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JP2001511349A - Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓにおける６−デオキシヘキソースの生合成及び移送のための遺伝子 - Google Patents

Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓにおける６−デオキシヘキソースの生合成及び移送のための遺伝子

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JP2001511349A
JP2001511349A JP2000504257A JP2000504257A JP2001511349A JP 2001511349 A JP2001511349 A JP 2001511349A JP 2000504257 A JP2000504257 A JP 2000504257A JP 2000504257 A JP2000504257 A JP 2000504257A JP 2001511349 A JP2001511349 A JP 2001511349A
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seq
nucleotides
dtdp
deoxyhexose
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JP2000504257A
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フロマンタン クロード
ミシェル ジャンマルク
レイナル マリーセシル
サラウベイ カディジャ
コルテス イエスス
ガイザー ザビーネ
リードレイ ピーター
メンデス カルメン
ア．サラス ホセ
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ヘキスト・マリオン・ルセル
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Priority claimed from FR9807411A external-priority patent/FR2786200A1/fr
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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
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    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

(57)【要約】 この発明は、エリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡＩＩＩ領域に対応する図２に表示された単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１)及びエリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＡＩ−ｅｒｙＫ領域に対応する図３に表示された単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:６)に関係する。この発明は又、オレアンドマイシン生合成遺伝子の領域に対応する図２２に表示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１５の配列)にも関係する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、Saccharopolyspora erythraeaにおける６−デオキシヘキソースの 生合成及び移送に関与する遺伝子並びに遺伝子操作によるエリスロマイシンのア
ナログの生産におけるそれらの利用を記載する。
【０００２】 エリスロマイシンＡは、グラム陽性細菌Sac. erythraeaにより生成される臨床
的に重要なマクロライド系抗生物質である。エリスロマイシンの生合成のための
遺伝子は、ｅｒｙ遺伝子のクラスター内に組織化されており、それは又、エリス
ロマイシンに対する自己耐性のための遺伝子ｅｒｍＥをも含んでいる。
【０００３】 ｅｒｙクラスターは、ポリケチドシンテターゼ(ＰＫＳと呼ばれる)及びこれに
隣接する２つの領域であってラクトン核(６−デオキシエリスロノリドＢ)のエリ
スロマイシンＡへの変換の後続段階に関与する遺伝子を含む２つの領域を含む３
つのポリペプチドをコードする３つの主要な遺伝子ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩ及
びｅｒｙＡＩＩＩ(遺伝子座ｅｒｙＡ)を含んでいる。
【０００４】 図１に表したエリスロマイシンＡ生合成プロセスにおいて、６−デオキシヘキ
ソースの生合成は、グルコース−１−ホスフェートから最終的な活性化された糖
ｄＴＤＰ−Ｌ−ミカロース又はｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミンへ導く全酵素反応を含
む。こうして生成されたｄＴＤＰ−Ｌ−ミカロース又はｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミ
ンは、次に、これら２つのデオキシヘキソースのラクトン核への移送の基質とし
て用いられる。エリスロマイシンの形成は、ラクトン核のＣ−３位のヒドリルを
介するミカロースの結合及びＣ−５位のヒドリルを介するデソサミンの結合を必
要とする。ミカロースの生合成又は移送に関与するすべてのｅｒｙＢ遺伝子及び
デソサミンの生合成又は移送に関与するすべてのｅｒｙＣ遺伝子は、未だ、明確
には同定されていない。
【０００５】 ５６ｋｂの長さを有するｅｒｙクラスターは、２１のオープンリーディングフ
レーム(ＯＲＦ)を含んでおり、その番号付けは、Haydock等(1991)及びDonadio等
(1993)により確立されている。ｅｒｙＡ遺伝子座は、ＯＲＦ１０、１１及び１２
を含んでいる。
【０００６】 ｅｒｙクラスターの左部分における遺伝子中断又は置換の初期の研究は、ｅｒ
ｙＣＩ遺伝子(ＯＲＦ１)の最初の同定、その後のｅｒｙＢＩ遺伝子(ＯＲＦ２)の
同定、ｅｒｙＨ遺伝子座(ＯＲＦ３、４及び５)(これらの不活性化は、６−デオ キシエリスロノリドＢの生成へと導く)の同定、ｅｒｙＢＩＩ遺伝子座(ＯＲＦ７
及び８)及びｅｒｙＣＩＩ遺伝子の同定を与えた(Weber等、1990)。
【０００７】 後続のラクトン核の修飾に関与する酵素活性の内で、Ｃ６位のヒドロキシル化
の原因であるｅｒｙＦ遺伝子(ＯＲＦ４)(Weber等、1991)及びＣ１２位のヒドロ キシル化の原因であるｅｒｙＫ遺伝子(ＯＲＦ２０)(Stassi等、1993)は、同定さ
れている。更に、クラジノースへのミカロースのＯ−メチル化(３”位ＯＨ)の原
因であるｅｒｙＧ遺伝子(ＯＲＦ６)は、同定されている(Weber等、1989)。エリ スロマイシンＡは、こうして、エリスロマイシンＢ又はエリスロマイシンＣを介
してエリスロマイシンＤから、提示した図式(図１)に従って形成される。
【０００８】 ｅｒｙクラスターの右部分(ＯＲＦ１３〜１９)に位置するｅｒｙＢ及びｅｒｙ
Ｃ遺伝子の機能的特性決定は、様々な雑誌に報告された断片的情報(Donadio等、
1993；Liu及びThorson、1994；Katz及びDonadio、1995)にもかかわらず、未だ、
正確には確立されていない。
【０００９】 マクロライド系抗生物質に対する商業的関心のために、新規な誘導体(特に、 有利な特性を有するエリスロマイシンアナログ)の獲得が熱心に追求されている 。エリスロマイシンのアグリコン部分(マクロラクトン)において又は／及びその
第二のヒドロキシル化において並びに糖部分(クラジノース及び／又はデソサミ ン)において、修飾は、望ましいであろう。
【００１０】 現在の方法例えば化学的修飾は、困難であり且つエリスロマイシンから得るこ
とのできる生成物の種類が限られている。例えば、Sakakibara等(1984)は、エリ
スロマイシンＡ又はＢから実施される化学的修飾(糖部分及びマクロラクトンの 両方)を概説している。
【００１１】 微生物Sac. erythraeaの遺伝子操作によるエリスロマイシンＡのマクロラクト
ンの修飾は、国際特許出願ＷＯ９３／１３６６３に記載されており、ＰＫＳをコ
ードする染色体のｅｒｙＡ遺伝子座の特異的な遺伝的変化による新規なポリケチ
ド分子の獲得も記載されている。例えば、７−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、
６−デオキシ−７−ヒドロキシエリスロマイシンＡ又は３−オキソ−３−デオキ
シ−５−デソサミニル−エリスロノリドＡが、この方法で得られている。
【００１２】 本発明は、ミカロース及びデソサミンの生合成又は結合に関与するSac. eryth
raeaの遺伝子(ｅｒｙＡ遺伝子座の下流に位置するｅｒｙＢＩＩ、ｅｒｙＣＩＩ Ｉ及びｅｒｙＣＩＩ並びに上流に位置するｅｒｙＢＩＶ、ｅｒｙＢＶ、ｅｒｙＣ
ＶＩ、ｅｒｙＢＶＩ、ｅｒｙＣＩＶ、ｅｒｙＣＶ及びｅｒｙＢＶＩＩ)の機能的 特性決定、それらのエリスロマイシンアナログの生産における利用並びにそれら
の製造方法に関するものである。
【００１３】 それ故に、本発明の主題は、図２に示した単離された一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ
配列(SEQ ID NO:１の順行配列及び相補性配列)であって、これは、エリスロマイ
シン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡＩＩＩ領域に対応しており
、特別の主題は、下記を含む上記のＤＮＡ配列である： − ＯＲＦ７(SEQ ID NO:１のヌクレオチド４８〜１０４６の相補性配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼを
コードするｅｒｙＢＩＩ配列、 − ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１０４６〜２３０８の相補性配列)に
対応し、デソサミニルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＣＩＩＩ配列、及
び − ＯＲＦ９(SEQ ID NO:１のヌクレオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)に
対応し、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラー
ゼをコードするｅｒｙＣＩＩ。
【００１４】 図２に示した上記のＤＮＡ配列は、例えば、以下に詳しい説明を与える操作条
件に従ってSac. erythraeaのゲノムＤＮＡ断片の制限断片をサブクローン化する
ことにより得ることのできるゲノムＤＮＡ配列である。
【００１５】 この発明の一層特別の主題は、ＯＲＦ７(SEQ ID NO:１のヌクレオチド４８〜 １０４６の相補性配列)に対応するｅｒｙＢＩＩ配列、ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１の
ヌクレオチド１０４６〜２３０８の相補性配列)に対応するｅｒｙＣＩＩＩ配列 又はＯＲＦ９(SEQ ID NO:１のヌクレオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)に
対応するｅｒｙＣＩＩ配列から選択する図２に示した単離されたＤＮＡ配列及び
この配列又はその断片とハイブリダイズし且つ／又は有意の相同性を有し且つ同
じ機能を有する配列である。
【００１６】 この発明の全く特別の主題は、ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１０４ ６〜２３０８の相補性配列＝SEQ ID NO:４の相補性配列)に対応し且つデソサミ ニルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＣＩＩＩ単離されたＤＮＡ配列(図 ２に 表示)である。
【００１７】 ＯＲＦ７に対応するｅｒｙＢＩＩ配列は、３３３アミノ酸を有するポリペプチ
ド(SEQ ID NO:２の配列)をコードし、ＯＲＦ８に対応するｅｒｙＣＩＩＩ配列は
、４２１アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:５の配列)をコードし、そし
てＯＲＦ９に対応するｅｒｙＣＩＩ配列は、３６１アミノ酸を有するポリペプチ
ド(SEQ ID NO:３の配列)をコードする。
【００１８】 上に示したそれぞれの酵素活性は、以下に実験部において説明するように、対
応する遺伝子への内部欠失の導入により示されたものである。
【００１９】 ハイブリダイズし且つ同じ機能を有する配列は、Sambrook等(1989)により記載
された高緊縮又は中緊縮の標準条件下で上記のＤＮＡ配列の１つとハイブリダイ
ズし且つ同じ酵素機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を包含すると理解
される。用語同じ酵素機能は、類似の性質の基質例えばｄＴＤＰ−６−デオキシ
ヘキソース又は裸の若しくはグリコシル化されたマクロラクトンに対する所定の
酵素活性を意味すると理解される。高緊縮の条件は、例えば、５×ＳＳＰＥ、１
０×デンハート、１００μｇ／ｍｌＤＮＡｓｓ、１％ＳＤＳ溶液中での６５℃で
１８時間でのハイブリダイゼーション(その後、２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ 溶液での２０分間の洗浄を６５℃で２回行い、その後、最後に１回、０．１×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での４５分間の洗浄を６５℃で行う)を含む。中緊縮 の条件は、例えば、最後の２０分間にわたる０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶
液での６５℃で１回の洗浄を含む。
【００２０】 有意の均一性を示し且つ同じ機能を有する配列は、上記のＤＮＡ配列の１つと
少なくとも６０％のヌクレオチド配列同一性を有し且つ同じ酵素機能を有する蛋
白質をコードする配列を包含すると理解される。
【００２１】 この発明の主題は、上記のＤＮＡ配列の１つによりコードされるポリペプチド
でもあり、特別の主題は、ＯＲＦ７(SEQ ID NO:２の配列を有する)、ＯＲＦ８(S
EQ ID NO:５の配列を有する)又はＯＲＦ９(SEQ ID NO:３の配列を有する)より選
択する図２に示したＯＲＦに対応するポリペプチド及びこのポリペプチドのアナ
ログである。
【００２２】 アナログは、生成物が同じ酵素機能を保持する限り、少なくとも一のアミノ酸
の置換、欠失又は付加により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを包
含すると理解される。これらの改変された配列は、例えば、当業者に公知の位置
指定突然変異導入技術を用いて製造することができる。
【００２３】 この発明の一層特別の主題は、図２に示したＯＲＦ８に対応するポリペプチド
(SEQ ID NO:５の配列を有する)である(デソサミニルトランスフェラーゼ活性を 有し、ＥｒｙＣＩＩＩと呼ばれる)。
【００２４】 この発明は、公知の遺伝子工学及び細胞培養法により、宿主細胞内での発現に
より得られるSac. erythraeaのＥｒｙＣＩＩＩ組換え蛋白質を記載する。
【００２５】 精製された組換え蛋白質の獲得は、活性な糖ｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミンのラク
トン核への移送を示すイン・ビトロ試験において、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子産物と
関連するグリコシルトランスフェラーゼ機能の特性表示の確認を与えた。
【００２６】 この発明の主題は又、チミジン５’−(トリヒドロゲンジホスフェート)、Ｐ’
−[３．４，６−トリデオキシ−３−(ジメチルアミノ)−Ｄ−．キシロ．−ヘキ ソピラノシル]エステル(ｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミン)及び塩基付加塩でもある(そ
の製造例は、以下に、実験部で記載する)。
【００２７】 この発明の主題は又、エリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＡ
Ｉ−ｅｒｙＫ領域に対応する図３に示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:６ の配列)でもあり、特別の主題は、下記を含む上記のＤＮＡ配列である： − ＯＲＦ１３(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２４２〜１２０７の配列)に対応し
、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼをコード
するｅｒｙＢＩＶ配列、 − ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応
し、ミカロシルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＢＶ配列、 − ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２０の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
をコードするｅｒｙＢＶＩ配列、 − ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６０３９の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼをコードす
るｅｒｙＣＩＶ配列、 − ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼをコー
ドするｅｒｙＣＶ配列及び − ＯＲＦ１９(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５エピメラーゼをコ
ードするｅｒｙＢＶＩＩ。
【００２８】 図３に示した上記のＤＮＡ配列は、例えば、以下に詳しい説明を与える操作条
件に従って、Sac. erythraeaのゲノムＤＮＡライブラリーを含むコスミドの制限
断片をサブクローン化することにより得ることができるゲノムＤＮＡ配列である
。
【００２９】 この発明の一層特別の主題は、図３に示したＯＲＦ１３(SEQ ID NO:６のヌク レオチド２４２〜１２０７の配列)に対応するｅｒｙＢＩＶ配列、ＯＲＦ１４(SE
Q ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応するｅｒｙＢＶ配 列、ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２０の配列)に対応
するｅｒｙＣＶＩ配列、ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４ ８３７の配列)に対応するｅｒｙＢＶＩ配列、ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:６のヌクレ
オチド４８３７〜６０３９の配列)に対応するｅｒｙＣＩＶ配列、ＯＲＦ１８(SE
Q ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)に対応するｅｒｙＣＶ配 列又はＯＲＦ１９(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)に対
応するｅｒｙＢＶＩＩ配列及びこの配列とハイブリダイズし且つ／又はこの配列
との有意の相同性を示す配列又はその断片(同じ機能を有するもの)より選択する
単離されたＤＮＡ配列である。
【００３０】 この発明の全く特別の主題は、ｅｒｙＢＶという図３に示したＯＲＦ１４(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応し、ミカロシルトラ
ンスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列である。
【００３１】 ＯＲＦ１３に対応するｅｒｙＢＩＶ配列は、３２２アミノ酸を有するポリペプ
チド(SEQ ID NO:７)をコードし、ＲＦ１４に対応するｅｒｙＢＶ配列は、４１５
アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:８)をコードし、ＯＲＦ１５に対応す
るｅｒｙＣＶＩ配列は、２３７アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:９)を
コードし、ＯＲＦ１６に対応するｅｒｙＢＶＩ配列は、５１０アミノ酸を有する
ポリペプチド(SEQ ID NO:１０)をコードし、ＯＲＦ１７に対応するｅｒｙＣＩＶ
配列は、４０１アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１４)をコードし、Ｏ
ＲＦ１８に対応するｅｒｙＣＶ配列は、４８９アミノ酸を有するポリペプチド(S
EQ ID NO:１１)をコードし且つＯＲＦ１９に対応するｅｒｙＢＶＩＩ配列は、１
９３アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１２)をコードする。
【００３２】 上に示したそれぞれの酵素活性は、以下に実験部で示すように、内部欠失の対
応遺伝子への導入により示されたものである。
【００３３】 ハイブリダイズするＤＮＡ配列並びに有意の相同性を示し且つ同じ機能を有す
るＤＮＡ配列は、前に示したものと同じ意味を有する。
【００３４】 この発明の主題は又、上記のＤＮＡ配列の１つによりコードされるポリペプチ
ドでもあり、特別の主題は、図３に示したＯＲＦ１３(SEQ ID NO:７の配列を有 する)、ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:８の配列を有する)、ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:９の
配列を有する)、ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:１０の配列を有する)、ＯＲＦ１７(SEQ
ID NO:１４の配列を有する)、ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:１１の配列を有する)又は ＯＲＦ１９(SEQ ID NO:１２の配列を有する)及びこのペプチドのアナログから選
択するＯＲＦに対応するポリペプチドである。
【００３５】 ポリペプチドのアナログは、前に示したものと同じ意味を有する。
【００３６】 この発明の一層特別の主題は、図３に示したＯＲＦ１４に対応し且つミカロシ
ルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO:８の配列を有する)
である(ＥｒｙＢＶと呼ばれる)。
【００３７】 上に示した及び図２又は３に示したこの発明の各ｅｒｙＢ又はｅｒｙＣＤＮＡ
配列の知識は、本発明を、例えば、化学合成の公知の方法により又は公知のハイ
ブリダイゼーション技術により若しくはＰＣＲ増幅によりオリゴヌクレオチド合
成プローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって再現
することを可能にする。
【００３８】 この発明のポリペプチドは、公知の方法により、例えば、化学合成により又は
組換えＤＮＡ法により原核若しくは真核宿主細胞内での発現により得ることがで
きる。
【００３９】 この発明の他の主題は、図２に示した配列ｅｒｙＢＩＩ(SEQ ID NO:１のヌク レオチド４８〜１０４６の相補性配列)、ｅｒｙＣＩＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレ
オチド１０４６〜２３０８の相補性配列)又はｅｒｙＣＩＩ(SEQ ID NO:１のヌク
レオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)、図３に示したｅｒｙＢＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２４２〜１２０７の配列)、ｅｒｙＢＶ(SEQ ID NO:６のヌ
クレオチド１２１０〜２４５４の配列)、ｅｒｙＣＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオ
チド２５１０〜３２２０の配列)、ｅｒｙＢＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３
３０８〜４８３７の配列)、ｅｒｙＣＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７
〜６０３９の配列)、ｅｒｙＣＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４
６の配列)又はｅｒｙＢＶＩＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６
の配列)から選択するＤＮＡ配列の少なくとも１つの、Sac. erythraeaにおける ハイブリッド二次代謝産物を合成するための利用に関係する。
【００４０】 ハイブリッド二次代謝産物は、エリスロマイシンのアナログ即ち糖部分に影響
を与える少なくとも一つの改変をを有し且つ抗生物質活性を有するエリスロマイ
シン誘導体又は ６−デオキシエリスロノリドＢ若しくは改変された若しくはさ
れてない少なくとも一つの糖残基が付加された抗生物質活性を有しないエリスロ
ノリドＢ等のエリスロマイシン前駆体の何れかを意味すると理解される。
【００４１】 この発明のｅｒｙＢ又はｅｒｙＣＤＮＡ合成の利用によるSac. erythraeaにお
けるハイブリッド二次代謝産物の合成は、例えば、上記のｅｒｙＢ又はｅｒｙＣ
遺伝子の少なくとも一つの不活性化及び少なくとも一つの外因性遺伝子又は例え
ば突然変異導入により得られるそれらの誘導体(他のマクロライド系抗生物質例 えばタイロジン、ピクロマイシン又はメチマイシンを生成する株において同じ機
能を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を有する)の導入により行うこと ができる。特に、外因性遺伝子の導入は、「ＤＮＡシャッフリング」法(Stemmer
、1994)により又は例えば糖残基の移送に介入するこの発明のｅｒｙＢ若しくは ｅｒｙＣ配列例えばｅｒｙＣＩＩＩ若しくはｅｒｙＢＶ配列に由来するキメラＤ
ＮＡ配列の構築により得られるＤＮＡ配列の、及びマクロライド系抗生物質を産
生する株例えばStreptomyces fradiae、Streptomyces olivaceus、Streptomyces venezuelae若しくはStreptomyces antibioticusから単離された相同遺伝子のイ
ンテグレーションにより行うことができる。
【００４２】 この発明は又、図２に示した配列ｅｒｙＢＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオチド ４８〜１０４６の相補性配列)、ｅｒｙＣＩＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１
０４６〜２３０８の相補性配列)又はｅｒｙＣＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオチド
２３２２〜３４０４の相補性配列)、図３に示したｅｒｙＢＩＶ(SEQ ID NO:６の
２４２〜１２０７の配列)、ｅｒｙＢＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜
２４５４の配列)、ｅｒｙＣＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２
０の配列)、ｅｒｙＢＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７の配
列)、ｅｒｙＣＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６０３９の配列)、 ｅｒｙＣＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)又はｅｒｙ
ＢＶＩＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)から選択する
ＤＮＡ配列又はこの配列の断片の少なくとも１つのハイブリダイゼーションプロ
ーブとしての利用に関係する。
【００４３】 この発明のｅｒｙＢ又はｅｒｙＣＤＮＡ配列を用いて、少なくとも１９ヌクレ
オチドのハイブリダイゼーションプローブを構成することができ、これは、フィ
ルター上に固定化した核酸の標準的ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲ増幅を
用いることにより、Sambrook等(1989)により記載された条件に従って、マクロラ
イド系抗生物質を産生する株において相同な遺伝子を単離することを可能にする
。
【００４４】 この発明は、特に、図２に示したｅｒｙＣＩＩＩＤＮＡ(SEQ ID NO:１のヌク レオチド１０４６〜２３０８の相補性配列＝SEQ ID NO:４の相補性配列)の、マ クロライド系抗生物質の産生株におけるマクロラクトンのグリコシル化の原因の
相同遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとしての利用に関
係する。
【００４５】 この発明は、一層特に、相同遺伝子が、S. antibioticusにおけるオレアンド マイシン生合成遺伝子である上記の利用に関係する。
【００４６】 この発明は、例として、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の配列の、オレアンドマイシン
産生株において相同遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブと
しての利用を記載する。用いたｅｒｙＣＩＩＩプローブは、デソサミン及びオレ
アンドロースのラクトン核への移送に関与するS. antibioticusにおけるグリコ シルトランスフェラーゼをコードするｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺伝子の単離を
与えた。
【００４７】 ｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺伝子の機能的特性決定は、S. antibioticusにお けるオレアンドマイシン生合成遺伝子のクラスターの右部分の構成を規定するこ
とを可能にした。
【００４８】 それ故、この発明の主題は、図２２に示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO
:１５の配列)であり、それは、下記を含むオレアンドマイシン生合成遺伝子のク
ラスターの領域に対応する： − ＯＲＦｏｌｅＰ１のヌクレオチド１８４〜１３８６に対応する配列、 − グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＲＦｏｌｅＧ１のヌクレ
オチド１４３７〜２７１４に対応する配列、 − グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＲＦｏｌｅＧ２のヌクレ
オチド２７２２〜３９９９に対応する配列、 − ＯＲＦｏｌｅＭのヌクレオチド３９９２〜４７２０に対応する配列(＝SEQ I
D NO:２０の配列)及び − ＯＲＦｏｌｅＹのヌクレオチド４８１０〜５９６７に対応する配列。
【００４９】 図２２に示した上記のＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１５の配列)は、例えば、オレア
ンドマイシン生合成遺伝子のクラスターの右部分をカバーするコスミドから以下
に詳述する操作条件に従ってｅｒｙＣＩＩＩプローブとのハイブリダイゼーショ
ンにより得ることのできるゲノムＤＮＡ配列である。
【００５０】 この発明の一層特別の主題は、図２２に示したＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO: １５のヌクレオチド１４３７〜２７１４の配列)に対応しグリコシルトランスフ ェラーゼ活性をコードする配列及びＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID NO:１５のヌクレ オチド２７２２〜３９９９の配列)に対応しグリコシルトランスフェラーゼ活性 をコードする配列より選択する単離されたＤＮＡ配列である。
【００５１】 この発明の全く特別の主題は、ＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオ チド１４３７〜２７１４の配列)に対応し、デソサミニルトランスフェラーゼ活 性をコードする上記の単離されたＤＮＡ配列、並びにＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID
NO:１５のヌクレオチド２７２２〜３９９９の配列)に対応し、オレアンドロシル
トランスフェラーゼ活性をコードする上記の単離されたＤＮＡ配列である。
【００５２】 ＯＲＦｏｌｅＧ１に対応する配列は、４２６アミノ酸を有するポリペプチド(S
EQ ID NO:１７の配列)をコードし且つＯＲＦｏｌｅＧ２に対応する配列は、４２
６アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１８の配列)をコードする。
【００５３】 上に示したそれぞれの酵素活性は、以下に実験部で示すように、対応遺伝子の
変化により示されたものである。
【００５４】 この発明の主題は又、ＯＲＦｏｌｅＧ１に対応するＤＮＡ配列によりコードさ
れ且つデソサミニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO: １７の配列)及びＯＲＦｏｌｅＧ２に対応するＤＮＡ配列によりコードされ且つ オレアンドロシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１ ８)でもある。
【００５５】 それぞれＯｌｅＧ１及びＯｌｅＧ２と呼ばれる上記のポリペプチドは、上に示
した公知の方法により得ることができる。
【００５６】 この発明の主題は又、Sac. erythraeaにおけるハイブリッド二次代謝産物の製
造方法でもあり、該方法においては： − 図２(SEQ ID NO:１の相補性配列)又は図３(SEQ ID NO:６の配列)に示したエ
リスロマイシンの生合成遺伝子のクラスターの少なくとも一のｅｒｙＢ配列又は
ｅｒｙＣ配列を含むＤＮＡ配列を単離し、 − 該配列中に改変を造って、変化した配列を得、 − この変化した配列を宿主株の染色体中にインテグレートして、改変された株
を得、 − この改変された株を、ハイブリッド二次代謝産物の形成を与える条件下で培
養し、そして − このハイブリッド二次代謝産物を単離する。
【００５７】 このＤＮＡ配列の改変は、例えば、上記の対応する酵素の１つをコードするこ
の発明のｅｒｙＢ又はｅｒｙＣ配列における少なくとも１ヌクレオチドのＤＮＡ
配列の付加及び／又は欠失により行うことができる。
【００５８】 変化した配列の宿主株へのインテグレーションは、例えば、図４に示した図式
に従って行うことのできる相同組換え法により行うことができ、該方法は、Sac. erythraea株の染色体変異体の生成へと導くが、次いで、該変異体を細胞培養の
公知の一般的方法に従って培養する。
【００５９】 この発明の特別の主題は、上記の方法であり、該方法においては、ＤＮＡ配列
は、下記より選択する酵素の１つをコードする − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。
【００６０】 この発明の一層特別の主題は、配列の変化が少なくとも一の上記の酵素の不活
性化を生じる上記の方法である。
【００６１】 少なくとも一の酵素の不活性化は、一方では、エリスロマイシンの産生のない
ことにより示され、他方では、エリスロマイシンの前駆体例えば６−デオキシエ
リスロノリドＢ、エリスロノリドＢ又は３−α−ミカロシルエリスロノリドＢの
蓄積及び／又は前に規定したハイブリッド二次代謝産物の対応改変株の培養上清
中への蓄積により示される。
【００６２】 この発明は、全く特に、不活性化された酵素がｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−
デオキシヘキソース４−レダクターゼであるか又は不活性化された酵素がｄＴＤ
Ｐ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼであるか又は酵素がミ
カロシルトランスフェラーゼであるか又は不活性化された酵素がｄＴＤＰ−４−
ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼである上記の方法に関
係するものである。
【００６３】 この発明は又、単離されたハイブリッド二次代謝産物が４”−ケト−エリスロ
マイシン、４’−ヒドロキシ−エリスロマイシン又は３”−Ｃデスメチル−２”
，３”−エン−エリスロマイシンから選択するエリスロマイシンアナログである
か又は単離されたハイブリッド二次代謝産物がデソサミニルエリスロノリドＢで
ある上記の方法にも関係する。
【００６４】 この発明によるプロセスの手段の例を、実験部に与える。Sac. erythraeaの改
変株におけるハイブリッド二次代謝産物の蓄積も又、以下に記載する。
【００６５】 この発明は又、下記より選択する酵素の少なくとも１つが不活性化され且つ少
なくとも一のハイブリッド二次代謝産物を生成しているSac. erythraeaの改変株
にも関係する − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。
【００６６】 この発明は、特に、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３
−レダクターゼが不活性化されていて３”−Ｃデスメチル−２”、３”−エン−
エリスロマイシンＣを産生するSac. erythraeaの改変株ＢＩＩ９２、ｄＴＤＰ−
４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼが不活性化されていて
４”−ケト−エリスロマイシンを産生するSac. erythraeaの改変株ＢＩＶ８７、
ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼが不活性化され
ていて４’−ヒドロキシエリスロマイシンＤを産生するSac. erythraeaの改変株
ＣＩＶ８９並びにミカロシルトランスフェラーゼが不活性化されていてデソアミ
ニルエリスロマイシンＢを産生するSac. erythraeaの改変株ＢＶ８８に関係する
。上記の株の詳細な構築は、以下に、実験部で与える。
【００６７】 この発明は又、S. antibioticusにおけるオレアンドマイシンの前駆体の製造 方法にも関係し、該方法においては、 − 宿主株の染色体中のＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド１４ ３７〜２７１４の配列)に対応するＤＮＡ配列及びＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID NO:
１５のヌクレオチド２７２２〜３９９９の配列)に対応するＤＮＡ配列から選択 した遺伝子の配列中に変化を造って、改変株を得、 − この改変株を、オレアンドマイシンの前駆体の蓄積を与える条件下で培養し
、そして − これらの前駆体を単離する。
【００６８】 このＤＮＡ配列の変化は、例えば、相同組換え法によるプラスミドのインテグ
レーションによる例えばS. antibioticus株の標的遺伝子の中断によって行うこ とができ、野生型株の染色体変異体の生成を生じる。
【００６９】 この発明は、特に、変化をＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド １４３７〜２７１４の配列)に対応するＤＮＡ配列中に造る上記のプロセスに関 係し、その結果は、少なくともデソアミニルトランスフェラーゼ活性の排除とオ
レアンドマイシン前駆体８，８ａ−デオキシオレアンドリドの蓄積である。
【００７０】 ｏｌｅＧ１遺伝子の中断により認められるオレアンドマイシンの非グリコシル
化前駆体８，８ａ−デオキシオレアンドリドの蓄積は、ｏｌｅＧ２遺伝子を不活
性化する転写極性効果のためである。
【００７１】 上記のプロセスの手段の例は、以下に、実験部で与える。
【００７２】 材料及び一般的方法 １．細菌株、プラスミド及び成長条件 この発明の実現のために用いたSac. erythraea株は、Sac. erythraea野生型株
ＮＲＲＬ２３３８の「レッドバリアント」と呼ばれる天然の表現型変異体(Hessl
er等、1997)であり、その成長は、固体培地Ｒ２Ｔ２(Weber等、1985により記載 されたペプトンを含まない培地Ｒ２Ｔ)、Ｒ２Ｔ２０(Yamamoto等、1986)上で又 は寒天上Ｍ１−１０２(Kaneda等、1962)にて、又は液体培地ＴＳＢ()にて３０℃
で日常的方法にて行われる。
【００７３】 Hopwood等(1983)により記載されたStreptomyces lividans株１３２６(John In
nes Culture Collection)(大腸菌の複製起点のないプラスミド例えばｐＩＪ７０
２及びｐＩＪ４８６の調製に使用)を、固体培地Ｒ２ＹＥ(Ｒ５)(Hopwood等、198
5)上に維持した。
【００７４】 大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ(Stratagene)、ＪＭ１１０(Stratagene)及びＤＨ５α
．ＭＣＲ(GibcoBRL)株の成長を、日常的方法で、液体培地２×ＹＴ若しくはＬＢ
中で又は寒天上の固体培地ＬＢにて、Sambrook等(1989)により記載されたように
行った。大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株を日常的クローニングに用いる。ＪＭ１１０
株を、制限部位例えばＢｃｌＩを用いるクローニングに用いる。ＤＨ５α．ＭＣ
Ｒ株は、最適トランスフォーメーションのためにSac. erythraea中に導入するこ
とを意図したプラスミドの調製のために用いる。
【００７５】 大腸菌におけるプラスミドの選択を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン(Sigma
)にて行った。
【００７６】 Bacillus subtilisＡＴＣＣ６６３３又はBacillus pumilusＡＴＣＣ１４８８ ４株を指標株として用いて、エリスロマイシンの産生を、抗生物質に対する細菌
の感受性の記録を用いる生物学的試験において評価した。
【００７７】 Ｌｉｔｍｕｓ２８、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９プラスミド(New England Biola
bs)を、日常的方法においてサブクローン化のために用いた。ｐＩＪ７０２ベク ター(Katz等、1983)を、John Innes Instituteから得た。ｐＩＪ４８６ベクター
(Ward等、1986)を、C.J.Thompson(Basle大学、スイス国)から得た。ファージミ ドｐＴＺ１８ＲをPharmacia Biotech.から得た。Sac. erythraea中への染色体イ
ンテグレーションに用いられたシャトルベクターcoli-streptomycesｐＵＷＬ２ １８(Wehmeier、1995)を、W.Piepersberg(Wuppertal大学、ドイツ国)から得た。
【００７８】 ２．ＤＮＡ操作及び配列決定 用いた分子生物学の一般的方法は、Sambrook等、1989に記載されている。
【００７９】 制限酵素(New England Biolabs及びBoehringer Mannheim)、ＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノー断片(Boehringer Mannheim)を含む商業的起源の試薬を用いた。 「ＤＮＡライゲーションシステム」キット(Amersham)を用いて連結を行い、プラ
スミドＭｉｄｉキット(Quiagen)又はＲＰＭキット(Bio101 Inc.)をプラスミドＤ
ＮＡの精製に用いた。
【００８０】 λバクテリオファージのＤＮＡの調製を、Ausubel等(1995)に従って行い、Sac
. erythraeaの染色体ＤＮＡの単離をHopwood等(1985)に従って行った。
【００８１】 S. lividansのトランスフォーメーション及びプラスミドの単離をHopwood等(1
985)に従って行った。
【００８２】 ３．エリスロノリドＢ及び３−α−ミカロシルエリスロノリドＢの調製 エリスロノリドＢ及び３−α−ミカロシルエリスロノリドＢを、変異体ｅｒｙ
ＣＩ(Dhillon等、1989により記載されたクローンＷＨＢ２２２１)の培養抽出物 からアミノプロピルゲル上のクロマトグラフィー(LichroprepNH2 25-40μ、Merc
k)により、連続的ブチルクロリド／メチレンクロリド混合物(１００：０、８０ ：２０、５０：５０及び２０：８０)による溶出勾配とその後のブチルクロリド ／メタノール混合物(９９：１〜９０：１０まで変化する)による直線的溶出勾配
を用いて精製した。期待される生成物を含む画分を真空下で乾燥させ、次いで、
薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)により分析する。次いで、エリスロノリドＢを
酢酸エチル／ヘキサン混合物から結晶化し、次いで、エタノールから再結晶させ
る。３−α−ミカロシルエリスロノリドＢを酢酸エチル／ヘキサン混合物から２
回結晶化させる。
【００８３】 挙げられる培地 １．Ｒ２Ｔ２： １リットルの水溶液の調製に要するもの：ショ糖１０３ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．２５ｇ
；イーストエキストラクト６．５ｇ；トリプトン５．０ｇ；バクトアガー２２．
０ｇ；蒸留水ｓｑｆ８６０ｍｌ。この溶液を３０分間１２０℃でオートクレーブ
にかけることにより滅菌する。使用時に、下記の無菌溶液を加える：２０ｍｌの
５０％グルコース；２５ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．０)；５ｍｌの０．
５％ＫＨ2ＰＯ4；２．５ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨ；５０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ2； ５０ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ2・Ｈ2Ｏ及び２ｍｌの「痕跡的元素」の溶液(Hopwood
等、1985)。
【００８４】 ２．Ｒ２Ｔ２０： １リットルの水溶液の調製に要するもの：２０６ｇのショ糖を含むＲ２Ｔ２培地
。
【００８５】 ３．Ｍ１−１０２(Kaneda等、1962)： １リットルの水溶液の調製に要するもの：グルコース５ｇ；市販の赤砂糖１０ｇ
；トリプトン５ｇ；イーストエキストラクト２．５ｇ；ベルセン３６ｍｇ；水道
水１０００ｍｌ；最終ｐＨをＫＯＨで７．０〜７．２に調節する。この溶液を１
２０℃で３０分間オートクレーブにかけて滅菌する。
【００８６】 ４．Ｒ２ＹＥ(Ｒ５)(Hopwood等、1985) １リットルの水溶液の調製に要するもの：ショ糖１０３ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．２５ｇ
；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １０．１２ｇ；カザミノ酸０．１ｇ；「痕跡的元素」の
溶液２ｍｌ；イーストエキストラクト５ｇ；ＴＥＳ５．７２ｇ；バクトアガー１
５ｇ；蒸留水ｓｑｆ９４０ｍｌ。この溶液を１２０℃で３０分間オートクレーブ
にかけて滅菌する。使用時に、次の無菌溶液を加える：１０ｍｌの０．５％ＫＨ 2 ＰＯ4；２０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ2；１５ｍｌの２０％Ｌ−プロリン；２０ｍ ｌの５０％グルコース及び１ｍｌの１０ｍＭＣｕＣｌ2。
【００８７】 ５．２×ＴＹ： １リットルの水溶液を調製するのに要するもの：トリプトン１０ｇ；イーストエ
キストラクト１０ｇ；ＮａＣｌ５ｇ。
【００８８】 ６．ＰＴ緩衝液： １リットルの水溶液を調製するのに要するもの：ショ糖１００ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．
２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ５．１ｇ；「痕跡的元素」の溶液２ｍｌ；蒸留水
ｓｑｆ８７５ｍｌ。この溶液を１２０℃で３０分間オートクレーブにかけて滅菌
する。使用時に、次の無菌溶液を加える：５ｍｌのＣａＣｌ2及び２０ｍｌの５ ．３％ＴＥＳ。
【００８９】 ７．ショ糖−スクシネート(Caffrey等、1992) １リットルの水溶液を調製するのに要するもの：ショ糖０．２Ｍ；コハク酸２０
ｍＭ；リン酸カリウム２０ｍＭ(ｐＨ６．６)；硫酸マグネシウム５ｍＭ；硝酸カ
リウム１００ｍＭ；「痕跡的元素」の溶液２ｍｌ。この溶液を１２０℃で３０分
間オートクレーブにかけて滅菌する。
【００９０】 添付の図面は、この発明のある面を説明している。 図１は、エリスロマイシンＡの生合成経路を表している。 図２は、ＯＲＦ７、８及び９を含むエリスロマイシンの生合成遺伝子のクラス
ターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡＩＩＩ領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:１の順行 配列及び相補性配列)及びそれらの演繹された蛋白質配列を表している。 図３は、ＯＲＦ１３〜１９を含むエリスロマイシンの生合成遺伝子のクラスタ
ーのｅｒｙＡＩ−ｅｒｙＫ領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:６の配列)及びそ
れらの演繹された蛋白質配列を表している。 図４は、相同組換えによる遺伝子置換についての図式を示している。 図５Ａは、Sac. erythraeaにおけるエリスロマイシンの生合成遺伝子のクラス
ターの左部分の構成(ＯＲＦ１〜９を矢印により示してある)並びにプラスミドｐ
Ｋ６２、ｐＢＣＫ１、ｐＫＢ２２、ｐＢＫ４４、ｐＢＩＩＳＢ、ｐＥｃｏ２及び
ｐＫ２３(ゲノムクローンλＳＥ５．５より生成)の制限地図を表している。(制 限酵素の略号：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂｃ、ＢｃｌＩ；Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ；Ｅ、Ｅｃ
ｏＲＩ；Ｋ、ＫｐｎＩ；Ｍ、ＭｌｕＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳａｃＩ；Ｓａ、Ｓ
ａｌＩ。) 図５Ｂは、Sac. erythraeaにおけるエリスロマイシンの生合成遺伝子のクラス
ターの右部分の構成(ＯＲＦ１３〜２１を矢印により示してある)並びにプラスミ
ドｐＢＫ６−１２、ｐＣＮ９、ｐＮＣＯ２８、ｐＮＢ４９、ｐＮＣＯ６２、ｐＰ
ＳＰ４、ｐＮＣＯ６２Ｘ及びｐＢＡＢ１８の制限地図を表している。(制限酵素 の略号：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂａ、ＢａｌＩ；Ｂｃ、ＢｃｌＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ
、ＥｃｏＲＩ；Ｋ、ＫｐｎＩ；Ｎ、ＮｃｏＩ；Ｎｓ、ＮｓｉＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；
Ｐｖ、ＰｖｕＩＩ；Ｓ、ＳａｃＩ；Ｓｃ、ＳｃａＩ；Ｓｈ、ＳｐｈＩ；Ｓｐ、Ｓ
ｐｅＩ；Ｘ、ＸｂａＩ；Ｘｈ、ＸｈｏＩ)。 図６Ａは、プラスミドｐＢＩＩΔの構築の図式を表している。 図６Ｂは、プラスミドｐＵＷＬ２１８の制限地図を表している。 図６Ｃは、プラスミドｐＢＩＩΔの制限地図を表している。 図７Ａは、プラスミドｐｄｅ１８８の構築の図式を表している。 図７Ｂは、プラスミドｐｄｅ１８８Ａの構築の図式を表している。 図７Ｃは、プラスミドｐＯＢＢの構築の図式を表している。 図７Ｄは、プラスミドｐＣＩＩＩΔの構築の図式及び制限地図を表している。 図８Ａは、プラスミドｐＣＩＩΔの構築の図式を表している。 図８Ｂは、プラスミドｐＯＲＴ１の制限地図を表している。 図８Ｃは、プラスミドｐＣＩＩΔの制限地図を表している。 図９Ａは、プラスミドｐＢＩＶΔの構築の図式を表している。 図９Ｂは、プラスミドｐＢＩＶΔの制限地図を表している。 図１０Ａは、プラスミドｐＢＶΔの構築の図式を表している。 図１０Ｂは、プラスミドｐＢＶΔの制限地図を表している。 図１１Ａは、プラスミドｐＰＳＴＩの構築の図式を表している。 図１１Ｂは、プラスミドｐＰＳＴＩの制限地図を表している。 図１２Ａは、プラスミドｐＸｈｏＩの構築の図式を表している。 図１２Ｂは、プラスミドｐＸｈｏＩの制限地図を表している。 図１３Ａは、プラスミドｐＣＩＶΔの構築の図式を表している。 図１３Ｂは、プラスミドｐＣＩＶΔの制限地図を表している。 図１４Ａは、プラスミドｐＣＶΔの構築の図式を表している。 図１４Ｂは、プラスミドｐＣＶΔの制限地図を表している。 図１５は、変異株ＢＩＩ９２、ＣＩＩＩ６８、ＣＩＩ６２、ＢＩＶ８７、ＢＶ
８８、ＣＩＶ８９及びＣＶ９０のサザーンブロットによる分析(Ｗｔと記した野 生型株「レッドバリアント」との比較)を表している。各変異体について、用い た制限酵素を各ブロットの下に示し、各ブロットの前に検出されたバンドのサイ
ズを分子量マーカーλ−ＨｉｎｄＩＩＩ及びλ−ＢｓｔＥＩＩに対して評価して
ある(オートラジオグラフィーでは検出できない)。 図１６は、変異株ＢＩＩ９１、ＣＩＩＩ６８、ＣＩＩ６２、ＢＩＶ８７、ＢＶ
８８、ＣＩＶ８９及びＣＶ９０のＰＣＲによる分析(Ｗｔで記した野生型株「レ ッドバリアント」との比較並びに相同組換えにより変異体を得るためにそれぞれ
用いたプラスミドｐＢＩＩΔ、ｐＣＩＩＩΔ、ｐＣＩＩΔ、ｐＢＩＶΔ、ｐＢＶ
Δ、ＰＣＩＶΔ及びｐＣＶΔとの比較)を表している。エチジウムブロミド染色 により検出されたバンドのサイズを、分子量マーカーΦＸ１７４−ＨａｅＩＩＩ
又はλ−ＢｓｔＥＩＩに対して評価してある。 図１７は、変異株ＢＩＩ９２、ＣＩＩＩ６８、ＣＩＩ６２、ＢＩＶ８７、ＢＶ
８８、ＣＩＶ８９及びＣＶ９０により生成された代謝産物のＴＬＣによる分析( 標準生成物エリスロマイシンＡ(ＥｒＡ)、エリスロマイシンＢ(ＥＢ)及び３−α
−ミカロシルエリスロノリドＢ(ＭＥＢ)との比較)を表している。 図１８は、７Ｍ尿素(ライン２)、Ｑセファロースクロマトグラフィー(ライン ３)、スーパーデックスクロマトグラフィー(ライン４)、Ｑソースクロマトグラ フィー(ライン６)を連続的に用いる抽出の後の、ＥｒｙＣＩＩＩ蛋白質の精製物
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析(標準分子量マーカー(ライン１及び５)使用)を表
している。 図１９は、ＥｒｙＣＩＩＩ蛋白質の、ｄ−ＴＤＰ−Ｄ−デソサミン(ライン２)
との又はｄ−ＴＤＰ−Ｄ−デソサミン及び３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ
(ＭＥＢ)(ライン３)とのインキュベーション(ＭＥＢ対照(ライン１)及びエリス ロマイシンＡ対照(ライン４)との比較)による生物活性試験のＴＬＣによる分析 を表している。点線は、B. pumilusについてのオートラジオグラムを用いて、抗
生物質活性を示す領域を表している。 図２０は、オレアンドマイシン生合成遺伝子の全クラスターをカバーする６つ
のコスミド(ｃｏｓＡＢ３５、ｃｏｓＡＢ７６、ｃｏｓＡＢ８７、ｃｏｓＡＢ６ ７、ｃｏｓＡＢ６３及びｃｏｓＡＢ６１)の局在性を表している。ｓｔｒＭ、Ｄ 、Ｅと記したプローブとハイブリダイズする制限断片ＢａｍＨＩ(Ｂと記してあ る)及びプローブｅｒｙＣＩＩＩとハイブリダイズするＢａｍＨＩ断片(３．５ｋ
ｂ及び２．７ｋｂ)を示してある。 図２１は、S.antibioticusにおけるオレアンドマイシン生合成遺伝子のクラス
ターの右部分の構成(種々のＯＲＦ(ｏｌｅＰ１、ｏｌｅＧ１、ｏｌｅＧ２、ｏｌ
ｅＭ、ｏｌｅＹ、ｏｌｅＰ及びｏｌｅＢと記してある)を矢印で示してある)並び
にプラスミドｐＣＯ３５−Ｓ及びｐＣＯ３５−Ｓから生成されたプラスミドｐＣ
Ｏ３のインサートの制限地図を表している。二重矢印は、図２２の配列に対応す
るインサートを示している(制限酵素の略号：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂｇ、ＢｇｌＩ Ｉ；Ｋ、ＫｐｎＩ；Ｓ、ＳａｃＩ；Ｓｈ、ＳｐｈＩ；星印は、それがユニーク部
位でないことを示している)。 図２２は、ｏｌｅＰ１、ｏｌｅＧ１、ｏｌｅＧ２、ｏｌｅＭ及びｏｌｅＹオレ
アンドマイシン生合成遺伝子をカバーする領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: １５の配列)及びそれらの演繹された蛋白質配列を表している。
【００９１】実施例１ ：エリスロマイシンの生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡ
ＩＩＩ領域のクローニング及び配列決定 特にＯＲＦ３〜９をカバーし、クローンλＳＥ５．５に対応するｅｒｍＥ遺伝
子の下流の＞２０ｋｂを有するSac. erythraeaＮＲＲＬ２３３８のゲノムＤＮＡ
断片並びにｅｒｍＥ遺伝子の３’末端から３．７〜８．０ｋｂの間に含まれるｅ
ｒｙクラスターの領域に対応しＯＲＦ３、４、５及び６を含む４．５ｋｂの断片
のヌクレオチド配列がHaydock等(1991)により記載された。
【００９２】 Haydock等(1991)により示された制限地図を考慮して、サブクローンをクロー ンλＳＥ５．５から制限断片をｐＵＣ１９中にサブクローン化することにより導
いた。こうして、プラスミドｐＫＢ２２、ｐＢＫ４４、ｐＢＩＩＳＢ及びｐＥｃ
ｏ２を、下記の仕方で図５Ａに従って生成した：
【００９３】 ＫｐｎＩ制限酵素により消化したクローンλＳＥ５．５のＤＮＡから、プラス
ミドｐＫ６２及びｐＫ６６を、５．８ｋｂのＫｐｎＩ断片のｐＵＣ１９中でのサ
ブクローニングにより直接構築した(プラスミドｐＫ６６は、ベクターに対して インサートを逆向きでサブクローン化した同じＫｐｎＩ断片に対応する)。次い で、２．９ｋｂのインサートを含むプラスミドｐＫＢ２２を、プラスミドｐＫ６
６から、ＯＲＦ８並びにＯＲＦ７及び９の部分をカバーするＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ
ＩＩ断片(２．９ｋｂ)のＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素消化による切り出し
により導いた。同様にして、２．９ｋｂのインサートを含むプラスミドｐＫＢ４
４をプラスミドｐＫ６２から、ＯＲＦ５及び６に対応するｅｒｙＧ遺伝子並びに
ＯＲＦ４に対応するｅｒｙＦ遺伝子をカバーするＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片( ２．９ｋｂ)の切り出しにより得た。
【００９４】 プラスミドｐＢＩＩＳＢを、プラスミドｐＢＫ４４から、ＳａｌＩ制限酵素で
消化したプラスミドｐＢＫ４４から得た６００ｂｐのＳａｌＩ断片のｐＵＣ１９
中でのサブクローン化により導いた(図５Ａ)。
【００９５】 ＥｃｏＲＩ制限酵素により消化したクローンλＳＥ５．５のＤＮＡから、プラ
スミドｐＥｃｏ２を、ＥｃｏＲＩ断片(２．２ｋｂ)のｐＵＣ１９中でのサブクロ
ーン化により直接構築した。
【００９６】 こうして得たサブクローンｐＫＢ２２、ｐＢＫ４４、ｐＢＩＩＳＢ及びｐＥｃ
ｏ２を、次いで、配列決定した。分析を、Quiagen100カラム(Quiagen)で前もっ て精製したプラスミド化ＤＮＡ試料につき、ＡＢＩプリズム３７７自動シーケン
サーにて行った。配列決定反応を、慣用のＭ１３プライマー又は合成プライマー
及び蛍光化ジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＴａｑＦＳポリメラーゼ(Perki
n Elmer)を用いるサンガー法(1977)により、５％ジメチルスルホキシドの存在下
で行い、用いた合成プライマーは、下記の配列を有した： Ｃ３Ｒ２ TCCTCGATGGAGACCTGCC (SEQ ID NO:２２) Ｂ２Ｒ１ GAGACCATGCCCAGGGAGT (SEQ ID NO:２３) Ｃ３Ｓ２ TCTGGGAGCCGCTCACCTT (SEQ ID NO:２４) Ｃ２Ｒ１ GACGAGGCCGAAGAGGTGG (SEQ ID NO:２５) Ｃ２Ｓ GCACACCGGAATGGATGCG (SEQ ID NO:２６) fullＣ３Ｓ CCGTCGAGCTCTGAGGTAA (SEQ ID NO:２７) fullＣ３Ｒ GCCCGAGCCGCACGTGCGT (SEQ ID NO:２８)及び Ｃ４ TGCACGCGCTGCTGCCGACC (SEQ ID NO:２９)。
【００９７】 配列データの編集を、オートアセンブラー(商標)ソフトウェアパッケージ(App
lied Biosystem)を用いて行った。これらの配列を、ソフトウェアのＧＣＧセッ ト(Devereux 1984)を用いて分析した。
【００９８】 得られたヌクレオチド配列は、図２の３４１２ｂｐのヌクレオチド配列(SEQ I
D NO:１の順行及び相補性配列)を確立させたが、その中に３つのＯＲＦ(７、８ 及び９)が、それぞれ、ヌクレオチド８９５７〜７９５９、１０２１９〜８９５ ７及び１１３１５〜１０２３３(図２では、ｅｒｍＥ遺伝子の５’末端に位置す るＢａｍＨＩ部位から番号付けしてある)に同定され(それぞれ、SEQ ID NO:１の
相補性配列、ヌクレオチド４８〜１０４６、１０４６〜２３０８及び２３２２〜
３４０４)、それぞれ、Liu及びThorson(1994)によるｅｒｙＢＩＩ、ｅｒｙＣＩ ＩＩ及びｅｒｙＣＩＩ遺伝子(これらの機能的特性表示は、未だ同定されていな かった)に対応している。これら３つのＯＲＦ７、８及び９は、同じ向きを有し 、読みは、ｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子の３’領域から行われる。
【００９９】 上記のＯＲＦのコード領域を含む大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの試料を、Collecti
on Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25
,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCEに、１９９７年７月１６日
に寄託した： − ＯＲＦ７、ＯＲＦ８及びＯＲＦ９の部分のコード配列を含むプラスミドｐＫ
６２を番号Ｉ−１８９７で寄託、 − ＯＲＦ９及びＯＲＦ８の部分のコード配列を含むプラスミドｐＥｃｏ２を番
号Ｉ−１８９９で寄託。
【０１００】実施例２ ：プラスミドｐＢＩＩΔの構築 ＯＲＦ７をコードするｅｒｙＢＩＩ遺伝子中に欠失を有するｐＢＩＩΔと呼ば
れる組込み型プラスミドを、図６Ａの図式に従って構築した。
【０１０１】 実施例１で得たプラスミドｐＫ６２中の５９８ｂｐのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩ断
片を、ＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩ酵素での消化により欠失させた。その結果生成し
たプラスミドｐＢＣＫ１を、次いで、図２の配列のヌクレオチド８０１１〜８８
６３のＯＲＦ７内の８５３ｂｐを欠失するようにＭｌｕＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵
素で消化した。これらの末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて埋
めた後に、この欠失を含むプラスミドを連結して大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ中にト
ランスフォームした。こうして生成したプラスミドｐ１９ＢＩＩΔから、この欠
失を有するＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片(４．３ｋｂ)を、プラスミドｐＵＷＬ
２１８中にサブクローン化した(図６Ｂ)。こうして生成したプラスミドｐＢＩＩ
Δ(図６Ｃ)中のヌクレオチド８０１１〜８８６３の８５３ｂｐの欠失の存在を、
配列決定により確認した。このプラスミドｐＢＩＩΔを、次いで、大腸菌ＤＨ５
αＭＲＣ株中に移し、その後、Sac. erythraeaをトランスフォームするのに用い
た。
【０１０２】実施例３ ：Sac. erythraea ｅｒｙＢＩＩΔ株(ＢＩＩ９２)の構築 ｅｒｙＢＩＩ遺伝子が実施例２で作製したプラスミドｐＢＩＩΔ中に導入した
ような内部欠失を有するSac. erythraea株の構築及びインテグレーションプロセ
スを下記の仕方で行った：
【０１０３】 プロトプラストの調製を、Weber及びLosick(1988)により記載された方法に従 って、記載されたＰＥＧ１０００の代わりのＰＥＧ３３５０(Sigma)及びＰ、Ｌ 又はＴ緩衝液の代わりのＭｇＣｌ2を含みＰＯ4Ｈ2Ｋを含まない改変Ｐ緩衝液(Ｐ
Ｔと呼ばれる)を用いて、下記の操作条件に従って行った：
【０１０４】 Sac. erythraea「レッドバリアント」(その試料を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCEに、１９９７年７月１６日に、番号Ｉ−１ ９０２で寄託した)の細胞(少なくとも１０8の芽胞)を５０ｍｌのＴＢＳ培地にて
３〜５日間、３０℃で成長させ、その後、１０．３％ショ糖で洗った。これらの
細胞を、２〜５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム(Sigma)を含む５０ｍｌのＰＴ緩衝液中 に再懸濁させ、次いで、３０℃で、１〜２時間インキュベートした(菌糸体マス 非分離で、菌糸体の少なくとも５０％がプロトプラストに変換されるまで)。こ れらのプロトプラストを、５０ｍｌのＰＴ緩衝液で洗い、同緩衝液１２．５〜２
５ｍｌに再懸濁させ、ゆっくり凍結させてから−８０℃に２００μｌのアリコー
トで保存した。
【０１０５】 トランスフォーメーションのために、一のアリコートを解凍して、５０μｌを
取り出し、次いで、１５ｍｌの試験管に移した。１〜１０μｇのプラスミドＤＮ
ＡｐＢＩＩΔ(実施例２で大腸菌ＤＨ５αＭＲＣ株から調製)を、５〜１０μｌの
ＴＥ緩衝液(１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に溶解さ
せ、次いで、傾けた試験管壁に付着させ、それに２×ＰＴ緩衝液中で１／２に希
釈する５０％水溶液から即座に調製したＰＴ緩衝液中のＰＥＧ３３５０溶液０．
５ｍｌを加えた。３〜５ｍｌのＰＴ緩衝液での希釈とその後の２５００ｒｐｍで
１５分間の遠心分離の後に、ペレットを０．５ｍｌのＰＴ緩衝液中に解離させ、
こうして得られたトランスフォームされたプロトプラストの懸濁液を直ちに２〜
３の非常に乾燥したＲ２Ｔ２ディッシュ上に分配する(層流フード中で３時間)。
これらのディッシュを、次いで、３２℃で１６〜２４時間、プロトプラストの再
生フィルムが現れるまでインキュベートした。ＤＭＳＯ中の５０ｍｇ／ｍｌのチ
オストレプトン(Sigma)のストック溶液から適当量を０．５〜１ｍｌの水で希釈 してから、これらのディッシュ上に、ゲロース１ｍｌ当たり２０μｇのチオスト
レプトンの終濃度になるように噴霧した。抗生物質の完全な吸収の後に、これら
のディッシュを３２℃で３〜４日間インキュベートして、これらのトランスフォ
ーマントを可視化した。これらのディッシュを更に数日間、芽胞が完全に発生す
るまでインキュベートした。
【０１０６】 最初の組換え事象(図４)に対応するインテグラントの選択を、胞子形成したデ
ィッシュのビロードを用いる複製により又は芽胞の懸濁液をチオストレプトンを
含むＲ２Ｔ２ディッシュ上に広げてから、潜在的インテグラントのクローンを成
長させる３２℃でのインキュベーションにより行った。
【０１０７】 第二の組換え事象(図４)を受けたクローンの選択のために、上で得られた５〜
１０のチオストレプトン耐性クローンを、８ｍｌのＴＳＢ液体培地中で、３０℃
で３〜４日間培養した。５０〜１００μｌを取り出して同じ条件下で再培養した
。チオストレプトン耐性マーカーの喪失を促進することを意図した希釈と培養の
４連続サイクルの後に、これらの細胞から上に示したようにプロトプラストを、
プラスミドを放出するように調製した。次いで、これらのプロトプラストを、個
別化されたコロニーを得るように、Ｒ２Ｔ２ディッシュ上に広げ、それらのチオ
ストレプトンに対する感受性を、チオストレプトンを含むＲ２Ｔ２ディッシュ上
での複製により測定した。
【０１０８】 第二の組換え事象の欠失部位に対する位置に依って(図４)、チオストレプトン
に感受性のコロニーの表現型が野生型であるか又は欠失を有する変異型であるこ
とが予想され得る。
【０１０９】 チオストレプトンに感受性のコロニーの内で、ｅｒｙ-の表現型を有する変異 体の選択を、エリスロマイシンに感受性であるB. pumilusＡＴＣＣ１４８８４株
についての抗生物質に対する細菌の感受性の記録によって、行った。このB. pum
ilus株を、抗生物質に対する細菌の感受性の記録による生物学的試験においてエ
リスロマイシンの産生を評価するための指標株として用いた。これらのコロニー
を、白金耳を用いてＲ２Ｔ２ディッシュ上に広げ、次いで、３０℃で３〜４日間
インキュベートした。次いで、変異体が集密的に成長したこれらの寒天領域をパ
ンチを用いて取り出して、B. pumilusの芽胞の懸濁液を接種した０．５×ＡＭｅ
ｒｃｋ(抗生物質寒天Ｎｏ．１Ｍｅｒｃｋ)の４ｍｌの上層で被覆したＡ−Ｍｅｒ
ｃｋディッシュ上に置き、その後、３７℃に一晩インキュベートした。
【０１１０】 次いで、この変異体の染色体中の予想される欠失(図２のヌクレオチド８０１ １〜８８６３の８５３ｂｐの欠失)の存在を、サザーンブロットを用いるゲノム 分析並びに下記の様式のＰＣＲによって確認した：
【０１１１】 サザーンブロットによる分析のために、適当な制限酵素で予め消化したゲノム
ＤＮＡのジーンスクリーンプラス(Dupont NEN)膜上への移送を、Ausubel等(1995
)に従って、０．４Ｎ ＮａＯＨ中で行った。これらのハイブリダイゼーション を、Sambrook等(1989)に従って、[γ32Ｐ]ＡＴＰ(Amersham)及びポリヌクレオチ
ドキナーゼ(Boehringer Mannheim)を用いて５’末端を標識した下記の配列を有 するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて行った： Ｂ２−Ｓ TTGGCGAAGTCGACCAGGTC (SEQ ID NO:３０) (ＥＭＢＬベースに参照番号Ｘ６０３７９で寄託されHaydock等(1991)により記載
された配列の４１１８〜４１３７位に位置するｅｒｙＧ遺伝子の開始のＤＮＡ領
域に対応する)。これらのハイブリダイゼーションを、迅速ハイブリダイゼーシ ョン緩衝液(Amersham)及び次の洗浄条件を用いて行った：２×５分間、２×ＳＳ
Ｃ、２０℃；３０分間、２×ＳＳＣ、６５℃；３０分間、０．１×ＳＳＣ、２０
℃。
【０１１２】 Hopwood等(1985)に従って単離し、その後、ＫｐｎＩ制限酵素により消化した ゲノムＤＮＡについてのサザーンハイブリダイゼーションにより、「レッドバリ
アント」野生型株からの５．８ｋｂのバンド及び変異体ＢＩＩ９２からの４．９
ｋｂのバンドが検出された。図１５に示したこれらの結果は、この変異体中のこ
の染色体領域における約９００ｂｐの欠失の存在を示している。
【０１１３】 ＰＣＲによる分析のために、ＴＳＢ培地での３日培養の試料１００μｌを遠心
分離した。得られたペレットを１０μｌのＴＳＢ培地に再懸濁し、その後、ｇｅ
ｎＡｍｐＰＣＲシステム９６００装置(Perkin Elmer Cetus)での増幅に用いた。
この試料を３分間９４℃に加熱した後に、次の増幅条件を用い：９４℃、１分間
；５５℃、１分間；７２℃、３分間；３０サイクル；ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラ
ーゼ(Perkin Elmer)(１０％ジメチルスルホキシド(ｖ／ｖ)の存在下)、その後、
７２℃で３分間の伸長を行った。この増幅を、上記のオリゴヌクレオチドＢ２Ｓ
及び下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて行った： Ｂ２−Ｒ GCCGCTCGGCACGGTGAACTTCA (SEQ ID NO:３１) (５’末端に３つのヌクレオチドを加えた図２の配列の８８７３〜８８９２位に 位置するＤＮＡ領域の相補鎖の配列に対応し、ＯＲＦ７に内部欠失を有する領域
のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)。
【０１１４】 全細胞についてのＰＣＲ増幅による分析は、野生型株において約１ｋｂのバン
ドを、変異体ＢＩＩ９２において０．１６ｋｂのバンドを、プラスミドｐＢＩＩ
Δを用いて得られたシグナルと同じ様式で検出した。図１６に示したこれらの結
果は、サザーン分析により検出された約９００ｂｐの欠失がプラスミドｐＢＩＩ
Δにより運ばれるもの(８５３ｂｐ)と同じであることを確認した。
【０１１５】 こうして得られた組換え株(ＢＩＩ９２と呼ぶ)を、次いで、この株により生成
される代謝産物を同定するために培養した。
【０１１６】実施例４ ：ＢＩＩ９２株の発酵及び生成された二次代謝産物の同定 この株の肉汁培養培地の抽出物を、エリスロマイシンＡ、エリスロマイシンＢ
及び３−α−ミカロシルエリスロノリドＢを標準として薄層クロマトグラフィー
(ＴＬＣ)により分析した。
【０１１７】 ＢＩＩ９２株を、５０ｍｌ三角フラスコ内で、エリスロマイシンＡ及びその誘
導体の最適生成を与える条件下で培養した。それは、細胞の予備培養を、ＥＰ１
培地(ソルリスＬ−コーンスティープリカー(Roquette freres)５ｇ／ｌ；脱脂し
た大豆粉末(Cargill)１０ｇ／ｌ；ＣＯ3Ｃａ２ｇ／ｌ；ＮａＣｌ５ｇ／ｌ；ｐＨ
＝６．８；グルコースｓｑｆ１５ｇ／ｌ(オートクレーブ後添加))中で、２８℃ で４８時間行うことと、その後の、ＥＰ２培地(脱脂した大豆粉末１０ｇ／ｌ； ＣＯ3Ｃａ０．２ｇ／ｌ；Ｃｌ2Ｃｏ−６Ｈ2Ｏ１ｍｇ／ｌ；ｐＨ＝６．８〜７． ０；グルコースｓｑｆ２０ｇ／ｌ(オートクレーブ後添加))での７％ｖ／ｖへの 希釈後の７２時間の培養からなる。
【０１１８】 次いで、この培養上清を、ｐＨ９〜１０で、酢酸エチルで抽出した。有機相を
ＭｇＳＯ4上で乾燥し、減圧下で乾燥してから、６０Ｆ２５４シリカゲル(Merck)
上のでＴＬＣ[ジクロロメタン／メタノール(９０：１０、ｖ／ｖ)又はイソプロ ピルエーテル／メタノール／２５％ＮＨ4ＯＨ(７５：３５：２、ｖ／ｖ)]により
分析した。或いは、この分析を、ＮＨ2Ｆ２５４型の結合シリカゲルプレート(Me
rck)上でのＴＬＣ[塩化ブチル／メタノール(９０：１０、ｖ／ｖ)]により行った
。
【０１１９】 これらのプレートの化学的暴露を、ｐ−アニスアルデヒド−９８％硫酸−エタ
ノール(１：１：９、ｖ／ｖ)溶液の噴霧化とその後数分間の８０℃での加熱によ
り行った。潜在的抗生物質活性を、ＴＬＣプレートの、B. pumilusＡＴＣＣ１４
８８４を接種した寒天上での直接バイオオートグラフィーにより分析した。
【０１２０】 化学的暴露により得られた結果(図１７)は、ＢＩＩ９２株が、ｅｒｙＢ変異体
に期待されるように、優先的にエリスロマイシンＢを蓄積することを示している
。
【０１２１】 抗生物質活性を示す低移動度の少しの代謝産物も検出された。これらの代謝産
物を、酢酸エチルで抽出して、質量分析法と結合した逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)により同定した。ＲＰ−ＨＰＬＣを、Kromasil C18５
μのカラム(２５０×４．６ｍｍ)にて、アセトニトリル／メタノール／酢酸アン
モニウム０．０６５Ｍ ｐＨ６．７混合物(３５０：１５０：５００、ｖ／ｖ)を
移動相として用いて、ＦｉｎｎｉｎｇａｎＴＳＱ７０００質量分析機を備えたＷ
ａｔｅｒｓクロマトグラフにて行った。
【０１２２】 エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの証跡と並んで、Ｍ１〜Ｍ４と呼ばれる４
つの少量の代謝産物が検出された： − Ｍ１は、ｍ／ｚ７０４に親ピークを、ｍ／ｚ５７６とｍ／ｚ１５８に断片化
生成物を生じる。デサミニル−エリスロノリドＡ(ｍ／ｚ５７６)の存在は、ｍ／
ｚの、エリスロマイシンＡ(ｍ／ｚ７３４)と比べての３０の差又はエリスロマイ
シンＣ(ｍ／ｚ７２０)と比べての１６の差が、中性糖残基により運ばれることを
示している。Ｍ１について提案される構造は、３”−Ｃデスメチル−２”，３”
−エン−エリスロマイシンＣである。 − Ｍ２は、ｍ／ｚ７０６に親ピークを、ｍ／ｚ５７６とｍ／ｚ１５８に断片化
生成物を生じる。デサミニル−エリスロノリドＡ(ｍ／ｚ５７６)の存在は、ｍ／
ｚの、エリスロマイシンＡ(ｍ／ｚ７３４)と比べての２８の差又はエリスロマイ
シンＣ(ｍ／ｚ７２０)と比べての１４の差が、中性糖残基により運ばれることを
示している。Ｍ２について提案される構造は、３”−Ｃデスメチル−エリスロマ
イシンＣである。 − Ｍ３は、ｍ／ｚ６９０に親ピークを、ｍ／ｚ５６０とｍ／ｚ１５８に断片化
生成物を生じる。デサミニル−エリスロノリドＢ(ｍ／ｚ５６０)の存在は、ｍ／
ｚの、エリスロマイシンＢ(ｍ／ｚ７１８)と比べての２８の差又はエリスロマイ
シンＤ(ｍ／ｚ７０４)と比べての１４の差が、中性糖残基により運ばれることを
示している。Ｍ３について提案される構造は、３”−Ｃデスメチル−エリスロマ
イシンＤである。 − Ｍ４は、ｍ／ｚ７２０に親ピークを、ｍ／ｚ５７６とｍ／ｚ１５８に断片化
生成物を生じる。このプロフィルは、デソサミニルエリスロノリドＡ(ｍ／ｚ５ ７６)の存在とアミノ化糖残基の消失を伴うエリスロマイシンＣ(ｍ／ｚ７２０) のものと同じであるが、代謝産物Ｍ４は、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいてエリスロマイ
シンと同じ滞留間を有しない。Ｍ４について提案される構造は、３”−Ｃデスメ
チル−エリスロマイシンＡである。
【０１２３】 不飽和中性糖を有する少量代謝産物Ｍ１(３”−Ｃデスメチル−２”，３”− エン−エリスロマイシンＣ)のＭＳ−ＭＳによる検出は、ｄＴＤＰ−ミカロース の生合成経路において、ｅｒｙＢＩＩ遺伝子がｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デ
オキシヘキソース２，３−レダクターゼをコードすることを示す。 ＢＩＩ９２株を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNC
M) INSTITUTE PASTEUR, 25,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCE
に、１９９７年７月１６日に、番号Ｉ−１９０３で寄託した。
【０１２４】実施例５ ：プラスミドｐＣＩＩＩΔの構築 ＯＲＦ８は、翻訳において、下流に位置するＯＲＦ７と結合され得る(極性効 果を回避するために、同相(in phase)欠失を導入した)。かかる欠失を運ぶｐＣ ＩＩＩΔと呼ばれる組込みプラスミドを、図７(Ａ〜Ｄ)の図式に従って構築した
。
【０１２５】 プラスミドｐｄｅ１８８(図７Ａ)を生成するために、ＯＲＦ８中に、６６３ｂ
ｐのＳａｌＩ欠失を、図２の配列のヌクレオチド９３８４〜１００４６に、実施
例１で得たプラスミドｐＢＫ４４から単離した２つのＳａｌＩ断片(図５Ａに示 したａ：７９４ｂｐ及びｂ：６３１ｂｐ)をプラスミドｐＵＣ１９中にサブクロ ーン化することにより導入した。この６６３ｂｐの欠失の存在を、配列決定によ
り確認した。次いで、このプラスミドｐｄｅ１８８を、欠失部位の両側の相同組
換えに利用できる染色体領域を広げるように、更なる２つのサブクローニングに
かけた。先ず、プラスミドｐｄｅ１８８Ａ(図７Ｂ)を生成するために、プラスミ
ドｐｄｅ１８８のＳａｃＩ断片(４５０ｂｐ)を、実施例１で得られたプラスミド
ｐＥｃｏ２のＳａｃＩ断片(１．１ｋｂ)により置き換えた。次いで、ＯＲＦ８中
に欠失を有するＥｃｏＲＩ断片(１．５ｋｂ)を、プラスミドｐｄｅ１８８Ａから
単離してプラスミドｐＯＢＢ中の完全なＯＲＦを有するＥｃｏＲＩ断片(１．６ ６ｋｂ)を置き換えるのに用いた。図７Ｃに表示したプラスミドｐＯＢＢは、実 施例１で調製したプラスミドｐＢＫ４４に対応し、そのＰｓｔＩ部位には、スト
レプトミセス複製起点並びにチオストレプトン耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＩ
Ｊ４８６の４ｋｂのＰｓｔＩ断片(ＰｓｔＩ制限酵素消化により得られたもの)が
サブクローン化された。合成されたプラスミドｐＣＩＩＩΔは、欠失部位の上流
及び下流にそれぞれ１．２７ｋｂ及び１．３８ｋｂの相同組換えのための染色体
領域を有する。こうして得られたプラスミドｐＣＩＩＩΔ(図７Ｄ)を、次いで、
大腸菌ＤＨ５αＭＲＣ株中に移してから、Sac. erythraeaをトランスフォームす
るために用いた。
【０１２６】実施例６ ：Sac. erythraeaｅｒｙＣＩＩＩΔ株(ＣＩＩＩ６８)の構築 ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子が実施例５で得られたプラスミドｐＣＩＩＩΔ中に導入
されたような内部欠失を有する株を、Sac. erythraeaのプロトプラストのプラス
ミドｐＣＩＩＩΔでのトランスフォーメーションにより調製した。
【０１２７】 プロトプラストの調製、組込みプロセス及びｅｒｙ-表現型を有する変異体の 選択は、実施例３と同様にして行った。
【０１２８】 更に、染色体中に予想される欠失(図２の配列のヌクレオチド９３８４〜１０ ０４６の６６３ｂｐの欠失)の存在を、実施例３に記載した条件に従うサザーン ブロット並びにＰＣＲ増幅によるゲノム分析により確認した。
【０１２９】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＥｃｏＲＩ制
限酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼーションを
用いて、野生型株から２．２ｋｂのバンド及び変異体ＣＩＩＩ６８から１．５ｋ
ｂのバンドが検出された： Ｃ３−Ｓ ATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG (SEQ ID NO:３２) (図２の配列の１０１９６〜１０２１９位に位置するＤＮＡ領域の相補鎖に対応 する)。図１５に示した結果は、この変異体において、染色体のこの位置に約７ ００ｂｐの欠失が存在することを示している。
【０１３０】 ＰＣＲ増幅を、上記のオリゴヌクレオチドＣ３−Ｓ及び下記の配列を有するオ
リゴヌクレオチドを用いて行った Ｃ３−Ｒ TCATCGTGGTTCTCTCCTTCC (SEQ ID NO:３３) (図２の配列の８９５４〜８９７４位に位置する配列に対応し、ＯＲＦ８に内部 欠失を有する領域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)。ＰＣＲ増幅 による分析は、ｐＢＩＩデルタで得られたシグナルと同じ様式で、野生型株にお
いて約１．２ｋｂのバンドを及び変異体ＣＩＩＩ６８において約０．６ｋｂのバ
ンドを検出を与えた。図１６に示した結果は、サザーン分析により検出された約
７００ｂｐの欠失がプラスミドｐＣＩＩＩΔにより運ばれたもの(６３３ｂｐ)と
同じであることを確認した。
【０１３１】 こうして得られた組換え株(ＣＩＩＩ６８と呼ばれる)を、次いで、この株によ
り生成される代謝産物を同定するために培養した。
【０１３２】実施例７ ：ＣＩＩＩ６８株の発酵及び生成された二次代謝産物の同定 ＣＩＩＩ６８株の培養及びＴＬＣとその後のバイオオートグラフィーによる分
析を実施例４に示した条件に従って行った。
【０１３３】 これらのＴＬＣの結果(図１７)は、ＣＩＩ６８株が、ｅｒｙＣ変異体に予想さ
れるように、優先的に、３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ並びに少量のエリ
スロノリドＢを蓄積することを示している。
【０１３４】 ｅｒｙＣＩＩＩ配列は、他の推定のグルコシルトランスフェラーゼ例えばS. p
euceticus(Otten等、1995)及びStreptomyces sp C5 (Dickens等、1996)における
ダウノルビシンの生合成に関与するＤａｕＨ(蛋白質レベルで４３％同一性)及び
ＤｎｒＳ(４７％同一性)並びにS. fradiae中でのチロシンの生合成経路における
ミカミノースのチラクトン上への移送に関与するＴｙｌＭ２(５０％同一性)と強
い相同性を有する(Gandecha等、1997)。
【０１３５】 これらの観察は、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子がエリスロマイシンの生合成経路にお
けるデソサミニルトランスフェラーゼをコードすることを示す。
【０１３６】実施例８ ：プラスミドｐＣＩＩΔの構築 ｐＣＩＩΔと呼ばれ且つＯＲＦ９をコードするｅｒｙＢＩＩ遺伝子中に欠失を
有する組込みプラスミドを、図８Ａの図式に従って構築した。
【０１３７】 プラスミドｐＫ２３(図５Ａ)を、ＫｐｎＩ制限酵素により消化したクローンλ
ＳＥ５．５のＤＮＡから単離された１０ｋｂのＫｐｎＩ断片をｐＵＣ１９中にサ
ブクローニングすることにより得た。
【０１３８】 先ず第一に、図８Ｂに示したシャトルベクターｐＯＲＴ１を、チオストレプト
ン耐性遺伝子及びストレプトミセスレプリコンを含むプラスミドｐＩＪ４８６の
ＰｓｔＩ制限酵素での消化により単離した４ｋｂのＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１９の
ＰｓｔＩ部位にサブクローニングすることにより得た。
【０１３９】 ３０４ｂｐの相外(out-of-phase)欠失を、ＯＲＦ９中に、図２の配列のヌクレ
オチド１０８８１〜１１１８４に、プラスミドｐＫ２３のＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断
片(１．１ｋｂ)を、実施例１で得たプラスミドｐＥｃｏ２のＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ
Ｉ断片(１．７ｋｂ)と共に、予めＳａｃＩとＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した上記
のプラスミドｐＯＲＴ１中にサブクローニングすることにより導入した。こうし
て得られた組込みプラスミドｐＣＩＩ(図８Ｃ)を、次いで、大腸菌ＤＨ５αＭＲ
Ｃ株中に移してからSac. erythraeaをトランスフォームするのに用いた。
【０１４０】実施例９ ：Sac. erythraeaｅｒｙＣＩＩΔ株(ＣＩＩ６２)の構築 ｅｒｙＣＩＩ遺伝子が実施例８で得たプラスミドｐＣＩＩΔに導入したような
内部欠失を有する株を、Sac. erythraeaのプロトプラストをプラスミドｐＣＩＩ
Δを用いてトランスフォームすることにより調製した。
【０１４１】 これらのプロトプラストの調製、組込みプロセス及びｅｒｙ-表現型を有する 変異体の選択は、実施例３のようにして行った。
【０１４２】 更に、染色体中に予想される欠失(図２の配列のヌクレオチド１０８８１〜１ １１８４の３０４ｂｐ)の存在を、実施例３に記載した条件に従うサザーンブロ ット並びにＰＣＲによるゲノム分析により確認した。
【０１４３】 上記の配列を有するオリゴヌクレオチドＣ３−Ｓをプローブとして用いるＥｃ
ｏＲＩ制限酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼー
ションを用いて、２．２ｋｂのバンドが野生型株から、１．８ｋｂのバンドが変
異体ＣＩＩ６２から検出された。図１５に示したこれらの結果は、変異体におけ
る染色体のこの領域内の約４００ｂｐの欠失の存在を示している。
【０１４４】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチド Ｃ２−Ｓ GGAATTCATGACCACGACCGATC (SEQ ID NO:３４) (参照番号Ｘ６２５６９でＥＭＢＬベースに寄託され、Bevitt等、1992により記 載された配列の２０２５８〜２０２８０位に位置するｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子の末
端のＤＮＡ領域の相補鎖に対応する)及び下記の配列 Ｃ２−Ｒ CGCTCCAGGTGCAATGCCGGGTGCAGGC (SEQ ID NO:３５) (図２の配列の１０５５８〜１０５８５位に位置する配列に対応し、ＯＲＦ９に 内部欠失を有する領域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)を有する オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅による分析は、プ
ラスミドｐＣＩＩΔで得られたシグナルと同じ様式で、野生型株において約７６
０ｂｐのバンドを、変異体ＣＩＩ６２において約４６０ｂｐのバンドの検出を与
えた。図１６に示した結果は、サザーン分析により検出された約４００ｂｐの欠
失がプラスミドｐＣＩＩΔにより運ばれたもの(３０４ｂｐ)と同じであることを
確認した。
【０１４５】 こうして得られた組換え株(ＣＩＩ６２と呼ばれる)を、次いで、この株により
生成される代謝産物を同定するために培養した。
【０１４６】実施例１０ ：ＣＩＩ６２株の発酵及び生成された二次代謝産物の同定 ＣＩＩ株の培養及びＴＬＣとその後のバイオオートグラフィーによる分析を、
実施例４に示した条件に従って行った。
【０１４７】 これらのＴＬＣの結果(図１７)は、ＣＩＩ６２株が、ｅｒｙＣ変異体に予想さ
れるように、優先的に３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ並びに少量のエリス
ロノリドＢを蓄積することを示している。
【０１４８】 ｅｒｙＣＩＩ配列は、ダウノサミン(ＤｎｒＱ、蛋白質レベルで３８％同一性 、Otten等、1995)及びミカミノース(ＯＲＦ１*によりコードされる蛋白質、蛋白
質レベルで４０％同一性、Gandecha等、1997)の生合成経路に関与する遺伝子(ケ
ト基を隣接する炭素から３位に移すのにも必要である)と強い相同性を有する。
【０１４９】 これらの観察は、ｅｒｙＣＩＩ遺伝子が、ｄＴＤＰ−デソサミンの生合成経路
におけるｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラー
ゼをコードすることを示している。
【０１５０】実施例１１ ：エリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＡＩ−ｅｒｙ
Ｋ領域のクローニング及び配列決定 ｅｒｙ遺伝子のクラスターのｅｒｙＡＩ−ｅｒｙＫ領域を含むコスミド例えば
コスミドＣｏｓ６Ｂを、コスミドベクターｐＷＥ１５(Stratagene)中のSac. ery
thraeaのゲノムＤＮＡライブラリーを、ｅｒｙＡＩ遺伝子の全体を含む１３．２
ｋｂのプローブＤＮＡ断片(図３の配列の４４３８２位に位置するＮｃｏＩ部位 とＸ６２５６９配列(Bevitt等、1992)の３９２位に位置するＮｃｏＩ部位との間
に含まれるＤＮＡ領域に対応する)を用いてスクリーニングすることにより単離 した。このプローブを、次の仕方で調製した：先ず、１３．２ｋｂのＮｃｏＩ断
片をBevitt等、1992に記載されたプラスミドｐＢＫ２５から単離し、ＮｃｏＩ末
端をクレノー断片を用いて埋めた後にｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位中にサブクロー
ニングした。こうして生成したプラスミドｐＮＣＯ１２から、１３．２ｋｂの断
片を、ＮｃｏＩ制限酵素での消化により単離した。
【０１５１】 こうして得たコスミドｃｏｓ６Ｂを、ＮｃｏＩ制限酵素により消化し、生成し
た２．８ｋｂ及び６．１ｋｂの断片をベクターＬｉｔｍｕｓ２８のＮｃｏＩ部位
にクローン化して、それぞれ、図５Ｂに示したプラスミドｐＮＣＯ２８及びｐＮ
ＣＯ６２を生成した。
【０１５２】 プラスミドｐＮＣＯ２８を、Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅキット(Promega)の供 給業者の指示に従って、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いてサブクローンを生成
することにより、それぞれ逆向きに、制限酵素ＳａｃＩ／ＸｂａＩ及びＮｓｉＩ
／ＢａｍＨＩでの消化により配列決定した。この配列を、下記の配列を有する合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて完成させた ６４４ GATCACGCTCTTCGAGCGGCAG (SEQ ID NO:３６) ６４５ GAACTCGGTGGAGTCGATGTC (SEQ ID NO:３７)及び ６５０ GTTGTCGATCAAGACCCGCAC (SEQ ID NO:３８)。
【０１５３】 プラスミドｐＮＣＯ６２の配列決定のために、テンプレートをBankier等(1987
)に従ってＤＮＡの超音波処理によりプライマーとしてｐＵＣ１８例えばベクタ ーを用いて生成した。この配列を、下記の配列を有する合成オリゴヌクレオチド
を用いて完成させた： ６４６ CATCGTCAAGGAGTTCGACGGT (SEQ ID NO:３９) ６４７ TGCGCAGGTCCATGTTCACCACGTT (SEQ ID NO:４０) ６４８ GCTACGCCCTGGAGAGCCTG (SEQ ID NO:４１) ６４９ GTCGCGGTCGGAGAGCACGAC (SEQ ID NO:４２)及び ８７４ GCCAGCTCGGCGACGTCCATC (SEQ ID NO:４３)。
【０１５４】 ＮｃｏＩ接合部を、上で得たコスミドｃｏｓ６ＢのＤＮＡをテンプレートとし
て用いて配列決定した(ＮｃｏＩ部位をカバーするその領域を上記の配列６４４ 及び６４５を有するプライマーを用いて配列決定した)。
【０１５５】 更に、０．９ｋｂのＣｌａＩ−ＮｃｏＩ断片(ｅｒｙＡＩ遺伝子の配列の出発 点とＯＲＦ１３の５’部分を含む)をｐＵＣ１８中にクローン化した。この断片 を、次の仕方で調製した：図５Ｂに表示したプラスミドｐＢＫ６−１２を、Bevi
tt等、1992に記載されたプラスミドｐＢＫ２５から単離した４．５ｋｂのＫｐｎ
Ｉ断片をファージミドｐＴＺ１８Ｒ中にサブクローニングすることにより最初に
生成した。次いで、サブクローンｐＣＮ９を、プラスミドｐＢＫ６−１２から単
離した０．９ｋｂのＣｌａＩ−ＮｃｏＩ断片のｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位中のサ
ブクローニングにより生成した(クレノー断片を用いて末端を埋めた後に)。こう
して得たプラスミドｐＣＮ９(図５Ｂ)を配列決定した。テンプレートを、Bankie
r等(1987)に従って、ｐＵＣ１８をベクターとして用いて、ＤＮＡの超音波処理 により生成した。
【０１５６】 この配列を、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて
完成させた： ８７５ CGACGAGGTCGTGCATCAG (SEQ ID NO:４４) 。
【０１５７】 このＤＮＡの配列決定を、サンガー法(1977)により自動シーケンサーを用いて
二本鎖ＤＮＡテンプレートについてApplied Biosystem 373 A シーケンサーを用
いて行った。配列データの編集は、ＳＡＰソフトウェア(Staden, 1984)を用いて
行った。これらの配列を、ＧＣＧソフトウェア(Devereux, 1984)を用いて分析し
た。
【０１５８】 得られたヌクレオチド配列は、図３の８１６０ｂｐのヌクレオチド配列(SEQ I
D NO:６の配列)を確立することを可能にしたが、この配列中には、７つのＯＲＦ
(１３−１９)が、それぞれ、ヌクレオチド４３８４１〜４４８０６、４４８０９
〜４６０５３、４６１０９〜４６８１９、４６９０７〜４８４３６、４８４３６
〜４９６３８、４９６７９〜５１１４５及び５１１７７〜５１７５５に同定され
(図３でｅｒｍＥ遺伝子の５’末端に位置するＢａｍＨＩ部位から番号付けした)
(それぞれ、SEQ ID NO:６の配列のヌクレオチド２４２〜１２０７、１２１０〜 ２４５４、２５１０〜３２２０、３３０８〜４８３７、４８３７〜６０３９、６
０８０〜７５４６及び７５７８〜８１５６である)、それぞれ、ｅｒｙＢＩＶ、 ｅｒｙＢＶ、ｅｒｙＣＶＩ、ｅｒｙＢＶＩ、ｅｒｙＣＩＶ、ｅｒｙＣＶ及びｅｒ
ｙＢＶＩＩ遺伝子に対応する(Liu及びThorson(1994)によるが、これらの機能的 特性決定は、未だ、同定されていなかった)。これらの７つのＯＲＦ(１３−１９
)は、同じ向きにあり、読みは、ｅｒｙＡＩ遺伝子の５’領域から行われる。
【０１５９】 上記のＯＲＦのコード領域を含む大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの試料を、Collecti
on Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25
,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCEに、１９９７年７月１６日
に寄託した： − ＯＲＦ１３及びＯＲＦ１４の部分のコード領域を含むプラスミドｐＢＫ６−
１２(番号Ｉ−１８９８) − ＯＲＦ１４及び１５並びにＯＲＦ１３と１６の部分のコード領域を含むプラ
スミドｐＮＣＯ２８(番号Ｉ−１９０１)及び − ＯＲＦ１７、１８及び１９並びにＯＲＦ１６の部分のコード配列を含むプラ
スミドｐＮＣＯ６２(番号Ｉ−１９００)。
【０１６０】実施例１２ ：プラスミドｐＢＩＶΔの構築 ＯＲＦ１３は、翻訳において、下流に位置するＯＲＦ１４に結合されるので、
同相欠失を導入しなければならなかった。ｐＢＩＶΔと呼ばれ、この欠失を運ぶ
組込みプラスミドを、図９Ａの図式に従って構築した。
【０１６１】 プラスミドｐＰＳＰ４(図５Ｂ)を、先ず、実施例１１で得たプラスミドｐＢＫ
６−１２から単離したＰｖｕＩＩ−ＳｐｅＩ断片(２．７ｋｂ)と実施例１１で得
たプラスミドｐＮＣＯ２８から単離したＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ断片(１．６ｋｂ)を
予めＳｍａＩ及びＰｓｔＩ制限酵素を用いて消化したベクターｐＵＣ１９中にサ
ブクローニングすることにより構築した。
【０１６２】 プラスミドｐＰＳＰ４から、プラスミドｐＢＩＶΔを、ＯＲＦ１３の内部に５
１０ｂｐのＢｃｌＩ−ＮｃｏＩ断片を欠失させ且つ５４ｂｐの合成アダプターか
ら生じた４５ｂｐをその代わりとすることにより生成した。このアダプターは、
下記の配列 ＳＥＱＡ AATTGATCAAGGTGAACACGGTCATGCGCAGGATCCTCGAGCGGAACTCCATGGGG (SEQ ID NO:４５)及び ＳＥＱＢ CCCCATGGAGTTCCGCTCGAGGATCCTGCGCATGACCGTGTTCACCTTGATCAATT (SEQ ID NO:４６) を有する２つの相補的オリゴヌクレオチドを対合させて４５ｂｐの配列をはさむ
ＢｃｌＩ部位及びＮｃｏＩ部位を造ることにより生成した。
【０１６３】 対合のために、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液(５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．４、２ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ)中で１．８μＭの終濃度にし、５分間１００℃に加熱し てからゆっくり周囲温度に冷却した。ＮｃｏＩ及びＢｃｌＩ制限酵素での消化の
後に、プラスミドｐＰＳＰ４中で結紮を行った(予め、該プラスミドの５１０ｂ ｐのＢｃｌＩ−ＮｃｏＩ断片を除去しておいた)。こうして生成したプラスミド ｐ１９ＢＩＶΔから、改変したＯＲＦ１３を有するＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片( ２．２ｋｂ)を、予めＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化したプラスミドｐ ＵＷＬ２１８中にサブクローニングした。こうして得られた組込みプラスミドｐ
ＢＩＶΔ(図９Ｂ)を、次いで、大腸菌ＤＨ５αＭＲＣ株中に移し、その後、Sac.
erythraeaをトランスフォームするのに用いた。
【０１６４】実施例１３ ：Sac. erythraeaｅｒｙＢＩＶΔ株(ＢＩＶ８７)の構築 ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子が実施例１２で得たプラスミドｐＢＩＶΔ中に導入した
ような内部欠失を有する株を、Sac. erythraeaのプロトプラストのプラスミドｐ
ＢＩＶΔによるトランスフォーメーションにより調製した。
【０１６５】 プロトプラストの調製、組込みプロセス及びｅｒｙ-表現型を有する変異体の 選択を実施例３のように行った。
【０１６６】 更に、染色体中に予想される欠失(図３の配列のヌクレオチド４３８７２〜４ ４３８２の５１０ｂｐの欠失)の存在及びその４５ｂｐの合成配列での置換を、 実施例３に記載した条件に従うサザーンブロット並びにＰＣＲによるゲノム分析
により確認した。
【０１６７】 下記の配列を有するＢ４−Ｒオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＸＨ
ｏＩ制限酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼーシ
ョンを用いて Ｂ４−Ｒ AACTCGGTGGAGTCGATGTCGTCGCTGCGGAA (SEQ ID NO:４７) （図３の配列の４４６８７〜４４７１８位に位置する相補鎖に対応する）、５．
４ｋｂのバンドを野生型株から、２．７ｋｂのバンドを変異体ＢＩＶ８７から検
出した。図１５に示したこれらの結果は、図３の配列の４７１１４位に位置する
ＸｈｏＩ部位の上流２．７ｋｂの距離にある追加のＸｈｏＩ部位の存在を示して
おり、それ故、この変異体染色体中のアダプターの取込み(プラスミドｐＢＩＶ Δの生成に用いた上記の合成アダプターの取込みにより予想される)を確認して いる。
【０１６８】 ＰＣＲ増幅を、下記の配列を有するオリゴヌクレオチド Ｂ４−Ｓ CAATATAGGAAGGATCAAGAGGTTGAC (SEQ ID NO:４８) (図３の配列の４３６５２〜４３６７８位に位置するＤＮＡ領域に対応する)及び
上記の配列を有するオリゴヌクレオチドＢ４−Ｒ(ＯＲＦ１３に内部欠失を有す る領域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)を用いて行った。ＰＣＲ 増幅による分析は、野生型株において約１ｋｂのバンドを、変異体ＢＩＶ８７に
おいて約５００ｂｐのバンドを、プラスミドｐＢＩＶ８７で得られたシグナルと
同じ様式で検出した(図１６)。
【０１６９】 サザーン分析及びＰＣＲの結果の全体は、５１０ｂｐの欠失及び合成アダプタ
ーの存在を変異体の染色体のレベルで確認した。
【０１７０】 こうして得られた組換え株(ＢＩＶ８７と呼ぶ)を、次いで、その株により生成
される代謝産物を同定するために培養した。
【０１７１】実施例１４ ：ＢＩＶ８７株の発酵及び生成された二次代謝産物の同定 ＢＩＶ８７株の培養及びＴＬＣによる分析を、実施例４に示した条件に従って
行った。
【０１７２】 ＴＬＣの結果(図１７)は、ＢＩＶ８７株が、ｅｒｙＢ変異体に予想されるよう
に、優先的にエリスロノリドＢを蓄積することを示している。
【０１７３】 抗生物質活性を示す低い移動度の少ない代謝産物も検出された。これらの代謝
産物を抽出して、実施例４に記載したように、質量分析法と結合したＲＰ−ＨＰ
ＬＣにより分析した。
【０１７４】 質量スペクトルの結果は、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの改変型が生成
されたことを示している。主要代謝産物及び３つの少量代謝産物が検出された。
【０１７５】 主要な代謝産物Ｍ５は、親ピークをｍ／ｚ７０２に、加水分解及び断片化生成
物をｍ／ｚ６８４、ｍ／ｚ５６０及びｍ／ｚ１５８に生じ、エリスロマイシンＤ
における２水素原子の除去に対応する(ｍ／ｚ７０４、ｍ／ｚ６８６)。デソサミ
ニルエリスロマイシンＢ(５６０の断片ｍ／ｚ)の存在は、質量の差異が中性糖に
より運ばれることを示している。この代謝産物について提案される構造は、４”
−ケトエリスロマイシンＤである。
【０１７６】 少ない代謝産物も又、それぞれ、ｍ／ｚの値に２の差を有するプロフィルを生
じる： − Ｍ６(７１８のｍ／ｚ、ｍ／ｚ７００、ｍ／ｚ５７６、ｍ／ｚ１５８)(エリ スロマイシンＣについてのｍ／ｚ７２０、ｍ／ｚ７０２の代わりに) − Ｍ７(７３２のｍ／ｚ、ｍ／ｚ７１４、ｍ／ｚ５７６、ｍ／ｚ１５８)(エリ スロマイシンＡについてのｍ／ｚ７３４、ｍ／ｚ７１６の代わりに) − Ｍ８(７１６のｍ／ｚ、ｍ／ｚ６９８、ｍ／ｚ５６０、ｍ／ｚ１５８)(エリ スロマイシンＢについてのｍ／ｚ７１８、ｍ／ｚ７００の代わりに)。
【０１７７】 提案される構造は、それぞれ、Ｍ６は、４”−ケトエリスロマイシンＣであり
、Ｍ７は、４”−ケトエリスロマイシンＡであり、Ｍ８は、４”−ケトエリスロ
マイシンＢである。
【０１７８】 これらの観察は、ｅｒｙＢＩＶが、ｄＴＤＰ−ミカロースの生合成経路におけ
るｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼをコード
するということを示す。
【０１７９】 ＢＩＶ８７株を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C
NCM) INSTITUTE PASTEUR, 25,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRAN
CEに、１９９７年７月１６日に、番号Ｉ−１９０４で寄託した。
【０１８０】実施例１５ ：プラスミドｐＢＶΔの構築 ｐＢＶΔという、ＯＲＦ１４をコードするｅｒｙＢＶ遺伝子中に欠失を運ぶ組
込みプラスミドを、図１０Ａの図式に従って構築した。
【０１８１】 図３の配列のヌクレオチド４４９６３〜４５６８８の７２６ｂｐの欠失を、実
施例１１で得たプラスミドｐＢＫ６−１２から単離したＢｃｌＩ−ＫｐｎＩ断片
(１．１ｋｂ)と実施例１１で得たプラスミドｐＮＣＯ２８から単離したＫｐｎＩ
−ＢａｍＨＩ断片(１．１ｋｂ)との連結により、ＯＲＦ１４中に生成した（予め
ＢａｍＨＩ制限酵素で消化したプラスミドｐＵＷＬ２１８中に）。こうして得た
組込みプラスミドｐＢＶΔ(図１０Ｂ)を、次いで、大腸菌ＤＨ５αＭＲＣ株に移
し、その後、Sac. erythraeaをトランスフォームするのに用いた。
【０１８２】実施例１６ ：Sac. erythraeaｅｒｙＢＶΔ株(ＢＶ８８)の構築 ｅｒｙＢＶ遺伝子が実施例１５で得たプラスミドｐＢＶΔに導入したような内
部欠失を有する株を、Sac. erythraeaのプロトプラストのプラスミドｐＢＶΔで
のトランスフォーメーションにより調製した。
【０１８３】 これらのプロトプラストの調製、組込みプロセス及びｅｒｙ-表現型を有する 変異体の選択を、実施例３のようにして行った。
【０１８４】 更に、染色体中に予想される欠失(図３の配列のヌクレオチド４４９６３〜４ ５６８８の７２６ｂｐの欠失)の存在を、実施例３に記載した条件に従うサザー ンブロット並びにＰＣＲ増幅によるゲノム分析により確認した。
【０１８５】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＮｃｏＩ制限
酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼーションを用
いて：
【０１８６】 更に、染色体中に予想される欠失(図３の配列のヌクレオチド４４９６３〜４ ５６８８の７２６ｂｐの欠失)の存在を、実施例３に記載した条件に従うサザー ンブロット並びにＰＣＲ増幅によるゲノム分析により確認した。
【０１８７】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＮｃｏＩ制限
酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼーションを用
いて： Ｂ５−Ｒ TCCGGAGGTGTGCTGTCGGACGGACTTGTCGGTCGGAAA (SEQ ID NO:４９) (図３の配列の４６０６０〜４６０９８位に位置するＤＮＡ領域の相補鎖に対応 する)、２．７ｋｂのバンドを野生型株から、２．０ｋｂのバンドを変異体ＢＶ ８８から検出した。図１５に示したこれらの結果は、この変異体における、染色
体のこの領域内の約７００ｂｐの欠失の存在を示している。
【０１８８】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチド： Ｂ５−Ｓ AGGAGCACTAGTGCGGGTACTGCTGACGTCCTT (SEQ ID NO:５０) (図３の配列の４４７９９〜４４８３１位に位置するＤＮＡ領域に対応する)及び
上記の配列を有するオリゴヌクレオチドＢ５−Ｒ(ＯＲＦ１４に内部欠失を有す る領域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)を用いて、ＰＣＲ増幅を 行った。ＰＣＲ増幅による分析は、プラスミドｐＢＶ８８で得られたシグナルと
同じ様式で、約１．３ｋｂのバンドを野生型株において、約５７０ｂｐのバンド
を変異体ＢＶ８８において検出した(図１６)。これらの結果は、サザーン分析に
より検出された７１０ｂｐの欠失がプラスミドｐＢＶΔにより運ばれるもの(７ ２６ｂｐ)と同じであることを確認する。
【０１８９】 こうして得られた組換え株(ＢＶ８８という)を、次いで、その株により生成さ
れる代謝産物を同定するために培養した。
【０１９０】例１７ ：ＢＶ８８株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 ＢＶ８８株の培養及びＴＬＣによる分析を例４に示した条件に従って実施した
。 ＴＬＣの結果（図１７）は、ＢＶ８８株がｅｒｙＢ変異体に期待されるように
エリスロノリドＢを優先的に蓄積することを示す。 低い易動性を有する少ない代謝産物も検出され、次いで抽出し、例４で使用し
た条件下で質量分光法を組合わせたＲＰ−ＨＰＬＣにより同定した。 質量スペクトルは、ｍ／ｚ５６０で親ピークを有する代謝産物及びｍ／ｚ５４
２及びｍ／ｚ１５８で脱水生成物及び断片化生成物であってその提案された構造
がデソサミニルエリスロノリドＢであるものの存在を示す。 ｅｒｙＢＶ配列は、他のグリコシルトランスフェラーゼ及び上記のｅｒｙＣＩ
ＩＩ遺伝子との強い相同性を示す（ヌクレオチドレベルで６０．７％の同一性、
蛋白質レベルで４４％同一性）。 これらの観察は、ｅｒｙＢＶ遺伝子がエリスロマイシンの生合成に係わるミカ
ロシルトランスフェラーゼをコード化することを示す。
【０１９１】例１８ ：プラスミドｐＣＶＩΔ（ｐＰＳＴＩ）の構築 ｐＰＳＴＩと称され、ＯＲＦ１５をコード化するｅｒｙＣＶＩ遺伝子に欠失を
持っている組込みプラスミドを以下の態様で図１１Ａのダイアグラムに従って構
築した。 最初に、プラスミドｐＮＢ４９を、ＮｓｉＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素により予
め消化させた例１１で得たプラスミドｐＮＣＯ２８をエキソヌクレアーゼＩＩＩ
で処理することによって生成させた。次いで、図３の配列のヌクレオチド４４３
８２〜４６５６２を含有するプラスミドｐＮＢ４９（図５）をＰｓｔＩ制限酵素
により消化させ、次いでサムブルック他、１９８９により報告されたようにヤエ
ナリ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）のヌクレアーゼ（ＮＥ ビオラブ社）により処理し
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて再連結し、形質転換した後、アン
ピシリン耐性のコロニーをＰｓｔＩ酵素による制限分析により選択した。Ｐｓｔ
Ｉ部位の喪失を逆Ｍ１３プライマーを使用してクローンをシーケンシングするこ
とによって確認し、図３の配列のヌクレオチド４６３６４の欠失が観察され、し
かしてこのように生成させたプラスミドｐＮＢ４９ΔＰｓｔにおいてＯＲＦ１５
に相変化が作り出された。次いで、ＢｇｌＩＩ制限酵素により消化されたプラス
ミドｐＩＪ７０２を、プラスミドｐＰＳＴＩを生成するプラスミドｐＮＢ４９Δ
ＰｓｔのＢｇｌＩＩ部位と連結した。ｐＰＳＴＩにおけるｐＩＪ７０２の配向を
、ＳｐｈＩ制限酵素により消化させた後に０．９ｋｂを有するＤＮＡ断片の存在
により確認した。このようにして得られた組込みプラスミドｐＰＳＴＩ（図１１
Ｂ）をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＲＣ株に移し、次いでＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａ
ｅａを形質転換するために使用した。
【０１９２】例１９ ：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＥｒｙＣＶＩΔ株（Ｐｓｔ１０）の構築 ｅｒｙＢＶ遺伝子が例１８で得たプラスミドｐＰＳＴＩに導入されたもののよ
うな内部欠失を持っている株を、プラスミドｐＰＳＴＩを有するＳａｃ．ｅｒｙ
ｔｈｒａｅａのプロトプラストの形質転換によって調製した。 プロトプラストの調製及び組込み方法は、例３のように実施した。 ｅｒｙ-表現型を有する変異体の選択は、指標株としてＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ株 の代わりにエリスロマイシン感性のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を使用して例３にお
けるように実施した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＡＴＣＣ６６３３を使用して、分
析すべき変異体を接種し且つ３０℃で３日間インキュベ−ションしたＭ１−１０
２培地中の寒天皿上での生物学的試験でエリスロマイシンの産生を評価した。次
いで、細菌により覆われた寒天帯域をパンチで採取し、次いで２００μｌのＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ６６３３の培養物を含有するＴＹ培地中の５ｍｌの
寒天の上層で覆われた２個のＴＹ皿上に置き、次いで３７℃で一夜インキュベ−
ションした。 また、エリスロマイシンの産生の無いことを、切り抜かれた寒天帯域上のそれ
ぞれの代謝産物の１０ｍＭ溶液を１０μｌの量で適用し、次いで３０℃で終夜イ
ンキュベーションしてから皿を上記のようにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養物で再
び覆うことによりエリスロノリドＢ又は３−α−ミカロシルエリスロノリドＢの
ような添加先駆物質の存在下に評価した。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ“レッド
バリアント”野生型株を対照として使用した。 プロトプラストをプラスミドｐＰＳＴＩにより形質転換し、チオストレプトン
耐性のコロニーを選択した後に、染色体への組込みを例３に記載した一般的方法
に従うサザーン分析法により確認した。 次の配列： １４−１：GGGGGATCCCATATGCGGGTACTGCTGACGTCCTTCG（SEQ ID No.51）及び １４−２：GAAAAGATCTGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTC（SEQ ID No.52） を有する合成オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより生成させたＯＲＦ１４
に相当する１２６９ｐｂのＤＮＡ断片をプローブとして使用した。 １４−１オリゴヌクレオチドは、図３の配列の位置４４８１１〜位置４４８３
３に位置するＤＮＡ領域に相当する配列の上流にＢａｍＨＩ部位及びＮｄｅＩ部
位を導入するように設計した。 １４−２オリゴヌクレオチドは、図３の配列の位置４６０２７〜位置４６０５
３に位置するＤＮＡ領域の相補鎖に相当する配列の下流にＢｇｌＩＩ部位を導入
するように設計した。ＣｌａＩ及びＰｓｔＩ制限酵素により予め消化させた染色
体ＤＮＡはインテグラントから４ｋｂ及び７ｋｂの所期のバンドを示したが、野
生型株は３ｋｂの所期のバンドを示した。 インテグラントを繰り返し培養した後に、得られた個別化したコロニーをチオ
ストレプトンに対する感受性及びエリスロマイシンの産生について分析し、次い
でｅｒｙ-表現型を有する変異体クローン（Ｐｓｔ１０）の染色体への所期の失 欠（図３の配列のヌクレオチド４６３６４からの欠失）の組込みをサザーン分析
法により確認した。野生型株及びＰｓｔ１０変異体からそれぞれ単離された染色
体ＤＮＡをＰｓｔＩ制限酵素により消化させた。０．８ｋｂのＰｓｔＩ−Ｎｃｏ
Ｉプローブによるハイブリダイゼーションは、野生型株から図３の配列のヌクレ
オチド４６３６８〜４７３９７に相当する１ｋｂのＰｓｔＩバンド並びに変異体
からの＞２０ｋｂのバンドを有する所期のプロフィルを生じた。また、上記の位
置４６３６８でのＰｓｔＩ部位の喪失が、ＰｓｔＩ及びＮｃｏＩ酵素による二重
消化の後に示され、野生型株から０．８ｋｂのＰｓｔＩ−ＮｃｏＩバンド（ヌク
レオチド４６３６８〜４７１４２）及び変異体による２．８ｋｂのＮｃｏＩバン
ド（ヌクレオチド４４３８２〜４７１４２）を生じた。 次いで、このようにした得られた組換え株（Ｐｓｔ１０と称する）を、産生し
た代謝産物を同定するために培養した。
【０１９３】例２０ ：Ｐｓｔ１０株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 Ｐｓｔ１０株をカフレー他、１９９２により報告されたシュクロース・スクシ
ネート培地で３０℃で３日間培養した。次いで、培養物の上層液をｐＨ９で酢酸
エチルにより抽出した。得られた有機相をＭｇ2ＳＯ4で乾燥し、次いで減圧下に
乾固させた。残留物をアセトニトリル−水混合物（１：１、ｖ／ｖ）に溶解し、
次いでＢｉｏＱ（マイクロマス社、マンチェスター、英国）又はフィニンガンＬ
ＣＯ（フィニンガグ社、カナダ）分光計での質量分光法によって分析した。 エリスロマイシンＡの産生（ｍ／ｚ７３４及びｍ／ｚ７１６）は観察されなか
ったが、立証されたエリスロノリドＢ（ＭＫ＋：ｍ／ｚ４４１及びＭＮａ＋：ｍ
／ｚ４２５）並びに３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ（ＭＫ＋：ｍ／ｚ５８
５及びＭＮａ＋：ｍ／ｚ５６９）の存在はＰｓｔ１０株をｅｒｙＣ変異体として
特徴づける。 ｅｒｙＣＶＩ配列は、Ｓ．ｎｏｇａｌａｔｅｒ（受入番号ＥＭＢ ＬＳ５２４
０３）におけるノガラマイシンの生合成に係わるＳｎｏＸ（蛋白質レベルで５５
．５％の同一性）、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ（受入番号ＥＭＢＬ Ｘ８１８８５）に
よるチロシンの生合成に係わるＴｙｌＭ１（蛋白質レベルで６５％の同一性）、
及びＳ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ（受入番号ＥＭＢＬ Ｓ２５２０４）における
スピラマイシンの生合成に係わるＳｒｍＸ（蛋白質レベルで５２．８％の同一性
）ような他のメチルトランスフェラーゼとの強い相同性を示す。 これらの観察は、ｅｒｙＣＶＩ遺伝子がｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミンの生合成経
路に係わるｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース−３−Ｎ−メチルトランスフ
ェラーゼをコード化することを示す。
【０１９４】例２１ ：プラスミドｐＢＶＩΔ（ｐＸｈｏＩ）の構築 ｐＸｈｏＩと称され且つＯＲＦ１６をコード化するｅｒｙＢＶＩ遺伝子に欠失
を持っている組込みプラスミドを図１２Ａのダイアグラムに従って以下の態様で
構築した。 例１１で得られ且つ図３の配列のヌクレオチド４７１４２〜５０２５４を含有
するプラスミドｐＮＣＯ６２のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片（３．１ｋｂ）をプラス
ミドリトマス２８のＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ部位でサブクローニングした。このよ
うに生成したプラスミドｐＮＣＯ６２Ｘ（図５Ｂ）をＰｓｔＩ制限酵素により消
化し、次いでＤＮＡポリメラーゼＴ４（ベーリンガーマンハイム社）により処理
した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて再連結し、形質転換した後、図
３の配列のヌクレオチド４７３９７でのＰｓｔＩ部位の喪失をシーケンシングに
より確認し、図３の配列のヌクレオチド４７３３７からヌクレオチド４７３９７
までの６０ｐｂの欠失を観察した。次いで、ＢｇｌＩＩ制限酵素により消化させ
たプラスミドｐＩＪ７０２をこの構築物のＢｇｌＩＩ部位に連結した。この構築
物におけるｐＩＪ７０２の配向を、ＸｈｏＩ制限酵素により消化させた後に４．
３ｋｂを有するＤＮＡ断片の存在によて確認した。このようにして得られた組込
型プラスミドｐＸｈｏＩ（図１２Ｂ）をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａを形質転換
するために使用した。
【０１９５】例２２ ：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ｅｒｙＢＶＩΔ（Ｘｈｏ９１）の構築 ｅｒｙＢＶＩ遺伝子が例２１で得たプラスミドｐＸｈｏＩに導入されたものの
ような内部欠失を持っている株を、プラスミドｐＸｈｏＩによるＳａｃ．ｅｒｙ
ｔｈｒａｅａのプロトプラストの形質転換によって調製した。 プロトプラストの調製及び組込み方法は、例３のように実施した。 ｅｒｙ-表現型を有する変異体の選択及び分析は、例１９に記載した条件で実 施した。 染色体への組込み及び所期の欠失の存在は、例１９に記載した一般的方法に従
ってサザーン分析法により確認した。 プラスミドｐＸｈｏＩによるプロトプラストの形質転換及びチオストレプトン
耐性のコロニーの選択の後、染色体への組込みをサザーン分析法により確認した
。プラスミドｐＮＣＯ６２の３．３ｋｂのＰｓｔＩ断片をプローブとして使用す
ることによって、ＰｓｔＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素により予め消化させたインテ
グラントの染色体ＤＮＡは所期の３ｋｂ及び６ｋｂのバンドを示した。 インテグラントを繰り返し培養した後、得られた個性化したコロニーをチオス
トレプトンに対する感受性及びエリスロマイシンの産生について分析し、次いで
ｅｒｙ−表現型を有する変異体クローンの染色体（ＸｈｏＩ）への所期の欠失（
図３の配列のヌクレオチド４７３３８からヌクレオチド４７３９７までの６０ｐ
ｂの欠失）の組込みをサザーン分析法により確認した。それぞれ野生型株及び変
異体ＸｈｏＩから単離した染色体ＤＮＡをＰｓｔＩ制限酵素により消化させた。
０．８ｋｂのＰｓｔＩ−ＮｃｏＩプローブ（図３の配列のヌクレオチド４６３６
８〜４７１４２）によるハイブリダイゼーションは、野生型株から図３の配列の
ヌクレオチド４６３６８〜４７３９７に相当する１ｋｂのＰｓｔＩバンド及び変
異体から４ｋｂのバンドを有する予期したプロフィルを与え、上記の位置４７３
９７でのＰｓｔＩ部位が喪失したことを示した。 また、位置４７３９７でのＰｓｔＩ部位の喪失は、ＰＣＲにより確認された。
染色体ＤＮＡを、図３の配列のヌクレオチド４７３００〜ヌクレオチド５７３２
０の配列及びヌクレオチド４７６６１〜ヌクレオチド４７６３６にそれぞれ相当
するプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅処理に付した。このようにして、
ＰｓｔＩ制限酵素により消化させた後にほぼ１００及び３００ｂｐの２個のバン
ドを生成する野生型株から３０６ｂｐの予期した断片が増幅された。変異体Ｘｈ
ｏ９１から３００ｂｐの断片が増幅され、６０ｂｐの欠失を生じた。次いで、こ
の断片を単離し、ＰｓｔＩ酵素による消化に対して抵抗性であることがわかった
。 次いで、このようにして得られ、Ｘｈｏ９１と称される組換え株を培養して産
生する代謝産物を同定した。
【０１９６】例２３ ：Ｘｈｏ９１株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 Ｘｈｏ９１株の培養及び培養上層液の質量分光法による分析を、例２０に記載
した条件に従って実施した。 エリスロマイシンＡの産生（ｍ／ｚ７３４及びｍ／ｚ７１６）は観察されなか
ったが、証明された過半量のエリスロノリドＢの存在（ＭＫ+：ｍ／ｚ４４１； ＭＮａ+：ｍ／ｚ４２５；Ｍ−Ｈ2Ｏ Ｈ+：ｍ／ｚ３８５）並びにデソサミニル エリスロノリドＢの存在（ｍ／ｚ５６０）はＰｓｔ１０株をｅｒｙＢ変異体とし
て特徴づける。 質量分光法の結果は、ブルッカーＦＴ−ＩＣＲ分光計での高分解能質量分光法
により確認された。 ｅｒｙＢＶＩ配列は、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ（受入番号ＥＭＢＬ Ｕ７７８
９１）におけるダウノルビシンの生合成に係わるＤｎｍＴとの強い相同性を有す
る（蛋白質レベルで４３．９％の同一性）。 これらの観察は、ｅｒｙＢＶＩ遺伝子がスコッチ及びハッチンソン、１９９６
により示唆されたように、ｄＴＤＰ−ミカロースの生合成に係わるｄＴＤＰ−４
−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼをコード化するこ
とを示す。
【０１９７】例２４ ：プラスミドｐＣＩＶΔの構築 ｐＣＩＶΔと称され、ＯＲＦ１７をコード化するｅｒｙＣＩＶ遺伝子に欠失を
持っている組込みプラスミドを以下の態様で図１３Ａのダイアグラムに従って構
築した。 例１１で得たプラスミドｐＮＣＯ６２を、ＢａｌＩ及びＢｃｌＩ制限酵素を使
用して、図３の配列のヌクレオチド４８６５０〜ヌクレオチド４９５９８のＯＲ
Ｆ１７内の９４９ｂｐを有する断片を除去するように消化した。ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノウ断片を使用して末端に充填した後に、プラスミドをＥ．ｃｏｌ
ｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて再連結し、形質転換した。このようにして生成し
たプラスミドｐＢＣＢ１７から、欠失を持っている２．６８ｋｂの断片をＸｂａ
Ｉ及びＳｐｈＩ酵素を使用して消化させることにより単離し、次いでプラスミド
ｐＵＷＬ２１８に相当する部位においてサブクローニングした。図３の配列のヌ
クレオチド４８６５０からヌクレオチド４９５９８までの９４９ｂｐの欠失の存
在をシーケンシングすることにより確認した。次いで、このようにして得られた
組込型プラスミドｐＣＩＶΔ（図１３Ｂ）をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＲＣ株に
移し、次いでＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａを形質転換するのに使用した。
【０１９８】例２５ ：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ｅｒｙＣＩＶΔ（ＣＩＶ８９）の構築 ｅｒｙＣＩＶ遺伝子が例２４で得たプラスミドｐＣＩＶΔに導入されたものの
ような内部欠失を持っている株を、プラスミドｐＣＩＶΔによりＳａｃ．ｅｒｙ
ｔｈｒａｅａのプロトプラストを形質転換することによって調製した。 プロトプラストの調製、組込み方法及びｅｒｙ-表現型を有する変異体の選択 は例３におけるように実施した。 さらに、染色体における予期した欠失（図３の配列のヌクレオチド４８６５０
からヌクレオチド４９５９８までの９４９ｂｐの欠失）の存在は、サザーンブロ
ットによるゲノム解析並びに例３に記載した条件に従うＰＣＲにより確認された
。 ＮｃｏＩ制限酵素によって消化されたゲノムＤＮＡについてサザーンのハイブ
リダイゼーションを使用し、図３の配列の位置４９９９６〜位置５００２２に位
置するＤＮＡ領域の相補鎖に相当する下記の配列： Ｃ４−Ｒ：AGCGGCTTGATCGTGTTGGACCAGTAC (SEQ ID No.53) を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、野生型株から６．２ｋ
ｂのバンド及び変異体ＣＩＶ８９から５．２ｋｂのバンドが検出された。図１５
に示す結果は、染色体のこの領域にほぼ１ｋｂの欠失が変異体に存在することを
示している。 ＰＣＲによる増幅を、図３の配列の位置４８１６９〜位置４８１９５に位置す
るＤＮＡ領域に相当する下記の配列： Ｃ４−Ｓ：GGCCTATGTGGACTACGTGTTGAACGT （SEQ ID No.54） を有するオリゴヌクレオチド及び上で示した配列を有するＣ４−Ｒオリゴヌクレ
オチドを使用して実施し、しかしてＯＲＦ１７で内部欠失を持っている領域のＰ
ＣＲ増幅によるフレーミングを可能にした。ＰＣＲ増幅による分析は、野生型株
における１．８ｋｂのバンド及び変異体ＣＩＶ８９における９００ｂｐのバンド
を、プラスミドｐＣＩＶΔにより得たシグナルと同等の態様で検出するのを可能
にした。図１６に示した結果は、サザーン分析法により検出されたほぼ９００ｂ
ｐの欠失がプラスミドｐＣＩＶΔが持ているもの（９４９ｂｐ）と同等であるこ
とを確認させる。 次いで、このように得られた組換え株（ＣＩＶ８９と称する）を、この株によ
り産生する代謝産物を同定するために培養した。
【０１９９】例２６ ：ＣＩＶ８９株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 ＣＩＶ８９株の培養及びＴＬＣによる分析を例４に示した条件に従って実施し
た。 ＴＬＣの結果（図１７）は、ＣＩＶ８９株がｅｒｙＣ変異体について予期され
るように３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ並びにエリスロノリドＢを優先的
に蓄積させることを示す。 また、低い易動性を持つ少量の代謝産物も検出され、次いで抽出し、例４で使
用した条件に従って質量分光法と組合わせたＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。 少量の代謝産物は、ｍ／ｚ７２０で親ピーク、ｍ／ｚ７０２、ｍ／ｚ５７６及
びｍ／ｚ１７４で脱水及び断片化生成物を生じる。ピーク１７４は４−ヒドロキ
シデソサミンに、ピーク５７６は４’−ヒドロキシデソサミニルエリスロノリド
Ｂに相当しよう。 これらの結果は、エリスロノリドＤ（親ピークｍ／ｚ７０４）と比べて１６の
ｍ／ｚの差はアミノ化糖が持ているを示唆している。この代謝産物について提案
される構造は４’−ヒドロキシエリスロマイシンＤである。 これらの観察は、該酵素がエリスロマイシンの生合成経路でヒドロキシル基の
引抜きに関与すること、ｅｒｙＣＩＶ遺伝子がｄＴＤＰ−６−デオキシヘキソー
ス３，４−デヒドラターゼをコード化することを示している。 ＣＩＶ８９株は、１９９７年７月１６日に微生物培養物国際収集機関（ＣＮＣ
Ｍ）であるパスツール研究所（フランス、７５７２４パリ セデックス１５、リ
ュ・ジュ・ドクチュール・ロウ２５）に番号Ｉ−１９０５として寄託された。
【０２００】例２７ ：プラスミドｐＣＶΔの構築 ｐＣＶΔと称され、ＯＲＦ１８をコード化するｅｒｙＣＶ遺伝子に欠失を持っ
ている組込みプラスミドを以下の態様で図１４Ａに示したダイアグラムに従って
構築した。 ＢａｌＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素による消化によって例１１で調製したプラス
ミドｐＮＣＯ６２から得たＢａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（３．４８ｋｂ）をベクタ
ーｐＵＣ１９のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ部位においてサブクーロニングさせた。次
いで、生じたプラスミドｐＢＡＢ１８（図５Ｂ）から、ＳｃａＩ酵素による消化
によってＳｃａＩ内部断片（１ｋｂ）を欠失させてＯＲＦ１８にいおて図３の配
列のヌクレオチド４９９９８からヌクレオチド５１０４１までの１０４４ｂｐの
欠失を生成させた。このようにして得たプラスミドｐＢＡＢΔＣＶから、次いで
、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素による消化によって、欠失を持ってい
る断片をｐＵＣ１９のポリリンカーから再び単離し、次いでプラスミドｐＵＷＬ
２１８においてサブクローニングさせた。このようにして得られた組込みプラス
ミドｐＣＶΔ（図１４Ｂ）をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＲＣ株に移し、次いでＳ
ａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａを形質転換するために使用した。
【０２０１】例２８ ：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ｅｒｙＣＶΔ（ＣＶ９０）の構築 ｅｒｙＣＶ遺伝子が例２７で得たプラスミドｐＣＶΔに導入されたもののよう
な内部欠失を持っている株を、プラスミドｐＣＶΔによるＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒ
ａｅａのプロトプラストの形質転換によって調製した。 プロトプラストの調製、組込み方法及びｅｒｙ-表現型を有する変異体の選択 は例３におけるように実施した。 さらに、染色体における所期の欠失（ヌクレオチド４９９９８からヌクレオチ
ド５１０４１までの１０４４ｂｐの欠失）の存在は、サザーンプロットによるゲ
ノム解析並びに例３に記載した条件に従うＰＣＲにより確認した。 ＮｃｏＩ制限酵素によって消化されたゲノムＤＮＡについてサザーンのハイブ
リダイゼーションを使用し、図３の配列の位置５１２２９〜位置５１２５９に位
置するＤＮＡ領域の相補鎖に相当する下記の配列： Ｃ５−Ｒ：AACGCCTCGTCCTGCAGCGGAGACACGAACA (SEQ ID No.55) を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、野生型株から６．２ｋ
ｂのバンド及び変異体ＣＶ９０から５．１ｋｂのバンドが検出された。図１５に
示す結果は、染色体のこの領域にほぼ１．１ｋｂの欠失が変異体に存在すること
を示している。 ＰＣＲによる増幅を、図３の配列の位置４９６６８〜位置４９６９４に位置す
るＤＮＡ領域に相当する下記の配列： Ｃ５−Ｓ：TTCGCTCCCCGATGAACACAACTCGTA （SEQ ID NO.56） を有するオリゴヌクレオチド及び上で示した配列を有するＣ５−Ｒオリゴヌクレ
オチドを使用して実施し、しかしてＯＲＦ１８において内部欠失を持っている領
域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にした。ＰＣＲ増幅による分析は、野
生型株においてほぼ１．６ｋｂのバンド及び変異体ＣＩＶ９０においてほぼ５０
０ｂｐのバンドを、プラスミドｐＣＶΔにより得られるシグナルと同等の態様で
検出するのを可能にした。図１６に示した結果は、サザーン分析法により検出さ
れたほぼ１．１ｋｂの欠失がプラスミドｐＣＶΔが持っているもの（１０４４ｂ
ｐ）と同等であることを確認させる。 次いで、このように得られた組換え株（ＣＩＶ９０と称する）を、この株によ
り産生する代謝産物を同定するために培養した。
【０２０２】例２９ ：ＣＶ９０株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 株ＣＶ９０の培養及びＴＬＣによる分析を例４に示した条件に従って実施した
。 ＴＬＣの結果（図１７）は、ＣＶ９０株がｅｒｙＣ変異体について予期される
ように３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ及びエリスロノリドＢを優先的に蓄
積させることを示す。 ｅｒｙＣＶによりコード化された蛋白質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１の配列）
の残基３８〜５０（ＶＴＧＡＧＤＧＤＡＤＶＱＡ）の配列： Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val Gln Ala （SEQ ID No.61） は、ウイーレンガ他、１９８５及びスクラットン他、１９９０により報告された
ＮＡＤ＋に結合する合意された配列と酷似する。 これらの観察は、ｅｒｙＣＶ遺伝子がｄ−ＴＤＰ−デソサミンの生合成経路で
ｄＴＤＰ−４，６−デオキシヘキソース３，４−レダクターゼとして関与するで
あろうレダクターゼをコード化することを示している。
【０２０３】例３０ ：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の生成物の過剰発現 例１に記載したＯＲＦ８に相当し、例７で同定したデソサミニルトランスフェ
ラーゼ活性をコード化するＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子
の生成物の異種発現を宿主株としてＥ．ｃｏｌｉを使用して実施した。このよう
にして封入体の形で産生した蛋白質を次いで精製し、その酵素活性をインビトロ
で決定した。
【０２０４】 １）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の発現 発現は、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの制御
下でＥ．ｃｏｌｉにおける組換え蛋白質のクローニング及び発現のためのベクタ
ーｐＥＴ１１ａ（ストラトジェン社）を使用して実施した。 まず、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子を、例１に記載したプラスミドｐＫ６２から以下
の態様で増幅した。 ＰＣＲによる増幅は、生のＰｆｕポリメラーゼ（ストラトジェン社）を使用し
、そしてｅｒｙＣＩＩＩの開始剤ＡＴＧの上流にＮｄｅＩ部位を導入するのを可
能にさせる次の配列： Ａ：GAAGGAGATATACATATGCGCGTCGTCTTCTCCTC （SEQ ID No.57） を有するオリゴヌクレオチド同族体Ａ及びｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の停止コドンの
下流にＢａｍＨＩ部位を導入するのを可能にさせる次の配列： Ｂ：CGGGATCCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCCTGC （SEQ ID No.58） を有するｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の相補鎖を有するオリゴヌクレオチド同族体Ｂを
プライマーとして使用して実施した。 次いで、増幅されたＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素により消化し、
次いでｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の全体を含有する得られた１．２ｋｂのＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ断片を、アンピシリン耐性のβ−ラクタマーゼ遺伝子と、複製起点Ｃ
ｏｌＥ１と、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素により予め消化されたクローニン
グ部位ＮｄｅＩの上流に位置するＲＮＡポリメラーゼＴ７の遺伝子のプロモータ
ーとを含有する発現ベクターｐＥＴ１１ａ（ストラトジェン社）において連結し
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて連結し、形質転換した後に、得ら
れたプラスミドｐＣＥＩＩＩを制限マップ及びシーケンシングにより確認した。 次いで、その染色体ＤＮＡにｌａｃＩq遺伝子を含有し、ＲＮＡポリメラーゼ Ｔ７の遺伝子の上流にｌａｃＵＶ５プロモーターを含有するｐＥＴキット（スト
ラトジェン社）のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（ＤＥ３）をプラスミドｐＥＣＩＩ
Ｉ．５により形質転換させた。 得られた形質転換した株（ＢＬ２１／ｐＥＣＩＩＩと称する）を５０ｍｌのエ
ルレンメイヤーフラスコにおいて、予備培養物からＯＤ600＝０．１で播種し、 次いで１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）に
よりＯＤ600＝１で誘発させたＬＢ媒体中で３７℃で培養した。導入して３時間 ３０分後に、培養物の１ｍｌを取り出し、濃縮し、次いで得られた細菌ペレット
を２４０μｌの水及び１２０μｌのＳＤＳ ３Ｘ試料緩衝液（トリス−ＨＣｌ、
１Ｍ、ｐＨ＝６．８：１．９ｍｌ；グリセリン：３ｍｌ；β−メルカプトエタノ
ール：１．５ｍｌ；ＳＤＳ ２０％：３ｍｌ；ブロモフェノールブルー１％、ｐ
Ｈ＝７；０．３ｍｌ；Ｈ2Ｏ：１０ｍｌに要する量）に溶解した。得られた溶液 の１５μｌから、抽出された総蛋白質を、コマシエブルーによる染色を使用して
１０％ポリアクリルアミドを含むゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 プラスミドｐＥＴ１１ａにより形質転換された対照株の総蛋白質と比べて、ｅ
ｒｙＣＩＩＩ蛋白質について予期されたＭＷに相当するほぼ４６Ｋｄの見掛け分
子量を有する蛋白質の過剰発現が観察された。
【０２０５】 ２）ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の精製 上記の形質転換されたＢＬ２１／ｐＥＣＩＩＩ株を６Ｌの発酵器において炭素
源としてグリセリンを含有する最小量の媒体（コルツ他、１９９５）中で２５℃
でＯＤ600＝１２まで培養し、次いでＩＰＴＧにより１８時間ＯＤ600＝５４まで
誘発させた。集めた培養液から５０００Ｇで３０分間遠心分離することによって
封入体を含有する細菌ペレットを単離した。 ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の誘発は、集めた培養液に直接か又は燐酸塩緩衝液中で
超音波により第一溶菌処理した後の細菌ペレットのいずれかについて、アリコー
トを１％ＳＤＳ緩衝液中で１００℃で５分間溶菌した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポ
リアクリルアミド勾配：１０〜２０％）とコマシエブルーによる染色を使用して
検査した。 集めた培養液の１Ｌに相当する１９０ｇの細菌ペレットを、２．５ｍＭのＥＤ
ＴＡ及び２．５ｍＭのＤＴＴを含有する２．５容のＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4緩衝
液（２０ｍＭ、ｐＨ７．２）に再懸濁させた。次いで、ラニー装置（ミニラボ、
８−３０Ｈタイプ，ＡＰＶホモジナイザーズＡｓ社、デンマーク）を使用して、
１０００バールの圧力下に３回通して溶菌処理した。４６，０００Ｇで３時間遠
心分離した後に、得られたペレットを２．５容の２Ｍ尿素中に懸濁させ、同じ条
件下で遠心分離した。 次いで、洗浄したペレットを、７Ｍ尿素をトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．
５）（緩衝液Ａ）に溶解してなる溶液の２．５容に懸濁させてｅｒｙＣＩＩＩ蛋
白質を可溶化させた。同じ条件下で遠心分離した後に、得られた集めた上層液は
、市販のキット（ピアース社）を使用してブラッドホード法により決定して２．
１ｇの総蛋白質を含有する。 次いで、７ｍＭ尿素液中の抽出物を、上記の緩衝液Ａにより予め平衡化したＱ
セファロース（ファルマシア社）の１８０ｍｌのカラム（５ｃｍ×９ｃｍ）に０
．５ｍ／ｈの割合で４〜８℃で装入し、２８０ｎｍで検出した。次いで、ｅｒｙ
ＣＩＩＩ蛋白質を、０．３ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａにより溶離した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド勾配：１０〜２０％）により立証され、コ
マシエブルーによる染色によって明示されたｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を含有する一
緒にした画分及び８３５ｍｇの総蛋白質を、次いで、上記の緩衝液Ａにより予め
平衡化したスーパーデックス２００（Ｐｒｅｐグレード、ファルマシア社）の５
．５Ｌのカラム（１０ｃｍ×７０ｃｍ）に装入した。カラムを緩衝液Ａにより溶
離し、２８０ｎｍで検出することによって、蛋白質ピークであって、その画分が
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより証明されるｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を含有するものを得、
これと２００ｍｇの総蛋白質を一緒にし、次いで緩衝液Ａにより予め平衡化した
Ｑソース（ファルマシア社）の１８０ｍｌのカラム（５ｃｍ×９ｃｍ）で精製し
た。緩衝液Ａ中で０〜０．３Ｍの間のＮａＣｌの線状勾配でもって溶離すること
によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと硝酸銀による明示により評価された均一純度の変
性ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を１００ｍｇ含有する３０ｍｌの溶液を得た。 図１８は、５００ｎｇの総蛋白質の付着量についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリア
クリルアミド勾配：１０〜１５％）及び硝酸銀による明示によってモニターされ
たｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質について、連続して７Ｍ尿素による抽出（線２）、Ｑセ
ファロースクロマトグラフィー（線３）、スーパーデックスクロマトグラフィー
（線４、Ｑソースクロマトグラフィー（線６）の後の純度のパターンを、分子量
マーカー（線１及び５）と対比して示す。 次いで、均一溶離物を１０ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液Ａにより希釈するこ
とによってｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を変性させて０．１ｍｇ／ｍｌの最終蛋白質濃
度を得た。次いで、希釈された溶液をトリス緩衝液 ５０ｍＭ；ＮａＣｌ ０．
１５Ｍ；０．３％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシル（ＮＯＧ）；ＤＴＴ １０ｍＭ、ｐＨ８．３に向けて透析し、次いで１０，０００のカットオフ限界
値を有するＰＬＧＣ０４３１０膜（ミリポア社）で限外ろ過することによって４
ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。 次いで、精製したｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を５００μｌのアリコートとして−２
０℃で冷凍状態で貯蔵した。
【０２０６】 ３）ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の特徴付け このようにして得られたｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の特徴付けを以下の性質につい
て検査した。 ａ）均一性 Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ装置（ファルマシア社）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（ポリアクリルアミド勾配：１０〜１５％）及び硝酸銀による明示による電気
泳動は、２０００ｎｇの付着量について９９％以上の純度を示す。 ｂ）電気泳動及び質量分光法による分子量 電気泳動を使用して、４６ｋＤａの見掛けＭＷは４５９２９の計算ＭＷと一致
すると決定された。 質量分光法と結びつけたＲＰ−ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ：ＥＳＩ−ＳＭ）による分
析は、４５９３４ｕｍａの質量を生じる。 ｃ）Ｎ−末端アミノ酸配列 Ｎ−末端配列は、ＰＴＨ−アミノ酸のＨＰＬＣ分析器と結びつけたモデルＡ４
９２蛋白質マイクロシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社）でマイ
クロシークエンシングすることによって決定した。 図２に記載したアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の配列）と一致する１
０個の第一残基について二次的配列は明示されなかった。 ｄ）生物学的活性 ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質のデソサミニルトランスフェラーゼ活性を、ｄＴＤＰ−
Ｄ−デソサミン（この調製は以下に記載する）からのエリスロマイシンＤ並びに
３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ（ＭＥＢ）（この調製は文献及び一般的方
法で上記した）の形成を証明することによってインビトロで決定した。 反応媒体は、以下の操作条件を使用して、１５０ｎモルのｄＴＤＰ−Ｄ−デソ
サミン、１３７．４ｎモルのＭＥＢ及び１ｍｇのｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を含有す
る。 ４．７８ｍｌのトリス緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．３（緩衝液Ｂ）；１ｍＭのＥ
ＤＴＡ及び４ｍＭのＰＥＦＡＢＬＯＣ Ｏ（メルク社）を含有する緩衝液Ｂにｄ
ＴＤＰ−Ｄ−デソサミントリエチルアミン塩（１５０ｎモル）を溶解してなる２
０μｌの溶液；ＭＥＢ（１３７．４ｎＭ）を緩衝液Ｂに溶解してなる１００μｌ
の溶液及び上で得た冷凍溶液の２５０μｌのアリコートに相当する１ｍｇのｅｒ
ｙＣＩＩＩ蛋白質を続けて、スクリュー栓を備えたガラス管に導入する。 渦巻きによりホモジネーションした後に、栓をしたガラス管を３０℃に恒温制
御した浴に５時間入れ、次いでｐＨを３２％ＮａＯＨにより９〜１０に調節し、
次いで反応混合物を５ｍｌの酢酸エチルにより３回抽出する。得られた抽出物を
減圧下に乾固させ、次いで１００μｌの塩化メチレンで溶解したものを、次いで
、溶離剤として塩化メチレン／メタノール混合物（９０：１０、ｖ／ｖ）を使用
して、例４に示した条件下でＴＬＣにより分析する。 対照試験（ｔ＝０）（このインキュベーションはＮａＯＨの添加により直ちに
停止する）を同じ条件下で実施する。 化学的な明示により得られた結果は、予期されたエリスロマイシンＤに近似す
るＲｆを有し、その弱い抗生物質活性がＢ．ｐｕｍｉｌｕｓについてのプレート
の直接オートバイオグラムにより検出される易動性でない生成物の出現を示す。 これらの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉで産生し、上記のように精製されたｅｒｙＣＩ
ＩＩ蛋白質が予期したデソサミニルトランスフェラーゼ活性を有し、正確に変性
されたことを確認させる。
【０２０７】例３１ ：Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓにおけるグリコシルトランスフェラーゼ
をコード化するｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺伝子を単離するためのプローブとし
てｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の配列の使用
【０２０８】 １）ｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺伝子のクローニング デソサミニルトランスフェラーゼ活性をコード化する例１に記載したＯＲＦ８
に相当するＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の配列を使用し
てハイブリダイゼーションプローブを調製し、サザーンハイブリダイゼーション
によりオレアンドマイシンを産生するＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ
１１８９１における相同性遺伝子の単離を可能にさせた。 例３に記載した操作条件に従い、生のｐｆｕポリメラーゼ（ストラトジェン社
）を使用し、次の配列： ｅｒｙＣＩＩＩ−１：CGGGTACCATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG （SEQ ID No.59） を有するオリゴヌクレオチドであってその５’領域にＫｐｎＩ制限部位を含み且
つその３’部分が図２の配列の位置１０１９６〜位置１０２１９に位置するＤＮ
Ａ領域の相補鎖に相当するもの並びに次の配列： ｅｒｙＣＩＩＩ−２：CGGGTACCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCC （SEQ ID No.60 ） を有するオリゴヌクレオチドであってその５’領域にＫｐｎＩ部位を含み且つそ
の３’部分が図２の配列の位置８９５４〜位置８９７４に位置するＤＮＡ領域の
相補鎖に相当するものをプライマーとして使用して、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の全
体を例１で得た６ｎｇのプラスミドｐＫ６２からＰＣＲにより増幅させた。 次いで、増幅により得られたほぼ１．２ｋｂのバンドをＫｐｎＩ制限酵素によ
り消化し、ＫｐｎＩ酵素により予め消化させたプラスミドｐＵＣ１９においてク
ローニングした。次いで、このようにして得られたプラスミドｐＣＩＩＩＰＣＲ
１を使用して、図２に示したｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の全てに相当する１．２ｋｂ
のＫｐｎＩ断片を再単離した。このようにして単離した断片を次いでサムブルッ
ク他、１９８９により報告された“ランダムプライミング”を使用して32Ｐによ
り標識化し、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ＡＴＴＣ１１８９１のゲノムＤＮ
Ａライブラリーから得られ且つ以下の態様（図２０）で調節されたコスミドクロ
ーンをサザーンハイブリダイゼーションにより分析するためのｅｒｙＣＩＩＩプ
ローブとして使用した。 スワン他、１９９４により報告された方法に従い、エリスロマイシンの生合成
遺伝子のクラスター内のＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのポリテチドシンターゼの
第三サブユニットで２ｋｂのＳｍａＩ内部断片をプローブとして使用し、次いで
染色体ウオーキングによって、オレアンドマイシン生合成遺伝子のクラスターに
相当する領域のほぼ１００ｋｂをオーバーラップし、カバーする一連の６個のコ
スミド（ｃｏｓＡＢ３５、ｃｏｓＡＢ７６、ｃｏｓＡＢ８７、ｃｏｓＡＢ６７、
ｃｏｓＡＢ６３及びｃｏｓＡＢ６１）を単離した。Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのｄＴＤ
Ｐ−グルコースシンターゼ、ｄＴＤＰ−グルコース４，６−デスヒドラターゼ及
びｄＴＤＰ−６−デオキシグルコース３，５−エピメラーゼ（ストックマン及び
ピーパースベルグ、１９９２）をそれぞれコード化するｓｔｒＤ、ｓｔｒＥ及び
ｓｔｒＭは、ｃｏｓＡＢ６１及びｃｏｓＡＢ６３コスミドによりハイブリダイゼ
ーションする（図２０）。類似の態様で、ホップウッド他、１９８５により報告
された標準的条件下で実施する上記のように調製したｅｒｙＣＩＩＩプローブに
よるサザーンハイブリダイゼーションによって、ｃｏｓＡＢ３５コスミド（スワ
ン他、１９９４）は、図２０に表わされた３．５ｋｂ及び２．７ｋｂの２個のＢ
ａｍＨＩ制限断片に正のシグナルを生じさせる。これに続くサブクローニング及
びシークエンシングは、これらの２個の断片がハイブリダイゼーションにより検
出されない０．６ｋｂのＢａｍＨＩ断片により分離されることを示す。 図２１に表わされ、ｏｌｅＢ遺伝子の１．４ｋｂ上流に位置するＥＭＢＬ Ｎ
ｏ．Ｌ０９６５４配列のＰＫＳのＯＬＥ−ＯＲＦ３遺伝子の位置１１０８１のＳ
ｓｔＩ部位とＥＭＢＬ Ｎｏ．Ｌ３６６０１配列の位置５のＳｓｔＩ部位との間
に含まれるオレアンドマイシン生合成遺伝子のクラスターの右部分に相当し、及
び上で調製したｅｒｙＣＩＩＩプローブによりハイブリダイゼーションするＳ．
ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ＡＴＴＣ１１８９１のゲノムＤＮＡの１０．８ｋｂ
のＳｓｔＩ断片をｃｏｓＡＢ３５コスミドから単離し、プラスミドベクターｐＳ
Ｌ１１８０（ファルマシア・バイオテク社）においてサブクローニングさせた。
このようにして得たｐＣＯ３５−Ｓクローンを使用して、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ
Ｐ１３ｍｐ１９バクテリオファージ（ニューイングランド・バイオラボ社）にお
いて異なったＤＮＡ断片をサブクローニングすることによって一本鎖鋳型を生成
させ、次いでこれらの断片のヌクレオチド配列をサンガー他（１９７７）の方法
に従い、バンドの圧縮の問題を制約するために供給者の勧めに従ってα［35Ｓ］
ｄＣＴＰ（アメルシャム社）及び７−デアザ−ｄＧＴＰの存在下に変性Ｔ７ポリ
メラーゼ（セクイナーゼバージョン２．０、米国バイオケミカルズ社）を使用し
て決定した。セクイナーゼキットから供給した標準プライマー及び内部合成プラ
イマー（１７ｍｅｒ）を使用した。 断片組立プログラム（ゲネチック・コンピューター・グループ、ウイスコンシ
ン大学）及びコドンプレファレンスプログラムを使用するオープンリーデイング
フレーム（ドゥブロー他、１９８４）の同定を使用して、配列データの組立を実
施した。 得られたヌクレオチド配列は、図２１に示すＳｐｈＩ*部位とＫｐｎＩ部位の 間に含まれる図２２で表わされる６０９３ｂｐのヌクレオチド配列（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１５の配列）を立証させた。ここに、５個のＯＲＦがヌクレオチド１
８４からヌクレオチド１３８６（ｏｌｅＰ１と称するＯＲＦ）、ヌクレオチド１
４３７からヌクレオチド２７１４（ｏｌｅＧ１と称するＯＲＦ）、ヌクレオチド
２７２２からヌクレオチド３９９９（ｏｌｅＧ２と称するＯＲＦ）、ヌクレオチ
ド３９９２からヌクレオチド４７２９（ｏｌｅＭと称するＯＲＦ）及びヌクレオ
チド４８１０からヌクレオチド５９６７（ｏｌｅＹと称するＯＲＦ）と同定され
た。５個のＯＲＦは同じ方向で転写される。 ＯＲＦのｏｌｅＰ１、ｏｌｅＧ１、ｏｌｅＧ２、ｏｌｅＭ及びｏｌｅＹのコー
ド化領域を含むプラスミドｐＣＯ３５−Ｓを含有するＥ．ｃｏｌｉの試料は、１
９９８年４月８日に微生物培養物国際収集機関（ＣＮＣＭ）であるパスツール研
究所（フランス、７５７２４パリ セデックス１５、リュ・ジュ・ドクチュール
・ロウ２５）に番号Ｉ−２００３として寄託された。 ｏｌｅＧ１遺伝子は、４２６個のアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）を有
するポリペプチドをコード化する。しかし、ＧＴＧコドンのすぐ上流に位置する
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおけるこのクラスのグリコシルトランスフェラーゼ
で高く保持されたアルギニンをコード化するＣＧＣコドンの存在は、開始コドン
が配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０．１７の位置１４３１にあるＣＴＧコドンであり得る
ことを示すであろう。 ｏｌｅＧ２遺伝子は、４２６個のアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８）を有
するポリペプチドをコード化する。 ブラストプログラム（アルツシュール他、１９９０）を使用して上記のｏｌｅ
Ｇ１及びｏｌｅＧ２のＯＲＦの誘導されたアミノ酸配列とデータベースの蛋白質
とを比較すると、異なった出所からのグリコシルトランスフェラーゼとの類似性
、特に、例３０に記載したｅｒｙＣＩＩＩデソサミニルトランスフェラーゼと７
２％の類似性及び５３％の同一性が示された。 次いで、ｏｌｅＧ１遺伝子又はｏｌｅＧ２遺伝子の機能の同定をＳ．ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｕｓ ＡＴＴＣ１１８９１における標的遺伝子の妨害によって及び
例３〜４に記載した方法を使用して変異体株により産生したオレアンドマイシン
の非グリコシル化先駆物質の同定によって実施した。
【０２０９】 ２）Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ｏｌｅＧ１Δ株（Ａ３５Ｇ１）の生成 オレアンドマイシンを産生するＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ株ＡＴＴＣ１１
８９１の染色体ＤＮＡの相同性領域にプラスミドｐＣＯ３を組み込むことによっ
てｏｌｅＧ１遺伝子が妨害された株を調製した。 まず、上で調製したプラスミドｐＣＯ３５−ＳをＢａｍＨＩ制限酵素により消
化することによって得たｏｌｅＧ１遺伝子より０．６ｋｂ内部のＢａｍＨＩ断片
（図２１）をプラスミドｐＯＪ２６０ ＮＲＲＬ Ｂ−１４７８５のＢａｍＨＩ
部位においてサブクローニングした。 次いで、このようにして生成したプラスミドｐＣＯ３をＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１ ｒｅｃＯ１５０４：：Ｔｎ５（コロドナー他、１９８５）中に移し、次いでＳ
．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓのプロトプラストを形質転換するのに使用した。ト
ランスフォーマントの選択は、アプラマイシン（注射用等級のアプラマイシン、
ローヌ・メリウ社）に対する抵抗性によって実施した。 プロトプラストの調製は、ホプウッド他、１９８５により報告された条件に従
ってＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ株ＡＴＴＣ１１８９１から実施した。 形質転換は、プロトプラストの５０μｌアリコート及び５μｇのプラスミドＤ
ＮＡ ｐＣＯ３を使用し、チオストレプトンを２５μｇ／ｍｌの最終濃度でアプ
ラマイシンで置き換えることにより実施した。 アプラマイシンに対する抵抗性によって実施したインテグラントの選択はＡ３
５Ｇ１と称するクローンを単離するのを可能にした。 Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓの染色体の相当領域における予期された変化が
サザーンブロット法によるゲノム解析によって確認された。単離し、次いで野生
型Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ株又はＡ３５Ｇ１変異体からのＰｓｔＩ制限酵
素により消化された染色体ＤＮＡを、上記の０．６ｋｂのＢａｍＨＩ断片をハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用してサザーン法により分析した。このよ
うにして野生型株で検出された４．７ｋｂのＰｓｔＩ断片をＡ３５Ｇ１変異体に
おける２．４及び６．５ｋｂの２個のＰｓｔＩ断片により置き換えることによっ
てプラスミドｐＣＯ３がＡ３５Ｇ１株の染色体にｏｌｅＧ１ ＯＲＦのレベルで
組み込まれることが確認される。 次いで、このようにして得られたＡ３５Ｇ１組換え株をこれより産生する先駆
物質を同定するために培養した。
【０２１０】 ３）Ａ３５Ｇ１株の発酵及び産生するオレアンドマイシン先駆物質の同定 Ａ３５Ｇ１株を、例４に記載した条件下でＥＰ１培地での４８時間予備培養か
らのＥＰ２培地中で５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにおいて７２時間培養
した。 酢酸エチルによる培養液抽出物を次いで例３及び４で使用した方法に従って分
析した。 ａ）抗生物質に対する細菌感受性を記録することによる生物学的試験を以下の
態様で実施した。 Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ株をＴＳＢ培地で３７℃で終夜増殖させた後、培養物を５
０％（ｗ／ｖ）のグリセリンを含有する媒体中で１／１００まで希釈し、次いで
得られた細胞懸濁液を−２０℃に保存してから使用する。 次いで、１％の寒天を含有し且つ５５℃に保持した１００ｍｌのＴＳＢ培地中
に１５０μｌの解凍した細胞懸濁液を導入することによって生物学的試験を実施
した。次いで、この混合物をペトリ皿に注いだ。冷却した後、５０〜２００μｌ
の酢酸エチル抽出物を含有するオックスホードシリンダーを寒天皿上に置き、４
℃で２時間保持し、次いで３７℃で終夜インキュベーションした。 抽出物はＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ ＡＴＴＣ１４８８４の増殖に対して抑止効果を
示さない。 ｂ）標準物質としてエリスロマイシンＡ、エリスロノリドＢ及び６−デオキシ
エリスロノリドＢを使用して、化学的明示を伴うＴＬＣによる分析を例４に記載
した条件に従って実施した。 ＴＬＣによる分析は、Ａ３５Ｇ１株がオレアンドマイシンを産生しないが、エ
リスロノリドＢよりも大きく且つ６−デオキシエリスロノリドＢに近似する易動
性を有するクリムソン生成物を優先的に蓄積させること、アグリコン８，８ａ−
デオキシオレアンドリド部分が予期できないことを示す。 ｃ）質量分光法を結びつけたＲＨ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる分析を
例４に記載した条件に従って実施した。２個の主要な代謝産物（Ｍ９及びＭ１０
と称する）が検出された（それぞれ６．１２ｍｎ及び１７．２３ｍｎで溶離）。
二つの生成物は、ｍ／ｚ３７３で親ピーク及び構造［８，８ａ−デオキシオレア
ンドリド］Ｈ+と一致し得る類似の断片化プロフィルを生じる。 しかし、Ｍ１０代謝産物の保持時間のみが提案した構造と一致するが、Ｍ９代
謝産物は異性体構造又は開環したラクトン分子に相当しよう。 また、例６に記載したＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＣＩＩＩ６８及び例１６
に記載したＢＶ８８の変異体株を補足する実験を、ｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺
伝子のそれぞれを発現させるプラスミド構築物を使用して実施した。 これらの観察及びオレアンドロシル８，８ａ−デオキシオレアンドリド又はデ
ソサミニル８，８ａ−デオキシオレアンドリドの検出の不存在は、ｏｌｅＧ１遺
伝子がオレアンドマイシンの生合成に係わるデソサミニルトランスフェラーゼを
コード化し、またｏｌｅＧ２がオレアンドロシルトランスフェラーゼをコード化
することをそれぞれ示す。
【０２１１】例３０の製造例 ：チミジン５’−（トリ水素ジホスフェート），Ｐ’−［３，４
，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキソピラノシル］
エステル，Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン工程Ａ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース塩酸塩 １．５Ｌの６Ｎ塩酸に１４６ｇのエリスロマイシンＡを周囲温度で攪拌しなが
ら添加する。得られた溶液を２時間還流させる。反応媒体を周囲温度に冷却し、
ろ過し、得られた残留物を水洗する。水性相を塩化メチレンで抽出し、次いで硫
酸エーテルで洗浄する。水性相に１０ｇの黒色Ｌ2Ｓを添加し、微量のエーテル を減圧下に追い出す。ろ過し、濃縮したのち、同じ条件で第二の実験を実施する
。二つの実験を一緒にし、エタノール（１５０ｃｍ3）に溶解し、１５０ｃｍ3の
エチルエーテルを添加する。得られた結晶を脱水し、洗浄し、乾燥する。４２ｇ
の所期の生成物を得た。Ｍｐ＝１５８〜１６０℃。工程Ｂ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース １，２−ジアセテート １５．２７ｇの工程Ａの生成物と１５０ｃｍ3の塩化メチレンを含有する混合 物に６０ｃｍ3のトリエチルアミンを２０℃で攪拌しながら添加する。２０ｃｍ3 の無水酢酸及び８０ｃｍ3の塩化メチレンを含有する溶液を２０℃で添加する。 周囲温度で２０時間攪拌し、洗浄し、濃縮し、硫酸エーテル中でペースト状にす
る。ろ液を減圧下に濃縮する。得られた残留物を酢酸エチル−トリエチルアミン
混合物（９５−５）により溶離することによってクロマトグラフィーする。１８
．６ｇの所期の生成物を得た。これはそのまま次の工程に使用する。工程Ｃ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース ２−アセテート １８．６ｇの工程Ｂの生成物と５０ｃｍ3のＤＭＦを含有する混合物を５０℃ にもたらし、６．６２ｇのヒドラジン酢酸塩ＮＨ2ＮＨ2・ＡｃＯＨを添加する。
反応混合物を攪拌し、これを酸性炭酸ナトリウム飽和溶液上に注ぐ。水性相を酢
酸エチルで抽出する。有機相を一緒にし、乾燥し、ろ過し、濃縮し、減圧下に蒸
留してトルエンとの共沸連行によりＤＭＦを除去する。１１．２８ｇの生成物を
得た。これをシリカでクロマトグラフィーし、酢酸エチル−トリエチルアミン混
合物（９０−１０）により溶離する。６．５ｇの所期の生成物を得た。これはそ
のまま次の工程に使用する。工程Ｄ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース ２−アセテート ビス（フェニルメチル）ホスフェート １．７３８ｇの上記工程の生成物と４０ｃｍ3のＴＨＦを含有する溶液に、５ ．７ｃｍ3のｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液を−７０℃で添加する。即時に 調製した１０ｇのジベンジルホスフォクロリド（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５
８，ｐ．１９５７）
【化１】 を２０ｃｍ3のＴＨＦに溶解してなる溶液を−７０〜−７５℃で添加する。−７ ０〜−７４℃１時間３０分攪拌し続ける。反応媒体を酸性炭酸ナトリウム飽和溶
液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し
、濃縮する。得られた生成物をシリカでクロマトグラフィーし、アセトン−塩化
メチレン混合物（５−５）で溶離する。１．０７０ｇの所期の生成物を得た。工程Ｅ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース，１−（ジ水素ホスフェート），Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン １．０７０ｇの上記工程の生成物、２０ｃｍ3の酢酸エチル、１０ｃｍ3のメタ
ノール、０．６２２ｃｍ3のトリエチルアミン及び２００ｇのパラジウム担持炭 を含有する混合物を水素気流内で周囲温度で３０分間攪拌し続ける。反応媒体を
ろ過し、メタノール及び酢酸エチルで洗浄し、ろ液を濃縮する。１ｇの油状物を
得た。これに１０ｃｍ3のメタノールを添加する。得られた溶液を２０時間攪拌 する。メタノールを減圧下に３０℃で追い出す。６８０ｍｇの所期の生成物を得
た。工程Ｆ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース，１−（ジ水素ホスフェート） 上記の工程で得られ、トリエチルアミン塩の形で単離された４２０ｍｇの生成
物を１．６ｃｍ3のメタノールに溶解する。３．２ｃｍ3の硫酸エーテルを添加す
る。次いで、６．４ｃｍ3の硫酸エーテルを添加する。融点が２４２〜２４４℃ である２５０ｍｇの所期の生成物を得た。工程Ｇ ：チミジン５’−（トリ水素ジホスフェート），Ｐ’−［３，４，６−ト
リデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキソピラノシル］エステル
，Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン ２２８ｍｇの製造１の生成物、６ｃｍ3のピリジン及び５４４ｍｇのチミジン ５’−モノホスフェートモルホリデート−４−モルホリン−Ｎ，Ｎ’−ジシクロ
ヘキシルカルボキサアミジンを混合する。温度を３０℃以下に保持しながら回転
蒸発器を使用して減圧下にピリジンを追い出す。６ｃｍ3のピリジンを添加し、 これを減圧下に追い出す。この操作を２回繰り返す。６ｃｍ3のピリジン及び１ ０５ｍｇの１Ｈ−テトラゾールを添加する。周囲温度で３日間攪拌する。減圧下
にピリジンを追い出し、水で溶解し、ろ過し、濃縮し、得られた生成物をクロマ
トグラフィーにより精製する。このようにして、所期の生成物を得た。 Ｒｆ＝０．１２（溶離剤：ＣＨ2Ｃｌ2、ＭｅＯＨ、水（６０−３５−６））。
【０２１２】 参考図書 アルトシュール ＳＦ、ギシュ Ｗ、ミラー Ｗ、マイヤー ＥＷ、リップマ
ン ＤＪ；（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０ アウスベル ＦＭ、ブレント Ｒ、キングストン ＲＥ、ムーア ＤＤ、セイ
ドマン ＪＧ、スミス ＪＡ、ストルール Ｋ；（１９９５）「分子生物学にお
ける現在のプロトコル」、マサチューセッツ・ジェネラル・ホスピタル及びハー
バード医学校、ジョンウイリー＆ソンズ社 バンキエル ＡＴ、ウエストン ＫＭ、バレル ＢＧ；（１９８７）Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｙ １５５：５１−９３ ベビット ＤＪ、コルテス Ｊ、ヘイドック ＳＦ、リードレイ ＰＦ；（１
９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０４：３９−４９ カフレー Ｐ、ベビット ＤＪ、スタウントン Ｊ、リードレイ ＰＦ；（１
９９２）ＦＥＢＳ３０４：２２５−２２８ コルテス Ｊ、ハイドック ＳＦ、ロバーツ ＧＡ、ベビット ＤＪ、リドレ
イ ＰＦ；（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：１７６−１７８ ドゥブロー Ｊ、ヘバーリ Ｐ、スミチエ Ｏ；（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５ ディロン Ｎ、ホール ＲＳ、コルテス Ｊ、リードレイ ＰＦ；（１９８９
）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１４０５−１４１４ ディケンズ ＭＬ、イエ Ｊ、ストロール ＷＲ；（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１７８：３３８４−３３８８ ドナジオ Ｓ、スタッシ Ｊ、マカルピン ＪＢ、スタバー ＭＪ、シェルド
ン ＰＪ、ジャクソン Ｍ、スワンソン ＳＪ、ウエンツ−ピエンコウスキー
Ｅ、ワング ＹＧ、ジャービス Ｂ、ハッチンソン ＣＲ、カッツ Ｌ；（１９
９３）Ｉｎ：バルツ ＲＨ、ヘジマン ＧＤ、スカトラド ＰＬ（編）：「工業
用微生物：基本及び応用分子遺伝学」アメリカ微生物学会 、ワシントンＤＣ、
２５７−２６５ ガンデチャ ＡＲ、ラージ ＳＬ、カンドリフ Ｅ；（１９９７）Ｇｅｎｅ１
８４：１９７−２０３ ヘイドック ＳＦ、ドウソン ＪＡ、ディロン Ｎ、ロバーツ ＧＡ、コルテ
スＪ、リードレイ ＰＦ；（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：
１２０−１２８ ヘスラー ＰＥ、ラーセン ＰＥ、コンスタンチノフ ＡＩ、シュラム ＫＨ
、ウエーバー ＪＭ；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．（
１９９７）４７：３９８−４０４ ホップウッド ＤＡ、キーザー Ｔ、ライト ＨＭ、ビブ ＭＪ；Ｊ．ｏｆ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８３）１２９：２２５７−２
２６９ ホップウッド ＤＡ、ビブ ＭＪ、シャター ＫＦ、キーザー Ｔ、ブルトン Ｃ、キーザー ＨＭ、リディエート ＤＪ、スミス ＣＰ、ワード ＪＭ、シ
ュレンプ Ｈ；（１９８５）「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの遺伝学的取り扱い
実験室マニュアル」ジョン・アイネス・ハウンドエーション、ノーウイッチ 金田 Ｔ、ブッテ ＪＣ、タウブマン Ｂ、コルコラン ＪＷ；（１９６２）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７：３２２−３２７ カッツ Ｅ、トンプソン ＣＪ、ホップウッド ＤＡ；（１９８３）Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９：２７０３−２７１４ コルツ ＤＪ、リナス Ｕ、ヘルムス Ｋ、サンダース ＥＡ、デックウエア
ー Ｗ−Ｄ；（１９９５）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３９：５９
−６５ カッツ Ｊ、ドナジオ Ｓ；（１９９５）「マクロダイド」Ｉｎ：ビニング
ＬＣ、スタッタード Ｃ（編）「抗生物質の産生の遺伝学及び生化学」、バッタ
ーワース−ハイネマン社、ニュートン、ＭＡ、３８５−４２０ リウ Ｈ−Ｗ、ソーソン ＪＳ；（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．４８：２２３−５６ オッテン ＳＬ、リウ Ｘ、ファーガソン Ｊ、ハッチンソン ＣＲ；（１９
９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６６８８−６６９２ 榊原 Ｈ、小村 Ｓ；（１９８４）Ｉｎ：小村 Ｓ（編）「マクロライド抗生
物質：化学、生物学及び実行」、アカデミックプレス社、ロンドン、８５−１２
５ サムブルック Ｊ、フリッチ ＥＦ、マニアチス Ｔ；（１９８９）「分子ク
ロニング、実験室マニュアル 第二版」、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス社、ＮＹ サンガー Ｆ、ニックレン Ｓ、コウルソン ＡＲ；（１９７７）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７ スコッチ Ｃ、ハッチンソン ＣＲ；（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７８：７３１６−７３２１ スクラットン ＮＳ、ベリー Ａ、パーハム ＲＮ；（１９９０）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４３：３８−４３ スタデン Ｒ；（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｓ Ｒｅｓ．１２：５２
１−５２８ スタッシ Ｄ、ドナジオ Ｓ、スタバー ＭＪ、カッツ Ｌ：（１９９３）Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１８２−１８９ ステムマー ＷＰＣ；（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｖｏｌ．９１，ｐｐ．１０７４７−１０７５１ ストックマン Ｍ、ピーパースベルグ Ｗ；（１９９２）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９０：１８５−１９０ スワン ＤＧ、ロドリゲス ＡＭ、ビルチェ メンデス Ｃ、サラス ＪＡ；
（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：３５８−３６２ ワード ＪＭ、ジャンセン ＧＲ、キーザー Ｔ、ビブ ＭＪ、バットナー
ＭＪ、ビブ ＭＪ；（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８
−４７５ ウエバー ＪＭ、ビアーマン ＣＫ、ハッチンソン ＣＲ；（１９８５）Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：４２５−４３３ ウエバー ＪＭ、ロシック Ｒ；（１９８８）Ｇｅｎｅ ６８：１７３−１８
０ ウエバー ＪＭ、ショーナー Ｂ、ロシック Ｒ；（１９８９）Ｇｅｎｅ ７
５：２３５−２４１ ウエバー ＪＭ、リュング ＪＯ、メイン ＧＴ、ポテンツ ＲＨＢ、ポーラ
ス ＴＪ、デウイット ＪＰ；（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：
２３７２−２３８３ ウエバー ＪＭ、リュング ＪＯ、スワンソン ＳＪ，アイドラー 、ＫＢ
マカルピン ＪＢ；（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１１４−１１７ ウエメイヤー ＵＦ；（１９９５）Ｇｅｎｅ １６５：１４９−１５０ ウイレンガ ＲＫ、タープストラ Ｐ、ホール ＷＧＪ；（１９８６）Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７：１０１−１０７ 山本 Ｈ、マウラー ＫＨ、ハッチンソンＣＲ；（１９８６）Ｊ．Ａｎｔｉｂ
ｉｏｌ．３４：１３０４−１３１３
【０２１３】 ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇにおけるフリーテキスト ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１ ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＩＩ” ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＩＩ” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：４ ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＩＩＩ” ／ｎｏｔｅ＝“ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、１０４６〜２３０８” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：６ ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＩＶ” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：２４２．．２４４、ａａ：Ｍｅｔ）
／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＶ” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：１２１０．．１２１２、ａａ：Ｍｅ
ｔ） ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＶＩ” ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＶＩ” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：３３０８．．３３１０、ａａ：Ｍｅ
ｔ） ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＶ” ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＶＩＩ” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：７５７８．．７５８０、ａａ：Ｍｅ
ｔ） ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１３ ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＩＶ” ／ｎｏｔｅ＝“ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、４８３７〜６０３９” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１５ ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＰ１” ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“８，８ａ−デオキシオレアンドリドのグリコシル化” ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＧ１” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：１４３７．．１４３９、ａａ：Ｍｅ
ｔ） ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“８，８ａ−デオキシオレアンドリドのグリコシル化” ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＧ２” ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＹ” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：２０ ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＭ” ／ｎｏｔｅ＝“ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、３９９２〜４７２９” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６０ ／ｄｅｓｃ＝“ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：６１ ／ｎｏｔｅ＝“ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１、３８〜５０”
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＢＲ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＭＸ，ＴＲ，ＵＳ (72)発明者 カディジャ サラウベイ フランス国 エフ75013 パリ、ブールヴ ァール マセーナ、100、アパルトマン 2042 (72)発明者 イエスス コルテス イギリス国 シービー４ １ピーゼット ケンブリッジ、ユニオン レーン、カンバ ンクス 26 (72)発明者 ザビーネ ガイザー イギリス国 シービー１ ２エルジー ケ ンブリッジ、グワイダー ストリート 37 (72)発明者 ピーター リードレイ イギリス国 シービー２ ２ビーエイチ ケンブリッジ、クラレンドン ロード 17 (72)発明者 カルメン メンデス スペイン国 エ33010 オビエド、セグン ドベ、カレ マルセリノ フェルナンデス ７ (72)発明者 ホセ ア．サラス スペイン国 エ33060 オビエド、２バホ イスクイェルダ、カレ ギリェルモ エ ストラーダ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA07 BA67 CA09 FA17 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ15 QQ98 QS17 QS31 4B064 AE47 AF02 AG01 CA03 CA04 CA19 DA02 4B065 AA01X AA50X AB01 CA34 CA44

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 図２に示した単離された一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列(SEQ I
    D NO:１の順行配列及び相補性配列)であって、エリスロマイシン生合成遺伝子の
    クラスターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡＩＩＩ領域に対応する当該単離された一本鎖又
    は二本鎖ＤＮＡ配列。
  2. 【請求項２】 下記を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列： − ＯＲＦ７(SEQ ID NO:１のヌクレオチド４８〜１０４６の相補性配列)に対応
    し、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼを
    コードするｅｒｙＢＩＩ配列、 − ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１０４６〜２３０８の相補性配列)に
    対応し、デソサミニルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＣＩＩＩ配列、及
    び − ＯＲＦ９(SEQ ID NO:１のヌクレオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)に
    対応し、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラー
    ゼをコードするｅｒｙＣＩＩ。
  3. 【請求項３】 ＯＲＦ７(SEQ ID NO:１のヌクレオチド４８〜１０４６の相 補性配列)に対応するｅｒｙＢＩＩ配列、ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１のヌクレオチド
    １０４６〜２３０８の相補性配列)に対応するｅｒｙＣＩＩＩ配列又はＯＲＦ９(
    SEQ ID NO:１のヌクレオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)に対応するｅｒ ｙＣＩＩ配列から選択する図２に示した単離されたＤＮＡ配列及びこの配列又は
    その断片とハイブリダイズし且つ／又は有意の相同性を示し且つ同じ機能を有す
    る配列。
  4. 【請求項４】 ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１０４６〜２３０８ の相補性配列＝SEQ ID NO:４の相補性配列)に対応し且つデソサミニルトランス フェラーゼをコードする図２に表示した単離されたＤＮＡ配列ｅｒｙＣＩＩＩ。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４の１つに記載のＤＮＡ配列の１つによりコード
    されるポリペプチド。
  6. 【請求項６】 ＯＲＦ７(SEQ ID NO:２の配列を有する)、ＯＲＦ８(SEQ ID
    NO:５の配列を有する)又はＯＲＦ９(SEQ ID NO:３の配列を有する)より選択する
    図２に示したＯＲＦに対応する請求項５に記載のポリペプチド及びこのポリペプ
    チドのアナログ。
  7. 【請求項７】 図２に示したＯＲＦ８に対応し、デソサミニルトランスフェ
    ラーゼ活性を有し、ＥｒｙＣＩＩＩと呼ばれる、請求項５に記載のポリペプチド
    (SEQ ID NO:５の配列を有する)。
  8. 【請求項８】 エリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＡＩ−
    ｅｒｙＫ領域に対応する図３に示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:６の配 列)。
  9. 【請求項９】 下記を含む、請求項８に記載のＤＮＡ配列： − ＯＲＦ１３(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２４２〜１２０７の配列)に対応し
    、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼをコード
    するｅｒｙＢＩＶ配列、 − ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応
    し、ミカロシルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＢＶ配列、 − ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２０の配列)に対応
    し、ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
    、 − ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７の配列)に対応
    し、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
    をコードするｅｒｙＢＶＩ配列、 − ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６０３９の配列)に対応
    し、ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼをコードす
    るｅｒｙＣＩＶ配列、 − ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)に対応
    し、ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼをコー
    ドするｅｒｙＣＶ配列及び − ＯＲＦ１９(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)に対応
    し、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５エピメラーゼをコ
    ードするｅｒｙＢＶＩＩ。
  10. 【請求項１０】 図３に示したＯＲＦ１３(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２ ４２〜１２０７の配列)に対応するｅｒｙＢＩＶ配列、ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:６
    のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応するｅｒｙＢＶ配列、ＯＲＦ １５(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２０の配列)に対応するｅｒｙ
    ＣＶＩ配列、ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７の配 列)に対応するｅｒｙＢＶＩ配列、ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８
    ３７〜６０３９の配列)に対応するｅｒｙＣＩＶ配列、ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:６
    のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)に対応するｅｒｙＣＶ配列又はＯＲ Ｆ１９(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)に対応するｅｒ
    ｙＢＶＩＩ配列及びこの配列とハイブリダイズし且つ／又はこの配列との有意の
    相同性を示す配列又はその断片(同じ機能を有するもの)より選択する単離された
    ＤＮＡ配列。
  11. 【請求項１１】 ｅｒｙＢＶという図３に示したＯＲＦ１４(SEQ ID NO:６ のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応し、ミカロシルトランスフェ ラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列。
  12. 【請求項１２】 請求項８〜１１の１つに記載のＤＮＡ配列の１つによりコ
    ードされるポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 図３に示したＯＲＦ１３(SEQ ID NO:７の配列を有する)、
    ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:８の配列を有する)、ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:９の配列を 有する)、ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:１０の配列を有する)、ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:
    １４の配列を有する)、ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:１１の配列を有する)又はＯＲＦ １９(SEQ ID NO:１２の配列を有する)から選択するＯＲＦに対応する請求項１２
    に記載のポリペプチド及びこのペプチドのアナログ。
  14. 【請求項１４】 図３に示したＯＲＦ１４に対応し且つミカロシルトランス
    フェラーゼ活性を有する請求項１２に記載のポリペプチド(SEQ ID NO:８の配列 を有する)である(ＥｒｙＢＶと呼ばれる)。
  15. 【請求項１５】 図２に示した配列ｅｒｙＢＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオ チド４８〜１０４６の相補性配列)、ｅｒｙＣＩＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオチ
    ド１０４６〜２３０８の相補性配列)又はｅｒｙＣＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオ
    チド２３２２〜３４０４の相補性配列)、図３に示したｅｒｙＢＩＶ(SEQ ID NO:
    ６のヌクレオチド２４２〜１２０７の配列)、ｅｒｙＢＶ(SEQ ID NO:６のヌクレ
    オチド１２１０〜２４５４の配列)、ｅｒｙＣＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド
    ２５１０〜３２２０の配列)、ｅｒｙＢＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０
    ８〜４８３７の配列)、ｅｒｙＣＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６
    ０３９の配列)、ｅｒｙＣＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の
    配列)又はｅｒｙＢＶＩＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配
    列)から選択するＤＮＡ配列の少なくとも１つの、Sac. erythraeaにおけるハイ ブリッド二次代謝産物を合成するための利用。
  16. 【請求項１６】 図２に示した配列ｅｒｙＢＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオ チド４８〜１０４６の相補性配列)、ｅｒｙＣＩＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオチ
    ド１０４６〜２３０８の相補性配列)又はｅｒｙＣＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオ
    チド２３２２〜３４０４の相補性配列)、図３に示したｅｒｙＢＩＶ(SEQ ID NO:
    ６の２４２〜１２０７の配列)、ｅｒｙＢＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１
    ０〜２４５４の配列)、ｅｒｙＣＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３
    ２２０の配列)、ｅｒｙＢＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７
    の配列)、ｅｒｙＣＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６０３９の配列
    )、ｅｒｙＣＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)又はｅ ｒｙＢＶＩＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)から選択
    するＤＮＡ配列又はこの配列の断片の少なくとも１つのハイブリダイゼーション
    プローブとしての利用。
  17. 【請求項１７】 図２に示したｅｒｙＣＩＩＩＤＮＡ(SEQ ID NO:１のヌク レオチド１０４６〜２３０８の相補性配列＝SEQ ID NO:４の相補性配列)の、マ クロライド系抗生物質の産生株におけるマクロラクトンのグリコシル化の原因の
    遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとしての利用。
  18. 【請求項１８】 相同遺伝子が、S. antibioticusにおけるオレアンドマイ シン生合成遺伝子である、請求項１７に記載の利用。
  19. 【請求項１９】 下記を含むオレアンドマイシン生合成遺伝子のクラスター
    の領域に対応する図２２に示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１５の配列)
    ： − ＯＲＦｏｌｅＰ１のヌクレオチド１８４〜１３８６に対応する配列、 − グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＲＦｏｌｅＧ１のヌクレ
    オチド１４３７〜２７１４に対応する配列、 − グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＲＦｏｌｅＧ２のヌクレ
    オチド２７２２〜３９９９に対応する配列、 − ＯＲＦｏｌｅＭのヌクレオチド３９９２〜４７２０に対応する配列(＝SEQ I
    D NO:２０の配列)及び − ＯＲＦｏｌｅＹのヌクレオチド４８１０〜５９６７に対応する配列。
  20. 【請求項２０】 図２２に示したＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌク レオチド１４３７〜２７１４の配列)に対応しグリコシルトランスフェラーゼ活 性をコードする配列及びＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド２７ ２２〜３９９９の配列)に対応しグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードす る配列より選択する単離されたＤＮＡ配列。
  21. 【請求項２１】 ＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド１４３ ７〜２７１４の配列)に対応し、デソサミニルトランスフェラーゼ活性をコード する請求項２０に記載の単離されたＤＮＡ配列。
  22. 【請求項２２】 ＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド２７２ ２〜３９９９の配列)に対応し、オレアンドロシルトランスフェラーゼ活性をコ ードする請求項２０に記載の単離されたＤＮＡ配列。
  23. 【請求項２３】 ＯＲＦｏｌｅＧ１に対応するＤＮＡ配列によりコードされ
    且つデソサミニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１ ７の配列)。
  24. 【請求項２４】 ＯＲＦｏｌｅＧ２に対応するＤＮＡ配列によりコードされ
    且つオレアンドロシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO
    :１８)。
  25. 【請求項２５】 Sac. erythraeaにおけるハイブリッド二次代謝産物の製造
    方法であって、該方法においては： − 図２(SEQ ID NO:１の相補性配列)又は図３(SEQ ID NO:６の配列)に示したエ
    リスロマイシンの生合成遺伝子のクラスターの少なくとも一のｅｒｙＢ配列又は
    ｅｒｙＣ配列を含むＤＮＡ配列を単離し、 − 該配列中に改変を造って、変化した配列を得、 − この変化した配列を宿主株の染色体中にインテグレートして、改変された株
    を得、 − この改変された株を、ハイブリッド二次代謝産物の形成を与える条件下で培
    養し、そして − このハイブリッド二次代謝産物を単離する、上記の製造方法。
  26. 【請求項２６】 ＤＮＡ配列が、下記より選択する酵素の１つをコードする
    、請求項２５に記載の方法 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
    、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
    、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。
  27. 【請求項２７】 配列の変化が少なくとも一の下記のの酵素の不活性化を生
    じる請求項２５に記載の方法 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
    、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
    、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。
  28. 【請求項２８】 不活性化される酵素がｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオ
    キシヘキソース４−レダクターゼである、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 不活性化される酵素がｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソ
    ース３，４−デヒドラターゼである、請求項２７に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 不活性化される酵素がミカロシルトランスフェラーゼであ
    る、請求項２７に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 不活性化される酵素がｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオ
    キシヘキソース２，３−レダクターゼである、請求項２７に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 単離されたハイブリッド二次代謝産物が４”−ケト−エリ
    スロマイシン、４’−ヒドロキシ−エリスロマイシン又は３”−Ｃデスメチル−
    ２”，３”−エン−エリスロマイシンから選択するエリスロマイシンアナログで
    ある、請求項２５に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 単離されたハイブリッド二次代謝産物がデソサミニルエリ
    スロノリドＢである、請求項２５に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 下記より選択する酵素の少なくとも１つが不活性化され且
    つ少なくとも一のハイブリッド二次代謝産物を生成しているSac. erythraeaの改
    変株 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
    、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
    、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。
  35. 【請求項３５】 ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３
    −レダクターゼが不活性化されていて３”−Ｃデスメチル−２”、３”−エン−
    エリスロマイシンＣを産生するSac. erythraeaの改変株(ＢＩＩ９２)。
  36. 【請求項３６】 ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レ
    ダクターゼが不活性化されていて４”−ケト−エリスロマイシンを産生するSac.
    erythraeaの改変株(ＢＩＶ８７)。
  37. 【請求項３７】 ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラ
    ターゼが不活性化されていて４’−ヒドロキシエリスロマイシンＤを産生するSa
    c. erythraeaの改変株(ＣＩＶ８９)。
  38. 【請求項３８】 ミカロシルトランスフェラーゼが不活性化されていてデソ
    アミニルエリスロマイシンＢを産生するSac. erythraeaの改変株(ＢＶ８８)。
  39. 【請求項３９】 S. antibioticusにおけるオレアンドマイシンの前駆体の 製造方法であって、該方法においては、 − 宿主株の染色体中のＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド１４ ３７〜２７１４の配列)に対応するＤＮＡ配列及びＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID NO:
    １５のヌクレオチド２７２２〜３９９９の配列)に対応するＤＮＡ配列から選択 した遺伝子の配列中に変化を造って、改変株を得、 − この改変株を、オレアンドマイシンの前駆体の蓄積を与える条件下で培養し
    、そして − これらの前駆体を単離する、上記の製造方法。
  40. 【請求項４０】 変化をＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド １４３７〜２７１４の配列)に対応するＤＮＡ配列中に造り、その結果が、少な くともデソアミニルトランスフェラーゼ活性の排除とオレアンドマイシン前駆体
    ８，８ａ−デオキシオレアンドリドの蓄積である、請求項３９に記載の製造方法
    。
  41. 【請求項４１】 チミジン５’−(トリヒドロゲンジホスフェート)、Ｐ’−
    [３．４，６−トリデオキシ−３−(ジメチルアミノ)−Ｄ−．キシロ．−ヘキソ ピラノシル]エステル(ｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミン)及びその塩基付加塩。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017536820A (ja) * 2014-11-14 2017-12-14 浙江海正薬業股▲ふん▼有限公司Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｈｉｓｕｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＣＯ．，ＬＴＤ． スピノサド異種発現株およびその構築方法ならびに使用

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6399789B1 (en) 1996-12-18 2002-06-04 Kosan Biosciences, Inc. Multi-plasmid method for preparing large libraries of polyketides and non-ribosomal peptides
US6388099B2 (en) 1998-10-29 2002-05-14 Kosan Biosciences, Inc. Production of 8,8a-dihydroxy-6-deoxyerythronolide B
DE60028956T2 (de) * 1999-04-16 2006-11-30 Kosan Biosciences, Inc., Hayward Multi-plasmid verfahren zur herstellung von grossen bibliotheken von polyketiden und nicht-ribosomalen peptiden
ES2165278B1 (es) * 1999-06-24 2003-06-16 Univ Oviedo Un procedimiento de obtencion de productos glicosilados mediante la biosintesis de los desoxiazucares: l-olivosa, l-oleandrosa y l-ramnosa.
US7033818B2 (en) 1999-10-08 2006-04-25 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant polyketide synthase genes
US6524841B1 (en) * 1999-10-08 2003-02-25 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant megalomicin biosynthetic genes and uses thereof
JP5037771B2 (ja) 2000-04-13 2012-10-03 バイオチカ テクノロジー リミテッド グリコシル化されたハイブリッド産物およびその産生方法と利用
CA2424567A1 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Regents Of The University Of Minnesota Method to alter sugar moieties
FR2851773A1 (fr) * 2003-02-27 2004-09-03 Aventis Pharma Sa Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leurs applications
JP5042497B2 (ja) * 2002-10-08 2012-10-03 アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム スピラマイシンの生合成に関与するポリペプチド、これらポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および、その使用
US7579167B2 (en) 2002-10-08 2009-08-25 Aventis Pharma S. Polypeptides involved in the biosynthesis of spiramycins, nucleotide sequences encoding these polypeptides and applications thereof
FR2845394A1 (fr) * 2002-10-08 2004-04-09 Aventis Pharma Sa Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leurs applications
GB0327721D0 (en) * 2003-11-28 2003-12-31 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
CA2824420A1 (en) 2011-01-28 2012-08-02 Amyris, Inc. Gel-encapsulated microcolony screening
CA2834783A1 (en) 2011-05-13 2012-11-22 Amyris, Inc. Methods and compositions for detecting microbial production of water-immiscible compounds
CA2879178C (en) 2012-08-07 2020-11-24 Amyris, Inc. Methods for stabilizing production of acetyl-coenzyme a derived compounds
EP2971027B1 (en) 2013-03-15 2019-01-30 Amyris, Inc. Use of phosphoketolase and phosphotransacetylase for production of acetyl-coenzyme a derived compounds
WO2015020649A1 (en) 2013-08-07 2015-02-12 Amyris, Inc. Methods for stabilizing production of acetyl-coenzyme a derived compounds
EP3313996A1 (en) 2015-06-25 2018-05-02 Amyris, Inc. Maltose dependent degrons, maltose-responsive promoters, stabilization constructs, and their use in production of non-catabolic compounds

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141926A (en) * 1990-04-18 1992-08-25 Abbott Laboratories Erythromycin derivatives
US5801032A (en) * 1995-08-03 1998-09-01 Abbott Laboratories Vectors and process for producing high purity 6,12-dideoxyerythromycin A by fermentation
US5998194A (en) * 1995-12-21 1999-12-07 Abbott Laboratories Polyketide-associated sugar biosynthesis genes

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017536820A (ja) * 2014-11-14 2017-12-14 浙江海正薬業股▲ふん▼有限公司Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｈｉｓｕｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＣＯ．，ＬＴＤ． スピノサド異種発現株およびその構築方法ならびに使用

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