JPS6022918B2 - Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンメチル−エステルとフェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はジベプチドェステルとフェニルアラニンメチル
ェステルとの付加化合物を製造する方法に関するもので
あり、さらに詳しくは蛋白分解酵素を用いてＮ−ペンジ
ルオキシカルボニル−Ｌ−ァスパラギン酸（以下Ｚ−Ｌ
−母ｐと略記する）とＬ−フェニルアラニンメチルェス
テル（以下Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅと略記する）とのジベプ
チドェステルにフェニルアラニンメチルェステル（以下
Ｐｈｅ−ＯＭｅと略記する）の付加した化合物（以下単
に付加化合物と略記する）を製造する方法に関するもの
である。

パパィンやキモトリプシンの様な蛋白分解酵素が蛋白分
解（ベプチド結合の切断）の逆反応であるべプチド結合
の生成反応に関与し得ることは古くから知られている。

例えば氏ｒｇｍａｎらはパパインを用いてァニドリの合
成を行っている。またＦｍＰｎはアミノ基をペンゾィル
基等で保護したロィシン等のモノァミノカルボン酸とカ
ルボキシル基をアミド又はアニリドとして保護したロィ
シンやグリシンをパパインやキモトリプシンを用いてべ
プチド結合させ得ることを明らかにしている ぐＡｄｖ
ａｎｃｅｓｍＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｎｅｍｉｓｔひ．第５
巻．３５頁（１７４９）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ．Ｎ．Ｙ）。磯和らはアミノ
基をペンジルオキシカルボニル基で保護したアミノ酸と
カルボキシル基をェステル化したアミノ酸とをパパィン
、プロリシン、スプチリシンＢＰＮ等の酵素を用いてべ
プチド合成反応を行ったことを報告している（日本化学
会第３５秋期大会予稿集、４８２頁及び４８６頁（１９
７６）、日本化学会）。また磯和ら及び本発明者払ま、
アミノ基を保護したアスパラギン酸又はグルタミン酸と
、カルボキシル基を低級ァルコキシ基等で保護してェス
テルとした他に官能基を持たないモノアミノモノカルボ
ン酸とを蛋白分解酵素の存在下で反応させ、更に反応生
成物とこのカルポキシル基をェステル化した他に官能基
をもたないモノアミノモノカルポン酸との付加化合物を
形成させ、これを分離孫取する方法を提案した（椿膿昭
５２−７２７ｙ号）。

本発明者らは、これらの付加化合物のうち、Ｚ‐Ｌ一Ａ
ｓｐとＬ一Ｐｈｅ−ＯＭｅとを反応させて得られるジベ
プチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物の製造
方法についてさらに詳しく検討した。特に工業的に実施
する際、原材料費に大きな影響のある酵素の使用量を低
減させるべく鋭意研究した。ところが少量の酵素を用い
て反応を行うと酵素が著しくあるいは完全に失活するこ
とを見し、出した。本発明者らは、この酵素失活現象を
究明した結果、この種の化学反応で当然必要と考えられ
る反応系の縄拝の継続が酵素活性維持に極めて有害であ
り、反応成分等を混和後、反応系を実質上静層状態に保
持すると酵素活性の低下を著しく抑制することができる
ことおよび静層状態を保持してもＺ−Ｌ−ＡｓｐとＬ−
Ｐｈｅ−ＯＭｅの縮合反応は進行し、しかも付加化合物
が高収率で得られることを発見して本発明を完成した。

即ち、本発明はＺ−ＡｓｐとＰｈｅ−ＯＭｅを金属プロ
テアーゼの存在下に水性媒体中で、反応系を実質上瀞層
状態に保持して反応させて、Ｚ−船ｐとＰｈｅ−ＯＭｅ
からなるジベプチドェステルを生成させ、さらにこのジ
ベプチドエステルとＰｈｅ一ＯＭｅとの付加化合物を形
成させることを特徴とするＮーベンジルオキシカルポニ
ル−Ｌーアス／ぐルチルーＬ−フエニルアラニンメチル
エステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物の製造方法を
提供するものである。

本発明の一方の出発物質であるＺ−Ａｓｐはアミノ基を
ペンジルオキシカルボニル基で保護したＬ−又はＤＬー
アスパラギン酸である。

ＤＬ体を用いるとそのＤ体は反応せず反応媒体中に残る
。本発明の他方の出発物質であるＰｈｅ−ＯＭｅはカル
ボキシル基をメチルェステルとしたＬ−又はＤＬ−フェ
ニルアラニンである。ＤＬ体を用いる場合、そのＤ体は
ジベプチドェステル中には入らないが、Ｌ体同様に生成
したジベプチドェステルと付加化合物を形成することが
できる。従ってＤＬ体を使用するとジベプチドェステル
生成によって溶液中のＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅが消費され、
ジベプチドェステルとの付加反応には、より○一体に富
むＰｈｅ一ＯＭｅが関与することになる。

この場合、後述する様にＬＬージベプチドェステルとＬ
−Ｐｈｅ一ＯＭｅとの付加化合物と、ＬＬ−ジベプチド
ェステルとＤ−Ｐｈｅ一ＯＭｅとの付加化合物の間には
水に対する溶解度に差があり、Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの
付加化合物が優先的に析出するので、得られる付加化合
物は○一Ｐｈｅ−ＯＭｅとの間 ５のものがほとんど又
は大部分となる。本発明の両出発物質はそれぞれ遊離の
形で用いてもよいし、水に可溶な塩の形で用いてもよい
。

従って本明細書では両出発物質についての記載は実施例
および特記ある場合を除き、それぞれの水ＺＯに可溶な
塩を含むものである。本発明の方法の両出発物質の使用
濃度には格別の限定はないが、本発明の方法が本質的に
生成物を析出させることに依存するものであるので、こ
の濃度は比較的高い方が望ましい。

しかし生成物Ｚの付加化合物は水に対する溶解度が小さ
いので（Ｚ一Ｌ一Ａｓｐ−Ｌ一Ｐｈｅ一〇ＭｅとＬ一Ｐ
ｈｅ一ＯＭｅとの付加化合物の場合２０℃での溶解度０
．３夕／１００？水程度、またＤ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの
付加化合物の場合２０午０で０．２夕／１００タ水程度
）可成４・２さし・濃度でも実施が可能である。具体的
には約０．００１モル／そないし７モル／そ程度好まし
くは０．１モル／そないし４モル／そである。この雨成
分の使用比率も限定的でない。

しかし本発明の方法が結局はＺ一Ｌ一Ａｓｐｌ分子とＰ
ｈｅ２−ＯＭｅ２分子とを結合させることにあるので、
この両原料はＺ−Ｌ−Ａｓｐに対するＬ−Ｐｈｅ一ＯＭ
ｅ又はＤＬ一Ｐｈｅ−ＯＭｅの基準で化学量論上１：２
のモル比で、実際上は１００：１乃至１：１００好まし
くは５：１乃至１：５、最も好ましくは２：１３乃至１
：４のモル比で用いるものである。本発明の反応は水性
媒体中、使用する蛋白分解酵素が酵素活性を示す舟条件
のもとで反応させるものである。

水性媒体としては通常水溶液を使用する。

その３際水に可溶の有機溶剤を併用してもよい。本発明
の方法で用いる触媒である酵素は活性中心に金属イオン
を有する金属プロテアーゼである。

その例としては微生物起源のもの、例えば放線菌起源の
中性プロテアーゼ、プロリシン、サーモライシン、コラ
ゲナーゼ、クロタルスアストロックスプロテアーゼ等を
挙げることができる。粗製の酵素例えばサーモアーゼ（
商標）なども使用できる。その際爽雑するェステラーゼ
等の作用を抑えるため、ポテトインヒビターなどの阻害
剤を併用することができる。本発明の方法ではサーモラ
ィシンおよびサーモアーゼ（商標）が最も好ましい。本
発明の方法で使用する酵素の量は原料Ｚ一Ｌ−＄ｐｌモ
ルに対して酵素に含まれる蛋白質に換算して３０ないし
３，０００雌、好ましくは６０なし、し２，５００の９
である。

本発明で使用する金属プロテアーゼが酵素活性を示すｐ
Ｈ範囲はｐＨ約４なし、し約９である。

一方本発明のジベプチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの
付加化合物形成反応もｐＨ依存性があり、結局本発明の
方法は餌約４なし、し約８、最も好ましくは舟約６なし
、し約７で行うのが望ましい。本発明の方法では副反応
としてＰｈｅ−ＯＭｅの加水分解反応が起り得る。この
副反応はｐＨの低い方が著しくない。前述した様に出発
原料であるＺ−船ｐおよびＰｈｅ−ＯＭｅは遊離型でも
塩でもよいが、この両成分を水性媒体中に溶解したとき
このｐＨ条件に調整する必要がある。

餌調節剤としては塩酸、硫酸、酢酸の様な慣用の無機酸
又は有機酸及び水酸化ナトリウム、水酸化カリウムの様
な水酸化アルカリ、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムの様なアルカリ炭
酸塩、アンモニア、トリメチルアミン、トリェチルアミ
ン、エタノールアミンの様な有機又は無機のアミン等の
慣用の無機又は有機の塩基を用いることができる。遊離
のＺ一Ａｓｐ又はＰｈｅ−ＯＭｅもこ０の目的で酸又は
塩基として使用することができる。また適当な緩衝剤を
使用してもよい。本発明の方法は温度１０℃乃至９０ｏ
ｏ、酵素活性を維持する観点から好ましくは２０ｑ０乃
至５０ｏｏで行うものである。

ク 本発明の方法の反応時間は反応温度および酵素の使
用量によって変るので一義的に限定することはできない
が、通常１０時間ないし２５０時間である。

本発明では反応系は、出発原料および酵素等を０混和後
反応終結まで実質上静層状態に保たれる。

反応の途中で短時間多少の蝿梓をすることは許される。
本発明の方法では付加化合物は微細な針状あるいは柱状
結晶として析出する。

静暦反応のため系全体に結晶が析出し、原料濃度が高い
ときは反応の終結時には系全体が固化した状態となる。

得られたスラリーは引続き固体が得られたときは破砕し
てスラリー化したのち固液分離してＺ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ
一Ｐｈｅ−ＯＭｅとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物を固
体として採取することができる。得られた付加化合物は
破砕後、あるいはそのま）酸水溶液と混和し分解してＺ
−Ｌ−粕ｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを固体成分とするスラリ−
にすることができる。本発明の方法によれば、少し、酵
素の使用量で極めて収率よくＺ−Ｌ−松ｐ‐Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＭｅとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物を製造するこ
とができる。

すなわち、酵素の失活を抑制することができるので、蝿
群を続けながら反応を行う場合に比べて反応の終綾時で
の収率が１０％から２０％高い。したがって酵素コスト
を低減させることができる。本発明の方法で原料として
ＤＬ体のＺ−Ａｓｐを用いると○体は反応せず水性媒体
中に残るので、これより○体を回収すれば、Ｚ−Ａｓｐ
の光学分割を同時に行うことができる。また、同機にＤ
Ｌ体のＰｈｅ−ＯＭｅを用いるとジベプチドェステルと
Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物が優先的に得られる
ので、この付加化合物を酸分解してＤ一Ｐｈｅ−ＯＭｅ
を回収することにより、Ｐｈｅ−ＯＭｅの光学分割を同
時に行うことができる。本発明の方法で得られたＺ−Ｌ
−船ｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加
化合物は、鉱酸等と接触させると容易にＺ‐Ｌ−船ｐ−
Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとＰｈｅ−ＯＭｅの塩に分解できる
。

Ｚ−Ｌ−松ｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅは通常の方法、たと
えば水素化分解等で保護基であるＮ−ペンジルオキシカ
ルボニル基を除去することによって低カロリー甘味剤と
して期待されているＬ−アスパルチルーＬーフェニルア
ラニンメチルェステルにすることができる。以下本発明
を実施例にて更に詳細に説明する。

実施例 １Ｚ−Ｌ一ＡＳｐ５３．４５夕（０．２モル）
、ＤＬ−Ｐｈｅ一ＯＭｅ・ＨＣＩ１６１．７６夕（０．
７５モル）および水酸化ナ ４トリウム水溶液５００の
【（ＮａｏＨ約０．７５モル）を１その反応器に仕込み
ｐＨ６．７とした。

これにサーモアーゼ（商標、大和化成株式会社製、蛋白
含有量：１５％、以下同じ）１夕および酢酸カルシウム
・１水塩０．雛夕を加えて混和し２５℃で１０独特間静
直して反応を行った。固化した反応混合物を破砕し、グ
ラスフィルターを用いて吸引炉適して湿結晶を得た。こ
のものの高速液体クロマトグラフ分析か夕 らＺ−Ｌ一
ＡＳｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−〇ＭｅとＰｈｅ−〇Ｍｅとの付加
化合物の収率は９３．３％であった。この湿結晶がＺ−
Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとＤ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ
との１：１付加化合物から成ることを以下のことから確
認した。０ この緑結晶を水でよく洗った後、酢酸エチ
ル一ｎーヘキサン混合液溶媒から再結晶して得た物の物
性及び元素分析結果は融点：１２８〜１３３ｑＣ 〔Ｑ〕客：−６．５（Ｃ＝１、メタノール）タ 元素分
析値Ｃ３２日３７Ｎ３０９としての計算値（％）実測値
（％）Ｃ ６３．２４
６３．３５日 ６．１３
６．１１Ｏ Ｎ ６．９７
７．０２赤外吸収スペクトル及び核
磁気共鳴スペクトルは袴願昭５２−７２７計餅こ添付さ
れたＺ−Ｌ−ふｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとＬ−Ｐｈｅ−
ＯＭｅとの１：１付加化合物のそれらと実質的に一致し
た。

即ち赤外吸収スペクトルについては３，２６０肌−１・
３，０００〜３，２００弧‐１・１，７２０肌‐１・１
，６６０伽‐１・１，６３０地‐１・１，５４０肌‐１
・１，４３０伽‐１・１，４５０弧‐１・１，３９０伽
‐１・１，２２０〜１，２９０地‐１、１，０５０仇‐
１、？４０弧‐１及び６９５伽‐１に特徴があり、核磁
気共鳴スペクトルについては６値で２．７５ｐ岬、３．
０２鞘肌、３．６１脚肌、３．７Ｐ血、４．４〜４．８
Ｐ側、５．０或風、５．８松風及び７．３岬こ特徴があ
った。

この結晶を塩酸水溶液と混和し、スラリーにしてから炉
過分離した。得られたケークをよく水で洗ってから乾燥
したものは〔Ｑ〕客：−１４‐３（Ｃ＝１ メタノール
）で赤外吸収スペクトル及び核磁気共鳴スペクトルは標
品Ｚ−Ｌ‐笹ｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅと一致した。

一方炉液は炭素水素ナトリウムでアルカリ性にして、ジ
クロロメタンで抽出した。ジクロルメタン層は乾燥後ジ
クロロメタンを蒸発させた。

残さにメタノールを加えて塩化水素ガスを吹き込んだ。
次に濃縮後エーテルを加えて針状結晶を得た。このもの
は 〔Ｑ〕客：−１５．８（Ｃ＝１ メタノール）で赤外吸
収スペクトル及び核磁気共鳴スペクトルは標品Ｄ−Ｐｈ
ｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩと一致した。

比較例 １反応中燈梓を継続したほかは実施例１と全く
同様にした。

付加化合物の収率は７２．８％であった。実施例 ２Ｚ
一Ｌ一ＡＳｐ５３．４５夕（０．２モル）ＤＬ一Ｐｈｅ
一ＯＭｅ・ＨＣＩ１４０．１９夕（０．６５モル）およ
び水酸化ナトリウム水溶液５００の上（ＮａｏＨ約０．
６５モル）を１その反応器に仕込みｐＨ６．６とした。
これにサーモアーゼ（商標）０．７夕および酢酸カルシ
ウム・１水塩０．６２夕を加えて混和し２５００で１４
０時間静遣して反応を行った。後処理は実施例１と同様
にして行い付加化合物を得た。付加化合物の収率は８６
．４％であった。比較例 ２ 反応中縄梓を継続したほかは実施例２と全く同様にした
。

付加化合物の収率は７４．０％であった。実施例 ３反
応を２０００で２０餌時間行うほかは実施例２と全く同
様にした。付加化合物の収率は９２．０％であった。比
較例 ３反応中櫨拝を継続したほかは実施例３と全く同
様にした。

付加化合物の収率は７８．５％であった。実施例 ４水
酸化ナトリウム水溶液、サモアーゼ（商標）および酢酸
カルシウムの使用量をそれぞれ３００の‘（ＮａｏＨ約
０．６５モル）、０．５夕および０．４４夕とし反応時
間を２２餌時間としたほかは実施例３と同機にした。付
加化合物の収率は９２．７％であった。比較例 ４反応
中鷹拝を継続したほかは実施例４と全く同機にした。

付加化合物の収率は６５．７％であった。実施例 ５Ｚ
−Ｌ一Ａｓｐｌｏ．６９夕（４０ミリモル）、ＤＬ一Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣ１２８．０４夕（１３０ミリモル）
および水酸化ナトリウム水溶液１００の‘（ＮａｏＨ
約１３０ミリモル）を内容積２００の‘の反応器に仕込
みＰＨ６．６ とした。これにサーモライシン３２雌（
蛋白含有量：６５％）および酢酸カルシウム・１水塩０
．１２夕を加えて混和し３０℃で２０餌時間静直し反応
を行った。引続き実施例１と同機にして後処理を行い付
加化合物を得た。付加化合物の収率は８２．５％であっ
た。比較例 ５反応中燈梓を継続したほかは実施例５と
全く同様にした。

付加化合物の収率は７１．０％であった。実施例 ６Ｚ
一Ｌ−Ａｓｐｌｏ．６９夕（４０ミリモル）、Ｌ−Ｐｈ
ｅ−ＯＭｅ・ＨＣ１２８．０４夕（１３０ミリモル）お
よび水酸化ナトリウム水溶液６０の【（ＮａｏＨ約１３
０ミリモル）を内容積２００の‘の反応器に仕込みｐＨ
６．４とした。これにサモアーゼ（商標）６０爪９およ
び酢酸カルシウム・１水塩５３の９を加えて混和し２７
℃で１８８時間静遣して反応を行った。引続き実施例１
と同様にして後処理を行い付加化合物を得た。収率は９
３．０％であった。

比較例 ６ 反応中胸粋を継続したほかは実施例６と全く同機にした
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸と
   フエニルアラニンメチルエステルを金属ブロテアーゼの
   存在下に水性媒体中で反応系を実質上静置状態に保持し
   て反応させて、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アスパ
   ラギン酸とフエニルアラニンメチルエステルとのジペプ
   チドエステルを生成させ、さらにこのジペプチドエステ
   ルとフエニルアラニンメチルエステルとの付加化合物を
   形成させることを特徴とするＮ−ベンジルオキシカルボ
   ニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチル
   エステルとフエニルアラニンメチルエステルとの付加化
   合物の製造方法。 ２ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸１
   モルに対して金属ブロテアーゼを酵素蛋白として３０な
   いし３，０００ｍｇ用いる特許請求の範囲第１項記載の
   製造方法。 ３ 水性媒体が水溶液である特許請求の範囲第１項又は
   第２項記載の製造方法。 ４ 反応をｐＨ６ないし７で行う特許請求の範囲第１項
   から第３項までのいずれか１項記載の製造方法。 ５ Ｌ体又はＤＬ体のＮ−ベンジルオキシカルボニル−
   アスパラギン酸およびＬ体のフエニルアラニンメチルエ
   ステルを用いてＬＬ体のジペプチドエステルとＬ体のフ
   エニルアラニンメチルエステルとの付加化合物を形成さ
   せる特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１
   項記載の製造方法。 ６ Ｌ体又はＤＬ体のＮ−ベンジルオキシカルボニル−
   アスパラギン酸およびＤＬ体のフエニルアラニンメチル
   エステルを用いてＬＬ体のジペプチドエステルとＤ体又
   はＤ体に富むフエニルアラニンメチルエステルとの付加
   化合物を形成させる特許請求の範囲第１項から第４項ま
   でのいずれか１項記載の製造方法。