JPH0363297A - 新規な修正されたｐｆ４組成物及び使用方法 - Google Patents
新規な修正されたｐｆ４組成物及び使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分９Ｆ ）
新しい毛細血管の発達である血管発生（アンギオゲネシ
スａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は発達しつつある胎児及
び成長する人に於いて重要な過程である。しかし、儲康
な成人に於いては、血管発生は傷の治癒及び月経サイク
ルにおいてのみ有意義に生じる。
スａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は発達しつつある胎児及
び成長する人に於いて重要な過程である。しかし、儲康
な成人に於いては、血管発生は傷の治癒及び月経サイク
ルにおいてのみ有意義に生じる。
現在では、成人に起っている血管発生の多くは性質上病
理学的なものであることが広く認識されている０例えば
、血管内皮細胞の増殖及び新しい毛細血管の形成は、容
量が数立方ミリメーターを越えるような充実性ｌ！瘍の
成長に必須のものである（フォークマン等、［１９８３
］Ｃ１ｂａ Ｆｏｕｎｄ、 Ｓｉｍｐ。
理学的なものであることが広く認識されている０例えば
、血管内皮細胞の増殖及び新しい毛細血管の形成は、容
量が数立方ミリメーターを越えるような充実性ｌ！瘍の
成長に必須のものである（フォークマン等、［１９８３
］Ｃ１ｂａ Ｆｏｕｎｄ、 Ｓｉｍｐ。
＋００： １３２〜＋４９） 、本発明者等は、発達し
つつあるＨ瘍は成長因子を分泌し、これは周りの内皮細
胞を分裂し、ＩＩ！瘍に向って移行することを刺激する
と理解している。
つつあるＨ瘍は成長因子を分泌し、これは周りの内皮細
胞を分裂し、ＩＩ！瘍に向って移行することを刺激する
と理解している。
充実性腫瘍の成長の池に、血管発生の機能不全を伴う他
の症状には、糖尿病性ｗ４膜症、水晶体後の線維増殖、
新生血管緑内障、乾瘤、線維性血管腫、免疫性及び非免
疫性炎症（関節リウマチを含む）、アテローム性動脈硬
化症プラーク内での毛細血管の増殖、血管腫、カボジ肉
腫を含んでおり、これらは最近制御が損われた内皮細胞
分裂及び毛管成長を特徴とする病気と認められている。
の症状には、糖尿病性ｗ４膜症、水晶体後の線維増殖、
新生血管緑内障、乾瘤、線維性血管腫、免疫性及び非免
疫性炎症（関節リウマチを含む）、アテローム性動脈硬
化症プラーク内での毛細血管の増殖、血管腫、カボジ肉
腫を含んでおり、これらは最近制御が損われた内皮細胞
分裂及び毛管成長を特徴とする病気と認められている。
これらの症状並びに充実性腫瘍の成長は、血管発生病と
して総称されている（フォークマンジエー、及びエム、
クラスバーン［１９８７］ ５ｃｉｅｎｃｅ ２３５：
４４２〜４４７） 。
して総称されている（フォークマンジエー、及びエム、
クラスバーン［１９８７］ ５ｃｉｅｎｃｅ ２３５：
４４２〜４４７） 。
血管発生病に加えて、内皮細胞の増殖が病原となってい
るか、少なくとも望まれないものとなっている他の症状
がある０例えば子宮内膜症は通常は子宮の内壁をなして
いるある種の内皮細胞の異常な増殖及び配置に特徴付け
られる。血管発生過程の抑制は、子宮内膜症を防止又は
軽減するのに役立ち得る。また子宮の内皮細胞成長の防
止は、避妊を意味し得る。
るか、少なくとも望まれないものとなっている他の症状
がある０例えば子宮内膜症は通常は子宮の内壁をなして
いるある種の内皮細胞の異常な増殖及び配置に特徴付け
られる。血管発生過程の抑制は、子宮内膜症を防止又は
軽減するのに役立ち得る。また子宮の内皮細胞成長の防
止は、避妊を意味し得る。
内皮細胞の成長は傷の治癒と関連している。この成長は
広範囲な外科手術の進行の間、そして過剰な癒痕形成が
起きる場合には望ましくない。従って内皮細胞の増殖を
抑制することは、望まれない癒痕形成を防止又は減少す
ることを助ける。
広範囲な外科手術の進行の間、そして過剰な癒痕形成が
起きる場合には望ましくない。従って内皮細胞の増殖を
抑制することは、望まれない癒痕形成を防止又は減少す
ることを助ける。
血管発生及び内皮細胞の増殖の機構は完全には特性が決
定されていない、マスト細胞が腫瘍の位置に於て新たな
毛細血管の成長が生じる前にＷ積する。しかし、マスト
細胞単独では血管発生を開始出来ない。マスト細胞の生
成物であるヘパリンは、血管発生に必要な毛細血管の内
皮細胞の移動を有意義に刺激することが示されている（
フォークマン ジｘ −、［＋９８４］ Ａｎｇｉｏｇ
ｅｎｅｓｉｓ：開始と調節、癌の新人と転移：生物的及
び治療的な面、ジ、エル、ニコルソン及びエル、ミラス
縞、ニューヨークのラベンブレス ２０１〜２０８頁〉
。
定されていない、マスト細胞が腫瘍の位置に於て新たな
毛細血管の成長が生じる前にＷ積する。しかし、マスト
細胞単独では血管発生を開始出来ない。マスト細胞の生
成物であるヘパリンは、血管発生に必要な毛細血管の内
皮細胞の移動を有意義に刺激することが示されている（
フォークマン ジｘ −、［＋９８４］ Ａｎｇｉｏｇ
ｅｎｅｓｉｓ：開始と調節、癌の新人と転移：生物的及
び治療的な面、ジ、エル、ニコルソン及びエル、ミラス
縞、ニューヨークのラベンブレス ２０１〜２０８頁〉
。
幾つかの物質がインビトロで内皮細胞の成長を抑制する
能力があることが知られている。内皮細胞成長の最もよ
く研究された抑制剤の一つは、プロタミンであり、これ
は精子のみに見出される蛋白質である。プロタミンは腫
瘍の血管発生を抑制し、その後の腫瘍の成長を抑制する
ことが示されている（ティラー ニス、及びジエー、フ
ォークマン［１９８２］ Ｎａｔｕｒｅ ２９７： ３
０２〜３１２） 、プロタミンの抗血管発生活性はその
良く知られたヘパリン結合能力によるものであった（テ
ィラー及びフォークマン［＋９８２］上記参照）。プロ
タミンでの臨床的な実験は、プロタミン注財に関連する
毒性の為に行なわれていない、鮭の精子から通常単離さ
れるプロタミンは人に於て抗原性であることが知られて
おり、そして２回目の暴露の時にこの蛋白質に対するア
ナフラキシー反応が観測されている。
能力があることが知られている。内皮細胞成長の最もよ
く研究された抑制剤の一つは、プロタミンであり、これ
は精子のみに見出される蛋白質である。プロタミンは腫
瘍の血管発生を抑制し、その後の腫瘍の成長を抑制する
ことが示されている（ティラー ニス、及びジエー、フ
ォークマン［１９８２］ Ｎａｔｕｒｅ ２９７： ３
０２〜３１２） 、プロタミンの抗血管発生活性はその
良く知られたヘパリン結合能力によるものであった（テ
ィラー及びフォークマン［＋９８２］上記参照）。プロ
タミンでの臨床的な実験は、プロタミン注財に関連する
毒性の為に行なわれていない、鮭の精子から通常単離さ
れるプロタミンは人に於て抗原性であることが知られて
おり、そして２回目の暴露の時にこの蛋白質に対するア
ナフラキシー反応が観測されている。
少なくとも二つの他の化合物がそれらのヘパリン結合活
性に間して研究されている。即ち、血小板ファクター４
（ＰＦ４）及びメージャーベーシックプロテイン（ｍ
ａｊｏｒ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。
性に間して研究されている。即ち、血小板ファクター４
（ＰＦ４）及びメージャーベーシックプロテイン（ｍ
ａｊｏｒ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。
メージャーベーシックプロテインはヘパリン結合活性を
示すが、それが非常に毒性であるために実用的な有用性
は殆ど無い。
示すが、それが非常に毒性であるために実用的な有用性
は殆ど無い。
血小板ファクター４は完全に配列が決定される良く知ら
れた蛋白質である（トイエル、ティーエフ１、ビー、ニ
ス、ケイム、エム、ファーマー、及Ｕアール、エル、ヘ
インリクソン［１９７７１Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
れた蛋白質である（トイエル、ティーエフ１、ビー、ニ
ス、ケイム、エム、ファーマー、及Ｕアール、エル、ヘ
インリクソン［１９７７１Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７４（６）＝２２５６
−２２５８） 、これは７０個の残基の分泌できる血小
板蛋白質であり、分子量が約７．８Ｋｄである。ヘパリ
ン結合活性の３ｉＥ拠が存在し、幾らかの抗血管発生活
性の徴候があるが（フォークマン［１９８４］上記参照
）、ＰＦ４は決して臨床的に有用性を有することが示さ
れていない。
−２２５８） 、これは７０個の残基の分泌できる血小
板蛋白質であり、分子量が約７．８Ｋｄである。ヘパリ
ン結合活性の３ｉＥ拠が存在し、幾らかの抗血管発生活
性の徴候があるが（フォークマン［１９８４］上記参照
）、ＰＦ４は決して臨床的に有用性を有することが示さ
れていない。
「オンコスタチンＡ」と記載され、元々のＰＦ４と同じ
か又は類似しているようである化合物がｌｉ瘍の成長を
行っていることが示されている（米国特許第４６４５８
２８及び４７３７５８０ 、両者ともトワードジック等
に発行されている）。しかし、これらの特許に報告され
た効果は免疫不全マウスに於けるゆっくりと増殖してい
る人の癌細胞に関するものである。これらの実験の結果
は宿主動物に元来存在する急速に成長している腫瘍への
効果を予測する為には容易に外挿する（あてはめる〉こ
とが出来ない、更に、これらの特許に報告されている実
験は、全くどんなアンギオスタチックなく血管発生を抑
制する）性質も予測又は開示していない。
か又は類似しているようである化合物がｌｉ瘍の成長を
行っていることが示されている（米国特許第４６４５８
２８及び４７３７５８０ 、両者ともトワードジック等
に発行されている）。しかし、これらの特許に報告され
た効果は免疫不全マウスに於けるゆっくりと増殖してい
る人の癌細胞に関するものである。これらの実験の結果
は宿主動物に元来存在する急速に成長している腫瘍への
効果を予測する為には容易に外挿する（あてはめる〉こ
とが出来ない、更に、これらの特許に報告されている実
験は、全くどんなアンギオスタチックなく血管発生を抑
制する）性質も予測又は開示していない。
種々のＰＦ４からのペプチドが精製され、それらの性質
が研究されている。どれもが血管発生の抑制に於けるど
んな役割も示していない、ＰＦ４のＣ−１３ペプチドは
好中球及び単球に対し、ケモスタチックであることが知
られている（トイエルティー、エフ１、アール、エム、
シニア、デイ−チャン、ジー、エル、グリフイン、アー
ル、エル、パインリクソン、イー、ティー、カイザー
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
が研究されている。どれもが血管発生の抑制に於けるど
んな役割も示していない、ＰＦ４のＣ−１３ペプチドは
好中球及び単球に対し、ケモスタチックであることが知
られている（トイエルティー、エフ１、アール、エム、
シニア、デイ−チャン、ジー、エル、グリフイン、アー
ル、エル、パインリクソン、イー、ティー、カイザー
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７８：４５８５
〜４５８７；オスターマンデイ−、ジー６、ジー、エル
、グリフイン、アール、エム、シニア、イー、ティー、
カイザー及びエイチ、ティー、トイエル［＋９８２］
Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ。
〜４５８７；オスターマンデイ−、ジー６、ジー、エル
、グリフイン、アール、エム、シニア、イー、ティー、
カイザー及びエイチ、ティー、トイエル［＋９８２］
Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、 Ｃｏｔｇｍ、 ＋０７ （ＩＣ＋３Ｏ−１３
５） 、単球の浸透が血管発生因子の分泌によって局部
的な内皮細胞の増殖及び移行を刺激することが予測され
ることに注目するのが重要である。従ってＰＦ４のペプ
チドは血管発生を抑制しないで刺激することが予測され
る。
５） 、単球の浸透が血管発生因子の分泌によって局部
的な内皮細胞の増殖及び移行を刺激することが予測され
ることに注目するのが重要である。従ってＰＦ４のペプ
チドは血管発生を抑制しないで刺激することが予測され
る。
血管発生及び内皮細胞増殖の有効かつ無毒の抑制物を見
つけ出す必要性は有意義で待望されている。血管発生は
広くみられる癌を含めた悲劇的なＥｉｉＮＡの開始及び
進行に主要な役割を果す、これらの病気を処置する為に
、局所的及び／又は全身的に投与できる有効で無毒の薬
剤は非常に有益であり得、そして長い間見つけることが
できなかったものである。
つけ出す必要性は有意義で待望されている。血管発生は
広くみられる癌を含めた悲劇的なＥｉｉＮＡの開始及び
進行に主要な役割を果す、これらの病気を処置する為に
、局所的及び／又は全身的に投与できる有効で無毒の薬
剤は非常に有益であり得、そして長い間見つけることが
できなかったものである。
本発明はＰＦ４又は組替えＰＦ４（ｒＰＦ４）の化学修
飾によって得られた組成物に関するものである。例えば
、ＰＦ４その遊離アミノ基を通じてフルオレスセイン−
イソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏ
ｔｈｔｏｃｙａｎａ、ｔｅ）でｗＪ飾出来、血管発生の
活性及び内皮細胞の増殖を抑制する能力を保持すること
が出来る。
飾によって得られた組成物に関するものである。例えば
、ＰＦ４その遊離アミノ基を通じてフルオレスセイン−
イソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏ
ｔｈｔｏｃｙａｎａ、ｔｅ）でｗＪ飾出来、血管発生の
活性及び内皮細胞の増殖を抑制する能力を保持すること
が出来る。
本発明の更に別の面は、活性が必要とされている特定の
場所をＰＦ４の生物活性の標的にすることである。これ
はＰＦ４ （又は適当な断片、類似体又は突然変異体）
をモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キャリア
蛋白質、細胞レセプター分子、又は他の結合蛋白質配列
と結合することによってなされうる。血管発生病の処置
及び内皮細胞増殖抑制に加えて、修飾されたＰＦ４はま
た特定細胞個体群を毒素の標的にするのにも使用できる
。ＰＦ４及び関連化合物の種々の他の修飾が本明細書ζ
ζ記載されている。これらの修飾は生物活性を増強する
為又はＰＦ４化合物の有用性をそれ以外の点で強化する
為に行なうことが出来る。
場所をＰＦ４の生物活性の標的にすることである。これ
はＰＦ４ （又は適当な断片、類似体又は突然変異体）
をモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キャリア
蛋白質、細胞レセプター分子、又は他の結合蛋白質配列
と結合することによってなされうる。血管発生病の処置
及び内皮細胞増殖抑制に加えて、修飾されたＰＦ４はま
た特定細胞個体群を毒素の標的にするのにも使用できる
。ＰＦ４及び関連化合物の種々の他の修飾が本明細書ζ
ζ記載されている。これらの修飾は生物活性を増強する
為又はＰＦ４化合物の有用性をそれ以外の点で強化する
為に行なうことが出来る。
本発明はＰＦ４、ｒＰＦ４及びこれらの化合物の断片及
び類似体を化学的に修飾することによって非常に望まし
い特性を有する新しい化合物を造ることが出来るという
発見に間するものである。
び類似体を化学的に修飾することによって非常に望まし
い特性を有する新しい化合物を造ることが出来るという
発見に間するものである。
例えばｒＰ Ｆ ４及びその断片の化学的な修飾は、驚
くへき、血管発生活性を抑制する能力並びに内皮細胞増
殖を抑制する能力を示す化合物の同定を生じた。変更さ
れた生物的な性質を生じる一つの特定の化学的修飾はｒ
ＰＦ４の遊離アミノ基をフルオレスセインーイソチオシ
アネー）（ＦＩＴＣ）で＃１ｉ飾することを含む。生じ
るアダクトＦｒＰ Ｆ ４はヘパリン結合領域内でのり
ジン残基の修飾の為にヘパリン結合活性を欠いているが
、驚くことに血管発生を抑制する能力並びにＨＵＶＥＣ
増殖を抑える能力をインビトロで保持する。
くへき、血管発生活性を抑制する能力並びに内皮細胞増
殖を抑制する能力を示す化合物の同定を生じた。変更さ
れた生物的な性質を生じる一つの特定の化学的修飾はｒ
ＰＦ４の遊離アミノ基をフルオレスセインーイソチオシ
アネー）（ＦＩＴＣ）で＃１ｉ飾することを含む。生じ
るアダクトＦｒＰ Ｆ ４はヘパリン結合領域内でのり
ジン残基の修飾の為にヘパリン結合活性を欠いているが
、驚くことに血管発生を抑制する能力並びにＨＵＶＥＣ
増殖を抑える能力をインビトロで保持する。
血管発生活性はまた嵩ばった疎水性のフルオレスセイン
部分で修飾されたＰＦ４断片及び突然変異体中で見出さ
れる。それらの生物活性に加えてＦＩＴＣ標識ＰＦ４配
列はＰＦ４分子の視覚的な検出に対し、有用である。更
に間違する生物活性を消失することなく、ＰＦ４及びそ
の断片を大きな部分で修飾することが出来ることは、Ｐ
Ｆ４、その断片、突然変異体又は誘導体を、毒素、モノ
ツクローナル抗体、ポリクローナル抗体、発螢光団、細
胞レセプター分子、非蛋白質性生物エフェクター分子、
キレータ−、キャリア蛋白質、及び他の大きな物質に結
合させる基礎を提供する。
部分で修飾されたＰＦ４断片及び突然変異体中で見出さ
れる。それらの生物活性に加えてＦＩＴＣ標識ＰＦ４配
列はＰＦ４分子の視覚的な検出に対し、有用である。更
に間違する生物活性を消失することなく、ＰＦ４及びそ
の断片を大きな部分で修飾することが出来ることは、Ｐ
Ｆ４、その断片、突然変異体又は誘導体を、毒素、モノ
ツクローナル抗体、ポリクローナル抗体、発螢光団、細
胞レセプター分子、非蛋白質性生物エフェクター分子、
キレータ−、キャリア蛋白質、及び他の大きな物質に結
合させる基礎を提供する。
本明細書に記載した化合物の用途の一つは、血管発病の
治療である０本明細書で使用される血管発生病という用
語は、充実性腫瘍の成長、及び糖尿病性網膜症、水晶体
後繊維増殖、新生血管緑内症、乾廖、繊維性血管腫、免
疫及び非免疫炎症（関節リウマチを含む）、アテローム
性動脈硬化症プラーク内での毛管増殖、血管腫及びカボ
ジ肉腫を含めた他の症状をさしている。本発明はまた、
制御不全の内皮細胞増殖の病気の処置の為に、「ＰＦ４
及びＰＦ４断片、類似体、及び突然変異体を使用するこ
とにも間するものである。
治療である０本明細書で使用される血管発生病という用
語は、充実性腫瘍の成長、及び糖尿病性網膜症、水晶体
後繊維増殖、新生血管緑内症、乾廖、繊維性血管腫、免
疫及び非免疫炎症（関節リウマチを含む）、アテローム
性動脈硬化症プラーク内での毛管増殖、血管腫及びカボ
ジ肉腫を含めた他の症状をさしている。本発明はまた、
制御不全の内皮細胞増殖の病気の処置の為に、「ＰＦ４
及びＰＦ４断片、類似体、及び突然変異体を使用するこ
とにも間するものである。
本明細書で使用する類似体という用語は、別の化合物と
実質的に同じであるが、例えば追加的なアミノ酸又は側
鎖基を付加することによって修飾されているものであり
うる。本明細書で突然変異体というのは、別の配列と実
質的に同じであるが、アミノ酸配列に於いである場所で
異なるアミノ酸を有しているアミノ酸配列をざす。断片
とはより長いアミノ酸配列の部分をさしている。
実質的に同じであるが、例えば追加的なアミノ酸又は側
鎖基を付加することによって修飾されているものであり
うる。本明細書で突然変異体というのは、別の配列と実
質的に同じであるが、アミノ酸配列に於いである場所で
異なるアミノ酸を有しているアミノ酸配列をざす。断片
とはより長いアミノ酸配列の部分をさしている。
本発明は特定のアミノ酸配列及び特別に例示した他の組
成物を包含している。本発明は更にこれらの配列の類似
体及び突然変異体、並びにその配列の断片、及びその断
片の類似体及び突然変異体を包含している。これらの類
似体、突然変異体及び断片は、類似体、断片又は突然変
異体がもともとの例示した化合物と同じ関連する生物活
性を実質的に保持する限り、本発明内に包含されている
。
成物を包含している。本発明は更にこれらの配列の類似
体及び突然変異体、並びにその配列の断片、及びその断
片の類似体及び突然変異体を包含している。これらの類
似体、突然変異体及び断片は、類似体、断片又は突然変
異体がもともとの例示した化合物と同じ関連する生物活
性を実質的に保持する限り、本発明内に包含されている
。
例えば当業者にはコンザーバティブなアミノ酸置換を行
なうことが容易である。これらの置換は以下により詳し
く議論する。これらの置換が関連する生物活性を実質的
に変更しないという程度に於いて、生じる化合物は本発
明の範囲内にある０関連する生物活性という用語は、化
合物の特定の応用についての問題となる活性をさしてい
る０例えばＰＦ４の幾つかの用途は以下に議論される。
なうことが容易である。これらの置換は以下により詳し
く議論する。これらの置換が関連する生物活性を実質的
に変更しないという程度に於いて、生じる化合物は本発
明の範囲内にある０関連する生物活性という用語は、化
合物の特定の応用についての問題となる活性をさしてい
る０例えばＰＦ４の幾つかの用途は以下に議論される。
これらの用途には、血管発生の抑制及び内皮細胞増殖の
抑制が含まれる。ＰＦ４がこれらの方法で使用されると
きは、類似体は血管発生の抑制又は内皮細胞増殖の抑制
をする化合物の能力を実質的に変えること無く、ＰＦ４
が修飾されている（例えばコンザーバティプなアミノ酸
置換〉場合に、類似体は化合物類をさしている。コンザ
ーバティブなアミノ酸置換は、本発明の主題の範囲内に
ある修飾の形態の一つの例にすぎない。
抑制が含まれる。ＰＦ４がこれらの方法で使用されると
きは、類似体は血管発生の抑制又は内皮細胞増殖の抑制
をする化合物の能力を実質的に変えること無く、ＰＦ４
が修飾されている（例えばコンザーバティプなアミノ酸
置換〉場合に、類似体は化合物類をさしている。コンザ
ーバティブなアミノ酸置換は、本発明の主題の範囲内に
ある修飾の形態の一つの例にすぎない。
本発明は化学的に修飾されたｒＰ Ｆ ４が、生体内で
の毛管形成及び胎児Ｍ制血管生成を抑制するという予期
しない発見から生じている。組替えＰＦ４の完全な長さ
のものがインビトロで成長因子に依存した人の内皮細胞
増殖を抑制することも決定されている。有意義なことに
は、ＰＦ４の血管発生抑制活性は長さが１３個のアミノ
酸にすぎないＰＦ４の配列に対応している合成ペプチド
によって保持されることも決定された。特に、ＰＦ４（
Ｃ−１３）のカルボキシ末端に対応する１３個のアミノ
酸の合成ペプチドは強力なアンギオスタチックな活性を
示した。
の毛管形成及び胎児Ｍ制血管生成を抑制するという予期
しない発見から生じている。組替えＰＦ４の完全な長さ
のものがインビトロで成長因子に依存した人の内皮細胞
増殖を抑制することも決定されている。有意義なことに
は、ＰＦ４の血管発生抑制活性は長さが１３個のアミノ
酸にすぎないＰＦ４の配列に対応している合成ペプチド
によって保持されることも決定された。特に、ＰＦ４（
Ｃ−１３）のカルボキシ末端に対応する１３個のアミノ
酸の合成ペプチドは強力なアンギオスタチックな活性を
示した。
Ｃ−１３ペプチドの活性は、それがヘパリンの抗凝固活
性に影響する能力がないことからして、特に警くべきこ
とである。Ｃ−１３ペプチドの使用は、全体のｒＰ Ｆ
４を使用することと比較して、幾つかの利点、例えは
少ない投与！（体重基盤）、抗原性である可能性が少な
いこと、及び新規な投与形に於ける有効性がより大きい
見込であることなどを与える。
性に影響する能力がないことからして、特に警くべきこ
とである。Ｃ−１３ペプチドの使用は、全体のｒＰ Ｆ
４を使用することと比較して、幾つかの利点、例えは
少ない投与！（体重基盤）、抗原性である可能性が少な
いこと、及び新規な投与形に於ける有効性がより大きい
見込であることなどを与える。
ＰＦ４のＣ−１３ペプチドはまた、マウスに於けるＣｏ
ｎ−Ａで誘発された免疫抑制を防止する能力を保持して
おり、これはヘパリンに影響されず、ペプチドが血管発
生を抑制する能力とおそらく独立している活性である。
ｎ−Ａで誘発された免疫抑制を防止する能力を保持して
おり、これはヘパリンに影響されず、ペプチドが血管発
生を抑制する能力とおそらく独立している活性である。
血管発生は数立方ミリメーターを越える充実性腫瘍の成
長に要求されることがよく理解されている。従って、充
実性腫瘍の処置に対し、血管発生を抑制することによっ
て腫瘍拒絶を生じる為に、ｒＰ Ｆ ４又はその修飾物
を使用することは治療の新規かつ高度に有利な手段を与
える。Ｃ−１３ペプチドがヘパリンの抗凝固活性に影響
すること無く血管発生を抑制するという事実は、この小
さなペプチドが同時に行う抗凝固治療を干渉しないとい
う利点も有するだろうということを実証するものである
。更に小さなペプチドは一般により大きな蛋白質よりも
抗原を生じることが少なく、従ってＰＦ４断片は経口及
び経皮投与に有利に使用できる。これらの分配方法は特
に胃腸の毛細血管の増殖、例えばカボジ肉腫及び皮膚の
病巣の処置にそれぞれ有用である。病巣内並びに全身的
なＰＦ４断片の投与は、これらの症状の処置にも適当で
ある。ＰＦ４断片の局所的又はエロゾル投与は皮膚又は
肺の病巣に夫々適している（例えばカボジ肉腫及び肺癌
）。
長に要求されることがよく理解されている。従って、充
実性腫瘍の処置に対し、血管発生を抑制することによっ
て腫瘍拒絶を生じる為に、ｒＰ Ｆ ４又はその修飾物
を使用することは治療の新規かつ高度に有利な手段を与
える。Ｃ−１３ペプチドがヘパリンの抗凝固活性に影響
すること無く血管発生を抑制するという事実は、この小
さなペプチドが同時に行う抗凝固治療を干渉しないとい
う利点も有するだろうということを実証するものである
。更に小さなペプチドは一般により大きな蛋白質よりも
抗原を生じることが少なく、従ってＰＦ４断片は経口及
び経皮投与に有利に使用できる。これらの分配方法は特
に胃腸の毛細血管の増殖、例えばカボジ肉腫及び皮膚の
病巣の処置にそれぞれ有用である。病巣内並びに全身的
なＰＦ４断片の投与は、これらの症状の処置にも適当で
ある。ＰＦ４断片の局所的又はエロゾル投与は皮膚又は
肺の病巣に夫々適している（例えばカボジ肉腫及び肺癌
）。
血管発生を抑制する能力を増強したＰＦ４の類似体が造
られている。このｒＰ Ｆ ４−２４１として知られる
類似体は、α−ヘリックス二次構造を保ちつつヘパリン
結合活性を除く為に、ＰＦ４のカルボキシ末端の４つの
りジン残基をコードしているＤＮＡ配列が二つのＧｌｎ
−Ｇｌｕ結合体をコードしている配列として変換されて
いる合成ＰＦ４遺伝子のカセット変異誘発によって造ら
れた。もし「ＰＦ ４−２４１（又はＦｒＰ Ｆ ４−
２４１）が病巣内投与されるなら、投与量は１μｇ／病
巣と４１１１ｇ／ｆｉｉ！巣の間であるように適用され
ることができる。全身投与に対しては、ｒＰ Ｆ ４−
２４１（又はＦｒＰ Ｆ ４−２４１）の投与量は、体
重ｋｇあたり０．５ｍｇと約１００ｍｇの間であり得る
０元々のｒＰＦ４（又はＦｒＰ Ｆ ４ ）の配列並び
にペプチド断片の投与に対して類似の及びより高い投与
量が使用できる０例えばｒＰＦ４（又はＦｒＰＦ４）及
びその断片の投与量は、ｒＰ Ｆ ４−２４１（又はＦ
ｒＰ Ｆ ４−２４１）の２倍又はそれ以上であり得る
。
られている。このｒＰ Ｆ ４−２４１として知られる
類似体は、α−ヘリックス二次構造を保ちつつヘパリン
結合活性を除く為に、ＰＦ４のカルボキシ末端の４つの
りジン残基をコードしているＤＮＡ配列が二つのＧｌｎ
−Ｇｌｕ結合体をコードしている配列として変換されて
いる合成ＰＦ４遺伝子のカセット変異誘発によって造ら
れた。もし「ＰＦ ４−２４１（又はＦｒＰ Ｆ ４−
２４１）が病巣内投与されるなら、投与量は１μｇ／病
巣と４１１１ｇ／ｆｉｉ！巣の間であるように適用され
ることができる。全身投与に対しては、ｒＰ Ｆ ４−
２４１（又はＦｒＰ Ｆ ４−２４１）の投与量は、体
重ｋｇあたり０．５ｍｇと約１００ｍｇの間であり得る
０元々のｒＰＦ４（又はＦｒＰ Ｆ ４ ）の配列並び
にペプチド断片の投与に対して類似の及びより高い投与
量が使用できる０例えばｒＰＦ４（又はＦｒＰＦ４）及
びその断片の投与量は、ｒＰ Ｆ ４−２４１（又はＦ
ｒＰ Ｆ ４−２４１）の２倍又はそれ以上であり得る
。
本発明の化合物は適当な製薬担体と組合せることが出来
る。例えばＦｒＰ Ｆ ４又はＦｒＰ Ｆ ４−２４１
は生理的に受入れられる担体、例えば燐酸緩衝化塩水、
蒸留水、賦形剤なとの中で処方出来、又はそのまま投与
できる。
る。例えばＦｒＰ Ｆ ４又はＦｒＰ Ｆ ４−２４１
は生理的に受入れられる担体、例えば燐酸緩衝化塩水、
蒸留水、賦形剤なとの中で処方出来、又はそのまま投与
できる。
材料及び方法
鶏の絨毛尿膜（ＣＡＭ）検定
受精卵を静置させて３日間３７℃で７０〜８０％相対湿
度で培養した。この間、胚が卵の内容物の上表面に上昇
した。４日のはじめに、卵は逆さまにすることなく割ら
れ、注意深く滅菌プラスチックへトリ皿に旺が上表面に
あるままに置いた。殻のない卵を更に７２時間３７℃で
２．５〜３．５工のＣ０２を含有している雰囲ス下で培
養し、その後成長する胚は認め得るＣＡＭを発達させた
。試験試料を１％ ＜ ｖｉｖ＞メチルセルロースと混
合することによって造ったディスクを乾燥し、主要な血
管と、胚からおよそ０．５ｃｍとの間に、ＣＡＭ上に置
いた。３７℃で更に４８時間培養後（２，５〜３．５Ｘ
ＣＯ２） 、試料を血管発生を抑制するそれらの能力に
ついて記録した。抑制はインブラントを取巻く駆血帯域
として見え、このディスクを避けている静脈によって形
成されたエルボ−及びインブラントの領域に於ける毛細
血管の減少した数を含んでいる場合が多い。
度で培養した。この間、胚が卵の内容物の上表面に上昇
した。４日のはじめに、卵は逆さまにすることなく割ら
れ、注意深く滅菌プラスチックへトリ皿に旺が上表面に
あるままに置いた。殻のない卵を更に７２時間３７℃で
２．５〜３．５工のＣ０２を含有している雰囲ス下で培
養し、その後成長する胚は認め得るＣＡＭを発達させた
。試験試料を１％ ＜ ｖｉｖ＞メチルセルロースと混
合することによって造ったディスクを乾燥し、主要な血
管と、胚からおよそ０．５ｃｍとの間に、ＣＡＭ上に置
いた。３７℃で更に４８時間培養後（２，５〜３．５Ｘ
ＣＯ２） 、試料を血管発生を抑制するそれらの能力に
ついて記録した。抑制はインブラントを取巻く駆血帯域
として見え、このディスクを避けている静脈によって形
成されたエルボ−及びインブラントの領域に於ける毛細
血管の減少した数を含んでいる場合が多い。
内皮＠胞増殖検定
人の積置管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＩＯＸ （Ｖ／
ｖ）胎児牛血清（ＦＢＳ）、１５０ｍｃｇ＃ａｌ内皮！
ｉｉ＋ａ成長サブレメント（ＥＣＧＳ）及び５単位／Ｉ
Ｉｌのヘパリンを含有している培地＋９９ （＋’；１
ｈｃｏ）中で、３７℃テ４〜５ＸＣＯ２で培養した。３
〜４日毎に培養基をトリプシン処理で収穫し、希釈して
再プレートにし、集合体に生育させた。実験の開始前に
細胞を遠心分離し、ヘパリンのない培地中に再懸濁し、
試験物質（ＰＦ４）と共に３日間、標準の培養条件下で
培養した。
ｖ）胎児牛血清（ＦＢＳ）、１５０ｍｃｇ＃ａｌ内皮！
ｉｉ＋ａ成長サブレメント（ＥＣＧＳ）及び５単位／Ｉ
Ｉｌのヘパリンを含有している培地＋９９ （＋’；１
ｈｃｏ）中で、３７℃テ４〜５ＸＣＯ２で培養した。３
〜４日毎に培養基をトリプシン処理で収穫し、希釈して
再プレートにし、集合体に生育させた。実験の開始前に
細胞を遠心分離し、ヘパリンのない培地中に再懸濁し、
試験物質（ＰＦ４）と共に３日間、標準の培養条件下で
培養した。
培！＠期間の終りに細胞を収穫し、計数した。平均の間
の統計的な有為性は、非対データに対する標準の学生を
一試験（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）で決定した。
の統計的な有為性は、非対データに対する標準の学生を
一試験（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）で決定した。
ｒＰ Ｆ ４生産
ＰＦ４部分の直前のメチオニン残基を含有しているＮ−
末端融合蛋白質として大腸菌中で組替えＰＦ４を造った
。不溶性の融合蛋白質をシアノゲンブロマイド処理で開
裂し、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラ
フィーで精製した。単離した蛋白質を２０ｍＭ酢酸ナト
リウム、ｐＨ４，０中に緩衝交換し、貯蔵の為には凍結
又はａＩｒｖ１乾燥した。
末端融合蛋白質として大腸菌中で組替えＰＦ４を造った
。不溶性の融合蛋白質をシアノゲンブロマイド処理で開
裂し、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラ
フィーで精製した。単離した蛋白質を２０ｍＭ酢酸ナト
リウム、ｐＨ４，０中に緩衝交換し、貯蔵の為には凍結
又はａＩｒｖ１乾燥した。
ペプチド生産
ペプチドを標準の１＃体相合成手順で造り、固体支持体
から開裂し、脱封鎖し、モして逆相ＨＰＬＣで精製した
。
から開裂し、脱封鎖し、モして逆相ＨＰＬＣで精製した
。
次の実施例は最良の形態を含めた本発明の実施に対する
手順を説明する。これらの実施例は制限するものと解釈
されるべきでない、特に別途記載しない限り全ての％は
重量、全ての溶媒混合物割合は容量による。
手順を説明する。これらの実施例は制限するものと解釈
されるべきでない、特に別途記載しない限り全ての％は
重量、全ての溶媒混合物割合は容量による。
実施例１
上記の様に製造した鶏の卵を種々の濃度の朝替えＰＦ４
又はＰＦ４の配列に由来するペプチドを含有しているデ
ィスクで処理した。ｒＰ Ｆ ４及び１３個のアミノ酸
しかないＣ末端ペプチドがＣＡＭに於いて血管発生を抑
制した（第１図）。各場合に於いて抑制は投与量依存性
であり、応答はほぼＰＦ４のＣ末端領域を含有している
阻害剤と同等である（モル基盤）。ＰＦ４のＮ末端ペプ
チド（Ｎ−２９）は試験された最も高い濃度に於いてさ
え血管発生を抑制せず、ＰＦ４の全ての抗血管発生活性
はおそらく分子のＣ末端部分と関連していることを示唆
している。 、Ｐ Ｆ ４のＣ末端はリジンに富んでい
るので、この検定系において、ポリリジンを試験し、６
．５ｎモル投与量で抑制を生じないことが分った。
又はＰＦ４の配列に由来するペプチドを含有しているデ
ィスクで処理した。ｒＰ Ｆ ４及び１３個のアミノ酸
しかないＣ末端ペプチドがＣＡＭに於いて血管発生を抑
制した（第１図）。各場合に於いて抑制は投与量依存性
であり、応答はほぼＰＦ４のＣ末端領域を含有している
阻害剤と同等である（モル基盤）。ＰＦ４のＮ末端ペプ
チド（Ｎ−２９）は試験された最も高い濃度に於いてさ
え血管発生を抑制せず、ＰＦ４の全ての抗血管発生活性
はおそらく分子のＣ末端部分と関連していることを示唆
している。 、Ｐ Ｆ ４のＣ末端はリジンに富んでい
るので、この検定系において、ポリリジンを試験し、６
．５ｎモル投与量で抑制を生じないことが分った。
実施例２
ＰＦ４のリジンに富んだ領域（６１〜６６の残基〉もＰ
Ｆ４によるヘパリンの結合と関連した領域である。ヘパ
リンは血管発生を調節する役割をすることが知られてお
り、血管発生は又別の良く特性が分つているヘパリン結
合蛋白質であるプロタミンによって影響を受は得る。Ｐ
Ｆ４に基づいた合成ペプチドがヘパリンに結合する能力
を評価する為に、本発明者等はヘパリンによって阻害さ
れる凝固カスケード酵素の活性を検定した。プロタミン
と血小板フンクー４はおよそ等モル濃度に於いて・トロ
ンビンとファクターＸａのヘパリン阻害を防止すること
が出来る。ＰＦ４の４１個の７ミノｗｉＣ末端ペプチド
（Ｃ−４１）はヘパリン阻害の防止がより効果的でなか
ったが、Ｃ−１３ペプチドは「ＰＦ４の有効水準の１０
倍の濃度に於いてさえ、トロンビンの阻害を防止するこ
とが出来なかった。
Ｆ４によるヘパリンの結合と関連した領域である。ヘパ
リンは血管発生を調節する役割をすることが知られてお
り、血管発生は又別の良く特性が分つているヘパリン結
合蛋白質であるプロタミンによって影響を受は得る。Ｐ
Ｆ４に基づいた合成ペプチドがヘパリンに結合する能力
を評価する為に、本発明者等はヘパリンによって阻害さ
れる凝固カスケード酵素の活性を検定した。プロタミン
と血小板フンクー４はおよそ等モル濃度に於いて・トロ
ンビンとファクターＸａのヘパリン阻害を防止すること
が出来る。ＰＦ４の４１個の７ミノｗｉＣ末端ペプチド
（Ｃ−４１）はヘパリン阻害の防止がより効果的でなか
ったが、Ｃ−１３ペプチドは「ＰＦ４の有効水準の１０
倍の濃度に於いてさえ、トロンビンの阻害を防止するこ
とが出来なかった。
この予想外の発見はＣ−１３ペプチドがヘパリン結合以
外の何等かの方法によって血管発生を抑制することを示
唆している。
外の何等かの方法によって血管発生を抑制することを示
唆している。
実施例３
多くの血管発生剤は内皮細胞増殖の直接の抑制によって
作用する。内皮細胞の分裂及び成長は成長因子の存在に
よって厳密に制併され、そしてこれに厳密に依存してい
る。本発明者等は、ｒＰＦ４及び関連するペプチドの、
成長因子に刺激された入内皮細胞増殖の抑制を、インビ
トロで評価した。ｒＰＦ４はＩＯｎ＋ｃｇ／ｍｌという
低さの濃度で、投装置に依存して内皮纏胞の成長を有意
義に抑制した。抑制はここで使用したヘパリン欠乏培地
中で２５ ＊ｃｇ／ｓ＋Ｉにおいて完了した。
作用する。内皮細胞の分裂及び成長は成長因子の存在に
よって厳密に制併され、そしてこれに厳密に依存してい
る。本発明者等は、ｒＰＦ４及び関連するペプチドの、
成長因子に刺激された入内皮細胞増殖の抑制を、インビ
トロで評価した。ｒＰＦ４はＩＯｎ＋ｃｇ／ｍｌという
低さの濃度で、投装置に依存して内皮纏胞の成長を有意
義に抑制した。抑制はここで使用したヘパリン欠乏培地
中で２５ ＊ｃｇ／ｓ＋Ｉにおいて完了した。
実ｇ＠例４
内皮細胞増殖の抑制に於けるＰＦ４のヘパリン結合活性
の重要性を評価する為に５単位／Ｉｌｌのヘパリンを含
有するか含有していない培地中でＩＩＩ＃ｌｉｌを培養
した。この実験の３日間の培養の間ヘパリンの存在はこ
れらの細胞の増殖を刺激した。ｒＰＦ４は対照（１０（
Ｈ）も、ヘパリン刺激（４５Ｋ）内皮細胞の成長も、両
方とも抑制したく表１〉。
の重要性を評価する為に５単位／Ｉｌｌのヘパリンを含
有するか含有していない培地中でＩＩＩ＃ｌｉｌを培養
した。この実験の３日間の培養の間ヘパリンの存在はこ
れらの細胞の増殖を刺激した。ｒＰＦ４は対照（１０（
Ｈ）も、ヘパリン刺激（４５Ｋ）内皮細胞の成長も、両
方とも抑制したく表１〉。
表 １
１４．４±２．５ ｂ６．０±０．６ 〜１
００５ｕ／ｌｌへ１１”＋ン １８．９：ｔ： １．
２ ｂ１４．０ｔｈ０．４ ４５
６は８ｘｌＯ’／ウエルのシーディングに基づく。
００５ｕ／ｌｌへ１１”＋ン １８．９：ｔ： １．
２ ｂ１４．０ｔｈ０．４ ４５
６は８ｘｌＯ’／ウエルのシーディングに基づく。
ｂ適当な対照と有意義に異なる（ ｐ ＜ ０．００５
）実施例５ ｒＰＦ４−２４１の構築ＰＦ４の
カルボキシ末端に於ける４つのりジン残基を２つのＧｌ
ｎ−ＧＩｕｖｉ合体に変換するのに、合成ＰＦ４遺伝子
のカセット突然変異発生を使用したく第２図参！Ｉり。
）実施例５ ｒＰＦ４−２４１の構築ＰＦ４の
カルボキシ末端に於ける４つのりジン残基を２つのＧｌ
ｎ−ＧＩｕｖｉ合体に変換するのに、合成ＰＦ４遺伝子
のカセット突然変異発生を使用したく第２図参！Ｉり。
この構築物は明らかに、この分子のこの領域に対するα
ヘワックスの２次構造（第３図〉を保持したが、同時に
ヘパリン結合活性を失った。
ヘワックスの２次構造（第３図〉を保持したが、同時に
ヘパリン結合活性を失った。
Ｐ Ｆ ４−２４１に対する遺伝子を、大腸菌中で、親
のｒＰ Ｆ ４分子と同じＮ−末端アミノ酸配列を有す
る融合蛋白として表現した。蛋白質をＣＮＢｒ及び蟻酸
で大ｌｌＩ薗融合ペプチドから開裂させ、［Ｉ Ｅ Ａ
Ｅ−セファロースクロマトグラフィーによりほとんど均
一に精製した。この蛋白質はＰＦ４に対するボノクロー
ナル抗体と反応性であり、アミノ酸分析によって適当な
修飾を保っていることが決定された。有意義なことに、
精製された突然変異体蛋白質はファクターＸａ抑制検定
に於いてヘパリン結合活性を欠いていた。
のｒＰ Ｆ ４分子と同じＮ−末端アミノ酸配列を有す
る融合蛋白として表現した。蛋白質をＣＮＢｒ及び蟻酸
で大ｌｌＩ薗融合ペプチドから開裂させ、［Ｉ Ｅ Ａ
Ｅ−セファロースクロマトグラフィーによりほとんど均
一に精製した。この蛋白質はＰＦ４に対するボノクロー
ナル抗体と反応性であり、アミノ酸分析によって適当な
修飾を保っていることが決定された。有意義なことに、
精製された突然変異体蛋白質はファクターＸａ抑制検定
に於いてヘパリン結合活性を欠いていた。
ここで記載した置換はペプチド断片並びに完全長のＰＦ
４分子に対して行うことが出来る０例えばＣ−１３−２
４１は次の配列を有する。
４分子に対して行うことが出来る０例えばＣ−１３−２
４１は次の配列を有する。
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇ Ｉｎ−Ｇ Ｉｕ −１ｌ
ｅ−ｌ １ｅ−Ｇ ｌ ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−５ｅｒ 実施例Ｇ ｒＰ Ｆ ４−２４１による血管発生の
抑制精製したｒＰ Ｆ ４−２４１をメチルセルロース
ディスク中で乾燥し、鶏の絨毛尿膜（ＣＡＭ）検定に於
いて、毛細血管成長の抑制能力について試験した。試験
した最も低い濃度に於いてさえ（１，２５ｎモｎ／テ”
イスク） ｒＰ Ｆ ４−２４１はＣＡＭ系に於ける血
管発生を広範囲に抑制したく第４図）、この抑制は膜上
のより大きな部間帯域によって示唆されるように、元々
のｒＰ Ｆ ４の等しい濃度によって生じたものよりも
いっそう有効であった。ｒＰ Ｆ ４−２４１の抑制効
果はヘパリンによって逆転されなかった。
ｅ−ｌ １ｅ−Ｇ ｌ ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−５ｅｒ 実施例Ｇ ｒＰ Ｆ ４−２４１による血管発生の
抑制精製したｒＰ Ｆ ４−２４１をメチルセルロース
ディスク中で乾燥し、鶏の絨毛尿膜（ＣＡＭ）検定に於
いて、毛細血管成長の抑制能力について試験した。試験
した最も低い濃度に於いてさえ（１，２５ｎモｎ／テ”
イスク） ｒＰ Ｆ ４−２４１はＣＡＭ系に於ける血
管発生を広範囲に抑制したく第４図）、この抑制は膜上
のより大きな部間帯域によって示唆されるように、元々
のｒＰ Ｆ ４の等しい濃度によって生じたものよりも
いっそう有効であった。ｒＰ Ｆ ４−２４１の抑制効
果はヘパリンによって逆転されなかった。
実施例７ ｒＰＦ４−２４１による入内皮４Ｉ胞増殖
の皿１ 元々のｒＰ Ｆ ４が完全に内皮＃Ｉ胞増殖を抑制する
濃度で、変異体ｒＰ Ｆ ４−２４１は少なくとも細胞
成長を抑制するのに同じ様に有効である（第５図）、更
に試験は元々のｒＰＦ４が殆ど又は全く効果を有しない
水準である０、５■ｃｇ／＋＋ｌの低い濃度でｒＰＦ
４−２４１が抑制することを示唆している。
の皿１ 元々のｒＰ Ｆ ４が完全に内皮＃Ｉ胞増殖を抑制する
濃度で、変異体ｒＰ Ｆ ４−２４１は少なくとも細胞
成長を抑制するのに同じ様に有効である（第５図）、更
に試験は元々のｒＰＦ４が殆ど又は全く効果を有しない
水準である０、５■ｃｇ／＋＋ｌの低い濃度でｒＰＦ
４−２４１が抑制することを示唆している。
元々のｒＰ Ｆ ４及び変異体ｒＰ Ｆ ４−２４１に
よる人請静脈内皮細胞増殖の抑制試験に於いて、両方と
もがこれらの細胞の増殖を抑制するのに有効であること
が示された。この試験の結果は第６図に示されている。
よる人請静脈内皮細胞増殖の抑制試験に於いて、両方と
もがこれらの細胞の増殖を抑制するのに有効であること
が示された。この試験の結果は第６図に示されている。
これらの結果は、ＰＦ４の効果がヘパリンの結合の為で
あったと仮定した血管発生のｒＰ Ｆ ４抑制の以前の
理論からすると注目すべき事である。
あったと仮定した血管発生のｒＰ Ｆ ４抑制の以前の
理論からすると注目すべき事である。
我々は蛋白質を、元々のＰＦ４の構造的な特徴の多くを
保持するが、検出可能なヘパリン結合活性を欠くものと
して設計したが、これは生体内で血管発生を抑制するの
に元々のＰＦ４よりもより活性であり、インビトロで内
皮細胞増殖を抑制するのにより活性であり得る。更に我
々が設計した変異体はヘパリン抗凝固療法に干渉するこ
とが予想されない。
保持するが、検出可能なヘパリン結合活性を欠くものと
して設計したが、これは生体内で血管発生を抑制するの
に元々のＰＦ４よりもより活性であり、インビトロで内
皮細胞増殖を抑制するのにより活性であり得る。更に我
々が設計した変異体はヘパリン抗凝固療法に干渉するこ
とが予想されない。
正常なＣ５７８Ｌ／６ＪＩＩマウス（６〜８週の年齢）
に皮下的に、Ｂ １６−ＦＩＯ黒腫腫瘍ラインの５ ｘ
１０’対数相の細胞を接種した。このプロトコルは進
行的すｌＩｌ瘍の成長に導き、大きな（３００ｎｕｗ３
）壊死１１１４をおよそ１０日間の後に生じ、その後未
処理動物の死は、通常ｎ＊ 痛の接種３週以内に生じた
。
に皮下的に、Ｂ １６−ＦＩＯ黒腫腫瘍ラインの５ ｘ
１０’対数相の細胞を接種した。このプロトコルは進
行的すｌＩｌ瘍の成長に導き、大きな（３００ｎｕｗ３
）壊死１１１４をおよそ１０日間の後に生じ、その後未
処理動物の死は、通常ｎ＊ 痛の接種３週以内に生じた
。
インビトロの腫瘍の成長及び血管発生を抑、制するｒＰ
Ｆ ４の有効性の試験に対する実験に於いて、腫瘍を
有している動物を二つの群に分割した。一つの群には、
ＩＩＩ瘍の接種後１日日から始めて、１００μ＋の５０
１燐酸ナトリウム、ｐＨ６，５中の５０μ８のｒＰＦ４
（もともとの配列）、５０ＩＩＭの塩化ナトリウムを初
期の＋ｔｉ１１Ｉに直接毎日注射した。対照群を同じ様
にｒＰＦ４を欠いているキャリア緩衝液で処理した。Ｉ
Ｉ瘍の容積を規則正しい間隔でディジタルカリバーで、
各主題の動物が受ける特定の処置が教えられていない実
験室−によって測定した。
Ｆ ４の有効性の試験に対する実験に於いて、腫瘍を
有している動物を二つの群に分割した。一つの群には、
ＩＩＩ瘍の接種後１日日から始めて、１００μ＋の５０
１燐酸ナトリウム、ｐＨ６，５中の５０μ８のｒＰＦ４
（もともとの配列）、５０ＩＩＭの塩化ナトリウムを初
期の＋ｔｉ１１Ｉに直接毎日注射した。対照群を同じ様
にｒＰＦ４を欠いているキャリア緩衝液で処理した。Ｉ
Ｉ瘍の容積を規則正しい間隔でディジタルカリバーで、
各主題の動物が受ける特定の処置が教えられていない実
験室−によって測定した。
贈［接種７日以内に対照動物は明らかな３吹元的な腫瘍
を有する一方、ｒＰ Ｆ ４処理動物は本質的に腫瘍が
無かった（第７図）。ｒＰ Ｆ ４で続けて処置するこ
とは、これらの条件下、即ち対照動物の腫瘍が壊死を生
じそして未処理マウスで以前に得られるように大きなも
のである条件下で、完全に腫瘍成長を抑制した。同じ効
果がｒＰ Ｆ ４−２４１が抑制剤として使用されたと
きにも観測された。
を有する一方、ｒＰ Ｆ ４処理動物は本質的に腫瘍が
無かった（第７図）。ｒＰ Ｆ ４で続けて処置するこ
とは、これらの条件下、即ち対照動物の腫瘍が壊死を生
じそして未処理マウスで以前に得られるように大きなも
のである条件下で、完全に腫瘍成長を抑制した。同じ効
果がｒＰ Ｆ ４−２４１が抑制剤として使用されたと
きにも観測された。
この発見は血管発生の抑制剤としてのｒＰ Ｆ ４の提
案が、悪性の黒腫及び他の癌の克服に有用であることを
支持するものである。進行的なＩＩ ［の成長は新しい
血管の形成を要求し、このことは抑制されればＩＩＩｆ
１１成長を制限するのみならず、既存の血管の道化並ひ
に悪性の浸入物に対する他の応答の増強を刺激する。
案が、悪性の黒腫及び他の癌の克服に有用であることを
支持するものである。進行的なＩＩ ［の成長は新しい
血管の形成を要求し、このことは抑制されればＩＩＩｆ
１１成長を制限するのみならず、既存の血管の道化並ひ
に悪性の浸入物に対する他の応答の増強を刺激する。
生体内のＩＩＩ瘍成長のｒＰ Ｆ ４抑制が最初の接種
（ｒＰＦ４の）の三日以内に明らかであったという発姑
はｒＰ Ｆ ４が長時間を要する免疫調整（イミュノモ
ジュレーション）によるものでなく、局所的な機構によ
って腫瘍成長を調整する様に作用することを示している
。更にｒＰ Ｆ ４はインビトロで腫瘍繍胞成長を直接
抑制しなかった。従ってこのことはｒＰＦ４が成長しつ
つある腫瘍に応答する宿主の血管発生性を変えたようで
ある。
（ｒＰＦ４の）の三日以内に明らかであったという発姑
はｒＰ Ｆ ４が長時間を要する免疫調整（イミュノモ
ジュレーション）によるものでなく、局所的な機構によ
って腫瘍成長を調整する様に作用することを示している
。更にｒＰ Ｆ ４はインビトロで腫瘍繍胞成長を直接
抑制しなかった。従ってこのことはｒＰＦ４が成長しつ
つある腫瘍に応答する宿主の血管発生性を変えたようで
ある。
同定された構造及び機能の蛋白質が変更が有意義に蛋白
質の２次構造を変更させないならばアミノ酸配列を変更
することによって構成することが示されている（カイザ
ー イー、ティー、及びエフ。
質の２次構造を変更させないならばアミノ酸配列を変更
することによって構成することが示されている（カイザ
ー イー、ティー、及びエフ。
ジエー６ケズディ−［１９８４１Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
３： ２４９−２５５）、従って本発明は蛋白質の２次
構造を変えないか、又は構造が変えられたとしても生物
的な活性が保持されている本明細書に描かれたアミノ酸
配列の変異体を含んでいる。特にアミノ酸のコンザーバ
ティブな置換が行われることが理解されるべきである。
３： ２４９−２５５）、従って本発明は蛋白質の２次
構造を変えないか、又は構造が変えられたとしても生物
的な活性が保持されている本明細書に描かれたアミノ酸
配列の変異体を含んでいる。特にアミノ酸のコンザーバ
ティブな置換が行われることが理解されるべきである。
例えば、アミノ酸は次のクラスに分けられ得る。塩基性
、疎水性、酸性、極性及びアミド。
、疎水性、酸性、極性及びアミド。
一つのクラスのアミノ酸が別の同じ種類のアミノ酸に置
き換えられる置換はその置換が実質的に化合物の生物活
性を変えない限り本発明の範囲内にあるものである。表
２は各クラスに属するアミノ酸の例を挙げている。
き換えられる置換はその置換が実質的に化合物の生物活
性を変えない限り本発明の範囲内にあるものである。表
２は各クラスに属するアミノ酸の例を挙げている。
表 ２
アミノ酸のクラス アミノ酸の例塩基性
Ｌｙｓ、 Ａｒｇ、 Ｈｉｓ疎水性
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、 Ｖａｌ、Ｐｈｅ。
Ｌｙｓ、 Ａｒｇ、 Ｈｉｓ疎水性
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、 Ｖａｌ、Ｐｈｅ。
Ｔｒｐ。
酸性 Ｇｌｕ、 Ａｓｐ。
極性 Ｓｅｒ、 Ｔｈｒ。
アミド Ｇｌｎ、 Ａｓｎある場合に
はノンコンザーバティブな置換もされうる。例えばＰＦ
４のＣ末端の近くのりジン残基は任意の次のアミノ酸で
置き換えられ得る。即ち、Ｇｌｕ、 Ｇｌｎ、 Ａｓｐ
、 Ａｓｎ、 Ｍｅｔ、 Ａｌａ％Ｌｅｕ及び１１ｅ。
はノンコンザーバティブな置換もされうる。例えばＰＦ
４のＣ末端の近くのりジン残基は任意の次のアミノ酸で
置き換えられ得る。即ち、Ｇｌｕ、 Ｇｌｎ、 Ａｓｐ
、 Ａｓｎ、 Ｍｅｔ、 Ａｌａ％Ｌｅｕ及び１１ｅ。
臨界的な要因はこれらの置換がｒＰ Ｆ ４又はｒＰＦ
４断片の生物活性から有意義に損われるものであっては
ならないということである。
４断片の生物活性から有意義に損われるものであっては
ならないということである。
容量中の５ｓ＋Ｈのフルオレスセインーイソ・チオシア
ネートで処理し、遊離アミノ基を修飾した。室温で暗所
において、３時間培養後、標識された蛋白質（ＦｒＰＦ
４又はＦｒＰ Ｆ ４−２４１）をゲル濾過及び５０ｍ
Ｍ酢酸への透析によって非結合ＦＩＴＣから分離した。
ネートで処理し、遊離アミノ基を修飾した。室温で暗所
において、３時間培養後、標識された蛋白質（ＦｒＰＦ
４又はＦｒＰ Ｆ ４−２４１）をゲル濾過及び５０ｍ
Ｍ酢酸への透析によって非結合ＦＩＴＣから分離した。
ＦｒＰＦ４のＣ末端の可能な構造を第８図に示す。
ＦｒＰ Ｆ ４を上記の様にＣＡＭ検定で活性を試験し
た。ＦｒＰ Ｆ ４はヘパリン結合活性を欠いているが
、ＣＡＭ上で血管発生の抑制剤として完全な活性を保有
していた。これらの検定の結果を表３に示す。
た。ＦｒＰ Ｆ ４はヘパリン結合活性を欠いているが
、ＣＡＭ上で血管発生の抑制剤として完全な活性を保有
していた。これらの検定の結果を表３に示す。
る修飾
ｍｕしたｒＰ Ｆ ４、又はｒＰ Ｆ ４−２４１
＜５０ｔｓＭＮａ２ＣＯ３、ｐＨ９，３，２５ｅＭＮ
ａＣｌ中の５ｒ＠ｇ）を５ａ＋ｌの０ ２２ １７ ３３ ３３ 実施例ｆｌ ＦｒＰ Ｆ ４及びＦｒＰ Ｆ ４−
２４１による内ＦｒＰ Ｆ ４及びＦｒＰ Ｆ ４−２
４１を内皮細胞増殖の抑制の能力を測定する為に別個に
試験した。［３Ｈ］−チミジンをＦｒＰ Ｆ ４の添加
後２４時間で培養基に加えた以外は、上記の通りＨＵＶ
Ｅ細胞をそのＦｒＰＦ４の感受性に付いて試験した。培
養基を更に６時間培養した。細胞を収穫し、洗浄し、Ｄ
ＮＡ中への放射性チミジンの取込を測定した。
＜５０ｔｓＭＮａ２ＣＯ３、ｐＨ９，３，２５ｅＭＮ
ａＣｌ中の５ｒ＠ｇ）を５ａ＋ｌの０ ２２ １７ ３３ ３３ 実施例ｆｌ ＦｒＰ Ｆ ４及びＦｒＰ Ｆ ４−
２４１による内ＦｒＰ Ｆ ４及びＦｒＰ Ｆ ４−２
４１を内皮細胞増殖の抑制の能力を測定する為に別個に
試験した。［３Ｈ］−チミジンをＦｒＰ Ｆ ４の添加
後２４時間で培養基に加えた以外は、上記の通りＨＵＶ
Ｅ細胞をそのＦｒＰＦ４の感受性に付いて試験した。培
養基を更に６時間培養した。細胞を収穫し、洗浄し、Ｄ
ＮＡ中への放射性チミジンの取込を測定した。
第９図に示されるように、ＦＩＴＣ結合ｒＰＦ４は、低
投与量に於いてさえ、人の請部静脈内皮細胞におけるＤ
ＮＡ合成を、従って細胞の増殖を抑制するのに、非常に
有効である。 ＦｒＰ Ｆ ４−２４１を用いて類似の
結果が得られた。この場合、「ＰＦ ４−２４１の濃度
の増加に対する、ＨＵＶＥ細胞増殖の抑制を上記の様に
内皮ｗ１＋１８！増殖検定を用いて試験した。 ＦｒＰ
Ｆ ４−２４１を用いる実験の結果を第１０図に示す
。
投与量に於いてさえ、人の請部静脈内皮細胞におけるＤ
ＮＡ合成を、従って細胞の増殖を抑制するのに、非常に
有効である。 ＦｒＰ Ｆ ４−２４１を用いて類似の
結果が得られた。この場合、「ＰＦ ４−２４１の濃度
の増加に対する、ＨＵＶＥ細胞増殖の抑制を上記の様に
内皮ｗ１＋１８！増殖検定を用いて試験した。 ＦｒＰ
Ｆ ４−２４１を用いる実験の結果を第１０図に示す
。
実施例１２ ＦＩＴＣ−ｒＰＦ４による生体内腫瘍
成長の抑制 Ｂ−１６黒Ｎｉ ＩＩＩ瘍を前に記載したようにＣ５７
ＢＬ６／Ｊマウス中で生育した。処置はＩＩ！瘍細胞の
移植（１８目）（こ続いて２４時間で開始し、そして１
００μｍの酢酸ナトリウム緩衝液ｐ １１４ 、０中の
２５μｇ１日のＦｒＰＦ４からなっていた。対照のマウ
スに同じ緩衝液中の２５７Ｌｇ／日のＦＩＴＣ標識チト
クロームＣを注射した。ＦｒＰ Ｆ ４によるｌ！瘍成
長の統計的に有意な抑制が１１日８で観測されたく第１
１図）。
成長の抑制 Ｂ−１６黒Ｎｉ ＩＩＩ瘍を前に記載したようにＣ５７
ＢＬ６／Ｊマウス中で生育した。処置はＩＩ！瘍細胞の
移植（１８目）（こ続いて２４時間で開始し、そして１
００μｍの酢酸ナトリウム緩衝液ｐ １１４ 、０中の
２５μｇ１日のＦｒＰＦ４からなっていた。対照のマウ
スに同じ緩衝液中の２５７Ｌｇ／日のＦＩＴＣ標識チト
クロームＣを注射した。ＦｒＰ Ｆ ４によるｌ！瘍成
長の統計的に有意な抑制が１１日８で観測されたく第１
１図）。
実施例１３ ＰＦ４活性の特定の場所への分配ある
種の症状を処置する為に、生物活性を特定の場所に向け
ることが場合によっては有益である。
種の症状を処置する為に、生物活性を特定の場所に向け
ることが場合によっては有益である。
例えは、充実性腫瘍の生育を抑制する為に、アンギオス
タチックな性質を有しているＰＦ４又は類似体を直接腫
瘍場所に送ることが望ましいものであり得る。これはＰ
Ｆ４ （又は類似体）を適当な抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体に結合させることによって達成できる。こ
の技術で良く知られた方法を用いて造られ得るモノクロ
ーナル抗体は、標的場所を選択的に探し出す。抗体が所
望の場所に移動するに従って、これはＰＦ４をもたらす
。従ってＰＦ４活性が特定の場所で濃縮され得る。
タチックな性質を有しているＰＦ４又は類似体を直接腫
瘍場所に送ることが望ましいものであり得る。これはＰ
Ｆ４ （又は類似体）を適当な抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体に結合させることによって達成できる。こ
の技術で良く知られた方法を用いて造られ得るモノクロ
ーナル抗体は、標的場所を選択的に探し出す。抗体が所
望の場所に移動するに従って、これはＰＦ４をもたらす
。従ってＰＦ４活性が特定の場所で濃縮され得る。
ＰＦ４なとのポリペプチドに対する結合抗体の一般的な
手段が当業者に良く知られており、例えば米国特許４．
＋３７１，９５８ （ローウェル等〉及び４，７９２゜
４４７（ウール等）によって議論されている。ＰＦ４は
また結合蛋白質（例えはトロンポスボンジン又は繊維芽
細胞成長因子）、細胞レセプター分子（例えばＣＯ４、
リンパ球機能関連抗体−１［Ｌ Ｆ Ａ−１］、及びフ
ォシウィレアランド（ｖｏｎν■１ｅｂｒａｎｄ）因子
［ｖＷＦ］）、又は相補的なリーガント、及び非蛋白質
性の生物エフェクター分子（例えばＩＣＡＭ−１，１１
４関連抗体、及びプロスタグランジン類）と類似の結合
を経て、特定の場所を標的にし得る。
手段が当業者に良く知られており、例えば米国特許４．
＋３７１，９５８ （ローウェル等〉及び４，７９２゜
４４７（ウール等）によって議論されている。ＰＦ４は
また結合蛋白質（例えはトロンポスボンジン又は繊維芽
細胞成長因子）、細胞レセプター分子（例えばＣＯ４、
リンパ球機能関連抗体−１［Ｌ Ｆ Ａ−１］、及びフ
ォシウィレアランド（ｖｏｎν■１ｅｂｒａｎｄ）因子
［ｖＷＦ］）、又は相補的なリーガント、及び非蛋白質
性の生物エフェクター分子（例えばＩＣＡＭ−１，１１
４関連抗体、及びプロスタグランジン類）と類似の結合
を経て、特定の場所を標的にし得る。
例えばモノクローナル抗体又は他の部分はＰＦ４のカル
ボキシ末端の近くに位置しているリジン残基の一方又は
両方の対に於いてＰＦ４と連係させ得る。これらの残基
として、モノクローナル抗体を連係させることによって
、アンギオスダチツクな活性はヘパリン結合が除去され
ていても保持される。またこれら及び池の位置に於いて
適当な部分と連結する前に、リジン残基の置換の為に他
のアミノ酸残基が用いられ得る。従って、本明細書に記
載した化合物は以下によって表わすことが出来る。
ボキシ末端の近くに位置しているリジン残基の一方又は
両方の対に於いてＰＦ４と連係させ得る。これらの残基
として、モノクローナル抗体を連係させることによって
、アンギオスダチツクな活性はヘパリン結合が除去され
ていても保持される。またこれら及び池の位置に於いて
適当な部分と連結する前に、リジン残基の置換の為に他
のアミノ酸残基が用いられ得る。従って、本明細書に記
載した化合物は以下によって表わすことが出来る。
〔式中（ａ）ＡはＰＦ４の残基１〜５７からなるポリペ
プチド配列の全部又は一部を表し、Ａは該ハイブリッド
ボリベブチト上に存在しても存在しなくてもよ＜、（ｂ
）Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥは任意のアミノ酸でありえ、（ｃ）
Ｆ、Ｇ、Ｈ及び■はモノクローナル抗体、ポリクローナ
ル抗体、フルオレスセイン−イソチオシアネート、発螢
光団、毒素、細胞レセプター分子、非蛋白質性生物エフ
ェクター分子、キレータ−からなる群から選ばれ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ及び■と命名した部分の少なくとも一つは該ハイ
ブリッドペプチド上に存在しなければならない〕。
プチド配列の全部又は一部を表し、Ａは該ハイブリッド
ボリベブチト上に存在しても存在しなくてもよ＜、（ｂ
）Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥは任意のアミノ酸でありえ、（ｃ）
Ｆ、Ｇ、Ｈ及び■はモノクローナル抗体、ポリクローナ
ル抗体、フルオレスセイン−イソチオシアネート、発螢
光団、毒素、細胞レセプター分子、非蛋白質性生物エフ
ェクター分子、キレータ−からなる群から選ばれ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ及び■と命名した部分の少なくとも一つは該ハイ
ブリッドペプチド上に存在しなければならない〕。
本明細書に記載した化合物の上記の表現において、縦の
線は水平の線上のアミノ酸の間の空間と同じ様に化学結
合の相互作用を表わしている。Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥに於け
る特別に記載した部分の存在は、他の残基に於いて生し
る連結の可能性を除外するものではない。
線は水平の線上のアミノ酸の間の空間と同じ様に化学結
合の相互作用を表わしている。Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥに於け
る特別に記載した部分の存在は、他の残基に於いて生し
る連結の可能性を除外するものではない。
Ｌｍ １Ｎ及び血管発生病の治療に対する全身的に活性
のアンキオスタチックな複合体として、その有効性を改
良する為に循環するＰＦ４の半減期を増加することが望
ましいものであり得る。例えばＰＦ４は大きなキャリア
蛋白質、例えば人血清アルビミン（ＨＳＡ） 、又は免
疫グロブリンにジサクシミジルスベレー） （ＤＳＳ）
により遊離第１級アミノ基を通じて架橋することが出来
る（即ち、リジン、ε−アミノ基又はＮ−末端αアミノ
基、モンテサノ等［＋９８２］ Ｂｉｏｃｈｅｗ、 Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 ＣｏｒＬＩＷａ。
のアンキオスタチックな複合体として、その有効性を改
良する為に循環するＰＦ４の半減期を増加することが望
ましいものであり得る。例えばＰＦ４は大きなキャリア
蛋白質、例えば人血清アルビミン（ＨＳＡ） 、又は免
疫グロブリンにジサクシミジルスベレー） （ＤＳＳ）
により遊離第１級アミノ基を通じて架橋することが出来
る（即ち、リジン、ε−アミノ基又はＮ−末端αアミノ
基、モンテサノ等［＋９８２］ Ｂｉｏｃｈｅｗ、 Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 ＣｏｒＬＩＷａ。
＋０９： ７−１３を参照）。
精製したｒＰ Ｆ ４及びＨＳＡ（夫々１０１ｇ及び１
０（ｈｉ８）を室温で４時間２５ｍＭＤ Ｓ Ｓと共に
培養した。反応をトリスＴｌｉ衝液、ｐＨ８，０を最終
濃度１００ｍ旧こ添加して停止させた。生じる組成物は
ヘパリン結合活性を欠いているが、ＨＵＶＥＣ増殖を抑
制する能力を保持している架橋した分子の不均一な混合
物であった。ＨＳＡがチトクロームＣに架橋している対
照試料はＨＵＶＥＣ成長を抑制しなかった。
０（ｈｉ８）を室温で４時間２５ｍＭＤ Ｓ Ｓと共に
培養した。反応をトリスＴｌｉ衝液、ｐＨ８，０を最終
濃度１００ｍ旧こ添加して停止させた。生じる組成物は
ヘパリン結合活性を欠いているが、ＨＵＶＥＣ増殖を抑
制する能力を保持している架橋した分子の不均一な混合
物であった。ＨＳＡがチトクロームＣに架橋している対
照試料はＨＵＶＥＣ成長を抑制しなかった。
実施例１５ 毒素分子をＰＦ４特異的標的へ分配Ｐ
Ｆ４を、毒素剤の活性を特定の細胞種に向ける標的分子
として使用することが有益な場合がある８例えばＰＦ４
は毒性のあるリシンＡ又はシイフチリア毒素を化学的又
は遺伝的に結合することが出来る。
Ｆ４を、毒素剤の活性を特定の細胞種に向ける標的分子
として使用することが有益な場合がある８例えばＰＦ４
は毒性のあるリシンＡ又はシイフチリア毒素を化学的又
は遺伝的に結合することが出来る。
ＰＦ４及びリシンＡからなる融合蛋白質を原核宿主又は
真核宿主中で組替えによって造ることが出来る。生じる
精製された毒素は内皮細胞、又は内皮細胞に近接した細
胞、例えばＩＩ！ＪＩＦ細胞に非常に特異性を有し得る
。別の方法としてＰＦ４及びリシンを架橋剤で結合する
ことが出来る。ＤＳＳは、ＰＦ４及びリシンへの活性を
保有させたまま、ＰＦ４とリジンＡを架橋することが出
来る。
真核宿主中で組替えによって造ることが出来る。生じる
精製された毒素は内皮細胞、又は内皮細胞に近接した細
胞、例えばＩＩ！ＪＩＦ細胞に非常に特異性を有し得る
。別の方法としてＰＦ４及びリシンを架橋剤で結合する
ことが出来る。ＤＳＳは、ＰＦ４及びリシンへの活性を
保有させたまま、ＰＦ４とリジンＡを架橋することが出
来る。
ＰＦ４は光活性化可能な分子、例えばヘマトポルフィリ
ン誘導体（ＨＰＤ）にも架橋剤で共有結合出来ろ。水溶
性のカルボジイミド（１ｆ１えばＥＤＣ）はＰＦ４の７
ミノ基にＨＰＤの酸１１＠を連結するのに最も有用であ
る。生じる結合体は、内皮細胞に冨んだ場所、例えば充
実性腫瘍に於いて濃縮し、そして腫瘍の場所に直接焦点
をあてた比較的毒性の無いレーザ又は光療法によって活
性化され得る。活性化されたＨＰＤは非特異的に近くの
細胞を殺す活性の酸素種を生じることが知られている。
ン誘導体（ＨＰＤ）にも架橋剤で共有結合出来ろ。水溶
性のカルボジイミド（１ｆ１えばＥＤＣ）はＰＦ４の７
ミノ基にＨＰＤの酸１１＠を連結するのに最も有用であ
る。生じる結合体は、内皮細胞に冨んだ場所、例えば充
実性腫瘍に於いて濃縮し、そして腫瘍の場所に直接焦点
をあてた比較的毒性の無いレーザ又は光療法によって活
性化され得る。活性化されたＨＰＤは非特異的に近くの
細胞を殺す活性の酸素種を生じることが知られている。
実施例＋６ ｒＰＦ４のシスティン残基の嫁御製造
の間、ｒＰ Ｆ ４のジスルフィドをジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）によって遊離のスルフヒドリルに還元する
が、ヘパリン結合活性は保有される。ＰＦ４の生物活性
を評価することは、ＤＴＴの除去を必要とし、このこと
はジスルフィドの橋が再形成されることとなり、これら
の活性にそれらが必須であるかどうかをわがらなくする
。
の間、ｒＰ Ｆ ４のジスルフィドをジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）によって遊離のスルフヒドリルに還元する
が、ヘパリン結合活性は保有される。ＰＦ４の生物活性
を評価することは、ＤＴＴの除去を必要とし、このこと
はジスルフィドの橋が再形成されることとなり、これら
の活性にそれらが必須であるかどうかをわがらなくする
。
ｒＰ Ｆ ４のスルフヒドリルをＤＴＴで予ｆａ還元し
、続いてフルオレスセインマレイミド（ＦＭ）で処理す
ることによって、特異的かつ非可逆的にｍ崎した。還元
され精製されたｒＰＦ４（炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
８，５中５ｍｇｒＳＣＢコ）をＩ ＯｍｇのＦＭで室温
で３時間処理した。残留するＦＭをＳＣＢ中のゲル濾過
で除去し、次に同じ緩衝液で透析した。ＦＭ−ｒＰＦ４
は部分的にヘパリン結合活性を保有していた。ＣＡＭ中
で試験したとき、そして内皮細胞増Ｍ検定で社験したと
きに、ＦＭ−ｒＰＦ４は抑制活性を示し、遊離のスルフ
ヒドリルも正しいジスルフィド結合も阿れもＰＦ４の７
ンギオスタチツク活性に必要とされないことを示してい
る。
、続いてフルオレスセインマレイミド（ＦＭ）で処理す
ることによって、特異的かつ非可逆的にｍ崎した。還元
され精製されたｒＰＦ４（炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
８，５中５ｍｇｒＳＣＢコ）をＩ ＯｍｇのＦＭで室温
で３時間処理した。残留するＦＭをＳＣＢ中のゲル濾過
で除去し、次に同じ緩衝液で透析した。ＦＭ−ｒＰＦ４
は部分的にヘパリン結合活性を保有していた。ＣＡＭ中
で試験したとき、そして内皮細胞増Ｍ検定で社験したと
きに、ＦＭ−ｒＰＦ４は抑制活性を示し、遊離のスルフ
ヒドリルも正しいジスルフィド結合も阿れもＰＦ４の７
ンギオスタチツク活性に必要とされないことを示してい
る。
このＦＭ峰＠ｒＰＦＡｔｉ別の内皮細胞！識又は抑制化
合物としてのある有用性を有するかもしれないが、最も
重要なことは、ＰＦ４のシスティン残基がＰＦ４を診断
又は治療用途の為に池の分子に連結又は架橋する為の標
的として適当であることをこれが示していることである
。
合物としてのある有用性を有するかもしれないが、最も
重要なことは、ＰＦ４のシスティン残基がＰＦ４を診断
又は治療用途の為に池の分子に連結又は架橋する為の標
的として適当であることをこれが示していることである
。
本明細書に記載された実施例及び具体例は説明の目的の
みのものであり、これに鑑みて種々の変更及び修正が当
業者に示唆され、本出願のそして特許請求の範囲の精神
及び範囲内に含まれるべきである。
みのものであり、これに鑑みて種々の変更及び修正が当
業者に示唆され、本出願のそして特許請求の範囲の精神
及び範囲内に含まれるべきである。
第１図はｒＰＦ４）ｊＬＵ種々の関連するペプチドでの
処理から生じる血管発生の抑制を示すグラフである。 第２図はｒＰ Ｆ ４の７ミノ配夕１１とｒＰ Ｆ ４
−２４１のものとの比較を示す図である。 第３図はｒＰ Ｆ ４とｒＰ Ｆ ４−２４１のα−ヘ
リックス立体配置を描いた略図である。 第４図ζｆｒＰＦ４とｒＰ Ｆ ４−２４１で処理する
ことから生じる血管発生の抑制を比較するグラフである
。 第５図はｒＰ Ｆ ４又はｒＰ Ｆ ４−２４１による
内皮細胞増殖の抑制を示すグラフである。 第６図はｒＰＦ４又はｒＰ Ｆ ４−２４１（７）処置
から生じる人の搏血管内皮細胞増殖の抑制を比較するグ
ラフである。 第７図はｒＰ Ｆ ４が腫瘍成長を抑制する能力を示す
グラフである。 第８図はＦｒＰ Ｆ ４のＣ−末端の可能性ある化学構
造を示す図である。 第９図はＦｒＰ Ｆ ４による入内皮細胞増殖の抑制を
示すグラフである。 第１０図はＦｒＰ Ｆ−２４１による入内皮細胞増殖の
抑制を示すグラフである。 第１１図はＦｒＰ Ｆ ４による腫瘍成長の抑制を示す
グラフである。
処理から生じる血管発生の抑制を示すグラフである。 第２図はｒＰ Ｆ ４の７ミノ配夕１１とｒＰ Ｆ ４
−２４１のものとの比較を示す図である。 第３図はｒＰ Ｆ ４とｒＰ Ｆ ４−２４１のα−ヘ
リックス立体配置を描いた略図である。 第４図ζｆｒＰＦ４とｒＰ Ｆ ４−２４１で処理する
ことから生じる血管発生の抑制を比較するグラフである
。 第５図はｒＰ Ｆ ４又はｒＰ Ｆ ４−２４１による
内皮細胞増殖の抑制を示すグラフである。 第６図はｒＰＦ４又はｒＰ Ｆ ４−２４１（７）処置
から生じる人の搏血管内皮細胞増殖の抑制を比較するグ
ラフである。 第７図はｒＰ Ｆ ４が腫瘍成長を抑制する能力を示す
グラフである。 第８図はＦｒＰ Ｆ ４のＣ−末端の可能性ある化学構
造を示す図である。 第９図はＦｒＰ Ｆ ４による入内皮細胞増殖の抑制を
示すグラフである。 第１０図はＦｒＰ Ｆ−２４１による入内皮細胞増殖の
抑制を示すグラフである。 第１１図はＦｒＰ Ｆ ４による腫瘍成長の抑制を示す
グラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ＰＦ４と実質的に同じ関連した生物活性を有
している、ＰＦ４、ＰＦ４の類似体又は突然変異体、Ｐ
Ｆ４の断片、又はＰＦ４の断片の類似体又は突然変異体
である、第一の物質と、 （ｂ）存在することが該第一の物質の関連する生物活性
を有意義に損わない、該第一の物質と共有結合している
か又はそれ以外の方法で結合している、第二の物質とか
らなる、ポリペプチド結合体（コンジユゲート）。 ２、該第一の物質が次のアミノ酸配列、 【遺伝子配列有り】 又はこれと実質的に同じでＰＦ４と実質的に同じ関連す
る生物活性を保持しているアミノ酸配列からなっている
特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド結合体。 ３、該第一の物質が次の１０個のアミノ酸配列、【遺伝
子配列有り】 又は実質的にこれと同じで該１０個のアミノ酸配列と実
質的に同じ関連する生物活性を保持しているアミノ酸配
列を含んでいる、特許請求の範囲第１項に記載のポリペ
プチド結合体。 ４、該第二の物質がフルオレスセイン−イソチオシアネ
ートを含んでいるか、又はそうでないなら、該第一の物
質をフルオレスセイン−イソチオシアネートで処理する
ことによって生じるものである特許請求の範囲第１項に
記載のポリペプチド結合体。 ５、該第二の物質がフルオロフォアである特許請求の範
囲第１項に記載のポリペプチド結合体。 ６、該第二の物質が毒素である特許請求の範囲第１項に
記載のポリペプチド結合体。 ７、該毒素がジフテリア毒素又はリシンＡである特許請
求の範囲第６項に記載のポリペプチド結合体。 ８、該第二の物質が抗体である特許請求の範囲第１項に
記載のポリペプチド結合体。 ９、該第二の物質がキャリア蛋白質である特許請求の範
囲第１項に記載のポリペプチド結合体。 １０、該キャリア蛋白質が人の血清アルブミンである特
許請求の範囲第９項に記載のポリペプチド結合体。 １１、該第二の物質がキレーターである特許請求の範囲
第１項に記載のポリペプチド結合体。 １２、該第二の物質が細胞レセプター分子又はその相補
的なリーガンドである特許請求の範囲第１項に記載のポ
リペプチド結合体。 １３、該第二の物質が非蛋白質性の生物エフェクター分
子である特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド結
合体。 １４、該第二の物質が嵩ばった疎水性の部分である特許
請求の範囲第１項に記載のポリペプチド結合体。 １５、該第二の物質が、該第一の物質のカルボキシ末端
近くに位置するリジン残基の一方又は両方の対の修飾を
通じて、該第一の物質についている特許請求の範囲第１
項に記載のポリペプチド結合体。 １６、該結合体が増加した血管発生抑制活性を有し、減
少したヘパリン結合活性を有している特許請求の範囲第
１５項に記載のポリペプチド結合体。 １７、該第一及び第二の物質が架橋剤で連結されている
特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド結合体。 １８、該架橋剤がジサクシミジルスベレートである特許
請求の範囲第１７項に記載のポリペプチド結合体。 １９、該架橋剤が水溶性のカルボジイミドである特許請
求の範囲第１７項に記載のポリペプチド結合体。 ２０、該第二の物質が光活性可能な分子である特許請求
の範囲第１項に記載のポリペプチド結合体。 ２１、該光活性可能な分子がヘマトポルフィリン誘導体
である特許請求の範囲第２０項に記載のポリペプチド結
合体。 ２２、（ａ）ＰＦ４と実質的に同じ血管発生抑制活性を
有している、ＰＦ４、ＰＦ４の類似体又は突然変異体、
ＰＦ４の断片、又はＰＦ４の断片の類似体又は突然変異
体である、第一の物質と、 （ｂ）存在することが該第一の物質の関連する生物活性
を損わない、該第一の物質と共有結合しているか又はそ
れ以外の方法で結合している、第二の物質とからなって
いる、ポリペプチド結合体を含んでいる血管発生病の処
置用の製剤組成物。 ２３、（ａ）ＰＦ４と実質的に同じ血管発生抑制活性を
有している、ＰＦ４、ＰＦ４の類似体又は突然変異体、
ＰＦ４の断片、又はＰＦ４の断片の類似体又は突然変異
体である、第一の物質と、 （ｂ）存在することが該第一の物質の血管発生抑制活性
を損わない、該第一の物質と共有結合しているか又はそ
れ以外の方法で結合している、第二の物質とからなって
いる、ポリペプチド結合体の有効量を投与することから
なる血管発生を抑制する方法。 ２４、（ａ）ＰＦ４と実質的に同じ内皮細胞増殖抑制活
性を有している、ＰＦ４、ＰＦ４の類似体又は突然変異
体、ＰＦ４の断片、又はＰＦ４の断片の類似体又は突然
変異体である、第一の物質と、（ｂ）存在することが該
第一の物質の関連する生物活性を損わない、該第一の物
質と共有結合しているか又はそれ以外の方法で結合して
いる、第二の物質とからなっている、ポリペプチド結合
体の有効量を投与することからなる内皮細胞増殖を抑制
する方法。 ２５、（ａ）ＰＦ４と実質的に同じ関連した生物活性を
有しており、処置を必要とする細胞と特異的に相互作用
するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又は抗原
性デターミナントに結合している、ＰＦ４、ＰＦ４の類
似体又は突然変異体、ＰＦ４の断片、又はＰＦ４の断片
の類似体又は突然変異体を投与することからなる、処置
を必要とする細胞に、ＰＦ４、ＰＦ４の類似体又は突然
変異体、ＰＦ４の断片、又はＰＦ４の断片の類似体又は
突然変異体を分配する方法。 ２６、該ＰＦ４の突然変異体が次のアミノ酸配列：【遺
伝子配列有り】 又は実質的にこれと同じで、ＰＦ４と実質的に同じ関連
する生物活性を保持しているアミノ酸配列を有している
特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７、ＰＦ４、ＰＦ４の類似体又は突然変異体、ＰＦ４
の断片、又はＰＦ４の断片の類似体又は突然変異体と結
合している毒素を投与することからなる、毒素をＰＦ４
が相互作用する場所に分配する方法。 ２８、該ＰＦ４の突然変異体が次のアミノ酸配列：【遺
伝子配列有り】 又は実質的にこれと同じで、ＰＦ４と実質的に同じ関連
する生物活性を保持しているアミノ酸配列を有する特許
請求の範囲第２７項に記載の方法。 ２９、（ａ）ＰＦ４、ＰＦ４−２４１、Ｃ−１３、Ｃ−
１３−２４１、Ｃ−４１及びＣ−４１−２４１からなる
群から選ばれる第一の物質と、 （ｂ）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、フル
オレスセイン−イソチオシアネート、発螢光団、毒素、
細胞レセプター分子、非蛋白質性生物エフェクター分子
、キレーター、及びキャリア蛋白質からなる群から選ば
れ、該第一の物質と共有結合しているか又はそれ以外の
方法で結合している、第二の物質とからなる、ポリペプ
チド結合体。 ３０、次の式のハイブリッドポリペプチド：【遺伝子配
列有り】 〔式中（ａ）ＡはＰＦ４の残基１〜５７からなるポリペ
プチド配列の全部又は一部を表し、Ａは該ハイブリッド
ポリペプチド上に存在してもしなくてもよく、（ｂ）Ｂ
、Ｃ、Ｄ及びＥは任意のアミノ酸でありえ、（ｃ）Ｆ、
Ｇ、Ｈ及びＩはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体、フルオレスセイン−イソチオシアネート、発螢光団
、毒素、細胞レセプター分子、非蛋白質性生物エフェク
ター分子、キレーターからなる群から選ばれ、Ｆ、Ｇ、
Ｈ及びＩと命名した部分の少なくとも一つは該ハイブリ
ッドペプチド上に存在しなければならない〕。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US376,333 | 1989-07-06 | ||
| US07/376,333 US5112946A (en) | 1989-07-06 | 1989-07-06 | Modified pf4 compositions and methods of use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0363297A true JPH0363297A (ja) | 1991-03-19 |
Family
ID=23484594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2176513A Pending JPH0363297A (ja) | 1989-07-06 | 1990-07-05 | 新規な修正されたｐｆ４組成物及び使用方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5112946A (ja) |
| EP (2) | EP0407122B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0363297A (ja) |
| AT (1) | ATE143698T1 (ja) |
| CA (1) | CA2019086A1 (ja) |
| DE (1) | DE69028739T2 (ja) |
| DK (1) | DK0407122T3 (ja) |
| ES (1) | ES2092493T3 (ja) |
| GR (1) | GR3021658T3 (ja) |
Families Citing this family (316)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5086164A (en) * | 1989-01-10 | 1992-02-04 | Repligen Corporation | Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases |
| US5800820A (en) * | 1989-01-10 | 1998-09-01 | Repligen Corporation | Methods and compositions for treatment of angiogenic diseases |
| WO1993002192A1 (en) * | 1991-07-15 | 1993-02-04 | Repligen Corporation | Modified pf4 compositions and methods of use |
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