JP2791418B2 - 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は血清アルブミンシグナルペプチドをコードす
るDNA、及びこのDNAを含む組換えDNAを用いることによ
る酵母による異種蛋白質の製造方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕

組み換えDNA技術により、目的蛋白質を組み換え宿主
に産生させる場合、その宿主が目的蛋白質を分泌発現す
ることに多くの利点が見出される。即ち、目的蛋白質が
宿主細胞内に直接発現されると宿主の増殖、生存に不都
合な毒性を示す場合、目的蛋白質を分泌発現することで
この毒性を回避することができる。また、毒性を持たな
い場合でも、目的蛋白質が宿主細胞内に多量に蓄積する
と宿主の増殖を抑制する場合があるが、分泌発現ではこ
れを避けることが可能である。また、目的蛋白質が宿主
細胞内に蓄積するような発現系では、目的蛋白質が宿主
細胞内で変性し、不溶化する現象がよく見られるが、分
泌発現の系ではこれを回避できる。また、商業的に組み
換えDNA技術を用いて目的蛋白質を生産する場合、目的
蛋白質が細胞内に蓄積する系では目的蛋白質を精製する
為に、細胞を破壊し、その破壊液中から目的蛋白質を精
製する必要がある。このような精製では組み換え宿主由
来の不純物が多く混入し、高純度の目的蛋白質を得るこ
とが困難である。一方、分泌発現系で目的蛋白質を生産
する場合には、培養液から目的蛋白質を精製すればよ
く、組み換え宿主由来の不純物の混入は最小限に防ぐこ
とができ、大きなメリットとなる。また、蛋白質の多く
は、糖鎖の付加、ジスルフィド結合の形成、不活性な前
駆体蛋白質の限定水解による活性化、特定のアミノ酸の
リン酸化、カルボキシル化等の修飾を受けるが、これら
の中には各種細胞で共通に備わった機能もあり、これら
の修飾のいくつかは分泌の過程で生じる。従って、目的
蛋白質を分泌発現で生産する場合、細胞内に蓄積する系
に比較して、より自然な蛋白質に近い機能および構造を
持った蛋白質の生産が期待される。

シグナルペプチドの性状についてはいくつかの知見が
あり、そのアミノ酸配列の特徴は以下のようである。Ｎ
末端近傍に塩基性アミノ酸が多く、またＣ末端側のシグ
ナルペプチダーゼに消化される部位近傍には極性を有す
るアミノ酸が多く、また、その間は疎水性のアミノ酸が
連続する。Ｎ末端近傍の延期性アミノ酸は、細胞内部表
面のリン脂質と相互作用し、中央部の疎水性アミノ酸の
連続は細胞膜通過に重要な役割を果たし、Ｃ末端の極性
アミノ酸はシグナルペプチダーゼに消化される時の認識
部位の役割を演じていると推定されている。このような
特徴は原核生物から高等動物に到るまで極めて類似して
おり、共通の蛋白質分泌メカニズムを推定させる。（M.
S.Briggs and L.M.Gierasch（1986）Adv.Protein Che
m.,38,109−180;G.von Heijne（1984）EMBO J.,３,2315
−2318） ヒト血清アルブミン蛋白質はプレプロ型蛋白質として
遺伝子上にコードされている〔特開昭62−29985号公報,
A.Dugaiczyk等（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,79,71
−75）参照〕。分泌に必須なシグナルペプチドから成熟
ヒト血清アルブミンのＮ末端近傍のアミノ酸配列、およ
びそれをコードするDNA配列を第１表に示した。

このうち、18アミノ酸から成るシグナルペプチドは分
泌時に除去され、また、６アミノ酸から成るプロペプチ
ドはプロセッシングにより除去されて、Asp−Ala−His
−Lys−Ser・・・のＮ末端アミノ酸配列を有し、585ア
ミノ酸から成る成熟ヒト血清アルブミン蛋白質となる。

ところで、酵母は菌体外プロテアーゼの分泌も少な
く、さらに分泌物に糖鎖を付加することもできるという
理由により異種蛋白質の分泌発現にとって優れたもので
ある。

しかして、酵母以外の細胞で分泌発現に寄与するシグ
ナルペプチドが、酵母においても機能する例がいくつか
報告されている。例えば、卵白リゾチームシグナルペプ
チドを用いたヒトリゾチームの酵母における分泌発現
（地神（1987）BIO IN−DUSTRY,4,117−123.）、植物蛋
白質タウマチンのシグナルペプチドを用いたタウマチン
の酵母における分泌発現（L.Edens,I.Bom,A.M.Ledeboe
r,J.Maat,M.Y.Toonen,C.Visser and C.T.Verrips（198
4）Cell,37,629−633）、ヒトインターフェロンαのシ
グナルペプチドを用いたヒトインターフェロンの酵母に
おける分泌発現（R.A.Hitzeman,D.W.Leung,L.J.Perry,
W.J.Kohy,H.L.Levineand D.V.Goeddel（1983）Science,
219,620−625）などである。

しかしながら、酵母以外の細胞で本来分泌発現に寄与
するシグナルペプチドが、酵母においても機能するとは
かぎらないのが実情である。

従って、本発明の目的は酵母から異種蛋白質を効率よ
く分泌発現させる方法、当該方法に使用されるベクタ
ー、および当該ベクターにて形質転換された形質転換体
を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

このような背景のもとに、本発明者らは酵母による蛋
白質の分泌発現に必須なシグナルペプチドについて研究
を重ねて来たところ、ヒト血清アルブミンのシグナルペ
プチドが酵母におけるシグナルペプチドとして機能する
ことを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させる
に至った。

即ち、本発明は下記（１）〜（４）に関するものであ
る。

（１）血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子及びその
誘導体。

（２）前記血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子を含
む組換えDNAを用いて形質転換した酵母から異種蛋白質
を分泌発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造方
法。

（３）前記血清アルブミンシグナルペプチドをコードす
るDNAを含む酵母を形質転換するための組換えDNA。

（４）前記血清アルブミンシグナルペプチドをコードす
るDNAを含む組換えDNAにて形質転換された酵母。

本発明に関する組換えDNAは、血清アルブミンシグナ
ルペプチド遺伝子、異種蛋白質遺伝子、プロモーター、
ターミネーターおよびプラスミドDNA又は染色体DNAから
なる。

血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は、例えば哺
乳動物に由来するものが好適に使用される。具体的には
ヒト由来、ラット由来、ウシ由来のものなどが用いられ
る。また、その遺伝子は主要部を残して変異させたもの
であってもよい。

ヒト由来のものとしては、 ラット由来のものとしては、 ウシ由来のものとしては、 などのアミノ酸配列で表わされるDNAが例示される。

当該血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は好まし
くは、ヒト由来のものが使用される。

さらに、本シグナルペプチド遺伝子は、一部変更する
ことによって、より効率的な効果を得ることができ、そ
れは次の一般式で示されるアミノ酸配列をコードする遺
伝子からなる。

好ましい組合わせとしては第２表のごときものが例示
される。

血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は上述したア
ミノ酸配列で表現できるDNA配列を有していればよい
が、各アミノ酸のコドンとして好ましいものは次の通り
である。

Ala:GCT又はGCC,Crs:TGT,Asp:GAC,Glu:GAA,Phe:TTC,Gl
y:GGT,His:GAC,Ile:ATT又はATC,Lys:AAG,Leu:TTG,Met:A
TG,Asn:AAC,Pro:CCA,Gln:CAA,Arg:AGA,Ser:TCT又はTCC,
Thr:ACT又はACC,Val:GTT又はGTC,Trp:TGG,Tyr:TAC 本発明における異種蛋白質としては、ヒト血清アルブ
ミン、インターフェロン−α，βあるいはγ、ウロキナ
ーゼ、成長ホルモン、インシュリン、各種リンホカイ
ン、ｈ−ANP、血液凝固第VIII因子、各種CSF、エリスロ
ポエチンなどが挙げられるが、特に限定されるものでは
ない。

ウロキナーゼの場合はプロ型などのいずれであっても
産生は可能である。異種蛋白質中特に、成熟型のヒト血
清アルブミン遺伝子が好ましい。本発明の特徴の一つ
は、シグナル配列と成熟型構造遺伝子、特に成熟型ヒト
血清アルブミン遺伝子を直接つないだことにあり、これ
により驚異的なアルブミンの産生量を達成したのであ
る。

このような異種蛋白質遺伝子は、特開昭62−29985号
公報（ヒト血清アルブミン）、特開昭61−185189号公報
（インターフェロン−α）、特開昭61−108397号公報
（インターフェロン−γ）、特開昭60−180591号公報
（ウロキナーゼ）などに記載されている。

上述の文献中では、異種蛋白質遺伝子を含むプラスミ
ドとして開示されている。

本発明の酵母を形質転換するための組換えDNAは、血
清アルブミンシグナルペプチド遺伝子の下流に異種蛋白
質遺伝子を自体既知の手段で連結し、さらに自体既知の
手段にてプラスミド又は染色体内に導入し、調製され
る。

プロモーターおよびターミネーターは酵母で機能する
ものであれば特に限定されない。

プロモーターとしては、PGKプロモーター（Nucleic A
cid Res.10（23）7791（1982））、ADHプロモーター（N
ucleic Acid Res.10（23）7791（1982））、phoE（５）
プロモーター（J.Mol.Biol.163（４）513（1983））、G
AL1プロモーター（Mol.Cell.Biol.４（11）2467（198
4））、GAL10プロモーター（Mol.Cell.Biol.４（11）14
67（1984））、GAP−DHプロモーター（J.Biol.Chem.258
5291（1983））などが好適に使用される。特にGAL1プ
ロモーターとの組み合わせが好ましい。

プロモーターは血清アルブミンシグナルペプチド遺伝
子の上流に位置する。

ターミネーターとしてはphoE（５）ターミネーター
（Cell,12,721−732（1977））、GAPDHターミネーター
（J.Biol.Chem.,254,9839−9845（1979））などが好適
に使用される。

ターミネーターは異種蛋白質遺伝子の下流に位置す
る。

プロモーター、ターミネーターは各々プラスミドに組
み込まれた形で入手される。

プラスミドDNAは酵母中で自律複製可能なものであれ
ば特に限定されない。

具体的には、pJDB207（アマーシャム社製）、pJDB219
（アマーシャム社製）などが例示される。

本発明の組換えプラスミドは、上述したプラスミド群
から各々、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子−異
種蛋白質遺伝子からなるDNA配列、プロモーターを含むD
NA配列およびターミネーターを含むDNA配列を制限酵母
により切り出した後に連結（接続）して適当なプラスミ
ドに組み込むか、または、一方のDNA配列を切り出した
後に他方のプラスミド中に組み込むかのいずれかの方法
により得られる。また、本発明の組換え染色体は、以下
の文献に記載された方法で酵母染色体中にプロモータ
ー、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、異種蛋白
質遺伝子、ターミネーターを挿入して得られる。（Pro
c.Nael.Acad.Sci.（U.S.A.），78,6354−6358（198
1）），（Method Enzymol.,101,228−245（1983）） その際、配列の順序は上流から下流に向かって、プロ
モーター、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、異
種蛋白質遺伝子、ターミネーターとなるように調製す
る。

また、選別時のマーカーとして、抗生物質〔テトラサ
イクリン、アンピシリン、カナマイシン〕耐性遺伝子あ
るいは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込むことも
可能である。

この組換えプラスミドを用いて形質転換体を製作する
方法ひいては異種蛋白質を製造する方法は以下の通りで
ある。

組換えプラスミドを宿主細胞に導入する。宿主細胞と
しては酵母が用いられる。具体的には挿入されるプラス
ミドが担持する選択マーカー遺伝子によって相補する変
異をもった変異株、たとえばロイシン要求性変異株であ
るサッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevi
siae）AH22（a,his4,leu2,can1）等が好適に用いられ
る。

宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方法、たとえ
ば、リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチ
レングリコール融合法、エレクトロポレーション法など
により行う。

必要な形質転換体を選択する。

形質転換株は、宿主細胞の自体公知の倍地で培養す
る。倍地としてはYNB液体倍地〔0.7％Yeast Nitrogen B
ase（Difco社）、２％グルコース〕、およびYPD液体倍
地〔１％イーストエキストラクト（Difco社）、２％ポ
リペプトン（大五栄養社）２％グルコース〕などが例示
さる。

培養は、通常15〜43℃（好適には30℃程度）で20〜10
0時間程度行い、必要により通気や撹拌を加えることも
できる。

培養後、培養上清を回収し、自体公知の方法、たとえ
ばアフィニティクロマトグラフィー、分画法などにより
異種蛋白質を精製する。

〔効果〕

本発明の方法により、目的とする異種蛋白質を分泌発
現で生産することができ、細胞内で蓄積する系に比較し
て、より自然な蛋白質に近い機能および構造を有する異
種蛋白質の生産が期待できる。

また、目的蛋白質が細胞内に蓄積する系では目的蛋白
質を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊液中から目
的蛋白質を精製する必要があが、本発明の方法によれば
かかる精製の必要がない。

特に蛋白質の分泌発現に必須なシグナルペプチドにつ
いて血清アルブミンシグナルペプチドを選択したことに
より、新たな発現系が確立でき、異種蛋白質の効率的な
発現に対しても有用と考えられる。さらに本発明の系
は、成熟型ヒトアルブミン遺伝子の発現・産生系におい
て、約160mg/のアルブミンの産生という驚異的な成果
を得た。

また、適宜アルブミンシグナル配列を変異（例えば第
２表）することにより、産生させるアルブミンのＮ末端
部が正確に切断された。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げる
が、本発明はこれらによって何ら限定されるものではな
い。

なお、本発明において多くの技法、反応および分析方
法は当業界においてよく知られている。特にことわらな
い限り、全ての酵素は商業的供給源、たとえば宝酒造；
ニューイングランド バイオラブス（NEB）（New Engla
nd Biolabs（NEB）〕マサチューセッツ、米国；アマー
シャム（Amersham）、英国およびベセスダ リサーチ
ラボラトリーズ〔Bethesda Research Labolatories（BR
L）〕、メリーランド、米国から入手することができ
る。

酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らな
い限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。

プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、プラークハ
イブリダイゼーション法、電気泳動法およびDNAのゲル
からの回収法は、「モレキュラークローニング」コール
ドスプリングハーバーラボラトリー〔「Molecler Cloni
ng」Cold Spring Harbor Laboratory（1982）〕に記載
されている方法により行った。酵母の形質転換法は、
「メソッド・イン・イースト・ジェネティクス」コール
ドスプリングハーバーラボラトリー（「Method in Yeas
t Genetics」）（Cold Spring Harbor Laboratory）（1
981）に記載されている方法で行った。

1.酵母GAL1,10プロモーターのクローニング １−1.酵母染色体DNAライブラリーの作製 酵母サッカロミセスセレビシエGRF18 PHO80cir⁰株
（特開昭61−268184号）の染色体DNAをR.Cryer等の方法
（R.Cryer et al.（1975）Method Enzymol.,12,39）で
抽出精製した。

M.Johnson and R.W.Davis（M.Johnson and R.W.Davis
（1984）Mol.Cell.Biol.,４,1440−1448.）によれば、
酵母GAL1,10プロモーター領域は酵母染色体上にあり制
限酵素EcoR I及びXba Iで消化すると約1kbのDNA断片と
して得られる。そこで上記のように抽出精製した酵母染
色体DNAをEcoR I及びXba Iで消化し、電気泳動により約
1kbのDNA断片を単離した。これをEcoR I及びXba I消化
し、子牛小腸由来アルカリホスファターゼ（CIP）で
５′末端のリン酸基を除いたプラスミドpUC19（ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリー社製）と混合し、ライゲー
ションキット（宝酒造社製）で連結した。これを大腸菌
エシェリシアコリJM109コンピテントセルに導入した。
トランスフォーマントを0.004％Ｘ−gal（５−bromo−
４−chloro−３−indolyl−β−thiogalactoside）及び
1mM IPTG（isopropy1−β,D−thiogalactopyranoside）
含有YTアガープレート（ポリペプトン8g、イーストエキ
ストラクト5g、塩化ナトリウム5gを水に溶解し、１と
した後12gの寒天末を加えてオートクレーブ滅菌後、プ
ラスチックシャーレに分注、固化する。Ｘ−gal,IPTGは
オートクレーブ後、培地が冷えてから添加する。）に塗
布し、37℃，一夜培養した。白色及び青色のコロニーが
出現するが、このうちDNAインサートを有するlaz Z遺伝
子欠損の白色コロニーのみを100個ずつ40μg/mlアンピ
シリン含有Ｌアガープレート（トリスベース0.62g、ポ
リペプトン10g、イーストエキストラクト5g、塩化ナト
リウム5gを水に溶解し、１とした後12gの寒天末を加
えてオートクレーブ滅菌し、プラスチックシャーレに分
注、固化する。アンピシリンはオートクレーブ後、倍地
が冷えてから添加する。）に滅菌した爪楊枝にて接種し
た。このＬアガープレートを37℃、一夜培養した。この
ような方法で、約5000個から成るライブラリーを作製し
た。形成したコロニーをニトロセルロースフィルターに
移し、0.5M水酸化ナトリウム−1.5M塩化ナトリウムから
成る溶液に浸しDNAを変性させ、次いで、1.5M塩化ナト
リウム−0.5Mトリス−塩酸,pH7.5から成る溶液で中和し
た。大腸菌の残渣を2xSSC（0.3M塩化ナトリウム−0.03M
クエン酸ナトリウム、pH7.0）で洗浄、除去しフィルタ
ーを風乾後、更に80℃、２時間減圧乾燥した。

１−2.プローブの作製 GAL1,10プロモーターをコードする遺伝子の塩基配列
の一部をアプライドバイオシステム社製DNA合成装置モ
デル381Aを用い、ホスホアミダイト法にて合成した。そ
の配列を以下に示す。

これを7M尿素−20％ポリアクリルアミドゲルで電気泳
動し、精製した。精製したDNA配列の５′末端を、［γ
−³²P］ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放
射能ラベルした。合成DNA10pmoles,［γ−³²P］ATP250
μCi,T4ポリヌクレオチドキナーゼ８ユニットを用いた
反応により³²Pで末端ラベルされた合成DNAプローブが、
2x10⁷cpm（セレンコフコウント）得られた。合成DNAプ
ローブの精製はNENSORB20（デュポン社製）を用いて行
った。

１−3.GAL1,10プロモーターのスクリーニング １−１項でDNAを固定したニトロセルロースフィルタ
ーを10枚ずつ一組にしてビニール袋に入れ、以下の処理
をした。6x SSC,0.1％SDS,及び100℃,5分間加熱後氷上
で冷却したサケ精子DNA20μg/mlから成るプレハイブリ
ダイゼーション溶液10mlをビニール袋に入れ、シール
後、40℃,3時間インキュベートした。プレハイブリダイ
ゼーション液を廃棄し、ハイブリダイゼーション溶液10
mlを入れて、40℃，一夜インキュベートした。ハイブリ
ダイゼーション溶液の組成は6x SSC,0.1％SDS,100μg/m
lサケ精子DNA,7.5x10⁵cpm/mlの³²P−プローブとした。
インキュベート終了後、フィルターをビーカーに移し、
6x SSC,0.1％SDSで50℃,30分間、2x SSC,0.1％SDSで50
℃,30分間、2x SSC,0.1％SDSで50℃,30分間、最後に0.1
x SSC,0.1％SDSで50℃,30分間の順に洗浄した。洗浄し
たフィルターは風乾し、100−200cpmのマークをスポッ
トした後オートラジオグラフィーした。その結果、２個
のポジティブクローンが得られた。このうちの１クロー
ンを40μg/mlアンピシリン含有スーパーブロス（バクト
トリプトン12g,イーストエキストラクト24g,グリセロー
ル5mlを水に溶解し900mlとしてオートクレーブ滅菌した
Ａ液、及びリン酸２水素カリウム3.81g,リン酸１水素カ
リウム12.5gを水に溶解し100mlとしてオートクレーブ滅
菌したＢ液を9:1（v/v）の割合で混合したもの）中37
℃，一夜振盪培養し、アルカリ−SDS法にてプラスミドD
NAを抽出精製した。このプラスミドDNA（pGAL11、図
１）について一部塩基配列をダイデオキシ法にて調べた
とろ、報告されている配列（M.Johnston and R.W.Davis
（1984）Mol.Cell.Biol.,4,1440−1448.）と一致した。
pGAL11はEcoR IからXba I部位の方向にGAL1プロモータ
ー、逆の方向にGAL10プロモーターを有している。

１−4.pGAL11 Xba I部位のBamH I部位への変換 pGAL11上のプロモーター配列を、シグナルペプチド及
びヒト血清アルブミン蛋白質をコードするDNA配列と連
結する場合に、Xba I部位を介する事はヒト血清アルブ
ミン遺伝子上にXba I部位が存在するので不都合であ
る。そこで、Xba I部位をBamH I部位に変換した。pGAL1
1をXba I消化後、dGTP,dATP,dTTP,dCTP存在下、大腸菌
由来DNAポリメラーゼI,クレノウ断片により付着末端を
修復した。このDNA断片に５′末端がリン酸化されたBam
H Iリンカー_pCGGATCCGを加え、T4 DNAリガーゼにより連
結した。これをBamH Iで消化後、再度T4 DNAリガーゼに
より連結し大腸菌エシェリシアコリHB101に導入した。
得られたトランスフォーマントより図１に示したプラス
ミドpGAL12を有するクローンを得た。

pGAL12をEcoR I及びBamH Iで消化する事により、約1k
bのDNA断片としてGAL1及びGAL10プロモーターを単離で
きる。

2.酵母pho5ターミネーターを有する大腸菌・酵母シャト
ルベクターpTP2の作製 特開昭62−151183号公報に述べられた酵母サッカロミ
セスセレビシエpho5遺伝子をコードしたプラスミドpAP5
を制限酵素Sau3A I及びPst Iで消化し、約370bpのpho5
ターミネーターをコードしたDNA断片を電気泳動で単離
した（図２）。市販のプラスミドpUC9をBamH I及びPst
Iで消化し、アルカリホスファターゼで処理後、上記370
bp断片と連結した。370bp断片のSau3A I切断部位の塩基
配列は であり、これはBamH I付着末端と連結するとBamH I部位
が再生される。従って、上記連結反応で得られたプラス
ミドpPT1をBamH I及びPst Iで消化する事により、ある
いはBamH I及びHind IIIで消化する事により370bpのpho
5ターミネーターを有するDNA断片が得られる（図２）。

市販のシャトルベクターpJDB207（図３）は大腸菌及
び酵母中で自律複製が可能である。これをBamH Iおよび
Hind IIIで消化後、アルカリホスファターゼ処理した。
pPT1をBamH I及びHind IIIで消化後、約370bpのpho5タ
ーミネーターを有するDNA断片を電気泳動で単離し、上
記pJDB207と連結した。得られたトランスフォーマント
より、図３に示したプラスミドpPT2を有するクローンを
得た。pPT2はpho5ターミネーターを有する大腸菌・酵母
シャトルベクターであり、大腸菌においてはβラクタマ
ーゼによるアンピシリン耐性のマーカー、酵母において
はロイシン栄養要求性を補うマーカーをそれぞれ有して
いる。

3.ヒト血清アルブミン遺伝子 ヒト血清アルブミンをコードするDNA配列は特開昭62
−29985に述べられたプラスミドpGX401（図4,5）に由来
し、以下のように誘導した。プラスミドpGX401を制限酵
素Xba I及びHind IIIで消化し、ヒト血清アルブミン蛋
白質のアミノ酸配列Ｃ末端側³⁵⁷Leu〜⁵⁸⁵Leu及び３′非
翻訳領域をコードする、約750bpのDNA断片（HSA2）を電
気泳動で単離した。市販のプラスミドpUC19をXba I及び
Hind IIIで消化し更にアルカリホスファターゼで処理
し、５′末端のリン酸基を除去した後、T4 DNAリガーゼ
によりHSA2と連結した。これを大腸菌エシェリシアコリ
HB101に導入し、得られたトランスフォーマントより図
６に示したプラスミドpHSA2を有するクローンを得た。

pGX401をDra I及びXba Iで消化し、約1kbのDNA断片を
電気泳動で単離した。このDNA断片はヒト血清アルブミ
ン蛋白質のアミノ酸配列Ｎ末端側¹²Lys〜³⁵⁶Thrをコー
ドするDNA配列である。

アプライドバイオシステム社製DNA合成機モデル381A
を用いてホスホアミダイト法にて成熟ヒト血清アルブミ
ン蛋白質のアミノ酸配列Ｎ末端¹Asp〜¹¹Pheをコードす
る以下のDNA配列を合成した。

アスパラギン酸（Asp）をコードするコドンはpGX401
ではGATであったが、ここではGACとした。その結果。上
記合成DNAを前記pGX401由来の約1kb DNA断片と連結後、
pUC19のSal I−Xba I部位に挿入するとSal I部位が再生
される。しかも、Hinc IIで消化すれば成熟ヒト血清ア
ルブミンのＮ末端¹Aspから始まるアミノ酸配列をコード
したDNA配列が得られる。

上記合成DNAの５′末端をATP及びT4ポリヌクレオチド
キナーゼによりリン酸化し，上記pGX401をDra I及びXba
Iで消化し電気泳動で単離した約1kbのDNA断片とT4 DNA
リガーゼで連結した。これを大腸菌エシェリシアコリHB
101に導入し、得られたトランスフォーマントから、図
７に示したプラスミドpHSA1を有するクローンを得た。

4.酵母にヒト血清アルブミンを分泌発現させる為のプラ
スミドDNAの作製 ヒト血清アルブミンのシグナルペプチドをコードする
第３表のようなDNA配列をアプライドバイオシステム社
製DNA合成機モデル381Aを用いホスファアミダイト法に
て合成した。

また、同様に−17,−5,−4,−3,−2,−１の部位を各
々LysまたはArgまたはHis,AlaまたはPro,LysまたはGly,
ValまたはCys,TrpまたはSer,AlaまたはGlyをコードする
DNA配列も合成した。具体例は第２表に示した。これら
天然型のアミノ酸を変更させたアミノ酸をコードするDN
A配列を導入した場合、後述するアルブミンの生産にお
いて、生産量を落とすことなくＮ末の切断部が、より正
確なアルブミンの発現分泌が達成できた。

上記合成DNAの５′末端をATP及びT4ポリヌクレオチド
キナーゼによりリン酸化した。一方、pHSA1をXba I及び
Hind IIで消化しヒト血清アルブミン蛋白質のＮ末端側
をコードする約1kbのDNA断片HSA1を電気泳動で単離し
た。上記リン酸化した合成DNAとHSA1を混合し、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて連結し、更にXba I及びB
amH Iで消化した。pHSA2をXba I及びBamH Iで消化後、
アルカリホスファターゼで処理した。これらのDNAを混
合し、T4 DNAリガーゼで連結後、大腸菌エシェリシアコ
リHB101コンピテントセルに導入した。得られたトラン
スフォーマントのうち、図８に示したプラスミドpNH001
を有するクローンを得た。

pNH001をEcoR I及びBamH Iで消化後、アルカリホスフ
ァターゼで処理した。pGAL12をEcoR I及びBamH Iで消化
後、電気泳動によりGAL1プロモーターを有する1kbのDNA
断片を単離し、上記処理をしたpNH001と混合し、T4DNA
リガーゼにより連結した。得られたトランスフォーマン
トより、図９に示したプラスミドpNH007を有するクロー
ンを得た。pNH007はGAL1はプロモーター下流にヒト血清
アルブミンシグナルペプチドをコードするDNA配列、及
びその直後に成熟ヒト血清アルブミン蛋白質をコードす
るDNA配列、及びその直後のヒト血清アルブミンcDNA由
来３′非翻訳領域がpUC19のEcoR I−Hind III部位に挿
入されたプラスミドDNAである。

pNH007をEcoR I及びHind IIIで消化し、電気泳動によ
り2.7kbのGAL1プロモーター、シグナルペプチド、成熟
ヒト血清アルブミン蛋白質、非翻訳領域をコードしたDN
A断片を単離した。又、pPT2をBamH I消化し、更にアル
カリホスファターゼで処理した。これと上記2.7kb DNA
断片を混合し、dATP,dGTP,dTTP,及びdCTP存在下、DNAポ
リメラーゼI,クレノウ断片にて付着末端を修復した。更
に、T4 DNAリガーゼにより連結し、大腸菌エシェリシア
コリHB101に導入した。得られたトランスフォーマント
より、図10に示したプラスミドpNH008を有するクローン
を得た。pNH008は大腸菌及び酵母中で自律増幅可能なプ
ラスミドで、酵母において機能するGAL1プロモーターの
支配下にヒト血清アルブミンシグナルペプチドとそれに
続いて成熟ヒト血清アルブミン蛋白質をコードするDNA
配列を有している。更に、pNH008は大腸菌においてアン
ピシリン耐性を付与する遺伝子、及び酵母においてロイ
シン栄養要求性を補う遺伝子を有しており、これらの遺
伝子はトランスフォーマントの選択マーカーとして使用
可能である。

5.プラスミドpNH008の酵母への導入とヒト血清アルブミ
ンの分泌発現 ５−１プラスミドpNH008の酵母への導入 ヒト血清アルブミン分泌発現用プラスミドpNH008を酵
母サッカロミセスセレビシエAH22（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA75,1929−1933（1978））に以下の方法により導入
した。

YPDメディウム（イーストエキストラクト10g,バクト
ペプトン20gを水に溶解し900mlとした後オートクレーブ
滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した20％グルコース10
0mlと混合した。）50ml中30℃，一夜振盪培養したサッ
カロミセスセレビシエAH22を遠心し、得られた細胞を水
20mlに懸濁後、再度遠心して細胞を得た。これを10mlの
50mMジチオスレイトール,1.2Mソルビトール,25mM EDTA,
pH8.5に懸濁し、30℃で10分間穏やかに振盪した。遠心
により細胞を集め、1.2Mソルビトール10mlに懸濁し、再
度遠心により細胞を集めた。細胞を10mlの1.2Mソルビト
ールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞を10mlの
0.2mg/mlザイモリアーゼ100T,1.2Mソルビトール,10mM E
DTA,0.1Mクエン酸ナトリウム,pH5.8に懸濁後、30℃で１
時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め、1.2Mソルビ
トール、次いで、10mM塩化カルシウム,1.2Mソルビトー
ル各10mlで洗浄し、遠心で細胞を集めた。細胞を1mlの1
0mM塩化カルシウム,1.2Mソルビトールに懸濁した。懸濁
液100μを滅菌試験管にとり、５μ（５μｇ）のpNH
008と混合し、室温に15分間静置した。更に、1.2mlの20
％ポリエチレングリコール4000,10mM塩化カルシウム,10
mMトリス−塩酸,pH7.5を加え穏やかに混合後、室温で20
分間静置した。遠心で細胞を集め、0.1mlの1.2Mソルビ
トール,10mM塩化カルシウム含有YPDメディウムに懸濁
し、30℃で30分間穏やかに振盪した。懸濁液1,5,10,20,
及び50μをそれぞれ45℃に保温した10mlの1.2Mソルビ
トール,3％ノーブルアガー,2％グルコース,0.7％イース
トナイトロジェンベースに懸濁し、1.2Mソルビトール,3
％バクトアガー,2％グルコース,0.7％イーストナイトロ
ジェンベースから成るプレートに拡げた。プレートが固
化したら、30℃で３日間静置培養した。形成したコロニ
ーを爪楊枝で採取し、3mlの0.7％イーストナイトロジェ
ンベース,2％グルコースに懸濁後、30℃で２日間振盪培
養した。そのうちの1.5mlを遠心し、細胞を集め3mlのYP
Gメディウム（イーストエキストラクト10g,バクトペプ
トン20gを水に溶解し900mlとした後オートクレーブ滅菌
し、別にオートクレーブ滅菌した20％ガラクトース100m
lと混合した。）に懸濁し、30℃で振盪培養した。培養
上清のヒト血清アルブミン濃度をRPHA法（EP特許第1226
20号）にて測定したところ、１日目で最高10μg/mlのヒ
ト血清アルブミンが検出された。

５−2.ヒト血清アルブミン分泌発現酵母の培養 ５−１項で述べたpNH008で形質転換されたヒト血清ア
ルブミン蛋白質を分泌発現する酵母サッカロミセスセレ
ビシエAH22を以下のように培養した。0.7％イーストナ
イトロジェンベース,2％グルコース,3％バクトアガーか
ら成るプレートで成育した上記組み換え酵母を白金耳で
採取し、50mlの0.7％イーストナイトロジェンベース,2
％グルコースから成るYNBメディウムに接種し、30℃で
２日間培養した。これを、更に500mlのYNBメディウムに
全量接種し、30℃で２日間培養した。遠心により細胞を
集め、500mlのYPGメディウムに懸濁し、30℃で振盪培養
した。０、３、６、24、48時間毎に培養液の一部を採取
し、遠心で培養上清を得、RPHA法にて培養液中に分泌さ
れたヒト血清アルブミン濃度を測定した。その結果、培
養開始３時間目から僅かにヒト血清アルブミンの分泌発
現が検出され、６時間目で0.25mg/、24時間目で20mg/
、48時間目で160mg/のヒト血清アルブミンの分泌発
現が検出された。

実験例 ヒト血清アルブミン（以下、HSAという）シグナルペ
プチド遺伝子および成熟型HSA遺伝子からなるプラスミ
ド（pNH008）と、プレプロHSA遺伝子〔HSAシグナルペプ
チド遺伝子（プレ配列）、HSAプロ配列および成熟型HSA
遺伝子を有する〕からなるプラスミド（pNH006）を用い
てHSA発現量を比較した。

（pNH006の調製） 実施例において、プレプロHSA遺伝子を有するプラス
ミドpGX401からプレプロHSA遺伝子全体を切り出す（実
施例では成熟型HSA遺伝子のみを切り出した）以外はほ
ぼ実施例に準じて行い、GAL10プロモーター、HSAシグナ
ルペプチド遺伝子、HSAプロ配列、成熟型HSA遺伝子およ
びpho5ターミネーターを有するHSA発現用プラスミドpNH
006を構築した。詳細を以下に示す。

1.pNH004の構築 GAL1プロモーター/GAL10プロモーターを有するpGAL12
（3.7kb）およびpUC19（2.7kb）からGAL10プロモーター
を有するpNH004（2.7kb）を構築した。

（１）pGAL12をEcoR IおよびKpn Iで消化してGAL10プロ
モーター断片（690bp）を回収 （２）合成リンカー をカイネーション処理 （３）（ｉ）（２）の合成リンカーと（１）の断片を混
合 （ii）T4 DNAリガーゼ処理 （iii）BamH IおよびXba Iで消化 （４）（ｉ）pUC19をBamH IおよびXba Iで消化 （ii）アルカリホスファターゼ処理 （５）（ｉ）（３）の断片と（４）のベクターを混合 （ii）T4 DNAリガーゼ処理 2.pNH005の構築 pNH004およびプレプロHSA遺伝子を有するpGX401（6.3
kb）から、GAL10プロモーター−プレプロHSA遺伝子を有
するpNH005（4.5kb）を構築した。

（１）pGX401をHind IIIおよびBstE IIで消化してプレ
プロHSA遺伝子断片（1.8kb）を回収 （２）（ｉ）pNH004をHind IIIおよびBstE IIで消化 （ii）アルカリホスファターゼ処理 （３）（ｉ）（２）の断片と（３）のベクターを混合 （ii）T4 DNAリガーゼ処理 3.pNH006の構築 pNH005およびpho5ターミネーターを有するpPT2（7.3k
b）から、GAL10プロモーター−プレプロHSA遺伝子−pho
5ターミネーターを有するpNH006（10kb）を構築した。

（１）pNH005をBamH IおよびHind IIIで消化してGAL10
プロモーター−プレプロHSA遺伝子断片（2.7kb）を回収 （２）（ｉ）pPT2をBamH Iで消化 （ii）アルカリホスファターゼ処理 （３）（ｉ）（１）の断片と（２）のベクターを混合 （ii）dNTPおよびクレノウ断片を添加し、DNAポ
リメラーゼＩで処理 （iii）T4 DNAリガーゼ処理 （酵母への導入と発現） 実施例に準じて行った。

（結果） 両プラスミドを用いた場合のHSA発現量（mg/）を第
１表に示す。

【図面の簡単な説明】

図１はGAL1、10プロモーターを有するプラスミドpGAL11
からpGAL12を構築する手順を示す。 図２はpho5遺伝子全体を有するプラスミドpAP5とpUC9か
ら、pho5ターミネーターだけを有するpPT1を構築する手
順を示す。 図３はpho5ターミネーターを有するプラスミドとpJDB20
7からpPT2を構築する手順を示す。 図４および５はプレプロヒト血清アルブミン遺伝子を有
すプラスミドpGX401の制限酵素地図を示す。 図６はプラスミドpGX401とpUC9からヒト血清アルブミン
遺伝子Ｃ末端側を有するpHSA2を構築する手順を示す。 図７はプラスミドpGX401とpUC9からヒト血清アルブミン
遺伝子Ｎ末端側を有するpHSA1を構築する手順を示す。 図８は、pHSA1、pHSA2および合成したシグナルペプチド
遺伝子からシグナルペプチド遺伝子および成熟ヒト血清
アルブミン遺伝子を有するプラスミドpNH001を構築する
手順を示す。 図９はpNH001とpGAL12から、GaL1プロモーター、シグナ
ルペプチド遺伝子および成熟ヒト血清アルブミン遺伝子
を有するプラスミドpNH007を構築する手順を示す。 図10はpNH007とpPT2から、GAL1プロモーター、シグナル
ペプチド遺伝子、成熟ヒト血清アルブミン遺伝子および
pho5ターミネーターを有するプラスミドpNH008を構築す
る手順を示す。 第11図はプラスミドpGAL12とpUC19からGAL10プロモータ
ーを有するプラスミドpNH004を構築した後に、pNH004と
pGAL401からGAL10プロモーター、プレプロヒト血清アル
ブミン遺伝子を有するプラスミドpNH005を構築する手順
を示す。 第12図はpNH005とpPT2から、GAL10プロモーター、プレ
プロヒト血清アルブミン遺伝子およびpho5ターミネータ
ーを有するプラスミドpNH006を構築する手順を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 村上 弘次 大阪府枚方市北中振１―24―９ ミドリ 十字緑風寮 (72)発明者 筒井 潔 大阪府枚方市北中振１―24―９ ミドリ 十字緑風寮 (72)発明者 池ケ谷 和男 大阪府枚方市北中振１―24―９ ミドリ 十字緑風寮 (72)発明者 南野 仁史 大阪府大阪市城東区今福西１―13―８― 504 (72)発明者 上田 定男 京都府向日市寺戸町飛竜８―３ 飛竜荘 ８号 (72)発明者 川辺 晴英 大阪府吹田市山田西３―29―14 (72)発明者 有村 博文 大阪府豊中市上野坂２―18―１―401 (72)発明者 真崎 厚司 大阪府枚方市香里ヶ丘５―３―１ 香里 団地Ｃ１棟４号室 (56)参考文献 特開 昭58−174396（ＪＰ，Ａ) 欧州公開206733（ＥＰ，Ａ１) 生化学，53［６］ （1981） Ｐ. 427−443 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/81 C12P 421/02 C12N 1/19 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下のアミノ酸配列で表される血清アルブ
   ミンシグナルペプチド遺伝子を含む組換えDNAを用いて
   形質転換した酵母から異種蛋白質を分泌発現させること
   を特徴とする異種蛋白質の製造方法。 ただし、MetLysTrpValThrPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSer
   SerAlaTyrSerを除く。
2. 【請求項２】異種蛋白質がヒト血清アルブミンであり、
   成熟型ヒト血清アルブミン遺伝子とシグナルペプチド遺
   伝子を直接結合したことを特徴とする請求項（１）記載
   の製造方法。
3. 【請求項３】以下のアミノ酸配列で示される血清アルブ
   ミンシグナルペプチド遺伝子。 ただし、MetLysTrpValThrPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSer
   SerAlaTyrSerを除く。
4. 【請求項４】請求項（３）記載の血清アルブミンシグナ
   ルペプチド遺伝子と異種蛋白質遺伝子を結合したDNAを
   含む組換えDNA。
5. 【請求項５】異種蛋白質がヒト血清アルブミンであり、
   成熟型ヒト血清アルブミン遺伝子と血清アルブミンシグ
   ナルペプチド遺伝子を直接結合したことを特徴とする請
   求項（４）記載の組換えDNA。
6. 【請求項６】請求項（４）又は（５）記載の組換えDNA
   によって形質転換された酵母。