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DE3752345T2 - Elektrolumineszente Verbindungen und Zwischenprodukte zur Herstellung - Google Patents

Elektrolumineszente Verbindungen und Zwischenprodukte zur Herstellung

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DE3752345T2
DE3752345T2 DE3752345T DE3752345T DE3752345T2 DE 3752345 T2 DE3752345 T2 DE 3752345T2 DE 3752345 T DE3752345 T DE 3752345T DE 3752345 T DE3752345 T DE 3752345T DE 3752345 T2 DE3752345 T2 DE 3752345T2
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DE
Germany
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solution
antibody
ruthenium
composition
sample
Prior art date
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DE3752345T
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Leopoldo Della Ciana
Walter J. Dressick
Peter Feng
Richard J. Massey
Paul A. Mied
Mohindar S. Poonian
Michael J. Powell
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Bioveris Corp
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IGEN International Inc
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Publication date
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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • In dieser Anmeldung wird anhand arabischer Zahlen in Klammern Bezug auf verschiedene Veröffentlichungen genommen. Diese Veröffentlichungen sind am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen vollständig zitiert.
  • Es besteht fortlaufend und zunehmend Bedarf nach raschen spezifischen Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung chemischer, biochemischer und biologischer Substanzen. Besonders wertvoll sind Verfahren zur Messung kleinerer Mengen an Pharmazeutika, Metaboliten, Mikroorganismen und anderen Materialien von diagnostischem Wert. Beispiele für solche Substanzen sind unter anderem Narkotika und Gift, zu therapeutischen Zwecken verabreichte Drogen, Hormone, pathogene Mikroorganismen und Viren, Antikörper, Metaboliten, Enzyme und Nukleinsäuren.
  • Das Vorhandensein dieser Substanzen kann oft durch bindende Verfahren festgestellt werden, die den viele biochemische und biologische Systeme kennzeichnenden hohen Spezifizitätsgrad nutzen. Häufig genutzte Verfahren gründen sich beispielsweise auf Antigen-Antikörper-Systeme, Techniken zur Hybridisierung von Nukleinsäuren und Protein-Liganden-Systeme. Bei diesen Verfahren wird das Vorhandenseins eines Komplexes von diagnostischem Wert typischerweise durch die Gegenwart oder die Abwesenheit einer zu beobachtenden "Markierung" angezeigt, die an einer oder mehreren der komplexbildenden Substanzen angefügt ist.
  • Das gewählte spezifische Markierungsverfahren diktiert oft die Brauchbarkeit und Vielseitigkeit eines bestimmten Systems zum Nachweis einer relevanten Substanz. Eine bevorzugte Markierung sollte preiswert und sicher sein und sich effizient mit zahlreichen chemischen, biochemischen und biologischen Substanzen verbinden lassen, ohne deren wichtige bindende Eigenschaften zu verändern. Die Markierung sollte ein besonders charakteristisches Signal geben und selten, bzw. am besten gar nicht in der Natur vorkommen. Die Markierung sollte über Zeiträume bis zu mehreren Monaten stabil und in wäßrigen Systemen nachweisbar sein. Der Nachweis der Markierung sollte rasch, sensibel und reproduzierbar sein, ohne daß dafür kostenaufwendige Spezialanlagen oder -personal erforderlich sind. Die Quantifizierung der Markierung sollte relativ unabhängig von Variablen wie Temperatur und der Zusammensetzung der zu untersuchenden Mischung sein. Besonders vorteilhaft sind Markierungen, die in homogenen Systemen verwendet werden können, d. h. Systemen, in denen die Trennung der als Komplex bzw. nicht als Komplex vorhandenen markierten Substanzen nicht erforderlich ist. Dies ist möglich, wenn die Nachweisbarkeit der Markierung bei Inkorporierung der markierten Substanz in einen spezifischen Komplex angepaßt wird.
  • Es sind bereits zahlreiche Markierungen entwickelt worden, von denen jede bestimmte Vor- und Nachteile aufweist. Beispielsweise sind radioaktive Markierungen recht vielseitig und können auch bei sehr niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden. Sie sind jedoch teuer und nicht ungefährlich. Außerdem erfordert ihr Einsatz hochentwickelte Anlagen und geschultes Personal. Darüber hinaus ist die Sensibilität radioaktiver Markierungen dadurch begrenzt, daß der nachweisbare Vorfall im wesentlichen nur einmal pro radioaktives Atom im markierten Material auftreten kann. Darüber hinaus können radioaktive Markierungen in homogenen Verfahren nicht verwendet werden.
  • Es besteht daher großes Interesse an Markierungen, die nicht radioaktiv sind. Dazu gehören Moleküle, die durch Spektrophotometrie-, Spinresonanz- und Lumineszenztechniken beobachtet werden können, sowie Enzyme, die solche Moleküle erzeugen. Zu den geeigneten nicht radioaktiven Materialien gehören organometallische Verbindungen. Wegen der Seltenheit mancher Metalle in biologischen System können Verfahren, die spezifisch die Metallkomponente der organometallischen Verbindungen nachweisen, mit Erfolg eingesetzt werden. Beispielsweise offenbart Cais, US-A-4,205,952 (1980), die Nutzung von immunchemisch aktiven, mit bestimmten organometallischen Substanzen markierten Materialien zur Quantifizierung spezifischer Antigene. Bei diesen Markierungen kann jedes allgemeine Verfahren zum Nachweis der gewählten Metalle verwendet werden, einschließlich Emissions-, Absorptions- und Fluoreszenzspektroskopie, Atomabsorption und Neutronenaktivierung. Diesen Verfahren mangelt es oft an Sensibilität. Außerdem können sie selten für ein homogenes System adaptiert werden und führen, wie im Fall der Atomabsorption, manchmal zur Zerstörung der Probe.
  • Von besonderem Interesse sind Markierungen, die durch photochemische, chemische oder elektrochemische Maßnahmen zum Lumineszieren gebracht werden können. "Photolumineszenz" ist das Verfahren, bei dem ein Material zum Lumineszieren gebracht wird, wenn es elektromagnetische Strahlung absorbiert. Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind Arten von Photolumineszenz. Bei "chemischen Lumineszenz-Verfahren" wird die lumineszierende Spezies durch die chemische Übertragung von Energie erzeugt. "Elektrochemische Lumineszenz" bedeutet die Erzeugung der lumineszierenden Spezies auf elektrochemischem Weg.
  • Diese Lumineszenzsysteme gewinnen zunehmend an Bedeutung. Beispielsweise offenbart Mandle, US-A-4,372,745 (1983) die Verwendung chemisch lumineszierender Markierungen bei immunchemischen Anwendungen. In den offenbarten System werden die Markierungen durch chemische Maßnahmen wie die Reaktion der Markierung mit H&sub2;O&sub2; und einem Oxalat in einen lumineszierenden Zustand versetzt. In diesen System wandelt H&sub2;O&sub2; das Oxalat oxydativ zu einem Derivat mit hoher Energie um, das dann die Markierung anregt. Dieses System funktioniert prinzipiell mit jedem lumineszierenden Material, das unter den oxidierenden Bedingungen des Versuchs stabil ist und durch das Oxalatderivat mit hoher Energie angeregt werden kann. Unglücklicherweise ist gerade diese Vielseitigkeit die Quelle einer größeren Einschränkung dieser Technik: typische biologische Flüssigkeiten, die den relevanten Analyten enthalten, enthalten auch eine große Anzahl von potentiell lumineszierenden Substanzen, die ein hohes Ausmaß an Hintergrundlumineszenz verursachen können.
  • Ein weiteres Beispiel für die immunchemische Nutzung der chemischen Lumineszenz, die allerdings mit den gleichen Nachteilen behaftet ist, ist das Oberhardt et al. erteilte amerikanische Patent US-A-4,280,815 (1981), wo die elektrochemische Erzeugung eines Oxidationsmittels (z. B. H&sub2;O&sub2;) in situ in unmittelbarer Nähe zu einem mit einer chemisch lumineszierenden Spezies markierten Immunreaktanten offenbart wird. Das elektrisch erzeugte Oxidationsmittel diffundiert zu der chemisch lumineszierenden Spezies und oxidiert sie chemisch, was zur Nettoübertragung eines oder mehrerer Elektronen auf das elektrisch erzeugte Oxidationsmittel führt. Bei der Oxidation sendet die chemisch lumineszierende Spezies ein Photon aus. Im Gegensatz ist bei der vorliegenden Erfindung die direkte Übertragung von Elektronen von einer Quelle elektrochemischer Energie zu einer chemisch lumineszierenden Spezies erforderlich, die wiederholt Photonen aussenden kann.
  • Die Erfindung betrifft elektrochemisch lumineszierende Markierungen. Geeignete Markierungen umfassen elektrochemo-lumineszierende Verbindungen, eingeschlossen organische Verbindungen und organometallische Verbindungen. Elektrochemische Lumineszenzverfahren zum Nachweis des Vorhandenseins markierter Materialien werden anderen Verfahren aus vielen Gründen vorgezogen. Sie können das Vorhandensein einer besonderen Markierung mit hoher Präzision diagnostizieren, sind sensibel, ungefährlich, preiswert und können zudem für die verschiedensten Anwendungen eingesetzt werden.
  • Organische Verbindungen, die geeignete elektrochemische Markierungen darstellen, schließen z. B. Rubren und 9,10-Diphenylanthracen ein. Viele organometallische Verbindungen sind geeignete elektrochemische Markierungen, doch besonders nützlich sind Verbindungen, die Ru und Os enthalten.
  • Somit betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform die Verwendung von Ru- und Os-haltigen Markierungen, die durch zahlreiche Verfahren nachgewiesen werden können. Diese Markierungen sind aus mehreren Gründen, die hier noch erörtert werden, vorteilhaft.
  • Ru- und Os-haltige organometallische Verbindungen sind in der Literatur bereits diskutiert worden. Cais offenbart, daß jedes Metallelement bzw. jede Kombination aus Metallelementen einschließlich Edelmetallen der Gruppe VIII wie Ru geeignete Komponenten für organometallische Markierungen sind, die durch Atomabsorptionsverfahren nachweisbar sind (Cais, Spalte 11, Zeile 20). Jedoch ist bei Cais Ruthenium kein bevorzugtes Metall, Osmium wird nicht gesondert erwähnt, es werden keine Daten über die Effizienz der Verwendung von Ru oder Os in einem der offenbarten Verfahren geliefert, und das bevorzugte Nachweisverfahren, nämlich die Atomabsorption, zieht die Zerstörung der Probe nach sich.
  • Weber, US-A-4,293,310 (1981) offenbart die Verwendung von Ru- und Os-haltigen Komplexen als elektrochemische Markierungen für Analyten in Immunanalysen. Die offenbarten Komplexe sind durch eine Thioharnstoffbindung mit den Aminogruppen der Analyten verbunden. Weber weist auch auf die Möglichkeit hin, Carboxylatester zwischen den Markierungen und Hydroxygruppen auf anderen Analyten zu bilden.
  • Nach Weber kann die Anwesenheit von markierten Substanzen mit einem Verfahren bzw. einem Apparat nachgewiesen werden, der einen Quencher und eine elektrochemische Strömungszelle mit einer Lichtvorrichtung umfaßt. Bei der Photoanregung überträgt die photo-elektrochemisch aktive Markierung ein Elektron auf ein Quenchermolekül; das oxidierte Molekül wird anschließend mit einem Elektron aus einer Elektrode der Strömungszelle, die unter geeigneter Spannung gehalten wird, reduziert. Dieses Elektron wird als Photostrom gemessen. Die Menge des freien markierten Analyten wird durch das Photostromsignal ermittelt. Es wird darauf hingewiesen, daß dieses Verfahren die Umkehrung des Nachweises lumineszierender Substanzen durch elektrochemische Lumineszenz ist.
  • In späteren Berichten erörterten Weber et al. die Probleme im Zusammenhang mit dem Einsatz dieses Verfahrens zum Nachweis Ru-haltiger Markierungen (1). In Tabelle 2 von Weber et al. (1) liegt die extrapolierte Nachweisgrenze für Tris(bipyridyl)ruthenium(II) unter optimalen Bedingungen bei 1,1 · 10&supmin;¹&sup0; Mol/l. In der Erwartung, daß der tatsächliche Einsatz dieser Markierungen auch Messungen in Gegenwart komplexer Mischungen nach sich ziehen würde, testeten Weber et al. ihr System auf mögliche Störsubstanzen. Die Tabelle 3 von Weber et al. führte Dimethylalkylamine, EDTA, N-Methylmorpholin, N,N'-Dimethylpiperazin, Hydroxid, Oxalat, Ascorbat, Harnsäure und Serum als Störstoffe auf, die die praktische Nachweisgrenze vermutlich erheblich über 1,1 · 10&supmin;¹&sup0; Mol/l anheben würden.
  • Diese Studien wurden mit einer einfachen Ru-haltigen Verbindung durchgeführt. Weber bzw. Weber et al. berichteten nicht über Studien bezüglich der Nachweisgrenze von komplexen, mit Ru-haltigen Markierungen markierten Substanzen. Auch davon, ob die Thioharnstoffbindung zwischen dem markierten Material und der Markierung unter den Versuchsbedingungen stabil war, war keine Rede.
  • Die speziellen Markierungen, mit denen sich die Erfindung befaßt, sind elektrochemisch lumineszierend. Sie können oft ohne Oxidation oder Reduktion in einen lumineszierenden Zustand versetzt werden, indem man sie elektromagnetischer Strahlung oder einer chemischen Energiequelle wie der, durch die typische Oxalat-H&sub2;O&sub2;- Systeme erzeugt werden, aussetzt. Außerdem kann die Lumineszenz dieser Verbindungen durch elektrochemische Methoden induziert werden, die ihre Oxidation und Reduktion nach sich ziehen.
  • Es ist über umfangreiche Arbeiten an Verfahren zum Nachweis von Ru(2,2'-bipyridin)&sub3;²&spplus; unter Verwendung photolumineszierender, chemisch lumineszierender und elektrochemisch lumineszierender Vorrichtungen (2, 3) berichtet worden. Diese Arbeiten zeigen, daß eine leuchtend orangefarbige Chemilumineszenz auf der wäßrigen Reaktion von chemisch oder elektrisch erzeugtem Ru(bpy)&sub3;³&spplus; (wobei "pby" einen Bipyridylliganden darstellt) mit starken Reduktionsmitteln basiert, die als Zwischenprodukte bei der Oxidation von Oxalationen oder anderen organischen Säuren entstehen. Lumineszenz läßt sich auch in Lösungen aus organischen Lösungsmitteln und H&sub2;O erzeugen, und zwar durch die Reaktion von elektrisch oder chemisch erzeugtem Ru(bpy)&sub3;¹&spplus; mit starken Oxidationsmitteln, die bei der Reduktion von Peroxydisulfat entstanden sind. Ein dritter Mechanismus zur Herstellung von elektrochemischer Lumineszenz aus Ru(bpy)&sub3;²&spplus; umfaßt die Schwingung eines Elektrodenpotentials zwischen einem Potential, das ausreichend negativ für die Erzeugung von Ru(bpy)&sub3;¹&spplus; und ausreichend positiv für die Erzeugung von Ru(bpy)&sub3;³&spplus; ist. Diese drei Verfahren werden "oxydative Reduktion", "reduktive Oxidation" bzw. "Ru(bpy)&sub3;3+/+ regeneratives System" genannt.
  • Das oxydative Reduktionsverfahren kann in Wasser durchgeführt werden und erzeugt eine intensive, leistungsfähige und stabile Lumineszenz, die gegenüber Sauerstoff oder Verunreinigungen verhältnismäßig unempfindlich ist. Diese Lumineszenz aus Ru(bpy)&sub3;²&spplus; hängt von der Gegenwart von Oxalat oder anderen organischen Säuren wie Pyruvat, Lactat, Malonat, Tartrat und Citrat und einer Vorrichtung zur oxydativen Erzeugung der Ru(bpy)&sub3;³&spplus;-Spezies ab. Diese Oxidation kann chemisch durch starke Oxidationsmittel wie PbO&sub2; oder ein Ce(IV)- Salz erfolgen. Sie kann auch elektrochemisch durch ein ausreichend positives Potential durchgeführt werden, das man entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich anlegt. Geeignete Elektroden für die elektrochemische Oxidation von Ru(bpy)&sub3;²&spplus; sind z. B. Pt, pyrolytisches Graphit und Glaskohlenstoff. Obwohl das Oxalat oder die andere organische Säure während der Chemilumineszenz aufgezehrt wird, kann man durch einen Überschuß des aufgezehrten Materials oder durch kontinuierlichen Nachschub dieses Materials zur Reaktionskammer für viele Stunden eine starke, konstante Chemilumineszenz erreichen.
  • Das reduktive Oxidationsverfahren kann man in teilweise wäßrigen Lösungen durchführen, die ein organisches Colösungsmittel wie z. B. Acetonitril enthalten. Diese Lumineszenz hängt von der Gegenwart von Peroxydisulfat und einer Vorrichtung zur reduktiven Erzeugung einer Ru(bpy)&sub3;¹&spplus;-Spezies ab. Die Reduktion kann chemisch durch starke Reduktionsmittel wie z. B. Magnesium und andere Metalle erfolgen. Sie kann auch elektrochemisch durchgeführt werden, indem man ein ausreichend negatives Potential entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich anlegt. Eine geeignete Elektrode für die elektrochemische Reduktion von Ru(bpy)&sub3;²&spplus; ist beispielsweise eine Elektrode aus poliertem Glaskohlenstoff. Wie beim oxydativen Reduktionsverfahren läßt sich durch Verwendung überschüssiger Reagenzien oder kontinuierlichen Nachschub für aufgezehrte Reagenzien zum Reaktionsgemisch für viele Stunden eine kontinuierliche und intensive Lumineszenz erreichen.
  • Das Ru(bpy)&sub3;3+/+ regenerative System kann in organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril oder in teilweise wäßrigen Systemen durchgeführt werden, indem man ein Elektrodenpotential zwischen einem Potential, das ausreichend negativ ist, um Ru(bpy)&sub3;²&spplus; zu reduzieren, und einem Potential, das ausreichend positiv ist, um Ru(bpy)&sub3;²&spplus; zu oxidieren, pulsieren läßt. Eine geeignete Elektrode für so ein regeneratives System ist beispielsweise eine Pt-Elektrode. Dieses System verbraucht keine chemischen Reagenzien und kann im Prinzip für einen unbegrenzten Zeitraum ablaufen.
  • Gemein ist diesen drei Verfahren zur Herstellung lumineszierender Ru-haltiger Verbindungen die wiederholte Oxidation-Reduktion oder Reduktion-Oxidation der Ru- haltigen Verbindung. Die Lumineszenz von Lösungen, die diese Verbindungen enthalten, hängt deshalb in hohem Ausmaß vom elektrischen Potential der angelegten Energiequelle ab und kann daher die Gegenwart der Ru-haltigen Verbindung besonders gut diagnostizieren.
  • Mandle zitiert Curtis et al. (4) als mögliche Markierung in Chemilumineszenzanwendungen. Curtis et al., berichten nur über unveröffentlichte Beobachtungen, daß Ru-Komplexe dazu gebracht werden können, Licht auszustrahlen, wenn sie durch ein Oxalat/H&sub2;O&sub2;-System (Curtis et al., S. 350) chemisch dazu angeregt werden.
  • Weder Mandle noch Curtis erkannten die außergewöhnliche Nützlichkeit von Ruthenium- und Osmiumkomplexen bei Chemilumineszenzanwendungen oder die Eignung elektrolumineszierender Systeme. Sprintschnik, G. et al. (5) haben, mit Octadecanol oder Dehydrocholesterol veresterte Komplexe aus Tris(2,2'-bipyridin)ruthenium(II) beschrieben und einlagige Filme aus diesen oberflächenaktiven Komplexen gebildet. Die Komplexe waren photolumineszierend. Setzte man die Filme jedoch dem Einfluß von Wasser und dann von Licht aus, entstand bei den Ru- Komplexen keine Photolumineszenz. Dies führte man auf die Photohydrolyse von Estergruppen in Gegenwart von Licht zurück.
  • Wir haben entdeckt und offenbaren in dieser Anmeldung, daß zahlreiche relevante Analyten und chemische Komponenten, die an relevante Analyten binden, sich auf einfache Weise durch Amid- oder Aminbindungen mit Ru- oder Os-haltigen Markierungen verbinden lassen. Die markierten Substanzen können dann durch eine von zahlreichen Methoden ermittelt werden. Am effizientesten, verläßlichsten und sensibelsten haben sich dabei Photolumineszenz-, Chemilumineszenz- und elektrochemische Lumineszenzmethoden erwiesen. In dieser Anmeldung wird auch offenbart, das elektrochemisch lumineszierende Markierungen einschließlich Ru- und Os-haltige Markierungen und organische Moleküle wie Rubren und 9,10-Diphenylanthracen besonders vielseitig und vorteilhaft sind. Die besonderen Vorteile der Verwendung dieser neuartigen markierten Substanzen und der Verfahren zu ihrem Nachweis werden im folgenden erörtert.
  • Seit vielen Jahren herrschen in der Lebensmittelindustrie Bedenken bezüglich der Gegenwart biologischer und chemischer Kontaminanten in rohen Lebensmittelbestandteilen und verarbeiteten Lebensmitteln. Es sind zwar technische Fortschritte bei der Verringerung der Lebensmittelkontamination und von darauf zurückzuführenden Erkrankungen gemacht worden, doch bisher ist kaum über Fortschritte bei der Entwicklung schneller und sensibler Verfahren zum Nachweis und zur Identifikation von Lebensmittelkontaminanten berichtet worden. Die derzeit existierenden Standardverfahren zum Nachweis schädlicher Kontaminanten in Lebensmitteln sind im allgemeinen zeitaufwendig, arbeitsintensiv und technisch schwierig. Die Analyseverfahren selbst sind zwar größtenteils ausreichend sensibel, doch die langwierigen Vorbereitungen der Proben für das eigentliche Nachweisverfahren führen oft zu einer geringen Ausbeute des fraglichen Kontaminanten, so daß man häufig falschnegative Antworten erhält.
  • Zwei Beispiele, die diese Probleme veranschaulichen, sind die derzeit anerkannten Standardverfahren zum Nachweis von Salmonellen und staphylogenen Enterotoxinen in Lebensmitteln. Zum Nachweis von Salmonellen in Lebensmitteln gehören mehrere Anreicherungsstufen, weil diese Bakterien bei Vorhandensein in Lebensmitteln normalerweise in geringer Anzahl gefunden werden und oft subletal verletzt sind. Deshalb müssen Nachweisverfahren für Salmonellen sensibel sein und die Wiederbelebung und das Wachstum verletzter Zellen ermöglichen.
  • Zwei Verfahren zum Nachweis von Salmonellen werden derzeit von der amerikanischen Food & Drug Administration (Amt für Lebensmittel und Medikamente) empfohlen. Diese Verfahren sind in The Bacteriological Analytical Manual for Foods (Handbuch der bakteriologischen Analyse von Lebensmitteln) (1984), 6. Auflage, Verband der offiziellen Analysechemiker, Washington, DC, aufgeführt. Eines davon ist eine Reinkulturtechnik, bei der mit Voranreicherung, selektiver Anreicherung und selektivem Beschicken einer Kulturschale gearbeitet wird. Dieses Verfahren dauert 4 Tage, bis man mutmaßliche, und 5 bis 7 Tage, bis man vollständige Ergebnisse erhält. Das andere Verfahren umfaßt die Immunofluoreszenz nach der selektiven Anreicherung. Dieses Verfahren ist schneller, kann jedoch aufgrund von Problemen der Kreuzreaktivität der im Test verwendeten mehrwertigen Antiseren zu einem hohen Vorkommen an falsch-positiven Ergebnissen führen (6, 7).
  • Das von der U. S. Food and Drug Administration empfohlene Verfahren zum Nachweis staphylogener Enterotoxine in Lebensmitteln wird ebenfalls im Bacteriological Analytical Manual for Foods (1984), 6. Auflage, Verband der offiziellen Analysechemiker, Washington, DC, angeführt. Dabei wird ein Extrakt einer großen Lebensmittelprobe, z. B. etwa 100 g, durch verschiedene Dialysekonzentrationsschritte auf ein kleines Volumen, z. B. 0,2 ml, konzentriert und der Probenextrakt in einer Ionenaustauschkolonne gereinigt, um die Probe für die Doppelimmundiffusionstechnik mittels Mikroobjektträger vorzubereiten. Dieses Verfahren dauert im allgemeinen mehr als eine Woche.
  • Schneller durchzuführende Tests sind kürzlich für den Nachweis zahlreicher Kontaminanten wie Bakterien, Toxine, Antibiotika und Pestizidrückstände in Lebensmitteln entwickelt worden. In vielen Fällen jedoch ist die Vorbereitung der Probe für den Test nach wie vor Zeit- und arbeitsaufwendig. Radioimmuntests (radioimmunoassays = RIA) und ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) haben den Zeitaufwand für das analytische Verfahren selbst verkürzt, sind jedoch immer noch laborintensiv und alles andere als einfach durchzuführen. Außerdem basieren diese Verfahren üblicherweise auf der Verwendung polyklonaler Antiseren, die in ihrer Spezifizität und Sensibilität schwanken und außerdem nur in geringer Menge für Tests eines bestimmten Lebensmittelkontaminanten zur Verfügung stehen. ELISA-Verfahren sind für die Analyse von Lebensmitteln entwickelt worden, die monoklonale Antikörper anstelle polyklonaler Antiseren verwenden. Die Verwendung monoklonaler Antikörper in einem Analysesystem für einen Lebensmittelkontaminanten stellt den konstanten Nachschub eines Reagenz zur Verfügung, das dem Test selbst eine unveränderliche Spezifizität und Sensibilität verleiht. Man hat monoklonale Antikörper in ELISA-Systemen für Tests auf Lebensmittelkontaminanten wie Salmonellen (8) und staphylogene Enterotoxine (9) verwendet. Im Handel erhältliche Produkte zum Nachweis von Salmonellen, bei denen die EIA- Methodik (Bio-Enzabead Screen Kit, Litton Bionetics) und die DNA-Sondentechnology (Gene-Trak, Integrated Genetics) angewendet werden, sind zeitaufwendig und laborintensiv. Im Handel erhältliche Tests zum Nachweis staphylogener Enterotoxine in Lebensmitteln, bei denen die umgekehrte passive Latexagglutination (SET-RPLA, Denka Seiken Co.) und die EIA-Methodik (SET-EIA, Dr. W. Bomelli Laboratories) angewendet werden, unterliegen den gleichen Einschränkungen.
  • In den vergangenen 100 Jahren wurden das Bakterium Escherichia coli und die coliforme Gruppe verbreitet als Indikatoren eingesetzt, um die Wasserqualität und das Auftreten von Kontamination durch Abwasser zu überwachen.
  • Derzeitige Nachweisverfahren für E. coli und/oder coliforme Gruppen basieren auf den Eigenschaften der Säure- oder Gasproduktion aus der Fermentation von Laktose. Die am meisten verbreiteten Methoden sind der Plausibilitätstest (Most Probable Number = MPN) und der Membranfiltrationstest (MF). Beide Techniken sind von der Umweltschutzbehörde (Environmental Protection Agency = EPA) und dem Amerikanischen Gesundheitsamt (American Public Health Association = APHA) für die mikrobiologische Untersuchung von Wasser und Abwasser (10) sowie von der Food and Drug Administration (FDA) für die bakteriologische Untersuchung von Milch und Lebensmitteln (11) genehmigt.
  • Das MPN-Verfahren besteht eigentlich aus drei (12) getrennten Tests (10). Beim präsumtiven Test wird ein nichtselektives Medium wie eine Brühe aus Laurylsulfattryptose (LST) oder eine Lactosebrühe verwendet, um festzustellen, ob aus der Fermentation von Lactose Gas entsteht. Von gaspositiven Röhrchen werden dann in einem stärker selektiven Medium Subkulturen angelegt, und zwar in einer Brühe aus Brillantgrün-Lactosegalle (BGLB) für coliforme Gruppen und eine E. coli (EC) Brühe für fäkale coliforme Gruppen, und erneut auf Gasproduktion untersucht (bestätigter Test). Proben aus positiven Bestätigungstests müssen zusätzlich getestet werden, indem man eine Kulturschale mit einem selektiven und differenzierenden Medium wie Eosinmethylen-Blau (EMB) Agar oder Endos-Agar damit beschickt und anschließend den Gramfärbungstest und einige biochemische Tests durchführt, um das Vorhandensein der Indikatorbakterien endgültig nachzuweisen (abgeschlossener Test). Der gesamte MPN-Test kann bis zu seinem Abschluß bis zu fünf (5) Tage dauern; deshalb verwenden die meisten Labors für die Routineanalyse von Wasser nur die Teile "präsumtiv" und "bestätigt" des MPN-Tests, die immer noch 48 bis 72 Stunden in Anspruch nehmen. Abgesehen davon, daß sie zeitaufwendig und in bezug auf Material kostenineffektiv sind, kommen bei den MPN- Tests häufig falsch-positive und falsch-negative Reaktionen vor (15, 16, 20).
  • Die MF-Technik für die bakteriologische Untersuchung von Wasser wurde Anfang der fünfziger Jahre eingeführt (12). Im Gegensatz zur MPN-Analyse, die ermüdend und zeitaufwendig war, konnte die MF-Analyse innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen werden, ohne daß weitere Bestätigungen erforderlich waren. Das MF-Grundverfahren wird wie folgt durchgeführt: Ein bestimmtes Volumen einer Wasserprobe, üblicherweise 100 ml, wird durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von 45 um filtriert und dann auf einer mit einem selektiven Medium gesättigten sterilen Unterlage bebrütet. Die beiden am häufigsten verwendeten Medien sind die mEndo- Brühe, die für coliforme Gruppen bei 35ºC, und die mFC- Brühe, die für fäkale coliforme Gruppen bei 44,5ºC selektiv ist (10). Seit der Einführung dieser Medien haben zahlreiche Autoren berichtet, daß sowohl die mEndo- als auch die mFC-Brühe dazu neigen, die tatsächliche Anzahl von vorhandenen Indikatorbakterien zu unterschätzen. Dies liegt entweder an der Selektivität des Mediums oder an der hohen, für die Bebrütung verwendeten Temperatur von 44,5ºC (21, 22). Solche falschnegative Ergebnisse erhielt man besonders häufig, wenn die Organismen in der Probe durch Umweltfaktoren und/oder Chemikalien subletal verletzt worden waren (17, 18). In jüngster Zeit sind vom EPA Modifikationen vorgeschlagen worden, und zwar soll anschließend an den MF-Test ein Bestätigungsverfahren durchgeführt werden.
  • Dabei müssen unter Verwendung der LST-Brühe und dann der BGLB-Brühe wie im MPN-Test auf jedem Filter mindestens zehn Kolonien auf Gasentwicklung untersucht werden (14). Durch solche Modifikationen würden sich zwar sowohl falsch-negative als auch falsch-positive Reaktionen verringern, gleichzeitig jedoch die Materialkosten steigen und die MF-Versuchszeit sich von 24 auf 72 Stunden verdreifachen.
  • 1982 führten Feng und Hartmann einen Fluorophortest zum Nachweis von E. coli unter Verwendung des Substrats 4- Methylumbelliferonglucuronid (MUG) ein (13). Die E. coli-Zellen erzeugten das Enzym B-Glucuronidase, das das Substrat aufspaltete und den fluorophoren 4-Methylumbelliferonrest freisetzte (19). Durch Inkorporierung der Verbindung MUG in das präsumtive LST-Medium, lieferte ein einziges Röhrchen an LST-MUG-Medium innerhalb von 24 Stunden sowohl die präsumtiven (Gasproduktion) als auch die bestätigten Daten (Fluoreszenz) für fäkale coliforme Gruppen. Obwohl der MUG-Test rasch und einfach war, produzierten nur 85 bis 95% der E. coli (je nach Quelle) dieses Enzym; der Test war also nicht 100% verläßlich. Außerdem war das System nicht auf die coliforme Gruppe anwendbar.
  • Derzeit existiert kein geeigneter Test für den Nachweis und die zahlenmäßige Auswertung von coliformen und fäkalen coliformen Gruppen in einer Probe. Die Entwicklung eines einfachen, schnellen und verläßlichen Nachweistests würde nicht nur weniger kosten- und zeitaufwendig sein, sondern auch die Effizienz der Überwachung der Wasserreinheit sowie der Lebensmittelver- und bearbeitung erheblich steigern.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion eines relevanten Analyten in einem festgelegten Volumen einer flüssigen Multikomponentenprobe zur Verfügung, welcher bei Vorhandensein in der Probe eine Konzentration von unter 10&supmin;³ Mol aufweist, bei dem man
  • a) die Probe mit einem Reagenz in Kontakt bringt, welches
  • (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszustrahlen, wenn es dem Einfluß einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Emission von Strahlung durch das Reagenz bewirkt, und
  • (ii) mit dem relevanten Analyten kombiniert werden kann, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der Analyt und das Reagenz aneinander binden;
  • b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die das Reagenz anregen kann, wiederholt elektrochemische Lumineszenz auszusenden, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß das Reagenz induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung zu emittieren, und
  • c) die emittierte elektromagnetische Strahlung nachweist, um festzustellen, ob der relevante Analyt in der Probe vorhanden ist.
  • Die Erfindung stellt auch ein kompetitives Verfahren zum Detektieren der Menge eines relevanten Analyten in einem festgelegten Volumen einer flüssigen Multikomponentenprobe zur Verfügung, welcher bei Vorhandensein in der Probe eine Konzentration von unter 10&supmin;³ Mol aufweist, bei dem man
  • a) die Probe mit dem Reagenz in Kontakt bringt, das
  • (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszustrahlen, wenn es dem Einfluß einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Emission von Strahlung durch das Reagenz bewirkt, und
  • (ii) mit dem relevanten Analyten um Bindungsstellen auf einem komplementären Material, das normalerweise nicht in der Probe vorhanden ist, konkurrieren kann, und mit dem komplementären Material, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der Analyt und das Reagenz kompetitiv an das komplementäre Material binden;
  • b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die das Reagenz anregen kann, wiederholt Strahlung auszusenden, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß das Reagenz induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszustrahlen, und
  • c) die ausgestrahlte elektromagnetische Strahlung quantitativ nachweist, um festzustellen, ob und in welcher Menge der relevante Analyt in der Probe vorhanden ist.
  • Ferner wird bereitgestellt ein Verfahren für die quantitative Bestimmung in einem vorbestimmten Volumen einer flüssigen Mehrkomponentenprobe der Menge eines relevanten Analyten, der in der Probe vorhanden ist, bei dem man
  • a) die Probe mit einer bekannten Menge des Reagenz in Kontakt bringt, welches
  • (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszustrahlen, wenn es dem Einfluß einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Emission von Strahlung durch das Reagenz bewirkt, und
  • ii) mit dem relevanten Analyten kombinieren kann, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß er Analyt und das Reagenz kombinieren;
  • b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die das Reagenz anregen kann, wiederholt Strahlung zu emittieren, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß das Reagenz induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung zu emittieren; und
  • c) die Menge an so emittierter Strahlung quantitativ bestimmt und dadurch quantitativ die Menge des relevanten Analyten, der in der Probe vorhanden ist, bestimmt.
  • Die Erfindung stellt weiterhin bereit ein kompetitives Verfahren für die quantitative Bestimmung in einem vorbestimmten Volumen einer flüssigen Mehrkomponentenprobe der Menge eines relevanten Analyten, der in der Probe vorhanden ist. Dieses Verfahren umfaßt, daß man:
  • a) die Probe mit einer bekannten Menge an Reagenz in Kontakt bringt, welches
  • (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszustrahlen, wenn es dem Einfluß einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Emission von Strahlung durch das Reagenz bewirkt, und
  • (ii) mit dem interessierenden Analyten um Bindungsstellen auf einem komplementären Material in Wettbewerb treten kann, das normalerweise nicht in der Probe vorhanden ist, und mit einer bekannten Mengen des komplementären Materials, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß der interessierende bzw. relevante Analyt und das Reagenz kompetitiv an das komplementäre Material binden;
  • b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die das Reagenz anregen kann, wiederholt Strahlung zu emittieren, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß das Reagenz induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung zu emittieren; und
  • c) die Menge an so emittierter Strahlung quantitativ bestimmt und dadurch quantitativ die Menge des relevanten Analyten, der in der Probe vorhanden ist, bestimmt.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zum Detektieren und Identifizieren der Anwesenheit einer Mehrzahl von relevanten Analyten in einem flüssigen Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelhomogenisat. Dieses Verfahren umfaßt:
  • a) Eintauchen in das flüssige Nahrungsmittel oder Nahrungshomogenisat einen Teil eines Diagnosereagenzhalters, geeignet für das Eintauchen in eine Flüssigkeit oder Feststoffsuspension und mit einer darauf immobilisierten Mehrzahl von Reagenzien, wobei jedes Reagenz an dem Diagnosereagenzhalter auf bestimmten, identifizierbaren Bereichen immobilisiert ist und einen Komplex mit einem einzelnen interessierenden Analyten so bilden kann, daß die Bildung eines immobilisierten Komplexes aus Reagenz/interessierendem Analyten gestattet wird;
  • b) Entfernen des Diagnosereagenzhalters aus dem flüssigen Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelhomogenisat;
  • c) Spülen des Diagnosereagenzhalters mit einer geeigneten Spüllösung;
  • d) Eintauchen des Teils des Diagnosereagenzhalters, der die immobilisierten Komplexe aus Reagenz/relevantem Analyten enthält, in eine Nachweislösung, die mindestens ein DetektionsReagenz bzw. NachweisReagenz enthält, das Komplexe mit den immobilisierten Komplexen aus Reagenz/relevantem Analyten bilden kann, um die Bildung eines immobilisierten Komplexes aus Reagenz/relevantem Analyt/DetektionsReagenz zu gestatten; und
  • e) Detektieren der Anwesenheit auf den identifizierbaren Bereichen des Diagnosereagenzhalters, an die die Reagenzien immobilisierte sind, des immobilisierten Komplexes aus Reagenz/relevantem Analyt/Detektionsmittel, dadurch detektieren und identifizieren der Anwesenheit einer Mehrzahl von relevanten Analyten in dem flüssigen Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelhomogenisat.
  • Die Erfindung stellt außerdem bereit einen Kit, geeignet für die Detektion und Identifizierung der Anwesenheit einer Vielzahl von Enterotoxinen in einer Probe. Dieser Kit umfaßt:
  • a) einen Diagnosereagenzhalter, versehen mit einem Griff, verbunden mit einer Oberfläche, geeignet für das Eintauchen in eine Flüssigkeit oder Feststoffsuspension, wobei die Oberfläche mindestens eine daran angeheftete Nitrocellulosemembran aufweist, wobei die Nitrocellulosemembran eine Vielzahl von monoclonalen Antikörpern aufweist, die separat und distinkt auf identifizierbaren Bereichen auf derselben immobilisiert sind, wobei jeder immobilisierte monoclonale Antikörper für eine antigenische Determinante auf einem Enterotoxin spezifisch ist;
  • b) eine erste Spüllösung, die eine gepufferte wäßrige Lösung, enthaltend ein Detergenz, umfaßt;
  • c) eine Detektion, die mindestens ein Konjugat aus monoclonalem Antikörper/Enzym umfaßt, wobei der monoclonale Antikörper desselben für antigenische Determinanten spezifisch ist, die sich unterscheiden, jedoch auf jedem Enterotoxin gelegen sind, für das die an die Nitrocellulosemembran, die an den Diagnosereagenzhalter angeheftet ist, immobilisierten monoclonalen Antikörper spezifisch sind;
  • d) eine zweite Spüllösung, die eine gepufferte wäßrige Lösung umfaßt;
  • e) ein Enzymsubstrat, das mit dem an den monoclonalen Antikörper der Detektionslösung konjugierten Enzym reagieren kann; und
  • f) einen farblosen Farbstoff.
  • Ein Verfahren für die Detektion der Anwesenheit von mindestens einer Bakterienspezies in einer Probe wird durch die vorliegende Erfindung ebenfalls bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt:
  • a) Einimpfen der Probe in mindestens eine Schale, die mit einem offenen Ende versehen ist und ein geeignetes Medium für das Fördern des Wachstums der Bakterienspezies enthält;
  • b) Kuppeln einer Kappe an das Ende der Schale, wobei die Fläche der Kappe, die dann, wenn diese an die Schale gekuppelt ist, zum Inneren der Schale exponiert ist, mit einer Oberfläche versehen ist, die für das Immobilisieren mindestens einer Bakterienkomponente geeignet ist;
  • c) Inkubieren der beimpften Medien unter solchen Bedingungen, daß die in das Medium eingeimpften Bakterien reproduzieren können;
  • d) auf den Kopf stellen jeder Schale für eine geeignete Zeitspanne, damit in dem Medium vorhandene Komponenten des Bakteriums auf der Oberfläche der Kappe immobilisiert werden können, die dem Inneren der Schale ausgesetzt ist;
  • e) Umdrehen der auf dem Kopf stehenden Schale in aufrechte Position;
  • f) Entkoppeln der Kappe von der Schale;
  • g) in Kontaktbringen der Oberfläche der Kappe, die Komponenten der Bakterien darauf immobilisiert aufweist, mit einem Reagenz, das einen Komplex mit den immobilisierten Komponenten der Bakterien bilden kann, unter solchen Bedingungen, um die Bildung eines immobilisierten Komplexes aus Bakterienkomponente/Reagenz zu gestatten; und
  • h) Detektieren von immobilisierten Komplexen aus Bakterienkomponente/Reagenz, dadurch Detektieren der Anwesenheit der Bakterienspezies in der Probe.
  • Weiterhin wird bereitgestellt durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit coliformer Bakterien in einer Probe. Dieses Verfahren umfaßt:
  • a) Einimpfen der Probe in mindestens eine Schale, die mit einem offenen Ende versehen ist und ein nicht selektives Laktosemedium sowie ein umgedrehtes Durham- Gärröhrchen aufweist;
  • b) Kuppeln einer mit einem Polystyrolinsert versehenen Kappe an das offene Ende jeder Schale;
  • c) Inkubieren des eingeimpften Mediums für mindestens 2 Stunden bei 37ºC;
  • d) Ermitteln, ob jede Schale Gas erzeugt hat über bakterielle Fermentation, gefangen in dem umgekehrten Durham-Gärröhrchen;
  • e) Umdrehen der Schalen, die Gas aufweisen, das in dem umgekehrten Durham-Gärröhrchen gefangen ist, auf den Kopf für eine geeignete Zeitspanne, um es in dem Medium vorhandenen coliformen Bakterien zu gestatten, Komplexe aus coliformen/Polystyrol zu bilden;
  • f) Umdrehen der auf dem Kopf stehenden Schalen in aufrechte Position;
  • g) Entkoppeln der Kappen von den Schalen;
  • h) Behandeln der Polystyrolinserts der entkoppelten Kappen mit einer für die Blockierung freier Stellen geeigneten Substanz;
  • i) Behandeln der Polystyrolinserts der Kappen, die mit einer für die Blockierung freier Stellen geeigneten Substanz behandelt worden sind, mit mindestens einem gegen coliforme Bakterien gerichteten Antikörper, markiert mit einem detektierbaren Marker und befähigt zur Bindung an coliforme Bakterien, unter Bedingungen, um die Bildung eines Komplexes aus Antikörper/coliformem Bakterium/Polystyrol zu gestatten; und
  • j) Detektieren der Anwesenheit eines Komplexes aus Antikörper/coliformem Bakterium/Polystyrol auf dem Polystyrolinsert, dadurch detektieren der Anwesenheit von coliformen Bakterien in der Probe.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 stellt Messungen mittels elektrochemischer Lumineszenz dar, die für einen homogenen Immuntest für die Feststellung der Konzentration eines Antigens in Lösung vorgenommen wurden.
  • Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines homogenen ECL-Theophyllintests.
  • Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines homogenen Theophyllintests in verschiedenen Seren.
  • normale Seren
  • hämolysierte Seren
  • lipämische Seren
  • ikterische Seren
  • Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines ECL-Theophyllintests verglichen mit den Ergebnissen eines Fluoreszenzpolarisations-Theophyllintests.
  • A. normale Seren: n = 4, Neigung 0,986; R = 1,00
  • B. hämolysierte Seren: n = 3, Neigung 0,878, r = 1,00
  • C. lipämische Seren: n = 5, Neigung 0,872, R = 0,99
  • D. ikterische Seren: n = 4, Neigung = 2,14, r = 1,00
  • Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines ECL-Theophyllintests im Vergleich zu den Ergebnissen eines HPLC-Tests.
  • n = 9, Neigung 1,197, r = 9,98.
  • Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der Abwandlung eines ECL-Signals, das in einem ECL-Digoxinimmuntest erzeugt wurde.
  • Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines ECL-Digoxinimmuntests.
  • = leer
  • = Digoxin
  • Fig. 8 ist eine graphische Darstellung des ECL-Signals, das durch verschiedene Konzentrationen der MBI 38-Verbindung I erzeugt wird.
  • Fig. 9. zeigt die Ergebnisse einer Hybridisierungs-/ Sensibilisierungsstudie der MBI 38-Verbindung I.
  • TAG = Verbindung I
  • Fig. 10 zeigt die Ergebnisse einer Spezifizitätsstudie der MBI 38-Verbindung I
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis des Vorhanden- oder Nichtvorhandenseins eines relevanten Analyten in einem festgelegten Volumen einer flüssigen Multikomponentenprobe zur Verfügung, welcher bei Vorhandensein in der Probe eine Konzentration von unter 10&supmin;³ Mol aufweist, bei dem man
  • a) die Probe mit einem Reagenz in Kontakt bringt, welches
  • (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszustrahlen, wenn es dem Einfluß einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Emission von Strahlung durch das Reagenz bewirkt, und
  • (ii) mit dem relevanten Analyten kombinieren kann, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der Analyt und das Reagenz aneinander binden;
  • b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die das Reagenz anregen kann, wiederholt Strahlung zu emittieren, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß das Reagenz induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung zu emittieren, und
  • c) die emittierte elektromagnetische Strahlung nachweist, um festzustellen, ob der relevante Analyt in der Probe vorhanden ist.
  • Im Rahmen dieser Anmeldung bedeutet "Molar" Konzentration eines Analyten in Lösung in Mol pro Liter oder die Meng an Materie in Teilchenform, die in einer flüssigen Probe in Teilchen oder Einheiten pro Liter vorhanden ist. Beispielsweise können 1 · 20²³ Teilchen pro Liter als 1 Mol ausgedrückt werden.
  • Die durch die Erfindung zur Verfügung gestellten Verfahren können als heterogene Tests durchgeführt werden, d. h. Tests, in denen ein ungebundenes markiertes Reagenz von einem gebundenen markierten Reagenz getrennt wird, ehe letzteres der Einwirkung elektrochemischer Energie ausgesetzt wird. Sie können auch als homogene Tests durchgeführt werden, d. h. Tests, in denen ein ungebundenes markiertes Reagenz und ein gebundenes markiertes Reagenz der Einwirkung der elektrochemischen Energie zusammen ausgesetzt werden. In den erfindungsgemäßen homogenen Tests kann man die von dem gebundenen markierten Reagenz ausgehende elektromagnetische Strahlung entweder durch eine Zunahme oder Abnahme in der vom gebundenen markierten Reagenz gegenüber dem ungebundenen markierten Reagenz ausgehenden elektromagnetischen Strahlung oder als elektromagnetische Strahlung einer anderen Wellenlänge unterscheiden. Dementsprechend wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein Reagenz, das mit den relevanten Analyten kombiniert wird, von der mit dem Reagenz in Kontakt gebrachten Probe abgetrennt, ehe die Probe der Einwirkung elektrochemischer Energie ausgesetzt wird. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor dem Kontakt mit dem Reagenz behandelt, um den relevanten Analyten zu immobilisieren. Maßnahmen zur Immobilisierung des relevanten Analyten sind in der Technik allgemein bekannt. Dabei kann die Probe z. B. mit einer Polystyrol-, Nitrocellulose- oder Nylonoberfläche bzw. einer Oberfläche, beschichtet mit ganzen Zellen, subzellulären Teilchen, Viren, Prionen, Viroiden, Lipiden, Fettsäuren, Nukleinsäuren, Polysacchariden, Proteinen, Lipoproteinen, Lipopolysacchariden, Glykoproteinen, Peptiden, zellulären Metaboliten, Hormonen, pharmakologischen Wirkstoffen, Beruhigungsmitteln, Barbituraten, Alkaloiden, Steroiden, Vitaminen, Aminosäuren, Zuckern, nichtbiologischen Polymeren, synthetischen organischen Molekülen, organometallischen Molekülen oder anorganischen Molekülen in Kontakt gebracht werden. Darüber hinaus kann der relevante Analyt jede dieser Substanzen sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der relevante Analyt Theophyllin. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der relevante Analyt Digoxin. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der relevante Analyt menschliches choriales Gonatropin (hCG). Darüber hinaus kann der relevante Analyt eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, Prion, Viroid, eine Nukleinsäure, ein Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glykoprotein, Peptid, Hormon, pharmakologischer Wirkstoff, nichtbiologisches Polymer, synthetisches organisches Molekül, organometallisches Molekül oder anorganisches Molekül sein und in der Probe in einer Konzentration von unter etwa 10&supmin;¹² Molar vorhanden sein. Außerdem kann der relevante Analyt eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, Prion, Viroid oder eine Nukleinsäure sein, die in der Probe in einer Konzentration unterhalb von etwa 10&supmin;¹&sup5; Molar vorhanden ist.
  • Das Reagenz, das mit der Probe in Kontakt gebracht wird, kann eine elektrochemisch lumineszierende, chemische Einheit umfassen, die mit einer ganzen Zelle, einem subzellulären Teilchen, einem Virus, einem Prion, Viroid, Lipid, einer Fettsäure, einer Nukleinsäure, einem Polysaccharid, einem Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glykoprotein, Peptid, zellulären Metaboliten, Hormon, pharmakologischen Wirkstoff, Beruhigungsmittel, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, einer Aminosäure, einem Zucker, einem nichtbiologischen Polymeren, einem synthetischen organischen Molekül, organometallischen Molekül, anorganischen Molekül, Biotin, Avidin oder Streptavidin konjugiert ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Wirkstoff eine elektrochemisch lumineszierende Einheit, die mit einem Antikörper, Antigen, einer Nukleinsäure, Hapten, Liganden oder Enzym, Biotin, Avidin oder Streptavidin konjugiert ist.
  • Die elektrochemilumineszente chemische Einheit kann eine metallhaltige organische Verbindung umfassen, in der aus der aus Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Palladium, Molybdän und Technetium bestehenden Gruppe ausgewählt ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Metall Ruthenium oder Osmium. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemilumineszente chemische Einheit Rubren oder 9,10-Diphenylanthracen. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis- [(4,41-carbomethoxy)-2,2'-bipyridin]2-[3-(4-methyl2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolanruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)- buttersäure]ruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente (2,2'-Bipyridin)-[cis-bis(1,2-diphenylphosphino)-ethylen]-{2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin- 4'-yl)propyl]1,3-dioxolan}osmium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis(2,2'-bipyridin)-[4- (4'-methyl-2,2'-bipyridin)butylamin]ruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis(2,2'-bipyridin)-[1-brom-4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan]- ruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis[(2,2'-bipyridin)-maleinimidhexansäure, 4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylaminruthenium(II).
  • Die Probe kann von einem Feststoff, einer Emulsion, Suspension, Flüssigkeit oder einem Gas sowie Wasser, Lebensmitteln, Blut, Serum, Urin, Kot, Gewebe, Speichel, Ölen, organischen Lösungsmitteln oder Luft abgeleitet sein. Darüber hinaus kann die Probe Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, n-Methylpyrrolidon oder tert-Butylalkohol enthalten. Die Probe kann ein Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel enthalten.
  • Ferner stellt die Erfindung ein kompetitives Verfahren zum Nachweis des Vorhanden- oder Nichtvorhandenseins eines relevanten Analyten in einem festgelegten Volumen einer flüssigen Multikomponentenprobe zur Verfügung, welcher bei Vorhandensein in der Probe eine Konzentration von 10&supmin;³ aufweist, bei dem man
  • a) die Probe mit einem Reagenz und mit dem Komplementärmaterial in Kontakt bringt, welches
  • (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszustrahlen, wenn es dem Einfluß einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Emission von Strahlung durch das Reagenz bewirkt, und
  • (ii) mit einem relevanten Analyten um Bindungsstellen auf einem normalerweise in der Probe nicht vorhandenen Komplementärmaterial in Wettbewerb treten kann, wobei der Kontakt unter geeigneten Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der relevante Analyt und das Reagenz kompetitiv an das Komplementärmaterial binden;
  • b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die das Reagenz anregen kann, wiederholt Strahlung zu emittieren, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß das Reagenz induziert wird, wiederholt elektrochemische Strahlung auszustrahlen, und
  • c) die ausgestrahlte elektrochemische Strahlung nachweist, um festzustellen, ob der relevante Analyt in der Probe vorhanden ist.
  • Das Reagenz kann der relevante, mit einer elektrochemisch lumineszierenden chemischen Komponente konjugierte Analyt oder ein Analogon des relevanten, mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente konjugierten Analyten sein. Darüber hinaus kann der relevante Analyt Theophyllin, Digoxin oder hCG sein. Darüber hinaus ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis[(4,41-carbomethoxy)- 2,2'-bipyridin]2-[3-(4-methyl2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]- 1,3-dioxolanruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(butan-1-al)- 4'-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis(2,2'-bipyridin)-[4- (4'-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)buttersäure]ruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente (2,2'- Bipyridin)-[cis-bis(1,2-diphenylphosphino)-ethylen]-{2-[3- (4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]1,3-dioxolan}osmium- (II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin)butylamin]ruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis(2,2'-bipyridin)-[1-brom-4-(4'-methyl-2,2'- bipyridin-4-yl)butan]ruthenium(II). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente Bis[(2,2'-bipyridin)-maleinimidhexansäure, 4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylaminruthenium(II).
  • Das Komplementärmaterial kann eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, Prion, Viroid, Lipid, eine Fettsäure, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glykoprotein, Peptid, ein zellulärer Metabolit, Hormon, pharmakologischer Wirkstoff, Beruhigungsmittel, Barbiturat, Steroid, Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker, ein nichtbiologisches Polymer, synthetisches organisches Molekül, organometallisches Molekül oder anorganisches Molekül sein.
  • Es ist im Bereich der Anmeldung, daß die hier bereitgestellten Verfahren durchgeführt werden, um den relevanten Analyt zu quantifizieren. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung bereit ein Verfahren zum quantitativen Nachweis der Menge eines relevanten Analyten in einem festgelegten Volumen einer flüssigen Multikomponentenprobe zur Verfügung, bei dem man
  • a) die Probe mit einer bekannten Menge eines Reagenz in Kontakt bringt, welches
  • (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszustrahlen, wenn es dem Einfluß einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Emission von Strahlung durch das Reagenz bewirkt, und
  • (ii) mit dem relevanten Analyten kombiniert werden kann, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der Analyt und das Reagenz aneinander binden;
  • b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die das Reagenz anregen kann, wiederholt Strahlung zu emittieren, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß das Reagenz induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung zu emittieren, und
  • c) die emittierte Strahlung quantitativ nachweist, um dadurch quantitativ die Menge des relevanten Analyt in der Probe festzustellen.
  • Dieses Verfahren kann als heterogener oder homogener Test durchgeführt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird jedes Reagenz, das nicht mit den relevanten Analyten kombiniert ist, von der mit einer bekannten Menge des Reagenz in Kontakt gebrachten Probe abgetrennt, ehe sie der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die das Reagenz induzieren kann, wiederholt Strahlung auszusenden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor dem Kontakt mit dem Reagenz behandelt, um den relevanten Analyten zu immobilisieren.
  • Der für diese Ausführungsform der Erfindung relevante Analyt kann eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, Prion, Viroid, Lipid, eine Fettsäure, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glykoprotein, Peptid, ein zellulärer Metabolit, Hormon, pharmakologischer Wirkstoff, Beruhigungsmittel, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker, ein nichtbiologisches Polymer, synthetisches organisches Molekül, organometallisches Molekül oder anorganisches Molekül sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der relevante Analyt Theophyllin. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der relevante Analyt Digoxin. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der relevante Analyt hCG.
  • Das Reagenz, mit dem die Probe in Kontakt gebracht wird, kann eine elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente sein, die mit einer ganzen Zelle, einem subzellulären Teilchen, einem Virus, einem Prion, Viroid, Lipid, einer Fettsäure, einer Nukleinsäure, einem Polysaccharid, einem Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glykoprotein, Peptid, zellulären Metaboliten, Hormon, pharmakologischen Wirkstoff, Beruhigungsmittel, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, einer Aminosäure, einem Zucker, einem nichtbiologischen Polymeren, einem synthetischen organischen Molekül, einem organometallischen Molekül oder anorganischen Molekül konjugiert ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Reagenz eine elektrochemisch lumineszierende chemische Komponente, die mit einem Antikörper, Antigen, einer Nukleinsäure, Hapten, einem Liganden oder Enzym, Biotin, Avidin oder Streptavidin konjugiert ist.
  • Die elektrochemisch lumineszierende Komponente kann eine metallhaltige organische Verbindung sein, in der das Metall aus der aus Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Palladium, Molybdän und Technetium bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Bevorzugt ist das Metall Ruthenium oder Osmium. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemolumineszente chemische Einheit Ruben oder 9,10-Diphenylantracen. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis[(4,4'-carbomethoxy)-2,2'-bipyridin]2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolanruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)buttersäure]ruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2- bipyridin)-[cis-bis(1,2-diphenylphosphino)ethylen]-{2-[3- (4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-dioxolan}osmium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2-bipyridin)butylamin]- ruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2'-bipyridin)-[1-brom-4)-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan]ruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis[(2,2'-bipyridin)-maleinimidhexansäure, 4-methyl-2,2'-bipyridin-41-butylaminruthenium(II).
  • Die Probe kann von einem Feststoff, einer Emulsion, Suspension, Flüssigkeit oder einem Gas abgeleitet sein. Proben, die den relevanten Analyten enthalten, können von Wasser, Lebensmitteln, Blut, Serum, Urin, Kot, Gewebe, Speichel, Ölen, organischen Lösungsmitteln oder Luft abgeleitet sein. Darüber hinaus können die Proben Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, n-Methylpyrrolidon oder tert-Butylalkohol enthalten. Die Probe kann ein Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel enthalten.
  • Ferner stellt die Erfindung ein kompetitives Verfahren zum quantitativen Nachweis der Menge eines relevanten Analyten in einem festgelegten Volumen einer flüssigen Multikomponentenprobe zur Verfügung. Dieses Verfahren umfaßt, daß man
  • a) die Probe mit einer bekannten Menge eines Komplementärmaterials und einer bekannten Menge eines Reagenz und mit einer bekannten Menge an Komplementärmaterial in Kontakt bringt, welches
  • (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung zu emittieren, wenn es dem Einfluß einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Ausstrahlung elektromagnetischer Strahlung durch das Reagenz bewirkt, und
  • (ii) mit dem relevanten Analyten in Wettbewerb um Bindungsstellen auf dem normalerweise nicht in der Probe vorhandenen Komplementärmaterial treten kann, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der relevante Analyt und das Reagenz kompetitiv an das Komplementärmaterial binden;
  • b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die das Reagenz anregen kann, wiederholt Strahlung auszusenden, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß das Reagenz induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung zu emittieren, und
  • c) die ausgestrahlte Strahlung quantitativ nachweist, um so die Menge des relevanten Analyten in der Probe quantitativ zu bestimmen.
  • Der relevante Analyt kann Theophyllin, Digoxin oder hCG sein.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Reagenz der relevante Analyt, konjugiert an eine elektrochemolumineszente chemische Einheit oder ein Analogon des relevanten Analyten konjugiert an eine elektrochemolumineszente chemische Einheit. Die elektrochemolumineszente chemische Einheit kann sein Bis[(4,4'-carbomethoxy)-2,2'-bipyridin]2-[3- (4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolanruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)buttersäure]ruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2-bipyridin)-[cis- bis(1,2-diphenylphosphino)ethylen]-{2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-dioxolan}osmium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2-bipyridin) butylamin] ruthenium (II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis- (2,2'-bipyridin)-[1-brom-4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4- yl)butan]ruthenium(II); in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die elektrochemisch lumineszierende chemische Einheit Bis[(2,2'-bipyridin)-maleinimidhexansäure, 4-methyl-2,2'-bipyridin-41-butylaminruthenium(II).
  • Das Komplementärmaterial kann eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, Prion, Viroid, Lipid, eine Fettsäure, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glykoprotein, Peptid, ein zellulärer Metabolit, Hormon, pharmakologischer Wirkstoff, Beruhigungsmittel, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker, ein nichtbiologisches Polymer, ein synthetisches organisches Molekül, organometallisches Molekül oder anorganisches Molekül sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Detektieren und Identifizieren der Anwesenheit einer Mehrzahl von relevanten Analyten in einem flüssigen Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelhomogenisat bereit. Dieses Verfahren umfaßt:
  • a) Eintauchen eines Teils eines diagnostischen Reagenzhalters, der für das Eintauchen in eine Flüssigkeit oder Feststoffsuspension geeignet ist und darauf immobilisiert eine Vielzahl von Reagenzien aufweist, wobei jedes Reagenz auf dem Diagnosereagenzhalter an bestimmten, identifizierbaren Regionen immobilisiert ist und einen Komplex mit einem einzelnen relevanten Analyten bilden kann, um die Bildung von immobilisierten Komplexen aus Reagenz/relevantem Analyten zu gestatten, in das flüssige Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelhomogenisat;
  • b) Entfernen des Diagnosereagenzhalters aus dem flüssigen Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelhomogenisat;
  • c) Spülen des Diagnosereagenzhalters mit einer geeigneten Spüllösung;
  • d) Eintauchen des Teils des Diagnosereagenzhalters, der den immobilisierten Komplex aus Reagenz/relevantem Analyten enthält, in eine Detektionslösung, die mindestens ein Detektionsmittel enthält, das Komplexe mit dem immobilisierten Komplex aus Reagenz/relevantem Analyten so bilden kann, um die Bildung von immobilisierten Komplexen aus Reagenz/relevantem Analyten/Detektionsmittel zu gestatten, und
  • e) Detektieren der Anwesenheit der identifizierbaren Bereiche auf dem Diagnosereagenzhalter, an die Reagenzien immobilisiert sind aus immobilisierten Komplexen aus Reagenz/relevantem Analyten/Detektionsmittel, dadurch Detektieren und Identifizieren der Anwesenheit einer Vielzahl von relevanten Analyten in dem flüssigen Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelhomogenisat.
  • Bei den relevanten Analyten kann es sich um Mikroorganismen handeln. Die Mikroorganismen können lebensfähig oder nicht lebensfähig sein. Zusätzlich kann es sich bei den Mikroorganismen um Bakterien handeln. Beispiele für Bakterien, die über dieses Verfahren detektiert werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Salmonella, Campylobacter, Escherichia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Clostridium, Streptococcus oder Staphylococcus.
  • Weiterhin kann es sich bei den relevanten Analyten um Antigene handeln. Solche Antigene schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Enterotoxine und Aflatoxine.
  • Die immobilisierten Reagenzien und Detektionsmittel können polyclonale Antikörper, monoclonale Antikörper, Mischungen von monoclonalen Antikörpern oder Mischungen von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern sein.
  • Das Detektionsreagenz kann mit einem detektierbaren Marker markiert sein. In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Detektionsmittel bzw. Detektionsreagenzien mit demselben detektierbaren Marker markiert. Solche Marker sind im Stand der Technik wohl bekannt und können ein Enzym, beispielsweise alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, Beta-Galactosidase oder Urease, eine fluoreszierende Einheit, beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat, Tetramethylrhodaminisothiocyanat, Dichlortriazinylaminofluorescein oder Texas Rot, oder eine chemolumineszente Einheit, beispielsweise Luminol, Isoluminol, oder einen Acridiniumester umfassen. Darüber hinaus kann es sich bei dem detektierbaren Marker um eine elektrochemolumineszente chemische Einheit handeln, die dazu induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung zu emittieren bei Exposition an eine Menge an elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle, die wirksam ist, die Einheit zur Emission von Strahlung zu induzieren. Diese elektrochemolumineszente chemische Einheit kann Ruthenium oder Osmium umfassen.
  • Die immobilisierten Reagenzien können auf einer Nitrocellulosemembran immobilisiert sein, die an den Diagnosereagenzhalter angeheftet ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Kit bzw. ein Ensemble bereit, der zum Detektieren und Identifizieren der Anwesenheit einer Vielzahl von Enterotoxinen in einer Probe geeignet ist. Dieser Kit umfaßt:
  • a) einen Diagnosereagenzhalter, versehen mit einem Griff, verbunden mit einer Oberfläche, geeignet für das Eintauchen in eine Flüssigkeit oder Feststoffsuspension, wobei die Oberfläche mindestens eine daran angeheftete Nitrocellulosemembran aufweist, wobei die Nitrocellulosemembran eine Mehrzahl von monoclonalen Antikörpern aufweist, die separat und unterscheidbar an identifizierbare Bereiche auf derselben immobilisiert sind, wobei jeder immobilisierte monoclonale Antikörper für eine antigenische Determinante auf einem Enterotoxin spezifisch ist;
  • b) eine erste Spüllösung, die eine gepufferte wäßrige Lösung, enthaltend ein Detergenz, umfaßt;
  • c) eine Detektion(slösung), die mindestens ein Konjugat aus monoclonalem Antikörper/Enzym umfaßt, wobei der monoclonale Antikörper derselben für antigenische Determinanten spezifisch ist, die sich von derjenigen unterscheiden, jedoch auf jedem Enterotoxin gelegen sind, für das der auf der Nitrocellulosemembran immobilisierte monoclonale Antikörper spezifisch ist, der an den Diagnosereagenzhalter angeheftet ist,
  • d) eine zweite Spüllösung, die eine gepufferte wäßrige Lösung umfaßt;
  • e) ein Enzymsubstrat, das mit dem an den monoclonalen Antikörper der Detektionslösung konjugierten Enzym reagieren kann; und
  • f) einen farblosen Farbstoff.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Nitrocellulosemembran mit monoclonalen Antikörpern versehen, die separat und getrennt auf dieser immobilisiert sind und die spezifisch für antigenische Determinanten auf einer Mehrzahl von Staphylococcen-Enterotoxinen spezifisch sind. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Nitrocellulosemembran versehen mit vier monoclonalen Antikörpern, die separat und distinkt bzw. unterscheidbar auf dieser immobilisiert sind und die spezifisch für die Staphylococcen-Enterotoxine A, B, D und E sind. Darüber hinaus kann diese Nitrocellulosemembran zusätzlich mit einem monoclonalen Antikörper versehen sein, der separat und distinkt auf dieser immobilisiert ist und der spezifisch für eine antigenische Determinante auf mehr als einem Staphylococcen-Enterotoxin ist. Dieses Enterotoxin kann spezifisch für antigenische Determinanten auf Staphylococcen-Enterotoxinen C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; sein. Das Enzym dieses Kits, das an den monoclonalen Antikörper konjugiert ist, der spezifisch für antigenische Determinanten ist, die sich von derjenigen unterschieden, jedoch auf dem jeweiligen Staphylococcen-Enterotoxin gelegen sind, für das die auf der Nitrocellulose immobilisierten monoclonalen Antikörper spezifisch sind, kann alkalische Phosphatase sein, deren Enzymsubstrat 5-Brom-4-chlorindolylphosphat ist, das mit dem Enzym reagieren kann und der farblose Farbstoff ist Nitrobluetetrazolium.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Detektieren und Identifizieren der Anwesenheit einer Vielzahl von Staphylococcen-Enterotoxinen in einer Flüssigkeit oder einer Feststoffsuspension bereit. Dieses Verfahren umfaßt:
  • a) Eintauchen eines Diagnosereagenzhalters, der mit einer Vielzahl von monoclonalen Antikörpern versehen ist, spezifisch für Staphylococcen-Enterotoxine, die separat und distinkt darauf immobilisiert sind, in die Flüssigkeit oder Feststoffsuspension für eine geeignete Zeitspanne, um die Bildung eines immobilisierten Komplexes aus monoclonalem Antikörper/Staphylococcen- Enterotoxin zu gestatten;
  • b) Entfernen des Diagnosereagenzhalters aus der Probe;
  • c) Eintauchen des Diagnosereagenzhalters in eine gepufferte wäßrige Lösung, die ein Detergenz umfaßt;
  • d) Entfernen des Diagnosereagenzhalters aus der gepufferten wäßrigen Lösung, die ein Detergenz umfaßt;
  • e) Eintauchen des Diagnosereagenzhalters in eine Detektionslösung, die ein Konjugat aus monoclonalem Antikörper alkalischer Phosphatase umfaßt, für eine ausreichende Zeitspanne, um die Bildung von immobilisierten Komplexen aus monoclonalem Antikörper/Staphylococcen- Enterotoxin/monoclonalem Antikörper alkalischer Phosphatase zu gestatten;
  • f) Entfernen des Diagnosereagenzhalters aus der Detektionslösung;
  • g) Eintauchen des Diagnosereagenzhalters in die gepufferte wäßrige Lösung;
  • h) Entfernen des Diagnosereagenzhalters aus der gepufferten wäßrigen Lösung;
  • i) Eintauchen des Diagnosereagenzhalters in eine Lösung, die 5-Brom-4-chlorindolylphosphat und Nitrobluetetrazolium umfaßt;
  • j) visuelles Detektieren der identifizierbaren Bereiche auf der Nitrocellulosemembran, auf denen sich ein blauer Niederschlag akkumuliert;
  • k) Korrelieren der identifizierbaren Bereiche auf der Nitrocellulosemembran, auf denen ein blaues Präzipitat akkumuliert, mit dem Staphylococcen-Enterotoxin, für das der auf dem Bereich immobilisierte monoclonale Antikörper spezifisch ist, dadurch Anzeigen der Anwesenheit und der Identität der Mehrzahl von Staphylococcen-Enterotoxinen in der Probe.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren für die Detektion der Anwesenheit mindestens einer Bakterienspezies in einer Probe. Dieses Verfahren umfaßt:
  • a) Impfen der Probe in mindestens eine Schale, die mit einem offenen Ende versehen ist und ein geeignetes Medium für das Fördern des Wachstums der Bakterienspezies enthält;
  • b) Kuppeln einer Kappe an das Ende der Schale, wobei die Fläche der Kappe, die dann, wenn diese an die Schale gekuppelt ist, zum Inneren der Schale exponiert ist, mit einer Oberfläche versehen ist, die für das Immobilisieren mindestens einer Bakterienkomponente geeignet ist;
  • c) Inkubieren des eingeimpften Mediums unter Bedingungen, um den in das Medium eingeimpften Bakterien die Reproduktion zu gestatten;
  • d) Umdrehen jeder Schale für eine geeignete Zeitspanne, um ein Immobilisieren der in dem Medium vorhandenen Komponenten des Bakteriums an die Oberfläche der Kappe zu gestatten, die dem Inneren der Schale ausgesetzt ist;
  • e) Umdrehen der auf dem Kopf stehenden Schale in aufrechte Position;
  • f) Entkoppeln der Kappe von der Schale;
  • g) in Kontaktbringen der Oberfläche der Kappe, die Komponenten der Bakterien darauf immobilisiert aufweist, mit einem Reagenz, das einen Komplex mit den immobilisierten Komponenten der Bakterien bilden kann, unter solchen Bedingungen, um die Bildung eines immobilisierten Komplexes aus Bakterienkomponente/Reagenz zu gestatten; und
  • h) Detektieren von immobilisierten Komplexen aus Bakterienkomponente/Reagenz, dadurch Detektieren der Anwesenheit der Bakterienspezies in der Probe.
  • Im Kontext der Anmeldung schließt "Bakterienkomponente" oder "Komponente von Bakterien" ein, ist jedoch nicht beschränkt auf eine ganze Zelle, eine Zellwandkomponente, eine Zellmembrankomponente und eine Flagellenkomponente.
  • Die Oberfläche der Kappe, die für das Immobilisieren mindestens einer Komponente der Bakterien geeignet ist, kann ein Polystyrolinsert, eine Nitrocellulosemembran oder eine Nylonmembran sein. Darüber hinaus kann die Oberfläche mit einem polyclonalen Antikörper, einem monoclonalen Antikörper, einer Mischung aus monoclonalen Antikörpern oder einer Mischung aus polyclonalen und monoclonalen Antikörpern beschichtet sein.
  • Das zur Bildung eines Komplexes mit den immobilisierten bakteriellen Komponenten befähigte Reagenz kann ein polyclonaler Antikörper, ein monoclonaler Antikörper, eine Mischung von monoclonalen Antikörpern oder eine Mischung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern darstellen. Darüber hinaus kann das Reagenz mit einem detektierbaren Marker, beispielsweise einem detektierbaren Enzym, einer Fluoreszenzeinheit oder einer chemolumineszenten Einheit markiert sein. Zusätzlich kann der detektierbarer Marker eine elektrochemolumineszente Einheit sein. In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt die elektrochemolumineszente Einheit Ruthenium oder Osmium.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die immobilisierten Komplexe aus bakterieller Komponente/Reagenz mit einem detektierbar markierten zweiten Reagenz detektiert werden, das in der Lage ist, einen Komplex mit den immobilisierten Komplexen aus bakterieller Komponente/Reagenz zu bilden. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Reagenz ein polyclonaler Antikörper, eine monoclonaler Antikörper, eine Mischung aus monoclonalen Antikörpern oder eine Mischung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern darstellen und das zweite Reagenz kann ein detektierbar markierter Anti-Antikörper sein, der gegen das Reagenz gerichtet ist.
  • Proben, in denen Bakterien detektiert werden können, schließen Wasser und Nahrungsmittel ein.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das für das Fördern des Wachstums der Bakterienspezies geeignete Medium ein nicht selektives Laktosemedium. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Medium ein nicht selektives Laktosemedium und ist die Bakterienspezies, die detektiert wird, mindestens ein coliformes Bakterium.
  • Ein Verfahren für die Detektion der Anwesenheit von coliformen Bakterien in einer Probe wird ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt:
  • a) Inokulieren der Probe in mindestens eine Schale, die mit einem offenen Ende versehen ist und ein nicht selektives Laktosemedium sowie ein umgedrehtes Durham- Gefäß aufweist;
  • b) Kuppeln einer mit einem Polystyrolinsert versehenen Kappe an das offene Ende jeder Schale;
  • c) Inkubieren des eingeimpften Mediums für mindestens 2 Stunden bei 37ºC;
  • d) Ermitteln, ob jede Schale über bakterielle Fermentation Gas erzeugt hat, gefangen in dem umgekehrten Durham-Gefäß;
  • e) Umdrehen der Schalen, die Gas aufweisen, das in dem umgekehrten Durham-Gefäß gefangen ist, auf den Kopf für eine geeignete Zeitspanne, um es in dem Medium vorhandenen coliformen Bakterien zu gestatten, Komplexe aus coliformen/Polystyrol zu bilden;
  • f) Umdrehen der auf dem Kopf stehenden Schalen in aufrechte Position;
  • g) Entkoppeln der Kappen von den Schalen;
  • h) Behandeln der Polystyrolinserts der entkoppelten Kappen mit einer für die Blockierung freier Stellen geeigneten Substanz;
  • i) Behandeln der Polystyrolinserts der Kappen, die mit einer für die Blockierung freier Stellen geeigneten Substanz behandelt worden sind, mit mindestens einem gegen coliforme Bakterien gerichteten Antikörper, markiert mit einem detektierbaren Marker und befähigt zur Bindung an coliforme Bakterien, unter Bedingungen, um die Bildung eines Komplexes aus Coliformen/Antikörper/Polystyrol zu gestatten; und
  • j) Detektieren der Anwesenheit eines Komplexes aus Coliformen/Antikörper/Polystyrol auf dem Polystyrolinsert, dadurch Detektieren der Anwesenheit von coliformen Bakterien in der Probe.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das nicht selektive Laktosemedium Phenol-Rot-Brühe.
  • Die für das Blockieren freier Stellen auf dem Polystyrolinsert geeignete Substanz kann Rinderserumalbumin (BSA) sein.
  • Der gegen coliforme Bakterien gerichtete Antikörper, markiert mit einem detektierbaren Marker, kann ein monoclonaler Antikörper, markiert mit einem detektierbaren Marker, sein. Der detektierbare Marker kann ein an den monoclonalen Antikörper konjugiertes Enzym ein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Enzym alkalische Phosphatase aus dem Kalbsdarm. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der detektierbare Marker eine an den monoclonalen Antikörper konjugierte fluoreszierende Einheit. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der detektierbare Marker eine an den monoclonalen Antikörper konjugierte elektrochemolumineszente Einheit. Die elektrochemolumineszente Einheit kann Ruthenium oder Osmium enthalten.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Probe um Wasser. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Probe ein Nahrungsmittel.
  • Die Schale, die ein offenes Ende aufweist, kann eine Phiole bzw. ein Reagenzglas sein.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Kit für die Detektion der Anwesenheit von coliformen Bakterien in Wasserproben. Dieser Kit umfaßt:
  • a) mindestens eine Phiole, enthaltend ein nicht selektives Laktosemedium;
  • b) mindestens ein Durham-Gärröhrchen;
  • c) mindestens eine Phiolenkappe, versehen mit einem Polystyrolinsert;
  • d) eine Lösung von Rinderseriumalbumin;
  • e) ein Konjugat aus einem monoclonalen, gegen coliforme Bakterien gerichteten Antikörper und Enzym;
  • f) eine gepufferte wäßrige Waschlösung; und
  • b) eine Lösung des Enzymsubstrats.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das an den monoclonalen, gegen coliforme Bakterien gerichtete Antikörper konjugierte Enzym die alkalische Phosphatase aus dem Kalbsdarm und das Enzymsubstrat ist Dinatrium-p-nitrophenolphosphat.
  • Die Erfindung stellt außerdem eine Verbindung bereit mit der Struktur:
  • worin n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n gleich 2.
  • Die Erfindung stellt weiterhin bereit eine Verbindung mit der Struktur
  • worin n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n gleich 2.
  • Die Erfindung stellt außerdem eine Verbindung mit der Struktur bereit
  • worin n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n gleich 2.
  • Die Erfindung stellt außerdem eine Verbindung mit der Struktur bereit:
  • in der R ein Anion und n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n 2.
  • Diese Verbindung kann eine Materialzusammensetzung mit der Struktur umfassen:
  • X-(Y)n-Z
  • worin X für eines oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder ein Analogon des relevanten Analyten, n für eine ganze Zahl und Z für die von der Erfindung bereitgestellte Verbindung steht.
  • Die Erfindung stellt außerdem eine Verbindung mit der Struktur bereit:
  • in der R ein Anion und n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n 2.
  • Diese Verbindung kann eine Materialzusammensetzung mit der Struktur umfassen:
  • X-(Y)n-Z
  • worin X für eines oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder ein Analogon des relevanten Analyten, n für eine ganze Zahl und Z für die von der Erfindung bereitgestellte Verbindung steht.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird eine Verbindung mit der Struktur
  • in der R ein Anion und n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n 3.
  • Diese Verbindung kann eine Materialzusammensetzung mit der Struktur umfassen:
  • X-(Y)n-Z
  • worin X für eines oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder ein Analogon des relevanten Analyten, n für eine ganze Zahl und Z für die von der Erfindung bereitgestellte Verbindung steht.
  • Die Erfindung stellt weiterhin eine Verbindung mit der Struktur bereit:
  • in der R ein Anion und n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n 3.
  • Diese Verbindung kann eine Materialzusammensetzung mit der Struktur umfassen:
  • X-(Y)n-Z
  • worin X für eines oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder ein Analogon des relevanten Analyten, n für eine ganze Zahl und Z für die von der Erfindung bereitgestellte Verbindung steht.
  • Die Erfindung stellt außerdem bereit eine Verbindung mit der Struktur:
  • worin n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n 3.
  • Die Erfindung stellt außerdem eine Verbindung mit der Struktur bereit:
  • worin m und n jeweils ganze Zahlen sind und gleich oder verschieden sein können. In einer Ausführungsform der Erfindung sind m und n jeweils 3.
  • Weiterhin stellt die Erfindung bereit eine Verbindung mit der Struktur:
  • in der R ein Anion und n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n 2.
  • Diese Verbindung kann eine Materialzusammensetzung mit der Struktur umfassen:
  • X-(Y)n-Z
  • worin X für eines oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder ein Analogon des relevanten Analyten, n für eine ganze Zahl und Z für die von der Erfindung bereitgestellte Verbindung steht.
  • Weiterhin stellt die Erfindung bereit eine Verbindung mit der Struktur:
  • Weiterhin stellt die Erfindung bereit eine Verbindung mit der Struktur:
  • in der R ein Anion und n eine ganze Zahl ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist n 2.
  • Diese Verbindung kann eine Materialzusammensetzung mit der Struktur umfassen:
  • X-(Y)n-Z
  • worin X für eines oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder ein Analogon des relevanten Analyten, n für eine ganze Zahl und Z für die von der Erfindung bereitgestellte Verbindung steht.
  • Weiterhin stellt die Erfindung bereit eine Verbindung mit der Struktur:
  • in der R ein Anion ist und m und n ganze Zahlen sind. In einer Ausführungsform der Erfindung ist m 5 und n 3.
  • Diese Verbindung kann eine Materialzusammensetzung mit der Struktur umfassen:
  • X-(Y)n-Z
  • worin X für eines oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder ein Analogon des relevanten Analyten, n für eine ganze Zahl und Z für die von der Erfindung bereitgestellte Verbindung steht. In einer Ausführungsform der Erfindung ist X Theophyllin. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist X Digoxigenium. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist X ein von hCG abgeleitetes Peptid.
  • Ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellt wird eine Zusammensetzung folgender Struktur
  • X-CH=CH-CO-NH(CH&sub2;)n-NH-CO-(CH&sub2;)m-Z,
  • in der X ein oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können,
  • Z eine elektrochemolumineszente chemische Einheit,
  • n eine ganze Zahl, die größer als oder gleich 1 ist, und
  • m eine ganze Zahl, die größer als oder gleich 1 ist, bedeutet.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist X ein beim Kohlenstoff 5 an CH hängendes Thymidin, n 7 und m 3.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist Z Bis(2,2'- bipyridin)-[4-(butan-1-al)-4-methyl-1-2,2'-bipyridin]- ruthenium(II).
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Thymidinnucleotid ein 3' endständiges Nucleotid, das an der Nucleotidsequenz
  • TCACCAATAAACCGCAAACACCATCCCGTCCTGCCAG
  • angefügt ist.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird eine Zusammensetzung der Struktur
  • [T-Y-Z]²&spplus;(R)&sub2;
  • in der
  • T Theophyllin, Y eine Verkettungsgruppe, die T mit Z verbindet, Z Bis(2,2'-bipyridin)-[4-methyl-2,2'- bipypridin-4'-yl]ruthenium(II) und R ein Anion bedeutet.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist Y am Kohlenstoff in Stellung 8 von T angefügt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat Y die Struktur
  • (CH&sub2;)nCO-NH-(CH&sub2;)n,
  • wobei m und n jeweils eine ganze Zahl darstellen, die gleich oder verschieden und größer als oder gleich 1 sein kann. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind m und n jeweils 3.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat Y die Struktur
  • wobei m, n und r jeweils ganze Zahlen bedeuten, die jeweils gleich oder verschieden und größer als oder gleich 1 sein können. In einer Ausführungsform der Erfindung ist m 1, n 1 und r 4.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat Y die Struktur
  • wobei m, n und r jeweils ganze Zahlen bedeuten, die jeweils gleich oder verschieden und größer als oder gleich 1 sein können. In einer Ausführungsform der Erfindung ist m 1, n 1 und r 4.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist Y am Stickstoff in Stellung 7 von T angefügt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat Y die Struktur
  • (CH&sub2;)n
  • in der n eine ganze Zahl größer als oder gleich 1 ist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist n 4.
  • Die Erfindung stellt außerdem bereit eine Verbindung mit der Struktur
  • worin Y ein Verbindungsarm bzw. Linker-Arm ist. In einer Ausführungsform der Erfindung hat Y die Struktur
  • (CH&sub2;)m-NH-CO-(CH&sub2;)n
  • worin m und n ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein können, und größer als oder gleich 1 sind. In einer Ausführungsform der Erfindung ist m 3 und ist n 2.
  • Die Erfindung stellt außerdem bereit eine Verbindung mit der Struktur
  • worin m und n ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein können. In einer Ausführungsform der Erfindung sind m und n jeweils 1.
  • Weiterhin bereitgestellt wird eine Zusammensetzung mit der Struktur
  • X-Z,
  • in der
  • X eine oder mehrere Aminosäuren bedeutet, die gleich oder verschieden sein können und mindestens eine Aminosäure umfassen, bei der es sich um Cystein oder Methionin handelt, und
  • Z Bis(2,2'-bipyridin)maleinimidhexansäure,4-methyl-2,2- bipyridin-4'-butylamidruthenium(II) bedeutet, das durch den Kohlenstoff an der Stellung 3 oder 4 des Maleinimids an einen Schwefelsubstituenten des Cysteins oder Methionins von X gebunden ist.
  • Folgende Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, diese jedoch nicht einschränken, wobei die Erfindung in den auf die Beschreibung folgenden Ansprüchen definiert ist.
    • Beispiel 1 Elektrochemische Lumineszenz in verschiedenen organischen Lösungsmitteln
  • Die elektrochemische Lumineszenz von Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)-chloridhexahydrat wurde in einem 15 ml 3-Hals-Kolben mit runden Boden gemessen. Dieser enthielt 10 ml einer wie nachstehend zubereiteten Lösung, einen 1,5 mm · 10 mm magnetischen Rührstab, eine Quasibezugselektrode aus Silberdraht mit 1,0 mm Durchmesser, eine Gegenelektrode aus 28er Platindraht und eine Arbeitselektrode aus 22er Platindraht, die an ein 1 cm · 1 cm großes quadratisches Stück aus 0,1 mm dicker, hochpolierter Platinfolie geschweißt war. (Die Arbeitselektrode aus Platinfolie wurde zu einem Halbkreis mit einem Durchmesser von 4,76 mm (3/16 inch) geformt, der die Gegenelektrode aus 28-er Platindraht im gleichen Abstand von 2,38 mm (3,32 inch) umgab.)
  • Der Silberdraht wurde an das EG&G Modell 178 der Elektrometersonde des Potentiometers/Galvanometers, EG&G Modell 173, angeschlossen. Die Gegenelektrode aus Platindraht und die Arbeitselektrode aus Platin wurden an die Anode bzw. die Kathode des Potentiometers, EG&G Modell 173, angeschlossen. Dann wurde die Vorrichtung geerdet.
  • Die cyclische Spannung wurde mit dem Potentiometer, EG&G Modell 173, an dem die universelle Programmiervorrichtung, EG&G Modell 175, befestigt war gemessen. Die Programmiervorrichtung wurde auf Meßlinien von 100 mV/sec zwischen der Anodenspannung von +1,75 V und der Kathodenspannung von 1,80 V eingestellt. Die elektrochemische Lumineszenz wurde unter Verwendung eines R928 Sekundärelektronenvervielfacherrohrs (SEV) von Hamamatsu, das innerhalb eines mit einem Kodak #23A Gelatine- (Rot)filter ausgerüsteten SEV-Gehäuses von Products for Research, Modell PR1402RF, angebracht war, nachgewiesen. Das SEV-Gehäuse an war ein SEV-Nachweissystem von Oriel, Modell 7070, angeschlossen. Die cyclische Spannungsmessung wurde auf einem Aufzeichnungsgerät von Houston Instruments, Modell 200 X-Y, aufgezeichnet.
  • Es wurden cyclische Spannungsmessungen für Lösungen aus 1 mM Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)-chloridhexahydrat (Aldrich Chemical Company), 0,1 M Tetrabutylammoniumtetrafluorborat (TBABF&sub4;) (Aldrich Chemical Company) durchgeführt, die mit folgenden organischen Lösungsmitteln zubereitet worden waren: Acetonitril, n-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und 1-Methyl, 2-pyrrolidon (Aldrich Chemical Company). Auch tert-Butylalkohol und entionisiertes destilliertes Wasser (1 : 1, v/v) wurden verwendet, um eine Lösung herzustellen, die 1 mM Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)-chloridhexahydrat und 0,1 M TBABF&sub4; enthielt. Die dabei entstehenden voltametrischen Kurven zeigten keine Veränderung im Redoxpotential des Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)- chloridhexahydrats bei Wechsel des organischen Lösungsmittels an.
  • Für die visuelle Bestimmung der elektrochemischen Lumineszenz wurden Lösungen wie folgt hergestellt: Ausreichende Mengen an Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)- chloridhexahydrat und TBABF&sub4; wurden in den vorstehenden organischen Lösungsmitteln von Spektroskopiequalität (Aldrich Chemical Company) aufgelöst, um Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 0,1 M zu ergeben. 10 ml der entstehenden Lösungen wurden dann in den 15 ml 3-Hals- Rundbodenkolben gegeben. Die Elektroden wurden in die Lösung getaucht, und die Arbeitselektrode pulsierte zwischen +1,75 und -1,45 Volt Spannung, um elektrochemische Lumineszenz zu erzeugen. Die elektrochemische Lumineszenz wurde in jeder der vorstehend beschriebenen Lösungen beobachtet.
  • Für die quantitative Messung der Auswirkung des Lösungsmittelwechsels auf die elektrochemische Lumineszenz wurden Lösungen wie folgt hergestellt: Ausreichende Mengen von Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)- chloridhexahydrat und TBABF&sub4; wurden den vorstehend beschriebenen organischen Lösungsmitteln zugesetzt, um Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 0,2 M zu ergeben. Einem aliquoten Teil dieser Lösung wurde ein gleiches Volumen an entionisiertem destilliertem Wasser zugesetzt, das ein stark oxidierendes Ammoniumpersulfat in einer Konzentration von 36 mM enthielt. Kontrolllösungen, die das Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)- chloridhexahydrat nicht enthielten, wurden hergestellt. 10 ml der entstehenden Lösungen wurden dann in den 15 ml 3-Hals-Rundbodenkolben gegeben. Die elektrochemische Lumineszenz wurde dadurch erreicht, daß man Kathodenspannung in Ein-Sekunden-Intervallen zwischen 0 und -2,0 pulsieren ließ.
  • Die Messungen der elektrochemischen Lumineszenz wurden durch Integration des entstehenden elektrochemisch lumineszierenden SEV-Signals unter Verwendung einer Integriervorrichtung durchgeführt, die an ein digitales Universalmeßgerät von Micronta, Modell 22191, angeschlossen war. Das elektrochemisch lumineszierende Signal wurde während des Pulsierens 10 Sekunden integriert und in Millivolt aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt und zeigen an, daß ein Wechsel des Lösungsmittels die Quantenausbeute des Ruthenium(II)-chlorids beeinflußt. Tabelle 1
  • * alle Messungen in Millivolt
    • Beispiel 2 Sensibilität des Nachweises von elektrochemischer Lumineszenz von mit Ruthenium markiertem-anti-Maus- Immunoglobulin G (IgG) Antikörper vom Kaninchen
  • Die elektrochemische Lumineszenz von mit 4,4'-(Dichlormethyl)-2,2'-bipyridyl,bis(2,2'-bipyridyl)ruthenium II markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper (Ruthenium-markierter anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen) wurde in einem 15 ml 3-Hals-Kolben mit runden Boden gemessen. Dieser enthielt 10 ml einer wie nachstehend zubereiteten Lösung, einen 1,5 mm · 10 mm magnetischen Rührstab, eine Quasibezugselektrode aus Silberdraht mit 1,0 mm Durchmesser, eine Gegenelektrode aus 28er Platindraht und eine Arbeitselektrode aus 22er Platindraht, die an ein 1 cm · 1 cm großes quadratisches Stück aus 0,1 mm dicker, hochpolierter Platinfolie geschweißt war. (Die Arbeitselektrode aus Platinfolie wurde zu einem Halbkreis mit einem Durchmesser von 4,76 mm (3/16 inch) geformt, der die Gegenelektrode aus 28-er Platindraht im gleichen Abstand von 2,38 mm (3/32 inch) umgab.)
  • Der Silberdraht wurde an das EG&G Modell 178 der Elektrometersonde des Potentiometers/Galvanometers, EG&G Modell 173, angeschlossen. Die Gegenelektrode aus Platindraht und die Arbeitselektrode aus Platin wurden an die Anode bzw. die Kathode des Potentiometers EG&G, Modell 173, angeschlossen. Dann wurde die Vorrichtung geerdet.
  • Die von der Ruthenium markierten, anti-Maus-IgG-Antikörperlösung vom Kaninchen ausgehende elektrochemische Lumineszenz wurde unter Verwendung eines R928 Sekundärelektronenvervielfacherrohrs (SEV) von Hamamatsu, das innerhalb eines mit einem Kodak #23A Gelatine(Rot)- filter ausgerüsteten SEV-Gehäuses von Products for Research, Modell PR1402RF, angebracht war, nachgewiesen. Das SEV-Gehäuse war ein SEV-Nachweissystem von Oriel, Modell 7070, angeschlossen.
  • Die elektrochemische Lumineszenz wurde dadurch induziert, daß man Kathodenpotential in Ein-Sekunden- Intervallen zwischen 0 und -2,0 pulsieren ließ. Die Messungen der elektrochemischen Lumineszenz wurden durch Integration des entstehenden elektrochemisch lumineszierenden SEV-Signals unter Verwendung einer Integriervorrichtung durchgeführt, die an ein digitales Universalmeßgerät von Micronta, Modell 22191, angeschlossen war. Das elektrochemisch lumineszierende Signal wurde während des Pulsierens 10 Sekunden integriert und in Millivolt aufgezeichnet.
  • Eine Grundlösung von 1,25 · 10&supmin;&sup7; M Ruthenium-markiertem anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen wurde aus einer konzentrierten Lösung (2 mg/ml, 7,5 Ru/Antikörper) des markierten Antikörpers durch Verdünnung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zubereitet. Ein aliquoter Teil dieser Lösung (80 Mikroliter) wurde 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO)/entionisiertem destilliertem Wasser (1 : 1), das 0,1 M Tetrabutylammoniumtetrafluorborat (TBABF&sub4;) und 18 mM Ammoniumpersulfat enthielt, im Reaktionsgefäß zugegeben. Die endgültige Ruthenium-markierte Antikörperkonzentration betrug 1 · 10&supmin;&sup9; M. Die elektrochemische Lumineszenz wurde wie vorstehend beschrieben gemessen.
  • Weitere Lösungen, die verschiedene Verdünnungen der Ruthenium-markierten anti-Maus-IgG-Antikörpergrundlösung vom Kaninchen darstellen, wurden hergestellt und aliquote Teile (80 Mikroliter) dieser Lösungen der gleichen Lösung aus Ruthenium-markiertem Antikörper im Reaktionsgefäß nach und nach zugesetzt, so daß sich die folgenden Konzentrationen von markiertem Antikörper ergaben: 5 · 10&supmin;&sup9; M, 1 · 10&supmin;&sup8; M und 5 · 10&supmin;&sup8; M. Die elektrochemische Lumineszenz für jede Lösung wurde wie beschrieben gemessen. Diese Messungen sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigen die Sensibilität des elektrochemisch lumineszierenden Nachweises markierter Antikörper (1 · 10&supmin;&sup9; M), und die Abhängigkeit der Intensität der elektrochemischen Lumineszenz von der Konzentration des Ruthenium markierten anti-Maus-IgG-Antikörpers.
    • Tabelle 2 Elektrochemische Lumineszenz (ECL) von Ruthenium-markiertem anti-Maus-Immunglobulin G (IgG) Antikörper vom Kaninchen
  • Konzentration von Ruthenium-markiertem anti-Maus-IgG-Antikörper ECL (mv)
  • 5 · 10&supmin;&sup8; M 1610
  • 1 · 10&supmin;&sup8; M 892
  • 5 · 10&supmin;&sup9; M 418
  • 1 · 10&supmin;&sup9; M 72
  • 0 0
    • Beispiel 3 Immunoloqische Reaktivität von Ruthenium-markiertem Rinderserumalbumin (BSA) in einem Festphasen ELISA
  • Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol wurden mit einer sättigenden Konzentration entweder von Rinderserumalbumin, das mit 4,4'-(Dichlormethyl)-2,2'- bipyridyl,bis(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) markiert war, d. h. Ruthenium-markiertem Rinderserumalbumin (6 Ru /BSA, 20 Mikrogramm/ml in PBS-Puffer, 50 Mikroliter/Vertiefung), oder unmarkiertem BSA (20 Mikrogramm/ml in PBS-Puffer, 50 Mikroliter/Vertiefung) beschichtet und bei Raumtemperatur eine Stunde bebrütet. Nach dieser Inkubationszeit wurde die Platte dreimal je 5 Minuten mit PBS gewaschen. Eine Lösung, die 6 mg/ml anti-BSA- Antikörper vom Kaninchen enthielt, wurde 1 : 20.000, 1 : 30.000, 1 : 40.000, 1 : 50.000 und 1 : 60.000 in PBS verdünnt. Dann wurden die verdünnten Lösungen jeweils doppelt in die mit Ruthenium-markiertem BSA oder unmarkiertem BSA beschichteten Vertiefungen gegeben und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur bebrütet. Nach drei Wäschen mit PBS wie zuvor wurde das Vorhandensein gebundener anti-BSA-Antikörper vom Kaninchen dadurch festgestellt, daß man anti-Kaninchen-IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege (1 : 1.000 Verdünnung in PBS einer 0,5 mg/ml Lösung, 50 Mikroliter/Vertiefung) in jede Vertiefung gab und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur bebrütete. Nachdem die Platte zweimal mit PBS, 0,5% Tween-20, und zweimal wie zuvor mit PBS gewaschen worden war, wurde Wasserstoffperoxid (30%) und 2,2'-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinsulfonat] (KPL, Gaithersburg, MD) im gleichen Volumen vermischt und 200 Mikroliter in jede Vertiefung der Platte gegeben. Nach 30 Minuten Bebrüten bei Raumtemperatur wurde die Platte spektrophotometrisch bei 414 nm abgelesen. Die mittlere Hintergrundabsorptionsfähigkeit in den Kontrollvertiefungen wurde vom Mittelwert der doppelten Ablesungen für jede Verdünnung des anti-BSA-Antikörpers vom Kaninchen abgelesen, der in die mit Ruthenium markierter BSA oder unmarkierter BSA beschichteten Vertiefungen gegeben worden war. Diese korrigierten Absorptionsfähigkeitswerte sind in Tabelle 3 aufgeführt.
  • Die Kurven, die man für das unmarkierte BSA und das Ruthenium-markierte BSA erhielt, waren parallel, wobei die korrigierten Absorbanzwerte an jedem Punkt in einem konstanten Verhältnis von ungefähr 0,6 blieben. Identische Ergebnisse erhielt man für die beiden anderen Partien Ruthenium markierter BSA, die unter Verwendung des gleichen aktivierten Rutheniumkomplexes wie vorstehend beschrieben hergestellt worden waren und ähnliche Ru/BSA-Markierungsverhältnisse aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß das Ruthenium-markierte BSA immunologisch reaktiv ist und im Vergleich zu unmarkiertem BSA ungefähr 60% seiner Immunreaktivität behält, wenn es mit Ruthenium markiert ist. Tabelle 3 Absorbanz bei 414 nm
    • Beispiel 4 Immunologische Reaktivität von Ruthenium-markiertem anti-Maus-Immunoglobulin (IgG) Antikörper vom Kaninchen durch einen kompetitiven Festphasen ELISA
  • Anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen, die mit 4,4'- (Dichlormethyl)-2,2'-bipyridyl,bis(2,2'-bipyridyl)- ruthenium(II) markiert waren (Ruthenium markierter Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper), wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, mit Enzym-markiertem, anti-Maus-IgG- Antikörpern im Wettbewerb um Bindungsstellen an Maus IgG zu treten, mit unmarkiertem anti-Maus-IgG vom Kaninchen verglichen. Die 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol wurden mit einer Lösung aus Maus-IgG (5 Mikrogramm/ml in PBS-Puffer) beschichtet, 60 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet und dann dreimal je fünf Minuten mit PBS gewaschen. Es wurden zwei Lösungen hergestellt. Eine enthielt eine Mischung aus anti-Maus-IgG-alkalischem-Phosphatasekonjugat vom Kaninchen und anti-Maus-IgG vom Kaninchen (1 mg/l), die andere eine Mischung aus anti-Maus-IgG-alkalischem- Phosphatasekonjugat vom Kaninchen und Ruthenium-markiertem anti-Maus IgG vom Kaninchen (1 mg/ml, 7,5 Ru/Antikörper). Diese beiden Lösungen und eine dritte, die anti-Maus-IgG-alkalisches Phosphatasekonjugat vom Kaninchen enthielt, wurden in PBS, das 0,5% Tween-20 enthielt, 1 : 6.000, 1 : 7.000, 1 : 8.000, 1 : 9.000, 1 : 10.000, 1 : 12.000, 1 : 14.000, und 1 : 1.000 verdünnt und dann (50 Mikroliter/Vertiefung) in getrennte Reihen der Platte gegeben, die mausgebundenes IgG enthielten. Die Platte wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet und zweimal mit PBS-Tween-20 sowie zweimal je fünf Minuten mit PBS gewaschen. Das Enzymsubstrat p-Nitrophenylphosphat (1,5 mg/ml in 10% Diethanolaminpuffer, pH 9,6) wurde jeder Vertiefung zugesetzt (200 Mikroliter/Vertiefung), die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet und spektrophotometrisch bei 405 nm abgelesen. Die mittlere Hintergrundabsorbanz in den Kontrollvertiefungen wurden vom mittleren Wert der Zweitablesungen für jede der drei Lösungen in jedem Verdünnungsgrad abgezogen. Diese Absorbanzwerte sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Man erhielt drei parallele Kurven, von denen die oberste die ungehemmte Bindung des Enzymkonjugats und die beiden unteren Kurven die Hemmung durch Rutheniummarkiertes anti-Maus IgG und unmarkiertes anti-Maus-IgG darstellen. Die Ruthenium-markierte anti-Maus-IgG-Kurve ist bei einem Punkt-für-Punkt Vergleich ungefähr 81% so niedrig wie die unmarkierte anti-Maus-IgG-Kurve im Vergleich zu der Enzymkonjugatkurve. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß der Ruthenium-markierte, anti- Maus-IgG-Antikörper aus ein Antigen (Maus-IgG) immunologisch reaktiv und beim Wettbewerb mit Enzymmarkierten anti-Maus IgG-Antikörper um Bindungen an Maus-IgG ungefähr 81% so reaktiv ist wie unmarkierter anti- Maus-IgG-Antikörper. Tabelle 4 Absorbanz bei 405 nm
  • 1) anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase (Enzymkonjugat)
  • 2) Enzymkonjugat plus Ruthenium-markiertes anti-Maus-IgG
  • 3) Enzymkonjugat plus unmarkiertes anti-Maus-IgG
  • * (A - B/A - C) · 100%
    • Beispiel 5 Elektrochemische Lumineszenz von Ruthenium-markiertem Rinderserumalbumin (BSA)
  • Eine Lösung, die 7,8 · 10&supmin;&sup6; M mit 4,4-(Dichlormethyl)- 2,2'-bipyridyl,bis(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) markiertes Rinderserumalbumin (BSA) enthielt (Rutheniummarkiertes Rinderserumalbumin), wurde aus einer Grundlösung aus Ruthenium-markiertem BSA (2,6 mg/ml, 6 Ru/BSA) durch Verdünnung in phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt. 26 Mikroliter dieser Lösung wurden im Reaktionsgefäß zu 10 ml DMSO/entionisiertem destilliertem Wasser (1 : 1), das 0,1 M TBABF&sub4; und 18 mM Ammoniumpersulfat enthielt, gegeben. Die endgültige Ruthenium-markierte BSA-Konzentration war 2 · 10&supmin;&sup8; M. Die elektrochemische Lumineszenz wurde wie in Beispiel V beschrieben gemessen.
  • Analog wurde eine Lösung, die 7,8 · 10&supmin;&sup6; M unmarkiertes BSA enthielt, hergestellt und dem Reaktionsgefäß zugesetzt, um eine endgültige unmarkierte BSA-Konzentration von 2 · 10&supmin;&sup8; M zu ergeben. Die elektrochemische Lumineszenz dieser Lösung und einer ähnlichen Lösung ohne BSA wurde gemessen. Die Messungsergebnisse der elektrochemischen Lumineszenz sind in Tabelle 5 für kovalent gekoppeltes, Ruthenium-markiertes und unmarkiertes BSA angegeben.
    • Tabelle 5 Elektrochemische Lumineszenz (ECL) von Ruthenium-markiertem BSA
  • Lösung ECL (mv)
  • 2 · 10&supmin;&sup8; M Ruthenium-markiertes BSA 730
  • 2 · 10&supmin;&sup8; M BSA 100
  • DMSO: H&sub2;O (1 : 1) 0
    • Beispiel 6 Elektrochemische Lumineszenz von Ruthenium-markiertem anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen
  • Eine Lösung, die 1,25 · 10&supmin;&sup6; M mit 4,4-(Dichlormethyl)- 2,2'-bipyridyl,bis(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) markierten anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen enthielt (Ruthenium markierter anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen), wurde aus einer Stammlösung aus Rutheniummarkiertem anti-Maus-IgG-Antikörper (vom Kaninchen 2 mg/ml, 7,5 Ru/Antikörper) durch Verdünnung in phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt. 80 Mikroliter dieser Lösung wurden im Reaktionsgefäß zu 10 ml DMSO/entionisiertem destilliertem Wasser (1 : 1), das 0,1 M TBABF&sub4; und 18 mM Ammoniumpersulfat enthielt, gegeben. Die endgültige Ruthenium-markierte Antikörper-Konzentration war 1 · 10&supmin;&sup8; M. Die elektrochemische Lumineszenz wurde wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen.
  • Analog wurde eine Lösung, die 1,25 · 10&supmin;&sup6; M unmarkierten anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen enthielt, hergestellt und dem Reaktionsgefäß zugesetzt, um eine endgültige unmarkierte Antikörper-Konzentration von 1 · 10&supmin;&sup8; M zu ergeben. Die elektrochemische Lumineszenz dieser Lösung und einer ähnlichen Lösung ohne zugesetzten Antikörper wurde gemessen. Die Messungsergebnisse der elektrochemischen Lumineszenz sind in Tabelle VIII für kovalent gekoppelte, Ruthenium-markierte und unmarkierte anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen angegeben.
    • Tabelle 6 Elektrochemische Lumineszenz (ECL) von Ruthenium-markiertem anti-Maus-IgG-Antikörpern vom Kaninchen
  • Lösung ECL (mv)
  • 1 · 10&supmin;&sup8; M Ruthenium-markierte anti- Maus-IgG Antikörper vom Kaninchen 892
  • 1 · 10&supmin;&sup8; M anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen 100
  • DMSO: H&sub2;O (1 : 1) 0
    • Beispiel 7 Homogener Immuntest der elektrochemischen Lumineszenz für Antikörper auf Rinderserumalbumin
  • Eine Lösung, die 7,8 · 10&supmin;&sup6; M mit 4,4-(Dichlormethyl)- 2,2'-bipyridyl,bis(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) markiertes Rinderserumalbumin (BSA) enthielt (Rutheniummarkiertes Rinderserumalbumin), wurde aus einer Stammlösung aus Ruthenium-markiertem BSA (2,5 mg/ml, 6 Ru/BSA) durch Verdünnung in phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt. 26 Mikroliter dieser Lösung wurden im Reaktionsgefäß zu 10 ml DMSO/entionisiertem destilliertem Wasser (1 : 1), das 0,1 M TBABF&sub4; und 18 mM Ammoniumpersulfat enthielt, gegeben. Die endgültige Ruthenium-markierte BSA-Konzentration war 2 · 10&supmin;&sup8; M. Die elektrochemische Lumineszenz wurde wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen.
  • Analog wurde eine Lösung, die 7,8 · 10&supmin;&sup6; M unmarkiertes BSA enthielt, hergestellt und dem Reaktionsgefäß zugesetzt, um eine endgültige unmarkierte BSA-Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup8; M zu ergeben. Die elektrochemische Lumineszenz dieser Lösung und einer ähnlichen Lösung ohne BSA wurde gemessen.
  • Eine Lösung, die 3,75 · 10&supmin;&sup5; M anti-BSA-Antikörper vom Kaninchen enthielt, wurde aus einer Grundlösung aus anti-BSA-Antikörper vom Kaninchen (6,0 mg/ml) durch Verdünnung in PBS hergestellt und ein aliquoter Teil (26 ul) der Lösung aus Ruthenium-markiertem BSA im Reaktionsgefäß zugesetzt, um eine endgültige Konzentration von anti-BSA-Antikörper vom Kaninchen von 1 · 10&supmin;&sup7; M zu ergeben.
  • Die elektrochemische Lumineszenz der dabei entstehenden Mischung aus Ruthenium-markiertem BSA-Antigen und Antikörper (Kaninchen anti-BSA) wurde gemessen. Die in Tabelle 7 aufgeführten Ergebnisse zeigen einen Rückgang in der elektrochemischen Lumineszenz des Rutheniummarkierten BSA bei Zugabe von anti-BSA-Antikörper vom Kaninchen und beweisen, daß ein homogener Nachweis von Antikörpern auf BSA durch elektrochemischen Lumineszenz geführt werden kann. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse weiß ein Fachmann, daß ein homogener Immuntest mittels elektrochemischer Lumineszenz zum Nachweis anderer relevanter. Analyten entwickelt werden kann. Tabelle 7 Verringerung der elektrochemischen Lumineszenz (ECL) von Ruthenium-markiertem Rinderserumalbumin beim Binden von Antikörper
    • Beispiel 8 Homogener Immuntest auf Mausimmunglobulin G (IgG) mittels elektrochemischer Lumineszenz
  • Eine Lösung, die 6,25 · 10&supmin;&sup6; M mit 4,4-(Dichlormethyl)- 2,2'-bipyridyl,bis(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) markierten anti-Maus Antikörper vom Kaninchen enthielt (Ruthenium markierter anti-Maus-IgG Antikörper vom Kaninchen), wurde aus einer Grundlösung aus Rutheniummarkiertem anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen (2 mg/ml, 7,5 Ru/BSA) durch Verdünnung in phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt. 80 Mikroliter dieser Lösung wurden im Reaktionsgefäß zu 10 ml DMSO/entionisiertem destilliertem Wasser (1 : 1), das 0,1 M TBABF&sub4; und 18 mM Ammoniumpersulfat enthielt, gegeben. Die endgültige Ruthenium-markierte Antikörper-Konzentration war 5 · 10&supmin;&sup8; M. Die elektrochemische Lumineszenz wurde wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen.
  • Analog wurde eine Lösung, die 6,25 · 10&supmin;&sup6; M unmarkierten anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen enthielt, hergestellt und dem Reaktionsgefäß zugesetzt, um eine endgültige unmarkierte Antikörper-Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup8; M zu ergeben. Die elektrochemische Lumineszenz dieser Lösung und einer ähnlichen Lösung ohne Antikörper wurde gemessen.
  • Eine Lösung, die 2,5 · 10&supmin;&sup5; M Maus-IgG enthielt, wurde aus einer Grundlösung von Maus-IgG (4,0 mg/ml) durch Verdünnung in PBS hergestellt. Unterschiedliche aliquote Teile (20 und 40 Mikroliter) dieser Lösung wurden der Lösung aus Ruthenium-markiertem, anti-Maus-IgG- Antikörper im Reaktionsgefäß zugesetzt, um endgültige Maus-IgG-Konzentrationen von 5 · 10&supmin;&sup8; M bzw. 1 · 10&supmin;&sup7; M zu ergeben.
  • Die elektrochemische Lumineszenz der entstehenden Mischung aus Ruthenium-markiertem anti-Maus-IgG- Antikörper und dem Antigen (Maus-IgG) wurde gemessen. Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse. Die Abhängigkeit der Messungen der elektrochemischen Lumineszenz von der Konzentration des Maus-IgG-Antigens ist in Fig. 1 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen einen Rückgang in der elektrochemischen Lumineszenz des Ruthenium markierten Antikörpers bei Zusatz von Antigen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wäre Fachleuten bewußt, daß ein homogener Immuntest mittels elektrochemischer Lumineszenz entwickelt werden kann, mit dem die Konzentration anderer relevanter Analyten entwickelt werden kann. Tabelle 8 Verringerung der elektrochemischen Lumineszenz (ECL) von Ruthenium-markiertem Antikörper beim Binden von Antigen
    • Beispiel 9 Heterogener Immuntest mittels elektrochemischer Lumineszenz auf Legionella unter Verwendung eines anti- Legionella-Immunglobulin G (IgG) Antikörpers von der Maus und Ruthenium-markiertem anti-Maus-Immunglobulin (IgG)-Antikörper vom Kaninchen
  • Eine mit Formaldehyd behandelte Suspension des Bakteriums Legionella micdadei wurde durch Verdünnung mit PBS-Puffer auf eine optische Dichte (bei 425 nm) von 1,00 eingestellt. Ungefähr 3 · 10&sup9; Zellen wurden in ein konisches Mikrozentrifugenrohr gegeben. Die Zellen wurden zentrifugiert (10 Minuten, 10.000 upm), der Überstand dekantiert, und die Zellen erneut in einer 1 50 Verdünnung eines monoklonalen, für Legionella micdadei spezifischen Maus-IgG-Antikörpers (1,45 mg/ml) in PBS (1 ml) suspendiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen zentrifugiert, der Überstand dekantiert, die Zellen erneut in PBS-Puffer suspendiert und wieder zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstands wurden die Zellen in einer mit 4,4'-(Dichlormethyl)-2,2'-bipyridyl,bis(2,2'-bipyridylruthenium(II) markierten 1 : 50 Verdünnung (in PBS) von anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen, d. h. Rutheniummarkiertem anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen (2 mg/ml, 7,5 Ru/Antikörper), erneut suspendiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen zentrifugiert, der Überstand dekantiert, und die Zellen wie zuvor erneut in PBS suspendiert und zweimal mit Zentrifugieren gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurden die Zellen in 200 Mikroliter PBS wieder suspendiert. 100 Mikroliter des Zellsuspension wurden in das Reaktionsgefäß gegeben, das 10 ml DMSO/entionisiertes destilliertes Wasser (1 : 1) enthielt, in dem 0,1 M TBABF&sub4; und 18 mM Ammoniumpersulfat enthalten waren. Die elektrochemische Lumineszenz der Zellsuspension wurde gemessen. Weitere 100 Mikroliter der Zellsuspension wurden dem Reaktionsgefäß zugesetzt und die elektrochemische Lumineszenz gemessen. Als Kontrolle wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren auch die elektrochemische Lumineszenz der Lösung ohne Zellen gemessen. Die in Tabelle 9 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß ein heterogener Immuntest mittels elektrochemischer Lumineszenz auf Legionella unter Verwendung Ruthenium markierter anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen erfolgreich durchgeführt wurde.
    • Tabelle 9 Heterogener Immuntest mittels elektrochemischer Lumineszenz auf Legionella micdadei
  • Probe ECL (mV)
  • Legionella micdadei Zellsuspension, 1,9 · 10&sup9; Zellen in DMSO/H&sub2;O (1 : 1) 160
  • Legionella micdadei Zellsuspension, 9,3 · 10&sup8; Zellen in DMSO/H&sub2;O (1 : 1) 90
  • DMSO : H&sub2;O (1 : 1) 0
    • Beispiel 10 Homogener Immuntest mittels elektrochemischer Lumineszenz auf Legionella unter Verwendung eines anti- Legionella-Immunglobulin G (IgG) Antikörpers von der Maus und Ruthenium-markiertem anti-Maus-Immunglobulin (IgG)-Antikörper vom Kaninchen
  • Eine Suspension des Bakteriums Legionella micdadei wurde wie in Beispiel 9 beschrieben hergestellt und mit für Legionella micdadei spezifischen IgG-Antikörpern von der Maus bebrütet. Die Zellen wurden zentrifugiert, gewaschen und erneut in 0,2 ml PBS-Puffer suspendiert. Ein aliquoter Teil (80 ml) von mit 4,4'-(Dichlormethyl)-2,2'-bipyridyl,bis(2,2'-bipyridylruthenium(II) markiertem anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen, d. h. Ruthenium markierter anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen wurde des Zellsuspension zugesetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur bebrütet. Als Kontrolle wurde eine identische Verdünnung von Rutheniummarkiertem, anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen in Abwesenheit der Zellsuspension auf die gleiche Weise bebrütet. Nach der Inkubationszeit wurde die Lösung aus markiertem Antikörper in das Reaktionsgefäß gegeben, das 10 ml DMSO/entionisiertes destilliertes Wasser (1 : 1) enthielt, in dem 0,1 M TBABF&sub4; und 18 mM Ammoniumpersulfat enthalten waren. Es ergab sich eine endgültige Konzentration an Ruthenium-markiertem, anti-Maus- IgG-Antikörper vom Kaninchen von 1 · 10&supmin;&sup8; M. Die elektrochemische Lumineszenz wurde wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen. Die in Tabelle 10 aufgeführten Ergebnisse zeigen eine Verringerung in der Aussendung elektrochemischer Lumineszenz bei Interaktion des Ruthenium markierten anti-Maus-IgG-Antikörpers mit an Legionella gebundenem monoklonalen Maus-Antikörper. Außerdem belegen sie, daß ein homogener Immuntest mittels elektrochemischer Lumineszenz auf Legionella micdadei erfolgreich durchgeführt wurde.
    • Tabelle 10 Homogener Immuntest mittels elektrochemischer Lumineszenz auf Legionella micdadei
  • Probe ECL (mv)
  • Mit 1 · 10&supmin;&sup8; Ruthenium markierter anti-Maus IgG Antikörper 976
  • Mit 1 · 10&supmin;&sup8; Ruthenium markierter anti-Maus IgG Antikörper plus an Legionella micdadei gebundener monoklonaler Antikörper 803
  • DMSO : H&sub2;O (1 : 1) 0
    • Beispiel 11 Erhöhung der elektrochemischen Lumineszenz bei Freisetzung eines an Bakterien gebundenen, Rutheniummarkierten Antikörpers
  • Eine mit Formaldehyd behandelte Suspension des Bakteriums Legionella micdadei wurde durch Verdünnung mit PBS-Puffer auf eine optische Dichte (bei 425 nm) von 1,00 eingestellt. 2 ml dieser Zellen wurden in ein konisches Mikrozentrifugenrohr gegeben. Die Zellen wurden zentrifugiert (10 Minuten, 10.000 upm), der Überstand dekantiert, und die Zellen erneut in einer 1 : 10 Verdünnung eines monoklonalen, für Legionella micdadei spezifischen Maus-IgG-Antikörpers (1,45 mg/ml) in PBS (1 ml) suspendiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen wie zuvor zentrifugiert, der Überstand dekantiert, die Zellen erneut in PBS-Puffer suspendiert und wieder zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstands wurden die Zellen in einer Ruthenium markierten 1 : 50 Verdünnung (in PBS) von anti-Maus-IgG-Antikörper vom Kaninchen (1 ml, 7,5 Ru/Antikörper), erneut suspendiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen wie zuvor zentrifugiert, der Überstand dekantiert, und die Zellen wie zuvor erneut in PBS suspendiert und zweimal mit Zentrifugieren gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurden die Zellen entweder in 100 Mikroliter PBS oder 1,0 M Essigsäure - 0,9% NaCl-Lösung (normale Salzlösung) wieder suspendiert und 40 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet. Nach dem Zentrifugieren wurden 100 Mikroliter der überstehenden Zellflüssigkeit zusammen mit 10 ml DMSO/entionisiertem destilliertem Wasser (1 : 1), in dem 0,1 M TBABF&sub4; und 18 mM Ammoniumpersulfat enthalten waren, in das Reaktionsgefäß gegeben. Die elektrochemische Lumineszenz der überstehenden Zellflüssigkeit aus Essigsäure/normaler Salzlösung und der überstehenden Flüssigkeit aus den mit PBS gewaschenen Zellen wurde gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse der Messung der elektrochemischen Lumineszenz in Tabelle 11 zeigen, daß die Elution des Ruthenium markierten, anti-Maus-IgG vom Kaninchen aus der mit monoklonalen Antikörpern beschichteten Legionella-Bakterien durch Behandlung der Zellen mit 1,0 M Essigsäure - normaler Salzlösung (Bezugszahl 23) zu einer Erhöhung in der durch den ungebundenen, mit Ruthenium markierten Antikörper erzeugten elektrochemischen Lumineszenz führt. Diese Ergebnisse zeigen auch, daß der Ruthenium-markierte Antikörper an das mit einem monoklonalen Antikörper beschichtete Legionella-Bakterium gebunden ist und daß die Wäsche mit PBS im Vergleich zum Hintergrundsignal nicht zu einer ECL-Erhöhung führte.
    • Tabelle 11 Elektrochemische Lumineszenz (ECL) überstehender Flüssigkeiten von Zellen, die mit Ruthenium markierten anti-Maus-Immunglobulin (IgG) beschichtet sind
  • Lösung ECL (mV)
  • Hintergrundkontrolle: 100 Mikroliter 1,0 M Essigsäure - normale Salzlösung 134
  • 100 Mikroliter des überstehenden Flüssigkeit von der Zellwäsche mit PBS 121
  • 100 Mikroliter der überstehenden Flüssigkeit von der Zellwäsche mit 1,0 M Essigsäure - normaler Salzlösung 214
    • Beispiel 12 Homogener kompetitiver Immuntest auf Pregnan-diol-3- glucuronid (PD3G) in Urin
  • Pregnan-diol-3-glucuronid (PD3G) kann in Urin nachgewiesen und quantifiziert werden, indem man eine Urinprobe mit einer bekannten Menge von mit einer elektrochemisch lumineszierende Komponente markiertem PD3G und einer bekannten Menge eines anti-PD3G-Antikörpers unter solchen Bedingungen in Kontakt bringt, daß das in der Probe vorhandene PD3G und die elektrochemisch lumineszierende PD3G-Komponente um Bindungsstellen auf dem Antikörper in Wettbewerb treten. Nach einer geeigneten Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung und das in der daraus bestimmten Probe vorhandene Menge an PD3G können quantifiziert werden.
    • Beispiel 13 Markierung von Nukleinsäuren mit einem Trisrutheniumbipyridyl-n-hydroxysuccinimidester
  • Nukleinsäureproben (5 bis 25 Mikrogramm) in 10 mM Trishydrochlorid (pH 8,0) - 1 mM EDTA können hitzedenaturiert, abgekühlt und durch eine durch Bisulfit katalysierte Transaminierung von Cytosinrückständen mit Ethylendiamin über 3 Stunden bei 42ºC modifiziert werden. Nach einer über Nacht durchgeführten Dialyse gegen dreimal ausgewechselten 5 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,5, können die Proben durch Ultrafiltration auf 100 Mikroliter konzentriert werden. Diese modifizierten Nukleinsäuren (1 bis 10 Mikrogramm) können in 100 Mikroliter mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,5 verdünnt werden.
  • Ein Trisrutheniumbipyridyl-N-hydroxysuccinimidesterderivat kann durch in der Technik bekannte Verfahren als 0,2 M Grundlösung in N,N'-Dimethylformamid hergestellt werden. 5 Mikroliter dieser Esterlösung können der modifizierten Nukleinsäurelösung in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,5, zugesetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur bebrütet werden. Markierte Nukleinsäureproben können durch Dialyse gegen mindestens dreimal ausgewechseltes 150 mM Natriumchlorid - 1 mM Natriumphosphatpuffer (ph 7,0) gereinigt und bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert werden.
    • Beispiel 14 Nukleinsäurehybridisierungstest auf HTLV-III in Blut
  • HTLV-III kann in ganzem Blut nachgewiesen werden, wenn man dieses so behandelt, daß die RNS aus Virenteilchen freigesetzt wird. Eine Probe, die RNS mit dem HTLV-III enthält, wird mit einem einsträngigen Oligonucleotid, das die HTLV-RNS ergänzt, in Kontakt gebracht und mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiert. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung und die in der daraus bestimmten Probe vorhandene Menge an HTLV-III RNS können quantifiziert werden.
    • Beispiel 15 Homogener Nukleinsäurehybridisierungstest auf Legionella-Bakterien in einer klinischen Probe
  • Legionella-Bakterien können in einer klinischen Probe wie Sputum nachgewiesen werden, wenn man dieses behandelt, um die ribosomale RNS aus den Bakterien freizusetzen. Die entstehende Probe wird mit einem einsträngigen Oligonucleotid, das für Legionella spezifische Sequenzen in der ribosomalen RNS ergänzt, in Kontakt gebracht und mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiert. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann quantifiziert und die in der Probe vorhandenen Legionella-Bakterien können daraus bestimmt werden.
    • Beispiel 16 Hybridisierungstest zum Nachweis von in genome DNS integrierter Cytomegalovirus-DNS durch das Strangverdrängungsverfahren
  • Cytomegalovirus (CMV)-DNS kann in menschlicher genomer DNS nachgewiesen werden, wenn man eine Gewebeprobe, z. B. Lymphozyten, behandelt, um die DNS freizusetzen, und diese mit Restriktionsenzymen spaltet. Die entstehende Probe, die doppelsträngige Fragmente von CMV enthält, wird mit einem einsträngigen Oligonucleotid, das die DMV-DNS ergänzt, in Kontakt gebracht und mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiert. Das einsträngige Oligonucleotid kann einen der Stränge des DNS-Doppelstrangs verdrängen. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann quantifiziert, und die in der Probe vorhandene CMV-RNS daraus bestimmt werden.
    • Beispiel 17 Hybridisierungstest zum Nachweis des ras-Onkogens in Krebszellen der menschlichen Blase unter Verwendung eines heterogenen Verfahrens
  • Das ras-Onkogen kann in Krebszellen der menschlichen Blase nachgewiesen werden, in dem man eine Gewebeprobe behandelt, um die DNS freizusetzen, diese mit Restriktionsenzymen spaltet, die DNS zu Einzelsträngen verschmilzt und an Nitrocellulosepapier bindet, wie bereits in Maniatis, T. et al., (24) beschrieben. Das Filterpapier mit gebundener einsträngiger DNS wird mit einem für das ras-Onkogen spezifischen Oligonucleotid in Kontakt gebracht und mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiert. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann nachgewiesen und das Vorhandensein der ras- Onkogen-DNS bestimmt werden.
    • Beispiel 18 Enzymtest auf der Grundlage eines elektrochemisch lumineszierenden Polymeren
  • Ein makromolekulares Enzymsubstrat, z. B. Stärke, Dextran oder ein synthetisch hergestelltes makromolekulares Polymer, kann mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiert werden. Das markierte Substrat kann dazu verwendet werden, das Vorhandensein eines Enzyms in einem Multikomponentensystem nachzuweisen und zu quantifizieren. Das markierte Substrat kann auch dazu verwendet werden, eine mit einem Antikörper, einer DNS-Probe, RNS-Probe, Streptavidin, Avidin oder Biotin verbundene Enzymmenge zu quantifizieren. Das markierte Substrat kann durch ein geeignetes Enzym selektiv in kleinere Fragmente aufgespalten werden. Jede beliebige Enzymsubstratkombination kann verwendet werden. Beispiele für Enzyme sind unter anderem Glycosidasen, Glucosidasen, Amylasen, Proteasen, Endonucleasen, Lyasen und Dextranasen. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann quantifiziert und die in der Probe vorhandene Enzymmenge daraus bestimmt werden. Der Vorteil liegt darin, daß durch die jeweils mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markierten aufgespaltenen Fragmente eine Verstärkung des elektrochemisch lumineszierenden Signals hervorgerufen wird.
    • Beispiel 19 Nachweis von Streptokokken durch einen Enzymtest mittels elektrochemischer Lumineszenz
  • Eine Streptokokken enthaltende Probe kann mit einer Reagenzmischung in Kontakt gebracht werden, die ein mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiertes synthetisches Peptid enthält. Das synthetische Peptid ist ein für eine von den Bakterien erzeugten Peptidase spezifisches Substrat. Die Wirkung der Peptidase auf das synthetische Peptid führt zur Erzeugung von Fragmenten, die mit der elektrochemisch lumineszierende Komponente markiert sind. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann quantifiziert und die in der Probe enthaltene Streptokokkenmenge daraus bestimmt werden.
    • Beispiel 20 Enzymimmuntest auf ein Hepatitis B-Oberflächenantigen mittels elektrochemischer Lumineszenz
  • Eine Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsag) enthaltende Blutprobe wird für einen angemessenen Zeitraum mit einem für das HBsag spezifischen Antikörper in Kontakt gebracht und mit Dextranase markiert. Der nicht an HBsag gebundene Antikörper wird entfernt und der Antigen-Antikörper-Komplex mit einem mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markierten Dextranpolymer in Kontakt gebracht. Die Wirkung der Dextranase auf die markierten Polymere führt zur Erzeugung von Fragmenten, die jeweils mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiert sind. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann quantifiziert und die in der Probe enthaltene Menge an Hepatitis B- Oberflächenantigen daraus bestimmt werden.
    • Beispiel 21 Homogener Test auf Bradykinin-Rezeptoren unter Verwendung eines mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markierten Bradykinins
  • Eine Gewebeprobe, die Bradykinin-Rezeptoren enthält, wird entsprechend zubereitet und mit Bradykinin in Kontakt gebracht, das mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiert ist. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann quantifiziert und die in der Probe enthaltene Menge an Bradykinin-Rezeptor daraus bestimmt werden. Dieser Test kann auch zur Messung anderer Interaktionen von Liganden und Rezeptoren wie einem Östrogen- Östrogen-Rezeptor verwendet werden. Außerdem kann man diesen Test dazu verwenden, unter Einsatz eines kompetitiven Bindungstestformats die Menge an unmarkierten Liganden zu bestimmen und quantifizieren.
    • Beispiel 22 Verwendung einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente zum Nachweis von Nukleinsäurehybriden
  • Eine Probe, die Nukleinsäurehybriden wie doppelsträngige DNS, RNS-DNS-Doppelstränge oder doppelsträngige RNS enthält, wird mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente in Kontakt gebracht, die spezifisch in Nukleinsäurehybriden einlagert. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann quantifiziert und die in der Probe enthaltene Menge an Nukleinsäurehybriden daraus bestimmt werden.
    • Beispiel 23 Nachweis von HTLV-III-Antigen im Komplex mit Antikörper in Speichel unter Verwendung von elektrochemischer Lumineszenz
  • Eine Speichelprobe, die HTLV-III im Komplex mit Antikörper enthält, wird mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die einen chaotopischen Wirkstoff enthält, um die Antigen-Antikörper-Komplexe zu sprengen. Diese Lösung wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der spezifisch für HTLV-III ist und mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente markiert wurde. Man entfernt den chaotopischen Wirkstoff und läßt die markierten und unmarkierten Antikörper mit Antigen rekombinieren. Nach angemessener Zeit kann die entstehende Probe induziert werden, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt wird, die die Induktion von wiederholter elektromagnetischer Strahlung durch die elektrochemisch lumineszierende Komponente bewirken kann. Die ausgesandte Strahlung kann quantifiziert und die in der Probe enthaltene Menge an HTLV-III Antigen daraus bestimmt werden. Diese Verfahren sind auch auf Proben anwendbar, die andere Typen von Antigen-Antikörper-Komplexen enthalten wie Hepatitis Antigen-Antikörper-Komplexe, Cytomegalovirus- Antikörper-Komplexe und Non-A-Non-B Hepatitis-Antikörperkomplexe in Serum.
    • Beispiel 24 Immuntest für die Detektion und Identifizierung einer Vielzahl von Staphylococcen-Enterotoxinen
  • Für jedes der Staphylococcen-Enterotoxine A, B, C, D und E spezifische monoclonale Antikörper und monoclonale Antikörper, die kreuzreaktiv für diese Enterotoxine sind, wurden aufgereinigt. Jeder Antikörper wurde aus Ascitesfluid mittels Passage des Ascites durch eine Säule des Staphylococcen-Proteins A, gekoppelt an ein Agarosegel als Trägermatrix, bereitgestellt, das zusammen mit Bindungs-, Elutions- und Regenerationspuffern als Teil eines Aufreinigungssystems für monoclonale Antikörper (Biorad Laboratories, Inc.) bereitgestellt wird. In dem Reinigungsverfahren wurden 2 ml an Ascitesfluid, typischerweise enthaltend 5-15 mg an monoclonalem Antikörper pro Milliliter, wurden vorfiltriert, indem man einen MetricellTM-Membranfilter (Gelman Science, Inc.) zwischen zwei F-13-Analysepapiere (Schleicher und Schuell, Inc.) im Boden einer 10 ml-Spritze (Becton Dickenson, Inc.) anordnet, das Ascitesfluid in die Spritze einführt, den Stöpsel einbringt und das Ascitesfluid in einen Sammelbehälter filtriert. Das Filtrat wurde mit einem gleichen Volumen an Bindungspuffer gemischt und auf eine 5 ml- Protein-A-Agarosesäule aufgetragen. Das Säulenreagenzreservoir wurde anschließend mit dem Bindungspuffer gefüllt, um den Elutionsprozeß zu beginnen. Das Eluat wurde auf Absorption bei 280 nm (A&sub2;&sub8;&sub0;) überwacht und 1 ml Fraktionen gesammelt. Wenn die Absorption bei 280 nm auf einen stabilen Grundlinienwert zurückgekehrt war, wurde die Säule mit 5 Bettvolumen an Bindungspuffer gewaschen und der Elutionspuffer dann verwendet, um das gereinigte Immunglobulin von der Säule zu eluieren. Um das Immunglobulin zu neutralisieren, wurde das Eluat in 0,3 ml 1 M Tris-HCl, pH 9,0, gesammelt. Wenn die A&sub2;&sub8;&sub0; wiederum auf einen stabilen Grundlinienwert zurückgekehrt war, wurde die Säule mit 5 Bettvolumen Elutionspuffer gewaschen, gefolgt von 10 Bettvolumen an Regenerationspuffer und 5 Bettvolumen an Bindungspuffer, so daß die Säule für den nächsten Reinigungszyklus fertig war. Die das gereinigte Immunglobulin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung einer gerührten Ultrafiltrationszelle (Amicon Corp.) konzentriert. Die Endkonzentration an gereinigtem Immunglobulin betrug mehr als 5 mg/ml, wie über den Lowry-Test auf Gesamtprotein ermittelt. Der gereinigte Antikörper wurde gegen zwei Chargen phosphatgepuffertes Kochsalz (PBS), enthaltend 0,1% Natriumazid, für 48 Stunden bei 4ºC dialysiert.
  • Die gereinigten monoclonalen Antikörper wurden in einem ELISA-System mit Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen titriert, um ein Maß ihrer immunologischen Reaktivität auf spezifische Enterotoxine bereitzustellen. Die Endpunkttiter für die Antikörper, die erhalten wurden, wurden mit Vergleichstiterwerten für zuvor annehmbare Chargen jedes Antikörpers verglichen. Antikörper eines ausreichenden Titers wurden als immunologisch funktional beschichtende Antikörper für Immobilisierung auf einem Diagnosereagenzhalter (beispielsweise einem Tauchstift) oder für die Konjugation an ein Enzym für die Verwendung als Sonden in dem Immuntest angenommen.
  • Diagnosereagenzhalter (Tauchstifte) mit daran angehefteten Nitrocellulosemembranen wurden für die Immobilisierung von Antikörpern auf der Membranoberfläche hergestellt, indem man die Membranen in phosphatgepuffertes Kochsalz für eine Stunde bei Raumtemperatur eintauchte, um die Benetzbarkeit der Membran zu verbessern. Die Stifte wurden aus der Lösung entfernt und die Membranen an Luft trocknen gelassen. Lösungen der gereinigten monoclonalen Antikörper, von denen jeder für eines der Staphylococcen-Enterotoxine A, B, C, D oder E spezifisch ist, und ein nicht spezifisches Maus- Immunglobulin (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.) als Kontrolle wurden auf verschiedene Bereiche der Membran aufgetragen, indem man 2 Mikroliter Antikörperlösung direkt auf die Membranoberfläche auftupfte. Die Konzentration jedes verwendeten Antikörpers war eine, von der bekannt war, daß sie die Bindungsplätze auf der Nitrocellulose absättigt: 250 ug/ml an 3A-Antikörper (spezifisch für Toxin A), 50 ug/ml an 2B-Antikörper (spezifisch für Toxin B), 300 ug/ml für 1C3-Antikörper (spezifisch für C1-, C2- und C3- Toxine), 200 ug/ml an 3D-Antikörper (spezifisch für D- Toxin), 250 ug/ml 4E-Antikörper (spezifisch für E-Toxin) und 200 ug/ml an nicht spezifischem Maus-Immunglobulin als Kontrolle. Die Tauchstifte ließ man an Luft bei Raumtemperatur trocknen und die verbleibenden Proteinbindungsstellen auf der Membran wurden durch Eintauchen der Tauchstifte in eine Lösung von phosphatgepuffertem Kochsalz, enthaltend 0,5% Tween 20 und 3% Rinderserumalbumin, abgesättigt. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei Raumtemperatur in dieser Blockierlösung ließ man die Stifte an Luft trocknen.
  • Gereinigte monoclonale Antikörper 2A (spezifisch für A- und E-Toxine), 6B (spezifisch für B-, C1-, C2- und C3-Toxine) und 1D (spezifisch für D-Toxin) wurden kovalent an das Enzym alkalische Phosphatase für die Verwendung als konjugierte Sonden gebunden, um die Anwesenheit von A-, B-, C1-, C2-, C3-, D- und E-Toxinen zu ermitteln, die auf der Membranoberfläche des Diagnosereagenzhalters bzw. Tauchstifts immobilisierte Antikörper gebunden sind. Jedes Konjugat wurde über ein stöchiometrisch gesteuertes zweistufiges Verfahren hergestellt, das Glutaraldehyd als bifunktionales Quervernetzungsmittel verwendet. In diesem Verfahren wurden 0,47 ml an alkalischer Phosphatase von EIA-Qualität (2500 U/mg, Boehringer Mannheim Corp.) zu 1,2 ml an 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend 13,4 ul wäßrige Glutaraldehydlösung (25%, Sigma Chemical Co.) zugesetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 90 Minuten gerührt, um die Anheftung des Glutaraldehyds an freie Aminogruppen des Enzymmoleküls zu gestatten. Nach dieser Inkubationszeit wurde ein 2 ml-aliquoter Anteil an gereinigten monoclonalen Antikörper in einer Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt, die Mischung für weitere 90 Minuten gerührt und auf Eis angeordnet, um die Konjugationsreaktion abzustoppen. Das Konjugat wurde gegen zwei Chargen an phosphatgepuffertem Kochsalz, enthaltend 0,1% Natriumazid, für 48 Stunden bei 4ºC dialysiert. Rinderserumalbumin wurde dem Dialysat auf eine Endkonzentration von 3% zum Stabilisieren während der verlängerten Lagerung bei 4ºC zugesetzt. Die Antikörper- Enzym-Konjugate wurden in einem ELISA-System mit Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen titriert, um ein Maß für ihre immunologische Reaktivität für spezifische Enterotoxine bereitzustellen. Die Endpunkttiter der Konjugate, die erhalten worden waren, wurden mit Vergleichstiterwerten für zuvor annehmbare Chargen jedes Konjugats verglichen. Die Konjugate mit ausreichendem Titer wurden für die Verwendung als Sonden in dem Tauchstifttest auf Staphylococcen- Enterotoxine angenommen.
  • Feste Nahrungsmittel wie Schinken, Wurst, Nudeln und Käse, die die Nahrungsmittelarten repräsentieren, die am häufigsten mit dem Ausbruch von Staphylococcen-Nahrungsmittelvergiftungen assoziiert sind, wurden in eine homogene flüssige Suspension umgewandelt, um den Test auf Staphylococcen- Enterotoxine durchzuführen. In einer typischen Extraktion wurden 20 ml Wasser zu 20 g Nahrungsmittel zugesetzt und die Mischung für 30 Sekunden unter Verwendung eines Stomacher-Lab-Blenders (Tekmar Co.) homogenisiert. Für viskosere Nahrungsmittel wurde das doppelte Volumen an Wasser verwendet. Staphylococcen-Enterotoxin wurde dem Nahrungsmittel entweder vor oder nach dem Homogenisieren zugesetzt. Das Nahrungsmittelhomogenisat wurde direkt unter Verwendung des oben beschriebenen Tauchstiftes als Diagnosereagenzhalter getestet. Positive Ergebnisse wurden mit Nahrungsmittelproben erhalten, zu denen niedrige Level an Enterotoxin zugesetzt worden waren. Weitere Extraktionsschritte wurden an den Nahrungsmittelhomogenisaten ausgeführt, um die Empfindlichkeit der Staphylococcen-Enterotoxin-Detektion zu verbessern. Das Homogenisat wurde typischerweise auf pH 4,5 mit 6 N HCl eingestellt und für 20 Minuten bei 20.000 · g zentrifugiert und der Überstand auf pH 7,5 mit 5 N NaOH eingestellt, wiederum 20 Minuten bei 20.000 · g zentrifugiert und der Überstand direkt in dem Tauchstifttest verwendet. Für Nahrungsmittelextrakte, die auf diese Weise hergestellt worden waren, betrugt die Empfindlichkeit der Enterotoxin- Detektion 1 ng pro ml an Extrakt für jedes Toxin in jedem getesteten Nahrungsmittel.
  • Flüssige Nahrungsmittel wie Milch wurden direkt getestet, indem man den Tauchstift als Diagnosereagenzhalter in das flüssige Nahrungsmittel eintauchte und den Test auf identische Weise wie für die festen Nahrungsmittelhomogenisate durchführte. Durch Testen dieser Nahrungsmittel wurde außerdem bestimmt, daß die Empfindlichkeit auf 1 ng pro ml verbessert werden kann, indem man die oben beschriebenen weiteren Extraktionsschritte durchführt.
  • Diagnosereagenzhalter (Tauchstifte), die mit Nitrocellulosemembran versehen sind, die auf derselben immobilisierte monoclonale Antikörper aufweisen, die spezifisch für individuelle Staphylococcen-Enterotoxine sind, wurden in ein Röhrchen eingetaucht, enthaltend 1 ml eines flüssigen Nahrungsmittels, Nahrungsmittelhomogenisats oder Nahrungsmittelextrakts, hergestellt wie oben, oder 1 ml an PBS. Jede dieser Lösungen enthielt 1 ng/ml eines zugesetzten Staphylococcen-Enterotoxins oder einer Mischung an Enterotoxinen, jeweils in einer Konzentration von 1 ng/ml. Der Tauchstift verblieb in diesen Probenlösungen für 1 Stunde Inkubationszeit bei Raumtemperatur unter Schütteln auf einem Rotationsschüttler eingetaucht. Die Tauchstifte wurden anschließend aus den Proben entfernt und unter Schütteln für 5 Minuten in PBS mit 0,5% Tween-20, anschließend zweimal mehr mit Schütteln in nur PBS für je 5 Minuten pro Waschung gewaschen. Eine Mischung von Konjugaten aus monoclonalem Antikörper alkalischer Phosphatase, hergestellt wie beschrieben, wurde wie folgt erzeugt: 1 : 1000 Verdünnungen von A2- Konjugat (spezifisch für A- und E-Toxine), 6B-Konjugat (spezifisch für B-, C1-, C2- und C3-Toxine) und 1D-Konjugat (spezifisch für D-Toxin) wurden in derselben Lösung hergestellt (30 ul jedes Konjugats in 30 ml PBS, enthaltend 0,5 % Tween-20 und 3% BSA). Die Tauchstifte wurden in diese Konjugatmischungen eingetaucht, 2 ml pro Stift, und für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Die Tauchstifte wurden zweimal in PBS-Tween, anschließend dreimal mit Schütteln in PBS für je 5 Minuten pro Waschung gewaschen, um nicht gebundenes Konjugat aus monoclonalem Antikörper alkalischer Phosphatase von der Membranoberfläche zu entfernen.
  • Nach der Entfernung von nicht gebundenem monoclonalem Antikörper/Enzymkonjugat von dem Tauchstift als Diagnosereagenzhalter wurde die Anwesenheit von gebundenem Konjugat angezeigt, indem man den Tauchstift in eine Lösung von 5- Brom-4-chlorindolylphosphat (BCIP, Sigma Chemical Co.) und Nitrobluetetrazolium (NBT, Sigma Chemical Co.) eintauchte. Die Lösungen von BCIP und NBT wurden einzeln wie folgt hergestellt: 3,2 mg an BCIP wurden in 10 ml 0,1 M Tris-HCl, 1,0M NaCl, 5 mM MgCl&sub2; gelöst und 8,8 mg an NBT wurden in 10 ml derselben Lösung gelöst. Diese Lösungen wurden unmittelbar vor der Anwendung miteinander vermischt. Die Tauchstifte wurden in die Substratmischung für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln eingetaucht, anschließend mit Wasser gespült und Luft getrocknet, was eine permanente Aufzeichnung des Testergebnisses bereitstellt. Da gesamte Testverfahren erfordert wenige bis keine Pipetierschritte, minimale Bearbeitungszeit und kann in etwa 2 Stunden durchgeführt werden. Das Substrat des Enzymkonjugats, BCIP, wurde durch das an das Toxin auf der Membran gebundene Konjugat hydrolysiert, um ein Reaktionsprodukt zu ergeben, das das NBT zu einem unlöslichen blauen Produkt reduziert, das an die Membran des Tauchstiftes bindet. Die Anwesenheit des Staphylococcen-Enterotoxins in der Probe, das durch den immobilisierten ersten monoclonalen Antikörper auf der Membran gebunden und durch die Bindung des zweiten Konjugats aus monoclonalem Antikörper/Enzym detektiert wurde, wurde durch die Anwesenheit eines blauen Punkts auf der Nitrocellulosemembran angezeigt. Wenn kein Staphylococcen- Enterotoxin in der Probe vorhanden war, verbliebt die Nitrocellulosemembran weiß. Die Fläche der Membran, an die das Maus-Immunglobulin als Kontrolle immobilisiert worden war, verbliebt in jedem Fall weiß. Die Identifikation der speziellen Staphylococcen-Enterotoxine, die vorhanden waren, das heißt A, B, C, D oder E, wurde durch die Anwesenheit eines blauen Punkts auf verschiedenen und identifizierbaren Flächen auf der Membran angezeigt, an die für das Toxin spezifische monoclonale Antikörper immobilisiert waren. Dieses Verfahren, das einen Tauchstift als Diagnosereagenzhalter anwendet, ist in der Lage, 1 ng pro ml eines oder einer Mehrzahl von Staphylococcen-Enterotoxinen in einem flüssigen Nahrungsmittel, Nahrungsmittelhomogenisat oder Nahrungsmittelextrakt zu detektieren.
    • Beispiel 25 Enzymimmunoassay (EIA) auf coliforme Bakterien
  • Experimente wurden durchgeführt, um die Detektionseffizienz für fäkale Coliforme zwischen dem Verfahren der vorliegenden Erfindung (CAP-EIA MPN) und dem von der EPA genehmigten MPN-Bestätigungsprozedur unter Verwendung der EC-Brühe bei 44,5ºC zu vergleichen.
  • Die Experimente wurden als ein Standard-5-Gefäß MPN-Test mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. Anstelle der Laurylsulfattryptose (LST; Difco Labs, Detroit, MI) als Brühe oder Laktosebrühe (Difco Labs, Detroit, MI) verwendete man Phenolrot-Laktosebrühe (PRLB; Difco Labs, Detroit, MI), enthaltend 80 ug/ml an 4-Methylumelliferon-Glucuronid (MUG; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) als erstes Medium. Die PRLB wurde gewählt, da der Farbstoff Phenolrot die Detektion einer Säureproduktion aus der Fermentation von Laktose gestattete. Gas, das aus der Laktosefermentation evolvierte, wurde durch die umgedrehten Durham-Gärröhrchen eingefangen, die in jede der Phiolen insertiert wurden. MUG wurde als eine Option eingeschlossen, um eine vorläufige Bestätigung der Anwesenheit von E. coli bereitzustellen. E. coli, das hauptsächliche fäkale coliforme Bakterium, ist der einzige Organismus, der in Wasser vorkommt, der MUG spalten kann, um ein unter UV-Licht sichtbares fluorogenes Radikal freizusetzen (4, 10).
  • Das CAP-EIA MPN-Testformat stellt drei Arten von Daten bereit: 1) Säure- und Gasproduktion aus der Fermentation von Laktose (vorläufige Analyse auf Coliforme); 2) Fluoreszenz aus der Spaltung von MUG (vorläufige Bestätigung für E. coli oder fäkale Coliforme); und 3) CAP-Enzymimmunoassay- Bestätigung (bestätigender Test, auf Basis monoclonaler Antikörper). Die Ergebnisse der MUG- und CAP-EIA-Reaktion wurden anschließend mit den Ergebnissen verglichen, die über Standardverfahren (1) auf Basis der Laktosefermentation bei erhöhten Temperaturen von 44,5ºC in EC-Brühe (Difco Labs, Detroit, MI) erhalten worden waren.
  • Das Experiment wurde wie folgt durchgeführt: Um die drei 10-fachen Verdünnungsserien zu erhalten, die für einen MPN- Test erforderlich sind, wurden die folgenden Volumen an Wasserproben, gesammelt aus einem Bach in der Nähe, zum Einimpfen der Phiolen, enthaltend 10 ml PRLB-MUG und ausgestattet mit einer Polystyrolvertiefung innerhalb der Phiolen-Kappe, eingeimpft.
  • Serien A - 5 Phiolen, 1,00 ml Inoculum
  • Serien B - 5 Phiolen, 1,10 ml Inoculum
  • Serien C - 5 Phiolen, 0,01 ml Inoculum
  • Alle Phiolen wurden anschließend über Nacht für etwa 18-20 Stunden bei 35ºC inkubiert.
  • Am folgenden Tag wurden alle Phiolen auf Säure- und Gasproduktion wie auch Fluoreszenz unter UV-Licht untersucht. Alle Phiolen, die eine Trübung (Wachstum) zeigten, wurden unabhängig von der Säure- oder Gasreaktion umgedreht, um es der Suspension aus Zellen/Medium zu gestatten, die Polystyrolvertiefung innerhalb der Kappe zu füllen. Die umgedrehten Phiolen wurden für 1 Stunde bei 35ºC gehalten, um eine Anheftung der Bakterien (Antigen) an die Polystyrolkappenvertiefungen zu ermöglichen. Die Antigen gebundenen Kappenvertiefungen wurden anschließend von den Phiolen entfernt, um mit den auf Antikörpern basierenden bestätigenden Tests fortzufahren.
  • Um den EIA-Anteil (Enzymimmunoassay-Anteil) des Tests durchzuführen, wurden die Vertiefungen für 30 Minuten bei 35ºC mit einer Lösung von 3% Rinderserumalbumin (BSA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS; 8,5 g NaCl: 1,02 g Na&sub2;HPO&sub4;: 0,386 g NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O: 1000 ml destilliertes Wasser, pH 7,2) behandelt, um freie Stellen auf dem Polystyrol zu blockieren. Sobald die BSA-Lösung dekantiert war, wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS gewaschen, anschließend setzte man 50 ul eines Hybridoma-Zellüberstands zu jeder Vertiefung zu, der gegen E.coli-Zellen gerichtete monoclonale Antikörper enthielt, und inkubierte für 1 Stunde bei 35ºC, um die Wechselwirkung des Antikörpers mit den spezifischen Antigenen (E.coli-Zellen), gebunden an Polystyrol, zu gestatten. Nach dem Dekantieren des Antikörperüberstandes wurden Spuren von jeglichem ungebundenen Antikörper durch Waschen der Vertiefungen dreimal unter Verwendung einer PBS-TweenTM-20- Lösung (PBS + 0,05% TweenTM 20, J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) entfernt. Ein affinitätgereinigter, mit alkalischer Phosphatase markierter Antikörper aus Ziege gegen Maus-IgG (Konjugat; KPL, Gaithersburg, MD) wurde 1 : 1000 in PBS verdünnt und 50 ul aliquote Anteile zu jeder Vertiefung zugesetzt. Nach einer Stunde Inkubation bei 35ºC wurde jedes nicht gebundene Konjugat in den Vertiefungen durch vier Waschungen mit einer PBS-TweenTM-20-Lösung entfernt. Bei dem für die Detektion verwendeten Substrat der alkalischen Phosphatase handelt es sich um Natrium-para-Nitrophenylphosphat oder Sigma-104-Substrat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), hergestellt in einer Endkonzentration von 1 mg/ml in 10% Diethanolaminpuffer (97 ml Diethanolamin; 0,2 g NaN&sub3;; 100 mg MgCl&sub2;·6H&sub2;O und 800 ml destilliertes Wasser, pH 9,8). Das Substrat wurde in 100 ul Aliquots pro Vertiefung zugesetzt und nach 30 Minuten Inkubation bei 35ºC wurde die Reaktion in den Vertiefungen visuell beobachtet. Zum Zweck der Quantifizierung in diesem Beispiel wurde die umgesetzte Substratlösung in eine Mikrotiterplatte transferiert und instrumentell mit dem Gerät TitertekTM-Multiscan (Flow Laboratories, Moleans, VA), ausgestattet mit einem 405 nm-Filter, bestimmt.
  • Um den konventionellen bestätigenden Test auf fäkale Coliforme unter Verwendung der EC-Brühe (Difco Labs, Detroit, MI) durchzuführen, wurde eine Schleife voll Wachstum aus jeder der über Nacht PRLB aseptisch in ein Röhrchen transferiert, enthaltend 10 ml EC-Brühe, ausgestattet mit einem umgekehrten Durham-Gärröhrchen. Die Röhrchen wurden anschließend für 24-48 Stunden bei 44,5ºC inkubiert, wie von den Standardverfahren (1) angegeben, anschließend auf Anzeichen der Laktosefermentation untersucht (eingefangenes Gas innerhalb des Durham-Gärröhrchens). Jede Spur an Gasblasen in den Röhrchen wurde als positive Reaktion betrachtet.
  • Die Ergebnisse aus Beispiel 1 zeigen an, daß auf Basis der Gaserzeugung aus Laktose eine positive Kombination von 551 erhalten wird, was gemäß der statistischen MPN-Tabelle 35 Coliforme/ml (vorläufiger Test) entspricht. Von den gaspositiven (+) Phiolen waren nur vier (A2-A5) im MUG-Test positiv und enthielten daher höchstwahrscheinlich E. coli (vorläufige Bestätigung für E. coli oder fäkale Coliforme). Unter den bestätigenden Daten zeigte der herkömmliche EC- Test fünf Röhrchen (A1-A5) positiv für fäkale Coliforme, wogegen über das CAP-EIA-Verfahren nur vier Phiolen (A2-A5) positive Reaktivität zeigten. Die positiven EIA-Ablesungen reichten von 0,55 bis zu 1,06, wobei eine negative Reaktion einer Ablesung um 0,20 ergab. Die positiven EIA-Daten werden stark gestützt von den positiven MUG-Daten dahingehend, daß beide dieser Tests die Anwesenheit von fäkalen Coliformen in denselben Phiolen anzeigten, A2-A5. Die Tatsache, daß die Phiole A1 negativ auf MUG und EIA, jedoch positiv über EC war, ist nicht überraschend auf Grund der Häufigkeit von falsch-positiven und falsch-negativen Reaktionen, die üblicherweise mit den konventionellen MPN-Verfahren assoziiert ist (15, 16, 20). Die Selektivität des EC-Mediums zusammen mit der erhöhten Temperatur der Inkubation beeinflußt bekanntermaßen die Rückgewinnung fäkaler Coliforme. Auch erzeugen etwa 7% der fäkalen Coliformen (E. coli) kein Gas auf EC (falsch-negative) und hat sich gezeigt, daß 8% der nicht-fäkalen Coliformen in EC-Brühe wachsen und Gas erzeugen (falsch-positive). Die im Röhrchen A1 beobachteten EC-Reaktionen können daher eine falsch- positive Reaktion darstellen, die für deren Diskrepanz zu den MUG- und EIA-Ergebnissen für Röhrchen A1 verantwortlich wäre. Im Hinblick auf die anderen Vertiefungen (B1-B5, C1- C5)in demselben Experiment beobachtete man eine exzellente Korrelation zwischen all den Tests. In anderen Worten waren Vertiefungen, die MUG (-) waren, auch EC (-) und EIA (-), wodurch das Fehlen von fäkalen Coliformen in diesen Phiolen bestätigt wurde.
  • In Experiment 2 war das zum Impfen der Phiolen verwendete Wasser stärker kontaminiert, da alle vorläufigen Röhrchen positiv auf Gasproduktion waren. Auf Basis der statistischen MPN-Tabelle würde eine positive Kombination von 5 5 5 die Anwesenheit von mehr als 240 Coliformen/ml andeuten. Im Vergleich der bestätigenden Tests wurde eine exzellente Korrelation zwischen MUG, EC und dem Antikörper basierten EIA erhalten. Jede Phiole, die eine Fluoreszenz zeigte (MUG +), war auch positiv über EC wie auch EIA. Die EIA- Reaktionen reichten von leicht schwach positiven Ablesungen von 0,46 (B2) bis zu sehr starken Reaktionen von 2,15, beobachtet für C4.
  • Die Ergebnisse dieser zwei Experimente zeigen, daß der auf Antikörper basierende CAP-EIA-Test der vorliegenden Erfindung genauso effizient ist wie der von der EPA genehmigte bzw. zugelassene EC-Test beim Bestätigen der Anwesenheit von fäkalen Coliformen. Zusätzlich, wie im Fall der Phiole A1 in Experiment 1 gezeigt, ist der CAP-EIA-Test weniger empfänglich für falsch-positive oder falsch-negative Reaktionen auf Grund der spezifischen Natur der Antikörper/Antigen-Reaktionen. Darüber hinaus bietet der CAP-EIA- Test zahlreiche bestimmte Vorteile über den herkömmlichen MPN-Test, nämlich: (1) Einfachheit - sowohl der vorläufige als auch der bestätigende Test können unter Verwendung derselben Phiole ohne die Notwendigkeit für weitere Transfers oder Medien ausgeführt werden; (2) Geschwindigkeit - der CAP-EIA-Test kann in ein Drittel bis der Hälfte der Zeit, die für einen herkömmlichen Test erforderlich ist, abgeschlossen werden; und (3) Spezifität - Antikörper sind hochspezifisch für ihre antigenen Ziele.
  • Diese Vorteile sowie das einzigartige Kappen-Vertiefungs- Design des CAP-EIA, der vier getrennte Sätze an Daten (Säure, Gas, Fluoreszenz und EIA) aus derselben Phiole bereitstellen kann, macht diesen zu einer weit überlegenen Alternative gegenüber dem herkömmlichen MPN-Test zum Analysieren von Coliformen und fäkalen Coliformen in Wasser und/oder Nahrungsmittelproben.
  • Das Konzept der Ausführung eines EIA in einer Kappe einer Phiole oder eines Röhrchens, enthaltend ein Polystyrolinsert, ist nicht auf Tests auf Coliforme oder fäkale Coliforme beschränkt und sollte äquivalent auf die Detektion anderer Bakterien anwendbar sein.
    • Beispiel 26 Zubereitung von 2-[3-(4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-propyl]-1,3-dioxolan
  • Unter einer inerten Argonatmosphäre wurden 30 ml trockenes Tetrahydrofuran (THF) und 7,65 ml trockenes Diisopropylamin (54,6 mMol) mit einer Spritze unter Rühren in einen 600 ml 3-Halskolben eingebracht. Die Lösung wurde auf -78ºC abgekühlt, indem man den Kolben in eine Mischung aus Trockeneis und Isopropanol in einem niedrigen Becherglas tauchte. 21,6 ml 2,5 M n-Butyllithium (54 mMol) wurden dem Kolben langsam zugesetzt. Die entstehende Lösung wurde 15 Minuten gerührt und eine Lösung aus 9,58 g in 300 ml trockenem THF aufgelöstem 4,41-Dimethyl-2,21-bipyridin (52 mMol) unter Rühren über eine Stunde durch eine Kanüle tropfenweise zugegeben.
  • Die entstehende braune Mischung wurde bei -78ºC noch 2 Stunden weitergerührt. Dann spritzte man 10 g 2-(2Bromethyl)-1,3-dioxolan (55 mMol) ein und rührte die entstehende Mischung 5 Minuten bei -780C. Dann wurde das Reaktionsgefäß in ein Eisbad (10ºC) gelegt. Nach 30 Minuten begann sich die Farbe zu verändern (nach einer Stunde war sie dunkelviolett, nach 2 Stunden blau, nach 2,5 Stunden grün und nach 3,25 Stunden zitronengelb).
  • Die Reaktionsmischung wurde mit 30 ml gesättigtem NaCl und dann mit 10 ml Wasser und 50 ml Ether abgeschreckt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit 300 ml Ether extrahiert und die kombinierten Etherphasen mit 100 ml Wasser rückextrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
  • Um das Reaktionsprodukt zu reinigen, wurde die Probe auf Aluminiumoxid (Merck) 90, Aktivität, III, neutral, getrennt. Die verwendeten Elutionsmittel waren Petroleumether/Diethylether (2 : 1) gefolgt von Petroleumether/Diethylether (1 : 1). (Das Ausgangsmaterial wird mit Petroleumether/Diethylether (2 : 1) vollständig eluiert, dann folgt das Produkt.
  • Die Protonen-NMR-Analyse bestätigte, daß das isolierte Reaktionsprodukt folgende Struktur hat:
    • Beispiel 27 Herstellung und Reinigung von 4-(Butan-1-al)-4-methyl- 2,2'-bipyridin
  • 2 g 2-[3-(4-Methyl-2,2-bipyridin-4'-yl)-propyl]-1,3- dioxolan wurden in 50 ml 1n HCl aufgelöst und 2 Stunden bei 50ºC erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt, mit Natriumbicarbonat auf einen pH zwischen 7 und 8 eingestellt und zweimal mit 100 ml Chloroform extrahiert.
  • Die kombinierten Chloroformphasen wurden mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und rotoverdampft, um ein gelbes Öl zu ergeben.
  • Das gelbe Öl wurde unter Verwendung von Ethylacetat/Toluol (1 : 1) als Elutionsmittel auf einer Kieselsäuregelsäule gereinigt; die Verunreinigung wurde mit Methanol eluiert.
  • Die Protonen-NMR-Analyse δ 1·-2·11; 2·43 (s,3H); 2·46-2·50) (t,2H); 2·53-2·80 (m,2H); 7·12-7·14 (m,2H); 8·17-8·21 (br. s,2H); 8·52-8·58 (m,2H); 9·89 (s,1H)] bestätigte, daß das Reaktionsprodukt folgende Struktur hat:
    • Beispiel 28 Herstellung von 4-(4-Methyl-2,2'-bipyridin-4-yl) - buttersäure
  • 0,5 g 4-(Butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin (2,0 mMol) wurden in 10 ml absolutem Aceton aufgelöst. 225 mg fein pulverisiertes Kaliumpermanganat (KMnO&sub4;; 1,42 mMol) wurden der Lösung unter Rühren portionsweise zugegeben. Auf die Reaktion folgte eine Dünnschichtchromatographie (Siliciumdioxid, Ethylacetat/Toluol 50 : 50), die ergab, daß sich mit dem allmählichen Verschwinden des Aldehyds ein Bipyridin von niedrigem Rf bildete.
  • Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde Wasser zugegeben und das MnO&sub2; filtriert und mit kleinen Portionen Na&sub2;CO&sub3; (aq.) gewaschen. Das Aceton wurde rotoverdampft und der Rückstand mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, um nichtsaure Bipyridine zu entfernen. Die wäßrige Lösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 1,0N HCl auf einen pH von 4,8 angesäuert. Die Lösung wurde teilweise wolkig, als sie diesen pH erreichte, wobei sich die Suspension bei einem niedrigeren pH wieder auflöste. Die Mischung wurde fünfmal mit gleichen Teilen CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem Öl rotoverdampft, das sich im Vakuum sofort verfestigte. Der rohe Feststoff wurde aus Chloroform : Petroleumether umkristallisiert, um weiße Kristalle zu erhalten.
  • Schmelzpunkt: 103,5 bis 105,5ºC; IR: 1704 cm&supmin;¹. Die Protonen-NMR-Analyse bestätigte die folgende Struktur:
    • Beispiel 29 Herstellung von Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(butan-1-al)-4'- methyl)-2,2'-bipyridin]ruthenium(II)-diperchlorat (Verbindung I)
  • 250 mg Rutheniumbipyridyldichloriddihydrat (0,48 mMol) (Strem) in 50 ml Ethylenglykol wurden rasch zum Siedepunkt erhitzt und dann in ein Siliconölbad getaucht (130ºC). Der dabei entstehenden violett-orangen Lösung wurden 150 mg 2-[3-(4-methyl-2,2'-bibyridin-4'-yl)- propyl]-1,3-dioxolan (0,53 mMol) in 10 ml Ethylenglykol zugesetzt. Die dabei entstehende orange Lösung wurde 30 Minuten bei 130ºC gerührt, auf Raumtemperatur abgekühlt und 1 : 1 mit destilliertem Wasser verdünnt.
  • Eine konzentrierte Natriumperchloratlösung in Wasser wurde der Lösung zugesetzt, wodurch ein sehr feiner oranger Niederschlag entstand. Die Mischung wurde über Nacht im Kühlschrank gelagert, filtriert und der Niederschlag mit Wasser gewaschen.
  • Der Niederschlag wurde in heißem Wasser aufgelöst und durch Zusatz von Perchlorsäure unkristallisiert. Es entstanden hellorange Kristalle, die dann filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet wurden. Dieses Umkristallisationsverfahren wurde wiederholt, wodurch man insgesamt 150 mg hellorange Kristalle erhielt.
  • Die NMR-Analyse ergab folgende Struktur:
  • In dieser Anmeldung wird die vorstehend identifizierte Verbindung als Verbindung I bezeichnet.
    • Beispiel 30 Herstellung von Bis(2,2-bipyridin) [4-(4-methyl-2,2'- bipyridin-4'-yl)buttersäure]ruthenium(II)-dihexafluorphosphat: Verbindung II
  • 134 mg 4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)buttersäure (0,52 mMol) wurden in 50 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde mit Argon entgast und mit 250 mg Rutheniumbipyridyldichloriddihydrat (Strem) (0,48 mMol) versetzt. Die Mischung wurde unter Argon 4 Stunden am Rückfluß gehalten. Das Wasser wurde rotationsverdampft und der Rückstand in der Minimalmenge Wasser von neuem aufgelöst und in eine SP-25-Sephadex-Ionenaustauschkolonne eingebracht. Nach der Elution von Verunreinigungen mit Wasser wurde die Verbindung als roter Substanzbereich mit 0,2 M NaCl-Lösung eluiert und durch Zusatz einer gesättigten wäßrigen Lösung von NH&sub4;PF&sub6; als Hexafluorphosphat isoliert. Das rohe Produkt wurde zweimal mit Diethylether aus heißem Aceton ausgefällt.
  • Analyse: Berechnet: C 43,80%, H 3,36%, N 8,76%.
  • Gefunden: C 43,82%, H 3,54%, N 8,55%.
  • Die Protonen-NMR-Analyse entsprach folgender Struktur:
    • Beispiel 31 Herstellung von N-[4-(4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)- butyl]phthalimid
  • Unter einer inerten Argonatmosphäre wurden 30 ml trockenes Tetrahydrofuran (THF) und 7,65 ml trockenes Diisopropylamin (54,6 mMol) mit einer Spritze unter Rühren in einen 600 ml 3-Halskolben eingebracht. Die Lösung wurde auf -78ºC abgekühlt, indem man den Kolben in eine Mischung aus Trockeneis und Isopropanol in einem niedrigen Becherglas tauchte. 21,6 ml 2,5 n-Butyllithium (54 mMol) wurden dem Kolben langsam zugesetzt. Die entstehende Lösung wurde 15 Minuten gerührt und eine Lösung aus 9,58 g in 300 ml trockenem THF aufgelöstem 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (52 mMol) unter Rühren über eine Stunde durch eine Kanüle tropfenweise zugegeben.
  • Die entstehende braune Mischung wurde bei -78ºC noch 2 Stunden weitergerührt. Dann setzte man rasch 100 g 1,3- Dibrompropan (0,495 Mol) zu und rührte die Mischung 1 Stunde bei -78ºC. Dann würde die Mischung noch zwei weitere Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ihre Farbe veränderte sich von braun zu blau und dann zu gelb. Der Großteil des Lösungsmittels wurde rotationsverdampft und 200 ml Wasser zugesetzt. Dadurch bildeten sich zwei Phasen. Man gab konzentrierte Salzsäure zu, um den pH auf 0 zu senken. Die organische Schicht wurde weggeschüttet. Die wäßrige Schicht wurde zweimal mit 100 ml Ether gewaschen. Der pH wurde auf einen Wert zwischen 1 und 2 angehoben. Ein rotes Öl trennte sich ab und wurde in CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Nachdem man die Lösung mit wasserfreiem Na&sub2;CO&sub3; getrocknet hatte, wurde der Großteil des CH&sub2;Cl&sub2; rotationsverdampft und die Probe in eine Kieselsäuregelkolonne eingebracht. Die Probe wurde mit Chloroform eluiert, wobei sich ein hellgelbes Öl ergab, das nach dem Abkühlen über Nacht kristallisierte (12,37 g).
  • 4 g des so hergestellten rohen 4-(4-Brombutyl)-4'-methyl-2,2'-bipyridin (13,3 mMol) wurden einer Suspension aus 2,46 g Kaliumphthalimid (13,3 mMol) in 60 ml Dimethylformamid (DMF) zugesetzt. Die Mischung wurde dann 2 Stunden bei etwa 50ºC gerührt. Man setzte der Mischung erst 90 ml CHCl&sub3; und dann 125 ml Wasser zu. Die CHCl&sub3;-Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht zweimal mit 50 ml Chloroform extrahiert. Die kombinierten CHCl&sub3;-Schichten wurden mit 50 ml H&sub2;O gewaschen, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und rotationsverdampft. Dabei blieb ein helloranges Öl übrig, das sich über Nacht verfestigte. Das rohe Produkt wurde aus Aceton/Ethanol umkristallisiert und ergab 2,21 g (44,5%) weiße Kristalle (Schmelzpunkt 114,5-117,8ºC).
  • Analyse: Berechnet: C 74,38%, H 5,70%, N 11,31%.
  • Gefunden: C 73,98%, H 6,14%, N 11,28%.
  • IR: Phthalimidcarbonyl erstreckt sich von 1771 bis 1704 cm&supmin;¹. Die Protonen-NMR-Analyse ergab aromatische Resonanzen (δ 7·75-7·85, m, 4H) zusätzlich zu den üblichen Bipyridylderivatsignalen. Diese Daten entsprechen der folgenden Struktur:
    • Beispiel 32 Herstellung von Theophyllin-8-buttersäure-[4-(4-methyl- 2,2'-bipyridin-4'yl)butyl]amid: Verbindung III
  • 370 mg (1 mMol) N-[4-(4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)- butyl]pthalimid wurden in 10 ml Ethanol aufgeschlämmt, mit Hydrazinhydrat (720 mg, 1,4 mMol) behandelt, gerührt und 4 Stunden am Rückfluß gehalten. Während dieser Zeit ging der gesamte Feststoff in Lösung. Gegen Ende der Reaktion bildete sich ein weißer Niederschlag.
  • Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung mit 50%- igem NaOH basisch gemacht und in 100 ml Wasser gegossen. Es entstand eine Lösung, und man gab Na&sub2;CO&sub3; zu, um das Produkt als Öl auszusalzen. Das Amin wurde unter Verwendung von drei 40 ml-Portionen CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die Extrakte wurden mit CaSO&sub4; getrocknet, filtriert und verdampft, um das Aminobipyridinderivat als farbloses Öl (Ausbeute = 0,135 gm; 56%) zu ergeben.
  • 1,34 g (5,6 mMol) 4-[4-(1-aminobutyl)]4'-methyl-2,2'- bipyridin und Theophyllin-8-buttersäure (1,18 g, 4,4 mMol) wurden bei Raumtemperatur in 10 ml trockenem Pyridin aufgelöst. Der Lösung wurden 1,16 g (5,6 mMol Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Bei Raumtemperatur wurde über Nacht weitergerührt. Die Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxid (mobile Phase = 15% Methanol/Chloroform) ergab einen Produktfleck mit einem Rf von 0,68. Ausgefällter Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt und das Pyridin gestrippt, um einen Feststoff zu ergeben. Dieser wurde in Ether pulverisiert und filtriert (Ausbeute = 2,13 g; 99%).
    • Beispiel 33 Herstellung von Bis(2,2-bipyridin [theophyllin-8- buttersäure-4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'- yl)butylamid]ruthenium(II)-dichlorid: Konjugat aus Ru(II) und Verbindung III
  • Einer Mischung aus 154 mg (0,296 mMol) aus Bis-(2,2'- biypridin)ruthenium(II)-dichloriddihydrat und 175 mg (0,357 mMol) aus der vorstehend beschriebenen Verbindung III wurden 40 ml Ethanol/H&sub2;O (1 : 1, v/v) zugesetzt. Diese Mischung wurde im Dunklen 15 Minuten mit Argon entgast und im Dunklen unter Argon 3 Stunden am Rückfluß gehalten, um eine klare, kirschrote Lösung herzustellen. Man ließ diese klare, kirschrote Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und trieb dann unter Verwendung eines Rotationsverdampfers das Lösungsmittel ab, während man die Lösung nach wie vor im Dunklen unter einer Temperatur von 37ºC oder weniger hielt.
  • Der entstehende Rückstand wurde in etwa 1 bis 3 ml Methanol wieder aufgelöst, in eine Sephadex LH-20 Chromatographiekolonne (75 cm · 3 cm) eingebracht und bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,4 bis 0,7 ml/min eluiert. Einem hellroten Substanzbereich (Produkt) folgten dichtauf ein brauner, nicht lumineszierender Substanzbereich (Verunreinigung) und zwei lumineszierende Substanzbereiche. Wie sich herausstellte, war der rote Produktsubstanzbereich mit einer kleinen Menge des Materials aus dem braunen, nicht lumineszierenden Substanzbereich kontaminiert. Dieses kontaminierende Material wurde vom Produkt abgetrennt, indem man die Probe unter ähnlichen Bedingungen durch eine zweite Sephadex LH-20 Kolonne laufen ließ.
  • Das rote Produkt erhielt man dadurch, daß man das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen abtrieb. Das entstehende feste Material wurde in ungefähr 1 ml Methanol wieder aufgelöst und in etwa 75 ml Diethylether wieder ausgefällt, um ein orangefarbenes Pulver zu ergeben, das durch Filtration gesammelt wurde.
  • Analyse:
  • Berechnet C 54,51%, H 5,72%, N 13,99%; O 10,47%; Cl 6,44% Gefunden C 55,04%, H 6,35% H 13,18%, O 10,62%, Cl 6,68%
    • Beispiel 34 Modulation eines durch das Konjugat aus Ru(II) und der Verbindung III erzeugten elektrochemisch lumineszierenden Signals unter Verwendung von für Theophyllin spezifischen Antikörpern
  • Das in Beispiel 33 beschriebene Konjugat aus Ru(II) und der Verbindung III wurde unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, der 0,35 M Natriumfluorid enthielt (PBF-Puffer), auf eine Endkonzentration von 150 nM verdünnt. Der für Theophyllin spezifische monoklonale Antikörper (Klon Nr. 9-49, Aszites Partie-Nr. WO399, Katalog-Nr. 046) wurde von Kallestadt Laboratories, Inc. (Chaska, MN) bezogen. Der monoklonale Antikörper wurde unter Verwendung von PBF-Puffer (zwischen 21,9 Mikrogramm Protein/ml auf 700 Mikrogramm/ml) verdünnt.
  • Ein anderer monoklonaler Antikörper (Kontroll MAB), der nicht mit Theophyllin reaktiv war, wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen und unter Verwendung von PBF-Puffer auf verschiedene Konzentrationen zwischen 21,9 Mikrogramm Protein/ml auf 700 Mikrogramm/ml verdünnt. Unter Verwendung von von der Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, Katalog-Nr. 26-140-8, Molekulargewicht 180,17) bezogenem Theophyllin wurde eine Standardtheophyllinlösung hergestellt. Theophyllin wurde in PBF-Puffer aufgelöst, bis sich Endkonzentrationen von 75 Mikromol ergaben, und wurde zur Verwendung in den Tests mit PBF- Puffer auf 6 Mikromol verdünnt. Vor der Messung der elektrochemischen Lumineszenz wurde der Reaktionsmischung eine Lösung zugesetzt, die 250 mMol Oxalsäure und 5% (v/v) Triton-X 100 (ECL-Lösung) enthielt. Die Messungen wurden unter Verwendung eines Lumineszenzmeßgeräts von Berthold durchgeführt, das insofern verändert worden war, als zwei Elektroden aus Platingaze in dem die Reaktionslösung enthaltenden Teströhrchen Platz fanden. Die Elektroden wurden an ein Potentiometer angeschlossen und die elektrochemische Lumineszenz dadurch gemessen, daß man eine angelegte Spannung von 1,5 bis 2,5 V mit einer Scan-Geschwindigkeit von 50 mM/sec über die Elektroden führte. Das für die Messung verwendete Lumineszenzmeßgerät von Berthold hatte ein hochaufnahmefähiges, rot-sensibles SEV-Rohr. Die Datenausgabe des Lumineszenzmeßgerätes an das Aufzeichnungsgerät wurde auf 10&sup5; Zähler/Volt eingestellt. Die Messungen wurden auf einem X-Y-Y'-Gerät aufgezeichnet; die Peakhöhe diente als Messung der elektrochemischen Lumineszenz. Zwischen den Messungen wurden die Elektroden gereinigt, indem man sie mit einer Pufferlösung mit einem pH von 4,2 spülte, die 0,1 M Phosphat, 0,1 M Citrat, 0,025 M Oxalsäure und 1% Triton X-100 enthielt. Man ließ die Elektroden 60 Sekunden zwischen +2,2 und -2,2 Volt und dann 10 Sekunden bei +2,2 in dieser Lösung pulsieren. Dann nahm man sie wieder heraus, spülte sie in destilliertem Wasser und rieb sie trocken. Das Experiment wurde wie in Tabelle XIV beschrieben durchgeführt.
  • Eine Lösung aus monoklonalen Kontrollantikörpern, Antikörpern auf Theophyllin oder PBF-Puffer wurde in einen Satz Teströhrchen gegeben (Schritt 1). Diesem Röhrchen wurde eine Lösung aus Theophyllin oder PBF-Puffer zugesetzt (Schritt 2). Die Lösungen wurden vermischt, indem man die Teströhrchen kurz schüttelte. Dann ließ man sie bei Raumtemperatur 25 Minuten reagieren. Als nächstes wurde eine Lösung aus dem Konjugat aus Ru(II) und der Verbindung III in die Röhrchen gegeben (Schritt 3). Man schüttelte die Teströhrchen und hielt sie 15 Minuten auf Raumtemperatur. Schließlich gab man 100 Mikroliter der ECL-Lösung in jedes Röhrchen und maß die elektrochemische Lumineszenz wie vorstehend beschrieben. Tabelle 15 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 12 Experimenteller Aufbau zum Studium der Wechselwirkungen eines Konjugats aus Antikörpern - Ru(II) - Verbindung III auf die elektrochemische Lumineszenz Tabelle 13 Auswirkung von Antikörper und Theophyllin auf die elektrochemische Lumineszenz von einem Konjugat aus Ru(II) und Verbindung III
  • Die elektrochemische Lumineszenz von doppelten Proben wurde wie vorstehend gemessen. Die elektrochemische Lumineszenz des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung II, das in der vorstehenden Studie verwendet wurde, betrug 57.200, wenn man sie in der Pufferlösung ohne Zusatz von Antikörper maß. Der Hintergrund für die Puffermischung war 5.750.
  • Die Daten zeigen, daß ein monoklonaler Antikörper, der Theophyllin spezifisch erkennt, bei Kontakt mit einem Theophyllinanalogon, an das eine Rutheniumverbindung angefügt ist, z. B. Ru(II) - Verbindung III, in seiner elektrochemischen Lumineszenz abnimmt. Die Abnahme der elektrochemischen Lumineszenz ist proportional zur Antikörperkonzentration, wenn die Konzentration des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III konstant bleibt. Wird ein Antikörper verwendet, der nicht mit Theophyllin reagiert, ist nur eine leichte Abnahme in der elektrochemischen Lumineszenz bei der höchsten Antikörperkonzentration zu beobachten.
  • Die Daten zeigen auch, daß bei Kontakt von Theophyllin mit dem anti-Theophyllinantikörper und anschließender Zugabe des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III zu dieser Mischung die Menge an elektrochemischer Lumineszenz größer ist. Dies zeigt, daß Theophyllin in Wettbewerb um die Bindung von Antikörper an das Konjugat aus Ru(II) und der Verbindung III tritt. Dies führt zu einer größeren Menge des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III, das elektrochemische Lumineszenz erzeugen kann.
    • Beispiel 35 Test auf Theophyllin in Serum auf der Basis eines homogenen Immuntests auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz
  • Auf der Grundlage der in Beispiel 34 beschriebenen Ergebnisse wurde ein homogener Immuntest für Theophyllin entwickelt, bei dem Antikörper gegen Theophyllin und das in Beispiel 33 beschriebene Konjugat aus Ru(II) und der Verbindung III in einem kompetitiven Bindungsformat verwendet wurden. Die verwendeten Materialien sind in Beispiel 34 beschrieben mit dem Unterschied, daß der PBF-Puffer 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, mit einem Gehalt von 0,1 m Natriumfluorid war. Für diesen Test wurde eine spezifische Konzentration aus monoklonalen Antikörpern gegen Theophyllin gewählt. Die Antikörperkonzentration betrug 55 Mikrogramm/ml. Die Konzentration des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III wurde auf 175 nM eingestellt. Man gab Theophyllin zu menschlichem Serum, um Endkonzentrationen von 2,5, 5, 10, 20 und 40 Mikrogramm Theophyllin pro Milliliter Serum zu erhalten.
  • Bei dem Test wurden 10 Mikroliter Serum zu 290 Mikrolitern monoklonalem anti-Theophyllinantikörper gegeben und die Lösung 25 Minuten auf Raumtemperatur gehalten. Dann gab man 100 Mikroliter des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III zu jedem Röhrchen, um eine Endkonzentration von 35 nM zu erhalten, und hielt diese Lösung 15 Minuten auf Raumtemperatur. 100 Mikroliter der in Beispiel 34 beschriebenen ECL-Lösung wurden jedem Röhrchen dann zugesetzt und die Eigenschaften der elektrochemischen Lumineszenz der Lösungen wie vorstehend beschrieben unter Verwendung eines Sweep-Modus von 1,5 bis 2,5 Volt bis 50 mV/sec gemessen. Die Daten sind in Fig. 2 aufgeführt und zeigen, daß ein Zusammenhang zwischen der Konzentration des Theophyllins in einer Serumprobe und der durch die Reaktionsmischung ausgestrahlten Menge an elektrochemischer Lumineszenz besteht. Diese Beobachtung zeigt, daß es möglich ist, einen Test auf Theophyllin zu entwickeln.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wäre es einem Fachmann möglich, einen homogenen Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz zu entwickeln, um einen relevanten Analyten in einer biologischen Matrix nachzuweisen und zu quantifizieren.
    • Beispiel 36 Test auf Theophyllin in hämolysierten, lipämischen, ikterischen und normalen Serumproben auf der Grundlage eines homogenen Immuntests auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz und eines Vergleichs zu einem Fluoreszenspolarisationstest
  • Die Konzentration von Theophyllin in verschiedenen Typen von Serumproben wurde unter Einsatz eines homogenen Immuntests auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz ermittelt. Das Format für den Test war ein kompetitiver Bindungstest unter Verwendung eines für Theophyllin spezifischen monoklonalen Antikörpers und des in Beispiel 31 beschriebenen Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III. Die Reagenzien und die Methoden für die elektrochemische Lumineszenz sind im vorstehenden Beispiel beschrieben.
  • Der zur Messung der Theophyllinkonzentration in den anderen Serumproben verwendete Fluoreszenzpolarisationstest wurde unter Verwendung eines automatisierten TDX-Instruments von Abbott Laboratories (North Chicago, IL) durchgeführt. Hämolysierte, lipämische, ikterische und normale Seren wurden in den Tests verwendet; die Daten für die abnormen Seren sind in der nachstehenden Tabelle 16 aufgeführt. Tabelle 16 Homogener Theophyllintest Eigenschaften potentiell problematischer Seren
  • Den Serumproben wurden verschiedene Theophyllinmengen zugesetzt, um Endkonzentrationen zwischen 2,5 und 40 Mikrogramm Theophyllin pro ml zu ergeben. Die Ergebnisse des homogenen Immuntests auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz sind in Fig. 3 gezeigt.
  • Jede Serumprobe wurde auch durch einen Fluoreszenzpolarisationstest auf ihre Theophyllinkonzentration analysiert. Die durch den homogenen Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz und den Fluoreszenzpolarisationstest gemessenen Theophyllinkonzentrationen wurden verglichen. Die Daten wurden gestreut aufgezeichnet, wie in Fig. 4 A bis D gezeigt. Die Datenpunkte wurden durch lineare Regression analysiert und die Korrelationskoeffizienten berechnet. Die Analyse zeigt eine ausgezeichnete Wechselbeziehung zwischen den beiden Tests. Die Korrelationskoeffizienten (r) lagen zwischen 0,98 und 1,00. Die Neigung der Kurven für normale, hämolysierte und lipämische Serumproben lag zwischen 0,8 und 1,2, was eine ausgezeichnete Rückgewinnung von Theophyllin aus diesen Serumproben zeigt.
  • Obwohl die durch die ikterischen, Theophyllin enthaltenden Serumproben ausgestrahlte elektrochemische Lumineszenz höher als bei den anderen Proben war, war sie bei jeder Theophyllinkonzentration proportional höher. Dies geht aus Fig. 4 D hervor. Der Korrelationskoeffizient beträgt 1,00 für die Datenpunkte, in denen die elektrochemische Lumineszenz und die Fluoreszenzpolarisation verglichen wird; die Neigung beträgt jedoch 2,14, was eine höhere Rückgewinnung für das Theophyllin in der ikterischen Serumprobe zeigt.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse kann die Theophyllinkonzentration in einer ikterischen Probe dadurch ermittelt werden, daß man dafür eine Standardkurve anlegt, indem man bekannte Mengen des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III zu aliquoten Teilen des ikterischen Serums zugibt. Diese Daten zeigen, daß ein homogener Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz verwendet werden kann, um die Theophyllinkonzentration in Serumproben zu messen, die abnorme Mengen an Hämoglobin, Lipid und Bilirubin enthalten.
  • Ein homogener Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz bietet gegenüber einem Fluoreszenzpolarisationsverfahren wegen der Vielfältigkeit des ECL-Nachweises mehrere Vorteile, z. B. einen sensibleren Nachweis bei höheren Konzentrationen von biologischen Molekülen.
  • Ein homogener Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz hat ferner gegenüber einem Fluoreszenzpolarisationsverfahren weitere Vorteile, weil keine Quelle für einfallendes Licht erforderlich ist; die elektrische Anregung ist die einzige Voraussetzung für effiziente Lichterzeugung. Folglich ist keine aufwendige optische Ausrüstung erforderlich. Da das Meßprinzip eine rein spezifische Photonenemission ist, die durch elektrochemische Stimulierung hervorgerufen wird, ist die Sensibilität des Systems potentiell viel größer als die Fluoreszenzpolarisation, und ein größerer Dynamikbereich steht zur Verfügung. Auch können mit einem homogenen Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz wesentlich mehr Analyten gemessen werden als mit der Fluoreszenzpolarisationstechnik. Dies liegt an der selektiven Anwendung der elektrisch stimulierten chemischen Lumineszenz durch Vorfälle der biomolekularen Erkennung, z. B. Wechselwirkungen zwischen Antikörper und Antigen.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse würde ein Fachmann wissen, daß homogene Immuntests auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz zum Nachweis anderer relevanter Analyten in abnormen Serumproben entwickelt werden können.
    • Beispiel 37 Test auf Theophyllin in Serum auf der Grundlage eines homogenen Immuntests auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz und Vergleich mit dem Hochdruckflüssigchromatographie-Verfahren (HPLC-Verfahren)
  • Menschlichen Serumproben wurden verschiedene Mengen an Theophyllin zugesetzt, um Endkonzentrationen zwischen 2,5 und 40 Mikrogramm Theophyllin zu ergeben. Dann wurde jede Probe in zwei aliquote Teile geteilt und die Theophyllinkonzentration in der Probe durch einen homogenen Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz im Vergleich zu den Ergebnissen ermittelt, die man durch das HPLC-Verfahren für die gleichen Proben erhielt. Das Format für den homogenen Immuntest auf elektrochemische Lumineszenz war ein kompetitiver Bindungstest unter Verwendung eines monoklonalen, für Theophyllin spezifischen Antikörpers und des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III. Die Reagenzien und Verfahren für diesen Test sind in einem vorstehenden Beispiel beschrieben. Das zur Messung der Theophyllinkonzentration in anderen Serumproben verwendete HPLC- Verfahren ist nachstehend beschrieben.
  • Theophyllin (1,3-Diemthylxanthin) wurde aus Serumproteinen abgetrennt, indem man letztere mit Acetonitril ausfällte. Die das Theophyllin enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde durch ein HPLC-System geleitet, das mit einer Micro Bondapak C18 Kolonne von Waters Associates (3,0 mm · 30 cm) ausgerüstet war. Das Chromatogramm war in weniger als 10 Minuten vollständig aufgelöst.
  • Es wurden folgende Reagenzien verwendet: Natriumacetat (von Reagenzqualität), entionisiertes Wasser (durch das Millipore Milli Q(R)-System gereinigt), Acetonitril (HPLC-Qualität) und Standardtheophyllin (Sigma). Das verwendete Lösungsmittel zur Ausfällung der Serumproteine war ein 20 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,0, der 14% (v/v) Acetonitril enthielt. Der Phasenpuffer für das HPLC-Verfahren war 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,0, der 7% (v/v) Acetonitril enthielt. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1,5 ml/min. das Elutionsmittel wurde durch einen auf 270 nm eingestellten UV-Spektrometer beobachtet. Die Sensibilität des UV-Absorbanz- Detektors wurde auf 0,02 Absorbance Units Full Scale (AUFS = Absorbanzeinheiten auf dem vollen Maßstab) eingestellt. Die Umgebungstemperatur lag typischerweise im Bereich von 22 und 24ºC.
  • Die Ergebnisse für den homogenen Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz und den HPLC-Test für die Feststellung der Theophyllinkonzentration in Serum sind in Fig. 5 gezeigt. Die Daten wurden gestreut erfaßt und die Datenpunkte durch lineare Regression analysiert. Der Korrelationskoeffizient (r) wurde berechnet. Er betrug 0,98, was eine ausgezeichnete Wechselwirkung zwischen den beiden Tests zeigt.
  • Die Steigung der Kurve betrug 1,197, was eine ausgezeichnete Rückgewinnung des Theophyllins aus der Serumprobe für den homogenen Immuntest auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz im Vergleich zu dem auf HPLC basierenden Standardverfahren zeigt. Der homogene Test auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz bietet aufgrund seiner Schnelligkeit, Sensibilität und Fähigkeit, auf einfache Weise Mehrfachproben zu bearbeiten, Vorteile gegenüber dem HPLC-Verfahren. Auf der Basis dieser Ergebnisse würde ein Fachmann wissen, daß man homogene Immuntests auf elektrochemische Lumineszenz zum Nachweis relevanter Analyten, die durch HPLC und ähnliche Verfahren nachgewiesen werden können, entwickeln kann.
    • Beispiel 38 Herstellung von Konjugaten aus Theophyllin und Rinderserumalbumin
  • Konjugate aus Theophyllin und Rinderserumalbumin (BSA) wurden durch folgendes Verfahren aus Theophyllin-3- methylbuttersäure, Theophyllin-8-buttersäure und Theophyllin-7-essigsäure hergestellt. 50 mg BSA wurden in 1,5 ml 0,15 M NaHCO&sub3;, ph 9,0, aufgelöst. Getrennt wurden 16 mg Ethyl-3'3-dimethylaminopropylcarbodiimidhydrochlorid (EDCI), 11 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) und entweder 17,8 mg Theophyllin-7-Essigsäure, 20 mg Theophyllin-8-buttersäure oder 20,9 mg Theophyllin-3- methylbuttersäure in Dimethylsulfoxid aufgelöst, der ersten Lösung zugesetzt und die Mischung 1 bis 2 Stunden bei 45ºC erhitzt. Man gab die Lösung tropfenweise zu der BSA-Lösung und ließ sie 1 Stunde reagieren. Die Theophyllinkonjugate von BSA wurden durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Sephadex G-25 Säule (1,6 cm · 38 cm) unter Verwendung von 0,15 M PBS/0,1% Azid, pH 7,4, als mobile Phase und einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h gereinigt.
    • Beispiel 39 Herstellung von Theophyllin - BSA Biomag(R) Teilchen
  • Ein 4 ml Volumen von Biomag(R)-Aminteilchen (Advanced Magnetic, Inc., Cambridge, MA) wurde zwei- bis dreimal in getrennten T-Kolben mit 20 ml phosphatgepufferter Salzlösung (Sigma) (PBS), pH 7,4, die 0,008% Nonidet P-40 (NP-40) enthielt, gewaschen. Dem nassen Biomag(R)- Kuchen wurden 10 ml 5%iges Glutaraldehyd (Sigma) in PBS zugesetzt und über drei Stunden unter Einsatz eines Rotationsmixers aktiviert. Die aktivierten Biomag(R)- Teilchen wurden wie vorstehend beschrieben insgesamt viermal gewaschen und in einen T-Kolben umgefüllt.
  • 6,8 mg Theophyllin-BSA, das wie in Beispiel 36 beschrieben hergestellt worden war, in 10 ml BPS/NP-40 wurden dem aktivierten feuchten Biomag(R)-Kuchen zugesetzt. Man ließ die Reaktion über Nacht unter Mischen bei 4ºC ablaufen.
  • Der aktivierte nasse Biomag(R)-Kuchen wurde dreimal mit 20 ml 1% BSA/0,15 M PBS/0,1% Azid (pH 7,4) gewaschen, wobei die erste Wäsche unter Einsatz eines Rotationsmixers ungefähr 30 Minuten dauerte.
    • Beispiel 40 Herstellung eines Konjugats aus der Verbindung I und anti-Theophyllin
  • 1,1 ml eines anti-Theophyllin monoklonalen Antikörpers von der Maus (Kallestadt, Partie Nr. WO399; 4,6 mg/ml) wurden 8 Minuten bei 10.000 g zentrifugiert. Der Puffer wurde mit 0,2 M NaHCO&sub3;, 0,15 M NaCl, mit Azid, pH 9,0 unter Verwendung eines Amicon Centricon(R)-Eindickers (zentrifugiert bei 3000 · g) ausgetauscht. Die Antikörperlösung wurde auf 2 ml verdünnt und mit 3,2 mg der Verbindung I versetzt. Man ließ die Reaktion unter Rühren 2 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Dann gab man 79 Mikroliter wäßriges NaBH&sub4; bei 1 mg/ml zu und rührte die Lösung 30 Minuten.
  • Die entstehende Lösung wurde in eine Sephadex G-25 (1,0 cm · 18,0 cm)-Kolonne eingebracht, die zuvor mit Trispuffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, und bei einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/h eluiert. Die Fraktionen, die das Konjugat aus der Verbindung I und anti-Theophyllin enthielten, wurden gesammelt, in ein Dialyserohr umgefüllt und gegen 0,15 m Phosphat/0,15 M NaF (PBS), pH 6,9 (4 l) dialysiert.
    • Beispiel 41 Test auf Theophyllin in Serum auf der Basis eines heterogenen Tests auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz
  • Unter Verwendung eines immunmetrischen Testformats wurde ein heterogener Test auf Theophyllin entwickelt. Dazu verwendete man einen mit der Verbindung I markierten, anti-Theophyllinantikörper und Theophyllin-BSA, das auf Biomag(R) magnetischen Teilchen immobilisiert worden war. Die Antikörperkonzentration betrug 20 Mikrogramm/ml. Die Konzentration der magnetischen Teilchen betrug 1% Feststoffe (Gew.-/Vol.) Man gab Theophyllin auf eine Endkonzentration von 10 und 40 Mikrogramm pro ml Serum zu. Das Standardtheophyllinserum wurde tausendfach in PBF-Puffer (Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 0,1 M Natriumfluorid), der 0,1% BSA enthielt, verdünnt.
  • Bei dem Test wurden 75 Mikroliter der verdünnten Standardseren zu 75 Mikroliter mit der Verbindung I konjugiertem Antikörper gegeben und die Lösung 20 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet. Dann wurden 50 Mikroliter der Theophyllin-BSA-Biomag(R) Teilchen zugesetzt und die Suspension 5 Minuten stehengelassen. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt und 100 Mikroliter des Überstands wie in Beispiel 46 beschrieben auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz gemessen.
  • * ECL-Zähler pro 10 Sekunden
  • ++ auf Verdünnung korrigiert
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wäre ein Fachmann imstande, einen heterogenen Immuntest auf der Basis elektrochemische Lumineszenz zur Bestimmung anderer relevanter Analyten in einer biologischen Matrix zu entwickeln.
    • Beispiel 42 Herstellung eines Konjugats aus der Verbindung II und Digoxigenin
  • 100,2 mg (0,104 mMol) der Verbindung II, 41 mg (0,105 mMol Digoxigenin (Sigma) und 28 mg (0,136 mMol) 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurden in einen mit einem Rührstab ausgestatteten 50 ml Rundbodenkolben gefüllt. Der entstehenden Mischung setzte man unter Verwendung einer Spritze mit einer 18er-Nadel 8 bis 10 ml wasserfreies Pyridin (Aldrich Sure-Seal) zu. Der Kolben wurde mit einem Pfropfen verschlossen, mit Teflon-Band versiegelt und der Inhalt leicht gerührt, bis eine rote Lösung entstand. Man ließ den Kolben 24 Stunden unter einer Haube stehen, wobei weitergerührt wurde, und gab dann 6 mg (0,015 mMol Digoxigenin und 20 mg (0,097 mMol) DCC zu. Die Lösung wurde mit einer Haube zugedeckt und bei Raumtemperatur im Dunklen gerührt. Am nächsten Tag war keine Ausfällung von Dicyclohexylharnstoff zu beobachten. Man gab weitere 18 mg (0,05 mMol) Digoxigenin und 103 mg (0,50 mMol) DCC zu. Der Kolben wurde erneut versiegelt und der Inhalt im Dunklen weitergerührt. Nach 72 Stunden wurden weitere 103 mg DCC zugesetzt und die Lösung im Dunklen 3 Stunden gerührt.
  • 5 bis 10 Tropfen H&sub2;O wurden der Lösung zugesetzt, die dann im Dunklen auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit abgetrieben wurde, so daß ein roter Feststoff entstand.
  • Dieser rote Feststoff wurde mit Aluminiumfolie abgedeckt und über Nacht im Vakuum über CaSO&sub4; in einem Exsikkator getrocknet. Der getrocknete Feststoff wurde dann in 3 bis 5 ml Methanol aufgelöst und der Mischung 0,25 wasserfreies festes LiClO&sub4; zugesetzt. Sobald sich das LiClO&sub4; aufgelöst hatte, wurde die Lösung in eine Sephadex LH-20 Säule (75 cm · 19 mm) eingebracht und bei einer Fließgeschwindigkeit zwischen 7 und 10 Sekunden pro Tropfen mit Methanol eluiert.
  • Als die Chromatographie fortschritt, waren drei Substanzbereiche zu beobachten - ein hellorangefarbener (rot lumineszierender) erster Substanzbereich (Fraktion 1); ein dunkelroter zweiter Substanzbereich, der den größeren Teil der Reaktion darstellte (Fraktion 2), und ein dritter Substanzbereich, der hinter den ersten beiden Substanzbereichen hing (vermutlich nicht umgesetztes Ausgangsmaterial) und verworfen wurde.
  • Weil die Substanzbereiche 1 und 2 auf der Säule kaum getrennt waren, wurde ein oranges Produkt im Substanzbereich 2 dadurch isoliert, daß man eine Methanollösung aus Fraktion 2 (15 ml) in etwa 300 ml trockenen Diethylether (gerührt) tropfen ließ. Der entstehende Niederschlag wurde durch Saugfiltration auf einer 15 ml mittleren Fritte gesammelt und fünfmal mit 15 ml Diethylether gewaschen. Rückständiger Ether wurde dadurch entfernt, daß man den Komplex über Nacht in einem Vakuumexsikkator über CaSO&sub4; trocknete. Dieses feste Material wurde als folgende Substanz identifiziert:
    • Beispiel 43 Elektrochemische Lumineszenz (ECL) eines Konjugats aus der Verbindung II und Digoxigenin: Abwandlung des ECL- Signals durch anti-Digoxinantikörper
  • Monoklonaler Digoxinantikörper wurde in einem Immuntestpuffer auf folgende Konzentrationen verdünnt: 1, 10, 50, 200 und 400 Mikrogramm/ml.
  • Ein Konjugat aus der Verbindung II und Digoxigenin (50 Mikromol) wurde in Immuntestpuffer (0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, der 0,1 M Natriumfluorid enthielt) auf 150 nM verdünnt.
  • Zu 200 Mikrolitern Immuntestpuffer in Polypropylenröhrchen (12 mm · 75 mm) gab man 100 Mikroliter verschiedener Konzentrationen von Digoxin-Antikörper und 100 Mikroliter des Konjugats aus der Verbindung II und Digoxigenin (150 nM). Der Inhalt der Röhrchen wurde auf einer Wirbelvorrichtung vermischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten bebrütet. Nach der Inkubation wurden 100 Mikroliter ECL-Lösung (wie vorstehend beschrieben) zugesetzt und die elektrochemische Lumineszenz gemessen.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt:
  • Spezifische Antikörperkonzentration ECL-Signal ( )
  • 0,1 108.000
  • 1 114.000
  • 5 82.500
  • 10 64.000
  • 20 52.000
  • 40 36.000
  • Summe der ECL-Zähler für ein 30 nM Konjugat aus Verbindung II und Digoxigenin: 113.666 (Peak-Höhe).
  • Bei einer Konzentration von 40 Mikrogramm/Röhrchen betrug die unspezifische Antikörpermodulation des Signals 67.000 Zähler im Vergleich zu 36.000 Zählern in Gegenwart eines spezifischen Antikörpers gegen Digoxin.
  • Wie aus Fig. 6 hervorgeht, zeigte sich bei zunehmender Konzentration von anti-Digoxinantikörper bei der Umsetzung mit einer festen Konzentration des Konjugats aus der Verbindung II und Digoxigenin eine zunehmende Modulation des Signals der elektrochemischen Lumineszenz. Diese Charakteristik kann vorteilhaft eingesetzt werden, um einen homogenen Test auf der Basis von elektrochemischer Lumineszenz für die Messung von Digoxin in Serum oder Plasma zu entwickeln.
    • Beispiel 44 Homogener Digoxintest
  • Auf der Grundlage der in Beispiel 43 beschriebenen Ergebnisse kann ein homogener Immuntest auf Digoxin auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz entwickelt werden. Dabei verwendet man Antikörper gegen Digoxin und das Konjugat aus der Verbindung II und Digoxigenin. Das Format entspricht dem kompetitiven Bindungstest. Die Reagenzien, die verwendet werden können, sind in Beispiel 43 beschrieben. Für diesen Test würde man eine spezifische Konzentration monoklonaler Antikörper gegen Digoxin wählen. Die Antikörperkonzentration kann zwischen 75 und 100 Mikrogramm pro ml liegen. Die Konzentrationen des Konjugats aus der Verbindung II und Digoxigenin können zwischen 5 und 15 nM (Endkonzentration) liegen.
  • Standarddigoxin würde man menschlichem Serum zusetzen, um eine Endkonzentration von 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 8 und 16 Nanogramm Digoxin pro ml Serum zu ergeben.
  • Bei diesem Test kann man 10 bis 30 Mikroliter Serum zu 300 Mikrolitern monoklonalem anti-Digoxinantikörper zugeben und die Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur halten. Dann kann man jedem Röhrchen 100 ml des Konjugats aus der Verbindung II und Digoxigenin zusetzen, wobei sich eine Endkonzentration im Bereich von 5 bis 15 nM ergibt, und die Lösung 20 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten. 100 Mikroliter der zuvor beschriebenen ECL- Lösung können jedem Röhrchen zugesetzt werden; die Messung der ECL erfolgt wie vorstehend beschrieben.
    • Beispiel 45 Herstellung eines Konjugats aus Ouabain und Rinderserumalbumin
  • 50 mg Ouabainoctahydrat (Aldrich) wurden in 5 ml entionisiertem H&sub2;O aufgelöst. Dem aufgelösten Ouabain gab man 81 mg NaIO&sub4; zu und bebrütete die Mischung 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde dadurch gestoppt, daß man die Mischung über eine Dowex 1X-8 Ionenaustauschharzkolonne (5 ml) leitete, die mit entionisiertem H&sub2;O ins Gleichgewicht gebracht worden war, bis der pH zwischen 5 und 6 lag. Die oxidierte Ouabain- Fraktion wurde gesammelt, als sich bei den in den Abwasserbehälter eintretenden Tröpfchen Anzeichen des Vermischens zeigten.
  • 100 mg kristallines, lyophilisiertes Rinderserumalbumin (Sigma) (BSA) wurden in 5 ml 0,1 M mit Kaliumphosphat gepufferter Salzlösung, pH 7,4, die 0,05% Azid enthielt, aufgelöst. Die oxidierte Ouabainlösung wurde der BSA-Lösung unter Rühren tropfenweise zugesetzt. Man ließ die entstehende Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren, ehe man 30 mg NaCNBH&sub4; (Aldrich) zugab. Die Lösung wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
  • Die Lösung wurde unter Verwendung von Polyethylenglykol-8000 (11 ml auf 4 ml) konzentriert, und freies Ouabain und überschüssiges Borhydrid wurden durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Kolonne = 0,6 cm · 37 cm; Elutionsmittel 0,1 M K&sub2;PO&sub4;/0,15 M NaCl, pH 7,5, 0,05% NaN&sub3;) aus der Lösung entfernt. Die Fraktionen 11 bis 17 wurden zusammengenommen und die Proteinkonzentration durch Messung der Absorbanz bei 280 nm (nach der Verdünnung) festgestellt.
    • Beispiel 46 Herstellung von Ouabain-BSA-Sepharose
  • 2 g mit Cyanbromid aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) wurde mit 400 ml 1 mM HCl in 50 ml Portionen auf einem gesinterten Scheibentrichter gewaschen. Dann wurde das Harz mit 20 ml 0,1 M NaHCO&sub3;, 0,5 M NaCl Puffer, pH 9,0 (Verbindungspuffer) gewaschen. Nachdem das Harz in einen Polypropylenbehälter umgefüllt worden war, wurden 30 mg in 15 ml Verbindungspuffer aufgelöstes Ouabain- BSA zugesetzt. Man ließ das aktivierte Harz 2 Stunden unter Rotationsmischen mit dem Ouabain-BSA reagieren. Die verbleibenden aktivierten Stellen wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 7 ml 0,5 M Ethanolamin (pH 8,0) zur Umsetzung gebracht. Unter Verwendung eines gesinterten Scheibentrichters wurde das Harz mit je 100 ml der folgenden Lösungen gewaschen: Verbindungspuffer; 0,15 M PBS; 1 mM HCl; Verbindungspuffer, 0,2% NP-40 in PBS und PBS. Das Harz wurde wieder auf 11 ml suspendiert und eine ausreichende Menge dieser Suspension in eine Kolonne mit 1 cm Innendurchmesser (Pharmacia) gefüllt, um ein gesamtes Bettvolumen von 3,5 ml zu ergeben.
    • Beispiel 47 Herstellung und Affinitätsreinigung eines Konjugats aus einem anti-Digoxin und der Verbindung I
  • 450 Mikroliter einer 1 mg/ml Stammlösung eines anti- Digoxin monoklonalen Antikörpers von der Maus (Cambridge Medical Diagnostics, Katalog-Nr. 200M-014, Partie Nr. MA 2507F) wurden unter Verwendung einer Amicon Centricon(R) Eindickungseinheit auf 100 Mikroliter konzentriert. Diesem Konzentrat setzte man 900 Mikroliter 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6, und 0,6 mg der Verbindung I zu. Die Reaktion (Amidierung) ließ man 2 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen und gab dann 30 Mikroliter 1,0 M NaBH&sub4; (aq) (Sigma) zu. Die entstehende Lösung ließ man eine Stunde stehen.
  • Überschüssige Mengen der Verbindung I und andere Produkte wurden durch Sephadex G-25 Chromatographie (Kolonne = 1,0 cmID · 18 cm; Elutionsmittel = 0,1 M phosphatgepufferte Salzlösung) vom Antikörperkonjugat abgetrennt. Die Probe wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h in 1 ml Portionen fraktioniert und die Absorbanz bei 280 nm bei 2,0 AUFS und 0,5 AUFS beobachtet.
  • Die Fraktionen 5, 6, 7 und 8 wurden zusammengenommen, in eine vorgewaschene Ouabain-BSA-Sepharose Affinitätskolonne (3,5 ml Kolonne mit 1 cm Durchmesser) eingebracht und bei einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/h eluiert. Nachdem nicht zurückgehaltenes Material eluiert worden war, wurde die Fließgeschwindigkeit auf 30 ml/h gesteigert, bis sich 20 ml Eluat gesammelt hatten. Die Salzkonzentration der mobilen Phase wurde auf 0,5 M erhöht; dann ließ man weitere 20 ml durch die Säule eluieren.
  • Für Ouabain spezifisches Konjugat aus anti-Digoxin und der Verbindung I wurde durch Zusatz von 4 M und 6 M KSCH entfernt. Fraktionen, die dem Konjugat aus anti- Digoxin und der Verbindung I entsprachen, wurden zusammengenommen und gegen 10 mM phosphatgepufferte Salzlösung (1 l; pH 7,4) gefolgt von 0,1 m Phosphatpuffer (4 l; pH 7,0) dialysiert.
    • Beispiel 48 Heterogener Immuntest auf Digoxin auf der Basis elektrochemischer Lumineszenz
  • 10 mg festes Digoxin wurden in 10 ml DMSO : H&sub2;O (8 : 2) aufgelöst, um eine Digoxinkonzentration von 1 mg/ml (nachstehend Stammlösung) zu ergeben.
  • Aus dieser Stammlösung wurden Arbeitslösungen in folgenden Konzentrationen in 0,15 M Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% BSA und 0,15 M NaF enthielt (nachstehend ECL-Puffer) hergestellt: 80 ng/ml, 40 ng/ml, 20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml und 0 ng/ml.
  • 75 Mikroliter des Konjugats aus anti-Digoxin und der Verbindung I (1 : 90 verdünnt) und 75 Mikroliter jeder Stammlösung wurden mittels einer Pipette in ein Glasröhrchen eingeführt, auf einer Wirbelvorrichtung vermischt und bei Raumtemperatur 20 Minuten bebrütet.
  • Jedem Röhrchen wurden 50 Mikroliter vorgewaschene Ouabain-BSA-Biomag(R)-Teilchen zugesetzt, auf einer Wirbelvorrichtung vermischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet. Biomag(R)-Teilchen wurden abgetrennt und der Überstand in ein getrenntes Röhrchen umgefüllt.
  • 100 Mikroliter Überstand wurden mit 400 Mikroliter 0,125 M Kaliumphosphat, 0,125 M Citronensäure, 32 mM Oxalsäure und 1,25% Triton X-100 in einem Röhrchen vermischt.
  • Die Probe wurde in eine Anlage von Berthold eingebracht und die elektrochemische Lumineszenz wie vorstehend gemessen mit dem Unterschied, daß das Verfahren insofern verändert war, als man die angelegte Spannung von Leerlaufschaltung auf 2,2 V erhöhte und die Photonenzähler für 10 Sekunden integrierte.
  • Die Elektrode wurde zwischen Messungen unter Verwendung von Phosphatcitratpuffer wie folgt gereinigt:
  • (a) die Elektrode eine Minute lang in 3-Sekunden-Intervallen abwechselnd zwischen -2,2 V und + 2,2 V pulsieren lassen;
  • (b) die Elektrode 10 Sekunden bei 2,2 V belassen;
  • (c) die Elektrode mit entionisiertem Wasser (H&sub2;O) spülen und trockentupfen.
  • Fig. 7 zeigt die Ergebnisse.
    • Beispiel 49 Markierung von DNS mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente
  • Die folgenden beiden Verfahren sind verwendet worden, um DNS mit einer elektrochemisch lumineszierenden Komponente zu markieren.
    • Synthese A
  • 1,0 A&sub2;&sub6;&sub0; des eigens synthetisierten 38 mer (MBI 38)
  • TCACCAATAAACCGCAAACACCATCCCGTCCTGCCAGT*,
  • wobei es sich bei T* um am Kohlenstoff 5 mit
  • -CH=CH-CO-NH-(CH&sub2;)&sub7;-NH&sub2;
  • modifiziertes Thymidin handelt, wurden in 100 Mikrolitern 0,01 M Phosphatpuffer, pH 8,7, aufgelöst. 100 Mikroliter einer Lösung aus Bis(2,2'-bipyridin)[4- butan-1-al)-4'-Methyl-2,2'-bipyridylruthenium(II)- diperchlorat (Verbindung I) (2,3 mg in 300 Mikroliter 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,7) aufgelöst. Der Inhalt wurde gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen.
  • 100 Mikroliter einer gesättigten wäßrigen Lösung aus Natriumborhydrid wurden der Mischung zugesetzt, um die reversible Verbindung aus Imin und Schiff's Base in eine nicht reversible Aminbindung zu verwandeln. Man ließ die Reaktion zwei Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Anschließend wurde die Lösung sorgfältig mit einigen Tropfen verdünnter Essigsäure behandelt, um überschüssiges Natriumborhydrid abzuschrecken. Die Reaktionslösung wurde in eine P-2 Gelfiltrationskolonne [457,2 mm · 12,7 mm (18 inches · 1/2 inch)] eingebracht, die zuvor mit 0,1 m Triethylammoniumacetat, pH 6,77, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Kolonne wurde mit dem gleichen Puffer eluiert, und man sammelte 2 ml-Fraktionen bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h. In den Fraktionen 9 und 10 eluierte DNS wurde sorgfältig von dem nicht umgesetzten Ruthenium- Bipyridylkomplex abgetrennt. Die gesammelte DNS-Probe wies eine typische UV-Absorption auf und zeigte darüber hinaus ein fluoreszierendes Emissionsspektrum bei 620 nm, wenn sie bei 450 nm angeregt wurde. Die Fluoreszenzemission zeugt vom Vorhandensein der Rutheniumbipyridylkomponente in der DNS-Probe. Das Produkt bewegt sich als einzelner orangefarbener Fluoreszenzsubstanzbereich auf Polyacrylamidgelelektrophorese. Die elektrophoretische Mobilität der markierten DNS (Konjugat aus MBI 38 und der Verbindung I) ist ungefähr gleich wie bei der unmarkierten DNS.
    • Synthese B
  • Zuerst wurde der Rutheniumkomplex in ein N-Hydroxysuccinimidderivat umgewandelt, indem man 30 mg in 60 Mikrolitern wasserfreiem Dimethylformamid auflöste und mit einer Lösung aus N-Hydroxysuccinimid (52 mg) in wasserfreiem DMF in Gegenwart von 94 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) behandelte. Man ließ die Reaktion 4 Stunden bei 0ºC ablaufen. Ausgefällter Dicyclohexylharnstoff wurde durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand (200 Mikroliter) der Lösung aus mittels Amino verbundener DNS (in Synthese A beschrieben) in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 8,77 (2A&sub2;&sub6;&sub0; in 100 Mikroliter Puffer) zugesetzt. Man ließ die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen. In der Reaktion fiel eine erhebliche Menge an Feststoff an, der durch Filtration durch Glaswolle entfernt wurde. Das Filtrat wurde konzentriert und in 0,5 ml 1 M Triethylammoniumacetat (pH 6,8) aufgelöst. Dann wurde die Reaktionsmischung wie in Synthese A beschrieben einer Chromatographie unterzogen. Die markierte DNS wies alle spektralen und elektrophoretischen Eigenschaften auf, die bereits für das in Synthese A hergestellte Material erörtert wurden.
    • Beispiel 50 Elektrisch erzeugte chemische Lumineszenzeigenschaften von markierter DNS
  • Die markierte DNS-Probe aus Beispiel 49, Synthese A (MBI 38-Verbindung I) wurde dazu verwendet, ihre Eigenschaften in bezug auf elektrochemische Lumineszenz zu studieren. Verschiedene Konzentrationen an markierter DNS wurden in 0,5 ml 0,1 m Phosphatpuffer, pH 4,2, der 0,1 m Citrat, 25 mM Oxalat und 1,0% Triton X-100 enthielt, aufgelöst und auf einem modifizierten Lumineszenzmeßgerät von Berthold gemessen. Fig. 8 zeigt das Ansprechen des elektrochemischen Lumineszenzsignals auf verschiedene DNS-Konzentrationen.
    • Beispiel 51 Hybridisierungsstudien eines mit der Verbindung I markierten Oligonucleotids
  • Der komplementäre Strang zu der in Beispiel 38 beschriebenen 38 mer wurde unter Verwendung des DNS- Syntheseapparates ABI-Modell 380 B synthetisiert und wurde mit MGEN-38 bezeichnet.
  • Um festzustellen, ob die kovalente Anbindung der Verbindung an das Oligonucleotid die Hybridisierungseigenschaften des MBI 38-Oligonucleotids beeinträchtigte, wurde folgendes Experiment entwickelt. Verschiedene Konzentrationen des Zielfragments (MGEN-38) wurden auf eine Bahn aus Gelman RP Nylonmembran aufgetupft, fixiert und entweder mit MBI 38 oder MBI 38-Verbindung I untersucht. Beide Fragmente wurden mit T4-Polynucleotidkinase und γ-32P[ATP] behandelt und mit ³²P am 5'- Ende markiert. Dann verglich man die Hybridisierungsempfindlichkeit von DNS und DNS, die mit der Verbindung I markiert worden war.
  • Konzentrationen von MGEN-38 DNA, die von 50 ng bis zu 0,05 ng reichten, wurden auf eine Nylonmembran geblottet und an der Luft trocknen gelassen. Doppelte Membranen wurden vorbereitet. Die Blots wurden jeweils zwei Minuten in folgenden Substanzen behandelt: 1,5 M NaCl- 0,5 M NaOH, um die DNS vollständig zu denaturieren; 1,5 M, NaCl-0,5 M TRIS, um den Blot zu neutralisieren, und schließlich in 2 · SSC. Der Blot wurde 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken.
  • Die Hybridisierungsprobe wurde wie folgt zubereitet: 3 Mikrogramm MBI 38 und MBI 38-Verbindung I wurden mit 10 Einheiten T4-Kinase und 125 Mikrocuries γ32P-ATP kinasiert. Der Prozentsatz der Isotopeninkorporierung in die DNS wurde festgestellt und ist nachstehend aufgeführt.
  • Gesamtanzahl von MBI 38 4,1 · 10&sup6; cpm/ul
  • inkorporierte Anzahl 3,1 · 10&sup5; cpm/ul
  • % Inkorporierung = 75,6%
  • Gesamtanzahl von MBI 38-Verbindung I 3,2 · 10&sup6; cpm/ul
  • inkorporierte Anzahl 2,6 · 10&sup5; cpm/ul
  • % Inkorporierung = 81,2%
  • Die Lösungen für die Vorhybridisierung und die Hybridisierung wurden wie bei Maniatis (24) hergestellt. Die Blots wurden bei 53ºC 4 Stunden mit 50 Mikrogramm/ml Kalbsthymus-DNS vorhybridisiert. Die Blots wurden dann in eine Hybridisierungslösung gelegt, die die jeweiligen Proben bei 10.000.000 cpm enthielten, und über Nacht (12 Stunden) bei 53ºC hybridisieren gelassen. An folgenden Tag wurden die Blots wie folgt gewaschen:
  • - zweimal je 15 Minuten mit 2 · SSC + 0,1% SDS bei 53ºC
  • - zweimal mit 0,2 · SSC + 0,1% SDS (wie vorstehend)
  • - zweimal mit 0,16 · SSC + 0,1% SDS (wie vorstehend)
  • Die Blots wurden dann an der Luft getrocknet und bei -70ºC der Einwirkung eines Kodak X-omat(R)-Films ausgesetzt.
  • Die Analyse der Röntgenbilder (siehe Fig. 9) zeigte, daß zwischen den Proben aus MBI 38 und MBI 38-Verbindung I sehr ähnliche Hybridisierungsprozesse zu beobachten waren. In beiden Fällen war die Hybridisierung der Probe bis auf 0,5 ng des Targets zu beobachten; schwache Spuren an Hybridisierung der Probe wurden auch für bis zu 0,05 ng der Target-DNS beobachtet. Keine Hybridisierungsaktivität der Probe war für die negative Kontroll-DNS nachzuweisen (Phage-λ-DNS, betupft bei 50 ng).
    • Beispiel 52 Spezifizitätsstudie über die Hybridisierung einer mit Verbindung I markierten DNS-Probe
  • Genome DNS aus verschiedenen E. coli und non-E. Coli Stämmen wurde nach von Maniatis (24) beschriebenen Verfahren isoliert.
  • E. coli Stamm EC8 - natürliches Isolat
  • E. coli Stamm PC1A - enteropathogener Stamm
  • E. coli Stamm 10HO7 - enterotoxigener Stamm
  • E. coli Stamm EC50 - natürliches Isolat
  • E. coli Stamm B - Laborstamm
  • E. coli Stamm K12 - Laborstamm
  • Enterobacter aerogenes
  • Citrobacter freundii
  • Salmonella paratyphi B
  • Salmonella potsdam
  • DNS aus den vorstehend aufgeführten Stämmen wurde in aliquoten Teilen von 3 Mikrogramm jeweils auf eine Gelman RP Nylonmenbran und auf eine S & S Nitrocellulosemembran aufgetupft. Als negative Kontrolle wurden 50 ng Phage-λ-DNS aufgetupft. Die positive Kontrolle bestand aus verschiedenen Konzentrationen des Komplementärstammes, MGEN-38, die von 50 ng bis zu 0,5 ng reichten. Die Blots wurden wir in Beispiel 51 beschrieben hergestellt und behandelt.
  • Die Probe-DNS bestand aus 3,0 Mikrogramm des Fragments aus MBI 38 und der Verbindung I, das mit 125 Mikrocuries γ³²P-ATP mit T4 kinasiert wurde, um Radioaktivität zu inkorporieren. Die folgende Menge an Radioaktivität wurde inkorporiert:
  • Gesamtanzahl MBI 38 - Verbindung 1 -3,35 · 10&sup6; cpm/ul
  • inkorporierte Anzahl -1,50 · 10&sup6; cpm/ul
  • % Inkorporierung = 44,7%
  • Für diesen Test wurden 2.600.000 cpm Aktivität zur Untersuchung jedes Filters aufgewendet. Die Hybridisierungslösungen, Bedingungen, Waschlösungen und Protokolle waren die gleichen wie für Beispiel 51 beschrieben.
  • Der Röntgenfilm des Blots (Fig. 10) zeigt, daß sowohl die positiven als auch die negativen Kontrollen entsprechend reagierten. Keine Hybridisierungsaktivität war für λ-DNS (50 ng) und starke Hybridisierung für die Komplementärsequenz, MGEN-38, bis zu einer Konzentration von 0,5 ng zu beobachten. Diese Erkenntnisse stimmen vollständig mit den Ergebnissen der Sensibilitätsstudie überein.
    • Beispiel 53 Herstellung von 2,2'-Bipyridiniumhexachlorosmat (VI)
  • 1,01 g Ammoniumhexachlorosmat (VI), (NH&sub4;)&sub2;OsCl&sub6; (Alfa) (1,00 Äquivalent) wurden bei 70ºC in 50 ml 3N HCl (aq) aufgelöst. In die heiße gerührte Lösung gab man tropfenweise eine Lösung aus 2,2-Bipyridin in 3N HCl (aq). Ein rotes Salz
  • (nachstehend (bpyH&sub2;²&spplus;)OsCl&sub6;²&supmin;) mit einem Molekulargewicht von 562,2 g/Mol fiel aus der Lösung aus.
  • Die Ausfällung wurde dadurch zum Abschluß gebracht, daß man die Lösung 2 Stunden bei 0ºC in einem Eisbad kühlte. Das Produkt wurde durch Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter gesammelt. Der Niederschlag wurde nacheinander mit 5 bis 10 ml Portionen eiskaltem 3N HCl (aq) und Wasser gewaschen. Nach einer letzten Wäsche mit 20 ml wasserfreiem Diethylether wurde das Produkt 48 Stunden bei 70ºC unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute waren 1,01 g eines orangefarbenen Pulvers (78% bezogen auf (NH&sub4;)&sub2;OsCl&sub6;. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel 54 Herstellung von 2,2'-Bipyridintetrachlorosmat (VI)
  • 0,9 g (1,60 mMol) des in Beispiel 51 hergestellten (bpyH&sub2;²&spplus;)OsCl&sub6;²&supmin;Salzes wurden in ein Pyrex-Teströhrchen abgewogen. Das Teströhrchen wurde in einen Pyrex-Rohrofen mit einer Zuleitung und einem Auslaß für Argon und einem Thermometer (bis maximal 400ºC) gelegt.
  • Die gesamte Anordnung wurde in einen Rohrofen gelegt und mit Argon gespült. Der Ofen wurde aktiviert und auf eine Temperatur von 270 bis 300ºC gebracht. Während der ganzen Reaktion wurde ein langsamer Argonstrom durch das Rohr geleitet. Der Argonauslaß wurde in die Dampfhaube entlüftet, um während der Reaktion erzeugtes HCl aus dem Labor zu entfernen. Als sich die Temperatur 270ºC näherte, begann die Pyrolyse des Reaktanten. Es war zu beobachten, daß sich aus dem Feststoff HCl-Gas entwickelte. 30 Minuten lang war eine starke HCl-Entwicklung zu beobachten, die dann allmählich nachließ. Nach sechs Stunden wurde der Ofen abgeschaltet und die Probe auf Raumtemperatur gekühlt. Das Produkt (bpy)- OsCl&sub4;, ein fein zerteilter rotbrauner Feststoff, wurde durch Suspendieren für 12 Stunden in einer gerührten 3N HCl (aq) Lösung und anschließendes Suspendieren für sechs Stunden in gerührtem wasserfreiem Diethylether gereinigt. Die Isolierung des Produkts durch Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter ergab 0,75 g (95%) Ausbeute an 2,2-Bipyridintetrachlorosmat (VI), nachstehend (bpy)OsCl&sub4; (Molekulargewicht 489,3 g/Mol).
  • Das Produkt wurde ohne zusätzliche Reinigung verwendet.
    • Beispiel 55 Herstellung von cis-(2,2'-Bipyridin)[cis-bis(1,2-diphenylphosphino)ethylen]dichlorosmium (II)
  • In einem 50 ml Rundbodenkolben mit einem Rührstab und einem Rückflußkondensator wurden 230 mg (0,47 mMol) (bpy)OsCl&sub4; wie in Beispiel 52 hergestellt und 465 mg (1,17 mMol) cis-Bis(1,2-diphenylphosphino)ethylen (EPPen) eingebracht. Man gab 25 ml Diethylenglykoldimethylether zu und hielt den Inhalt unter einer Argonatmosphäre 5 Stunden am Rückfluß. Die dunkelgrünschwarze Lösung wurde unter einer Argonatmosphäre auf Raumtemperatur gekühlt und in einen 200 ml Becher umgefüllt. Bei Zugabe von 80 ml wasserfreiem Diethylether entstand ein dunkelgrüner Niederschlag. Der Niederschlag wurde durch Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter (mittlere Porosität) gesammelt und fünfmal mit je 20 ml wasserfreiem Diethylether gewaschen. Dann wurde der Niederschlag in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst, wobei eine tannengrüne Lösung entstand. Man ließ die Lösung durch die Schwerkraft durch einen Glasfrittenfilter (mittlerer Porosität) in etwa 30 ml gerührten wasserfreien Diethylether tropfen. Es kam zum Ausfall des graugrünen cis-(2,2'-Bipyridin)[cis-bis- (1,2-diphenylphosphino)ethylendichlorosmium(II)-Komplexes, nachstehend cis-(bpy)(DPPen)OsCl&sub2;. Der Komplex wurde durch Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter (mittlere Porosität) gesammelt. Das Produkt wurde rasch mit 20 ml kaltem 1 : 2 v/v Ethanol/Wasser und dann siebenmal mit je 30 ml Diethylether gewaschen. Das schiefergraue Pulver wurde über Nacht in einem Vakuumexsikkator über CaSO&sub4; getrocknet.
  • Ausbeute: 240 mg (63% bezogen auf (bpy)OsCl&sub4;; Molekulargewicht 814,4 g/Mol. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel 56 Herstellung von (2,2'-Bipyridin)[cis-bis(1,2- diphenylphosphino)lethylen{2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'yl)propyl]1,3-dioxolan}osmium(II)-dichlorid
  • In einen mit einem Rührstab und einem Rückflußkondensator ausgerüsteten 100 ml Rundbodenkolben gab man 129 mg (0,158 mMol) wie in Beispiel 53 hergestelltes cis-(bpy))(DPPene)OsCl&sub2; und 0,3 g (1,0 mMol) 2-[3-(4- Methyl-2,2-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolan, d. h. bpy-Oxal. Dazu gab man 15 ml Ethylenglykol. Die Suspension wurde 3 Stunden unter einer Argonatmosphäre am Rückfluß gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur gab man 10 ml H&sub2;O zum Kolbeninhalt.
  • Eine Kolonne (30 cm Höhe · 19 mm Innendurchmesser) aus Sp-Sephadex C-25 Ionenaustauschharz in Wasser wurde hergestellt. Der Inhalt des Reaktionskolbens wurde in die Säule eingegeben. Die Säule wurde mit H&sub2;O (ungefähr 500 ml) eluiert, um Ethylenglykol und überschüssigen bpy-Oxalliganden zu entfernen. Durch die Elution mit 0,25 NaCl (aq) Lösung wurde ein kleiner hellgelber Substanzbereich (orangefarbene Fluoreszenz unter langwelligem UV-Licht) und anschließend ein nicht lumineszierender olivgrüner Substanzbereich abgetrennt. Diese Substanzbereiche stellten Nebenprodukte der Reaktion dar. Man versuchte nicht, sie zu identifizieren, sondern verwarf sie. Sobald diese Substanzbereiche aus der Kolonne entfernt worden waren, begann man mit der Elution. Es wurden drei Substanzbereiche eluiert. Als erstes wurde ein orangefarbener Substanzbereich mit oranger Lumineszenz als Chloridsalz der erwünschten Produktkomponente, (2,2'-Bipyridin)[cis-bis(1,2- diphenylphosphino)ethylen{2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'yl)propyl]1,3-dioxolan}osmium(II), nachstehend (bpy)(DPPen)(byp-Oxal)Os(II)²&spplus;, identifiziert. Er ließ sich sauber von einem daran hängenden gelben Substanzbereich (grüne Lumineszenz) und braunen Substanzbereich (nicht lumineszierend) trennen.
  • Das Volumen der Lösung in der Fraktion (etwa 400 ml), die das (bpy)(DPPen)(byp-Oxal)Os(II)²&spplus; enthielt, wurde durch Verdampfen auf einem Rotationsverdampfer auf etwa 50 ml verringert. Das wäßrige NaCl-Konzentrat wurde dann mit 3 50 ml-Portionen CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Extrakte wurden kombiniert, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und durch Faltenfilterpapier schwerkraftfiltriert. Die rote CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung wurde durch Verdampfen auf einem Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 10 ml konzentriert. Dar Komplex wurde als orangefarbener Feststoff isoliert, indem man die CH&sub2;- Cl&sub2;-Lösung langsam in 200 ml gut gerührten Petroleumether tropfen lieb. Der ausgefähte Komplex wurde durch Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter (mittlere Porosität) gesammelt. Das Produkt wurde dreimal mit je 15 ml Diethylether gewaschen und dann über Nacht über CaSO&sub4; im Vakuumexsikkator getrocknet.
  • Ausbeute: 110 mg (bpy)(DPPen)(byp-Oxal)Os(II)²&spplus;(Cl&supmin;)&sub2; · 2H&sub2;O (63% bezogen auf cis-(bpy)(DPPen)OsCl&sub2;).
  • Das Produkt ist ein Dihydrat und analytisch rein: C&sub5;&sub7;H&sub5;&sub4;N&sub4;O&sub4;P&sub2;Cl&sub2;Os·2H&sub2;O (Molekulargewicht = 1109,59 mg/Mol)
  • Theorie: C 55,20%, H 4,87%, N 5,05%, O 5,77%, Cl 6,39%.
  • Gefunden C 56,03%, H 5,18%, N 4,88%, O 6,87%, Cl 7,07%.
    • Beispiel 57 Herstellung von cis-Dichlor-bis-[4,4'-carbomethoxy)- 2,2'-bipyridin]ruthentum (II)
  • In einen 250 ml Rundbodenkolben mit Rührstab und Rückflußkondensator gab man 750 mg (1,55 mMol) cis-Tetra- (dimethylsulfoxid)dichlorruthenium(II) (Ru(DMSO)&sub4;Cl&sub2;) und 100 ml Ethylenglykol. Der Kolbeninhalt wurde unter einer Argonatmosphäre sanft zum Sieden gebracht und mit 756 mg (3,09 mMol) (4,4'-Carbomethoxy)-2,2'-bipyridin versetzt. Unter Argon wurde weitere 5 Minuten erhitzt. Die orangefarbene Lösung wurde braunschwarz. Dazu gab man 0,75 g Lithiumchlorid und 50 ml Ethylenglykol. Die Lösung wurde weitere 10 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden der Mischung etwa 100 ml H&sub2;O zugesetzt. Die Mischung wurde fünfmal mit je 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert.
  • Die CH&sub2;Cl&sub2;-Extrakte wurden sechsmal mit je 200 ml Wasser gewaschen. Die Wasserschichten wurden nach jeder Wäsche auf Fluoreszenz (rot) getestet. Die Wäschen wurden so lange fortgesetzt, bis keine Fluoreszenz in dar wäßrigen Schicht nachweisbar war. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Extrakte wurden über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Produkt wurde durch Verdampfen der CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung in einen gerührten Überschuß (10faches Volumen) von wasserfreiem Diethylether isoliert. Das ausgefällte Produkt wurde durch Saugfiltration gesammelt, einmal mit 30 ml Diethylether gewaschen und über Nacht in einem Vakuumexsikkator über CaSO&sub4; getrocknet. Ausbeute: 25% metallisch-grüne Kristalle.
  • Das Produkt ist analytisch rein.
  • Theorie: C 44,57; H 4,01; N 7,43; Cl 9,40, O 21, 21
  • Gefunden: C 44,16; H 3,72; N 7,11; Cl 9,53; O 20,15
  • Molekulargewicht 754,5 g/Mol
    • Beispiel 58 Herstellung von Bis[(4,4'-carbomethoxy)-2,2'bipyridin]- 2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolanruthenium(II)-diperchlorat
  • 250 mg Bis(4,4'-dicarbomethoxy-2,2'-bipyridin)ruthenium(II)-dichlorid (0,33 mMol) in 50 ml Methanol/Wasser (1 : 1) wurden 105 mg (0,37 mMol) 2-[3-(4-Methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolan (bpy- Oxal) zugegeben und die Mischung unter einer Argonatmosphäre 12 Stunden am Rückfluß gehalten. Die Lösung wurde abgekühlt und mit 0,5 ml 70%igem HClO&sub4; versetzt. Das Methanol wurde langsam verdampft. Rote Kristalle fielen aus und wurden in einem mit Fritte versehenen Trichter gesammelt, mit einer kleinen Menge kaltem Wasser und anschließend Ethanol und Ether gewaschen und bis zum Vakuum getrocknet. Ähnliche Verfahren wurden verwendet, um Komplexe aus Bis(4,4'-dicarbomethoxy- 2,2'-bipyridin)ruthenium(II)-dichlorid und entweder 4- (4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)buttersäure oder 4,4'- Methyl-2,2'-bipyridin herzustellen.
    • Beispiel 59 Markierung von menschlichem IgG mit der Verbindung I
  • 2 ml menschliches IgG (2,5 mg/ml) wurden über Nacht unter leichtem Rühren bei 4ºC gegen 2 l Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6, dialysiert. Die Verbindung I wurde in einem Überschub von 100 Mol zum vorhandenen Protein (2,7 mg/100 Mikroliter Dimethylformamid) hergestellt und langsam aufgelöst. Das dialysierte Protein wurde bei Raumtemperatur über 2 Stunden unter leichtem Rühren tropfenweise zu dem Markierungsaldehyd gegeben. Ein Überschuß von 100 Mol Natriumborhydrid (zum Protein) (100 Mikroliter einer 1,24 mg/ml Lösung in entionisiertem Wasser wurde der Lösung zugesetzt und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur sanft gerührt. Das Konjugat wurde in eine Sephadex G-25 Kolonne (1,0 cm · 18,0 cm) eingebracht, die bei Raumtemperatur mit 0,2 m Tris, pH 8,0 ins. Gleichgewicht gebracht worden war, und das Eluat bei 280 nm überwacht. Der Volumenpeak wurde gesammelt, zusammengefaßt und gegen 2 Liter des Tris-Puffers dialysiert. Das Konjugat wurde durch Standard ELISA- Verfahren auf immunologische Aktivität getestet und bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.
    • Beispiel 60 Herstellung von Teilchen aus Biomag(R)/anti-Mensch IgG von der Ziege
  • Ein aliquoter Teil von 2,5 ml Teilchen mit endständigen Gruppen aus 5% Biomag(R)-Amin (Advanced Magnetics, Cambridge, MA) wurde in einen sauberen T-Kolben gefüllt und fünfmal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Der nasse Kuchen wurde in 12,5 ml 5%igem frischen Glutaraldehyd (Sigma) erneut suspendiert und bei Umgebungstemperaturen drei Stunden immer wieder über Kopf rotiert. Der nasse Kuchen wurde in einen zweiten T-Kolben umgefüllt und dreimal mit PBS gewaschen. Die aktivierten Teilchen wurden erneut mit PBS aus 12,5 ml suspendiert und in ein 15 ml Zentrifugenrohr umgefüllt. Dieser Suspension gab man 12,5 mg anti-Human-IgG von der Ziege (H + L) (Jackson Laboratories) in 2 ml PBS zu. Das Röhrchen wurde drei Stunden bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4ºC über Kopf rotiert. Am nächsten Tag wurden die Teilchen zweimal mit PBS gewaschen, die 1% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, und bis zur Verwendung bei 4ºC in 12,5 ml PBS gelagert, die 0,1% BSA enthielt.
    • Beispiel 61 Pseudo-homogener Test auf der Basis von elektrochemischer Lumineszenz von menschlichem IgG unter Verwendung des Tests auf der Basis von Biomag(R) magnetischen Teilchen
  • Ein Konjugat aus der Verbindung I und menschlichem IgG wurde 1 zu 50 in 0,15 M Phosphatpuffer verdünnt, der 0,1% BSA enthielt, und bei 250 Mikroliter/Röhrchen aliquot gestellt. 150 Mikroliter Verdünner (PB mit BSA wie vorstehend) wurden pro Röhrchen zugesetzt. Anschließend gab man entweder verschiedene Verdünnungen des Analyten (menschliches IgG) oder Verdünner (negative Kontrollen) zu. Außerdem wurde in einigen Röhrchen ein nichtspezifischer Analyt (anti-Kaninchen IgG von der Ziege) verwendet, um die Spezifizität des Tests zu überprüfen. 50 Mikroliter von mit anti-Human-IgG von der Ziege (H & L) gekoppeltem 1%igem Biomag(R) wurden jedem Röhrchen zugesetzt. Der Inhalt der Röhrchen wurde auf einer Wirbelvorrichtung vermischt und 15 Minuten unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur bebrütet. Die Teilchen wurden magnetisch aus der Lösung entfernt und 100 Mikroliter des entstehenden Überstandes wurden in ein Berthold-Rohr umgefüllt, dem 400 Mikroliter einer Lösung aus Citrat-Oxalat-Triton X-100 zugesetzt wurden. Der Inhalt des Rohrs wurde auf einer Wirbelvorrichtung vermischt und auf einem modifizierten Gerät zur Messung der Lumineszenz von Berthold abgelesen, das mit einem R-268 SEV-Rohr und einer kreisförmigen Elektrode von 0,29 inch Durchmesser aus Doppelmaschen aus 52er Platin ausgestattet war. Diese befand sich auf einer mit einem leitfähigem Anstrich bedeckten Polycarbonatunterlage und war durch einen Kontakt aus Platindraht und Silberanstrich mit einem Durchmesser von 0,01 inch mit einer Spannungsquelle verbunden. Die angelegte Spannung wurde von +1,4 auf +2,15 V erhöht, während man eine 10-Sekunden-Integration vornahm. Zwischen den einzelnen Ablesungen wurde die Elektrode elektrochemisch gereinigt, indem man sie in entionisiertem Wasser spülte, sie dann in 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer tauchte, der Oxalsäure und Triton X-100 enthielt, und die angelegte Spannung über 2 Minuten und 20 Sekunden von -2,2 auf +2,2 V steigerte (wobei man 3 Sekunden auf jedem Spannungswert verweilte) und anschließend die Spannung 10 Sekunden bei +2,2 V hielt. Die Elektrode wurde aus der Reinigungslösung entnommen, mit entionisiertem Wasser gespült und mit einem absorptionsfähigen Wischtuch trockengetupft. Bei diesem Format war das Signal der elektrochemischen Lumineszenz direkt proportional zur Analytkonzentration.
    • Beispiel 62 Herstellung von Bis(2,2'-bipyridin)maleinimidhexansäure, 4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamidruthenium(II)-diperchlorat: Verbindung IV
  • 4-[4-(1-Aminobutyl)]-4'-methyl-2,2'-bipyridin, das wie in Beispiel 30 beschrieben aus 500 mg (1,35 · 10&supmin;³ Mol Phthalimid) hergestellt worden war, wurde in 5 ml trockenem Pyridin mit 0,313 g (1,48 · 10&supmin;³ Mol) Maleinimidhexansäure und 0,306 g (1,48 · 10&supmin;³ Mol) DCC aufgelöst. Nach dem man die Mischung über Nacht stehengelassen hatte, wurde der Dicycloharnstoff abfiltriert und das Pyridin unter Vakuum abgetrieben. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (Aluminiumoxid mit Aktivität II, 5% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;) gereinigt und ergab das gereinigte Produkt. Ausbeute: 0,56 g (95%).
  • 100 mg (2,3 · 10&supmin;&sup4; Mol) Maleinimidhexansäure,4-Methyl- 2,2'-bipyridin-4'-butylamid und 100 mg (2,06 · 10&supmin;&sup4; Mol) Bis-(2,2'-bipyridin)rutheniumdichloriddihydrat wurden in 50 ml Ethanol/Wasser (1 : 1) aufgelöst, mit Argon entgast und 4 Stunden am Rückfluß gehalten. Die entstehende klare orangefarbene Lösung wurde mit 25 ml festem NaClO&sub4;, 25 Ml Ethanol und 25 ml Aceton verdünnt und unter Vakuum langsam verdampft. Als sie trocken war, wurden weitere 25 ml Wasser und 25 ml Aceton zugesetzt und die Lösung auf etwa 15 bis 20 ml rotationsverdampft. Der ausgefällte Feststoff wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Probe wurde durch präparative TLC auf Aluminiumoxid unter Verwendung von Methanol und Chloroform im Verhältnis 1 : 9 gereinigt. Der am schnellsten laufende Substanzbereich wurde dadurch isoliert, daß man ihn von der Platte schabte und die Verbindung durch Rühren in Methanol und Chloroform (1 : 1) eluierte. Nach der Filtration zur Entfernung des Aluminiumoxids wurde die orangefarbene Lösung bis zur Trockenheit verdampft und ergab 86,7 mg gereinigte Verbindung (72%). Die Struktur wurde durch NMR bestätigt.
    • Beispiel 63 Markieren von hCG-Peptid mit der Verbindung IV
  • 2 mg menschliches choriales Gonadotropin (hCG) Peptid (#109-145, JP141, Vernon Stevens, Ohio State University) wurden in 10 ml 0,15 M Citratpuffer, pH 6,0, suspendiert, und 1,13 mg der Verbindung IV wurden in 300 Mikrolitern Dimethylformamid aufgelöst. Die Peptidlösung wurde der Lösung aus der Verbindung IV über den Zeitraum von einer Minute tropfenweise zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang leicht gerührt. Dann wurde die Probe in eine Bio-Gel P-2 Kolonne (Bio-Rad; 1 cm · 45 cm) eingebracht, die bei Raumtemperatur mit 0,2 M Tris-Base, pH 8,5, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Fließgeschwindigkeit betrug 15 ml/h, und das Eluat wurde bei 280 nm überwacht. Das Nettovolumen des Durchlaufs wurde gesammelt, zusammengefaßt und in eine QAE-Sephadex A-25 Kolonne (Pharmacia; 1 cm · 10 cm) eingebracht, die bei Raumtemperatur mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Dies erfolgte, um unmarkierte Peptide zu entfernen. (Diese werden an das positiv geladene Harz adsorbiert; die positive Ladung des markierten Peptids ließ es ohne weitere Behandlung aus der Säule austreten.) Das Eluat wurde bei 280 nm überwacht. Der erste Hauptpeak wurde gesammelt, zusammengefaßt und durch Lyophilisierung konzentriert. Die getrocknete Verbindung wurde in einem minimalen Volumen PFB erneut suspendiert. Das Konjugat aus hCG-Peptid und der Verbindung IV wurde bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.
    • Beispiel 64 Reinigung von anti-hCG-Peptid vom Kaninchen durch DEAE AFFI-Gel Blue Chromatographie
  • 4 ml DEAE AFFI Gel Blue (Bio-Rad) wurde in eine Chromatographiekolonne (1 cm · 10 Kolonnengröße) eingefüllt und bei Raumtemperatur mit 0,2 M Tris-HCl, welches 0,028 M NaCl, pH 8,0, enthielt, 1 Stunde bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/h ins Gleichgewicht gebracht. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 20 ml/h verringert. Dann brachte man 1 ml anti-hCG-Peptid vom Kaninchen (anti 109-145, Vernon Stevens, Ohio State University), das gegen den Kolonnenpuffer vordialysiert worden war, in die Säule ein. Man sammelte Fraktionen von 1 ml und überwachte das Eluat bei 280 nm. Der Volumen-Peak wurde gesammelt, aus mehreren Durchläufen zusammengefaßt und dadurch konzentriert, daß man das Eluat in einen 12 K MWCO Dialysesack einbracht, der von Polyethylenglykol 6,000 (Sigma) umgeben war. Der Antikörper wurde mit Standard ELISA Techniken auf Immunreaktivität und mit HPLC auf Reinheit getestet. Es zeigte sich ein Haupt-Peak, was auf eine reine, aktive Zubereitung hindeutet.
    • Beispiel 65 Titration eines Konjugats aus hCG Peptid und der Verbindung IV gegen gereinigtes anti-hCG-Peptid vom Kaninchen: Modulation des elektrochemischen Lumineszenzsignals
  • Ein Konjugat aus hCG-Peptid und der Verbindung IV wurde in 0,1 M Phosphatpuffer, der 0,1 M Citrat enthielt, pH 6,2, verdünnt. Aliquote Teile dieser Mischung wurden in Mikrozentrifugenrohre eingebracht. Der zuvor gereinigte anti-Peptidantikörper wurde auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und in die Röhrchen gegeben, die auf einer Wirbelvorrichtung vermischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur bebrütet wurden. Kurz vor dem Ablesen der elektrochemischen Lumineszenz wurde ein aliquoter Teil in ein Berthold-Rohr umgefüllt, dem man Oxalsäure und Triton X-100 (Sigma) zusetzte. Der Inhalt der Röhrchen wurde auf einer Wirbelvorrichtung vermischt und unter Verwendung des Sweep-Modus (+1,5 bis 2,5 V bei 50 mV/sec) gelesen. Dabei wurde dreimal gescannt und die Peak-Höhe des zweiten Scans als Wert genommen. Auch hier verwendete man ein Gerät von Berthold zur Messung der Lumineszenz, welches ein R-268 SEV-Rohr mit einer Elektrode aus doppelten Platinmaschen aufwies. Zwischen den Ablesungen wurde die Elektrode elektrochemisch gereinigt, indem man sie zuerst mit entionisiertem Wasser spülte und sie dann in 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer, pH 6,1, tauchte, der 25 mM Oxalat und 1% Triton-100 enthielt. Die angelegte Spannung wurde mit 3 Sekunden auf jedem Wert zwischen +2,2 und -2,2 V über 1 Minute und 50 Sekunden umgeschaltet und dann 10 Sekunden bei +2,2 V gehalten. Dann wurde der Strom abgeschaltet, die Elektrode aus der Reinigungslösung genommen, mit entionisiertem Wasser gespült und mit absorptionsfähigen Tüchern trockengeblottet.
  • Die Ergebnisse zeigten einen allgemeinen Trend, bei dem das Signal der elektrochemischen Lumineszenz direkt proportional zur Antikörperkonzentration im Peptid war. Dies steht im Gegensatz zu den anderen Experimenten, bei denen das Signal der elektrochemischen Lumineszenz abfällt, wenn der mit elektrochemischer Lumineszenz markierte Analyt mit Antikörper in Kontakt kommt.
    • Beispiel 66 Leistungen des elektrochemischen Lumineszenzsignals: Stabilitätsdaten des Konjugats aus Ru(II) und der Verbindung III
  • Das Konjugat aus Ru(II) und der Verbindung III wurde in 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer, pH 6,1, entweder mit oder ohne 1%iges normales menschliches Serum (NHS) verdünnt, Von jedem Puffertyp wurde einer bei 4, 20, 37 und 55ºC bebrütet. An den Inkubationstagen 3, 4 und 5 wurden Proben entnommen. Die Proben wurden bei Raumtemperatur ins Gleichgewicht gebracht und auf die Leistung ihres elektrochemischen Lumineszenzsignals untersucht. 400 Mikroliter der Probe wurden mit 100 Mikrolitern 125 mM Oxalsäure-5% Triton X-100 in einem Röhrchen vermischt und in ein modifiziertes Gerät von Berthold zur Messung der elektrochemischen Lumineszenz mit einem Hamamatsu R-268 SEV-Rohr und einer Elektrode aus doppelmaschiger Platingaze gelegt. Die Ablesung erfolgte dadurch, daß man die angelegte Spannung von mit 50 mV/sec über drei Zyklen von +1,5 bis +2,5 V führte. Die Peak-Höhe des zweiten Zyklus wurde aufgezeichnet und in Zähler der elektrochemischen Lumineszenz umgewandelt. Zwischen den Ablesungen wurde die Elektrode elektrochemisch gereinigt, indem man sie in 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer, der 25 mM Oxalat und 1% Triton X-100 enthielt, tauchte und die Spannung über 1 Minute und 50 Sekunden von -2,2 bis +2,2 V pulsieren ließ und 3 Sekunden auf jedem Wert verharrte. Man hielt die Spannung 10 Sekunden auf +2,2 V und nahm sie dann weg. Die Elektrode wurde aus der Reinigungslösung genommen, mit entionisiertem Wasser gespült und mit absorptionsfähigen Tüchern trockengetupft. Die Ergebnisse zeigen, daß es im Verlauf der Studie in jedem Puffertyp ein beständiges Signal gab. Dies weist auf die Stabilität des Reagenz und seine Fähigkeit zur Erzeugung eines elektrochemischen Lumineszenzsignals hin.
    • Beispiel 67 Test der Immunreaktivität eines Konjugrats aus Ru(II und der Verbindung III: Stabilitätsstudien
  • Das Konjugat aus Ru(II) und der Verbindung III wurde unter den in Beispiel 64 beschriebenen Bedingungen verdünnt und bebrütet. An Tag 3, 4 und 5 entnahm man Proben, kühlte sie auf Raumtemperatur ab und testete sie mittels PCFIA (fluoreszierender Immuntest durch Teilchenkonzentration) unter Verwendung einer Pandex Screen Vorrichtung von Pandex, Inc., Mundelein, IL, auf Immunreaktivität. Der PCFIA wurde in einem kompetitiven Testformat durchgeführt. Die Latexteilchen (Pandex) wurden mit Theophyllin-BSA konjugiert. Eine konstante Menge dieser Teilchen wurde mit der Testlösung aus dem Konjugat aus Ru(II) und der Verbindung III zu Endkonzentrationen von anti-Theophyllin monoklonalen Antikörper (Aszites, Hyclone Katalog-Nr. E-312OM, Partie Nr. RD200) und einer konstanten Menge anti-Maus-IgG- PITC-Konjugat von der Ziege (Pandex, Katalog-Nr. 33- 020-1, Partie Nr. CO1) vermischt. Nach dem Bebrüten wurden die Proben auf einem Pandex Screen-Gerät verarbeitet und abgelesen. Die Ergebnisse zeigen, daß auch nach 5 Tagen Inkubation bei 55ºC kein merklicher Verlust an Aktivität auftrat.
    • Beispiel 68 Elektrochemische Lumineszenz verschiedener Ruthenium- und Osmiumverbindungen
  • Die Elektrochemie verschiedener Osmium- und Rutheniumverbindungen wurde in Form von 1 mM Lösungen in 10 ml mit Stickstoff gespültem Acetonitril mit 0,1 m Tetrabutylammoniumtetrafluorborat als Elektrolyt gemessen. Die Arbeitselektrode war eine Platinscheibe von Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, IN. Eine Gegenelektrode aus Platindraht und ein 1,0 mm Silberdraht wurden als Bezugselektrode verwendet. Die Messungen wurden durch Scannen von -2,2 bis +2,2 V (vs. SCE) mit einer Scan-Geschwindigkeit von 100 mV/sec durchgeführt. Nach jeder elektrochemischen Messung wurde die Spannungsdifferenz zwischen einer Bezugselektrode aus gesättigtem Kalomel (SCE) und dem Silberdraht festgestellt. Somit sind die angegebenen Werte auf die Spannung gegenüber SCE korrigiert.
  • Die Messungen der elektrochemischen Lumineszenz (ECL) wurden in 0,5 ml wäßrigen Lösungen durchgeführt, die 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer (pH 4,2), 25 mM Oxalsäure und 1% Triton X-100 enthielten. Das verwendete Elektrodensystem bestand aus zwei Elektroden aus 52er Platingaze, die durch einen 0,1 mm Platindraht an eine Transistorbuchse von Radio Shack (Nr. 275-548) angeschlossen war. Die Elektroden wurden außen an einem 50 mm dicken Stück Celluloseacetatkunststoff befestigt. Der Kunststoff wurde maschinell so bearbeitet, daß ein Loch mit 6,35 mm (1/4 inch) Durchmesser die Lösung auf einfache Weise zwischen der Arbeits und der Gegen- Bezugselektrode fließen ließ. Die Elektroden wurden so an einen Potentiometer angeschlossen, daß eine Elektrode als Arbeitselektrode (die dem SEV-Rohr näher war) und die andere als Gegen- und Bezugselektrode diente. Die Messungen wurden dadurch vorgenommen, daß man einen Sweep von 1,5 bis 2,5 V (Vorspannung) mit einer Scan- Geschwindigkeit von 50 mv/sec durchführte. Die Messungen der ECL werden als Verhältnis von Signal zu Geräusch wiedergegeben, bzw. als Verhältnis von Signal zu Hintergrund für eine bestimmte Konzentration der Verbindung. Der Hintergrund wird als lumineszierende Zähler definiert, die mit Puffer und ohne Zusatz von ECL-Komponenten beobachtet werden. Die Messungen der Lumineszenz waren der Ausstoß an Peak-Licht, der während des ersten oder zweiten linearen Abtastens beobachtet wurde.
  • Die Messungen sowohl der elektrochemischen Lumineszenz (ECL) aus auch der Voltametrie jeder Lösung wurden mit entweder einem Potentiometer von EG&G, Modell 273, oder einem Bipotentiometer von Ursar Scientific Instruments, Oxford, England vorgenommen. Der Photonenfluß jeder ECL-Messung wurde mit einem Lumineszenzmeßgerät von Berthold, Biolumat LB 9500 von Wilebad, Deutschland vorgenommen. Dieser war so modifiziert, daß entweder ein Zwei- oder ein Dreielektrodensystem in die 0,5 ml Meßlösung gelegt werden konnte. Die elektrochemischen Messungen und die Messungen der elektrochemischen Lumineszenz wurden beide auf einem Aufzeichnungsgerät von Kipp & Zonen, Modell BD 91 X,Y,Y', Delft, Niederlande, vorgenommen.
  • Die Messungen der Fluoreszenz erfolgten mit 50 Mikromollösungen der erwünschten Verbindung in 3,0 ml ECL- Lösung oder, wenn sie in der ECL-Lösung nicht löslich waren, in Acetonitril. Die Messungen wurden auf einem Fluoreszenz-Spektrophotometer LS-5 von Perkin-Elmer durchgeführt. Zuerst wurden Scans der Anregungs- und der Emissionsspektren der Lösungen durchgeführt, ehe man die Anregungs- und Emissionsspektren aufzeichnete, so daß das Emissionsspektrum gemessen werden konnte, während es mit maximaler Anregungswellenlänge strahlte. Das Anregungsspektrum dagegen konnte aufgezeichnet werden, während man die maximale Emissionswellenlänge überwachte.
  • 1) (S/N) ist das Verhältnis von Signal zu Geräusch, wo das Signal als ECL-Ausstoß (Lumineszenzzähler) einer Verbindung bei einer bestimmten Konzentration definiert wird. Geräusch bedeutet die Lumineszenzzähler der Puffers, in dem die Verbindung aufgelöst wurde.
  • Im Gegensatz zur ELC der anderen Verbindungen, die bei einem pH von 4,2 gemessen wurden, zeigt die Verbindung C) auch erhebliche ECL beim physiologischen pH von 7,0.
  • a) Tris(2,2'-bipyridin)ruthenium²&spplus;
  • b) Tris(4,4'-carboxylat-2,2'-bipyridin)ruthenium²&spplus;
  • c) Tris(4,4'-carboethoxy-2,2'-bipyridin)ruthenium²&spplus;
  • d) Bis(2,2'-bipyridin)[theophyllin-8-buttersäure- 4-(4-methyl-2,2'bipyridin)4'-yl)amid]ruthenium(II)- dichlorid
  • e) [Bis(2,2'-bipyridin){monocarbonyl}pyridyl]osmium- (II)-dihexafluorphosphat
  • f) (2,2'-bipyridin)[cis-bis(1,2-diphenylphosphin)- ethylen]{2-[3-(4-methyl-2,2'bipyridin-4'yl)propyl]- 1,3-Dioxolan}osmium(II)-dichlorid.
    • Beispiel 69 Herstellung von Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'- bipyridin)butylamin]ruthenium(II)diperchlorat
  • 1,29 g (2,48 mMol) Bis-(2,2-bipyridin)ruthenium(II)- dichloriddihydrat (Strem) und 0,719 g (2,98 mMol) 4-[4- (1-Aminobutyl)]4'-methyl-2,2-bipyridin (in Beispiel 32 beschrieben) wurden in 50 ml 50/50 Ethanol/H&sub2;O suspendiert und unter Argon 3 Stunden am Rückfluß gehalten. Die Reaktionslösung wurde konzentriert und auf Sephadex C-25 chromatographisch getrennt, wobei zuerst mit destilliertem Wasser und dann mit 0,25 M NaCl eluiert wurde. Die endgültige Elution wurde mit 0,4 M NaCl durchgeführt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden auf etwa 100 ml konzentriert und mit Perchlorsäure versetzt, bis die Lösung wolkig wurde. Bei Kühlung über Nacht erhielt man rot-orange Kristalle des Produkts(1,215 g). Die Elementaranalyse bestätigte, daß es sich um folgende Struktur handelte:
    • Beispiel 70 Herstellung von Theophyllin-8-(3,3-dimethyl)buttersäure
  • 5,6-Diamino-N¹,N³-dimethyluracilhydrat (10 g, 0,059 Mol) und 3,3-Dimethylglutarsäureanhydrid (12,6 g), 8,85 · 10&supmin;² Mol) wurden in 100 ml N,N-Dimethylanilin aufgelöst und unter Verwendung einer Dean-Stark-Falle zum Rückfluß gebracht. Der Inhalt der Reaktion wurde nach dem Erhitzen flüssig und nahm eine orangerote Farbe an. Nach 4 Stunden Rückfluß hatte sich 1 ml Wasser in der Falle gesammelt, was darauf hindeutete, daß die Reaktion abgeschlossen war. Man ließ die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen, wobei die gesamte Masse fest wurde. Der Feststoff wurde auf einem Frittetrichter filtriert und gewaschen, bis er sich hellgelb färbte. Nach zwei Kristallisationen aus DMF erhielt man reinweiße Kristalle des Zwischenprodukts Lactam (Schmelzpunkt 283,1 bis 284,9ºC). Das Lactam wurde 8 Stunden in Wasser gekocht. Beim Abkühlen ergab die Lösung reinweiße Kristalle (Schmelzpunkt 218 bis 220ºC). Die Protonen-NMR und die Elementaranalyse entsprachen der folgenden Struktur:
    • Beispiel 71 Herstellung von Bis-(2,2'-bipyridin)[theophyllin-8-(3,3- dimethylbuttersäure-{4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'yl)- butyl}amid]ruthenium(II)-diperchlorat
  • 100 mg (0,34 mMol) Theophyllin-8-(3,3-dimethyl)buttersäure und 0,32 g (0,34 mMol) Bis(2,2-bipyridin)-[4-(4'- methyl-2,2-bipyridin)]butylaminruthenium(II)-diperchlorat wurden zusammen mit 0,351 g (1,7 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml trockenem Pyridin aufgelöst. Die Reaktion wurde 2 Tage gerührt. Eine erhebliche Menge an Dicyclohexylharnstoffniederschlag wurde durch Filtration entfernt; die Pyridinlösung wurde unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und auf Sephadex LH-20 chromatographiert. Bei der Konzentration der erwünschten Fraktionen wurde das Produkt aus Ether ausgefällt, um einen orangefarbenen Niederschlag zu ergeben. Die Elementaranalyse und Protonen-NMR entsprachen der Struktur:
    • Beispiel 72 Herstellung von Theophyllin-8-propyl-(4-methyl-2,2'- bipyridin-4'-butyl)carboxamid
  • 61,8 mg (1,55 · 10&supmin;&sup4; Mol) 8(γ-Aminopropyl)theophyllinphthalsäurehydrazidsalz wurden in 1 ml H&sub2;O aufgelöst und mit HCl angesäuert. Das ausgefällte Phthalsäurehydrazid wurde abfiltriert und das wäßrige Filtrat verdampft und unter Vakuum getrocknet, um 34,5 mg (1,31 · 10&supmin;&sup4; Mol) Theophyllin-8-propylaminhydrochlorid zu ergeben. Diese Substanz wurde in 5 ml trockenem Pyridin aufgelöst und mit 36,90 mg (1,44 · 10&supmin;&sup4; Mol) 4-(4- Methyl-2,2-bipyridin-4'-yl)buttersäure und 26,4 mg (2,62 · 10&supmin;&sup4; Mol) Triethylamin versetzt. Schließlich gab man 29,7 mg (1,44 · 10&supmin;&sup4; Mol) Dicyclohexylcarbodiimid zu der Lösung. Die entstehende wolkige Lösung wurde über Nacht gerührt. Das ausgefällte Salz und Dicyclohexylharndstoff wurden abfiltriert und die Lösung bis zur Trockenheit gestrippt, um einen weißen Feststoff zu ergeben. Dieser wurde auf Aluminiumoxid unter Verwendung von 5% Methanol in Dichlormethan als Elutionsmittel chromatographiert. Es ergaben sich 44,2 mg (71%) des Produkts als weißes Pulver (Schmelzpunkt 215 bis 216,5ºC). Die Protonen-NMR und die Elementaranalyse bestätigten die folgende Struktur:
    • Beispiel 73 Herstellung von Bis(2,2'-bipyridin)-[theophyllin-8- propyl(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butyl)carboxamid]ruthenium(II)-dichlorid
  • 100 mg (2,05 · 10&supmin;&sup4; Mol) Bis(2,2'-bipyridin)rutheniumdichlorid (Strem) und 108 mg (2,27 · 10&supmin;&sup4; Mol) Theophyllin-8-propyl(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'- butyl)carboxamid wurden zu 50 ml 50%igem Ethanol gegeben, das mit Argon entgast worden war. Die Lösung wurde am Rückfluß erhitzt. Die entstehende kirschrote Lösung wurde unter Hochvakuum bei Raumtemperatur konzentriert. Der Rückstand wurde auf Sephadex LH-20 (75 cm · 19 mm Innendurchmesser) unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Der Produktsubstanzbereich wurde isoliert, verdampft und in wasserfreien Ether ausgefällt. Die Produktausbeute betrug 156 mg (75%). Die Elementaranalyse zeigte das Vorhandensein von 4 Mol Methanol im Produkt.
  • Analyse:
  • Berechnet: C 54,09; H 5,56; N 14,16; O 10,29; Cl 6,52
  • Gefunden: C 53,30; H 5,22; N 14,56; O 10,63; Cl 6,95
    • Beispiel 74 Herstellung von Bis(2,2'-bipyridin)-[1-brom-4-(4'- methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan]ruthenium(II) - diperchlorat
  • 0,29 g des in Beispiel 29 hergestellten Liganden 1- Brom-4-4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan und 0,32 g Bis(2,2'-bipyridin)ruthenium(II)-dichlorid wurden in einen Kolben in 60 ml 1 : 1 v/v Ethanol/Wassermischung umgefüllt. Die Lösung wurde 15 Minuten mit Stickstoff entgast. Die Reaktion wurde am Rückfluß unter Stickstoff dreieinhalb Stunden erhitzt. Eine wäßrige gesättigte Lösung wurde der abgekühlten roten Lösung zugesetzt. Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt und der tiefrote Rückstand auf einer Aluminiumoxidkolonne (20 cm · 2,5 cm, Merck, neutrale Aktivität 3) unter Verwendung von Acetonitril und Toluol im Verhältnis 1 zu 1 als Elutionsmittel chromatographiert. Das Produkt wurde als dunkelroter Substanzbereich (Substanzbereich Nr. 2) auf der Säule eluiert. Die erwünschte Fraktion wurde konzentriert, in ungefähr 10 ml Volumen Dichlormethan wieder aufgelöst, aus wasserfreiem Ethylether ausgefällt und schließlich unter Vakuum getrocknet, um 320 mg (53%) Produkt zu ergeben. Seine Struktur wurde durch Elementaranalyse und Spektralcharakteristiken wie folgt bestätigt:
    • Beispiel 75 Herstellung von Bis(2,2'-bipyridin)-[theophyllin-9-[4- (4-methyl-2,2'-bipyridin-4'yl)butan]ruthenium(II)diperchlorat
  • Das Silbersalz von Theophyllin wurde durch Vermischen einer Ammoniaklösung von Theophyllin (2,168 g in 25 ml konz. NH&sub4;OH und 75 ml Wasser) und einer Ammoniaklösung aus Silbernitrat (2,006 g in 10 ml konz. NH&sub4;OH und 30 ml H&sub2;O) hergestellt, wobei die Reaktion im Dunklen durchgeführt wurde. Kurz nach Vermischen der beiden Lösungen bildete sich ein weißes Produkt. Nach dessen Ausfällung wurde der Niederschlag durch Filtration auf einer 60 ml Mediumglasfritte gesammelt. Der Niederschlag wurde mit verdünntem Ammoniak gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Struktur des Silbersalzes von Theophyllin wurde durch Elementaranalyse gestützt.
  • 41 mg des Silbersalzes von Theophyllin und 122 mg Bis(2,2'-bipyridin)[1-brom-4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin- 4-yl)butan]ruthenium(II)-diperchlorat wurden in 15 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) aufgelöst, wobei die Reaktion im Dunklen durchgeführt wurde. Die entstehende rote Lösung wurde mit Argon entgast und am Rückfluß 24 Stunden erhitzt. Anschließend wurde sie unter Argon auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde weiter bis zur Eistemperatur abgekühlt; dann wurde die schwarze Silbermetallsuspension abfiltriert und mit 5 ml Aceton gewaschen. Das rote Filtrat wurde mit 0,2 g Lithiumperchlorat behandelt; nach der Auflösung von LiClO&sub4; wurde die Lösung unter Vakuum verdampft und der rote Rückstand unter Vakuum über Nacht im Dunklen getrocknet. Die Probe wurde in 3 bis 5 ml Methanol wieder aufgelöst. 0,25 g wasserfreies LiClO&sub4; wurde zugesetzt und aufgelöst. Die dabei entstehende Lösung wurde auf einer Sephadex LH-20 Kolonne (75 cm · 19 cm Innendurchmesser) unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Das Hauptprodukt wurde als Fraktion Nr. 2 (dunkelroter Substanzbereich eluiert. Die Fraktion Nr. 2 wurde konzentriert, wieder in Methanol aufgelöst und in Ethylether ausgefällt. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet und ergab 80 mg (50% Ausbeute) Material, dessen Struktur durch Elementaranalyse, Infrarot und Emissonsspektren bestätigt wurde.
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Claims (51)

1. Verbindung mit der Struktur
worin n eine ganze Zahl ist.
2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin n 2 ist.
3. Verbindung mit der Struktur
worin n eine ganze Zahl ist.
4. Verwendung gemäß Anspruch 3, worin n 2 ist.
5. Verbindung mit der Struktur
worin n eine ganze Zahl ist.
6. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin n 2 ist.
7. Verbindung mit der Struktur
worin R ein Anion und n eine ganze Zahl ist.
8. Verbindung gemäß Anspruch 7, worin n 2 ist.
9. Verbindung mit der Struktur
worin R ein Anion und n eine ganze Zahl ist.
10. Verbindung gemäß Anspruch 9, worin n 2 ist.
11. Verbindung mit der Struktur
worin R ein Anion und n eine ganze Zahl ist.
12. Verbindung gemäß Anspruch 11, worin n 3 ist.
13. Verbindung mit der Struktur
worin R ein Anion und n eine ganze Zahl ist.
14. Verbindung gemäß Anspruch 13, worin n 3 ist.
15. Verbindung mit der Struktur
worin n eine ganze Zahl ist.
16. Verbindung gemäß Anspruch 15, worin n 3 ist.
17. Verbindung mit der Struktur
worin m und n jeweils ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein können.
18. Verbindung gemäß Anspruch 7, worin m und n beide 3 sind.
19. Verbindung mit der Struktur
worin R ein Anion und n eine ganze Zahl ist.
20. Verbindung gemäß Anspruch 19, worin n 2 ist.
21. Verbindung mit der Struktur.
22. Verbindung mit der Struktur
worin R ein Anion und n eine ganze Zahl ist.
23. Verbindung gemäß Anspruch 22, worin n 2 ist.
24. Verbindung mit der Struktur
worin R ein Anion und m und n jeweils ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein können.
25. Verbindung gemäß Anspruch 24, worin m 5 und n 3 ist.
26. Materiezusammensetzung mit der Struktur
X-Y-Z
worin:
X für eines oder mehrere Nukleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder Analogen eines interessierenden Analyten steht;
Y für eine Linker-Gruppe mit mindestens einem Kohlenstoffatom und angeheftet an X und Z steht; und
Z für eine Verbindung von Anspruch 7, 9, 11, 13, 19, 22 oder 24 steht.
27. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 26, worin X Theophyllin ist.
28. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 26, worin X Digoxigenin ist.
29. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 28, worin X ein von humanem Choriogonadotropin abgeleitetes Peptid ist.
30. Materiezusammensetzung mit der Struktur
X-CH=CH-CO-NH-(CH&sub2;)n-NH-CO-(CH&sub2;)m-Z
worin:
X für eines oder mehrere Nukleotide steht, die gleich oder verschieden sein können;
Z für eine elektrochemolumineszente chemische Einheit gemäß einem der Ansprüche 7, 9, 11, 13, 19, 22 oder 24 steht;
n eine ganze Zahl größer oder gleich 1 darstellt; und
m eine ganze Zahl größer oder gleich 1 darstellt.
31. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 30, worin X an das CH am Kohlenstoff 5 angeheftetes Thymidin ist, n 7 und m 3 ist.
32. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 31, worin Z bis-(2,2-Bipyridin)-[4- (butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]-ruthenium (II) ist.
33. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 32, worin das Thymidinnukleotid ein endständiges 3'-Nukleotid ist, angeheftet an die Nukleotidsequenz
TCACCAATAAACCGCAAACACCATCCCGTCCTGCCAG
34. Materiezusammensetzung mit der Struktur
[T-Y-Z]²&spplus;(R)&sub2;
worin:
T Theophyllin darstellt;
Y eine T an Z anheftende Linker-Gruppe darstellt;
Z für bis-(2,2'-Bipyridin)[4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl]ruthenium (II) darstellt; und
R für ein Anion steht.
35. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 34, worin Y an dem Kohlenstoff in Position 8 von T angeheftet ist.
36. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 35, worin Y die Struktur aufweist
(CH&sub2;)m-CO-NN-(CH&sub2;)n
und worin m und n eine ganze Zahl, die gleich oder verschieden sein kann, größer oder gleich 1 darstellen.
37. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 36, worin m 3 und n 4 ist.
38. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 36, worin m und n beide 3 sind.
39. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 35, worin Y die Struktur aufweist
und worin m, n und r eine ganze Zahl, die gleich oder verschieden sein kann, größer oder gleich 1 darstellen.
40. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 39, worin m 1, n 1 und r 4 ist.
41. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 35, worin Y die Struktur aufweist
und worin m, n und r eine ganze Zahl, die gleich oder verschieden sein kann, größer oder gleich 1 darstellen.
42. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 41, worin m 1, n 1 und r 4 ist.
43. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 34, worin Y an den Stickstoff in Position 7 von T angeheftet ist.
44. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 43, worin Y die Struktur aufweist
(CH&sub2;)n
und worin n eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist.
45. Materiezusammensetzung gemäß Anspruch 44, worin n 4 ist.
46. Verbindung mit der Struktur
worin Y ein Linker-Arm ist.
47. Verbindung gemäß Anspruch 46, worin Y die Struktur aufweist
(CH&sub2;)m-NH-CO-(CH&sub2;)n
und worin m und n ganze Zahlen größer oder gleich 1 sind, die gleich oder verschieden sein können.
48. Verbindung gemäß Anspruch 47, worin m 3 und n 2 ist.
49. Verbindung mit der Struktur
worin m und n ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein körnen.
50. Verbindung gemäß Anspruch 49, worin m und n beide 1 sind.
51. Materiezusammensetzung mit der Struktur
X-Z
worin:
X für eine oder mehrere Aminosäuren steht, die gleich oder verschieden sein können, umfassend mindestens eine Aminosäure, bei der es sich um Cystein oder Methionin handelt;
und
Z bis-(2,2'-Bipyridin)-maleimidohexansäure, 4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamidruthenium (II) ist, angeheftet über den Kohlenstoff in Position 3 oder 4 des Maleimids an einen Schwefelsubstituenten des Cysteins oder Methionins.
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