードするＤＮＡ配列と同調的に位置づけられる。”外来性タンパク質”とは、自然界に存在する系において、ビヒクルの酵母プロモーターの制御下に生産されず且つビヒクルの酵母シグナルにプチドと共に生産されないタンパク質を意味する。この用語は酵母タンノξり質を含むが、好ましくは外来性ＤＮＡ配列は非酵母タンパク質の成熟体をコードする。

成熟タンパク質をコードする配列に対するシグナル配列の融合を促進させるために、自然界に存在するシグナルＤＮＡ配列を変化させることができる。しかしながら、得られるシグナルにプチト９のアミノ酸配列に反映する変化は避けるべきである。

シグナルＤＮＡ配列の３′末端は外来性ＤＮＡ配列の５′末端に連結（１ｉｇａｔｉＯｎ　）され、これらの配列間に外部からのヌクレオチドが全く存在しないようにする。この方法では形成期のタンパク質が目的とする成熟タンパク質に直接に隣接したシグナルにプチドを含み、そして分泌されるタンパク質は外部アミノ酸を含まないだろう。

好適なりローニングビヒクルの他の成分には、ＤＮＡ複製開始点およびシラスミド選択用の表現型塩基を与えるＤＮＡ断片が含まれる。９９９８Ｍ１ｕ−アルファに存在する詳細な特徴は、その前駆体プラスミドｐ９９　Ｎおよびｐ９９Ｎからの９９９８Ｍ１ｕ−アルファの作製方法に関する次の説明により例示される。

クローニングビヒクルの作製および前駆体上記のクローニングビヒクルは、多目的のクローニング部位を与えるように修飾された、酵母転写調節配列および酵母シグナル配列を含むベクターを遺伝子操作することにより作製される。プラスミ）”９９ＮＭ１ｕ　（第３図参照）はクローニング部位ＭｘｕＩを含むこの種のベクターである。この制限酵素部位は酵母シグナルＤＮＡ配列の末端に、またはその近くに配置されるべきであシ、こうして制限エンドヌクレア、−ゼ消化または合成リンカ−の使用により遺伝子工学的に処理された、目的の分泌または非分泌タンパク質をコードする外来性ＤＮＡ配列がその後プラスミ）”９９ＮＭ１ｕのＭ１ｕＩ部位に挿入され、それにより目的タンパク質またはにプチドの発現および分泌が達成される。

制限酵素部位がどこに配置され且つどんな配列が必要とされるかによって、使用するリンカ−は自然界に存在する完全なシグナルＤＮＡ配列を保持するように遺伝子操作されるが、遺伝暗号の不必要な部分は実施する遺伝子操作工程に関して若干の柔軟性を与える。同様に、シグナル配列への同調融合を確かなものとするために、外来性ＤＮＡ配列の５′末端忙おいて遺伝子操作およびヌクレオチド９付加が必要となるかも知れない。この種のリンカ−の構造および作製の例は９９９８Ｍ１ｕ−アルファに関して後述する。

ｐ９９Ｎおよびその作製の詳細な説明は以下の通シであり、その後制限酵素部位Ｍ１ｕ工を挿入することによるｐ９９Ｎからの９９９８Ｍ１ｕの作製を説明する。この作製において使用する通常の組換えＤＮＡ法は、マニアラス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）　ラのモレキュラークローニンク：実験手引書、コールド・スプリング・ハーバ−研究所、コールドトスプリング・ハーバ−（１９８２）に記載サブラスミド９９Ｎは次のＤＮＡセグメントを含有する（　Ｅｃ。

Ｒ工部位から時計と反対口りに）：１、酵母の染色体４からの１．４５ＫｂのＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡ断片に含まれる機能的ＴＲＰ１遺伝子〔キンゲスマン（Ｋｉｎｇａｍａｎ）らの遺伝子（Ｇｅｎｅ　）二、　１４１〜１５２（１９７９）およびジャンパー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ　）およびカーボン（Ｃａｒｂｏｎ　）の遺伝子　１０．１５７〜１６６（１９８０）を参照〕。この断片は１０３ｂｐの機能的ＴＲＰ　１プロモーター領域、６７２ｂｐのコーディング配列、および転写終結配列としてばかりでな（ａｒｓｌ配列と呼ばれる弱いＤＮＡ複製開始点（またはレプリコン）として機能する６７８’ｂｐ３’非翻訳領域を含む；プラスミ）’　Ｙ　Ｒｐ　７はジャンパーおよヒカーボンの上記文献（１９８０）に記載されておシ、ＴＲＰＩおよびアンピシリン耐性遺伝子が同じ方向で転写されるような向きでｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたこの１．４５　ＫｂのＥｃｏＲＩ断片アンピシリン耐性遺伝子および大腸菌内で機能するＤＮＡ複製開始点を含有する；３、大部分のサツカロミセス・セレビシェ菌株に内在する２ミクロンの自然界に存在する環状プラスミドの３体からの１．４５ＫｂのＨｉｎｃ　［断片〔ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ　）のサツカロミセス属酵母の分子生物学：　％ｆ’８ｍｂｌＵ’　＠　（Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎａ　Ｉｎｈｅ−ｒｉｔａｎＣｅ　）　＋　コールド・スプリング・ハーバ−研究所、コールド・スプリング・ハーバ− 、１９８１年を参照〕。Ｈｌｎｃ　■　断片は”強い″ＤＮＡ複製開始点を含み（すなわち、それは酵母内でより高いプラスミドコピー数を与えるのでａｒｓ　ｌよりも゛強力“である）、且つ有光細胞分裂あたシに相当低いプラスミド損失率を与える。これはまた大部分の酵母菌株に保有される内生０２ミクロンプラスミドの存在が原因している。プラスミド９９Ｎにおけるベクター断片の向きはこの機能にとって重要ではない；４、ｐＢＲ３２２のＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩからノ５９７ｂｐ配列；ｓ、ｓＫｂのＥｃｏＲニーＰＨ０５断片からの０．６ＫｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩセグメント。この断片は完全なＰＨ○５プロモーターおよび１７個のアミノ酸から成るシグナルはプチド（初めのメチオニンを含む）をコードするのに必要な全てのＤＮＡ配列を合む；および６．　ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲ工断片がスば一す−（５ｐａｃｅｒ　）領域として使用される。この断片の起源および長さはプラスミド９９Ｎ　またはその誘導体での使用にとって重要ではない。プラスミド９９Ｎにおけるスに一す−領域はＰＨ０５構造配列から成る。

プラスミド＃９９Ｎは次のようにして作製される。プラスミドＹＲｐ７をＥｃｏＲＩで部分消化して、２つあるＥｃｏＲＩ部位のうち１つだけを切断する。大部分の消化産物は５．ＢＫｂの線状化されたＹＲｐ７分子から成る。これらの線状分子のうち約半分は一方のＢｃｏＲＩ部位で切断され、残りの半分は他方のＥｃｏＲＩ部位で切断される。この線状分子混合物をマニアチスらの上記文献（１９８２）に記載されるようなゲル電気泳動、その後のゲルからの溶離により、非切断環状分子および短い線状分子（両方のＥｃｏＲＩ部位が切断されることによりまれに生じる）から分離する。その後５′突出ＥｃｏＲＩ末端はＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ酵素）を使ってａＮＴＰで修復する。（これとは別に、５′ＥｃｏＲ工突出末端は最初に１本鎖特異的５′→ごエキソヌクレアーゼを使って除去することができる。）このようにして生じた平滑末端分子はＤＮＡＩＪガーゼを使って再連結（環状化）させ、これにより１つのＥｃｏＲＩ認識配列が欠失される。ＴＲＰＩプロモーターに隣接したＥｃｏＲ工部位全部位する当該プラスミドＹＲｐ７’は制限酵素マツピングにより同定する。次に酵母２ミク０７プラスミト９由来ノ１．４５ＫｂのＨ１ｎｃｌｌ断片をＹＲｐ７’のＮｒｕＩ部位に連結させる。得られたプラスミドＹＲｐ７’Ｎは１ｉ：ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの両方で消化する。ゲルから単離される６、８７Ｋｂの大きな断片がベクター断片である。

サツカロミセス・セレビ／工のＰＨ０５遺伝子はｐ６０と呼ばれるにプチドに相当する大きな、リン酸基により抑制される酸性ホスファターゼ酵素（ＡＰａｓｅ）をコードシ、且つ染色体２からのＢＫｂのＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡ断片内に含まれる〔ポスチアン（Ｂｏｅｔｉａｎ　）らの旦ＮＡＳ　ｎＪ４５０４〜４５０８　（１９８０）およびクラ？　−（Ｋ　ｒａｍｅｒ　）およびアンデルセｙ　（Ａｎｄｅｒｓｅｎ　）のＰＮＡＳ７７、　６５４１〜６５４５　（１９８０）を参照されたい〕。ＰＨ０５断片はＢＫｂのＥｃｏＲ，Ｉ　ＰＨ０５領域を保有するプラスミド〔例えばｐＡＰ２０．アンダーツ７　（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　）　、チ＃（’ｒｈｉ１１）およびクラマーのモＬ／り・セル・バイオｏ　（Ｍｏ１ｅｃ、　ＣｅｒＩＢｉｏｌ、　）３　：　５６２〜５６９．１９８３を参照〕をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化し、０，６ＫｂのＢａｍＨＩ−Ｋｐｎ工断片をゲルから単離することにより作られる。ＢａｍＨＩ部位（−５５３）からＡＴＧ　）リプレットに先行するヌクレオチドまでの５′→３’　Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、転写を開始させるのに十分な上流配列を有する機能的ＰＨ０５プロモーター領域を表わす。

ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩス×−サー断片の組成は任意である。プラスミ）’９９Ｎ　の場合のスば一す−断片は、Ｋｐｎ工部位（＋ｑ４ｂｐ）から始まってＰｓｔ工部位（＋１５００ｂｐ）　（ＥｃｏＲＩリンカ−配列が付加される）で終るＰＨ０５構造配列から成る。この断片はＰＨ０ｓ断片およびベクター断片と組み合わせ、ＤＮＡＩＪガーゼを使って環状プラスミドとする。この生成物を使って大腸菌をアンピシリン耐性へと形質転換する。形質転換細胞のこのプールから、プラスミ）”９９Ｎを同定し且つプラスミドＤＮＡを作る。

プラスミド９９ＮはＮＲＲＬに寄託番号１５７９０　として寄託された。

プラスミド９９Ｎは”プラスミド９９Ｎ−アルファ”のところで述べる技術を使って、最初の塩基対がＧから始まる外来性ＤＮＡ配列のだめのクローニングビヒクル（例えばｐ９９Ｎ−アルファ）を作製する際に使用できる。また、ｐ９９ＮにＭ１ｕＩ部位を挿入すると、最初の塩基対の同一性に係りなく外来性ＤＮＡの発現が可能になるであろう。

プラスミ）”９９ＨＭ１ｕ９９ＨのＰＨ０５シグナル配列の３′末端内にＭ１ｕ工部位を挿入するためには、次の遺伝子操作工程を必要とする。最初に、ＰＨ０５プロモーターおよびシグナル配列を含む９９Ｎの１．９５ＫｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２内に挿入してプラスミドｐＢＲＰｈｏを作る。次いで、ｐＢＲＰｈｏのｐＢＲ部分にあるＢａｌＩ部位を排除（Ａｖａ　Ｉ−Ｐｖｕ　］ｌ断片を除去）してｐＡＰＰを作製する。今や、ｐＡＰＰはＰＨ０５シグナルをコードするＤＮＡ配列の３′末端に接近して位置するＢａｌＩ部位を１つだけ有する。

次の工程はＢａＩＩ部位の隣りに位置するＫｐｎ工部位をＭ１ｕＩ部位で置換することを包含する。この置換を達成するために、ｐＡＰＰをＫｐｎＩで消化し、３′突出部分をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使って除く。合成Ｍ１ｕニリンカー（ＡＣＧＣＧＴ）を連結し、続いてＭｌｕＩで消化後連結してこのベクターを閉じる。細菌の形質転換細胞をＭｌｕＩ部位の有無について調べて、シラスミドｐＡＰＰＭを単離する。

ｐＡＰＰＭはＭｌｕＩで消化し、ＢａｌＩ部位およびＭ１ｕＩ突出部分を含む合成７一体（５’ＴＧＧＣＣＡＡ　３’）および１１一体（５’ＣＧＣＧＴＴＧＧＣＣＡ３’）を連結させる。これらのリンカ−のいくつかを２つのＭ１ｕ工突小突出の中間に連結させることができ、これは次の構造：（ＰＨＯｓシグナル−Ｅａｘ・・・Ｍｘｕ−Ｂａｘ・・・・・・Ｂａ１−Ｍｌｕ）へと導く。これらの構造体をＢａＩＩで消化し、連結させてベクターを閉じる。これは全ての不必要なリンカ−を除き、Ｍ１ｕＩ部位をＰＨ０５シグナル内のＢａＩＩ部位の隣りに移動させ、それにより意図する配置を得る。この配置はＤＮＡ塩基配列決定により証明される（　ｐＰｈｏＭ）。

プラスミド９９Ｎおよびｐ　Ｐｈｏ　Ｍからの９９ＨＭ１ｕの作製は次のように行われる。ｐＰｈｏＭの１，９５ＫｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離し、次にＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの両方で切断し且つ細菌の酸性ホスファターゼで処理した９９ＮＫ連結させる。細菌の形質転換細胞をＭ１ｕＩ部位含有プラスミドについてスクリーニングする。第３図に示すこのプラスミド９９ＮＭ１ｕを単離し、そして託された。

こうして、９９ＨＭｊｕをＭｌｕＩで消化する場合４−塩基突出部分が作られ、これはシグナル配列のカルボキシ末端をコードする部位で正確に終っている。このＭ１ｕ工突小突出は、ＤＮＡ　４リメラーゼＩ（フレノウ酵素）の大型断片を使ってａＮＴＰで修復する（平滑末端の完全なＰＨ０５シグナル配列を生ずる）か、あるいはこの突出部分をヌクレアーゼＳ１で消化する（最後の４つのヌクレオチドが消失した平滑末端のＰＨ０５シグナル配列へと導く）かのいずれかの方法で修飾することができる。９９Ｎ　Ｍｌｕのこの領域はさらにＦ’ｎｕＤ■（認識配列ＣＧＣＧ　）で切断でき、これは最後の２つのヌクレオチドが消失した平滑末端のＰＨ０５シグナル配列をもたらす。

これらの修飾は、制限酵素による消化丑たは合成リンカ−の使用により遺伝子工学的に処理されたコーディング領域への枠内でのＰＨ０５シグナル配列の融合を可能にする。

次の実施例はＰＨ０５のプロモーター、翻訳開始部位およびシグナル配列によって支配されたプツ力ロミセス・セレビシェにオケるヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのアルファサブユニット（アルファｈＣＧ）の合成および分泌を開示している。

アルファｈＣＧ　および酵母酸性ホスファターゼはともにそれらのアミン末端にシグナルペプチドを含むプレータンパク質から誘導されル分泌タンパク質である。

成熟アルファｈＣＧ　のコーディング配列の最初の５０ヌクレオチドは、既知制限酵素の認識配列を全く含まない。従って、シグナル配列へのアルファｈＣＧ　の成熟部分の融合は非常に長い合成リンカ−の広範な使用を必要とする。このことは制限酵素認識部位の全部のヌクレオチドではなく１つまたは２つのヌクレオチド９を含む位置で、成熟コーディング配列の出発点から下流に１つの制限酵素部位を作ることにより避けることができる。

その後、この新しく作った制限酵素部位とｃ＋ｃ＋ＮＭｘｕのＭ１ｕＩ部位との間に比較的短い安価な合成りＮＡ断片を挿入する。

好適な方法において、アルファｈＣＧの成熟体をコードするＤＮＡ断片は、プラスミド９９　ＮＭ　１ｕのＰＨ０５シグナルへの正確な同調融合を達成するために遺伝子工学的に処理される。

完全なプレーアルファｈＣＧ分子をコードするアルファｈＣＱクローンは、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ工とＥＣ０ＲＩ（７）間でクローニングした。この挿入物の制限酵素切断地図の一部および成熟アルファｈＣＧのコーディング配列の最初の３０７クレオチドの配列を第５図に示す。成熟アルファｈＣＧの最初のアミノ酸のコドンは矢印で示した羽塩基から出発する。９４位置のＧをＣで置換すると、Ｐｓｔ工部位（ＣＴＧＣＡＧ　）が作られるだろう。その後この部位は合成りＮＡＩＪンカニを挿入するために使用される。

エキソヌクレアーゼＢａ１３１を使って、約９０ｂｐが消化されるような条件下でＢａｍ　ＨＩ部位からこの断片を切除することができる。これらの消化断片にＥｃｏＲニリンカー（それらの３′末端にＣを含む）を連結させる。切除がｓ’ ＴＧＣＡＧ　３’の配列で正確に終った分子のみが、Ｃの付加後に、９４位置にＰｓｔ　工部位を含むだろう。こうして、上記の連結混合物をＰｓｔ工で切断し、長さが約２５０　ｂｐの断片（各末端にＰｓｔＩ部位を含む）をｐＢＲ３２２のＰ日ｔＩ部位でクローニングすることにより選択することができる。この断片を含むプラスミドはＰｓｔ工で消化して、合成１〇一体（５’ＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣ３’）および１８一体（５’ＣＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡ３’）を連結させる。これらのリンカ−はＭ１ｕ■突出部分およびＰｓｔ　Ｉ突出部分で終る消失したアルファｈＣＧコーディング配列を含む。その後、これらの連結混合物をＭｌｕＩで消化し、その断片をｐＰｈｏＭのＭｌｕＩ部位においてクローニングする。アルファｈＣＧコーディング領域の３′断片はＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてこのシラスミド内に挿入できる。成熟アルファｈＣＧ　コーディング領域へ融合したＰＨ０５シグナルおよびＰＨ０５プロモーターを含む全部のＢａｍＨＩ７ＫｃｏＲ工断片はｐ９９ＮＭｌｕ内に挿入し、それによ！ｌｌｐ９９ＮＭ１ｕ−アルファを作製する。このプラスミドはその後酵母を形質転換するために使用する。

プラスミド９９Ｎ−アルフア別の方法において、プラスミド９９Ｎ　をハイブリッド遺伝子（ＰＨＯｓシグナル配列がアルファｈＣＧ　の成熟体をコードするＤＮＡ配列と融合したもの）を作製するためのイクターとして使用して、プラスミド’９９Ｎ−アルファ（第４図に示す）を作った。ハイブリッド遺伝子の特異的作製は、ＰＨ０５シグナル配列が全１７アミノ酸シグナルＲプチビをコードする最初の５１ヌクレオチドと追加のダアニン（Ｇ）残基のみを含むように処理されたので可能であった。これは初めにＰＨ０５ＤＮＡをＫｐｎＩ酵素で消化して３′突出鎖を生成することによシ達成された。次に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性によシ平滑末端分子を得た。成熟アルファｈＣＧのコーディング領域は、ｐ９９ＮＭ１ｕ−アルファの上記作製方法と同じ方法で処理された。

成熟コーディング領域へＧＡを付加すると、認識配列ＧＡＧＣＴＣを有する新しい制限酵素部位Ｓａｃ　Ｉが作られる。これはＢａ１３１を使ってＢａｍＨ工部位から切除したアルファｈＣＧ　断片を、修復５ａＩＩ部位を含む断片（それ故それらの末端にＧＡを含む）に連結させることによシ達成された。新しく作られた５ａｃＩ部位はその中にＡ１ｕ工部位（ＡＧＣＴ　）を含む。ＡｌｕＩで切断すると、成熟アルファｈＣＧの最初のアミノ酸の最初のＧを消失した断片が生成する。これらの断片を９９Ｎ　内の修飾シグナルペプチドへ融合させると、成熟アルファｈＣＧをコードする配列に同調融合された完全なＰＨ０５シグナル配列、翻訳開始部位および完全なプロモーターを含むプラスミド９９Ｎ−アルフアが作製される。

プラスミド９９Ｎ−アルフアは寄託番号Ｂ　１５７９１としてＮＲＲＬに寄託された。

タンノξり質の合成ベッグス（Ｂｅｇｇｓ　）　’のネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　２７５　：　１０４〜１０９　（１９７Ｂ）に記載されるような標準技術を使って、宿主酵母をクロー二／グビヒクルで形質転換する。

よび遺伝子発現、６０７〜６３６頁、コールド・スプリング・ノ・−バー研究所、コールドゞ・スプリング・ノ１−バー、ニューヨーク州、１９８２年におけるボッツタイン（Ｂｏｔｅｔθｉｎ）およびデービス（Ｄａｖｉｓ）の゛酵母による組換えＤＮＡ研究の原理および実施″゛に要約されるような標準技術を使って、標準培地で培養する。分泌された成熟ポＩＪ　ｄプチドは周囲の培地から回収する。

プラスミ）’９９Ｎ−アルファを用いて、突然変異ｔｒｐ　１遺伝子（トリプトファン要求性を引き起こす）を保有するサツカロミケス・セレビシェの菌株をＴｒｐ＋表現型（トリプトファン原栄養株）へ形質転換した。プラスミ）”９９Ｎ −アルファは形質転換酵母をトリプトファンの不存在下で増殖させる発現可能な酵母ｔｒｐｌ遺伝子を保有する。プラスミ）’ＤＮＡによる酵母の適当な形質転換方法は例えばばッグスの上記文献（１９７８年）Ｋ記載されている。１つ以上のＴｒｐ＋形質転換酵母をトリプトファン不含合成増殖培地上での単集落分離により分離した。この培地は５Ｃ−ＴＲＰと呼ばれ、その組成を表１に示す。

表　１デキストロース　２０　ｇ２０　９硫酸アンモニウム　５　ｇ　５　ｇ硫酸マグネシウム　０．５，９　０．５ｇ塩化ナトリウム　０．１ｇ０．１１！塩化カルシウム　０．１．９　０．１Ｆビオチン、葉酸　各々　２μｇ　各々２ μＩホウ酸　５００μｍ　５００μｇ硫酸銅　４０μｇ　４０μＩヨウ化カリウム　１００μ、９　１００μｌイノシトール　２　ｒＲ９２■ トレオニン　１５０　ｍ９　１５０　■ロイシン、リシン　各々６０ｒｎｇ各々６０　ηＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ　３０ｍ９ＫＣＩ　Ｏ１，５ｇ形質転換菌株はトリシトファンを含まず且つＫＨ２ＰＯ４３０ｒｎ９／ｌおよびＫｃｌｌ、５ｇ／ｌを含む低リン酸塩含量の合成液状増殖培地中でインキュ（− トシた。この培地はＬＰ３ｏ（ＳＣ−ＴＲＰ）有する細胞はこの培地で増殖し、そして無機リン酸の細胞内濃度が減少し始めるときアルファｈＣＧ　の合成を開始する。３０℃で２日間インキュベートした後、抗原的に活性なアルファｈＣＧの実質上全部（９０チ以上）が培地中に見出された。代表的濃度はラジオイムノアッセイで測定して０．２　ｍ９／ｌ　またはそれ以上であった。

アルファｈＣＧの大部分または全部が培地中に分泌されたので、最初に遠心分離、濾過などのいくつかの有利な手段のいずれかを使って収穫した細胞懸濁液から酵母細胞を取り除いた。その後、細胞不含の発酵培地は、純粋なアルファｈＣＧを単離するように設計された適当なタンパク質精製法で処理した。

先に述べたように、シラスミド’９９ＮＭｌｕ外来性遺伝子またはｃＤＮＡにＰＨ０５シグナル配列を結合させる際に使用され、そしテサツ力ロミ七ス・セレビシェのいずれの菌株にも導入することができる。その後、ｐ９９Ｎ−アルファで形質転換した酵母を使用するアルファｈＣＧの生産について上述したような技術を使って目的の外来性タンパク質を生産させるだめに、この形質転換酵母を使用することができる。この系は細胞外液体中に分泌され且つ収量の増大した外来性タンパク質を与える。

本明細書において述べたプラスミド寄託物は各々（ａｉ　本特許出願の未決の間、培養物に対する利用は３７　ＣＦ’Ｒ１，１４および３５　Ｕ、　Ｓ、　Ｃ，１２２のもとて権利があると米国特許／商標局の長官によって決定された者に限り認める；および（ｂ）寄託培養物の一般人への利用可能性の制限は全て最終的に本特許の認可の際に解くことを保証する；という条件のもとで作られた。

その他の実施態様その他の実施態様は次の請求の範囲内のものである。発現されたポリペプチド中のシグナル切断部位の十分な認識を達成するために、３個の末端アミノ酸は自然界に存在する酵母シグナル配列のアミノ酸と同一であるべきである。完全な未修飾シグナル切断部位を生産することが望ましいが、当業者なら若干の変更を施しつつ請求された本発明を利用することが可能であるだろう。同様に、目的ポリペプチドのＮ末端において数個の外部アミノ酸を加えることができ、またシグナルＤＮＡ配列の末端に関して制限酵素部位のわずかな（３〜６塩基対）移動を許容することができる。

ＦＩＧ　１ＦＩＧ　２ＦＩＧ　３ＦＩＧ　４国際調査報告＋ｍ″″″＋１ａａａｌ　Ａ＠ｇ＆ｔａｂｈｎ　Ｈａｐ、、〒、、Ｓ日、、、ｏ１３０６

Claims

【特許請求の範囲】

（１）互いに同調した状態で且つ転写の順に、酵母転写調節配列；酵母シグナルペプチドをコードする酵母シグナル配列；および目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列から成る外来性ＤＮＡ配列；を含み、酵母宿主内で外来性ＤＮＡ配列を発現し得るクローニングビヒクル。
（２）酵母シグナル配列および外来性ＤＮＡ配列が、目的タンパク質に隣接した完全な酵母シグナルペプチドから成り且つこれらの間に外部からのアミノ酸が全く存在しないタンパク質をコードする、請求の範囲第１項記載のクローニングビヒクル。
（３）酵母転写調節配列がリン酸により抑制される酵母酸性ホスフアターゼ遺伝子の自然界に存在する転写調節配列と実質的に同一である、請求の範囲第１項記載のクローニングビヒクル。
（４）酵母転写調節ＤＮＡ配列が酵母ＰＨＯ５遺伝子の転写調節配列と実質的に同一である、請求の範囲第３項記載のクローニングビヒクル。
（５）酵母転写調節配列がサッカロミセス・セレビシエの染色体２からの８ＫｂのＥｃｏＲＩ　ＰＨＯ５ゲノムＤＮＡ断片の０．６ＫｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片内に含まれる断片と実質的に同一である、請求の範囲第４項記載のクローニングビヒクル。
（６）酵母シグナル配列が自然界に存在するリン酸−抑制性酵母酸性ホスフアターゼ遺伝子により発現されるシグナルペプチドと実質的に同一のペプチドをコードする、請求の範囲第１項記載のクローニングビヒクル。
（７）酵母シグナルＤＮＡ配列がＰＨＯ５ゲノム断片により発現される完全なシグナルペプチドと同一のシグナルペプチドをコードする、請求の範囲第６項記載のクローニングビヒクル。
（８）シグナルペプチドのカルボキシ末端における３個のアミノ酸がＡｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａである、請求の範囲第１項記載のクローニングビヒクル。
（９）酵母シグナル配列が次のシグナルペプチド：【配列があります】をコードする、請求の範囲第８項記載のクローニングビヒクル。
（１０）酵母シグナル配列（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）が：【配列があります】のいずれかである、請求の範囲第９項記載のクローニングビヒクル。
（１１）外来性ＤＮＡ配列が非分泌タンパク質または非分泌ペプチドをコードする、請求の範囲第１項記載のクローニングビヒクル。
（１２）外来性ＤＮＡ配列が分泌タンパク質または分泌ペプチドをコードする、請求の範囲第１項記載のクローニングビヒクル。
（１３）外来性ＤＮＡ配列が哺乳動物のタンパク質またはペプチドをコードする、請求の範囲第１項記載のクローニングビヒクル。
（１４）自然界に存在する酵母ＰＨＯ５転写調節配列と実質的に同一の転写調節配列；自然界に存在する酵母ＰＨＯ５ゲノムＤＮＡにより発現される酵母シグナルペプチドと実質的に同一のシグナルペプチドをコードするシグナル配列、この際前記シグナル配列によりコードされる前記シグナルペプチドの３個のカルボキシ末端アミノ酸は、自然界に存在する前記のＰＨＯ５ゲノムＤＮＡにより発現される３個のカルボキシ末端アミノ酸と同一である；および前記シグナル配列の３′末端の制限エンドヌクレアーゼ切断部位、この際前記３′末端と前記切断部位の間には外部からの塩基対が存在しない；を含み、それにより目的タンパク質をコードする外来性ＤＮＡがその外来性ＤＮＡの適切なリーデイング・フレームを保ちつつしかも前記シグナル配列の３′末端と前記外来性ＤＮＡの５′末端の間に外部からの塩基対を導入することなしに、前記シグナル配列ヘスプライシングされ得るＤＮＡ断片。
（１５）酵母シグナルＤＮＡ配列が次のペプチド：【配列があります】をコードする、請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ断片。
（１６）酵母シグナルＤＮＡ配列が【配列があります】からなる請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ断片。
（１７）制限エンドヌクレアーゼ部位がＭｌｕＩである請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ断片。
（１８）ＤＮＡ断片がクローニングベクターＰ９９ＮＭｌｕ（ＮＲＲＬ番号Ｂ１５７９２）またはｐ９９Ｎ（ＮＲＲＬ番号１５７９０）の中に組み込まれる、請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ断片。
（１９）自然界に存在する酵母ＰＨＯ５転写調節配列と実質的に同一の転写調節配列；次のシグナルペプチド：【配列があります】をコードするシグナル配列；前記シグナル配列の３′末端に隣接するＧヌクレオチド；を含み、それにより目的タンパク質をコードする外来性ＤＮＡが、その５′末端にＧ塩基を結合する場合、その外来性ＤＮＡの適切なリーデイング・フレームを保ちつつＤＮＡ断片の前記３′末端ヘスプライシングされて、目的タンパク質に隣接した前記シグナルペプチドから成り且つこれらの間に外部からのアミノ酸が存在しないペプチドをコードするＤＮＡを作製し得るＤＮＡ断片。
（２０）シグナル配列（追加のＧヌクレオチドを含む）が【配列があります】である請求の範囲第１９項記載の断片。
（２１）転写調節配列および自然界に存在するシグナル配列と同一のシグナル配列を含むプラスミドを準備し；前記の自然界に存在する酵母シグナル配列をその３′末端で修飾して制限エンドヌクレアーゼ切断部位を作り、この場合修飾されたシグナル配列が自然界に存在する酵母シグナル配列によりコードされる３個のカルボキシ末端アミノ酸と同一の３個のカルボキシ末端アミノ酸をコードする９個の塩基対をその３′末端に含む；ことから成る請求の範囲第１４項記載のクローニングビヒクルの作製方法。
（２２）目的ペプチドおよびペプチドシグナル配列から成るペプチドを酵母宿主内で合成し、前記目的ペプチドを酵母宿主の膜を通して分泌させる方法であって、転写の順に、酵母転写調節ＤＮＡ配列；シグナルペプチドをコードする酵母シグナルＤＮＡ配列（前記シグナルペプチドの３個のカルボキシ末端アミノ酸は自然界に存在する酵母シグナルペプチドの３個のカルボキシ末端アミノ酸と同一である）；および目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列からなる外来性ＤＮＡ配列；を含み、これらの配列が互いに同調的に位置づけられ、酵母宿主内で前記外来性ＤＮＡ配列を発現し得るクローニングビヒクルを準備し；酵母宿主を前記クローニングビヒクルで形質転換し；その後形質転換された酵母宿主を培養して所定のタンパク質またはペプチドを分泌させる；ことから成る方法。
（２３）所定のタンパク質がグリコシル化される請求の範囲第２２項記載の方法。