JPH03280881A - 微生物の固相化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗原−抗体反応を行なうプレートの表面に微
生物を固相化する方法に間する。

［従来の技術］ マイクロプレート、プラスチックビーズ、プラスチック
試験管等は、酵素免疫測定法において、抗原な固相化し
、検体中の抗体を測定するための菌として有用である。

［発明が解決しようとする課題］ 然しなから、抗原が細菌、真菌、原虫等の微生物である
時、微生物は上記器具に固相化されにくく、ブランクが
高い、感度が悪いという問題点かある。

そこで従来、検体中の微生物に対する抗体価を測定する
場合には、酵素免疫測定法によることなく、微生物懸濁
液を用いた凝集反応法が採用されている。凝集反応法は
、酵素免疫測定法に比較し、感度的に劣る、擬反応が起
こり易い、光学的測定か困難等の欠点を有している。

従って、前記器具に微生物を効率的に固相化てきるので
あれば、検体中の微生物に対する抗体価の測定を、凝集
反応法よりも優れた酵素免疫測定法を利用して行なうこ
とができる。

本発明は、抗原−抗体反応を行なう器具の表面に微生物
を効率的に固相化することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 請求項１に記載の本発明は、抗原−抗体反応を行なう器
具の表面に微生物を固相化する方法において、該器具の
表面に遊離アミノ基を有する高分子溶液を接触、吸着せ
しめ、該高分子溶液を除去、洗浄後、遊離アミノ基と化
学的に結合する官能基な分子内に２つ以上もつ架橋剤溶
液を接触、反応させ、該架橋剤溶液を除去、洗浄後、微
生物溶液を接触、反応させ、該微生物溶液を除去、洗浄
するようにしたものである。

請求項２に記載の本発明は、前記高分子がＰｏ１ｙ−Ｌ
−Ｌｙｓｉｎｅであるようにしたものである。

［作用］ 請求項１に記載の本発明によれば、下記■の作用がある
。

■酵素免疫測定法において、通常、抗原を固相化し、反
応を行なうためのマイクロプレート、ビーズ、試験管等
の器具は、プラスチック、主としてポリスチレンを成形
して作られる。そして、これらの器具はその表面に蛋白
質を吸着する性質を有する。他方、細菌、真菌、原虫等
の微生物はその外側を多糖からなる細胞壁でおおわれて
おり、これらの器具表面に吸着しない、或いはしにく　
　し＼　。

そこで、本発明にあっては、先ず器具表面に吸着する性
質を有している高分子（これは架橋剤との化学的結合性
を有する遊離アミノ基を備えている）を該器具表面に吸
着させた０次に、上記高分子と、固相化しようとする微
生物とを架橋するための架橋剤を反応させた。この時、
架橋剤の一方の反応基は高分子の遊離アミノ基と結合し
、他方の反応基は官能基として残る。従って、微生物を
接触せしめれば、上記架橋剤の残存している官能基か微
生物のアミノ基と反応する結果、器具表面に微生物を効
率良く固相化てきる。

請求項２に記載の本発明によれば、下記■の作用かある
。

■前記高分子としてＰｏ１ｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅを用い
たから、器具表面に対する吸着か確実である。

尚、本発明の実施において、前記高分子としては、Ｐｏ
１ｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅの他、血清アルブミン、アルギ
ン酸を用いることができる。

又、本発明の実施において、前記架橋剤としては、グル
タルアルデヒドやビスイミデート系、ジイソシアネート
系の架橋剤を用いることができる。

［実施例コ （実施例１） 本発明を用いて、Ａ群連釦球菌に対するウサギ抗血清に
抗体価を測定した。

（Ａ）　Ａ群連鎖球菌固相化マイクロプレートの作製 ■９６穴マイクロプレートの各ウェルに、１０μｇ／ａ
ｎのＰｏ１ｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ炭ＷＩＩＩＩ衝液（Ｐ
Ｈ９，ｌ１ｔ）を１００μβずつ分注し、遊離アミノ基
を有するＰｏ１ｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅを接触、吸着せし
める。室温にて３０分間靜１した後、各ウェル内液を除
去、０．１５ＭＮａＣｌ２を含むリン酸緩衝液（ＰＨ７
，４）　（以下ＰＢＳと略記する）で洗浄する。

■次に、上述の各ウェルに、架橋剤としての０．２５％
グルタルアルデヒド−ＰＢＳ溶液を　１００μβ／ウエ
ルずつ分注し、接触、反応せしめる。室温にて３０分間
靜１した後、各ウェル内液を除去、ＰＢＳで洗浄する。

０次に、Ａ群連錆球菌をＰＢＳに浮遊させた懸濁液（約
１０？個７１０を１００μβずつ各ウェルに分注し、接
触、反応せしめる。室温にて３０分間放置した後、各ウ
ェル内懸濁液を除去、ＰＢＳで洗浄する。

■クリシンーＢＳＡ　　（ウシ血清アルブミン）溶液を
各ウェルに　１００μβずつ分注し、室温にて３０分間
靜１し、遊離のアルデヒド基をマスクする。各ウェルを
ＰＢＳにて洗浄する。

ＣＢ）ウサギ抗血清の抗体価測定 ■Ａ群連鎖球菌で免疫したウサギの抗血清を、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、　０．１％ＢＳＡ、　　０．５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液て２倍ずつ段階
希釈する。

■上記（Ａ）の本発明方法にて作製した９６穴マイクロ
プレートの各ウェルに、各希釈抗血清を１００μβずつ
分取する。室温にて１時間静置の後、各ウェル内液を除
去、０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて洗浄す
る。

■パーオキシダーゼ標識抗つサギーＩｇＧ抗体（ヒツジ
由来）溶液を、各ウェルに１００μρずつ分注し、室温
にて１時間静置する。

■各つェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに
て洗浄し、各ウェルに２．２−ａｚｉｎｏ−ｄｉ−［３
−ｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎ　５ｕｌｐ
ｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄｌ　０．１５ｍｇ／ｍＡ、３０％
　ＨＪｔ　５ｕ　Ａ　／１０ｍＡを含ムｏ、ＩＭクエン
酸／　Ｎａ０Ｈ（ＰＨ４，０）溶液を２００μρずつ分
注する。室温にて３０分間靜装の後、　１Ｍフッ化ナト
リウム液１００μβを加え、反応を停止させ、４１５ｒ
＋＋ｗの吸光度を測定する（第１図参照）。

尚、上記（Ｂ）■で用いるマイクロプレートとして、Ｐ
ｏ１ｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅのみを処理したプレートに菌
体を固相化したもの、及びｐｏｌｙ−１−Ｌｙｓｉｎｅ
とグルタルアルデヒドの両処理をしないプレートに菌体
を固相化したものを用いた場合の測定結果を第１図に併
せ示した。

第１図によれば、本発明の実施により、マイクロプレー
ト表面に菌体な効率良く固相化できたことが認められる
。

（Ｃ）　ＩＩ集反応によるウサギ抗血清の抗体価測定Ａ
群連鎖球菌浮遊液（約１０８個／ｌΩ）とウサギ抗血清
希釈液をスライドガラス上て１滴ずつ適下、混合し、凝
集の有無を調べた。

Ａ群連鎖球菌抗血清の抗体価測定において、前記（Ｂ）
の本発明を用いた酵素免疫測定法による結果と、上記（
Ｃ）の凝集反応法による結果とを表１に比較して示した
。

表１によれば、本発明を用いた酵素免疫測定法の実施に
より、抗体価を極めて高感度で測定できることが認めら
れる。

（実施例２） 本発明を用いて、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓに
対するウサギ抗血清の抗体価を測定した。

（Ａ）　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　　固相化
マイクロプレートの作製 前記実施例１の（Ａ）におけると同様にして、Ｃａｎｄ
ｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　　固相化マイクロプレート
を作製した。

（Ｂ）ウサギ抗血清の抗体価測定 前記実施例１の（Ｂ）におけると同様にして、ウサギ抗
血清の抗体価を測定し、第２図を得た。

尚、ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅとグルタルアルデヒド
の両処理をしないプレートに菌体を固相化したものを用
いた場合の測定結果を、第２図に併せ示した。

第２図によれば、本発明の実施により、マイクロプレー
ト表面に菌体を効率良く固相化できたことが認められる
。

（Ｃ）凝集反応によるウサギ抗血清の抗体価測定前記実
施例１の（Ｃ）におけると同様にして、凝集反応による
ウサギ抗血清の抗体価を測定した。

Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ抗血清の抗体価測定
におし＼て、前記ＣＢ）の本発明を用いた酵素免疫測定
法による結果と、上記（Ｃ）の凝集反応法による結果と
を表２に比較して示した。

表２によれば、本発明を用いた酵素免疫測定法の実施に
より、抗体価を極めて高感度で測定てきることが認めら
れる。

［発明の効果］ 以上のように本発明によれば、抗原−抗体反応を行なう
器具の表面に微生物を効率的に固相化することがてきる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡ群連鎖球菌抗血清の抗体価測定結果を示す線
図、第２図はＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ抗血清
の抗体価測定結果を示す線図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原−抗体反応を行なう器具の表面に微生物を固
   相化する方法において、該器具の表面に遊離アミノ基を
   有する高分子溶液を接触、吸着せしめ、該高分子溶液を
   除去、洗浄後、遊離アミノ基と化学的に結合する官能基
   を分子内に２つ以上もつ架橋剤溶液を接触、反応させ、
   該架橋剤溶液を除去、洗浄後、微生物溶液を接触、反応
   させ、該微生物溶液を除去、洗浄することを特徴とする
   微生物の固相化方法。
2. （２）前記高分子がＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅである
   請求項１記載の微生物の固相化方法。