JPH10507087A - 発酵による高純度６，１２−ジデオキシエリスロマイシンａを産生するベクターおよびその方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組換え体ＤＮＡ技術を用いて高純度６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを産生する方法を開示する。エリスロマイシンＣ−１２およびＣ−６ヒドロキシラーゼを欠くエリスロマイシン産生株Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａは、６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡと、前駆体分子である６−デオキシエリスロマイシンＤとの混合物を産生する。前駆体を最終生成物に変換することを達成させるために、ｅｒｙＧの第２のコピーがＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体の非必須領域に挿入され、それにより高純度６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを得る。

Description

【発明の詳細な説明】発酵による高純度６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを産生するベクター およびその方法 本出願は、１９９５年６月８日に提出された米国仮出願第６０／１２３，４５ ６号の利益を主張する。 技術分野 本発明は、エリスロマイシン誘導体の製造に関する。特に、本発明は産生生物 の遺伝子操作を通して高純度６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを生成す ることに関する。 発明の背景 エリスロマイシンＡは、グラム陽性細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒ ａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ（Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）により産生される、臨 床的に有用で、広範なスペクトラムを有するマクロライド系抗生物質である。新 しい医薬品を設計し開発する上で有用な可能性のあるエリスロマイシン生合成の 中間体は、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにより微量に生成され、他のエリスロマ イシン誘導体との混合物としてこれらの化合物の化学的修飾を絡ませながら産生 される。 この技術分野で教示されるとおり、（Ｄｏｎａｄｉｏら、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎ ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｃ．Ｌ．Ｈｅｒｓｈｂｅｒ ｇｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＱｕｅｅｎｅｒおよびＧ．Ｈｅｇｅｍａｎ編、１９８９、Ａｍ ｅｒｉｃａｎ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシント ン、ＤＣ ２０００５参照）、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａによるエリスロマイ シンＡの生合成は、図１に示される提示の右手の経路にしたがって達成される。 １４員マクロラクトンである６−デオキシエリスロノリドＢ（6-deoxyerythrono lide B）は、初めプロピオニルと２−メチルマロニルのチオエステル類から作ら れ、そしてその後Ｃ−６位をヒドロキシル化してエリスロノリドＢを形成する。 グルコースから糖類ミカロースおよびデソサミンが合成され、そしてエリスロノ リドＢに加えられてエリスロマイシンＤになる。提示経路での次の段階は、（い ずれかの順で）Ｃ−１２位でエリスロマイシンＤをヒドロキシル化すること（結 果としてエリスロマイシンＣを形成する）、またはＣ−３”位をメチル化するこ と（結果としてエリスロマイシンＢを形成する）である。その後のエリスロマイ シンＢのヒドロキシル化またはエリスロマイシ ンＣのメチル化によりエリスロマイシンＡが生成する。 エリスロマイシンの生合成に関与する遺伝子についての我々の現在の理解、お よびＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ中の遺伝子を不活化する技術により、エリスロ マイシンＡの前駆体および誘導体を製造するために上記経路の管理された操作が 可能である。エリスロマイシンＢおよびエリスロマイシンＤのようなエリスロマ イシンＡの天然に生じる前駆体は、これらの方法により容易に生成される。しか し、ｉｎ ｖｉｖｏでのエリスロマイシンＡの高度に純粋な誘導体を作る他の試 みは、特に生合成の後半の段階で作用する酵素の基質を変える場合では、常に成 功するというものではない。そのような場合は、さらなる遺伝子修飾が必要とさ れうる。 発明の要旨 本発明の方法は、エリスロマイシン産生微生物の遺伝子修飾を包含し、それに より該エリスロマイシン産生微生物は、高純度３”−Ｏ−メチル化エリスロマイ シン誘導体を産生する株に形質転換される。特に、染色体ＤＮＡの非必須領域が 、エリスロマイシン３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを産生し、且つ、通常 エリスロマイシンＤおよびＣをそれぞれエリスロマイ シンＢおよびＡに変換するｅｒｙＧの第２のコピーを挿入することにより遺伝的 に修飾される。 本発明を具体化する微生物は、水性培地での培養で、式： で表される高純度６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを産生するＳａｃ． ｅｒｙｔｈｒａｅａの新規株である。 エリスロマイシンを産生する微生物を６，１２−ジデオキシエリスロマイシン Ａを産生する株に形質転換するのは、突然変異誘発技術によりそして特に、相同 的組換えによる遺伝子置換を通して達成される。この方法を用いて、それぞれＣ −６およびＣ−１２位でエリスロマイシンをヒドロキシル化するのに必須のシト クロムＰ−４５０酵素をコードするｅｒｙＦおよびｅｒｙＫ遺伝子は、これらの 遺伝子に欠失を担持する組込みプラスミドにより置換される。欠失コピーによる 野生型遺伝子の 置換の結果として、Ｃ−６及びＣ−１２のいずれの位置もヒドロキシル化されな い。図１の左手側に理論的に示されるとおり、ｅｒｙＦ遺伝子での欠失が、６− デオキシエリスロノリドＢがエリスロノリドＢに変換するのを防ぎ、糖基の添加 は、その後６−デオキシエリスロマイシンＤを形成させる。第２の欠失変異、す なわちｅｒｙＫ遺伝子での変異は、６−デオキシエリスロマイシンＤが６−デオ キシエリスロマイシンＣにヒドロキシル化されることを防ぐ。したがって、機能 性ｅｒｙＫ遺伝子の不存在下で、６−デオキシエリスロマイシンＤのメチル化に より、直接的に６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ（６−デオキシエリス ロマイシンＢとしても示される）が形成される。 しかし、６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ産生株の形成を困難なもの とする因子は、６−デオキシエリスロマイシンＤが、基質を６，１２−ジデオキ シエリスロマイシンＡに変換するエリスロマイシン３”−Ｏ−メチルトランスフ ェラーゼに対する基質として不十分なことである。これにより、前駆体である６ −デオキシエリスロマイシンＤに対する所望の６，１２−ジデオキシエリスロマ イシンＡ生成物の比が低くなる。したがって、高純度６，１２−ジデオキシエリ スロマイシンＡ を生成するためにさらに必要なことは、３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを コード化する遺伝子ｅｒｙＧの第２のコピーを産生生物に導入することにある。 本発明のこの特定の具体例では、ｅｒｍＥ^*プロモーターによって作動するｅｒ ｙＧの第２のコピーを相同的組換えを介してＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの染色 体の非必須領域に挿入し、そしてＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株に安定に保持さ せるプラスミドが構築される。 図面の簡単な説明 本発明は、付随の図面により十分に理解される。ここで、 図１は、エリスロマイシンＡ（右手側で）およびＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ 中の６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ（左手側で）の生合成についての 提示された代謝経路である。 図２は、ｐＤＰＥ４の構築を描写する流れ図である。 図３は、ｐＧＭ５０４の構築を描写する流れ図である。 図４は、ｐＤＰＥ３５の構築を描写する流れ図である。 図５は、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａでの遺伝子置換の概略表示である。 図６は、ＥＲ７２０−ＫＦの発酵の生成物の薄相クロマトグ ラフィである。 図７は、ＥＲ７２０−ＫＦＧ＋の発酵の生成物の薄相クロマトグラフィである 。 図８ａは、遺伝子工学的に製造されたＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ＥＲ７２ ０−ＫＦで産生される６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡと６−デオキシ エリスロマイシンＤとの量を例示する。 図８ｂは、遺伝子工学的に製造されたＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ＥＲ７２ ０−ＫＦＧ＋により産生される６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡと６− デオキシエリスロマイシンＤとの量を例示する。 図９は、ｐＫＡＳ３７の構築を描写する流れ図である。 図１０は、ｐＫＡＳ３７の制限地図を描写する。 図１１は、ｐＫＡＳＩ３７の構築を描写する流れ図である。 図１２は、ｐＫＡＳＩ３７の制限地図を描写する。 図１３は、第２部位領域の範囲内に含まれるＤＮＡの断片の一本鎖ＤＮＡ配列 を描写する。 発明の詳細な説明 本発明は、分子の３”位がＯ−メチル化された高度に純粋な エリスロマイシン誘導体を産生させることができるエリスロマイシン産生微生物 の遺伝的修飾のための方法を提供する。本発明の化合物は、構造式： で表される６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを包含する。 この化合物は、遺伝的に修飾されたエリスロマイシン産生微生物を液体培地で 育成し、その後培養培地から化合物を抽出することにより得られた。該化合物は 、発酵中で優勢なエリスロマイシン誘導体として発見された。 本発明は、エリスロマイシン産生株を所望の化合物を産生する変異株に形質転 換することを含む、高度に純粋な３”−Ｏ−メチル化エリスロマイシン誘導体を 製造するための方法を提供する。本発明の１つの具体例で、エリスロマイシン産 生微生物 は細菌Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａである。遺伝子操作を行って得られた形質転 換体は、ｅｒｙＦおよびｅｒｙＫによりコードされるシトクロムＰ−４５０酵素 に欠陥があるのみならず、エリスロマイシン３”−Ｏ−メチルトランスフェラー ゼをコードするｅｒｙＧのさらなるコピーを含有する。ｅｒｙＧのこの第２のコ ピーの存在により、６−デオキシエリスロマイシンＤを６，１２−ジデオキシエ リスロマイシンＡに十分に変換させることが可能であり、図８ａおよび８ｂで示 されるとおりエリスロマイシンの混合物よりむしろ高純度最終産物を産生するＳ ａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの株が提供される。 本発明は、一例として、相同的組換えにより、染色体の非必須領域のある部位 を、チオストレプトン耐性マーカーおよびｅｒｍＥ^*プロモーターの制御下にあ るｅｒｙＧの第２のコピーを組み込んで含む同様の領域のコピーで置換すること を含む、ｅｒｙＧの第２のコピーをＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体の非必須 領域に導入する特定の方法をも提供する。 本発明の方法は、サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒ ａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセオプラヌス（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏ ｐｌａｎｕｓ）、ノカルデイア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ.）、マイクロモノ スポラ種（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、アルスロバクター種（Ａ ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）およびストレプトマイセス・アンチバイオテ ィクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）を含むがそれ に限定されないエリスロマイシン産生微生物に広範に使用できる。これらの内、 Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａが最も好ましい。もちろん、異なる微生物の非必須 領域で相同な第２の部位の特定の配列は、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａについて の配列番号：１で示されるものからいくぶん変化しうるが、このような部位を同 定する方法は、この技術を習熟した者の通常の技術の範囲にある。 Ｃ−６およびＣ−１２両方のヒドロキシル化は、それぞれｅｒｙＦおよびｅｒ ｙＫ遺伝子によりコードされるシトクロムＰ−４５０酵素により触媒される。こ れらの２つの活性を欠くエリスロマイシン産生Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株は 、６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを産生することが予測される。これ らのヒドロキシル化反応を排除する１つの方法は、シトクロムＰ−４５０モノオ キシゲナーゼ系の操作に必要とさ れる細胞性遺伝子の不能状態の突然変異による。これは、これらの遺伝子を、欠 失を含むコピーで置換することにより達成され、それにより遺伝子は非機能性で 非可逆性になる。エリスロマイシン生合成でのヒドロキシル化段階を破壊させる 、相同的組換えによる遺伝子置換のために設計された全てのプラスミドが利用で きる。さらに、本発明の方法は、エリスロマイシンのＣ−６およびＣ−１２ヒド ロキシル化で不完全な突然変異体を作るために遺伝子置換を使用することになん ら制限されない。遺伝子破壊、トランスポゾン突然変異生成、あるいは化学的ま たは光誘導突然変異生成のようなヒドロキシラーゼ系を破壊する他の系は、微生 物の所望の遺伝的修飾を作るために使用できる。このような代替手段は、当業界 で通常に習熟した者によく知られている。 外来ＤＮＡをプラスミドに挿入して遺伝子置換プラスミドを形成するいくつか の方法は、当業界で知られているが、本発明によって好ましい方法が、図２およ び３に概略的に示され、以下の実施例で例示される。本発明での好ましい具体例 で、（ａ）その各々がストレプトマイセスで機能性がある、抗生物質チオストレ プトンに対する耐性を付与するＤＮＡの断片及び複製起 点を含むプラスミドｐＩＪ７０２またはｐＩＪ４８６の断片（ｔｓｒ）、（ｂ） その各々がＥ．Ｃｏｌｉで機能性がある、抗生物質アンピシリンに対する耐性を 付与するＤＮＡ断片および複製起点（ａｍｐ）、および（ｃ）その各々がゲノム 由来のプラスミドのプラスミド組込みおよびその後の切除の認識配列として作用 する能力がある、突然変異した（すなわち、欠失した）目的の遺伝子、および当 該突然変異した遺伝子の両側に隣接する少なくとも約１ｋｂの隣接ＤＮＡを含む Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体由来のＤＮＡ断片、を含む択可能なＤＮＡプ ラスミドが構築される。切除が組込みの起こる側と反対側の欠失の側で起こる場 合、図５に略図で例示されるとおり野生型遺伝子は欠失したものに置換される。 実施例１および図２は、ｅｒｙＫに欠失を作る為に構築されたプラスミドの例で ある。実施例２および図３は、ｅｒｙＦに欠失を作る為に構築されたプラスミド の例である。 上記で同定された特定の抗生物質耐性遺伝子および機能性複製起点は、所望の 組換え体プラスミドを選択および複製させる場合にのみ必要である。他の機能性 マーカーおよび複製起点も、本発明の実施に使用できる。同様に、遺伝子を突然 変異コピー で置換するために、組換え体プラスミドが目的の遺伝子に隣接するゲノムの一部 に組込まれるようにし、そして目的の遺伝子の他の側で切除できるようにする全 ての認識配列が使用できる。さらに、本発明のプラスミドは、上述の例のように 、部分的ゲノム消化を用いることなく構築されうる。その代わりに、ｅｒｙＦお よびｅｒｙＫに隣接する領域の配列が知られている場合、認識配列は、新たに（ 例えばポリメラーゼ連鎖反応により）合成し、必要な起点および耐性断片とライ ゲートして遺伝子置換プラスミドを形成することができる。 実施例４で、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのエリスロマイシン産生株は、エリ スロマイシンＣ−６およびＣ−１２ヒドロキシラーゼに欠陥があるように遺伝的 に修飾された。これは、最初に（Ｃ−１２ヒドロキシラーゼをコードする）ｅｒ ｙＫの野生型コピーを実施例１に記載されたプラスミドｐＤＰＥ４を用いて欠失 したコピーで置換することにより達成された。エリスロマイシン生合成の提示さ れた経路から予測されるとおり、いくらかのエリスロマイシンＤも発酵の初期に 産生しつつ、変異株はエリスロマイシンＢを産生した。この突然変異株の（Ｃ− ６ヒドロキシラーゼをコードする）ｅｒｙＦ遺伝子は、その後 実施例２に記載されたプラスミドｐＧＭ５０４を用いて遺伝子の欠失コピーで置 換された。この２重に欠失した株の予測される生成物である６，１２−ジデオキ シエリスロマイシンＡが作られたか、この株は、図６に示されるとおり６日間の 発酵を通して大量の６−デオキシエリスロマイシンＤも産生した。６−デオキシ エリスロマイシンＤは１日目から６日目まで優勢な誘導体であった。 高度に純粋な６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを産生するために、ｅ ｒｙＧの余剰のコピーがＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体の非必須領域に導入 された。ｅｒｙＧの産生物はエリスロマイシンＤおよびＣをそれぞれエリスロマ イシンＢおよびＡに標準的に変換する３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼであ る。ｅｒｙＧの第２のコピーをＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体に加えるため の遺伝子置換プラスミドを構築する好ましい方法は、図４で略図で示され、実施 例３で記載されている。本発明の好ましい具体例で、（ａ）ストレプトマイセス およびサッカロポリスポラで機能性がある複製起点を含むプラスミドｐＣＤ１の 断片、（ｂ）その各々がＥ．Ｃｏｌｉで機能性がある、抗生物質アンピシリンに 対する耐性を付与するＤＮ Ａ断片及び複製起点、および（ｃ）未知であるが、プラスミド組込みおよび切除 の認識部位として作用する能力のある必須でない機能を有するａｃ．ｅｒｙｔｈ ｒａｅａ染色体のある領域から得られるＤＮＡ断片、を含む択可能なＤＮＡプラ スミドが構築される。（以降、未知であって非必須機能のこのＤＮＡ断片は、「 第２部位」領域と呼ぶ。図１３は第２部位領域の部分であるおよそ１ｋｂの一本 鎖ＤＮＡ配列を描写する。）「第２部位」領域の範囲内に組み込まれるのは、ｅ ｒｍＥ^*プロモーターに操作可能に結合した３”−Ｏ−メチルトランスフェラー ゼをコードする第１の断片、及び抗生物質チオストレプトンに対する耐性を付与 するプラスミドｐＷＨＭ３（本明細書においてｐＣＳ５とも呼ばれる）由来の第 ２の断片の、２つの追加ＤＮＡ断片である。ｐＤＰＥ３５と称される本発明を具 体化するプラスミドを含有するＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５αの培養は、イリノイ州、 ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（Ａｇｒ ｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎ）に寄託され、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１４８６が与えられた。 先の実施例にあるように、土記で同定された特定の抗生物質 耐性遺伝子および機能性複製起点は、所望の組換え体プラスミドの選択および複 製をさせる場合にのみ必要である。他のマーカーおよび複製起点が使用できる。 同様に、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体の非必須領域に相同である全てのＤ ＮＡ断片は、ｅｒｙＧおよびｔｓｒ遺伝子を取り囲む組込み／切除認識配列とし て使用できる。実施例５には、ｅｒｙＫおよびｅｒｙＦで先に欠失され、そして 現在ｅｒｙＧの余剰のコピーを含む、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの株の構築に ｐＤＰＥ３５を使用することが記載されている。図７に示されるとおり、ｅｒｙ Ｇのこの余剰のコピーは、高純度６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを少 なくとも４日間の発酵期間にわたって生成させる。本明細書において株ＥＲ７２ ０−ＫＦＧ＋として示されるｅｒｙＫおよびｅｒｙＦに欠失を有するＳａｃ．ｅ ｒｙｔｈｒａｅａ株は、イリノイ州、ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号ＮＲＲＬ ２１４８４が与え られた。 Ａ．定義 以下に示す語および語句は、以下に記載される意味を示す。 ここで使用される場合に「シトクロムＰ−４５０モノオキシ ゲナーゼ系」の語は、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａで一緒に機能してエリスロマ イシンＢまたはその誘導体をヒドロキシ化するタンパク質の一群（２つのフラボ タンパク質、鉄−硫黄タンパク質、およびＣ−６またはＣ−１２ヒドロキシラー ゼ酵素）に相当する。「シトクロムＰ−４５０酵素」の語は、シトクロムＰ−４ ５０モノオキシゲナーゼ系のＣ−６またはＣ−１２ヒドロキシラーゼ酵素に相当 する。 ここで使用される場合に「エリスロマイシン誘導体」の語は、抗生物質活性お よび／またはプロキネチック（prokinetic）活性を示すエリスロマイシン様化合 物に相当する。エリスロマイシン様化合物は、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよ びＤで見られるような１４員マクロラクトン環および２つのＯ結合糖分子を有す ることで一般的に特徴づけられる。「エリスロマイシン誘導体」は、それらが３ ”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの基質として作用するという条件で、マクロ ラクトン環および／または糖部分に修飾および／または置換基を有するエリスロ マイシン様化合物を含むことが意図される。例えば、一般に知られた修飾として は、 ４”−デオキシエリスロマイシン、 ６−デオキシエリスロマイシンＤ、 ６，９−エポキシエリスロマイシン、 ６−Ｏ−メチルエリスロマイシン、 ４”−アミノ−６，４”−ジデオキシエリスロマイシンＡ、 ９，４”−ジアミノ−６，９，４”−トリデオキシエリスロマイシンＡ、 ８，９−アンヒドロ−４”−デオキシエリスロマイシンＡ−６，９−ヘミケタ ール、 ８，９−アンヒドロ−４”−デオキシエリスロマイシンＢ−６，９−ヘミケタ ール、 ８，９−アンヒドロ−４”−デオキシ−３’−Ｎ−デスメチルエリスロマイシ ンＡ−６，９−ヘミケタール、 ８，９−アンヒドロ−４”−デオキシ−３’−Ｎ−デスメチル−３’−Ｎ−エ チルエリスロマイシンＡ−６，９−ヘミケタール、 ８，９−アンヒドロ−４”−デオキシ−３’−Ｎ−プロパルギルエリスロマイ シンＡ−６，９−ヘミケタール ブロミド、 ８，９−アンヒドロ−４”−デオキシ−３’−Ｎ−デスメチルエリスロマイシ ンＢ−６，９−ヘミケタール、 ８，９−アンヒドロ−４”−デオキシ−３’−Ｎ−デスメチル−（３’−Ｎ− エチルエリスロマイシンＢ−６，９−ヘミケタール、 ８，９−アンヒドロ−４”−デオキシ−３’−Ｎ−プロパルギルエリスロマイ シンＢ−６，９−ヘミケタール ブロミド、 ９−デオキソ−４”，６−ジデオキシ−８−エピ−６，９−エポキシエリスロ マイシンＡ、 ９−デオキソ−３’−Ｎ−デスメチル−４”，６−ジデオキシ−８−エピ−６ ，９−エポキシエリスロマイシンＡ、 ９−デオキソ−３’−Ｎ−デスメチル−４”，６−ジデオキシ−８−エピ−３ ’−Ｎ−エチル−６，９−エポキシエリスロマイシンＡ、 ９−デオキソ−４”，６−ジデオキシ−８−エピ−６，９−エポキシ−３’− Ｎ−プロパルギルエリスロマイシンＡ ブロミド、 ９−デオキソ−４”，６−ジデオキシ−６，９−エポキシエリスロマイシンＡ 、 ９−デオキソ−３’−Ｎ−デスメチル−４”，６−ジデオキシ−６，９−エポ キシエリスロマイシンＡ、 ９−デオキソ−３’−Ｎ−デスメチル−４”，６−ジデオキシ−６，９−エポ キシ−３’−Ｎ−エチルエリスロマイシンＡ、 および ９−デオキソ−４”，６−ジデオキシ−６，９−エポキシ−３’−Ｎ−プロパ ルギルエリスロマイシンＡ ブロミド が挙げられる。 ここで使用される場合に「発現」の語は、ポリペプチドを産生する構造遺伝子 のようなコーディングＤＮＡ分子によってなされる転写および翻訳を含めた細胞 内プロセスの組合せに相当する。 ここで使用される場合に「相同的組換え」の語は、同一のまたは同一に近い配 列を含むＤＮＡ鎖の間の相補的塩基対および乗換えに相当する。 ここで使用される場合に「複製起点」の語は、宿主細胞中のプラスミドまたは 他のベクターの複製および維持を制御し且つ行なわせる、ＤＮＡ配列に相当する 。 ここで使用される場合に「操作可能に結合された」の語は、構造遺伝子の転写 の開始をこえてプロモーターにより及ぼされる制御に相当する。 ここで使用される場合に「プロモーター」の語は、構造遺伝子の発現制御エレ メントを提供し、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、その遺伝子のＲＮＡ合 成（転写）を開始するＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列の群での認識部位に相当する 。 ここで使用される場合に「制限断片」の語は、１つまたはそれ以上の制限酵素 の作用により生成された全ての線状ＤＮＡに相当する。 構造遺伝子の語は、発現してポリペプチドを生成する遺伝子に相当する。 ここで使用される場合に「形質転換」の語は、外因性ＤＮＡ配列（例えばベク ター、組換え体ＤＮＡ分子）を、その外因性ＤＮＡが染色体に組み込まれるかま たは自律複製をすることができる細胞またはプロトプラストに導入するプロセス に相当する。 ここで使用される場合に「ベクター」の語は、宿主細胞で複製をすることが可 能なＤＮＡ分子、および／または別のＤＮＡセグメントが操作可能に結合して、 当該結合セグメントを複製できるＤＮＡ分子に相当する。プラスミドは典型的ベ クターである。 Ｂ．細菌株、プラスミドベクターおよび増殖培地 本発明の以下の実施例を行うのに使用されたエリスロマイシン産生微生物は、 Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＥＲ７２０（ＤｅＷｉｔｔ，Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：９６９（１９８５））であった。Ｅ．Ｃｏｌｉ由来プ ラスミドの増殖のための宿主株は、メリーランド、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇの Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）か ら得たＤＨ５αであった。 プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９およびｐＢＲ３２２はＢＲＬから得ること ができる。プラスミドｐＣＳ５はＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの組込み形質転換 用の多機能ベクターである。（プラスミドｐＣＳ５はＶａｒａら、Ｊ．Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ．１７１（１１）：５８７２（１９８９）により記載され、そしてｐ ＷＨＭ３として最初に称された。）プラスミドｐＩＪ７０２（Ｋａｔｚら、Ｊ． Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９：２７０３（１９８３））およびｐＩＪ４ ０７０がＪｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得られた。プラスミド ｐＣＤ１は、Ｃｌａｕｄｅ Ｄｅｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｈｅｒ ｂｒｏｏｋ、Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ から得た。制限地図分析および部分的配列決定は、このプラスミドがＤｏｕｌｌ Ｊ．Ｌ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６：３４９（１９ ８３）に記載されたｐＪＶ１に関連していることを示した。 Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａは、５０ｍｌのＳＧＧＰ培地（Ｙａｍａｍｏｔｏ ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３９：１３０４（１９８６））で、適切であればプ ラスミド選択のために１０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）のチオ ストレプトンを補足して、プロトプラスト形質転換用および慣用の液体培養で増 殖させた。 Ｃ．試薬および一般的方法 市販の試薬は、アンピシリン、チオストレプトン、（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリから購入された）制限エンドヌク レアーゼ、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、および子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｃ ＩＡＰ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチ ューセッツから購入された）を含めた、本発明の遺伝的変異体、プラスミド、化 合物を作るのに使用された。 標準分子生物学的手段（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））が、組込 みプラスミドの構築および特徴づけのために使用された。プラスミドＤＮＡは、 アルカリ性溶菌法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ Ｈ．Ｃ．およびＤｏｌｙ Ｊ．のＮｕｃ ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７９））により慣用的に分 離された。制限フラグメントは、プレプ−エイ−ジーン（Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎ ｅ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア）またはジーン クリ ーン（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ）ＩＩ（Ｂｉｏ１０１、Ｖｉｓｔａ、カリフォルニ ア）のいずれかで、０．８−１％アガロースゲルから回収された。プラスミド構 築の各段階についてのライゲーションの生成物は、中間宿主Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＨ ５α（ＢＲＬから購入された）を形質転換するのに使用され、該Ｅ．ＣｏｌｉＤ Ｈ５αは組換え体プラスミドを担持する宿主細胞を選択するためにアンピシリン の存在下で培養された。Ｘ−ｇａｌを用いた挿入ＤＮＡの存在についてのスクリ ーニングが適切な場合には使用された。プラスミドＤＮＡが、液体培養で増殖さ れた個々の形質転換細胞から分離され、公知制限部位に ついて特徴づけられた。 Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａプロトプラストの組込み形質転換、および慣用的 増殖および胞子形成が、ＤｏｎａｄｉｏらのＳｃｉｅｎｃｅ１１５：９７（１９ ９１）、ＷｅｂｅｒおよびＬｏｓｉｃｋのＧｅｎｅ６８：１７３（１９８８）お よびＹａｍａｍｏｔｏらのＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３９：１３０４（１９８６） に記載された手段にしたがって行われた。 以下の略称は、本明細書を通して使用される。 ａ．ＴＥＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホ ン酸 ｂ．Ｒ３Ｍ：１リットル水溶液当たりに以下の成分を含有する増殖培地：８３０ ｍＬのＨ₂Ｏ中の、１０３ｇの蔗糖、０．２５ｇのＫ₂ＳＯ₄、４ｇの酵母抽出物 、４ｇのカザアミノ酸、４ｇのトリプトン、２２グラム寒天。その溶液をオート クレーブにかけることにより殺菌する。殺菌後、以下の追加成分を添加する：２ ０ｍＬの２．５Ｍ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＬの５０％グルコース、２０ｍＬの２． ５Ｍ ＣａＣｌ₂、１２．５ｍＬの２Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍ Ｌの微量元素溶液（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５，Ｇｅｎｅｔｉ ｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔ ｕｔｅ）、０．３７ｍＬの０．５Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄および２．５ｍＬのＮａＯＨ。 ｃ．Ｐ_M：１リットル水溶液当たりに以下の成分を含有する緩衝液：８９０ｍＬ のＨ₂Ｏ中の、２００グラム（ｇ）の蔗糖、０．２５ｇのＫ₂ＳＯ₄：更に、殺菌 後の追加成分として、１００ｍＬの０．２５Ｍ ＴＥＳ（ｐＨ７．２）、２ｍＬ の微量元素溶液（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕ ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、０． ０８ｍＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ₂、１０ｍＬの０．５％ＫＨ₂ＰＯ₄、２ｍＬの２ ．５Ｍ ＭｇＣｌ₂。 ｄ．Ａ４Ｂｆ：１リットル水溶液当たりに、１５ｇの大豆粉、５０ｇのグルコー ス、５ｇのＮａＣｌ、および１ｇのＣａＣＯ₃を含有する増殖培地。 ｅ．ＳＣＭ：１リットル水溶液当たりに、２０ｇのソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ） 、１５ｇの可溶性澱粉、１０．５ｇの ＭＯＰＳ、１．５ｇの酵母抽出物および０．１ｇのＣａＣｌ₂を含有する増殖培 地。 以下の実施例に照らすことにより、先述のことがよりよく理解され得る。この 実施例は、本発明の実施を制限することなく例示するものとして提供される。以 下にそして明細書を通してともに、文献についての引用は参照として特に組み込 まれることを意味する。 実施例１ プラスミドｐＤＰＥ４の構築 ｐＤＥＰ４は、図２に示される概略による組換え体ＤＮＡ技術の標準法を用い て構築された。ｅｒｙＫを含有し、ＯＲＦ１９およびＯＲＦ２１の部分に隣接す る２．５５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＥＶＥＨ８から単離し、そし て同じ酵素で切断されたｐＵＣ１８とライゲートしてプラスミドｐＤＰＥ１を作 った。その後、このプラスミドをＥｃｏＯ１０９１で切断し、そして生成した３ つの断片の内の２つ（すなわち、０．９と４．３ｋｂのサイズを示すもの）を単 離した。これらの２つの断片をライゲートして、ｅｒｙＫ遺伝子の範囲内に小さ な欠失を含むｐＤＰＥ２を作った。その後、ｐＤＰＥ ２由来の２．１ｋｂ ＥＣｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を、同じ酵素で切断したｐＣＳ ５とライゲートしてｐＤＰＥ３を得た。ｐＥＶＥＨ８からＯＲＦ１９を含有する ０．７６５ｋｂ ＰｓｔＩ断片を切除し、これをＰｓｔＩで切断してＣＩＡＰで 処理したｐＤＰＥ３にライゲートすることにより、追加の近接ＤＮＡ配列をｅｒ ｙＫの下流に加えて、ｐＤＰＥ４を作った。制限分析により方向が確認された。 実施例２ プラスミドｐＧＭ５０４の構築 ｐＧＭ５０４は、図３に示される概略による組換え体ＤＮＡ技術の標準法を用 いて構築された。ｐＵＣ１８をＳｓｔＩで切断し、このプラスミドをｐＩＪ７０ ２のＳｓｔＩ部位にライゲートさせることによりストレプトマイセス−Ｅ．Ｃｏ ｌｉシャトルベクターであるｐＧＭ４２０を構築した。ｐＵＣ１８ポリリンカー は、ｐＩＪ７０２のＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩおよびＡｓｐ７１８部位の近くに方向 づけられる。ｅｒｙＦを含有し、ｅｒｙＧの一部を含むＤＮＡの近くに隣接する Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＤＮＡの５．３ｋｂ ＰｓｔＩ断片をｐＧＭ４２ ０のＰｓｔＩ部位にクローン化して、ｐＭＷ６５を 得た。ｅｒｙＦで０．５ｋｂのフレーム外欠失が、Ａｓｐ７１８およびＳｓｔＩ でｐＭＷ６５の連続的部分消化により生じ、その後ｐｏｌ１Ｋを付着末端に満た し、そしてライゲートしてｐＧＭ５０４を得た。 実施例３ プラスミドｐＤＥＰ３５の構築 ｐＤＰＥ３５は、図４に示される概略による組換え体ＤＮＡ技術の標準法を用 いて構築された。ｅｒｙＧを含有するコスミドｐ７Ａ２（ＰａｕｌｕｓらのＪ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：２５４１（１９９０））由来の４．５ｋｂ Ｅｃ ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、同じ酵素で切断されたｐＢＲ３２２とライゲートし て、ｐＧＭ４０３を得た。その後、ｅｒｙＧを含有するｐＧＭ４０３のＥｃｏＲ Ｉ−ＳｐｈＩ断片を、同じ酵素で切断されたｐＵＣ１８にライゲートしてｐＤＰ Ｅ８を作った。（ｐＩＪ４０７０から得たＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に担持さ れた）ｅｒｍＥ^*プロモーターをｐＤＰＥ８のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ部位にｅ ｒｙＧの上流に挿入し、ｐＫＡＳ２を作った。ｅｒｍＥ^*−ｅｒｙＧ融合体を含 む１．５ｋｂ断片を単離するために、ＥｃｏＲＩで、その後部分的にＮａｅＩで 、ｐＫ ＡＳ２を完全に消化した。この断片を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｃＩＩで切断し たｐＵＣ１８とライゲートして、ｐＫＡＳ３を作った。ｐＫＡＳ３をＳｓｐＩお よびＳｐｈＩで消化して３．４ｋｂ断片を得た。この断片を、ｅｒｙＧの下流に ＥｃｏＲＩ部位を加えるために同じ酵素で切断したｐＵＣ１９の０．６ｋｂ断片 にライゲートして、ｐＫＡＳ４を得た。 以下の方法で、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＤＮＡの「第２部位」領域にｅ ｒｙＧ遺伝子を挿入した。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体ＤＮＡの１１ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＢＲ３２２誘導体とライゲートしてｐＧＭ４６９を 作った。このＨｉｎｄＩＩＩ断片は唯一のＳｔｕＩ部位を含み、その中にＥｃｏ ＲＩ−ＳｔｕＩリンカーを挿入して、ｐＧＭ４７３を作った。このプラスミドを ＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＡＰで処理した。ｅｒｍＥ^*−ｅｒｙＧ融合体を含む ｐＫＡＳ４由来の１．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を単離し、ｐＧＭ４７３とライゲ ートしてｐＫＡＳ１９を作った。その後、「第２部位」領域構築物を含むｐＫＡ Ｓ１９の１４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されＣＩＡＰ で処理されたｐＣＤ１とライゲートして、ｐＫＡＳ２０を得た。 以下の方法で、チオストレプトン耐性遺伝子をｅｒｙＧの下流に配置した。プ ラスミドｐＣＳ５由来のｔｓｒ遺伝子を含有する１．１ｋｂ ＢｃｌＩ断片を（ ＢａｍＨＩで切断し、ＣＩＡＰで処理した）ｐＵＣ１９に挿入し、ｐＤＰＥ２３ Ａを作った。多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉ ｔｅ：ＭＣＳ）をｔｓｒの下流に挿入するために、このプラスミドをＥｃｏＲＩ およびＳｃａＩで消化し、同様の酵素で切断したｐＵＣ１８にライゲートして、 ｐＤＰＥ２６を得た。その後、ｔｓｒを含有する１．１ｋｂ ＸｂａＩ断片を、 ｐＤＰＥ２６から単離し、そしてＸｂａＩで切断し、ＣＩＡＰで処理したｐＫＡ Ｓ２０とをライゲートして、ｐＤＰＥ３４を作ることができた。 以下の方法でｐＤＰＥ３４からｔｓｒの第２コピーの除去を行なった。Ｓａｃ ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの複製起点を含有するｐＣＤ１由来の３ｋｂ ＮｄｅＩ− ＥｃｏＲＩ断片を、同様の酵素で消化されたｐＵＣ１９とライゲートして、プラ スミドｐＤＰＥ２１を得た。その後、ｐＤＰＥ３４由来のｔｓｒ、ｅｒｙＧ、及 びｅｒｍＥ^*プロモーターを含有するＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＤＮＡの１ ５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片 をｐＤＰＥ２１のＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲートさせてプラスミドｐＤＰＥ３ ５を得た。 実施例４ Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ｅｒｙＫ、ｅｒｙＦ株の構築（ＥＲ７２０−ＫＦ ） Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＥＲ７２０細胞の野生型ｅｒｙＫおよびｅｒｙ Ｆを、実施例１および２の組換え体プラスミドに担持されたこれらの遺伝子の欠 失変異で置換することにより、６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ産生微 生物の例を製造した。組込みによる形質転換および切開を以下の方法にしたがっ て行った。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＥＲ７２０細胞を３日間３２℃で５０ ｍＬのＳＧＧＰ培地中で増殖し、そしてその後１０ｍＬの１０．３％蔗糖で洗浄 した。細胞を１ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む１０ｍＬのＰ_M緩衝液に再懸濁し、 そして菌糸体断片のほとんどが球形プロトプラストに変換されるまで、３０℃で １５−３０分間インキュベートした。プロトプラストをＰ_Mで１度洗浄し、そし てその後−８０℃で２００ｍＬアリコート中で貯蔵する為１０％ＤＭＳＯを含有 する同様の緩衝液３ｍＬに再懸濁した。 プロトプラストのアリコートをすばやく解凍し、マイクロフュージ（ｍｉｃｒ ｏｆｕｇｅ）で１５秒間遠心分離し、上澄をデカントし、そして試験管に残るＰ_M 中のプロトプラストを再懸濁すことにより、形質転換を行った。１０μＬのＤ ＮＡ溶液を添加し（７μＬのＰ_M緩衝液中の、実施例１から得た約１μｇ／μＬ のｐＤＰＥ４ＤＮＡの３μＬ）、そして試験管を穏やかに軽くたたくことにより プロトプラストと混合した。その後、Ｔ緩衝液（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）中の２５％ＰＥＧ８０００の１ｍＬの１０分の２を加え、 ３度溶液をピペットで吸入することで混合し、そして懸濁液を乾燥Ｒ３Ｍプレー トにすぐに広げた。プレートを３０℃で２０時間インキュベートし、１００μｇ ／ｍＬチオストレプトンを含有する２ｍＬの水で覆い、短時間乾燥させ、そして ３０℃であと４日インキュベートした。 組込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を選択するために、形質転換体を非選択的 Ｒ３Ｍ培地（すなわち、チオストレプトンな しで）上のレプリカ平板法に付し、胞子形成をさせ、そしてその後１０μｇ／ｍ Ｌチオストレプトンを含有するＲ３Ｍ培地上のレプリカ平板法に付した。チオス トレプトンを含有するＳＧＧＰに１０コロニーを接種した。これらの内、８つが 増殖し、そして組込み体として選択された。サザンハイブリダイゼーションによ り、プラスミドＤＮＡの組込みが確認され、そして８株全てがエリスロマイシン Ａを作ることがＴＬＣ分析により判った。 その後、８つの組込み体をＲ３Ｍ上で非選択的に増殖させ、胞子形成をさせた 。胞子を平板培養して、Ｒ３Ｍプレート上に個々のコロニーを得、その後チオス トレプトンに対する感受性についてスクリーニングし、これにより染色体からの プラスミド配列の損失が示された。８つのチオストレプトン感受性コロニーを選 択し、そしてサザンハイブリダイゼーションにより、そしてエリスロマイシンＤ およびＢの生成により、これらの内の２つが染色体にｅｒｙＫの欠失コピーを含 むことが確認された。 ｅｒｙＫ欠失株が（実施例２に記載された）ｐＧＭ５０４の受容体として使用 される以外は、ｅｒｙＫ欠失について上記で 記述されたとおりに、ｅｒｙＦの欠失コピーでの置換が行われた。サザン分析に より組み込み及びＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体からのプラスミドの切除が モニタリングされた。そしてＥＲ７２０−ＫＦと名付けられた得られた株が６， １２−ジデオキシエリスロマイシンＡおよび６−デオキシエリスロマイシンＤの 混合物を産生することが判った。 実施例５ Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ｅｒｙＫ、ｅｒｙＦの構築「第２部位」：：ｅ ｒｙＧ＋（ＥＲ７２０−ＫＦＧ＋） 本発明の６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ産生微生物の好ましい例は 、ＥＲ７２０−ＫＦ細胞を実施例３の組換え体プラスミド（すなわちｐＤＰＥ３ ５）で形質転換させて、６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡと６−デオキ シエリスロマイシンＤの混合物よりむしろ高度に純粋な６，１２−ジデオキシエ リスロマイシンＡを産生する株を構築することにより作られた。組込みおよびＳ ａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体からのｐＤＰＥ３５の切除後、ｅｒｍＥ^*プロ モーターにより作動されるｅｒｙＧの第２コピーを後に残すことが以下のとおり 行われた。実施例４で記載されたとおりＥＲ７２０−ＫＦ細胞の プロトプラストをｐＤＰＥ３５で形質転換した。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染 色体中の未知であるが非必須機能の相同な領域にプラスミドを組込むことにより 作られた重複を分割するために、そして結果としてこのプラスミドにより導入さ れたｅｒｙＧとチオストレプトン耐性マーカーを後に残すために、形質転換体を チオストレプトンを含有するＲ３Ｍプレートで連続して２回ストリークした。チ オストレプトンに２回通過させた後増殖できたそれらのコロニーは、サザン分析 により、染色体の「第２部位」領域に組込まれたｅｒｙＧの第２コピーを含有す ることが判った。この株は、ＥＲ７２０−ＫＦＧ＋と命名された。 実施例６ ＥＲ７２０−ＫＦおよびＥＲ７２０ＫＦＧ＋の発酵、およびその２つの株により 産生された化合物の同定 実施例４および５で生成された組換え体Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株を、以 下の発酵手段を用いて培養した。ＥＲ７２０−ＫＦおよびＥＲ７２０ＫＦＧ＋の ６００ｍＬ種培養を綿栓付２リットルフラスコ中のＡ４Ｂｆ培地で、３２℃、２ ２５ｒｐｍでそれぞれ４８および７２時間増殖させた。３０リット ルのＳＣＭ培地（ＥＲ７２０−ＫＦＧ＋については１０μｇ／ｍＬまで加えられ たチオストレプトンを伴う）に含有する４５リットルＬＨ発酵槽（Ｉｎｃｅｌ Ｔｅｃｈ，Ｈａｙｗａｒｄ，カリフォルニア）に１．５リットルの種培養を接種 した。細胞を３２℃、２５０ｒｐｍ、５ｐｓｉの上部圧で、そして０．７−１容 量のＯ₂／培養の容量／分の通気率で増殖させた。最初に０．０１％まで消泡剤 を添加し、そしてｐＨをプロピオン酸とＫＯＨを用いて７．０に制御した。ＥＲ ７２０−ＫＦについては、０、２４、４０、４８、６６、７２および１４４時間 で、ＥＲ７２０ＫＦＧ＋については、２４、４０、４８、６６、７２、８８およ び１４４時間で培養サンプルを採取した。 以下の手段により、エリスロマイシン誘導体を産生株の培養ブロスから分離し た。１分間マイクロフュージで遠心分離することにより細胞を１．５ｍＬの培養 から除去した。１ｍＬの上清を別の試験管に取り、そして６μＬのＮＨ₄ＯＨを 添加することによりｐＨを９．０に調整した。０．５ｍＬの酢酸エチルを添加し 、試験管を１０秒間渦撹拌し、そしてその後およそ５分間遠心分離して相を分離 した。有機相を別の試験管に取り、そして水相を０．５ｍＬの酢酸エチルで再抽 出した。２番目の 有機相を最初のものといっしよにプールし、そしてスピードバック（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ．）で乾燥させた。残渣を１１μＬの酢酸エチルに取り出し、そして１ μＬをＴＬＣ平板上にスボットした。プレートに適用された化合物の量が検量法 の直線の範囲にあることを保証するために、６，１２−ジデオキシエリスロマイ シンＡの標準曲線も包含された。 シリカゲル薄相クロマトグラフィ平板（メルク６０Ｆ−２５４）をイソプロピ ルエーテル−メタノール−ＮＨ₄ＯＨ（７５：３５：２）を用いて展開した。ア ニスアルデヒド−硫酸−エタノール（１：１：９）をプレートに噴霧することに より、化合物を可視化した。この試薬で、６，１２−ジデオキシエリスロマイシ ンＡおよび６−デオキシエリスロマイシンＤは青いスポットとして現れ、そして さらにそれらは、標準のものとそれらのＲｆ値（溶媒前線の移動に対するスポッ トの移動の比率）を比較することにより同定される（図６および７参照）。 モレキュラー・ダイナミックス・パーソナル・デンシトメーター（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ） （ＰＤ−１２０レーザーベース透過型スキャナー）を用いて１００μｍ分解能で ＴＬＣス ポットを測定することにより、遺伝子工学的に製造された株により産生された６ −デオキシエリスロマイシンＤに対する６，１２−ジデオキシエリスロマイシン Ａの比率を分析した。図８ａは、６日間にわたるの発酵の間じゅう、Ｃ−６およ びＣ−１２ヒドロキシラーゼを欠く株が６，１２−ジデオキシエリスロマイシン Ａを産生する一方で、非メチル化前駆体である６−デオキシエリスロマイシンＤ も大量に蓄積されたことを例示する。しかし、図８ｂに示されるとおり、３”− Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の余剰コピーがこの株の非必須領域に加え られた場合、６−デオキシエリスロマイシンＤの蓄積を圧倒することができ、そ してこの前駆体を高度に純粋な６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡに変換 することができた。 実施例７ プラスミドｐＫＡＳ３７の構築 図９に示される概略による組換え体ＤＮＡ技術の標準法を用いて、ｐＫＡＳ３ ７を構築した。ｐＩＪ４０７０由来のｅｒｍＥ^*プロモーターをｐＵＣ１９のＢ ａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ｐＫＡＳ７を得た。ＫｐｎＩからＢｇｌ ＩＩまでの部位を含むポリリンカーの領域をｐＩＪ４０７０からｐＵＣ １９に移して、ｐＫＡＳ８を得た。ｐＫＡＳ７をＳｓｐＩ／ＢａｍＨＩで消化し 、そしてｅｒｍＥ^*プロモーター断片をＳｓｐＩ／ＢｇｌＩＩ消化ｐＫＡＳ８に 挿入して、ｐＫＡＳ１６を得た。ＰｖｕＩＩ部位を排除するために、プラスミド ｐＫＡＳ１６をＮａｅＩ／ＥｃｏＯ１０９で消化し、クレノウで充填（fill-in ）し、そしてライゲートしてｐＫＡＳ１７を得た。その後ｐＫＡＳ１７をＳｓｐ Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｅｒｍＥ^*断片を同様に消化したｐＩＪ４ ０７０にライゲートしてｐＫＡＳ１８を得た。 ＢｃｌＩ消化によりｔｓｒ遺伝子をから切除し、そしてＣＩＡＰで脱リン酸化 したＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１９にライゲートして、ｐＤＰＥ２３Ｂを得た。その 後ｐＤＰＥ２３ＢをＳｓｐＩ／ＮｄｅＩで消化し、そしてｅｒｍＥ^*断片をＳｓ ｐＩ／ＡＳｅＩで消化したｐＫＡＳ１８から単離し、そしてライゲートして、ｐ ＫＡＳ２３を作った。ｐＫＡＳ２３をＳｓｔＩＩ／ＰｖｕＩＩで消化し、そして ｐＣＳ５由来の１．１ｋｂ ＳｓｔＩＩ／ＳｍａＩ断片をライゲートさせてｐＫ ＡＳ３３を得た。 ｐＤＰＥ３５をＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩで消化し、そして ｐＣＤ１レプリコン断片を、同様に消化したｐＧＭ４６９にライゲートしてｐＫ ＡＳ３０を得た。ｐＫＡＳ３０を、別々にＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで消化し、 且つ同時にクレノウで充填して、ｐＫＡＳ３４を得た。ｐＫＡＳ３４をＳｔｕＩ で部分的に消化し、ＣＩＡＰで脱リン酸化して、ＳｓｐＩ／ＦｓｐＩで消化した ｐＫＡＳ３３由来のｅｒｍＥ^*およびｔｓｒ遺伝子を含有する断片をライゲート してｐＫＡＳ３５（−）を作った。ＭｌｕＩ／ＮｄｅＩでｐＤＰＥ２１を消化し 、クレノウを充填し、そしてライゲートすることにより、ｐＤＰＥ３６を作った 。ｐＫＡＳ３５（−）をＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩで消化し、そして同様に消化した ｐＤＰＥ３６由来のｐＣＤ１レプリコンをライゲートしてｐＫＡＳ３６を作った 。ｐＫＡＳ３６およびｐＫＡＳ３５（−）をＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＩで消化してｐ ＫＡＳ３７を作った。このプラスミドの詳細な制限地図を図１０に示す。プラス ミドｐＫＡＳ３７を含有するＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５αの培養を上述のとおりアグ リカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号ＮＲ ＲＬＢ−２１４８５が付与された。 実施例８ プラスミドｐＫＡＳＩ３７の構築 図１１に示される概略による組換え体ＤＮＡ技術の標準法を用いて、ｐＫＡＳ ３７の代替例であるｐＫＡＳＩ３７を構築した。ｐＫＡＳＩ３７の「第２部位」 領域を得るために、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＥＲ７２０またはＮＲＲＬ２ ３３８の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしておよそ１２ｋｂの断片 を０．７％アガロースゲルから単離する。この断片のプールを（同様にＨｉｎｄ ＩＩＩで消化された）ｐＵＣ１９にライゲートする。第２部位を担持するプラス ミドについて、ミニプレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩ およびＳｔｕＩで消化することにより、形質転換体をスクリーニングして、（Ｂ ａｍＨＩについては）６．８、５．６および２．１ｋｂ、（ＭｌｕＩについては ）１１．３、３．３および０．３ｋｂ、（ｓｔｕＩについては）１４．９ｋｂの 予測された断片を作った。ＨｉｎｄＩＩＩ断片の適切な方向は、「第２部位」領 域の１方の末端でＫｐｎＩ部位がｐＵＣ１９ポリリンカーのＫｐｎＩ部位に隣接 するので、ＫｐｎＩ消化により決定される。生じるプラスミドはｐＸ１である。 その後、プラスミドｐＣＤ１をＭｌｕＩで消化し、クレノウで処理し、そして ＫｐｎＩで消化する。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａレプリコンを含有する約３ｋ ｂの得られた断片を、ＮｄｅＩ（クレノウを充填）、およびＫｐｎＩで消化した ｐＸ１にライゲートして、プラスミドｐＸ２を形成する。その後プラスミドｐＸ ２をＫｐｎＩで消化し、クレノウで処理し、そして再ライゲートしてプラスミド ｐＸ３を得る。ｐＸ３をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウで処理し、そして再 ライゲートしてプラスミドｐＸ４を得る。 当該プラスミドの最終構築段階は、ｅｒｍＥ^*プロモーター、ポリリンカーお よびｔｓｒ遺伝子の挿入を含む。プラスミドｐＩＪ４０７０をＫｐｎＩで消化し 、クレノウで処理し、そして再ライゲートしてプラスミドｐＸ５を形成する。そ の後、アニーリングされた時に以下の制限部位：ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｋｐ ｎＩ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ ｔＩ（合成ポリリンカー）を含む２つのオリゴヌクレオチドを合成する。この２ 本鎖断片を、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＸ５中にライゲートして、 プラスミドｐＸ６を得る。その後プラスミド ｐＣＳ５をＢｃｌＩで消化し、得られた１ｋｂ ｔｓｒ含有断片をｐＸ６のＢａ ｍＨＩ部位中にライゲートしてプラスミドｐＸ７を得る。その後ｐＸ７を、Ｅｃ ｏＲＩで部分的に消化し、クレノウで処理し、そしてｅｒｍＥ^*プロモーター− 合成ポリリンカー−ｔｓｒ遺伝子を含有する１．４ｋｂ ＤＮＡ断片を、ｐＸ４ のＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ「第２部位」領域の唯一のｓｔｕＩ部位に挿入し 、プラスミドｐＫＡＳＩ３７を形成する。プラスミドｐＫＡＳＩ３７の詳細な制 限地図を図１２に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイン，グレゴリー・テイー アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、コンステイチユーシヨン・アベニユ ー・5743 (72)発明者 ポスト，デイビツト・エイ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、 ケノシヤ、ハリソン・4914 (72)発明者 サター，マーク アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、 ケノシヤ、シツクステイフアースト・アベ ニユー・7099 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．目的のＤＮＡ配列をエリスロマイシン産生宿主細胞の染色体に組込むため の組換え体ＤＮＡベクターであって、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅ ｒｙｔｈｒａｅａ 染色体の非必須領域の第１のＤＮＡ配列、特定の宿主細胞で複 製を行うことができる第２のＤＮＡ配列および選択可能マーカー遺伝子をコード する第３のＤＮＡ配列を含むベクター。 ２．前記第２のＤＮＡ配列がプラスミドｐＣＤ１に由来する請求項１に記載の ＤＮＡベクター。 ３．さらに、ｅｒｍＥ^*プロモーター（ここで該ｅｒｍＥ^*プロモーターは、目 的の遺伝子に操作可能に結合している）をコードするＤＮＡ配列を含む請求項１ に記載のＤＮＡベクター。 ４．前記目的の遺伝子がｅｒｙＧ遺伝子である請求項３に記載のＤＮＡベクタ ー。 ５．さらに、多重なクローニング部位を含む請求項１に記載のＤＮＡベクター 。 ６．前記ベクターがプラスミドｐＫＡＳ３７である請求項１に記載のＤＮＡベ クター。 ７．さらに、ｅｒｙＧ遺伝子を含む請求項６に記載のＤＮＡベクター。 ８．前記ベクターがプラスミドｐＤＰＥ３５である請求項１に記載のＤＮＡベ クター。 ９．実質的に純粋な３”−メチル化エリスロマイシン誘導体を作る方法であっ て、 ａ．ｅｒｙＧ遺伝子を含有する組込み組換え体ベクターを宿主細胞（ここで、 該宿主細胞は該３”−メチル化エリスロマイシン誘導体および３”−非メチル化 エリスロマイシン誘導体の混合物を産生する）に導入すること、 ｂ．該宿主細胞の安定な組込み体（ここで、該組込み体は、該組込み体の染色 体の非必須領域に安定に組み込まれた該ｅｒｙＧ遺伝子を有する）を選択するこ と、 ｃ．該安定な組込み体を培地で培養すること、および ｄ．該３”−メチル化エリスロマイシン誘導体を該培地から単離すること、 を含む方法。 １０．前記組込み組換え体ＤＮＡベクターが請求項１、４、６または８のベク ターである請求項９に記載の方法。 １１．実質的に純粋な６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを作る方法で あって、 ａ．ｅｒｙＧ遺伝子を含有する組込み組換え体ベクターを、該６，１２−ジデ オキシエリスロマイシンＡおよび６−デオキシエリスロマイシンＤの混合物を産 生する宿主細胞に導入すること、 ｂ．該宿主細胞の安定な組込み体（ここで、該組込み体は、該組込み体の染色 体の非必須領域に安定に組み込まれた該ｅｒｙＧ遺伝子を有する）を選択するこ と、 ｃ．該安定な組込み体を培地で培養すること、および ｄ．該６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを該培地から単離すること、 を含む方法。 １２．前記組込み組換え体ＤＮＡベクターが請求項１、請求項４、請求項６ま たは８のベクターである請求項１４に記載の方法。 １３．３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性のための少なくとも１つの基 質を産生する宿主細胞で３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を増加させる 方法であって、 ａ．ｅｒｙＧ遺伝子（ここで、ｅｒｙＧ遺伝子は該３”−Ｏ−メチルトランスフ ェラーゼ活性をコードする）を含有する組込み組換え体ベクターを，該宿主細胞 に導入すること、および ｂ．該宿主細胞の安定な組込み体（ここで、該組込み体は、該組込み体の染色体 の非必須領域に安定に組み込まれた該ｅｒｙＧ遺伝子を有する）を選択すること 、 を含む方法。 １４．前記組込み組換え体ＤＮＡベクターが請求項１、４、６または８のベク ターである請求項１９に記載の方法。 １５．３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を増加させる様に修飾された デオキシエリスロマイシン産生宿主株を作る方法であって、 ａ．ｅｒｙＧ遺伝子（ここで該ｅｒｙＧ遺伝子は、該３”−Ｏ−メチルトラン スフェラーゼ活性をコードする）を含有する組込み組換え体ベクターを該宿主株 に導入すること、および ｂ．該宿主株の安定な組込み体（ここで、該組込み体は、該組込み体の染色体 の非必須領域に安定に組み込まれた該ｅｒｙＧ遺伝子を有する）を選択すること 、 を含む方法。 １６．前記組込み組換え体ＤＮＡベクターが請求項１、４、６または８のベク ターである請求項２４に記載の方法。 １７．３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を過剰に産生するように修飾 されたエリスロマイシン誘導体産生宿主株であっで、該修飾が、該宿主株の染色 体の非必須領域に該３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性をコードするｅｒ ｙＧ遺伝子の安定な組込みである、前記宿主株。