JPH0363571A - 大腸菌群の検査キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は食品や飲料水などの衛生上の指標である大腸菌
群の検定キットに関する。

（従来の技術） 大腸菌群の公定法での定義は、「ダラム陰性の無芽胞性
の短桿菌で、乳糖を分解してガスを産生するすべての好
気性、通性嫌気性の菌」となっている。エシェリキア属
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）及びタレプシエラ（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ）等の細菌がこれに属する。大腸菌群の
存在している食品・飲料水は、その取扱中に直接・間接
に大または動物の糞便・尿などに接触した機会があって
、病原菌汚染の可能性のある不潔な食品であることを意
味する。従って、大腸菌群の検査は食品衛生上非常に重
要な検査である。

従来、大腸菌群の測定には公定法として、ブリリアント
グリーン乳糖胆汁ブイヨン培地（ＢＧＬＢ）あるいは乳
糖ブイヨン培地にダーラム管を入れたものを用い、それ
に食品試料を入れて２４時間あるいは４８時間、３５〜
３７℃で培養し、ダーラム管内にガスの蓄積が見られる
か否かを観察し、ガスの蓄積の見られたものについては
さらに遠藤培地等を用いた確定試験を行わねばならない
。確定試験までを行うと４８〜７２時間の長時間の培養
を要する。そのため加工食品の製造所における出荷前の
検査や各工程の衛生管理などは不可能に近い。ペーパー
ストリップ等を用いた簡易法もあるにはあるが、不正確
であり、１２時間程度の培養時間を要する。

これらの検査には無菌操作ができる設備と、よく訓練さ
れた人員が必要である。

（発明が解決しようとする課題） 最近数種類の大腸菌やサルモネラ菌検査用の酵素結合イ
ムノアッセイやＤＮＡプローブ技術を応用した測定キッ
トが市販されている。これらは上記の方法に比べてより
簡便で検査時間も短く　（約Ａに）なっている。しかし
、これらは大腸菌またはサルモネラ菌など個々の菌種を
特異的に検出することを目的にしてつくられ大腸菌群全
体を検出するものではない。

大腸菌群を検査する方法としては下記の条件が要求され
る。１）大腸菌群のほとんどが検出でき、２）操作が簡
単である。従って本発明は、それらの条件を満たした大
腸菌群の検査法及びそれに用いる器具を提供することを
目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は、腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｃｅａｅ）に属する菌株に対するポリクロナール抗体を
コーティングした担体と、当該抗体に標識酵素を結合さ
せた化合物とを、主な構成要素とする大腸菌群の検査キ
ットである。好ましくは、腸内細菌科に属する細菌の煮
沸菌体のポリクローナル抗体を担体にコーティングした
ものと、その抗体に標識酵素を結合させた酵素標識抗体
、その酵素に対する基質、及び発色原物質からなる大腸
菌群の検査キットである。

腸内細菌科に属する菌株は、この科に属する細菌であれ
ばいずれの細菌であっても本発明に利用できるが、大腸
菌群、病原性をもつ腸内細菌科の細菌に交差性をもつ抗
体を得るためには、エンテロバクタ−・クロアカニ（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）、またはサ
ルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔ　
　ｈｉｍｕｒｉｕｍ）が好ましい。

ポリクローナル抗体は煮沸菌体を例えばウサギ、ギニア
ビッグ、ラット、マウス等の動物に注射することによっ
て、その動物の血清から得られる。

それらの抗血清をそのまま用いても良いし、公知の手段
を用いて精製しても良い。また２種以上の抗血清を混合
しても良い。担体として、プラスチック試験管、マイク
ロタイタープレート、濾紙、ニトルセルロース膜、プラ
スチックビーズ、ガラスピーズあるいは不織布等が用い
られる。標識酵素は、セイヨウワサビ・ペルオキシダー
ゼ、アルカリ・フォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ等が用いられる。ペルオキシダーゼの基質としては、
過酸化水素または過酸化尿素が用いられる。

抗体と標識酵素との結合はグルタルアルデヒド法、過ヨ
ウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法等の
公知の手段でなされる。発色原物質としてはＡＢＴＳ　
（２，２′−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン）
−６′−スルホン酸）、５−アミノサリチル酸、ルミノ
ール、あるいはＴＭＢ　（３，３”、５．５　’−テト
ラメチルベンジジン）等が用いられる。アルカリ・フォ
スファターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン
酸、β−ガラクトシダーゼの基質としては０−またはｐ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、あるいは４
−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドが用
いられる。

本発明の大腸菌群の検査キットの使用方法を以下に詳し
く述べる。食品あるいは飲料水の検体を無菌の生理緩衝
液で適当量に希釈して、ブイヨン培地に加えて、３７℃
で４時間以上インキュベートする。この培養液を、抗体
をコーティングした担体に加え３０分間、室温でインキ
ュベートする。その際、同時に陰性対照としてバチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　
）　ＩＦＯ１３７１９の煮沸菌体の懸濁液を同時に担体
に加え、インキュベートする。その後、未吸着物質を、
緩衝液等で数回よく洗い流す。そこに標識酵素を結合し
た抗体の溶液を加え３０分間、室温でインキュベートす
る。数回緩衝液等で、洗浄し、基質あるいは基質および
発色原物質を加え、室温でインキュベートする。同様の
ことを陰性対照についても試料と同時に行う。

３０分後、希硫酸を加えて反応を停止し、吸光度あるい
は蛍光強度を測定する。インキュベート後の培養液中の
大腸菌群の菌体量が１０ｓ／ｍ１以上ある場合は、吸光
度あるいは蛍光強度は菌体量の対数に比例する。試料の
吸光度もしくは蛍光強度が陰性対照のそれよりも２．５
倍以上あるとき、試料中の大腸菌群は陽性と判定できる
。

（発明の効果） 本発明によれば、簡単な操作で感度良く、大腸菌群のほ
とんど全部が検出でき、また短時間での検査が可能であ
る検査キットを提供することができる。

（実施例） 次に、実施例で本発明を説明する。なお、本発明は実施
例にのみ限定されるものではない。

実施例１ サルモネラ・チフィムリウムＩＦＯ１２５２９の煮沸菌
体の生理緩衝液ｐＨ７，４を１週間に１回、３週間ウサ
ギの腹控内に、次に１週間に１回、３週間同しウサギに
静脈注射した。８週間後に採血し、抗血清を得た。この
抗血清５−をリン酸緩衝生理食塩水にツイーン８０を０
．５％含んだ液で１０倍に希釈し、その２ｎ１１をホル
ミルセルロファイン（チッソ０１製、商品名）にリポポ
リサンカライドを結合させたものを担体としたカラム１
０ｍ１（サイズ：直径ｌ　ｃｍ、高さ１３ｃｍ）にかけ
た。同じ緩衝液３Ｍでカラムを洗い、その後グリシン塩
酸緩衝液ｐＨ２，５で抗サルモネラ抗体を溶出させた。

溶出液にトリスヒドロキシルアミンをｐＨ８，５になる
まで加え、これをリン酸緩衝生理食塩水に１夜透析した
ものを抗サルモネラ抗体溶液とした。

エンテロバクタ−・クロアカニＩＦＯ１３５３５の抗体
溶液も同様にして得た。

これらの抗体溶液を１部ずつ混合して、その１ｍｌを０
．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，２で５００倍に希釈し、
９６穴式マイクロタイタープレートに１００μｌずつ分
注した。このプレートを３７℃で１時間インキュベート
した後、抗体溶液を捨てた。次に、卵白アルブミン３％
を含む０．ＯＩＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐ）１７．５を
３００ｐｌずつ各ウェルに加えて１時間、３７℃でイン
キュベートした後、内容物を捨て、０．０１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ１，０で３回洗浄してから水分を切った。プレ
ートを凍結乾燥してシリカゲル等の乾燥剤を入れたビニ
ール袋に入れ、４℃で保存した。

この状態で少なくとも６ケ月間は安定であった。

一方、先に述べた抗サルモネラ抗体４０ｍｇを、ＥＴＡ
グレードのセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ３０ｎ＋
ｇを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　５
−に溶解した溶液と混合した。マグネチツクスターラー
でゆっくり撹拌しながら、１−エチル−３（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド５０ｍｇを徐々に
加え、ｐｌ（を０．ＩＮ塩酸、および０、Ｉ　Ｎ水酸化
ナトリウムで６．０〜７．０に調整しながら室温で２０
時間反応させた。反応液をセルロファインＧＣＬ−１０
００ｓｆ　（チッソ■製、商品名）のカラムに通して未
反応物を分離して取り除いた。これを酵素標識抗サルモ
ネラ抗体液とした。

同様にして、酵素標識抗エンテロバクター抗体を調製し
た。

一方、エシェリキア・コリに１２１ＦＯ３３０１（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフイ
ムリウムＩＦＯＬ２５２９、エンテロバクタ−・クロア
カニＩＦＯ１３５３５、イエルシニア・アルドヴアエＪ
ＣＭ５８９２（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ａｌｄｏｖａｅ）、
クレブシェラ・テリゲナＪＣＭ　１６８７（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ　ｔｅｒｒｉ　ｅｎａ）、アエロモナス・ヒ
ドロキシル・サブスピーシーズ・ヒドロフイラＪＣＭ　
１０２７（へｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈ　ｄｒｏ　ｈｉｌａ
　５ｕｂｓ　ｅｃｉｅｓｈ　ｄｒｏ　ｈｉｌｌａ）、セ
ラチア・マルセッセンスＪＣＭ１２３９　（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、プロテウス・ヴルガ
リスＩＦＯ３８５１（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌ　ａｒｉ
ｓ）の菌体１白金耳を、それぞれブイヨン培地で３５℃
、３時間培養した。この培養液を熱湯に５分間漬けた後
、放冷してから、先に調整しておいたマイクロタイター
プレートに１００ｐｌずつ加えて３７℃でインキュベー
トした。３０分後、プレートの各ウェルを０．０５％の
ツイーン２０を含む蒸留水で３回洗浄した。

次に、２種の酵素標識抗体を１部ずつ混合したものを各
ウェルに加えて３７℃でインキュベートした。３０分後
、再びプレートの各ウェルを０．０５％ツイーン２０を
含む蒸留水で３回洗浄した。よく水気を切った後、ＡＢ
ＴＳ　（２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアプ
リン）−６′−スルホン酸）と０，１Ｍ過酸化水素水の
クエン酸緩衝液ｐＨ５，５混液を０．２１ｎ！加えて１
５分静置して発色させ、イムノリーダーで４０５ｎｍの
吸光度を測定した。その結果を表１に示した。

表１ ＊二級光度０．２以上を陽性とした。陰性対照は０．０
８である。

表１に示すように、サルモネラ、エシェリキア、イエル
シニア、エンテロバクタ−、クレブシェラで陽性の値を
示した。アエロモナス、セラチア、プロテウスでは陰性
であった。アエロモナス、セラチア、プロテウスは大腸
菌群に属さないのでこの結果は好ましい。サルモネラお
よびイエルシニアは大腸菌群には厳密にいえば属してい
ないが、食中毒の原因の菌として大腸菌群の菌とともに
検出されることが望ましいので、この結果は好ましい。

実施例２ 牛挽肉５０ｇに一白金耳のエシェリキア・コリに１２を
加えた後、２００　ｍｌの生理食塩水で希釈懸濁し、こ
の懸濁液ニー、０．１−１０．０１１ｎ１、懸濁液を生
理食塩水で１０３倍および１０’倍に希釈した液１　ｍ
ｌ、０．１−１０．０１−をそれぞれ５本ずつのダーラ
ム発酵管を入れたＢＧＬＢ培地、ダーラム発酵管を入れ
ないＢＧＬＢ培地１０−に接種した。

ダーラム発酵管を入れたＢＧＬＢ培地は３７℃で２４時
間または４８時間培養し、ガス発生の有無を調べた。そ
の結果を比較例として表２に示した。

表２ 表に示すように実施例２では比較例より感度がよかった
。要した時間は比較例で４８時間であったが、実施例２
では７時間と大幅に短縮された。

発酵管を入れないＢＧＬＢ培地は３７℃で５時間培養後
、実施例１の方法で作成した抗体吸着プレート、標識酵
素液を用いて実施例１の方法で酵素免疫測定（ＥＬ、ｌ
５Ａ）を行った。その結果を表３に示した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅ
   ａｅ）に属する菌株に対するポリクロナール抗体をコー
   ティングした担体と、当該抗体に標識酵素を結合させた
   化合物とを、主な構成要素とする大腸菌群の検査キット
   。
2. （２）菌株が、サルモネラ・チフィムリウム（￥Ｓａｌ
   ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ￥）及びエン
   テロバクター・クロアカエ（￥Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
   ｒ　ｃｌｏａｃａｅ￥）の両方である請求項１記載の検
   査キット。