JPH11235179A - ｐｔｈ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｐｔｈポリペプチドおよび該ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 ｐｔｈポリペプチドおよびｐｔｈポリペ
プチドをコードしているポリヌクレオチド、ならびに組
み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法を提供す
る。また、抗菌化合物をスクリーニングするためにｐｔ
ｈポリペプチドを利用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その製造および
使用、ならびにその変種、アゴニストおよびアンタゴニ
スト、ならびにその使用に関する。特に、本発明は、ペ
プチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼファミリーのポリヌク
レオチドおよびポリペプチドならびにそれらの変種（以
下、「ｐｔｈ」、「ｐｔｈポリヌクレオチド」、および
場合により「ｐｔｈポリペプチド」と称する）に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】スタフィロコッカス属（Staphylococc
i）の遺伝子および遺伝子産物を抗生物質の開発に用い
ることは特に好ましい。スタフィロコッカス属は医学的
に重要な微生物属を形成している。それらは２つのタイ
プの疾病、すなわち、侵入的および毒素生成的疾病を引
き起こすことが知られている。一般的には、侵入的感染
は皮膚表面および深部組織の両方に影響する膿瘍形成に
より特徴づけられる。エス・アウレウス（S. aureus）
は癌患者における菌血症の第２の主要原因である。骨髄
炎、敗血性関節炎、敗血性の血栓性静脈炎および急性細
菌性心内膜炎も比較的よく見られる。スタフィロコッカ
ス属の毒素生成的特性により生じる３つの臨床的症状が
ある。これらの疾病の明らかな徴候は、組織侵入および
菌血症に対立するものとしてのエンドトキシンの作用に
より生じる。これらの症状は、スタフィロコッカス食中
毒、熱傷皮膚症候群およびトキシンショック症候群を包
含する。

【０００３】スタフィロコッカス・アウレウス感染の頻
度は過去２０〜３０年間に劇的に上昇している。これは
多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人
口の増加に起因している。いくつかのまたはすべての標
準的な抗生物質に対して耐性を有するスタフィロコッカ
ス・アウレウス株を単離することはもはやめずらしいこ
とではない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌
剤、ワクチンおよび診断試験についての必要性を形成し
た。

【０００４】そのうえ、薬剤の発見方法は、現在のとこ
ろ、「機能的遺伝学」、すなわち、高処理量のゲノムま
たは遺伝子に基づく生物学を包含するので抜本的な改革
を受けている。このアプローチは、「位置的クローニン
グ」に基づく初期のアプローチおよび他の方法に取って
代わりつつある。機能的遺伝学は、現在利用可能な多く
の分子生物学的データベースならびに他のソースから潜
在的に興味ある遺伝子配列を同定するための種々の道具
に大きく依存している。薬剤の発見の標的としての、さ
らなる遺伝子および他のポリヌクレオチド配列ならびに
それらの関連ポリペプチドの同定および特徴づけをする
必要性があり続けている。

【０００５】抗生物質活性に関して化合物をスクリーニ
ングするために有用であるという利点を有した、本発明
のｐｔｈ具体例のごとき因子に対する要望があることは
明白である。かかる因子はまた、感染、機能不全および
疾患の発生病理における役割を決定するのに有用であ
る。感染、機能不全および疾患を予防、改善または治癒
するための方法を見出すために、かかる因子ならびにそ
のアンタゴニストおよびアゴニストを同定および特徴づ
けする必要も明らかにある。

【０００６】ペプチジルｔＲＮＡヒドロラーゼは、ｍＲ
ＮＡ翻訳、ペプチジルｔＲＮＡ中間体からのｔＲＮＡの
再生において中心的な役割を果たしている。広範な細菌
においてＰｔｈ活性は明かに遍在しており、ｐｔｈ相同
体が同定されている。哺乳動物における類似活性は、全
く異なる酵素のセットにより媒介される。イー・コリ
（E. coli）におけるＰｔｈ活性の阻害は、蛋白合成の
阻害を引き起こし、最終的には細胞死を引き起こす。我
々は、Ｐｔｈがエス・ニューモニアエ（S. pneumonia
e）およびエス・アウレウス（S. aureus）におけるイン
ビチリ増殖に必須であり、両方の病原株に感染期間中に
この蛋白をコードしている遺伝子が発現されることを示
した。それゆえ、この蛋白の阻害剤は、細菌が宿主感染
を確立し維持することを妨害し、それゆえ、抗細菌療法
において有用性を発揮しうる。

【０００７】本発明のある種のポリペプチドは、既知の
ビー・ズブチリス（B. subtilis）のｓｐｏＶＣｐｔｈ
蛋白：最も近いポリペプチド：ペプチジル−ｔＲＮＡヒ
ドロラーゼ（ｓｐｏＶＣ）（B. subtilis）に対して有
意なアミノ酸配列相同性を有する。データベース：Swis
s-Prot受託番号Ｐ３７４７０；Ogasawara, N., Nakai,
S. and Yoshikawa, H., Systemic sequencing of the 1
80 kilobase region of the Bacillus subtilis chromo
some containing the replication origin; DNA Res. 1
(1), 1-14 (1994)。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｐｔｈ、詳
細にはｐｔｈポリペプチドおよびｐｔｈポリヌクレオチ
ド、組み換え物質ならびにそれらの製造方法に関する。
もう１つの態様において、本発明は、かかるポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関し、とりわ
け、微生物による疾病の治療を包含する。さらなる態様
において、本発明は、本発明により提供される材料を用
いるアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、なら
びに同定された化合物を用いる微生物による感染および
かかる感染に関連した症状の治療方法に関する。さらな
る態様において、本発明は、微生物による感染およびか
かる感染に関連した症状の検出のための診断アッセイ、
例えば、ｐｔｈ発現または活性の検出のためのアッセイ
に関する。開示された本発明の精神および範囲内での種
々の変更および修飾は、以下の説明を読み、本開示の他
の部分を読めば、当業者に容易に明らかになるであろ
う。

【０００９】

【課題を解決するための手段】以下により詳細に説明す
るように、本発明は、ｐｔｈポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドに関する。詳細には、本発明は、ビー・ズブ
チリスのｓｐｏＶＣポリペプチドに対するアミノ酸配列
相同性により関連づけられるスタフィロコッカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）のｐｔｈのポリペプ
チドおよびポリヌクレオチドに関する。特に、本発明
は、それぞれ配列番号：１または３および配列番号：２
または４として表１に示されるヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を有するｐｔｈに関する。

【００１０】 表１ ｐｔｈポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 （Ａ）スタフィロコッカス・アウレウスのｐｔｈポリヌクレオチド配列［配列番 号１］ 5'- ATGAAATGTATTGTAGGTCTAGGTAATATAGGTAAACGTTTTGAACTTACAAGACATAATATCGGCTTTGAA GTCGTTGA TTATATTTTAGAGAAAAATAATTTTTCATTAGATAAACAAAAGTTTAAAGGTGCATATACAATTGAACGAAT GAACGGAG ATAAAGTGTTATTTATCGAACCAATGACAATGATGAATTTGTCAGGAGAAGCAGTTGCACCGATTATGGATT ATTACAAT GTTAATCCAGAAGATTTAATTGTCTTATATGATGATTTAGATTTAGAACAAGGACAAGTTCGCTTAAGACAA AAAGGAAG TGCGGGCGGTCACAATGGTATGAAATCAATTATTAAAATGCTTGGTACAGACCAATTTAAACGTATTCGTAT TGGTGTGG GAAGACCAACGAATGGTATGACGGTACCTGATTATGTTTTACAACGCTTTTCAAATGATGAAATGGTAACGA TGGAAAAA GTTATCGAACACGCAGCACGCGCAATTGAAAAGTTTGTTGAAACATCACGATTTGACCATGTTATGAATGAA TTTAATGG TGAAGTGAAATAA-3'

【００１１】 （Ｂ）この表のポリヌクレオチド配列より推定されるスタフィロコッカス・アウ レウスのｐｔｈポリペプチド配列［配列番号２］ NH₂- MKCIVGLGNIGKRFELTRHNIGFEVVDYILEKNNFSLDKQKFKGAYTIERMNGDKVLFIEPMTMMNLSGEAV APIMDYYN VNPEDLIVLYDDLDLEQGQVRLRQKGSAGGHNGMKSIIKMLGTDQFKRIRIGVGRPTNGMTVPDYVLQRFSN DEMVTMEK VIEHAARAIEKFVETSRFDHVMNEFNGEVK*-COOH

【００１２】 （Ｃ）スタフィロコッカス・アウレウスのｐｔｈのＯＲＦ配列［配列番号３］ 5'- ATGAAATGTATTGTAGGTCTAGGTAATATAGGTAAACGTTTTGAACTTACAAGACATAATATCGGCTTTGAA GTCGTTGA TTATATTTTAGAGAAAAATAATTTTTCATTAGATAAACAAAAGTTTAAAGGTGCATATACAATTGAACGAAT GAACGGAG ATAAAGTGTTATTTATCGAACCAATGACAATGATGAATTTGTCAGGAGAAGCAGTTGCACCGATTATGGATT ATTACAAT GTTAATCCAGAAGATTTAATTGTCTTATATGATGATTTAGATTTAGAACAAGGACAAGTTCGCTTAAGACAA AAAGGAAG TGCGGGCGGTCACAATGGTATGAAATCAATTATTAAAATGCTTGGTACAGACCAATTTAAACGTATTCGTAT TGGTGTGG GAAGACCAACGAATGGTATGACGGTACCTGATTATGTTTTACAACGCTTTTCAAATGATGAAATGGTAACGA TGGAAAAA GTTATCGAACACGCAGCACGCGCAATTGAAAAGTTTGTTGAAACATCACGATTTGACCATGTTATGAATGAA TTTAATGG TGAAGTGAAATAA-3'

【００１３】 （Ｄ）この表のポリヌクレオチドＯＲＦ配列から推定されるスタフィロコッカス ・アウレウスのｐｔｈポリペプチド配列［配列番号：４］ NH₂- MKCIVGLGNIGKRFELTRHNIGFEVVDYILEKNNFSLDKQKFKGAYTIERMNGDKVLFIEPMTMMNLSGEAV APIMDYYN VNPEDLIVLYDDLDLEQGQVRLRQKGSAGGHNGMKSIIKMLGTDQFKRIRIGVGRPTNGMTVPDYVLQRFSN DEMVTMEK VIEHAARAIEKFVETSRFDHVMNEFNGEVK*-COOH

【００１４】寄託材料 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株を含む
寄託株を、１９９６年４月１１日に、スコットランド、
ＡＢ２ １ＲＹ、アバディーン、マチャードライブ２３
Ｓt.のナショナル・コレクション・オブ・インダストリ
アル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテッド（本
明細書にて「ＮＣＩＭＢ」という）に、ＮＣＩＭＢ受託
番号４０７７１の下で寄託した。その寄託株は寄託の際
にスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９と命名
された。スタフィロコッカス・アウレウス寄託株を、本
明細書では「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」と称す
る。

【００１５】寄託株は全長のｐｔｈ遺伝子を含んでい
る。寄託株に含まれるポリヌクレオチドの配列ならびに
それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
は、本明細書における配列の記載とのいずれの不一致に
おいても支配的である。寄託株の寄託は、特許手続き上
の微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件
下で行われている。特許が発行されると何ら制限または
条件もなく、最終的に株は分譲される。寄託株は当業者
の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条
の下に要求されるような、寄託が実施可能要件であるこ
とを承認するものではない。

【００１６】寄託株、それに由来の化合物を製造、使用
または販売するには、ライセンスが必要であるが、その
ようなライセンスはここで付与されるものではない。本
発明の一の態様は、寄託株に含まれるスタフィロコッカ
ス・アウレウスＷＣＵＨ２９株により発現可能な成熟ポ
リペプチドをコードする単離核酸分子を提供することで
ある。さらには、本発明は寄託株中のＤＮＡのｐｔｈヌ
クレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸
配列を提供する。また、本発明は寄託株より単離された
ｐｔｈポリペプチド配列およびそれに由来のアミノ酸配
列を提供する。

【００１７】ポリペプチド 実質的に本発明ｐｔｈポリペプチドは系統発生論的に他
のペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼファミリーの蛋白
に関連している。本発明の１の態様において、スタフィ
ロコッカス・アウレウスのポリペプチド（本明細書では
ｐｔｈおよびｐｔｈポリペプチドという）、ならびに生
物学的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なそ
の変種、ならびにそれを含む組成物が提供される。本発
明のとりわけ好ましい具体例は、ｐｔｈ遺伝子の自然発
生対立遺伝子によりコードされるｐｔｈポリペプチドの
変種である。

【００１８】さらに本発明は下記のものである単離ポリ
ペプチド： （ａ）配列番号：２の全長にわたって配列番号：２のア
ミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好まし
くは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なく
とも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも
９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９
％の同一性を有するかまたは全く同一であるアミノ酸配
列を含むかまたはそれよりなるポリペプチド； （ｂ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１に対
して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同
一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一
性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を
有するかまたは全く同一であるポリヌクレオチド配列を
含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド； （ｃ）配列番号：２の全長にわたって配列番号：２のア
ミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好まし
くは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なく
とも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも
９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９
％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むかまた
はそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチド； （ｄ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：１に対
して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同
一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一
性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を
有するかまたは全く同一であるポリヌクレオチド配列を
含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド； （ｅ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：３に対
して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同
一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一
性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を
有するかまたは全く同一であるポリヌクレオチド配列を
含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド；あるいは （ｆ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のア
ミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好まし
くは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なく
とも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも
９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９
％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むかまた
はそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチド； （ｇ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：２のア
ミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好まし
くは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なく
とも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも
９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９
％の同一性を有するかまたは全く同一であるアミノ酸配
列を含むかまたはそれよりなるポリペプチドを提供す
る。

【００１９】本発明のポリペプチドは、表１［配列番号
２または４］のポリペプチド（とりわけ成熟ポリペプチ
ド）ならびにポリペプチドおよびフラグメント、詳細に
は、ｐｔｈの生物活性を有し、表１［配列番号１または
３］のポリペプチドまたはその該当部分と少なくとも７
０％の同一性、好ましくは表１［配列番号２または４］
のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性、より好ま
しくは表１［配列番号２または４］のポリペプチドと少
なくとも９０％の類似性（より好ましくは、少なくとも
９０％の同一性）、さらにより好ましくは表１［配列番
号２または４］のポリペプチドと少なくとも９５％の類
似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有
するポリペプチドおよびフラグメントを包含し、さらに
かかるポリペプチドの部分も包含し、一般に、ポリペプ
チドのかかる部分は少なくとも３０個のアミノ酸、より
好ましくは、少なくとも５０個のアミノ酸を含む。

【００２０】本発明はまた、 Ｘ−（R₁）_m−（R₂）−（R₃）_n−Ｙ

【００２１】［式中、アミノ末端のＸは水素または金属
であり、カルボキシル末端のＹは水素または金属であ
り、R₁およびR₃はいずれかのアミノ酸残基または修飾ア
ミノ酸残基であり、ｍは１〜１０００の整数または０で
あり、ｎは１〜１０００の整数または０であり、R₂は本
発明のアミノ酸配列、特に表１のアミノ酸配列またはそ
れらの修飾形態を意味する］で示されるポリペプチドを
包含する。上記の式中、R₂はアミノ末端残基がその左側
でR₁に結合し、そのカルボキシ末端残基がその右側でR₃
に結合するように方向づけられる。ｍおよび／またはｎ
が１より大きい場合、Ｒ₁またはＲ₃のいずれかでで表さ
れるアミノ酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポ
リマーのいずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ま
しい。本発明の他の好ましい具体例は、ｍが１ないし５
０、１００または５００の間の整数であり、ｎが１ない
し５０、１００または５００の間の整数のものである。
本発明がスタフィロコッカス・アウレウス由来のもので
あるのが最も好ましいが、同じ分類学上の属の他の生物
由来のものであっても好ましい。また本発明ポリペプチ
ドは、例えば、同じ科または目から得られるものであっ
てもよい。

【００２２】フラグメントは、その全体が上記したポリ
ペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが、一部と同じ
であるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。
ｐｔｈポリペプチドと同様、フラグメントは「独立して
いる（free-standing）」であるか、またはそれらが一
の部分または領域、最も好ましくは単一の連続した領
域、単一のより大きなポリペプチドを形成するより大き
なポリペプチドの中に含まれていてもよい。

【００２３】好ましいフラグメントは、例えば、表１
［配列番号２または４］のアミノ酸配列または、アミノ
末端を含む連続した一連の残基またはカルボキシル末端
を含む連続した一連の残基のような、その変種の一部を
有する末端切断ポリペプチドを包含する。宿主細胞、特
に、スタフィロコッカス・アウレウス中の本発明のポリ
ペプチドの分解型も好ましい。さらに、アルファヘリッ
クスおよびアルファヘリックス形成領域、ベータシート
およびベータシート形成領域、ターンおよびターン形成
領域、コイルおよびコイル形成領域、親水領域、疎水領
域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレ
キシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、および高
抗原指数領域を含むフラグメントのような、構造的また
は機能的属性によって特徴づけられるフラグメントもま
た好ましいフラグメントである。

【００２４】さらに好ましいフラグメントは、配列番
号：２のアミノ酸配列由来の少なくとも１５、２０、３
０、４０、５０または１００個の連続したアミノ酸を有
するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、あるいは配
列番号：２のアミノ酸配列由来の末端切断または欠失さ
れた少なくとも１５、２０、３０、４０、５０または１
００個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む
単離ポリペプチドを包含する。

【００２５】生物学的に活性なフラグメントも好ましい
フラグメントである。生物学的に活性なフラグメント
は、類似活性または改良活性を有するもの、または望ま
しくない活性が減少したフラグメントを含め、ｐｔｈの
活性を媒介するフラグメントである。さらに、動物、特
にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラグメン
トも含まれる。特に好ましいものは、スタフィロコッカ
ス・アウレウスの生存に必須の機能または個体、特に、
ヒトにおいて疾患を開始または疾病を維持する能力を与
える酵素群の受容体またはドメインからなるフラグメン
トである。

【００２６】本発明のポリペプチドのフラグメントであ
る変種は、ペプチド合成法により対応する全長のポリペ
プチドの製造に使用することができる。したがって、こ
れらの変種は、本発明の全長ポリペプチドを製造するた
めの中間体として使用できる。

【００２７】アミノ酸に関する標準的１文字および３文
字表記に加えて、「Ｘ」または「Ｘａａ」なる語もま
た、本発明のあるポリペプチドを記載するのに用いられ
る。「Ｘ」および「Ｘａａ」は、２０種の天然に存在す
るいずれかのアミノ酸がポリペプチド配列のそのように
指定される位置にあってもよいことを意味する。

【００２８】ポリヌクレオチド ｐｔｈポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ド、詳細には、本明細書でｐｔｈと命名されるポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチドを提供すること
が本発明の１の目的である。本発明の特に好ましい具体
例において、ポリヌクレオチドは、全長の遺伝子を含
む、表１（配列番号：１または３）に示す配列を含むｐ
ｔｈポリペプチド、またはその変種をコードしている領
域を含む。出願人らは、この全長の遺伝子は当該ポリペ
プチドを有する生物（例えば、スタフィロコッカス・ア
ウレウス）の増殖および／または生存に必須であると考
える。本発明のさらなる態様として、ｐｔｈポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチド、詳細には、スタフィロコッ
カス・アウレウスのｐｔｈポリペプチドおよびポリヌク
レオチドをコードおよび／または発現する単離核酸分子
が提供され、核酸分子としては、例えば、未プロセッシ
ングＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡ、Ｂ−およびＺ−ＤＮＡが挙げられる。本
発明のさらなる具体例は、生物学的、診断上、予防上、
臨床的または治療上有用なポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチド、ならびにその変種、ならびにそれらを含む組
成物を包含する。本発明のもう一つの態様は、表１［配
列番号２または４］の推定アミノ酸配列を有するｐｔｈ
ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、それ
に密接に関連するポリヌクレオチドおよびそれらの変種
に関する。

【００２９】もう１つの特に好ましい本発明具体例にお
いて、表１（配列番号：２または４）のアミノ酸配列を
含むかまたはそれよりなる、スタフィロコッカス・アウ
レウス由来のｐｔｈポリペプチドが提供される。表１
［配列番号１または３］に示すポリヌクレオチド配列の
ような本明細書の情報を使用し、出発材料としてスタフ
ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９を使用し、細菌
からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングし、配
列決定し、つづいて全長クローンを得る標準的クローニ
ングおよびスクリーニング法を使用して、ｐｔｈポリペ
プチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを得るこ
とができる。例えば、表１［配列番号１または３］に示
す配列のような本発明のポリヌクレオチド配列を得るに
は、典型的には、エシェリシア・コリまたは他の適当な
宿主中のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９
の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、部分配列
から由来する放射標識したオリゴヌクレオチド、好まし
くは１７量体またはそれより長いオリゴヌクレオチドで
プローブする。ついで、該プローブと同じＤＮＡを有す
るクローンを厳密な条件を使用して区別できる。該オリ
ジナル配列から設計された配列決定プライマーで同定さ
れた個々のクローンを配列決定することにより、該配列
を両方の方向に伸長し、全長を決定することが可能であ
る。都合よくは、プラスミド・クローンから調製された
変性二本鎖ＤＮＡを用いてかかる配列決定を行う。適当
な技法は、Maniatis,T.，Fritsch,E.F.およびSambrook
ら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2ndE
d.；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York（1989）（特に、ハイブリダイゼ
ーションによるスクリーニング１.９０および変性二本
鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこと）によ
り記載されている。直接ゲノムＤＮＡ配列決定を行って
全長の遺伝子配列を得てもよい。例えば、表１［配列番
号１または３］に示すポリヌクレオチドは、スタフィロ
コッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９から由来するＤＮＡ
ライブラリー中に見いだされたものである。

【００３０】そのうえ、表１［配列番号１または３］の
ＤＮＡ配列は、表１［配列番号２または４］に示すのと
ほぼ同数のアミノ酸残基を有し、公知のアミノ酸残基の
分子量から計算できる推定分子量を有する蛋白をコード
するオープンリーディングフレームを有する。配列番号
１のヌクレオチド番号１と、ヌクレオチド番号５７１で
始まる停止コドンとの間の配列番号１のポリヌクレオチ
ドが、配列番号２のポリペプチドをコードする。

【００３１】さらなる態様において、本発明は、下記の
ポリヌクレオチドを含むかまたはそれらよりなる単離ポ
リヌクレオチドを提供する： （ａ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１に対
して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同
一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％の同
一性を有するかまたは全く同一であるポリヌクレオチド
配列； （ｂ）配列番号：２の全長にわたって配列番号：２のア
ミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好まし
くは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なく
とも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも
９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７
〜９９％またはちょうど１００％の同一性を有するポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列；ある
いは （ｃ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：１に対
して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同
一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％また
は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列； （ｄ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：３に対
して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同
一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％の同
一性を有するかまたは全く同一であるヌクレオチド配
列；または （ｅ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のア
ミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好まし
くは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なく
とも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも
９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７
〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列。 本発明ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
（スタフィロコッカス・アウレウス以外の種由来のホモ
ログおよびオーソログを包含）を、厳密なハイブリダイ
ゼーション条件において、配列番号：１もしくは３の配
列またはそれらのフラグメントを含むかまたはそれらよ
りなる標識または検出可能プローブを用いて適当なライ
ブラリーをスクリーニングし、次いで、該ポリヌクレオ
チド配列を含む全長遺伝子および／またはゲノムクロー
ンを単離する工程を含む。

【００３２】本発明は、表１［配列番号１または３］の
コーディング配列と、その全長にわたって同一であるポ
リヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、成熟
ポリペプチドまたはそのフラグメント用のコーディング
配列自体ならびにリーダーまたは分泌配列、プレ、プロ
またはプレプロ蛋白配列をコードするコーディング配列
のような他のコーディング配列を有するリーディング・
フレーム中の成熟ポリペプチドまたはフラグメントのコ
ーディング配列を提供する。ポリヌクレオチドはまた、
例えば、転写されるが翻訳されない配列、終止シグナル
（例えば、ｒｈｏ−依存的およびｒｈｏ−非依存的終止
シグナル）、リボソーム結合部位、Kozak配列、ｍＲＮ
Ａを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグ
ナルのごとき少なくとも１つの非コーディング５’およ
び３’配列を包含する非コーディング配列を含むが、こ
れらに限定するものではない。また、ポリヌクレオチド
配列はさらなるアミノ酸をコードしているさらなるコー
ディング配列を含んでいてもよい。例えば、融合ポリペ
プチドの精製を促進するマーカー配列をコードすること
ができる。本発明のある種の具体例において、マーカー
配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）において提供
され、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1989）86：8
21-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチ
ドであるか、またはＨＡタグ（Wilsonら、Cell，37:767
(1984)）であり、ともにそれらに融合したポリペプチド
配列の精製において有用である。本発明ポリヌクレオチ
ドは、限定するものではないが、構造遺伝子および遺伝
子の発現を調節する、本来的に結合している配列からな
るポリヌクレオチドを包含する。

【００３３】本発明の好ましい具体例は、表１の配列番
号１に示されるヌクレオチド１からヌクレオチド５７１
のすぐ上流にあるヌクレオチドまたはヌクレオチド５７
１を含むヌクレオチドまでを有するポリヌクレオチドで
あり、それは共にｐｔｈポリペプチドをコードする。

【００３４】本発明はまた、式： Ｘ−（R₁）_m−（R₂）−（R₃）_n−Ｙ ［式中、分子の５’末端のＸは水素または金属あるいは
Ｙと一緒になって共有結合を形成し、分子の３’末端の
Ｙは水素または金属あるいはＸと一緒になって共有結合
を形成し、R₁およびR₃は、各々、独立していずれかの核
酸残基であり、ｍは１〜３０００の整数または０であ
り、ｎは１〜３０００の整数または０であり、R₂は本発
明の核酸配列または修飾核酸配列、特に表１より選択さ
れる核酸配列を意味する］で示されるポリヌクレオチド
を包含する。上記した式のポリヌクレオチド中、R₂は
５’末端残基がその左側でR₁に結合し、その３’末端残
基がその右側でR₃に結合するように方向付けられる。ｍ
および／またはｎが１より大きい場合、Ｒ₁および／ま
たはＲ₂のいずれかで表される核酸残基の鎖は、ヘテロ
ポリマーまたはホモポリマーのいずれであってもよく、
ヘテロポリマーが好ましい。好ましい具体例において、
ＸおよびＹが一緒になって共有結合を形成する場合、前
記した式のポリヌクレオチドは閉じた環状ポリヌクレオ
チドであり、それはその式が第２の鎖が相補性を有する
第１の鎖を示す二本鎖ポリヌクレオチドであり得る。も
う一つ別の具体例において、ｍおよび／またはｎは１と
１０００の間の整数である。他の好ましい本発明の具体
例は、ｍが１ないし５０、１００または５００の間の整
数であり、ｎが１ないし５０、１００または５００の間
の整数である。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドはスタフィロコ
ッカス・アウレウス由来であるのが最も好ましいが、分
類学上同じ属の生物より得ることも好ましい。また、例
えば、分類学上同じ科または目から得てもよい。本明細
書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド」なる用語は、本発明のポリペプチド、特に、細菌
性ポリペプチド、より詳細には、表１［配列番号２また
は４］に示すアミノ酸配列を有するスタフィロコッカス
・アウレウス・ｐｔｈのポリペプチドをコードする配列
を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語はコード
および／非コーディング配列を含んでもよいさらなる領
域と共に、該ポリペプチドをコードする単一の連続また
は非連続領域（例えば、組み込まれたファージ、挿入さ
れた配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれたト
ランスポゾン配列、またはＲＮＡエデティング（editin
g）もしくはゲノムＤＮＡ再組織化により中断されてい
る）を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はさら
に、表１［配列番号２または４］の推定アミノ酸配列を
有するポリペプチドの変種をコードする、本明細書に記
載したポリヌクレオチドの変種に関する。本発明のポリ
ヌクレオチドのフラグメントである変種は本発明の全長
ポリヌクレオチドの合成に使用できる。

【００３６】さらに好ましい具体例は、数個、わずか
な、５〜１０、１〜５、１〜３、２または１個あるいは
０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、
欠失または付加された表１［配列番号２または４］のｐ
ｔｈポリペプチドのアミノ酸配列を有する、ｐｔｈ変種
をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましく
は、ｐｔｈポリペプチドの特性、活性を変化させないサ
イレント置換、付加および欠失である。

【００３７】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
［配列番号２または４］に示すアミノ酸配列をを有する
ｐｔｈポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全
長にわたって少なくとも７０％の同一性を有するポリヌ
クレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドに相補的
なポリヌクレオチドである。また、最も好ましいもの
は、ｐｔｈポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
と全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有する領
域からなるポリヌクレオチドおよびそれと相補的なポリ
ヌクレオチドである。この点で、その同じものと全長に
わたって少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレ
オチドが特に好ましく、中でも少なくとも９５％の同一
性を有するものが特に好ましい。さらには、少なくとも
９５％の同一性を有するものの中で少なくとも９７％の
同一性を有するものがより好ましく、中でも少なくとも
９８％および少なくとも９９％の同一性を有するものが
特に好ましい。少なくとも９９％の同一性を有するもの
がより好ましい。好ましい具体例は、表１［配列番号１
または３］のＤＮＡによってコードされている成熟ポリ
ペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであ
る。本発明のある好ましい具体例によれば、特に厳密な
条件下で、例えば表１のポリヌクレオチドのごときｐｔ
ｈポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする
ポリヌクレオチドが提供される。

【００３８】さらに本発明は、本明細書にて上記した配
列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関
する。この点において、本発明は特に、本明細書にて上
記したポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書で
用いる場合、「厳密な条件」および「厳密なハイブリダ
イゼーション条件」という語は、ハイブリダイゼーショ
ンが、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくと
も９７％の同一性がある場合にのみ起こることを意味す
る。厳密なハイブリダイゼーション条件の一例として、
５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎa
Ｃl、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン
酸ナトリウム（pＨ７.６）、５ｘデンハート（Denhard
t’s）溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／
ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一
夜インキュベーションし、ついでハイブリダイゼーショ
ン支持体を０.１ｘＳＳＣ（約６５℃）で洗浄すること
が挙げられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件
は公知であり、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：ALABO
RATORY MANUAL，Second Edition，Cold Spring Harbor,
N.Y.（1989）、特に、第11章に例示されている。本発
明により提供されるポリヌクレオチド配列に関して溶液
ハイブリダイゼーションを用いてもよい。

【００３９】本発明は、配列番号１または３に示したポ
リヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当なライブラ
リーを、厳密なハイブリダイゼーション条件下、配列番
号１または３に示す該ポリヌクレオチド配列の配列を有
するプローブまたはそのフラグメントでスクリーニング
し、該ＤＮＡ配列を単離することにより得ることができ
るポリヌクレオチド配列を含むかまたはそれよりなるポ
リヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチ
ドを得るのに有用なフラグメントには、例えば、本明細
書のいずれかの場所で十分に説明するプローブおよびプ
ライマーが包含される。

【００４０】本明細書において本発明のポリヌクレオチ
ドの分析についてさらに説明するように、例えば、上記
したような本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用し、ｐｔｈをコードする全長ｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ｐｔｈ遺伝子に対
して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離することができる。そのような
プローブは、一般に、少なくとも１５塩基を含むであろ
う。好ましくは、そのようなプローブは少なくとも３０
塩基からなり、少なくとも５０塩基を有してもよい。特
に好ましいプローブは、少なくとも２０塩基を有し、３
０以下の塩基を有する。例えば、ｐｔｈ遺伝子のコード
領域は、表１（配列番号１または３）のＤＮＡ配列を使
用してスクリーニングしてオリゴヌクレオチド・プロー
ブを合成することにより単離できる。ついで、本発明の
遺伝子の配列と相補性の配列を有する標識したオリゴヌ
クレオチドを用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡのライブラリーをスクリーニングし、ライブラリー
のどのメンバーがプローブとハイブリダイゼーションす
るか決定する。

【００４１】全長のＤＮＡを得るための、あるいは短い
ＤＮＡを伸長させるための利用可能で当業者によく知ら
れたいくつかの方法があり、例えば、ｃＤＮＡ末端の迅
速増幅（ＲＡＣＥ）（例えば、Frohman, et al., PNAS
USA 85,8998-9002, 1988参照）に基づく方法がある。ma
rathon^TM法（Clontech Laboratories Inc.）に例示され
る当該方法の最近の変法は、例えば、より長いｃＤＮＡ
の検索を有意に簡単にしている。Marathon^TM法におい
て、ｃＤＮＡは選択組織から抽出されたｍＲＮＡから調
製され、各末端に「アダプター」配列が連結される。次
いで、遺伝子特異的かつアダプター特異的オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行って
ＤＮＡの「失われた」５’末端を増幅する。次いで、
「ネステッド」プライマー、すなわち、増幅生成物の範
囲ににアニールするように設計されたプライマー（典型
的には、アダプター配列中のさらなる３’にアニールす
るアダプター特異的プライマーならびに既知遺伝子配列
中のさらなる５’にアニールする遺伝子特異的プライマ
ー）を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。次いで、この反応
の生成物をＤＮＡ配列決定により分析し、次いで、存在
しているＤＮＡに生成物を直接結合して完全配列を得る
こと、あるいは５’プライマーの設計に関する新たな配
列の情報を用いて別個の全長ＰＣＲを行うことにより、
全長のＤＮＡを構築する。

【００４２】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、本明細書においてポリヌクレオチド分析に関し
てさらに説明するように、例えば、疾患、特にヒトの疾
患に対する治療および診断の発見のための研究試薬およ
び研究材料として用いることができる。表１（配列番号
１または２または３または４）の配列に由来するオリゴ
ヌクレオチドである本発明のポリヌクレオチドは、本明
細書に記載の方法に使用できるが、好ましくはＰＣＲに
使用し、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全体と
して、または部分的に感染組織において細菌中で転写さ
れるか否か測定する。そのような配列はまた、病原体が
達した感染の段階およびタイプの診断においても有用性
がある。

【００４３】また、本発明は、成熟蛋白に、さらなるア
ミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加わるか、成熟ポ
リペプチドの内部にアミノ酸が加わった（例えば、成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。この
ような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態への蛋白
のプロセッシングにおいて役割を果たし、蛋白を運び、
蛋白の半減期を長くしたり、短くしたり、あるいは分析
または生産のための蛋白の取り扱いを容易にすることが
できる。インビボで一般的なように、該付加アミノ酸は
細胞酵素により成熟蛋白からプロセッシングにより除か
れる。本発明の各ポリヌクレオチドおよび全ポリヌクレ
オチドについて、それに相捕的なポリヌクレオチドが提
供される。これらの相捕的ポリヌクレオチドが、相捕的
である各ポリヌクレオチドに対して十分に相捕的である
ことが好ましい。一またはそれ以上のプロ配列に融合し
たポリペプチドの成熟形態を有する前駆体蛋白は該ポリ
ペプチドの不活性形でもよい。プロ配列がそのような不
活性前駆体から除かれると、一般に活性化される。プロ
配列のいくらかまたは全体を、活性化の前に除去でき
る。一般に、そのような前駆体はプロ蛋白と称される。

【００４４】核酸塩基に関する標準記号Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ
／Ｕに加えて、また「Ｎ」なる語を、本発明の特定のポ
リヌクレオチドを記載するのに用いることができる。
「Ｎ」は、隣接するヌクレオチド位置と一緒になって作
用する場合、正確な読み枠を読中で読まれる場合で、Ｎ
がそのような読み枠において未成熟終止コドンを形成す
る効果を有する塩基でないことが好ましい場合を除き、
４種のＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基のいずれかがＤＮＡ
またはＲＮＡ配列のその指定位置にあることを意味す
る。

【００４５】要するに、本発明のポリヌクレオチドは成
熟蛋白、リーダー配列の加わった成熟蛋白（プレ蛋白と
も称される）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１また
はそれ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、また
はリーダー配列と、一般に、ポリペプチドの活性な成熟
形態を生成するプロセッシング工程の間に除去される１
またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体で
あるプレプロ蛋白をコードする。

【００４６】ベクター、宿主細胞、発現系 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子
操作される宿主細胞および組換え技術による本発明のポ
リペプチドの製造に関する。さらに無細胞翻訳系を用
い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用してかか
る蛋白を製造することができる。本発明の組み換えポリ
ペプチドを、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞か
ら、当業者によく知られた方法により製造してもよい。
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む発現系、か
かる発現系で遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組み
換え法による本発明ポリペプチドの製造に関する。組換
え体産生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系も
しくはそれらの一部、または本発明のポリヌクレオチド
を取り込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞
への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ト
ランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオ
ン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、トランスダクション、スクレープ・ローディン
グ、弾道導入および感染のような、Davisら、BASIC MET
HODS IN MOLECULAR BIOLOGY（1986）およびSambrook
ら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd E
d. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor, N.Y.（1989）のごとき複数の標準的研究室マ
ニュアルに記載されている方法によって行うことができ
る。

【００４７】適当な宿主の代表例は、レンサ球菌（stre
ptococcus）、ブドウ球菌（staphylococcus）、腸球菌
（enterococcus）、大腸菌（E.coli）、ストレプトマイ
セス（streptomyces）、シアノバクテリア（cyanpobact
eria）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびスタフィ
ロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の
ごとき細菌細胞；クルベロミセス（Kluveromyces）、サ
ッカロミセス（Saccharomyces）のごとき酵母細胞、担
子菌、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）お
よびアスペルギルス（Aspergillus）；ドロソフィラ（D
rosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細
胞のごとき昆虫細胞；CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BH
K、293、CV-1およびボーウェス（Bowes）メラノーマ細
胞のごとき動物細胞；および裸子植物または被子植物の
ごとき植物細胞を包含する。

【００４８】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多様な発現系を使用することができる。かかる系
は、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来
の系、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファー
ジ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿
入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュ
ロウイルス、ＳＶ４０のごときパポバウイルス、ワクシ
ニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポックスウイ
ルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのような
ウイルス由来のベクター、およびコスミドおよびファー
ジミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージの遺
伝因子由来のベクターのごとき、それらの組み合わせに
由来するベクターを包含する。発現系構築物は、発現を
制御ならびに引き起こす調節領域を有していてもよい。
一般に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、増幅ま
たは発現し、および／またはポリペプチドを発現するの
に適した系またはベクターを、この点にて発現に使用し
てもよい。適当なＤＮＡ配列を、例えば、Sambrookら、
MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL（前掲）に示
されている技術のごとき、種々のよく知られた慣用的技
術のいずれかによって、発現系に挿入してもよい。

【００４９】真核細胞の組み換え発現系において、翻訳
された蛋白を小胞体内腔、周辺腔または細胞外環境に分
泌するために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペ
プチドに挿入してもよい。これらのシグナルは、ポリペ
プチドに固有のものであってもよく、または異種のシグ
ナルであってもよい。本発明のポリペプチドは、硫酸ア
ンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンま
たはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを包含する、よく知られた方法によって組換
え細胞培養物から回収および精製できる。最も好ましく
は、高品質液体クロマトグラフィーが精製に使用され
る。ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性
する場合、蛋白を再生するための周知方法を用いて、再
び活性な立体配座とすることができる。

【００５０】診断、予後、セロタイピングおよび変異ア
ッセイ また本発明は、診断試薬として使用するための本発明の
ｐｔｈポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、
とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｐｔｈポリヌクレ
オチドおよび／またはポリペプチドの検出は、疾患の診
断、疾病の段階の決定、または薬剤に対する感染生物の
応答に関する診断方法を提供するであろう。ｐｔｈ遺伝
子または蛋白を含む生物に感染、または感染の可能性が
ある真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトを、種々の
よく知られた方法ならびに本明細書記載の方法により核
酸レベルまたはアミノ酸レベルで検出できる。

【００５１】予後、診断または他の分析に供するポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドは、感染していると思わ
れる個体および／または感染した個体の身体材料から得
られる。これらの源由来のポリヌクレオチド、特にＤＮ
ＡまたはＲＮＡを検出に直接用いてもよく、あるいは分
析に付す前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いるこ
とにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡ（詳細にはｍＲＮ
Ａ）、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡも同じようして使用
できる。増幅を用いると、個体に存在する原核生物の種
および株を原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴
づけすることができる。対照配列の遺伝子型と比較した
増幅生成物の大きさの変化により、欠失および挿入を検
出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識したｐｔｈ
ポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせる
ことにより同定できる。完全に対合した配列は、ＲＮas
e消化により、または融解温度の差により、誤対合二重
らせんと区別できる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性剤を
伴ったまたは変性剤を含まないゲル中のＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動の移動度の変化により、または直接的な
ＤＮＡの配列決定により検出できる。例えば、Myers
ら、Science，230:1242（1985）を参照のこと。特異的
な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセ
イ、例えば、ＲＮaseおよびＳ１保護または化学的切断
法によっても明らかにすることができる。例えば、Cott
onら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:4397-4401（198
5）を参照のこと。ヌクレアーゼ保護アッセイ、例え
ば、ＲＮａｓｅ、Ｖ１およびＳ２保護アッセイまたは化
学的開裂法により、特定位置における配列の変化を明ら
かにすることができる。例えば、Cotton et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985)参照。

【００５２】もう１つの具体例において、ｐｔｈヌクレ
オチド配列またはそのフラグメントを含むオリゴヌクレ
オチドプローブの一群を構築して、例えば遺伝学的変
異、セロタイプ、分類学的分類または同定のための効果
的なスクリーニングを行うことができる。アレイ法は適
応範囲が広く、遺伝子発現、遺伝学的連関、および遺伝
学的変化を包含する分子遺伝学における種々の問題を解
決するために用いられる（例えば、Chee et al., Scien
ce,274:610 (1996)参照）。

【００５３】よって、もう１つの態様において、本発明
は、 （ａ）本発明ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号：
１または３のヌクレオチド配列、またはそのフラグメン
ト； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相捕的なヌク
レオチド配列； （ｃ）本発明ポリペプチド、好ましくは配列番号：２ま
たは４のポリペプチド、またはそのフラグメント；ある
いは （ｄ）本発明ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配
列番号：２または４のポリペプチドに対する抗体を含む
診断キットに関する。かかるキットにおいて、（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要な成分を含んでいて
もよいことが理解されよう。かかるキットは、とりわけ
疾病または疾病に対する感受性についての診断において
有用である。

【００５４】また本発明は、診断試薬としての本発明ポ
リヌクレオチドの使用にも関する。疾病または発病に関
連した本発明ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号：
１または３のポリヌクレオチドの変異形態の検出は、ポ
リヌクレオチドの発現低下、発現過剰または発現の変化
により生じる疾病の診断、疾病経過の予後、疾病段階の
決定、または疾病に対する感受性の決定に加えて用いる
診断用道具、またはかかる診断等の決定のための道具を
提供するであろう。かかるポリヌクレオチドにおける変
異を有する生物、特に感染生物を、本明細書記載のいず
れかの場所で説明するような種々の方法によりポリヌク
レオチドレベルで検出してもよい。本発明ヌクレオチド
配列は生物の染色体の同定にも価値がある。配列は特別
に標的化され、生物（詳細にはスタフィロコッカス・ア
ウレウス）の染色体上の特定の位置とハイブリダイゼー
ションしうる。本発明染色体に関連した配列のマッピン
グは、それらの配列を病原性および／または生物の環境
学的地位および／または生物の薬剤耐性とを関連づけ、
さらには生物に遺伝子を対応させることにおける重要な
工程でありうる。配列を正確な染色体位置にマッピング
したならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地
図のデータと関連づけることができる。かかるデータ
は、配列データベースにおいてオンラインで見いだされ
る。次いで、遺伝学的方法、例えば、連関（物理的に近
接した遺伝子の同時遺伝）の分析、あるいはコンジュゲ
ーション（conjugation）のごとき接合の研究により、
同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関
係を同定する。第１の表現型を有する生物と、異なる第
２の表現型を有する生物との間のポリヌクレオチドおよ
び／またはポリペプチド配列の相違を調べることもでき
る。第１の表現型を有する生物のいくつかまたは全部に
変異が観察されるが、第２の表現型を有する生物には変
異が観察されない場合、変異は第１の表現型の発生原因
である可能性がある。

【００５５】本発明のポリヌクレオチドおよび／またあ
ポリペプチド中に変異または多型性（対立遺伝子変異）
を担持する生物由来の細胞を、例えばセロタイピングを
可能にするような種々の技術によりＤＮＡレベルで検出
できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡにおける
変異を検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲを自動検出
系、例えばＧeneＳcan等と組み合わせて用いるのが特に
好ましい。ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもまた
同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることがで
きる。一例として、ｐｔｈポリペプチドをコードする核
酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて変異を同定およ
び分析することができる。典型的なプライマーの例を下
表２に示す。

【００５６】 表２ ｐｔｈポリヌクレオチド増幅用プライマー 配列番号 プライマー配列 5 5'-ATGAAATGTATTGTAGGTCTAGGT-3' 6 5'-TTATTTCACTTCACCATTAAATTC-3'

【００５７】また本発明は、式： Ｘ−（R₁）_m−（R₂）−（R₃）_n−Ｙ ［式中、分子の５’末端のＸは水素または金属あるいは
Ｙと一緒になって共有結合を形成し、分子の３’末端の
Ｙは水素または金属あるいはＸと一緒になって共有結合
を形成し、R₁およびR₃は、各々、独立していずれかの核
酸残基または修飾ヌクレオチド残基であり、ｍは１〜２
０の整数または０であり、ｎは１〜２０の整数または０
であり、R₂は本発明プライマー配列、特に表２より選択
される核酸配列を意味する］で示されるポリヌクレオチ
ドを包含する。上記した式のポリヌクレオチド中、R₂は
５’末端残基がその左側でR₁に結合し、その３’末端残
基がその右側でR₃に結合するように方向付けられる。ｍ
および／またはｎが１より大きい場合、いずれかのＲ基
で表される核酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモ
ポリマーのいずれであってもよく、好ましくは表１のポ
リヌクレオチドの領域に相捕的なヘテロポリマーであ
る。好ましい具体例において、ｍおよび／またはｎは１
ないし１０の間の整数である。

【００５８】さらに本発明は、５’および／または３’
末端から１、２、３または４個のヌクレオチドが除去さ
れたプライマーを提供する。特に、これらのプライマー
を、個体由来の試料、例えば身体材料から単離されたｐ
ｔｈＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅に用いることが
できる。プライマーを用いて感染個体から単離されたポ
リヌクレオチドを増幅して、ポリヌクレオチド配列研究
のための種々の方法に供してもよい。このようにして、
ポリヌクレオチド配列中の変異を検出し、変異を用いて
感染または感染段階もしくは経路を診断および／または
予後を行い、あるいは感染物のセロタイプおよび／また
は分類を行ってもよい。

【００５９】本発明はさらに、疾患、好ましくは細菌感
染、さらに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス
による感染の診断方法であって、表１［配列番号１また
は３］の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの
上昇を、個体由来のサンプルから決定することを特徴と
する方法を提供する。ｐｔｈポリヌクレオチドの発現の
増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当
該分野で周知の方法である任意の方法、例えば増幅、Ｐ
ＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブロッテ
ィング、スペクトロメトリーおよびその他のハイブリダ
イゼーション法を用いて測定できる。

【００６０】加えて、正常対照組織サンプルと比較して
ｐｔｈポリペプチドの過剰発現を検出するための本発明
による診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出
することができる。宿主由来のサンプル中のｐｔｈポリ
ペプチドのレベルを決定するために用いることができる
アッセイ技法は、当業者に周知である。このようなアッ
セイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセ
イ、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセ
イ、抗体検出およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。

【００６１】ディファレンシャル発現（differential e
xpression） 本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、ディフ
ァレンシャルスクリーニング法の試薬として用いてもよ
い。多くのディファレンシャルスクリーニングおよびデ
ィファレンシャルディスプレイ法が当該分野に存在し、
本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いるこ
とができる。例えば、ディファレンシャルディスプレイ
法はChuang et al., J. Bacteriol. 175:2026-2036 (19
93)に記載されている。この方法は、ランダムプライム
されたＲＴ−ＰＣＲを用いて存在するｍＲＮＡを同定す
ることにより生物中で発現される遺伝子を同定するもの
である。感染前および感染後の特徴を比較することによ
り、感染の間にアップレギュレーションおよびダウンレ
ギュレーションされる遺伝子を同定し、ＲＴ−ＰＣＲ生
成物を配列決定し、「未知」ＯＲＦにマッチさせること
ができる。インビボ発現法（ＩＶＥＴ）はCamilli et a
l., Proc. Natl. Acad Sci. USA91:2634-2638 (1994)
に記載されている。ＩＶＥＴは、研究室での培養物との
比較を行って、感染における重要な役割に関与してい
る、感染中にアップレギュレーションされる遺伝子を同
定するものである。この方法により同定されるＯＲＦは
感染の確立および／または維持において重要な役割を有
すると考えられる。この方法において、標的生物のラン
ダムな染色体フラグメントを、プラスミドベクター中の
プロモーター不含組み換え遺伝子の上流にクローン化す
る。レソルバーゼ（resolvase）部位に隣接した抗生物
質耐性遺伝子を担持する標的細胞中にこの構築物を導入
する。抗生物質存在下での増殖は、レコンビナーゼ（re
combinase）遺伝子の転写を支持しうるプラスミドベク
ター中にクローン化されたフラグメントの集団から消失
し、それゆえ、抗生物質耐性の消失を引き起こす。各抗
生物質感受性細菌により担持される染色体フラグメント
は感染の間に通常アップレギュレーションされる遺伝子
のプロモーターまたは当該遺伝子の一部を担持している
はずである。レコンビナーゼ遺伝子上流の配列決定によ
りアップレギュレーションされる遺伝子の同定が可能と
なる。ＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現パターンを分析
してもよい。本発明ポリヌクレオチドを用いるＲＴ−Ｐ
ＣＲ用に、メッセンジャーＲＮＡを細菌感染組織、例え
ばネズミの感染後４８時間たった肺から単離し、次い
で、ランダムヘキサヌクレオチドでプラムされたＲＮＡ
試料の逆転写を行い、その後遺伝子特異的プライマーペ
アーを用いてＰＣＲを行うことによって各ｍＲＮＡ量を
評価する。得られたＰＣＲ生成物の定量による特定のｍ
ＲＮＡ種の存在および量の決定は、感染組織中で転写さ
れた細菌遺伝子についての情報を提供する。遺伝子転写
の分析を感染の異なる時点において行って細菌による発
病における遺伝子調節についての詳細な知識を得て、い
ずれの遺伝子産物が抗細菌剤のスクリーニングのための
標的であるのかを明確に理解することができる。使用Ｐ
ＣＲプライマーの遺伝子特異的な性質により、細菌ｍＲ
ＮＡ調製物が常に哺乳動物ＲＮＡを含む必要があるとは
いえないことが理解されよう。このことは、感染組織か
らの簡単かつ迅速なＲＮＡの調製を可能にし、細菌中で
非常に短命（半減期２分のオーダー）な細菌ｍＲＮＡ種
を得ることを可能にする。最適には、非常に短時間のう
ちに、ＴＲＩｚｏｌｅ（GIBCO-BRL）存在下で機械的に
破砕し、次いで、ＴＲＩｚｏｌｅ試薬およびＤＮＡａｓ
ｅ処理を製造者の指示に従って行って夾雑ＤＮＡを除去
することにより、感染ネズミ肺組織から細菌ｍＲＮＡを
調製する。好ましくは、適当に標識された配列特異的オ
リゴヌクレオチドプローブを用いてノーザンをプローブ
することにより検出されるスタフィロコッカス・アウレ
ウスの１６ＳリボソームＲＮＡが最大量となるような条
件を見いだすことによってプロセスを最適化する。典型
的には、５’色素標識プライマーをＰＣＲ反応において
各ＰＣＲプライマーペアーに用い、最適にはＰＣＲ反応
を８ないし２５サイクルで終了する。ＰＣＲ生成物を６
％ポリアクリルアミドで分離し、GeneScanner（ＡＢＩ
により製造されている）を用いて検出し定量する。

【００６２】グリッディング（gridding）およびポリヌ
クレオチド引き算 方法は、いわゆる「高密度ＤＮＡアレイ（high density
array）」またはグリッドを用いる遺伝子発現および同
一性についての情報を得るためのものである。例えば、
M.Chee et al., Science, 274:610-614 (1996)およびそ
の中の引用文献参照。かかるグリッディングアッセイを
用いて、発現配列タグ（ＥＳＴ）と呼ばれるある種の新
規遺伝子配列が同定された（Adams et al., Science, 2
52:1651-1656 (1991)）。遺伝子産物に基づいて特定の
遺伝子配列を同定するための方法のバラエティーも記載
されている。例えば、１９９１年５月３０日公開国際特
許出願ＷＯ９１／０７０８７参照。さらに、所望配列の
増幅のための方法が記載されている。例えば、１９９１
年１１月１４日公開の国際特許出願ＷＯ９１／１７２７
１参照。

【００６３】本発明ポリヌクレオチドをポリヌクレオチ
ドアレイの成分として、好ましくは高密度アレイまたは
グリッドとして用いてもよい。これらの高密度アレイは
診断および予後目的に特に有用である。例えば、異なる
遺伝子、さらにはポリヌクレオチドまたは本発明ポリヌ
クレオチドを含む各スポットのセットをプロービング
（身体試料から得たプローブを用いるハイブリダイゼー
ションまたは核酸増幅を用いるプロービングのごとき）
に使用して、個体中の特定のヌクレオチド配列または関
連配列の存在を決定してもよい。かかる存在は、病原
体、特にスタフィロコッカス・アウレウスの存在を示す
可能性があり、疾病または疾病経過の診断および／また
は予後に有用である可能性がある。配列番号：１または
３のポリヌクレオチド配列の多くの変種を含むグリッド
が好ましい。また、配列番号：２または４のポリペプチ
ド配列をコードしているポリヌクレオチド配列の多くの
変種を含むものが好ましい。

【００６４】抗体 本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドまたはそれ
らの変種、あるいはそれらを発現する細胞を、かかるポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドそれぞれに対して免
疫特異的な抗体を得るための免疫原として用いることが
できる。１の好ましい本発明の具体例において、ｐｔｈ
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する抗体が提
供される。

【００６５】本発明のポリペプチドに対して得られる抗
体は、ポリペプチドあるいはエピトープが付いたフラグ
メント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒト以外の
動物に、慣用的プロトコールを用いて投与することによ
り得ることができる。モノクローナル抗体を調製する場
合、連続的細胞系培養により産生される抗体を提供する
当該分野にて周知の技術を用いることができる。例え
ば、Kohler, G.およびMilstein, C., Nature，256：495
−497（1975）；Kozborら、Immunology Today, 4：72
（1983）；Coleら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, Alan R Liss,Inc.、77−96頁（1985）に記載
されるような種々の技法が挙げられる。

【００６６】一本鎖抗体を製造するための技術（米国特
許第４９４６７７８号）を用いて、本発明のポリペプチ
ドに対する一本鎖抗体を産生することができる。また、
トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の
哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができ
る。

【００６７】別法として、ファージディスプレイ（phag
e display）技法を利用して、抗‐ｐｔｈの保持に関し
てスクリーニングしたヒトのリンパ球のＰＣＲ増幅した
ｖ遺伝子のレパートリー由来の、または無処理のライブ
ラリー由来の、ポリペプチドに対する結合活性を有する
抗体遺伝子を選択してもよい（McCafferty,Ｊ.ら、Natu
re 348:552-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology
10:779-783(1992)）。これらの抗体の親和性はチェイン
シャフリング（chain shuffling）により改善すること
もできる（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628（199
1））。

【００６８】前記の抗体を用いてポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定することができ、アフィニ
ティークロマトグラフィーにより該ポリペプチドを精製
することができる。従って、とりわけ、ｐｔｈポリペプ
チドまたはｐｔｈポリヌクレオチドに対する抗体を用い
て、感染、とりわけ細菌感染を治療することができる。

【００６９】ポリペプチド変種は、本発明の特定の態様
を形成する、抗原的、エピトープ的または免疫学的に等
価な変種を包含する。

【００７０】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはその融合蛋白は、マウスまたは他
の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫するため
の抗原として使用される。融合蛋白はポリペプチドに安
定性を付与できる。抗原は、例えば抱合することによ
り、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）またはキーホール・リムペット・ヘモシアニ
ン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合させ
ることができる。別法として、蛋白もしくはポリペプチ
ド、またはその抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペ
プチドの多重コピーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫
原性を改良するのに十分な抗原性を有しており、キャリ
ヤを使用しなくてすむ。

【００７１】好ましくは、抗体またはその変種を修飾し
て個体における免疫原性を減少させる。例えば、個体が
ヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」され
ており；例えばJones,P.ら、Nature 321：522−525（19
86）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273（199
1）に記載されているように、ハイブリドーマ由来の抗
体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植さ
れている。本発明の１の態様によれば、治療または予防
目的、詳細には遺伝学的免疫化のための本発明ポリヌク
レオチドの使用が提供される。本発明の特に好ましい具
体例は、ｐｔｈポリヌクレオチドの自然発生対立遺伝子
変種およびそれによりコードされるポリペプチドであ
る。

【００７２】本発明ポリヌクレオチドの遺伝学的免疫に
おける使用には、好ましくは、プラスミドＤＮＡの筋肉
への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet 1：363（199
2）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther. 4：419（196
3））、特異的蛋白キャリヤを複合させたＤＮＡの送達
（Wuら、J.Biol Chem. 264：16985（1989））、リン酸
カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS USA 83：9551（1986））、種々の形態のリポソ
ーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243：375
（1989））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356：152（1
992）；Eisenbraunら、ＤＮＡ Cell Biol 12：791（199
3））およびクローン化レトロウイルスベクターを用い
たインビボ感染（Seegerら、PNAS USA 81：5849（198
4））などの適当な送達方法を用いる。

【００７３】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 さらに、本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを
用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラ
リー、および天然産物の混合物中の、小分子基質とリガ
ンドとの結合を評価することもできる。これらの基質お
よびリガンドは天然の基質およびリガンドでよく、また
は構造上もしくは機能上の模倣物でもよい。例えば、Co
liganら、Current Protocols in Immunology 1（2）：
第5章（1991）を参照のこと。

【００７４】本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは多くの生物学的機能の原因であり、該機能には多く
の疾病状態、詳細には上記疾病が包含される。それゆ
え、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能を刺激
または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング
法を工夫することが望ましい。したがって、さらなる態
様において、本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドならびに関連ポリペプチドおよびポリヌク
レオチドの機能を刺激または阻害する化合物を同定する
ためのスクリーニング方法を提供する。一般的には、ア
ゴニストまたはアンタゴニストを上記疾病の治療および
予防のために用いてもよい。種々の源、例えば、細胞、
無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物の混合
物から化合物を同定できる。そのようにして同定された
かかるアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤は、天
然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素等であって
もよく、場合によってはｐｔｈポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチド、あるいはそれらの構造上または機能上の
模倣物であってもよい（Coligan et al., Current Prot
ocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)参照）。

【００７５】スクリーニング法は、単に化合物のポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドへの、あるいはポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドを有する細胞もしくは膜へ
の、あるいはポリペプチド含む融合蛋白への結合を、直
接的または間接的に候補化合物に結合した標識により測
定するものであってもよい。別法として、スクリーニン
グ法は標識競争物質との競争を用いるものであってもよ
い。さらに、これらのスクリーニング法は、ポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドを含む細胞に適した検出系を
用いて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化
または阻害により生じるシグナルを化合物が発生させる
かどうかを試験するものであってもよい。一般的には、
既知アゴニスト存在下で活性化の阻害剤をアッセイし、
次いで、候補化合物存在下でのアゴニストによる活性化
の効果を観察する。構成的に活性のあるポリペプチドお
よび／または構成的に発現されるポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドを、アゴニストまたは阻害剤の効果を逆
転させる物質を探すスクリーニング法に用いてもよく、
候補化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活
性化を阻害するかどうかを試験することによる。さら
に、スクリーニング法は、単に、候補化合物を本発明ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する溶液と混
合して混合物を作成し、混合物中のｐｔｈポリペプチド
および／またはポリヌクレオチド活性を測定し、次い
で、混合物中のｐｔｈポリペプチドおよび／またはポリ
ヌクレオチド活性を標準に対して比較することを特徴と
する。Ｆｃ部分および上記ｐｔｈポリペプチドから作成
されるような融合蛋白を用いて高処理量アッセイを行っ
て本発明ポリペプチドのアンタゴニストならびに系統分
類的および／または機能的に関連したポリペプチドを同
定することもできる（D.Bennett et al., J. Mol. Reco
gnition, 8:52-58 (1955);およびK.Johanson et al.,J.
Biol. Chem., 270(16):9549-9471 (1955)参照）。本発
明ポリペプチドと結合および／または相互作用するポリ
ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を用いて、細胞
中のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの精製に対す
る添加化合物の影響を検出するためのスクリーニング方
法を組み立ててもよい。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを
構築して、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を
用いてポリペプチドの分泌または細胞結合レベルを、当
該分野において標準的な方法により測定してもよい。こ
れにより、適当に操作された細胞または組織からのポリ
ペプチドの生成を阻害または促進しうる作用剤（それぞ
れ、アンタゴニストまたはアゴニストという）を見いだ
すことができる。

【００７６】本発明はまた、ｐｔｈポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドの作用、特に静菌および／または殺菌
性である化合物の作用を亢進（アゴニスト）または遮断
（アンタゴニスト）する化合物を同定するための化合物
のスクリーニング方法を提供する。スクリーニング方法
には高処理量（high−throughput）技術が包含される。
例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニ
ングするために、ｐｔｈポリペプチドおよびかかるポリ
ペプチドの標識基質またはリガンドを含む合成反応混合
物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞
コンパートメント、またはそれらのいずれかの調製物
を、ｐｔｈアゴニストまたはアンタゴニストであるかも
しれない候補分子の存在下または不在下でインキュベー
トする。候補分子がｐｔｈポリペプチドに作動または拮
抗する能力は、標識リガンドの結合の低下またはかかる
基質からの生成物の生成低下に反映される。結合しても
影響を及ぼさない分子、すなわちｐｔｈポリペプチドの
効果を誘起しない分子は、ほとんどの場合、良好なアン
タゴニストであろう。よく結合し、基質からの生成物の
生成速度を高め、シグナルトランスダクションを増大さ
せ、あるいは化学チャンネル活性を増大させる分子はア
ゴニストである。基質からの生成物の生成速度、シグナ
ルトランスダクション、あるいは化学チャンネル活性の
レベルの検出はリポーターシステムを用いることにより
強調できる。この点に関して有用なリポーターシステム
は、生成物に転換される比色標識基質、ｐｔｈポリヌク
レオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答するリポ
ーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを
包含するが、これらに限定するものではない。

【００７７】本発明ポリペプチドを用いて膜結合または
可溶性受容体を同定してもよく、かかるポリペプチドは
当該分野において標準的な受容体結合法により同定され
る。これらの方法、リガンド結合およびクロスリンキン
グアッセイを包含するが、これらに限らない。これらの
方法において、ポリペプチドを放射性標識（例えば^{12 5}
Ｉ）、化学修飾（例えばビオチン化）または検出および
精製に適したペプチド配列に融合され、推定上の受容体
（例えば細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、身体材
料）の源とともにインキュベーションする。他の方法は
表面プラスモン共鳴および分光学的法法を包含する。こ
れらのスクリーニング方法を用いて、ポリペプチドのそ
の受容体への結合と競争するポリペプチドのアゴニスト
およびアンタゴニストを同定してもよい。かかるアッセ
イを行うための標準的方法は当該分野においてよく知ら
れている。

【００７８】蛍光タグを付した分子に関する蛍光分極値
は回転相関時間（rotational correlation time）また
は回転速度（tumbling rate）に依存する。別の応答レ
ギュレーターポリペプチドもしくは他のポリペプチドと
結合した応答レギュレーターポリペプチドのごとき蛋白
複合体であって蛍光標識分子を含むように標識されてい
るものは、蛍光標識されたモノマー蛋白よりも高い分極
値を有するであろう。この方法を用いて、ポリペプチド
複合体を分裂させる小型分子を特徴づけるのが好まし
い。

【００７９】蛍光エネルギー転移を用いて、応答レギュ
レーターポリペプチドダイマー、トリマー、テトラマ
ー、または高次構造、あるいは別のポリペプチドに結合
した応答レギュレーターポリペプチドにより形成される
構造の形成を妨害する小型分子を特徴づけてもよい。応
答レギュレーターポリペプチドをドナーおよびアクセプ
ター両方の蛍光発色団で標識することができる。２種の
標識種を混合し、ドナー蛍光発色団を励起したならば、
アクセプターの蛍光を観察することにより蛍光エネルギ
ー転移を検出することができる。ダイマー化をブロック
する化合物は蛍光エネルギー転移を阻害するであろう。

【００８０】表面プラスモン共鳴を用いて、応答レギュ
レーターポリペプチドの自己結合ならびに応答レギュレ
ーターポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分
子との結合に対する小型分子の影響をモニターすること
ができる。低いサイト密度（site density）において応
答レギュレーターポリペプチドをセンサーチップにカッ
プリングさせて、共有結合分子がモノマー性となるよう
にすることができる。次いで、溶液蛋白を応答レギュレ
ーターポリペプチド被覆表面上に通し、局所屈折率の変
化により生じる共鳴角の変化をモニターすることにより
特異的結合をリアルタイムで検出することができる。こ
の方法を用いて、応答レギュレーターポリペプチドの自
己結合ならびに応答レギュレーターポリペプチドと別の
ポリペプチドもしくは小型分子との結合に関する反応速
度および平衡結合定数に対する小型分子の影響を特徴づ
けることができる。

【００８１】シンチレーション近接アッセイを用いて、
応答レギュレーターポリペプチドと別の応答レギュレー
ターポリペプチドもしくは別の分子との結合の間の相互
作用を特徴づけることができる。応答レギュレーターポ
リペプチドをシンチレーション充填ビーズにカップリン
グさせることができる。放射性標識応答レギュレーター
ポリペプチドの添加は結合を生じ、放射性源分子はシン
チレーション液に極めて近接した状態となる。よって、
応答レギュレーターポリペプチドの結合によりシグナル
が放出され、応答レギュレーターポリペプチドの自己結
合または応答レギュレーターポリペプチドと別のポリペ
プチドもしくは小型分子との結合を妨害する化合物はシ
グナルを減少させるであろう。

【００８２】ＩＣＳバイオセンサーはＡＭＢＲＩ（Aust
ralian Membrane Biotechnology Research Institute）
により記載されている。それらは高分子の自己結合をカ
ップリングし、懸濁膜二重層中のガンマシジンにより促
進されるイオンチャンネルを閉鎖し、それゆえバイオセ
ンサーのアドミッタンス（イン−ダンスと同様）の測定
可能な変化が起こる。このアプローチは６０回のアドミ
ッタンス変化でも直線性があり、理想的には、小型分子
コンビナトリアルライブラリーの大規模な高処理量スク
リーニングに適する。

【００８３】本発明の他の具体例において、本発明ポリ
ペプチドおよびまたはポリヌクレオチドと結合あるいは
相互作用して、その活性または発現を阻害または活性化
する化合物を同定する方法であって、ポリペプチドおよ
び／またはポリヌクレオチドへの結合、あるいはポリペ
プチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物との他
の相互作用を可能にする条件下で本発明ポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチドをスクリーニングすべき
化合物と接触させて、アゴニストとの結合あるいは他の
相互作用を評価し（該方法において、好ましくは、かか
る結合または相互作用はポリペプチドおよび／またはポ
リヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互作用に応
答した検出可能シグナルを提供しうる第２の化合物に関
連したものである）、次いで、ポリペプチドおよび／ま
たはポリヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互作
用から生じるシグナルの存在または不存在を検出するこ
とにより、化合物がポリペプチドおよび／またはポリヌ
クレオチドと結合あるいは相互作用し、その活性または
発現を活性化または阻害するかどうかを決定する方法が
提供される。

【００８４】ｐｔｈアンタゴニストのアッセイのもう１
つの例は、競争阻害アッセイに適した条件下で、ｐｔｈ
および潜在的なアンタゴニストを、ｐｔｈ結合分子、組
換えｐｔｈ結合分子、天然基質もしくはリガンド、また
は基質もしくはリガンド模倣物と混合する、競合アッセ
イである。ｐｔｈ分子を例えば放射活性または比色化合
物により標識し、結合分子に結合した、あるいは生成物
に変換したｐｔｈ分子の数を正確に決定して、潜在的な
アンタゴニストの効果を評価できる。

【００８５】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ヌクレオチドおよび／またはポリペプチドと結合し、そ
れによりその活性を阻害し、消滅させる小型有機分子、
ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜在的
アンタゴニストはまた、ｐｔｈにより誘導される活性を
誘導しない結合分子のような結合分子の同一部位に結合
し、ｐｔｈを結合から排除することによりｐｔｈの作用
を妨げる、密接に関連した蛋白または抗体のような小型
有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよい。

【００８６】潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合してその部位を占領し、それにより細
胞性結合分子との結合を妨害して、正常な生物学的活性
を妨害する小型分子を包含する。小型分子の例は、小型
有機分子、ペプチド、ペプチド様分子を包含するが、こ
れらに限定するものではない。その他の潜在的なアンタ
ゴニストはアンチセンス分子を包含する（これらの分子
についての記載に関しては、Okano,J.，Neurochem. 56:
560（1991）；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE IN
HIBTORS OF GENE EXPRESSION、ＣＲＣプレス、ボッカラ
ートン、フロリダ州（1988）を参照のこと）。好ましい
潜在的アンタゴニストは、ｐｔｈに関連する化合物およ
びその変種を包含する。潜在的なポリペプチドアンタゴ
ニストの他の例は抗体を包含し、あるいはいくつかの場
合には、ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素
等の密接に関連したオリゴヌクレオチドまたは蛋白、あ
るいはリガンド、基質、受容体、酵素等のフラグメン
ト、あるいは本発明ポリペプチドに結合するが応答を誘
発せず、その結果ポリペプチドの活性が阻害することと
なる小型分子を包含する。

【００８７】ある種の本発明ポリペプチドは天然ｐｔｈ
ポリペプチドの生物学的模倣物、機能的模倣物である。
これらの機能的模倣物を、とりわけ、ｐｔｈポリペプチ
ドの活性に拮抗するように、あるいは本明細書にいずれ
かの場所に記載の様式で抗原または免疫原として用いて
もよい。本発明ポリペプチドの機能的模倣物は末端切断
ポリペプチドを包含するが、これに限らない。例えば、
好ましい機能的模倣物は、配列番号：２に示すポリペプ
チドを含むポリペプチドであってアミノまたはカルボキ
シ末端の２０、３０、４０、５０、６０、７０または８
０個のアミノ酸を欠くポリペプチドを包含し、さらにこ
れらの末端切断配列の１つまたはそれ以上のものを含む
融合蛋白を包含する。これらの機能的模倣物のそれぞれ
をコードしているポリヌクレオチドを発現カセットとし
て用いて各模倣物ポリペプチドを発現させてもよい。こ
れらのカセットが５’および３’制限部位を有していて
所望の場合にカセットを一緒にして連結するための便利
な手段となることが好ましい。これらのカセットが当該
分野で知られたまたは本明細書にいずれかの場所に記載
された遺伝子発現シグナルを含むことがさらに好まし
い。

【００８８】よって、もう１つの態様において、本発明
は、本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドに関するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受
容体、基質、酵素等；あるいはかかるポリペプチドおよ
び／またはポリヌクレオチドの生成を減少または促進す
る化合物を同定するためのスクリーニングキットに関す
る。該キットは： （ａ）本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオ
チド； （ｂ）本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオ
チドを発現する組み換え細胞； （ｃ）本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオ
チドを発現する細胞膜；あるいは （ｄ）本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオ
チドに対する抗体を含むものであり、好ましくは該ポリ
ペプチドは配列番号：２のものであり、好ましくは該ポ
リヌクレオチドは配列番号：１のものである。 かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または
（ｄ）は重要成分を含有していてもよいことが理解され
よう。

【００８９】本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌ
クレオチドを、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレ
オチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の構
造に基づく設計方法に用いてもよいことが、当業者に容
易に理解されよう。該方法は： （ａ）最初にポリペプチドおよび／またはポリヌクレオ
チド、またはそれらの複合体の３次元構造を決定し、
（ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の反応
部位、結合部位またはモチーフである可能性のある部位
の３次元構造を推定し、（ｃ）推定された反応部位、結
合部位および／またはモチーフと結合または反応すると
予想される候補化合物を合成し、次いで（ｄ）候補化合
物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で
あるかどうかを試験することを含む。これが繰り返しプ
ロセスであり、自動およびコンピューター制御工程を用
いてこの繰り返しプロセスを行ってもよいことが、さら
に理解されよう。

【００９０】さらなる態様において、本発明は、例えば
ｐｔｈポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの
過剰発現、発現不足、上昇した活性、または低下した活
性に関連した疾病のごとき異常な状態の治療方法を提供
する。ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの
発現および／または活性が過剰な場合、いくつかの方法
を用いることができる。１の方法は、ポリペプチドおよ
び／またはポリヌクレオチドの機能および／または発現
を阻害（例えば、リガンド、基質、受容体、酵素等の結
合をブロックすることにより、あるいは２次的シグナル
を阻害することにより）するに有効な量の上記阻害化合
物（アンタゴニスト）を医薬上許容される担体とともに
対象に投与し、そのことにより異常なな症状を改善する
ことを含む。もう１つの方法において、やはり内在性ポ
リペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと競争して
リガンド、基質、受容体、酵素等に結合することができ
る可溶性形態のポリペプチドを投与してもよい。かかる
競争物質の典型例はｐｔｈポリペプチドおよび／または
ポリヌクレオチドのフラグメントを包含する。

【００９１】さらなる態様において、本発明は、本発明
ポリペプチドまたはそのフラグメントおよび種々のサブ
クラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロ
ブリンの重鎖または軽鎖の不変領域の種々の部分を含
む、遺伝子工学により得られる可溶性融合蛋白に関す
る。好ましい免疫グロブリンはヒトＩｇＧ（詳細にはＩ
ｇＧ１）の重鎖の不変部分であり、融合はヒンジ領域で
起こる。特定の具体例において、血液凝固因子Ｘａを用
いて開裂できる開裂配列を導入することによりＦｃ部分
を簡単に除去することができる。さらにそのうえ、本発
明は、遺伝子工学によるこれらの融合蛋白の製造方法、
ならびに薬剤スクリーニング、診断および治療における
それらの使用に関する。本発明のさらなる態様はかかる
融合蛋白をコードしているポリヌクレオチドにも関す
る。融合蛋白法の例は国際特許出願ＷＯ９４／２９４５
８およびＷＯ９４／２２９１４に見いだされる。

【００９２】さらにもう１つのアプローチにおいて、発
現ブロッキング法を用いて内在性ｐｔｈポリペプチドを
コードしている遺伝子の発現を阻害することができる。
このブロッキングは遺伝子発現のいずれの工程を標的と
してもよいが、好ましくは、転写および／または翻訳を
標的とする。この種の既知方法の例は、体内で生じるか
または別個に投与されるアンチセンス配列の使用を包含
する（例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense I
nhibitors of Gene Expression, CRC Press, Bocca Rat
on, FL (1988)中O'Connor, J. Neurochem (1991) 56:56
0参照）。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形
成するオリゴヌクレオチドを提供してもよい。例えば、
Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Coone
y et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al., S
cience (1991) 251:1360参照。これらのオリゴヌクレオ
チドはそれ自体投与することができ、あるいは重要部分
のオリゴマーをインビボで発現させることもできる。

【００９３】本明細書で得られるＤＮＡ配列は、各々、
抗菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現でコードされた蛋白は、抗菌薬物をスクリーニングす
るための標的として用いることができる。加えて、コー
ドされた蛋白のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列
あるいはシャイン・ガルガノまたは他の個々のｍＲＮＡ
の翻訳容易化配列を用いて、目的とするコーディング配
列の発現を調節するアンチセンス配列を構築することが
できる。

【００９４】本発明はまた、感染の続発症に関与する、
病原体および哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を
妨害するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオ
チドまたは阻害物質の使用を提供する。特に本発明の分
子は、細菌、特にグラム陽性菌が内在装置上の哺乳動物
細胞外マトリックス蛋白、または創傷部の細胞外マトリ
ックス蛋白に付着することを防御するために；例えば、
哺乳動物チロシンキナーゼのリン酸化を開始することに
よる、ｐｔｈ蛋白介在の哺乳動物細胞侵入を遮断するた
めに(Rosenshineら、Infect. Immun. 60：2211 (199
2))；哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と組織損傷を媒
介する細菌性ｐｔｈ蛋白との間の細菌付着を遮断するた
めに；内在装置の埋め込みまたは他の外科的手技以外に
より開始した感染における病因の通常の進行を遮断する
ために使用することができる。

【００９５】本発明のさらに別の態様によれば、ｐｔｈ
のアゴニストおよびアンタゴニスト、好ましくは静菌性
または殺菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供さ
れる。本発明のアンタゴニストおよびアゴニストを用い
て、例えば、疾患を阻害し、治療することができる。

【００９６】ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter
pylori）（本明細書中、エッチ・ピロリともいう）菌
は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３
分の１以上の胃に感染している（国際癌研究機関（Inte
rnational Agency for Research on Cancer）（1994）S
chistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pylori
（International Agency for Research on Cancer，Lyo
n，France；http：／／www．uicc．ch／ecp／ecp2904．
htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近になっ
て、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を
認識し、その細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分
類した。本発明により提供されるスクリーニング法を用
いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物（ｐｔｈポ
リペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのアゴニス
トおよびアンタゴニスト）、特に狭スペクトルの抗生物
質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有用であ
る。このような治療はヘリコバクター・ピロリ誘発性
癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる治療はま
た胃潰瘍および胃炎も治癒する。

【００９７】ワクチン 生成物、組成物、ならびにｐｔｈ発現の評価、疾病の治
療、遺伝学的変異のアッセイ、および細菌、特にスタフ
ィロコッカス・アウレウス細菌に対する免疫学的応答を
生起させるためのｐｔｈポリペプチドおよび／またはポ
リヌクレオチドの生物への投与方法が本発明により提供
される。本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物にお
ける免疫学的応答を誘発する方法であって、抗体および
／またはＴ細胞免疫応答を生成するのに適当なｐｔｈポ
リヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、またはそ
のフラグメントもしくは変種を個体に接種し、該個体を
感染、特に細菌感染、最も好ましくはスタフィロコッカ
ス・アウレウス感染から防御することを含む方法に関す
る。さらに、そのような免疫学的応答による細菌複製を
遅らせる方法も提供する。本発明のさらにもう一つ別の
態様は、個体における免疫学的応答を誘発する方法であ
って、インビボでｐｔｈポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチド、またはそのフラグメントまたは変種を
発現するために、該ｐｔｈポリヌクレオチドおよび／ま
たはポリペプチド、またはそのフラグメントまたは変種
の発現を指向する核酸ベクターを該個体に送達し、例え
ば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞を含
め、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるよ
うに免疫学的応答を誘発し、該個体にて疾患が既に確立
されているか否かにかかわらず該個体を疾患から保護す
ることを含む方法に関する。遺伝子を投与する一例は、
粒子上のコーティングとして遺伝子を所望の細胞に投与
することによるものである。このような核酸ベクターは
ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、修飾核酸、ＤＮＡ／ＲＮ
Ａハイブリッド、ＤＮＡ−蛋白複合体またはＲＮＡ−蛋
白複合体を含んでいてもよい。

【００９８】本発明のさらなる態様は、その中に免疫学
的応答を誘発する能力を有するか、または誘発している
個体に導入されると、その個体においてｐｔｈポリヌク
レオチドおよび／またはそれによりコードされるポリペ
プチドに対する免疫学的応答を誘発する免疫学的組成物
であって、該ｐｔｈポリヌクレオチドおよび／またはそ
れによりコードされるポリペプチド、または他の本発明
ポリペプチドの抗原をコードし、発現するＤＮＡを含む
組換えｐｔｈポリヌクレオチドおよび／またはそれによ
りコードされるポリペプチドを含む組成物に関する。免
疫学的応答は、治療的および予防的に使用でき、抗体免
疫および／またはＣＴＬまたはＣＤ４＋Ｔ細胞から生ず
るような細胞性免疫から得ることができる。

【００９９】ｐｔｈポリペプチドまたはそのフラグメン
トは、それ自体抗体を産生しないが、第１の蛋白の安定
化ならびに免疫原性および保護特性を有するであろう融
合蛋白の産生能を有する補蛋白（co−Protein）と融合
させることができる。このような融合組換え蛋白は、好
ましくは、さらに、ヘモフィラス・インフルエンザ（He
mophilus influenzae）からのリポプロテインＤ、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベ
ータガラクトシダーゼのような抗原性補蛋白、蛋白を可
溶化し、その産生および精製を容易にするような比較的
大きい補蛋白からなる。さらに、補蛋白は、免疫系の全
身的な刺激を与える上で、アジュバントとして作用して
もよい。補蛋白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシ
末端のいずれかに結合してもよい。本発明は、本発明の
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび、Sato，Y.
ら，Science，273：352(1996)に記載されるような免疫
刺激ＤＮＡ配列からなる組成物、特にワクチン組成物お
よび方法を提供する。

【０１００】また、本発明は、スタフィロコッカス・ア
ウレウス感染の動物モデルにおけるそのような遺伝的免
疫実験において使用したＤＮＡ構築物中で細菌細胞表面
蛋白の非可変領域をコードすることが明らかにされた、
記載されたポリヌクレオチドまたはその特定のフラグメ
ントを使用する方法も提供する。そのような実験は、予
防的または治療的免疫応答を起こさせることのできる蛋
白エピトープの同定に特に有用である。この方法によ
り、動物、とりわけヒトにおける細菌感染、特にスタフ
ィロコッカス・アウレウス感染の予防剤または治療剤の
開発のために、動物の必須器官から感染の抵抗または除
去に特に有用なモノクローナル抗体を産生させることが
できると考えられる。

【０１０１】宿主を免疫するための抗原として本発明ポ
リペプチドを用い、例えば、損傷組織への細菌の付着を
遮断することにより、細菌の侵入を妨げる特異抗体を生
じさせることができる。組織損傷の例としては、例え
ば、機械的、化学的または熱的損傷による、または内在
装置の埋め込みによる皮膚や結合組織の傷、あるいは
口、乳腺、子宮または膣のような粘膜における傷が挙げ
られる。

【０１０２】本発明はまた、本発明の免疫原性組換えポ
リペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと適当な担
体とからなるワクチン処方も包含する。蛋白は胃で破壊
されうるので、非経口的投与（例えば、皮下、筋肉内、
静脈内、皮内等の投与を包含する）が望ましい。非経口
投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤、およ
びその処方を個体の体液、好ましくは血液と等張にする
溶質を含有してもよい、水性および非水性滅菌注射溶
液；懸濁化剤または増粘剤を含有してもよい、水性およ
び非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は、単位投与また
は複数投与用コンテナ、例えば、密封されたアンプルお
よびバイアルにて提供され、使用直前に滅菌液体担体を
添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵することができ
る。ワクチン処方はまた、水中油系のごとき処方の免疫
原性を高めるアジュバント系および当該分野において知
られている他の系を有してもよい。投与量はワクチンの
比活性に依存し、慣用的実験操作によって容易に決定で
きる。本発明をある種のｐｔｈポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドについて記載したが、この記載は天然のポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドのフラグメント、な
らびに組換えポリペプチドまたはポリヌクレオチドの免
疫原性を実質的に変化させない付加、欠失または置換を
有する同様なポリペプチドおよびポリヌクレオチドも包
含することが理解されるであろう。

【０１０３】組成物、キットおよび投与 本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生
物に投与される、ｐｔｈポリヌクレオチドおよび／また
はｐｔｈポリペプチドを含む組成物が提供される。本発
明はまた、上記したポリヌクレオチドおよび／またはポ
リペプチドあるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴ
ニストからなる組成物に関する。本発明のポリペプチド
は、対象への投与に適した医薬担体のような細胞、組織
または器官用の未滅菌または滅菌担体と組み合わせて使
用できる。かかる組成物は、例えば、媒体添加または治
療上有効量の本発明のポリペプチドおよび／またはポリ
ヌクレオチドと、医薬上許容される担体または賦形剤を
含む。かかる担体は、限定するものではないが、食塩
水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノールおよびその組み合わせを包含する。処方は投
与方法に適していなければならない。本発明は、さらに
は、上記した本発明の組成物の一またはそれ以上の成分
を充填した、一またはそれ以上のコンテナを含む診断お
よび医薬用パックおよびキットに関する。

【０１０４】本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
および他の化合物を、単独で、または、治療用化合物な
どの他の化合物と組み合わせて用いてもよい。該医薬組
成物は、例えば、とりわけ、局所、経口、経肛門、経
膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経鼻、経皮経路に
よる投与を含む、いずれかの有効な、都合のよい方法で
投与される。治療および予防において、活性成分は個体
に注射用組成物、例えば、好ましくは等張の滅菌水性分
散液として投与される。

【０１０５】また、組成物は、例えば、軟膏、クリー
ム、ローション、眼軟膏、点眼剤、点耳剤、マウスウォ
ッシュ、含浸包帯および縫合糸ならびにエアゾルの形態
の局所用処方とすることができ、適当な通常の添加剤、
例えば、保存料、薬剤浸透を助ける溶媒、軟膏やクリー
ムにおけるエモリエント等を含むことができる。そのよ
うな局所用処方はまた、適合する通常の担体、例えば、
クリームまたは軟膏基剤、ローション用のエタノールま
たはオレイルアルコールも含有することができる。この
ような担体は、処方の約１〜９８重量％を構成してもよ
く、より一般的には、処方の約８０重量％までを構成す
る。

【０１０６】さらなる態様において、本発明は、医薬上
許容される担体または賦形剤を混合された治療上有効量
のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、例え
ば可溶性形態の本発明ポリペプチドおよび／またはポリ
ヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストペプチ
ドまたは小型分子化合物を含む組成物が提供される。か
かる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキスト
ロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれら
の混合物を包含するが、これらに限らない。さらに本発
明は、上記本発明組成物の１種またはそれ以上の成分を
入れた１個またはそれ以上の容器を含む医薬パックおよ
びキットに関する。本発明のポリペプチド、ポリヌクレ
オチドおよび他の化合物を単独で、あるいは治療化合物
のごとき他の化合物と組み合わせて使用してもよい。組
成物を投与経路（例えば、全身投与または経口投与）に
適合させる。医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、
注射、典型的には静脈注射を包含する。皮下、筋肉内ま
たは腹腔内のごとき他の注射経路を用いることもでき
る。全身投与のための別の手段は、胆汁酸塩またはフシ
ジン酸または他の界面活性剤のごとき浸透剤を用いる経
粘膜または経皮投与を包含する。さらに、腸溶処方また
はカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も
可能である。これらの化合物の投与は局所的なものであ
ってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよ
い。

【０１０７】哺乳動物、特にヒトに投与するには、一日
の活性薬剤の用量は、０.０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／
ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。いずれにして
も、個体に最も適した実際の用量は医者により決定さ
れ、個体の年齢、体重および応答により変化する。上記
の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より
高いまたは低い用量範囲が適当な個体もあり、それらも
本発明の範囲内である。内在装置には外科移植、補綴お
よびカテーテル、すなわち、個体の体内に導入され、そ
の位置に長時間止まる装置が包含される。例えば、その
ような装置としては、人工関節、心臓弁、ペースメーカ
ー、血管グラフト、血管カテーテル、脊髄液シャント、
尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（continuous ambulat
ory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテーテルが挙
げられる。

【０１０８】本発明の組成物は、内在装置の挿入の直前
に関連する細菌に対する全身的効果を達成するために注
射で投与できる。治療は、手術の後、装置が体内にある
間継続できる。加えて、組成物は、細菌の傷汚染、特
に、スタフィロコッカス・アウレウスの傷汚染を防止す
るために、いずれの手術用の手術周辺カバーの拡張にも
使用できる。多くの整形外科医は、補綴関節を有するヒ
トは、菌血症を生じ得る歯の治療前に抗生物質による予
防を考慮すべきと考えている。後の重い感染は、重篤な
合併症となり、時に、補綴関節の損失および著しい罹病
率、致死率を伴う。したがって、該活性物質を、この状
況の予防的抗生物質の代替品として使用することにまで
拡張することができる。

【０１０９】上記した治療に加えて、本発明の組成物
は、一般に、傷組織に露出したマトリックス・蛋白への
細菌付着を予防するための傷治療剤、抗生物質予防に代
え、あるいは共に、歯の治療における予防的用途に使用
できる。別法として、本発明の組成物は挿入直前に内在
装置を浸すのに使用できる。該活性物質は、好ましく
は、傷または内在装置を浸す場合、１μｇ／ｍｌ〜１０
ｍｇ／ｍｌの濃度で使用できる。

【０１１０】便利には、ワクチン組成物は注射剤の形態
である。通常のアジュバントを使用して免疫応答を高め
ることができる。ワクチン用の適当な単位投与量は抗体
０.５〜５μｇ／ｋｇであり、この用量を、好ましくは
１〜３週間の間隔で１〜３回投与する。指示した用量範
囲で、本発明の化合物では、その化合物の適当な個体へ
の投与を妨げる、有害な毒作用は何も観察されない。

【０１１１】配列データベース、触知可能媒体中の配
列、およびアルゴリズム ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、その２次
元および３次元構造を決定し、類似の相同性を有するさ
らなる配列を同定するための貴重な情報源を形成する。
配列をコンピューター読み込み可能媒体に保存し、次い
で、既知の高分子構造プログラムにおいて保存したデー
タを用いて、ＧＣＣのごときよく知られた既知検索ツー
ルを用いてデータベースを検索することにより、これら
のアプローチを最も容易に簡略化することができる。本
発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは検索分析に
有用なデータベースならびに配列分析アルゴリズム中の
成分として有用である。見出しのこのセクションならび
にこのセクションに関連した請求項の用語「配列データ
ベース、触知可能媒体中の配列、およびアルゴリズム」
「本発明ポリヌクレオチド」および「本発明ポリヌクレ
オチド配列」は、本発明ポリヌクレオチドの検出可能な
化学的または物理的特性を意味し、触知可能媒体に還元
または保存されていてもよいものである。例えば、クロ
マトグラフィーのスキャンデータまたはピークのデー
タ、写真のデータまたはそこから得られたスキャンデー
タ、コールドベース、および質量スペクトル分析データ
が挙げられる。データベースおよびアルゴリズムという
見出しのこのセクションならびにそれに関連した請求項
で用いる用語「本発明ポリペプチド」および「本発明ポ
リペプチド配列」は、本発明ポリペプチドの検出可能な
化学的または物理的特性を意味し、触知可能媒体に還元
または保存されていてもよいものである。例えば、クロ
マトグラフィーのスキャンデータまたはピークのデー
タ、写真のデータまたはそこから得られたスキャンデー
タ、コールドベース、および質量スペクトル分析データ
が挙げられる。

【０１１２】本発明は、本発明ポリペプチド配列および
／または本発明ポリヌクレオチド配列を保存したコンピ
ューター読み込み可能媒体を提供する。例えば、下記の
メンバーを含み、保存したコンピューター読み込み可能
媒体が提供される：メンバーは、本発明ポリヌクレオチ
ドの配列を含むポリヌクレオチド；本発明ポリペプチド
配列の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列
が本発明ポリヌクレオチド配列の配列を含むものである
ポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１つの配列
が本発明ポリペプチド配列の配列を含むものであるポリ
ヌペプチド配列のセット；本発明ポリヌクレオチド配列
の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータセッ
ト；本発明ポリペプチド配列の配列を含むポリペプチド
をコードしているポリヌクレオチド配列を表すデータセ
ット；本発明ポリヌクレオチド配列の配列を含むポリヌ
クレオチド；本発明ポリペプチド配列の配列を含むポリ
ペプチド；少なくとも１つの配列が本発明ポリヌクレオ
チド配列の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列
のセット；少なくとも１つの配列が本発明ポリペプチド
配列の配列を含むものであるポリペプチド配列のセッ
ト；本発明ポリヌクレオチド配列の配列を含むポリヌク
レオチド配列を表すデータセット；本発明ポリペプチド
配列の配列を含むポリペプチド配列をコードしているポ
リヌクレオチド配列を示すデータセットである。コンピ
ューター読み込み可能媒体は情報またはデータを保存す
るのに用いる物体のいずれの組成物であってもよく、例
えば、市販フロッピーディスク、テープ、チップ、ハー
ドドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディス
クを包含する。特徴配列または鎖、詳細には遺伝学的配
列またはコードされた遺伝学的配列の分析方法が本発明
により提供される。配列分析のための好ましい方法は、
例えば、同一性および類似性の分析のごとき配列相同性
分析、ＲＮＡ構造分析、配列アッセンブリー、クラディ
スティック（cladistic）分析、配列モチーフ分析、読
み枠決定、核酸塩基コーリング（calling）、核酸塩基
トリミング、および配列決定クロマトグラムピーク分析
の方法を包含する。

【０１１３】コンピューターによる方法は相同性の同定
を行うために提供される。この方法は、本発明ポリヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド配列をコンピュー
ター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌク
レオチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチドまた
はポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を
含む。

【０１１４】コンピューターによる方法は相同性の同定
を行うためにも提供され、該方法は、本発明ポリペプチ
ド配列を含むポリペプチド配列をコンピューター読み込
み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリペプチド配列を
少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド
配列と比較して相同性を同定する工程を含む。

【０１１５】さらにコンピューターによる方法はポリヌ
クレオチドアッセンブリー用にも提供され、該方法は、
本発明ポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオ
チド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供
し、次いで、該第１のポリヌクレオチド配列と第２のポ
リヌクレオチド配列との間の少なくとも１つの重複領域
をスクリーニングする工程を含む。

【０１１６】本発明のさらなる具体例は、相同性の同定
を行うためのコンピューターによる方法を提供し、該方
法は、本発明ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
チド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供
し、次いで、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して
相同性を同定する工程を含む。

【０１１７】本発明のさらなる具体例は、相同性の同定
を行うためのコンピューターによる方法を提供し、該方
法は、本発明ポリペプチド配列を含むポリペプチド配列
をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次い
で、該ポリペプチド配列を少なくとも１つのポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定
する工程を含む。

【０１１８】本発明のさらなる具体例はポリヌクレオチ
ドアッセンブリーのためのコンピューターによる方法を
提供し、該方法は、本発明ポリヌクレオチド配列を含む
第１のポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込み
可能媒体中に提供し、次いで、該第１のポリヌクレオチ
ド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少なくと
も１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む。

【０１１９】本発明のもう１つの好ましい具体例におい
て、下記のものからなる群より選択されるメンバーを保
存したコンピューター読み込み可能媒体が提供される：
メンバーは、配列番号：１または３の配列を含むポリヌ
クレオチド；配列番号：２または４の配列を含むポリペ
プチド；少なくとも１つの配列が配列番号：１または３
の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセッ
ト；少なくとも１つの配列が配列番号：２または４の配
列を含むものであるポリペプチド配列のセット；配列番
号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド配列を表
すデータセット；配列番号：２または４の配列を含むポ
リペプチド配列をコードしているポリヌクレオチド配列
を表すデータセット；配列番号：１または３の配列を含
むポリヌクレオチド；配列番号：２または４の配列を含
むポリペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号：１
または３の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列
のセット；少なくとも１つの配列が配列番号：２または
４の配列を含むものであるポリペプチド配列のセット；
配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド配
列を表すデータセット；配列番号：２または４の配列を
含むポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチ
ド配列を表すデータセットである。さらなる好ましい本
発明の具体例は、相同性の同定を行うためのコンピュー
ターによる方法を提供し、該方法は、配列番号：１また
は３の配列を含むポリヌクレオチド配列をコンピュータ
ー読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌクレ
オチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは
ポリペプチド配列を比較して相同性を同定する工程を含
む。さらなる好ましい本発明の具体例は、相同性の同定
を行うためのコンピューターによる方法を提供し、配列
番号：２または４の配列を含むポリペプチド配列をコン
ピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポ
リペプチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチドま
たはポリペプチド配列を比較して相同性を同定する工程
を含む。さらなる好ましい本発明の具体例は、ポリヌク
レオチドアッセンブリーのためのコンピューターによる
方法を提供し、該方法は、配列番号：１または３の配列
を含む第１のポリヌクレオチド配列をコンピューター読
み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第１のポリヌク
レオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少
なくとも１つの重複領域をスクリーニングする工程を含
む。

【０１２０】本発明のさらなる具体例は、相同性の同定
を行うためのコンピューターによる方法を提供し、該方
法は、配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオ
チド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供
し、次いで、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して
相同性を同定する工程を含む。

【０１２１】本発明のさらなる具体例は、相同性の同定
を行うためのコンピューターによる方法を提供し、該方
法は、配列番号：２または４の配列を含むポリペプチド
配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次
いで、該ポリペプチド配列を少なくとも１つのポリヌク
レオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同
定する工程を含む。

【０１２２】本発明のさらなる具体例はポリヌクレオチ
ドアッセンブリーのためのコニューターによる方法を提
供し、該方法は、配列番号：１または３の配列を含む第
１のポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込み可
能媒体中に提供し、次いで、該第１のポリヌクレオチド
配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少なくとも
１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む。

【０１２３】本明細書において引用したすべての文献
（特許および特許出願に限らない）は出典明示によりそ
の内容を本明細書の一部とする。本願が優先権を主張す
るいずれの特許出願もまた出典明示により本明細書の一
部とする。

【０１２４】用語 本明細書中で頻繁に使用される特定の用語を、その理解
を容易にするために以下に定義する。「抗体（複数でも
可）」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体、キメラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａ
ｂフラグメントを包含し、さらにＦａｂまたは他の免疫
グロブリン発現ライブラリーの産物を包含する。「抗原
的に等価な誘導体（複数でも可）」は、特定の抗体によ
り特異的に認識されるポリペプチド、ポリヌクレオチ
ド、またはいずれかの等価物を包含し、該特定の抗体
は、本発明蛋白、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
に対して生成した場合に、病原体と哺乳動物宿主との間
の身体的相互作用を妨害するものである。「二特異的
（複数でも可）」とは、少なくとも２つの抗原結合ドメ
インを含む抗体を意味し、各ドメインは異なるエピトー
プに指向されている。「身体材料（複数でも可）」と
は、個体または生物由来の材料を意味し、骨、血液、血
清、脳脊髄液、精液、唾液、筋肉、軟骨、器官組織、皮
膚、尿、糞便または生検材料のごとき細胞、組織および
排泄物等を包含する。該生物は、個体に感染、侵入、ま
たは棲息するものである。「疾病（複数でも可）」は、
例えば、上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、
急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば、蓄膿
症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内膜炎）、
胃腸感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿
瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感染（例え
ば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼
窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染（例えば、副睾
丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候
群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、
蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、ならびに骨および関
節感染（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）を包含する
細菌による感染により引き起こされる疾病、またはかか
る細菌による感染に関連した疾病を意味する。「融合蛋
白（複数でも可）」は、２種の、しばしば関係のない融
合遺伝子またはそのフラグメントによりコードされた蛋
白をいう。一例において、ＥＰ−Ａ−０４６４には、別
のヒト蛋白またはその一部と一緒になった免疫グロブリ
ン分子の不変領域の種々の部分を含む融合蛋白が開示さ
れている。多くの場合、免疫グロブリンのＦｃ領域を融
合蛋白の一部分として用いることは治療および診断にお
ける使用に有利であり、例えば、改善された薬物動態学
的特性が得られる（例えば、ＥＰ−Ａ ０２３２２６２
参照）。一方、いくつかの用途には、融合蛋白が発現、
検出および精製された後、Ｆｃ部分を欠失できることが
望ましいであろう。「宿主細胞（複数でも可）」は外来
性ポリヌクレオチド配列によって形質転換またはトラン
スフェクションされた、あるいは形質転換またはトラン
スフェクションされうる細胞である。

【０１２５】「同一性」は、当該分野で公知であり、配
列の比較で決定されるような、２またはそれ以上のポリ
ペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオ
チド配列の間の関係である。また、当該分野では、「同
一性」は、場合によっては、配列の鎖間の対合によって
決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」
は、Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.
編，Oxford University Press，New York，1988；Bioco
mputing：Informatics and Genome Projects, Smith,
D.W.編，Academic Press，New York，1993；Computer A
nalysis of Sequence Data，Part I，Griffin, A.M.お
よびGriffin, H.G.編，Humana Press，New Jersey，199
4；Sequence Analysis in Molecular Biology，Von Hei
nje,G．Academic Press，1987；およびSequence Analys
is Primer，Gribskov,M.およびDevereux, J.編，M Stoc
kton Press，New York，1991；およびCarllio,HおよびL
ipman,D.，SIAM J.Applied Math., 48：1073(1988)に記
載されている方法（これらに限らない）を含め、公知方
法により容易に決定することができる。同一性を決定す
る好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与
えるように設計されている。そのうえ、同一性を測定す
る方法は公に入手できるコンピュータ・プログラムに集
成されている。２つの配列の間の同一性を測定する好ま
しいコンピュータ・プログラム方法は、例えば、ＧＣＳ
プログラムパッケージ（Devereux,J.ら，Nucleic Acids
Research（1984）12（1）：387）、BLASTP、BLASTNお
よびFASTA（Atschul,S. F.ら, J.Molec.Biol.（1990）2
15：403−410）を包含するが、これに限らない。BLAST
XプログラムはNCBIおよび他の源（BLAST Manual，Altsh
ul, S．ら，NCBI NLM NIH Bethesda，MD20894；Altschu
l,S．ら，J．Mol．Biol.，215：403−410(1990)）から
公に入手できる。また、周知のスミス・ウォーターマン
（Smith Waterman)アルゴリズムを用いて同一性を決定
することもできる。

【０１２６】ポリペプチド配列の比較のためのパラメー
ターは以下のものを包含する： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J.Mol.Bio
l. 48:443-453 (1970) 比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff, Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919 (1992)からのBLOSSUM
62 ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Ge
netics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」
プログラムとして公に利用できる。上記パラメーターは
ポリペプチド比較のための省略時パラメーターである
（エンドギャップについてペナルティーを伴わない）。
ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターは
下記のものを包含する： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J.Mol.Bio
l. 48:443-453 (1970) 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Ge
netics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」
プログラムとして公に利用できる。上記パラメーターは
ポリヌクレオチド比較のための省略時パラメーターであ
る。

【０１２７】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドにつ
いての「同一性」に関する好ましい意味は、下記（１）
および（２）に示される。 （１）さらにポリヌクレオチドの具体例は、配列番号：
１の対照配列に対して少なくとも５０、６０、７０、８
０、８５、９０、９５、９７または１００％の同一性を
有する単離ポリヌクレオチド配列を包含し、本発明ポリ
ヌクレオチド配列は配列番号：１の対照配列と同一であ
ってもよく、あるいは対照配列と比較してある程度の数
までのヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる
変化は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換
（トランジションおよびトランスバージョンを包含）ま
たは挿入からなる群より選択され、該変化は対照ヌクレ
オチド配列の５’または３’末端の位置あるいはそれら
の末端位置の間の位置において、対照配列中のヌクレオ
チドにおいて個々にまたは散在して、あるいは対照配列
中の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよ
い。配列番号：１中の全ヌクレオチド数と個々の同一性
パーセント値（１００で割ったもの）とをかけて、その
積を配列番号：１中の全ヌクレオチド数から差し引くこ
とによりヌクレオチド変化の数を決定する。これを下式
により説明する： ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ） 式中、ｎ_nはヌクレオチド変化の数であり、ｘ_nは配列番
号：１中の全ヌクレオチド数であり、ｙは、例えば７０
％なら０．７０、８０％なら０．８０、８５％なら０．
８５、９０％なら０．９０、９５％なら０．９５、９７
％なら０．９７、１００％なら１．００であり、・は積
の演算子であり、ｘ_nとｙとの整数でない積は切り捨て
により最も近い整数とした後、ｘ_nから差し引く。配列
番号：２のポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チド配列の変化は、好ましくはコーディング配列中のナ
ンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を引き
起こす可能性があり、それゆえ、かかる変化に随伴して
ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド
が変化する。例えば、本発明ポリヌクレオチド配列は配
列番号：１の対照配列と同一であってもよく、すなわ
ち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列と
比較してある程度の数までの核酸の変化を有していても
よい（その場合、同一性％は１００％未満である）。か
かる変化は、少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トラ
ンジションおよびトランスバージョンを包含）または挿
入からなる群より選択され、該変化は対照ポリヌクレオ
チド配列の５’または３’末端の位置あるいはそれらの
末端位置の間の位置において、対照配列中の核酸におい
て個々にまたは散在して、あるいは対照配列中の１また
はそれ以上の連続した群として生じてもよい。配列番
号：１中の全核酸数に個々の同一性を示す整数を１００
で割った値をかけて、その積を配列番号：１中の全核酸
数から差し引くことにより同一性％値についての核酸変
化数を決定する。あるいはこのことは下式により説明さ
れる： ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ） 式中、ｎ_nは核酸変化の数であり、ｘ_nは配列番号：１中
の全核酸数であり、ｙは、例えば７０％なら０．７０、
８５％なら０．８５等であり、ｘ_nとｙとの整数でない
積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘ_nから差
し引く。

【０１２８】（２）さらにポリペプチドの具体例は、配
列番号：２のポリペプチド対照配列に対して少なくとも
５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７また
は１００％の同一性を有するポリペプチドを含む単離ポ
リペプチドを包含し、該ポリペプチド配列は配列番号：
２の対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配列
と比較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有して
いてもよい。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ酸
の欠失、置換（保存的および非保存的置換を包含）また
は挿入からなる群より選択され、該変化は対照ポリペプ
チド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置あるいは
それらの末端位置の間の位置において、対照配列中のア
ミノ酸において個々にまたは散在して、あるいは対照配
列中の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよ
い。配列番号：２中の全アミノ酸数と同一性を示す整数
を１００で割った値とをかけて、その積を配列番号：２
中の全アミノ酸数から差し引くことによりアミノ酸変化
の数を決定する。これを下式により説明する： ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ） 式中、ｎ_aはアミノ酸変化数であり、ｘ_aは配列番号：２
中の全アミノ酸数であり、ｙは、例えば７０％なら０．
７０、８０％なら０．８０、８５％なら０．８５、９０
％なら０．９０、９５％なら０．９５、９７％なら０．
９７、１００％なら１．００であり、・は積の演算子で
あり、ｘ_aとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も
近い整数とした後、ｘ_aから差し引く。例えば、本発明
ポリペプチド配列は配列番号：２の対照配列と同一であ
ってもよく、すなわち、１００％同一であってもよく、
あるいは対照配列と比較してある程度の数までのアミノ
酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性％は１
００％未満である）。かかる変化は、少なくとも１個の
アミノ酸の欠失、置換（保存的または非保存的置換を包
含）または挿入からなる群より選択され、該変化は対照
ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置
あるいはそれらの末端位置の間の位置において、対照配
列中のアミノ酸において個々にまたは散在して、あるい
は対照配列中の１またはそれ以上の連続した群として生
じてもよい。配列番号：２中の全アミノ酸数に個々の同
一性パーセント値（１００で割ったもの）をかけて、そ
の積を配列番号：２中の全アミノ酸数から差し引くこと
により同一性％値についてのアミノ酸変化数を決定す
る。これを下式により説明する： ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ） 式中、ｎ_aはアミノ酸変化の数であり、ｘ_aは配列番号：
２中の全アミノ酸数であり、ｙは、例えば７０％なら
０．７０、８５％なら０．８５等であり、ｘ_aとｙとの
整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、
ｘ_aから差し引く。

【０１２９】「免疫学的に等価な誘導体」は、ポリペプ
チド、ポリヌクレオチド、またはいずれかの等価物を包
含し、それらが脊椎動物において抗体を生成させるため
に適当な処方中に用いられた場合に、抗体は病原体と哺
乳動物宿主との間の即時的な身体的相互作用を妨害する
ように作用する。「免疫特異的」とは、他の関連ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチド、特に先行技術のポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドに対してよりも本発明ポ
リペプチドまたは本発明ポリヌクレオチドに対して実質
的に大きなアフィニティーを有する抗体の特性を意味す
る。「個体（複数でも可）」とは多細胞真核生物を意味
し、後生動物類、哺乳動物、ヤギ類、ウシ類、類人猿、
霊長類およびヒトを包含するが、これらに限らない。

【０１３０】「単離された」とは、「ヒトの手によ
り」、その天然の状態から変えられること、すなわち、
天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あ
るいは両方されたことを意味する。例えば、生体に天然
に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離された」ものではないが、その天然状態で共存する物
質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは、本明細書で用いる用語としての「単離された」
ものである。さらには、形質転換、遺伝的操作により、
または他のいずれかの方法により生物に導入されている
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、まだ生物内に
あり、その生物が生きているまたは死んでいるとして
も、「単離された」ものである。

【０１３１】「生物（複数でも可）」は、（ｉ）Strept
ococcus、Staphylococcus、Bordetella、Corynebacteri
um、Mycobacterium、Neisseia、Haemophilus、Actinomy
ces、Streptomyces、Nocardia、Enterobacter、Yersini
a、Fancisella、Pasturella、Moraxella、Acinetobacte
r、Erysipelothrix、Branhamella、Actinobacillus、St
reptobacillus、Listeria、Calymmatobacterium、Bruce
lla、Bacillus、Closterdium、Treponema、Escherichi
a、Salmonella、Kleibsiella、Vibrio、Proteus、Erwin
ia、Borrelia、Leptospira、Spirillum、Campylobacte
r、Shigella、Legionella、Pseudomonas、Aeromonas、R
ickettsia、Chlamydia、BorreliaおよびMycoplasmaであ
る属（これらに限らない）のメンバー、ならびにグルー
プＡのStreptococcus、グループＢのStreptococcus、グ
ループＣのStreptococcus、グループＤのStreptococcu
s、グループＧのStreptococcus、Staphylococcus aureu
s、Streptococcus pyrogenes、Streptococcus agalacti
ae、Streptococcus faecalis、Streptococcus faeciu
m、Streptococcus durans、Neisseria gonorrheae、Nei
sseria meningitidis、Staphylococcus aureus、Staphy
lococcus epidermidis、Corynebacterium diptheriae、
Garnella vaginalis、Mycobacterium tuberculosis、My
cobacterium bovis、Mycobacterium ulcerans、Mycobac
terium leprae、Actinomyces israelli、Listeria mono
cytogenes、Bordetella pretusis、Bordetella parapre
tusis、Bordetella bronchiseptica、Esherichia col
i、Shigella dysenteriae、Haemophilus influenzae、H
aemophilus aegyptius、Haemophilus parainfluenzae、
Haemophilus ducreyi、Bordetella、Salmonella typh
i、Citrobacter freundii、Proteus mirabilis、Proteu
s vulgaris、Yersinia pestis、Klebsiella pneumonia
e、Serratia marcessens、Vibrio cholera、Shigella d
ysenterii、Shigella flexneri、Pseudomonas aerugino
sa、Franscisella tularensis、Brucella abortis、Bac
illus anthracis、Bacillus cereus、Clostridium perf
ringens、Clostridium tetani、Clostridium butulinu
m、Treponema pallidum、Rickettsia rickettsiiおよび
Chlamydia trachomitisである種またはグループ（これ
らに限らない）のメンバーを包含する原核生物、（ｉ
ｉ）Archaebacter（これに限らない）を包含する古細
菌、および（ｉｉｉ）原生動物、真菌類、Saccharomyce
s、KluveromycesまたはCandida属（これらに限らない）
のメンバー、およびSaccharomyces cerevisiae、Kluver
omyces lactisまたはCandida albicans種のメンバー
（これらに限らない）を包含する単細胞または糸状真核
生物を意味する。

【０１３２】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであっ
てもよい。「ポリヌクレオチド」は、単鎖および二本鎖
ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖およ
び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖
ＲＮＡ、単鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、
および単鎖またはより典型的には二本鎖または三本鎖領
域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよ
いＤＮＡおよびＲＮＡを含含むハイブリッド分子を包含
するが、これに限定されない。さらに、本明細書におい
て用いる「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる三本鎖
領域をいう。これらの領域の鎖は同じ分子からのもので
も、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら
分子の一またはそれ以上のすべてを含んでもよいが、よ
り典型的には、分子のいくつかの領域のみを含む。三本
螺旋領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオチ
ドである。本明細書において用いる場合、「ポリヌクレ
オチド（複数でも可）」なる用語はまた、一つまたはそ
れ以上の修飾された塩基を含有する上記ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを包含する。すなわち、安定性または他の理由で修
飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語が
本明細書で意図するところの「ポリヌクレオチド（複数
でも可）」である。さらに、イノシンなどの通常でない
塩基、またはトリチル化された塩基などの修飾塩基を含
むＤＮＡまたはＲＮＡ（２つの例だけを示す）も、その
用語を本明細書で用いる場合のポリヌクレオチドであ
る。多種の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされており、
当業者に公知のように多くの有用な目的に使用されてい
ることが理解されよう。本明細書で用いる「ポリヌクレ
オチド」なる語は、ポリヌクレオチドのこのような化学
的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウ
イルスおよび、例えば、単純型細胞および複雑型細胞な
どの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を
包含する。「ポリヌクレオチド（複数でも可）」はま
た、しばしばオリゴヌクレオチド（複数でも可）と称さ
れる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【０１３３】「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプ
チド結合または修飾ペプチド結合で互いに結合した２つ
またはそれ以上のアミノ酸を含含むいずれのペプチドま
たは蛋白をもいう。「ポリペプチド（複数でも可）」
は、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマー
と称される短い鎖、および一般に蛋白と称される長い鎖
の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によりコードさ
れている２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含有しても
よい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、プロセッシ
ングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の工程、また
は化学修飾技法のいずれかによって修飾されたものを有
する。かかる修飾は、基本テキストにて、およびより詳
細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献にて詳しく
記載されており、それらは当業者に周知である。同じ型
の修飾が、所定のポリペプチド中、いくつかの部位で、
同じまたは異なる程度にて存在してもよいことは明らか
であろう。また、所定のペプチドは多くの型の修飾を有
していてもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチ
ドのどこででも起こりうる。修飾は、例えば、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、
共有交差結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメー
トの形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、ＧＰ
Ｉアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル
化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質
付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシ
ル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレ
ノイル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移ＲＮＡに
より媒介される蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチ
ネーションを包含する。例えば、PROTEINS−STRUCTURE
AND MOLECULAR PROPERTIES, 第２版，Ｔ.Ｅ.Ｃreighto
n，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃompany，New York（1993）お
よびＷold,Ｆ.，POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICAT
ION OF PROTEINS，Posttranslational Protein Modific
ations：Perspectives and Prospects,pgs. 1−12，B.
C.Johnson編，Academic Press，New York（1983）；Sei
fterら,Meth Enzymol.（1990）182：626−646、およびR
attanら, Protein Synthesis：Posttranslational Modi
fications and Aging，Ann N.Y.Acad Sci（1992）663：
48-62を参照のこと。ポリペプチドは、分枝してもよ
く、分枝を伴ったまたは伴わない環状であってもよい。
環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天
然のプロセッシングの結果であり、同様に全く合成的な
方法で合成できる。

【０１３４】「組み換え発現系（複数でも可）」は、本
発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造のため
に宿主細胞または宿主細胞溶解物中に導入または形質転
換された発現系またはその部分または本発明ポリヌクレ
オチドをいう。

【０１３５】「引き算セット（subtraction set）」
は、本発明の少なくとも１のポリヌクレオチドを含む１
種またはそれ以上、しかし好ましくは１００種未満のポ
リヌクレオチドである。

【０１３６】本明細書中で使用される「変種（複数でも
可）」なる語は、各々、対照標準のポリヌクレオチドま
たはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持して
いるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリ
ヌクレオチドの典型的な変種は、別の対照標準のポリヌ
クレオチドとヌクレオチド配列において異なっている。
変種のヌクレオチド配列における変化は、対照標準のポ
リヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのア
ミノ酸配列と変わっていてもよいし、または変わってい
なくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後述するよう
に、対照標準の配列によってコードされたポリペプチド
において、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断
をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変種は、別の
対照標準のポリペプチドとはアミノ酸配列において異な
っている。一般に、差異は、対照標準のポリペプチドと
その変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの
領域においては同一であるように限定される。変種およ
び対照標準のポリペプチドは、一またはそれ以上の置
換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによって、アミ
ノ酸配列において異なってもよい。置換または挿入され
たアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたも
のであってもなくてもよい。また本発明は、本発明の各
ポリペプチドの変種、すなわち保存的アミノ酸置換によ
り対照標準とは異なっており、そのことにより残基が同
様の特性を有する別の残基に置換されているものを包含
する。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
およびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基Ａｓ
ｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；塩基性残基
ＬｙｓおよびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基Ｐｈｅおよ
びＴｙｒ間のものである。数個、５〜１０個、１〜５
個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸がいずれ
かの組み合わせで置換、欠失、または付加されている変
種が特に好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの変種は、対立遺伝子変種のような天然に存在するも
のであってもよく、または天然に存在することが知られ
ていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの天然に存在しない変種は、変異誘発法ま
たは直接合成あるいは当業者に公知の他の組換え法によ
って作られてもよい。

【０１３７】

【実施例】以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以
外は、当業者に周知で慣用的な標準的な技法を用いて実
施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもの
ではない。

【０１３８】実施例１ 株の選択、ライブラリーの製
造および配列決定 表１（配列番号１または３）に示すＤＮＡ配列を有する
ポリヌクレオチドは、エシェリシア・コリ中のスタフィ
ロコッカス・アウレウスの染色体ＤＮＡのクローンライ
ブラリーより得た。重複するスタフィロコッカス・アウ
レウスＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローン
からの配列データを用いて、配列番号１の連続したＤＮ
Ａ配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例えば以
下の方法１および２により製造してもよい。全細胞ＤＮ
Ａをスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９よ
り、標準法に従って単離し、以下に示す二つの方法のい
ずれかによりサイズ分画する。

【０１３９】方法１ 標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮ
Ａをニードル（needle）に通して機械的に剪断する。１
１ｋｂｐまでの大きさのＤＮＡフラグメントをエキソヌ
クレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼで処理することに
よって末端切断し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フ
ラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダ
ＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーを
パッケージングし、次いでパッケージングしたライブラ
リーでエシェリシア・コリを感染させる。ライブラリー
を標準方法により増幅する。

【０１４０】方法２ 全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングす
るための一連のフラグメントを得るのに適当な１つの制
限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓ
ｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分
解し、かかるフラグメントを標準的方法に従ってサイズ
分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡに連結し、次い
でそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、
ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラ
リーをパッケージングし、パッケージングしたライブラ
リーでエシェリシア・コリを感染させる。ライブラリー
を標準方法により増幅する。

【０１４１】実施例２ 感染中のスタフィロコッカス・
アウレウス由来の遺伝子の発現の決定 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９に感染し
た４日目のマウス鼠蹊部由来の壊死脂肪組織を、カオト
ロピック剤およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在下で効果的
に破砕し処理して動物ＲＮＡおよび細菌ＲＮＡの混合物
を得る。安定な調合物および高収率の細菌ＲＮＡを得る
ための破砕および処理の最適条件は、その後のノーザン
ブロット上におけるスタフロコッカス・アウレウスエ
１６Ｓ ＲＮＡに特異的な放射性標識オリゴヌクレオチ
ドとのハイブリダイゼーションの使用にも用いる。得ら
れたＲＮＡについてのＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ
不含、ＤＮＡおよび蛋白不含の調合物は、スタフィロコ
ッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の各遺伝子の配列から
設計されたユニークなプライマーペアーを用いる逆転写
ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に適する。

【０１４２】ａ）感染のマウス動物モデルからのスタフ
ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感染組織の単離 体積１０ｍｌの滅菌栄養培地（No.2 Oxoid）に、寒天培
養プレートから単離した個々のスタフィロコッカス・ア
ウレウスＷＣＵＨ２９を撒く。３７℃で１６〜２０時間
培養物を好気的にインキュベーション（静置培養）す
る。このスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９
ブロス培養物（ブロス中に約１０⁸ｃｆｕ／ｍｌとなる
よう希釈）０．５ｍｌを右前足の大腿部（鼠蹊部）に皮
下注射することにより４週齢のマウス（メス、１８〜２
２ｇ、ＭＦ１株）をそれぞれ感染させる。感染後２４時
間は、マウスを定期的にモニターすべきであり、その
後、研究終了まで毎日モニターすべきである。全身感染
の徴候、すなわち、昏睡、逆立った毛、群れからの離脱
を示す動物を詳細にモニターすべきであり、徴候が瀕死
状態に至る場合には動物を即座に除去すべきである。傷
害進展を示す外部から目で見てわかる徴候は感染２４〜
４８時間後に現れるであろう。動物の腹部の試験によ
り、皮膚下の膿瘍の盛り上がった輪郭が示されるであろ
う。局所的な傷害は右の下大腿部にとどまるはずである
が、場合によっては左の下大腿部および上に広がって胸
部に至るかもしれない。場合によっては、膿瘍が皮膚層
から破裂してくるかもしれない。このような場合、感染
動物を即座に除去し、可能ならば組織をサンプリングす
る。動物を除去しないと、膿瘍を覆っている壊死皮膚組
織が脱落し、腹部筋肉壁が露出するかもしれない。感染
から約９６時間後に、二酸化炭素による窒息を用いて動
物を殺す。死亡と組織処理／保存との間の時間を最短に
するために、グループにおいてではなく、個々にマウス
を殺すべきである。死亡したマウスを仰向けに置き、７
０％アルコールで毛を横向けに拭く。左下大腿部から腹
部へと、はさみを用いる最初の皮膚の切開を行い、次い
で、胸部を切る。腹部から右の下大腿部への切開により
切開を完了する。腹膜を貫通しないように注意すべきで
ある。鉗子で皮膚を固定し、含むから皮膚を静かに引っ
張る。腹膜を覆っているが通常には筋肉シートを完全に
は貫通していない、露出した膿瘍を切除するが、内蔵を
傷つけないように注意する。液体窒素中での迅速凍結の
前に、膿瘍／筋肉シートおよび他の感染組織を切片化す
る必要があるかもしれない。切片化によりプラスチック
製収集バイアル中での保存が容易となる。

【０１４３】ｂ）感染組織試料からのスタフィロコッカ
ス・アウレウスＷＣＵＨ２９の単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の４〜６個の感染組織試料
（各０．５〜０．７ｇ）を−８０℃の貯蔵庫からドライ
アイス−エタノール浴中に取り出す。微生物安全キャビ
ネット中で試料を破砕し、残った試料をドライアイス−
エタノール浴中で保存する。組織試料中の細菌を破砕す
るために、TRIzol Reagent（Gibco BRL,Life Technolog
ies）を添加し、次いで、０．１ｍｍジルコニア／シリ
カビーズをチューブにほとんどいっぱいになるまで満た
し、ネジの部分にビーズか付かないように注意してふた
をして、良好な密閉状態を保ち、エアロゾル発生をなく
す。次いで、試料をMini-BeadBeater Type BX-4（Biosp
ec Products）dehomojinaizuする。壊死脂肪組織を５０
００ｒｐｍで１００秒間処理して細菌溶解物を得る。イ
ンビボで増殖した細菌はインビトロで増殖したスタフィ
ロコッカス・アウレウス（３０秒のビーズ処理で破砕さ
れる）よりも長時間処理を要する。ビーズ処理後、フー
ム−フード（fume-hood）中で開栓する前に、氷でチュ
ーブを冷却する。なぜなら、破砕中に熱が発生し、TRIz
olが分解され、シアニドが遊離する可能性があるためで
ある。次いで、２００ｍｌのクロロホルムを添加し、チ
ューブを手で１５秒間振盪して完全に混合する。室温で
２〜３分後、チューブを１２０００ｘｇ、４℃で遠心分
離し、TRIzol Reagentの製造者による方法によりＲＮＡ
抽出を続行する。すなわち、約０．６ｍｌの水相を滅菌
エッペンドルフチューブに移し、０．５ｍｌのイソプロ
パノールを添加する。室温で１０分後、試料を１２００
０ｘｇ、４℃で１０分遠心分離する。上清を取って捨
て、次いで、ＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％エタノー
ルで洗浄する。短時間ボルテックス撹拌して試料を混合
し、その後７５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離する。
エタノールを除去し、ＲＮＡペレットを５分以上減圧乾
燥する。次いで、試料を１００マイクロリットルのＤＥ
ＰＣ処理水中に繰り返しピペッティングすることにより
再懸濁し、次いで、５５℃で５〜１０分置く。最後に氷
上で少なくとも１分置いた後、２００ユニットのＲｎａ
ｓｉｎ（Promega）を添加する。ＲＮＡ調合物は−８０
℃で１カ月まで保存される。長期保存には、プロトコー
ルの洗浄段階における７５％エタノール中のＲＮＡ沈殿
は−２０℃で少なくとも１年保存できる。１％アガロー
スゲル上に試料を泳動することにより単離ＲＮＡの品質
を評価する。臭化エチジウム染色した１ｘＴＢＥゲルを
用いて収集全ＲＮＡを可視化する。感染組織からの細菌
ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、２．２Ｍホ
ルムアルデヒドゲルで泳動を行い、Hybond-N（Amersha
m）に減圧ブロッティングする。次いで、ブロットを、
スタフィロコッカス・スレウスの１６Ｓ ｒＲＮＡに特
異的な³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブ（K. Greis
en, M. Loeffelholz,A. Purohit and D. leong. J. Cli
n. (1994) Microbiol. 32 335-351）とハイブリダイゼ
ーションさせる。配列のオリゴヌクレオチドをプローブ
として使用する。ハイブリダイゼーションしているバン
ドのサイズを、インビボ増殖したスタフィロコッカス・
アウレウスＷＣＵＨ２９から単離された対照ＲＮＡのも
のとノーザンブロットにおいて比較する。全ＲＮＡ試料
中において正しいサイズの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡバンド
が検出でき、ＴＢＥゲル上で可視化した場合、哺乳動物
ＲＮＡの分解が示される。

【０１４４】ｃ）スタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終体積９０マイクロリットルのバッファー（２００ユ
ニットのRnasin（Promega）を添加補足）中で、３ユニ
ットのＤＮＡａｓｅＩ（増幅グレード）（GibcoBRL, Li
fe Technologies）を用いて、氷上で１５分処理するこ
とにより、７３マイクロリットルのＲＮＡ試料からＤＮ
Ａを除去した。製造者のプロトコールに従ってTRIzol L
S試薬（Gibco BRL, Life Technologies）によりＤＮＡ
ａｓｅを不活性化し除去した。ＤＮＡａｓｅ処理したＲ
ＮＡを、Ｒｎａｓｉｎを添加したＤＰＥＣ処理水７３マ
イクロリットル中に再懸濁した。

【０１４５】ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤ
ＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの
試料１０マイクロリットルを、First Strand cDNA合成
キット用のSuperScript Preamplification System（Gib
co BRL, Life Technologies）を用いて逆転写する。１
ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始
する。SuperScriptII逆転写酵素を添加しない対照も反
応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処理
し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。

【０１４６】ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるための
ＰＣＲの使用 下記成分を添加することにより氷上で０．２ｍｌのチュ
ーブにおいてＰＣＲ反応物をセットアップする：４５マ
イクロリットルのPCR SUPERMIX（Gibco BRL, Life Tech
nologies）；マクロリットルの５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂（最
終濃度２．５ｍＭとする）；１マイクロリットルのＰＣ
Ｒプライマー（最適には、１８〜２５塩基対の長さで、
類似のアニーリング温度を有するように設計されたも
の）（各プライマーは初発濃度１０ｍＭ）；および５マ
イクロリットルのｃＤＮＡ。Perkin Elmer GeneAmp PCR
System 9600においてＰＣＲ反応を行った：９５℃で５
分、次いでそれぞれ９４℃、５０℃そして７２℃で３０
秒を５０サイクル、その後７２℃で３分、次いで、保持
温度４℃とする（最適には、ＰＣＲ生成物の出現または
欠乏を決定するためのサイクル数は３０〜５０回、ＲＴ
反応からの初発ｃＤＮＡ量の評価を行う場合には、最適
には８〜３０サイクル）。次いで、１０マイクロリット
ルの部分試料を１％ ＴＢＥゲルで泳動し、臭化エチジ
ウム染色する。ＰＣＲ生成物については、存在するなら
ば、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Gibco BRL, Life Tech
nologies）との比較によりサイズを評価する。別法とし
て、便利には、標識ＰＣＲプライマー（例えば、５’末
端を標識したもの）を用いてＰＣＲ生成物を標識し、Ｐ
ＣＲ生成物の適当な部分試料をポリアクリルアミドゲル
で泳動し、適当なゲルスキャンニングシステム（例え
ば、Perkin Elmerにより提供されるGeneScanTMソフトウ
ェアを用いたABI PrismTM 377 Sequencer）を用いてそ
の存在および量を調べる。ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆
転写酵素反応物、非転写スタフィロコッカス・アウレウ
スＷＣＵＨ２９ゲノム配列からＰＣＲ生成物を生じるよ
うに設計された１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーもしくはＤ
ＮＡ特異的プライマーペアーを含んでいてもよい。プラ
イマーペアーの効率を試験するために、それらをスタフ
ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９全ＤＮＡを用い
るＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応をセットアッ
プし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイクログラムのＤＮＡ
を用いて上記のごとく３５サイクルのＰＣＲ反応を行
う。ＤＮＡ ＰＣＲまたはＰＴ／ＰＣＲのいずれにおい
ても予想サイズの生成物を生じないプライマーペアーは
ＰＣＲ反応できず、そのようなものとしては不均一であ
る。ＤＮＡ ＰＣＲで正しいサイズの生成物を生じるも
のは２つのクラスに分類される：１．インビボで転写さ
れない遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を
生じる再現性がないもの；および２．インビボで転写さ
れる遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイ
ズの生成物を再現性をもって生じ、＋ＲＴ試料において
−ＲＴ対照におけるシグナル（生じた場合には）よりも
強力なシグナルを生じるもの。

【０１４７】実施例３ エス・アウレウスにおける必須
性の研究 ｐｔｈ遺伝子のすぐ上流およびすぐ下流のＤＮＡ配列を
薬剤耐性決定部分と連結し、エス・アウレウスにおける
必須性試験のために適当なベクター中に挿入した。この
キメラベクターをエス・アウレウス中に導入し、変異ｐ
ｔｈおよび野生型ｐｔｈの療法を含む同時組み込み体を
単離した。同時組み込み体を分離し、野生型ｐｔｈ遺伝
子を含まず変異ｐｔｈのみを含む変異株を単離すること
は不可能であることがわかった。必須でない産物をコー
ドする遺伝子を用いる実験において、この分離工程を容
易に行えるが、必須産物をコードする遺伝子を用いた場
合には行うことができない。よって、このことはｐｔｈ
遺伝子産物がエス・アウレウスの生存に必須であること
を強く示唆する。

【０１４８】

【配列表】（１）一般的情報： （ｉ）出願人：Zalacain, Magdalena Biswas, Sanjoy Li, Tong McDevitt, Damien Traini, Christopher M. Warren, Richard L. Fosberry, Andrew P. Lawlor, Elizabeth J. Hodgson, John E. Ward, Judith （ｉｉ）発明の名称：ｐｔｈ （ｉｉｉ）配列の数：６ （ｖｉ）連絡先： （Ａ）宛て名：Dechert Price & Phoads （Ｂ）通り名：4000 Bell Atlantic Tower, 1717 Arch
Stre （Ｃ）都市名：Philadelphia （Ｄ）州名：PA （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：19103-2793 （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：Windows 95 （Ｄ）Windowsバージョン２．０b用FastSEQ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号：０８／９２０１１４ （Ｂ）出願日：１９９７年８月２６日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：Falk, Stephen T （Ｂ）登録番号：３６７９５ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ１００７８−１ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：２１５−９９４−２４８８ （Ｂ）ファックス番号：２１５−９９４−２２２２ （Ｃ）テレックス：

【０１４９】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５７３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATGAAATGTA TTGTAGGTCT AGGTAATATA GGTAAACGTT TTGAACTTAC AAGACATAAT 60 ATCGGCTTTG AAGTCGTTGA TTATATTTTA GAGAAAAATA ATTTTTCATT AGATAAACAA 120 AAGTTTAAAG GTGCATATAC AATTGAACGA ATGAACGGAG ATAAAGTGTT ATTTATCGAA 180 CCAATGACAA TGATGAATTT GTCAGGAGAA GCAGTTGCAC CGATTATGGA TTATTACAAT 240 GTTAATCCAG AAGATTTAAT TGTCTTATAT GATGATTTAG ATTTAGAACA AGGACAAGTT 300 CGCTTAAGAC AAAAAGGAAG TGCGGGCGGT CACAATGGTA TGAAATCAAT TATTAAAATG 360 CTTGGTACAG ACCAATTTAA ACGTATTCGT ATTGGTGTGG GAAGACCAAC GAATGGTATG 420 ACGGTACCTG ATTATGTTTT ACAACGCTTT TCAAATGATG AAATGGTAAC GATGGAAAAA 480 GTTATCGAAC ACGCAGCACG CGCAATTGAA AAGTTTGTTG AAACATCACG ATTTGACCAT 540 GTTATGAATG AATTTAATGG TGAAGTGAAA TAA 573

【０１５０】（２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Lys Cys Ile Val Gly Leu Gly Asn Ile Gly Lys Arg Phe Glu Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Asn Ile Gly Phe Glu Val Val Asp Tyr Ile Leu Glu Lys 20 25 30 Asn Asn Phe Ser Leu Asp Lys Gln Lys Phe Lys Gly Ala Tyr Thr Ile 35 40 45 Glu Arg Met Asn Gly Asp Lys Val Leu Phe Ile Glu Pro Met Thr Met 50 55 60 Met Asn Leu Ser Gly Glu Ala Val Ala Pro Ile Met Asp Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Val Asn Pro Glu Asp Leu Ile Val Leu Tyr Asp Asp Leu Asp Leu Glu 85 90 95 Gln Gly Gln Val Arg Leu Arg Gln Lys Gly Ser Ala Gly Gly His Asn 100 105 110 Gly Met Lys Ser Ile Ile Lys Met Leu Gly Thr Asp Gln Phe Lys Arg 115 120 125 Ile Arg Ile Gly Val Gly Arg Pro Thr Asn Gly Met Thr Val Pro Asp 130 135 140 Tyr Val Leu Gln Arg Phe Ser Asn Asp Glu Met Val Thr Met Glu Lys 145 150 155 160 Val Ile Glu His Ala Ala Arg Ala Ile Glu Lys Phe Val Glu Thr Ser 165 170 175 Arg Phe Asp His Val Met Asn Glu Phe Asn Gly Glu Val Lys 180 185 190

【０１５１】（２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５７３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： ATGAAATGTA TTGTAGGTCT AGGTAATATA GGTAAACGTT TTGAACTTAC AAGACATAAT 60 ATCGGCTTTG AAGTCGTTGA TTATATTTTA GAGAAAAATA ATTTTTCATT AGATAAACAA 120 AAGTTTAAAG GTGCATATAC AATTGAACGA ATGAACGGAG ATAAAGTGTT ATTTATCGAA 180 CCAATGACAA TGATGAATTT GTCAGGAGAA GCAGTTGCAC CGATTATGGA TTATTACAAT 240 GTTAATCCAG AAGATTTAAT TGTCTTATAT GATGATTTAG ATTTAGAACA AGGACAAGTT 300 CGCTTAAGAC AAAAAGGAAG TGCGGGCGGT CACAATGGTA TGAAATCAAT TATTAAAATG 360 CTTGGTACAG ACCAATTTAA ACGTATTCGT ATTGGTGTGG GAAGACCAAC GAATGGTATG 420 ACGGTACCTG ATTATGTTTT ACAACGCTTT TCAAATGATG AAATGGTAAC GATGGAAAAA 480 GTTATCGAAC ACGCAGCACG CGCAATTGAA AAGTTTGTTG AAACATCACG ATTTGACCAT 540 GTTATGAATG AATTTAATGG TGAAGTGAAA TAA 573

【０１５２】（２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： Met Lys Cys Ile Val Gly Leu Gly Asn Ile Gly Lys Arg Phe Glu Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Asn Ile Gly Phe Glu Val Val Asp Tyr Ile Leu Glu Lys 20 25 30 Asn Asn Phe Ser Leu Asp Lys Gln Lys Phe Lys Gly Ala Tyr Thr Ile 35 40 45 Glu Arg Met Asn Gly Asp Lys Val Leu Phe Ile Glu Pro Met Thr Met 50 55 60 Met Asn Leu Ser Gly Glu Ala Val Ala Pro Ile Met Asp Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Val Asn Pro Glu Asp Leu Ile Val Leu Tyr Asp Asp Leu Asp Leu Glu 85 90 95 Gln Gly Gln Val Arg Leu Arg Gln Lys Gly Ser Ala Gly Gly His Asn 100 105 110 Gly Met Lys Ser Ile Ile Lys Met Leu Gly Thr Asp Gln Phe Lys Arg 115 120 125 Ile Arg Ile Gly Val Gly Arg Pro Thr Asn Gly Met Thr Val Pro Asp 130 135 140 Tyr Val Leu Gln Arg Phe Ser Asn Asp Glu Met Val Thr Met Glu Lys 145 150 155 160 Val Ile Glu His Ala Ala Arg Ala Ile Glu Lys Phe Val Glu Thr Ser 165 170 175 Arg Phe Asp His Val Met Asn Glu Phe Asn Gly Glu Val Lys 180 185 190

【０１５３】（２）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： ATGAAATGTA TTGTAGGTCT AGGT 24

【０１５４】（２）配列番号：６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６： TTATTTCACT TCACCATTAA ATTC 24

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ０７Ｋ 14/31 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｆ 33/569 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/48 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 マグダレーナ・サラカイン アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、ウッドミント・ドラ イブ126番 (72)発明者 サンジョイ・ビスワス アメリカ合衆国19301ペンシルベニア州パ オリ、サウス・バレー・ロード77番、アパ ートメント・ビー４ (72)発明者 トン・リ アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、イースト・フィフス・アベニ ュー74番、アパートメント・ディー204 (72)発明者 ダミアン・マックデビット アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、オーバールック・サークル38番 (72)発明者 クリストファー・エム・トレイニ アメリカ合衆国19063ペンシルベニア州メ ディア、ポッター・コート50番 (72)発明者 リチャード・ロイド・ウォーレン アメリカ合衆国19422ペンシルベニア州ブ ルー・ベル、キャスカート・ロード825番 (72)発明者 アンドリュー・ピー・フォスベリー イギリス、シーブイ１・６ユージー、ケン ブリッジシャー、リントン、ザ・ウッドラ ンズ42番 (72)発明者 エリザベス・ジェイ・ローラー アメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マ ルバーン、ラップ・ロード260番 (72)発明者 ジョン・イー・ホッジソン アメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マ ルバーン、ラップ・ロード260番 (72)発明者 ジュディス・ウォード イギリス、アールエイチ４・２ビーティ、 ドーキング、コトマンディーン、カーメ ラ・コテージ19番 (72)発明者 マーティン・バーナム アメリカ合衆国19504ペンシルベニア州バ ート、フォージデイル・ロード565番 (72)発明者 マーティン・ローゼンバーグ アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州ロ イヤーズフォード、ミンゴ・ロード241番

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ｉ）配列番号：２または４の全長にわ
   たって配列番号：２または４のアミノ酸配列に対して少
   なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単
   離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である
   単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列
   を含む組み換えポリヌクレオチドによりコードされるポ
   リペプチドからなる群より選択される単離ポリペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 （ｉ）配列番号：２または４の全長にわ
   たって配列番号：２または４のアミノ酸配列に対して少
   なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
   ド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のポリペプチドをコード
   しているヌクレオチド配列に対してその全長にわたって
   少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオ
   チド； （ｉｉｉ）配列番号：１または３の全長にわたって配列
   番号：１または３のヌクレオチド配列に対して少なくと
   も （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
   ド； （ｉｖ）配列番号：２または４のポリペプチドをコード
   しているヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
   ド； （ｖ）配列番号：１または３のポリヌクレオチドである
   単離ポリヌクレオチド。 （ｖｉ）厳密なハイブリダイゼーション条件下で配列番
   号：１または３の配列またはそのフラグメントの配列を
   有する標識プローブを用いて適当なライブラリーをスク
   リーニングすることにより得ることのできる単離ポリヌ
   クレオチド； （ｖｉｉ）スタフィロコッカス・アウレウス中に含まれ
   るｐｔｈ遺伝子により発現される成熟ポリペプチドをコ
   ードしている単離ポリヌクレオチド；および （ｖｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ
   ｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）または（ｖｉｉ）の該単離ポリ
   ヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド配列か
   らなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドに対して抗原性
   のある、あるいは免疫特異的な抗体。
4. 【請求項４】 個体の治療方法であって、 （ｉ）請求項１のポリペプチドの活性または発現の促進
   を必要とする個体については、 （ａ）該ポリペプチドに対する治療上有効量のアゴニス
   トを個体に投与すること；または （ｂ）インビボで該ポリペプチドの活性を生じるような
   形態の、該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
   チド配列を含む単離ポリヌクレオチドを個体に提供する
   ことを含み、あるいは （ｉｉ）請求項１のポリペプチドの活性または発現の阻
   害を必要とする個体については、（ａ）該ポリペプチド
   に対する治療上有効量のアンタゴニストを個体に投与す
   ること；または （ｂ）該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
   ド配列の発現を阻害する核酸分子を個体に投与するこ
   と；または （ｃ）リガンド、基質、または受容体を求めて該ポリペ
   プチドと競争する治療上有効量のポリペプチドを個体に
   投与することを含む、の治療方法。
5. 【請求項５】 個体における請求項１のポリペプチドの
   発現または活性に関連した、個体における疾病またはか
   かる疾病に対する感受性の診断または予後の方法であっ
   て、下記工程： （ａ）該個体のゲノム中の該ポリペプチドをコードして
   いるヌクレオチド配列における変異の存在または不存在
   を決定すること；または （ｂ）該個体由来の試料中の該ポリペプチドの発現の存
   在または量を分析することを含む方法。
6. 【請求項６】 請求項１のポリペプチドの機能を活性化
   または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング
   方法であって、 （ａ）候補化合物に直接または間接的に結合した標識を
   用いてポリペプチドまたはポリペプチドを有する細胞も
   しくは膜またはその融合蛋白への候補化合物の結合を測
   定すること； （ｂ）標識競争物質の存在下でポリペプチドまたはポリ
   ペプチドを有する細胞もしくは膜またはその融合蛋白へ
   の候補化合物の結合を測定すること； （ｃ）ポリペプチドを有する細胞もしくは細胞膜に適す
   る検出系を用いて、候補化合物がポリペプチドの活性化
   または阻害により発生するシグナルを生じさせるかどう
   かを試験すること； （ｄ）候補化合物と、請求項１のポリペプチドを含有す
   る溶液とを混合して混合物を作成し、混合物中のポリペ
   プチドの活性を測定し、次いで、混合物の活性を標準と
   比較すること； （ｅ）例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて細胞中で該ポ
   リペプチドをコードしているｍＲＮＡおよび該ポリペプ
   チドの生成に対する候補化合物の影響を検出すること、
   あるいは （ｆ）（１）化合物の相互作用を評価するために、化合
   物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件下
   でポリペプチドを含む組成物をスクリーニングすべき化
   合物と接触させ（かかる相互作用は、化合物とポリペプ
   チドとの相互作用に応答した検出可能シグナルを生じる
   ことのできる第２の成分に関連したものである）；次い
   で（２）化合物とポリペプチドとの相互作用から生じる
   シグナルの存在または不存在を検出することにより、化
   合物がポリペプチドと相互作用し、その活性を活性化ま
   たは阻害するかどうかを決定することからなる群から選
   択される方法を含む方法。
7. 【請求項７】 請求項１のポリペプチドの活性または発
   現についてのアゴニストまたはアンタゴニスト。
8. 【請求項８】 適合する宿主中に存在する場合に、請求
   項１のポリペプチドを生成する能力のあるポリヌクレオ
   チドを含む発現系。
9. 【請求項９】 （ｉ）配列番号：２または４の全長にわ
   たって配列番号：２または４のアミノ酸配列に対して少
   なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリ
   ペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単
   離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である
   単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列
   を含む組み換えポリヌクレオチドによりコードされるポ
   リペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを発
   現する、請求項８の発現系を含む宿主細胞またはその
   膜。
10. 【請求項１０】 （ｉ）配列番号：２または４の全長に
    わたって配列番号：２または４のアミノ酸配列に対して
    少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリ
    ペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単
    離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である
    単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列
    を含む組み換えポリヌクレオチドによりコードされるポ
    リペプチドからなる群より選択されるポリペプチドの製
    造方法であって、該ポリペプチドの生成に十分な条件下
    で請求項９の宿主細胞を培養することを含む方法。
11. 【請求項１１】 （ｉ）配列番号：２または４の全長に
    わたって配列番号：２または４のアミノ酸配列に対して
    少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリ
    ペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単
    離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である
    単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列
    を含む組み換えポリヌクレオチドによりコードされるポ
    リペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを発
    現する、請求項８の発現系を含む宿主細胞またはその膜
    の製造方法であって、適合宿主中に存在する場合に上記
    ポリペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉ
    ｖ）を生成可能なポリヌクレオチドを含む発現系で細胞
    を形質転換またはトランスフェクションして、適当な培
    養条件下で宿主細胞が上記ポリペプチド（ｉ）、（ｉ
    ｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を生成するようにする
    ことを含む方法。
12. 【請求項１２】 （ｉ）配列番号：２または４の全長に
    わたって配列番号：２または４のアミノ酸配列に対して
    少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリ
    ペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単
    離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である
    単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列
    を含む組み換えポリヌクレオチドによりコードされるポ
    リペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを発
    現する、請求項１１の方法により製造される宿主細胞ま
    たはその膜。
13. 【請求項１３】 配列番号：１または３の配列を含むポ
    リヌクレオチド；配列番号：２または４の配列を含むポ
    リペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号：１また
    は３の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセ
    ット；少なくとも１つの配列が配列番号：２または４の
    配列を含むものであるポリペプチド配列のセット；配列
    番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド配列を
    表すデータセット；配列番号：２または４の配列を含む
    ポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチド配
    列を表すデータセット；配列番号：１または３の配列を
    含むポリヌクレオチド；配列番号：２または４の配列を
    含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号：
    １または３の配列を含むものであるポリヌクレオチド配
    列のセット；少なくとも１つの配列が配列番号：２また
    は４の配列を含むものであるポリペプチド配列のセッ
    ト；配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチ
    ド配列を表すデータセット；配列番号：２または４の配
    列を含むポリペプチド配列をコードしているポリヌクレ
    オチド配列を表すデータセットからなる群より選択され
    るメンバーを保存したコンピューター読み込み可能媒
    体。
14. 【請求項１４】 相同性の同定を行うためのコンピュー
    ターによる方法であって、配列番号：１または３の配列
    を含むポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込み
    可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌクレオチド配列
    を少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチ
    ド配列と比較して相同性を同定する工程を含む方法。
15. 【請求項１５】 ポリクレオチドアッセンブリーのため
    のコンピューターによる方法であって、配列番号：１ま
    たは３の配列を含む第１のポリヌクレオチド配列をコン
    ピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第
    １のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配
    列との間の少なくとも１つの重複領域をスクリーニング
    する工程を含む方法。
16. 【請求項１６】 （ａ）配列番号：３の全長にわたって
    配列番号：３に対して少なくとも７０％、８０％、９０
    ％、９５％、９７％の同一性を有するヌクレオチド配列
    を含む単離ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：３のポリヌクレオチドを含む単離ポリ
    ヌクレオチド； （ｃ）配列番号：３のポリヌクレオチド；または （ｄ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のア
    ミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０
    ％、９５％、９７〜９９％の同一性を有するポリペプチ
    ドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離ポリヌ
    クレオチドからなる群より選択される単離ポリヌクレオ
    チド。
17. 【請求項１７】 （ａ）配列番号：４の全長にわたって
    配列番号：４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
    ％、８０％、９０％、９５％、９７〜９９％の同一性を
    有するアミノ酸配列を含むポリペプチド； （ｂ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のア
    ミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０
    ％、９５％、９７〜９９％同一であるアミノ酸配列を有
    するポリペプチド； （ｃ）配列番号：４のアミノ酸を含むポリペプチド； （ｄ）配列番号：４のポリペプチドであるポリペプチド （ｅ）配列番号：３に含まれる配列を含むポリヌクレオ
    チドによりコードされるポリペプチドからなる群より選
    択されるポリペプチド。