JPH0358467B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、臨床化学分析に於けるヘモグロビン
の影響回避方法に関する。 更に詳しくは、ヘモグロビンの吸収又はその吸
収の経時的変動に伴なう正負の誤差を回避するた
めに、特定の界面活性剤を用いることを特徴とす
るヘモグロビンの影響回避方法に関する。 近年、臨床化学分析に於ける技術の進歩は著し
く、自動分析機の発達と共に、ソフト面での技術
開発も盛んに行なわれている。特に、最近は目的
物のみならず、測定対象物に対し正負の誤差を与
える血清中の共存物質の消去方法についての研究
も盛んである。例えば、ビリルビンの影響を回避
する方法としては、過ヨウ素酸消去法、ビリルビ
ンオキシダーゼ酸化法等が開発されており、Ｌ−
アスコルビン酸については、ヨウ素酸酸化法、Ｌ
−アスコルビン酸オキシダーゼ酸化法等が、ま
た、ヘモグロビンから鉄の遊離を押える目的に
は、イミダゾールを始めとする含窒素化合物の添
加法等が開発されている。しかしながら、ヘモグ
ロビンの吸光度及びその吸収の経時的変動が、目
的物の測定に対して正負の誤差を与えることに対
する回避技術はこれまで皆無に近かつた。このよ
うなヘモグロビンの影響は、従来の測定方法、即
ち、分析する際に本検とは別に検体盲検専用のチ
ヤンネルを設け、別個に測定した検体盲検を本検
値より差し引くという方法をとつていたころは、
それほど問題にはならなかつた。ところが、分析
機器の発達に伴ない、例えば、試料と、発色成分
の１部を含むか、又は発色成分を全く含まない第
１試液との混合溶液の吸光度を初めに測定し（第
１点の吸光度）、次いで、残りの発色成分、又は
全発色成分を含む第２試液を添加して、目的成分
を発色させ、再度吸光度を測定し（第２点の吸光
度）、第１点の吸光度を最終液量に換算して、第
２点測定の吸光度より差し引き、盲検チヤンネル
を使用せずに検体盲検をより高精度にキヤンセル
する機構（この機構を以後、２点測定法と略称す
る。）が開発されるようになると、新たに、ヘモ
グロビンの影響が大きな問題となつてきた。即
ち、ヘモグロビンに関しては、液性、試薬組成、
反応条件により、その吸光度が経時に減少（まれ
に増加）し、第１点目の吸光度に比べ、２点目の
吸光度にはヘモグロビンの吸光度の減少による測
定値の低下が顕著に現われ、２点測定法の機能を
備えた装置では、その演算機構により記憶された
第１点目の吸光度を液量換算して、第２点目の吸
光度より差し引くため、２波長測光に於ける主波
長、あるいは１波長測光に於ける測定波長が、ヘ
モグロビンの吸収帯（340〜600nｍ）のより高い
吸光度位置にある場合は、通常、目的物の測定に
負の誤差を、また、２波長測光の副波長がヘモグ
ロビンの吸収帯のより高い吸光度位置にある場合
は、正の誤差を与えてしまうことがしばしばあつ
た。 従つて、この２点測定法では、第１点の吸光度
測定から第２点の吸光度測定までのあいだに、測
定物対象物の吸収以外の妨害物質の吸収が変化し
ないことが、より高精度な盲検補正の絶対条件で
あり、かかる目的に適う、すぐれたヘモグロビン
の影響回避方法の出現が渇望されていた。 最近、血液中のヘモグロビンを測定するにあた
り、そのヘモグロビンの吸収を固定することを目
的して、脂肪族高級スルホン酸塩を用いる方法が
特許出願（特開昭56−120951号）されている。し
かしながら、このスルホン酸塩を、ヘモグロビン
以外の目的対象物を測定する際のヘモグロビンの
影響回避のために、その測定系に用いるというこ
とはこれまでに全くなされておらず、このスルホ
ン酸塩が目的物の測定に影響を与えずに、ヘモグ
ロビンの吸収を固定することができるかどうかは
全く不明であつた。 本発明者らは、ヘモグロビンの影響回避方法に
ついて鋭意研究の結果、すでに公知になつている
脂肪族高級スルホン酸及びその塩以外にも、C₁₁
〜C₁₆のアルキル基を持つ硫酸エステル、C₁₁〜
C₁₆の１級アミン及びその塩類、並びに第４級ア
ンモニウム塩類の１部にも、ヘモグロビンの吸収
固定作用があることを見出し、且つ、脂肪族高級
スルホン酸及びその塩類を含めたこれら特定の界
面活性剤の内の１種又は２種以上のものを、ヘモ
グロビンの妨害をうける目物の測定の際に、試薬
安定性や溶解性を考慮して、適宜選択して第１試
薬に添加すれば、目的物の測定の影響を与えず、
ほぼ瞬間的的にヘモグロビンと結合し、その吸収
を固定して経時的変動を押え、目的物の測定に対
し、ヘモグロビンによる正負の誤差をほぼ完全に
回避できることを見出し、本発明をを完成するに
到つた。 本発明は、ヘモグロビンの吸収又はその吸収の
経時的変動が、臨床化学分析に与える正負の誤差
を回避する目的で、試液中に下記一般式，，
，から成る群より選ばれた一種又は二種以上
の界面活性剤を添加することを特徴とする臨床化
学分析方法である。 R¹−SO₃M R¹−OSO₃M R¹−NH₂・Ｙ 〔式中、R¹は炭素数11〜16のアルキル基、R²、
R³は炭素数１〜３のアルキル基、Ｍはアルカリ
金属、Ｙは鉱酸又は有機酸、Ｘはハロゲン又は無
機酸、有機酸の残基、を表わす。〕 上記式中、R¹で表わされる炭素数11〜16のア
ルキル基としては、ウンデシル基、ドデシル基、
トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル
基、ヘキサデシル基が挙げられ、R²、R³で表わ
される炭素数１〜３のアルキル基としては、メチ
ル基、エチル基、プロピル基が挙げられ、Ｍで表
わされるアルカリ金属イオンとしては、ナトリウ
ムイオン、カリウムイオン、リチウムイオシ等が
挙げられ、Ｙとしては、塩酸、硫酸等の鉱酸、又
は酢酸等の有機酸、Ｘとしては、塩素、臭素、ヨ
ウ素等のハロゲン、又はHSO₄ 等の無機酸残
基、又はCH₃COO 等の有機酸残基が夫々挙げ
られる。 本発明の方法によれば、オキシヘモグロビンの
吸収は瞬時に破壊されてシアンメトヘモグロビン
に類似の吸収に変わる為、ヘモグロビンの妨害を
受ける恐れのある測定対象物の測定に於て、ヘモ
グロビンの吸収及びその吸収の経時的変動によつ
て生ずる測定誤差を回避でき、しかも目的物の測
定には何ら影響を与えず、より正確な測定値が得
られる。 第１図に、ヘモグロビンの吸収曲線ａ、及びヘ
モグロビンに本発明に係る界面活性剤を添加した
場合の吸収曲線ｂ、並びにシアンメトヘモグロビ
ンの吸収曲線ｃを示す。即ち、第１図に於て、(a)
はヘモグロビン溶液（15ｇ／dl）20μにPH＝8.3
の0.01M酢酸ソーダ溶液5.0mlを添加した場合、
(b)は同ヘモグロビン溶液に0.5％のラウリル硫酸
ソーダを含むPH＝8.3の0.01M酢酸ソーダ溶液5.0
mlを添加した場合、(c)は同じく、ドラブキン試液
（KCN0.005％、フエリシアン化カリウム0.02％、
重炭酸ナトリウム0.1％）5.0mlを添加した場合、
に於ける夫々の吸収曲線を示している。第１図か
ら明らかな如く、ヘモグロビンに本発明に係る特
定の界面活性剤であるラウリル硫酸ソーダ
（SDS）を添加すると、瞬時にオキシヘモグロビ
ンの吸収ａが破壊され、シアンメトヘモグロビン
ｃに類似の吸収ｂに変わる。 本発明に係る界面活性剤とヘモグロビンの結合
体の吸収は、界面活性剤の種類により多少異なる
が、いずれも第１図の吸収曲線とほぼ同様な結果
が得られる。尚、ラウリルスルホン酸塩のこれら
の作用については既に公知であり、血液中のヘモ
グロビンの測定に利用されているが、本発明のよ
うに、この作用をヘモグロビン以外の物質の測定
時に、ヘモグロビンの妨害を防ぐ目的で利用した
ものは、これまでに全くなく、本発明者らが初め
てである。 表１に、本発明に係る各種界面活性剤とこれら
を添加した場合のヘモグロビンの吸収変動の関係
を示す。 表中、例えば0.106↓は、ヘモグロビンの吸収
が当初のものより0.160低下することを示してお
り、本発明に係る特定の界面活性剤を添加した場
合には、始めは大きく低下し、そのあとの低下は
少ないが、無添加の場合には、４〜６分後に於て
も相当量の低下が見られる。即ち、本発明に係る
特定の界面活性剤を添加した場合には極めて短時
間の内にヘモグロビンが固定化されて、以後は殆
んど変化しなくなるが、無添加の場合にはいつま
でも変化し続けていることが判る。

【表】

〔試料〕

プール血清１ml、及びプール血清各0.9mlに各
種濃度のヘモグロビンを0.1mlずつ添加し、ヘモ
グロビン濃度を夫々０，50，100，150，20，250，
300，350，400，450，500，700，1000mg／dlとし
たものを使用。 〔試薬〕 第１試液 カフエイン 2.5％ 安息香酸ソーダ 3.8％ 酢酸ソーダ 6.3％ EDTA−4Na 0.1％ Brij−35（花王アトラス(株)商品名） 0.2％ ラウリル硫酸ソーダ 0.5％ 第２試液 スルフアニル酸 0.1％ 塩 酸 0.1N これらを、使用時に0.2％の亜硝酸ソーダ溶液
と１：１に混合する。 〔測定方法〕 日立製作所自動分析機736型を使用。 試料10μに第１試液400μを加え、37℃に3.2
分（192秒）放置して、λ₂＝546nm、λ₁＝600nm
の２波長で吸光度を測定した後、第２試液100μ
を添加して、37℃で４分間反応し、λ₂＝
546nm、λ₁＝600nmの２波長で吸光度を測定す
る。第１点の吸光度差E₁を410/510倍して第２点
吸光度差E₂から差し引き、同様の操作で得た標
準の吸光度より、試料中のビリルビン濃度を算出
する。 比較例 １ 〔試料〕 実施例１に同じ。 〔試薬〕 第１試液 実施例１の第１試液からラウリル硫酸ソーダ
を除いたもの。 第２の試液 実施例１に同じ。 〔測定方法〕 実施例１に同じ。 実施例１及び比較例１の総ビリルビン濃度の測
定結果を表２に示す。

〔測定方法〕

日本電子クリナライザーVX−1000を使用。 試料15μに第１試液400μを加え、これを水
165μで反応管に導き、37℃に2.5分放置して、
第１点吸光度E₁を540nmで測定した後、第２試薬
100μを水100μで押し出し、37℃で2.3分放置
した後、第２点吸光度E₂を540nmで測定する。第
１点吸光度E₁を580/780倍して、第２点吸光度E₂
より差し引き、同様の操作で得た標準の吸光度よ
り、試料中のビリルビン濃度を算出する。 本実施例に於ける検量線を第４図に示す。 実施例 ３ 総ビリルビンの測定（塩化ベンザルコニウム使
用） 〔試薬〕 実施例２に同じ。 〔測定方法〕 試料溶液として、人血清中に各種濃度のヘモグ
ロビンを添加したものを各15μ用いる。以下の
測定方法は実施例２に同じ。 比較例 ２ 〔試料〕 実施例３と同じ。 〔試薬〕 第１試液として、実施例３の第１試液から塩化
ベンザルコニウムを除いたものを用いる。第２試
液は実施例３に同じ。 〔測定方法〕 実施例３に同じ。 実施例３及び比較例２の総ビリルビン濃度の測
定結果を表３に示す。

【表】 表３より明らかな如く、ビリルビンの測定に於
て、本発明に係る特定の界面活性剤である塩化ベ
ンザルコニウムを添加することにより、ヘモグロ
ビンの負誤差が大幅に改善されていることがわか
る。 実施例 ４ 総ビリルビンの測定（同時再現性） 試料としてプール血清及び高値プール血清を使
用し、実施例２と同じ試薬（塩化ベンザルコニウ
ム使用）を用い、実施例２と同じ測定方法（日本
電子クリナライザーVX−1000使用）により繰り
返し総ビリルビンの測定を行う。結果を表４に示
す。

【表】

〔試料〕

人血清30検体使用 〔試薬〕 実施例２に同じ。 〔測定方法〕 実施例２に同じ。 比較例 ３ 〔試料〕 実施例５と同じ検体（人血清30検体） 〔試薬〕 実施例５の試薬から塩化ベンザルコニウムを除
いたもの 〔測定方法〕 実施例５に同じ。 本発明の測定方法である実施例５（塩化ベンザ
ルコニウム使用）と、従来法である比較例３の相
関を表５及び第５図に示す。

【表】

【表】 表５及び第５図より明らかなように、溶血のな
い検体に於て、本法は従来法と良い相関を示して
いる。（Ｙ＝1.011X＋0.0548，ｒ＝0.999）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヘモグロビン溶液（15ｇ／dl）20μ
中に、(a)PH＝8.3の0.01M酢酸ソーダ溶液を添
加した場合、(b)0.5％のラウリル硫酸ソーダを含
むPH＝8.3の0.01M酢酸ソーダ溶液を添加した場
合、(c)ドラブキン試液（KCN0.005％、フエリシ
アン化カリウム0.02％、重炭酸ナトリウム0.1％）
を夫々5.0ml添加した場合に於ける夫々の吸収曲
線を示し、横軸は吸収波長（nm）を、縦軸は吸
光度（OD）を表わす。第２図は、実施例１に於
ける反応タイムコースを示したもので、１，２，
３は、夫々ヘモグロビン濃度（mg／dl）０，500，
1000の場合の反応タイムコースであり、縦軸は
546nmの吸光度と600nmの吸光度の吸光度差
（OD）×10⁴を示し、横軸は時間（秒）を表わす。
また、R₁は第１試薬添加点、F₁は第１測定点、
R₂は第２試薬添加点、E₂は第２測定点を示し、
E₂１，E₂２，E₂３は夫々１，２，３のE₂点に於
ける論理盲検値（E₁に於ける盲検値を液量補正
したもの）を示している。第３図は、比較例１に
於ける反応タイムコースを示したもので、１′，
２′，３′は、夫々ヘモグロビン濃度（mg／dl）
０，500，1000の場合の反応タイムコースであり、
縦軸は546nmの吸光度と600nmの吸光度の吸光度
差（OD）×10⁴を示し、横軸は時間（秒）を表わ
す。また、R₁は第１試薬添加点、E₁は第１測定
点、R₂は第２試薬添加点、E₂は第２測定点を示
し、E₂１′，E₂２′，E₂３′は、夫々１′，２′，
３′のE₂点に於ける理論盲検値（E₁に於ける盲検
値を液量補正したもの）を示している。第４図
は、実施例２に於ける検量線を示し、横軸はビリ
ルビン標準液の希釈度を、縦軸はビリルビン濃度
（mg／dl）を表わす。第５図は、本発明の方法で
ある実施例５（塩化ベンザルコニウム使用）と従
来法である比較例３（塩化ベンザルコニウム使用
せず）との相関を示したもので、縦軸Ｙは本法に
於けるビリルビン測定値（mg／dl）を、横軸Ｘは
従来法に於けるビリルビン測定値（mg／dl）を表
わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヘモグロビンの吸収又はその吸収の経時的変
   動が臨床化学分析に与える正負の誤差を回避する
   目的で、試液中に下記一般式，，，から
   成る群より選ばれた一種又は二種以上の界面活性
   剤を添加することを特徴とする臨床化学分析方
   法。 R¹−SO₃M R¹−OSO₃M R¹−NH₂・Ｙ 〔式中、R¹は炭素数11〜16のアルキル基、R²、
   R³は炭素数１〜３のアルキル基、Ｍはアルカリ
   金属、Ｙは鉱酸又は有機酸、Ｘはハロゲン又は無
   機酸、有機酸の残基、を表わす。〕