JPH02502513A - 病気抵抗体及び害虫抵抗体を植物に組み込む方法並びに植物に組み込まれ該抵抗体の暗号に対応する新規な遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 病気抵抗体及び害虫抵抗体を植物に組み込む方法並びに植物に組み込まれ該抵抗 体の暗号に対応する新規な遺伝子 発明の背景 本発明は遺伝子工学を利用して、病気（ｄｉｓｅａｓｅ）及び害虫（ｐｅｓｔｓ ）から植物を保護する方法に関し、感染性又は有客な状態に対する拮抗因子（ａ ｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ａｇｅｎｔｓ）又は抑制因子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ）を、植物の中に組み込む方法に関する。植物は、ウィルス、細菌、菌類を病原 体とする病原性の状態におかれている。植物は、更に又、様々な昆虫の如き害虫 によっても莫大な被害を受ける。本発明は、そのような病原性状態に対処できる 手段を植物そのものの中で組み合わせて結合できる方法を提供するものである。

植物生物学は１９４０年の初め頃から発展してきたもので、根頭癌腫病（ｃｒｏ ｗｎ　ｇａｌｌ）の発生がいかなる生物学的法則に基づいているかを解明するた めの実験が行なわれてきた。癌腫を発生させる原因は、伝染性の有機体であるア ゲロバクチリア　チュームフェイシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の細菌プラスミドであることが明らかにされた。このプラ スミドは、生物化学的な細部において現在の組換えＤＮＡ技術を利用できる特徴 がある。感染作用の操作モードが明らかになったのは、細菌プラスミドの小さな 断片を植物の核の中に実際に入れ込んだとき、プラスミドは植物の核と結合して 植物遺伝子として作用し、細菌が誘発されるという発見によるものだった。この 発見によって、アゲロバクチリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びそれらの プラスミドを、植物の核に外来ＤＮＡを運ぶための運搬体（ｖｅｈｉｃｌｅｓ） として利用できるようになった。

しかしながら、これらの技術を適用するには次のような条件を満たす必要があっ た。

（１）アゲロバクチリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）プラスミドによって感 染されやすいこと。

（２）変質させた（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）植物を再生するのに組織培養技術 を必要とすること。

ところが、アゲロバクチリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は穀類（ｃｅｒｅ ａｌｓ）を感染させることができないため、これまでのところ、遺伝子工学を穀 類に適用して成功したという報告はない。

その他の遺伝子と同じように、植物遺伝子は単に核酸基のストリング（ｓｔｒｉ ｎｇｓ）に過ぎない。植物の内部で人工遺伝子を作用させることにより、固有の 内因値を有する遺伝子、又は植物細胞の中で調節作用を行なうｍＲＮＡの如き中 間遺伝子を生産できる。人工遺伝子が最も多く使用されるのは、天然有機体から 遺伝子を単離して純化することが技術的にできない場合である。純化した人工遺 伝子を用いることにより、病気又は害虫から植物を保護することもできる。人工 遺伝子を用いて植物内のウィルス及びウィロイドに抵抗力が与えられるのは、多 くのウィルスが植物宿主と共進化（ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）することによるも のである。植物及び動物は、極めて正確かつニレガントなメカニズムによって進 化し、遺伝子は調節されて（ｒｅｇｕｌａｔｅａ）エクスプレス（ｅｘｐｒｅｓ ｓ）される。共進化したウィルスは、植物遺伝子の一般的構造に似せて擬態する ことにより、植物の真核細胞を利用してきたし、利用し続けている。

植物は最終的に病気にかかることもある。植物及び動物が進化に拘束を受けるよ うに、ウィルスも又同じように拘束を受ける。これは、ウィルスは、植物及び動 物の系に従属して遺伝子の調節及びエクスプレスを行ない、それら固有の遺伝子 を合成して植物に翻訳する（ｔｒａｎｓｌａｔｅ）ためである。この従属性が、 ウィルス性病気を制御する上でキーポイントになると考えられる。

最近では、新規な方法によって細菌が幾つかの遺伝子のエクスプレスを調節する ことが見出されている。特定蛋白質の生合成が細胞によって抑制（ｒｅｐｒｅｓ ｓ）される状態の下では、制御レベルが追加される。この新たに発見された遺伝 子制御は、「ｍ１ｃＲＮＡＪ制御と呼ばれるもので、ｒｍＲＮＡ−干渉相補的Ｒ ＮＡＪを表わしている。このｍ１ｃＲＮ　Ａ又は「アンチセンス」ＲＮＡは遺伝 子の５°方向の末端と相補的である。メッセンジ＋−ＲＮＡ　（！ＩＩＲＮＡ） をアニーリングして１１ｉｃＲＮＡにすれば、ｌ１ｌＲＮＡの量が減少するとい う最高の効果を有しており、このようにして通常の蛋白質合成から取り除くこと ができる。

ウィロイドは、数百のヌクレオチドから成る単−鎮リボ核酸（ＲＮＡ）である。

これらは、自己複製（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）構造物の中で最小の ものであり、最下等の生命形態を表わしている。これらは、数多くの植物病の原 因となる因子であり、ウィロイド構造の微細性及び植物遺伝子型の感受性に応じ て、植物に対して、穏やかな反応から致死的な反応に至るまで、一定範囲にわた って反応する。ウィロイドの場合、病気を引き起こす分子の複製を抑制するもの と推論される。ウィロイドは核酸の感染性要素であり、ウィルスのように蛋白質 成分を含んでいない。ウィルスに対しても同じような方法を用いると、核酸の複 製を遮断（ｂｌｏｃｋ）する機会がある（転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ） と呼ばれる）。

多くの植物は、ウィルス抵抗性を備えた遺伝子を含んでいる。このウィルス抵抗 性は、単一の優性遺伝子による場合もあるし、幾つかの遺伝子を必要とする遺伝 学的な複合体による場合もある。現在のところ、こ５ｏｌａｔｅ）　Ｌ−１純化 することは実用化されておらず、これら遺伝子を運搬する染色体の位置すら特定 できない。

しかし、生体内（インビボ）で作られたアンチセンス断片を用いると、単一の優 性遺伝子を組み込むことによって、ウィルス抵抗性及びウィロイド抵抗性が付与 され、ウィルス性ゲノムの特定領域に相補的なＲＮＡを生産し、ウィルスの複製 又は翻訳を中断する役割を果たせる可能性はある。この相補的、即ちアンチセン ス遺伝子は、特定のウィルス性病原体に特有のものである。これら幾つかのアン チセンス遺伝子を授けられた植物は、ジャガイモのウィルス性病気において観察 される症状の如き、種々のウィルス性病気から保護される。

植物をウィルス性病気から保護するには１個又は２個以上の人工遺伝子を用いる のに対し、細菌から保護する場合、昆虫が細菌に感染する性質を利用することに より細菌性病気に対する抵抗を与えるものである。

ヒアロフオラ（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ（シルクモスの一種））のさなぎは細菌性 感染に反応し、ｍＲＮＡを合成し、最終的に約１５乃至２０個の新しい蛋白質が 生産される。卵白や人間の涙の中に存在する抗細菌性蛋白質であるリゾチーム（ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）並びに、セクロビン（ｅｅｃｒｏｐｉｎｓ）及びアタシン（ ａｔｔａｃｉｎｓ）と呼ばれる他の２種類の抗細菌性ペプチドは、新たに合成さ れたこれらの蛋白質から純化されたものである。リゾチームが、細菌の成長を抑 えるのに有効であることは明らかにされている。

２種類の濃度のりゾチームを小さな紙皿の上に採り、寒天培地に植物の病原性細 菌を播いた後、リゾチームの抑制ゾーンは全く澄んで（ｃｌｅａｒ）いた。

これら蛋白質は、かなり広いスペクトル活性を有しており、種類の異なる多くの 細菌にも効果がある。このようにして、昆虫は、細菌性感染と戦うための新規な 手段を発展させてきた。今までの免疫学者は、この方法は特異性（ｓｐｅｃｉｆ ｉｃｉｔｙ）に欠けると考えるけれども、昆虫は３種以上の細菌性蛋白質を有す るかなり有力な蛋白質の宝庫であり、異なる方向から細菌性病原体を活発に破壊 しようと作用するかも知れない。このように、侵入した細菌の挑戦力は強力であ るため、侵入細菌を包囲することは極めて難しい。細菌性病原体は、本来的に１ つの毒素に対して抵抗性を有するかもしれないが、３つの全ての毒素に対して抵 抗性を有するとはほとんど考えられない。蛋白質毒素の作用を正確に知ることは 必要であるが、それらは原核生物特有であり、真核細胞に対して良性であると思 われる。経済的な損失をもたらす細菌性病気から植物を保護するために、ヒアロ フォラ（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）の液素性反応で生じた蛋白質を組み合わせるこ とは、遺伝子工学的な見地からは魅力的である。−例として、ジャガイモの主た る病気を挙げると、エルライリア　キャロットボラ（Ｅｒｗｉｒｆａ　ｃａｒｏ ｔｏｖｏｒａ）によって引き起こされる軟性腐敗（ｓｏｆｔ　ｒｏｔ）とプソイ ドモナス　ソランアセアラム（Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｅｅａ ｒｕｍ）によって引き起こされる細菌性萎凋病が示される。これらの病気は、ア ジア、アフリカ、中南米の多くの地域においてジャガイモの成長を阻止する主原 因となっている。これら抗細菌性蛋白質の暗号を有する遺伝子を穀類植物に組み 入れれば、細菌性病気からの植物保護に革命をもたらすことになるかも知れない 。

抗細菌性蛋白質を生産する昆虫の場合と同じように、菌に対して効果的な蛋白質 の暗号をもった遺伝子を含む幾つかの細菌が見出されている。これらの細菌は天 然の宝庫である。これらフンバウンドと、これら天然抗菌剤の合成を暗号化した 遺伝子の分子的特徴を、生化学的に分析することは、穀類植物における菌性病気 の範囲を狭め、病気の苛酷さを緩和する上で大変重要である。１８４５年乃至１ ８６０年において、フィトフトラ　インフエステンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒ ａ　ｊｎｆｅｓｔａｎｓ）又はレイト　ブライト（Ｌａｔｅ　Ｂｌｉｇｈｔ）を 原因とするジャガイモの菌性病気によってアイリッシュポテトは大飢饅にさらさ れ、１００万人が餓死した。更に、この菌性疫病によってもたらされたジャガイ モの不作のために、１５０万人が北米に移住した。

植物から得られる食物及び繊維の莫大な損失を引き起こす直接的な原因が昆虫に あり、昆虫が感染ベクター　（ｖｅｃｔｏｒ）として他の植物の病原体から広が ってきた場合、害虫の蔓延を防止するには、昆虫被害に対する植物の耐性を大き くする必要がある。このように植物の耐性を高めることは、経済的に非常に価値 がある。

植物を昆虫被害から保護する方法として、バ千ルスツリンジエンシス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から単離した蛋白質の如き天然殺虫剤 を用いるものがある。これは、幾つかの鱗翅類の昆虫の幼虫に対して毒性を有す る細菌の中に、高分子重量結晶を形成するものである。しかしながら、この昆虫 は幾つかの世代を経ると毒性に対して免疫ができるものと考えられている。この ため、他の可能性を検討せねばならない。最も期待できる方法の１つと１７で、 キチナーゼと呼ばれる酵素を天然殺虫剤として用いることが考えられる。キチナ ーゼは細菌の中で作られた酵素であり、その暗号に対応する遺伝子は単離してい る。昆虫の外骨格と臓器はキチン（ｃｈｉｔｉｎ）から構成され、キチンの外皮 を破壊又は分離すると自然環境から感染し、極く短時間内に死に至る。キチナー ゼ酵素を暗号化した遺伝子を植物の中に組み込むことにより、植物の中にキチン 分解酵素が形成され、昆虫から受ける被害を阻止することができ、二次的には、 昆虫がベクターとじて用いられることによる他の植物への病気の広がりを抑える ことができる。

発明の要約 広い解釈において、本発明は病原性の植物状態（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｌａ ｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を抑制する方法を提供するものであって、該方法は 、天然又は人よりＮＡ源の結紮（ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって得られた前記病原 性植物状態の抑制因子を植物ゲノムの中にエクスプレス（ｅｘｐｒｅｓｓ）し、 １個又は２個以上のポリペプチド抑制因子又は抑制因子プリカーサ（ｐｒｅｃｕ ｒｓｏｒｓ）の暗号に対応する遺伝子を植物ベクターの中に組み込み、病原性の 植物状態にある植物の中に前記ベクターを組み込むものである。

より具体的には、本発明は植物のウィルス性感染、細菌性感染、菌性感染等の病 原性植物状態又は昆虫侵入による植物状態を阻止する方法を提供するものであっ て、該方法は、前記植物状態の抑制因子又は抑制因子プリカーサの暗号に対応す る少なくとも１個の遺伝子を植物ゲノムの中にエクスプレスものであって、抑制 因子又はプリカーサは、（ａ）生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で作られるウィルス性 の転写又は翻訳を遮断するための相補的オリゴヌクレオチド、（ｂ）ヒアロフォ ラ（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）の細菌性感染に対する液素性反応によって得られた １個又は２個以上の蛋白質、（ｃ）抗菌性プラスミド、（ｄ）前記植物を糧とす る昆虫が環境から感染されるようにするため、昆虫のキチン外皮を破壊して得ら れたキチナーゼ酵素、の中から選択され、エクスプレスは、前記抑制因子又はプ リカーサの暗号に対応する遺伝子を含有したプラスミドをランダムに結紮し、Ｔ −ＤＮＡのバインドＩＩＩ（Ｂｉｎｄ　ＩＩＩ）　１７の断片を組み込んだ大腸 菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の中に抑制因子含有プラスミドを取り込 み、不変移（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）Ｒ１プラスミドを運搬するアゲロバクチリ ア菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔｒａｉｎ）の中に組み込み、植物ゲノ ムで培養することにより、パラセンジャー（合成）ＤＮＡを含むＴ−ＤＮＡが植 物ゲノムの中に組み込まれ、植物ゲノムと共に再び生産されて、病原性状態を抑 制する効果を発揮するようにしている。

少なくとも１個のポリペプチド抑制因子又は抑制因子プリカーサの暗号に対応す る遺伝子をエクスプレスする方法は、遺伝子の結紮及び植物ベクターｐＭＯＮ２ ３７の中への組込みを含んでいる。

通常はウィルスに感染しやすい植物においてウィルスの増殖を抑制又は防止する 方法であって、該方法は、ウィルスの翻訳を遮断するため、相補的なオリゴヌク レオチドから成る遺伝子を植物の中にエクスプレスするものである。

本発明の更に特徴とするところは、植物の細菌性感染を抑制又は防止する方法を 提供することにあり、該方法は、ヒアロフォラ（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）の細菌 性感染に対する液素性反応によって生じた少なくとも１個の蛋白質の暗号に対応 する少なくとも１個の遺伝子を、細菌性感染を受けやすい植物のゲノムの中にエ クスプレスすることを含んでいる。

本発明が有する他の特徴には、通常は菌類に感染しやすい植物の菌性感染を抑制 する方法を含んでおり、該方法は、菌の成長を抑制するのに有効な細菌製蛋白質 の暗号に対応する遺伝子をエクスプレスするものである。

本発明が更に有する特徴には、経済的価値の高い穀類又は繊維植物が鱗翅類の幼 虫による被害を受けるのを阻止する方法を含んでおり、該方法は、キチナーゼ酵 素の暗号に対応する遺伝子を穀類又は繊維植物にエクスプレスするものであって 、鱗翅類の幼虫が植物を摂取したとき、キチナーゼ酵素は、幼虫のキチン外皮を 破壊するものであって、この破壊によって外的環境から感染させるのである。

望ましい実施例の詳細な説明 本発明は、細菌性感染、ウィルス性感染、菌性感染及び昆虫の侵入等の植物状態 を阻止又は抑制する因子を提供するものである。先ず第１に、細菌性感染を原因 とする植物の病気を阻止する方法について説明する。

細菌性感染は、幾つかの昆虫における抗細菌反応に原因があるものと考えられて いる。前述したように、ヒアロ７ｒう（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）のさなぎは、ｍ ＲＮＡを合成し、１５乃至２０個の新しい蛋白質を製造し、該蛋白質からリゾチ ーム、セクロビン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）及びアタシン（ａｔｔａｃｉｎ）を純化 する。

リゾチーム遺伝子及び蛋白質はヒアロフォラ（Ｈｙａｌ。

ｐｈｏｒａ）から得られるプラスミドから作られ、クリーンティス　キサントボ ーロス（Ｋｌｅａｎｔｈｉｓ　Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ）から供給される。プ ラスミドｐＢＲ３２２は酵素Ｐｓｔｌによって分解され、リゾチーム遺伝子が取 り除かれる。

得られた断片を純化し、Ｂａｌ　３１酵素で処理し、３゜のポリｄＧテールを取 り除く。次に、アダプターを示すと下記の通りである。

ＧｍＣＡＴＧ人Ａ＾ＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧｍＣ＾丁ＧＡＡ ＡＣＣ人ＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＴＡＧ人ＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣ人ＡＡ ＧＴＡＣＴＴｒＧこのアダプターは酵素Ｘｍｎ　Ｉで分解後、結紮して断片とし た。次に、断片をＳａｌ　Ｉで分解し、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２の中にクロ ーン化した。リゾチーム遺伝子は酵素ＢｇｌＩＩによる分解によって救出し、植 物ベクターｐＭＯＮ２３７の中に組み込んだ。

抗細菌性蛋白質の暗号に対応するリゾチーム遺伝子が同定され（ｉｄｅｎｔｉｆ ｉｅｄ）、下記に示すヌクレオチドのシーケンスを含んでいる。

λＣ人ＴｅＴＧＴｒＴＣＡ丁ＱＡＡＡＣＧＴＴｒＣＡＣＯＡＧＡ　ｉＧＯ００Ｇ ＴＴＡＧＴ（：　ＣＡＧ　Ｃ人ＣＩ　ＣＴＴＡにＯＡにＡＣＧＡＧＧＣＴＴＣＯ 人τＧＡＡＡＣＴＴｒＧＡ丁ＧＡＣ丁＾＾ＣＴＧＧＧＴＣＴＣＯＣＴＴ　ＧＴＣ ＧＡＧ人人Ｃ０ＡＡＡＯＣＯＱＡＣＱＯＴＴＴＡＣＣＱλ丁＾講＾Ａ丁ｃａａ丁 ＾人人ＣＴＴ人Ａ大人ＡＧＡＡＣＧＯ人丁ＣＴＣＧＡＯＡ（”ＴＡＣＧＱＣＣＴ ＣＴｒＣＣＡＱムＴＣＡＡＴＯ人Ｃ人ＡＡＴ人Ｃ丁ｃａＴＧＣＡＧ丁ＡＡＧＧＯ ＡＴＣＣＡＣＴＣＣＴＱＱＡＡＡＯＯＡＴＴＯＯＡＡＣＱＴＯＡＣＴＴＧＴＡＡ ＴＣＡＣＣＴＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＯＡＣＡＴ丁ＡＯＣＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＣ ＧＴＯＣＯＣＯ人１０ＡＡＯＡＴＴ丁ＡＣ人ＡＡＣＣＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴ　０ ＡＣＯＣＴＴＯＱ　丁ｋＣＧＧＡ７００ＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴ ＯＧＡＣＴＯＣＣＡこのリゾチーム遺伝子は付随蛋白質又はポリペプチドを生産 し、下記に示すアミノ酸のシーケンスを有している。

Ｌｙｓ　ｋｒＨＰｈｅη「人ｒｇ　Ｃ）ｎ　ＧｌｙＬｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｕ　Ｌｅｕ人ｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ＾ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ 　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａ唐氏@Ｔｒｐ Ｖａｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖｍｌ　Ｇｌｕ人５ｎＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｕｙ　Ａｒ ｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｘｆｅ　Ｇｕｙ　Ｌ凾刀@Ｖｍｌ Ａｓｐ　Ｌｙｓ＾ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌ ｃｕ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ＾３ｎ＾ｓｐ　Ｌｙｉ　Ｔｙ窒sｒｐ Ｃｙｘ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｕｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ　ＣｙｓＡｓｎ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　fＩＫＩ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖｍ１人ｌｓｈ人１ｍ　Ｔ ｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｍ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　kｙｓ　Ａｒｇ Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｒｍ丁ｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｕｙ丁ｒｐ　Ｌｙ ｇ＾ｓｎＨｉｍ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　ＧＸｙ　Ｌｅｕ@Ｐｒ。

人ｓｐ　Ｉｌｅ　５ｅｒＡｓｐ　ＣｙＬ同じようにして、クリーンテイス　キサ ントポーロス（Ｋｌｅａｎｔｈｉｓ　Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ）からプラスミ ドｐＢＲ３２２の一部として得られたアタシン（ａｔｔａｃｉｎ）遺伝子及びそ の付随蛋白質を、適当な開始アミノ酸と停止アミノ酸を供給して取り除き、植物 ベクターの中に組み込み、成長させて植物細胞内の抗細菌特性を調べるために適 当な宿主の中に入れた。アタシン（ａｔｔａｃｉｎ）遺伝子は、従来の方法によ って酵素Ｐｓｔ、Ｉで分解ｌ２．た後、ｐＢＲ３２２から取り除いた。得られた プラスミド断片を純化し、ＦｎｕＤ　Ｈ及びＤｒａ　Ｉで分解した。アダプター のオリゴヌを結紮によって断片に結合した。次に、アダプターを含有した断片を Ｓａｌ　Ｉで分解し、プラスミドｐＢＲ３２２の中にクローン化した。全長のア タシン（ａｔｔａｅｉｎ）遺伝子はＢｇｌ　ｎによる分解によってｐ　Ｂ　Ｒ３ ２２から得られ、植物ベクターｐＭ　ＯＮ　２３７の中に組み込み、アミノ終端 部に開始メチオニンを得た。抗細菌性遺伝子を含んだ植物ベクターｐＭＯＮ２３ ７は、ｐＭＯＮ２３７を組み込んだ植物細胞から作られた植物に対して抗細菌特 性を付与する。

抗細菌蛋白質の暗号に対応するアタシン（ａｔｔａｃｉｎ）遺伝子が同定され、 下記に示すヌクレオチドのシーケンスを含んでいる。

ＣＡＣＱＣＯＣＡＣＯＯＡＧＣＣＣＴｒＡＣＯＣＴＣＡＡＯＴＣＣＯＡＴＧＱＴ ＡＣＣＴＣＴＯＯＴＯ（ＴＯＴＯＯＴｒＡＡＡＧ丁ＡＣＣＣＴｒＴＣＯＴＧＯＴ 　人ＡＣＱＡＣＡＡＧＡＡＴＡ丁ＡＱＴＡＡｒｃＧＣＴ　ＡＴＣＣＣ丁ＴＣＣＧ ＴＡＣＡＣＴＴＡＡＣＴＧＡＴＡＣＱ　ＣＡＧＡＡＡＣＴＡＯＧＣＯＣＴＧＣＡ ＡＣＣＯｃ＋ｒＯＧＡＣＴＣＧＣＡ　Ｃ丁ＧＣＨＡＴ人ＡＴＡＴＡ　人ＡＣＯＯ ＴＣＡＣＯＯＡＣＴＡＡＧＴＣＴＯＡＣＧＯＡＴＡＣＡＣＡＯＡ丁ＣＣＣＣ００ （ｌＴＴＣＧＯｋ（ＨＡＣＡＡＯ人丁ＧＡＣ＾ＧＣＡＧＣＣＯＧＣＡＡＡＯＴＯ 人人丁Ｑτ大人τｃｃＡＣＡ人ＴＧ人Ｔ人人ＣＣ人ｃｃ＾ＣＡＴＣ人ＣＡＧＣＧ ＡＡＧ　ＣＣＴＴｒＣＯＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＴＯＣＣＯ０ＡＴＡＴｒＣＣ ＴＡＡＴＧ’ｒ人ＯＣＴ人ＡＴＴＴＣＡＡＣＡＣＴＧ丁ＣＧＯＴＯＧＣＧＱ人人 丁人ＧＡＣτ人ＴＡＴ＠丁τＣＡＡＡＯＡＴ人人０ＡＴＴｃｃτＣＣ人ＴＣＴＣ ＯＯＡＧＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＣＯＯ＾（：ｍＡＴＣＡ人丁Ｃ０ＣＡＡＣＯＡ ＣＴＡＣＴＣＴＣＴ？ＧＡＣＧＧＯＡＡＡＣＴＯＡＡＣＣＴＣＴｒＣＡＡＧＡＣ ＴＣＣＴＧＡ丁ＡＣＣＴＣＧ　ＡＴＴＯＡ丁丁ＴＣＡＡＣＣＣＣ００ＴＴｒＣＡ ｇｏＡＡＧＴｒＣＩＯＡＴＡＣＡＣＣ！’ｒＴｒＯＡＴ＠ＡＡＯＴＣＯＴＣＴ　 丁０ＯＯＡＯＣＣＴＡＡＣＴｒにのアタシン（ａｔｔａｃｉｎ）遺伝子は、下記 １こ示すアミノ酸のシーケンスを有する付随蛋白質又はポリペプチドを生産する 。

Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｌｍ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｘｎ　 Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｕｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ@Ｖｉｌ　Ｖａｌ Ｌｙｘ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ｉ’ｈｅ　Ａｌｕ　Ｇｕｙ　Ａｘｎ　、ｋｓｐ　Ｌｙ ｓ　Ａｘｎ　Ｘｌｅ　Ｖｍｌ　Ｓｅｒ　Ａｌｉ　Ｘｌｅ　Ｇ撃凵@Ｓｅｒ　Ｖａ ｌ Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　０１７人 １ｍ　ＡＩ＋ａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖｍｌ　Ａｌｉ@Ｌｅｕ　Ａｓｐ Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｕｙ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ@Ｐｈｅ　Ｇｌｙ Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ａｉｍ人１ｓ＋　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＶＥＸ＾ ｓｏ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　gｉｓ　Ａｓｐ ｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌｍ　Ｌｙｓ　Ａｉｍ　Ｐｈｅ　Ａｂａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　 Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｈａ　Ａｓｎ@Ｖａｌ　Ｐｒ。

Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＴｂＴＶｍＸ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａ ｓｐ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　wｎｃ　Ｇｌｙ ＾１ａ　Ｓｅｒ　ＡＩａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌｘ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｐ丁ｙｒ　rｅｒ　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉ−ｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ 　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｈ■Oｓｎ　Ａｌａ Ｇｕｙ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌ）＋＋　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　ＴｈｒＰｒｏ　ｌ’ｈｅ 　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｐｒ潤Oｓｎ　Ｐｈｅ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｙ　Ｐｈｅ＋更にかつ 、同様にして、クリーンテイス　キサントポーロス（Ｋｌｅａｎｔｈｉｓ　Ｘａ ｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ）から受は入れられたプラスミドｐＢＲ３２２の中で得ら れたセクロビン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）遺伝子を生産する抗細菌性蛋白質は、最初 に制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ及びＨｉｎＰＩ　Ｎで切り取り、プラスミド断片ｐｃＰＦ Ｌ１にする。得られた２６０塩基対の断片を純化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで 処理し、ＨｉｎＰｌ　１部位の中に入れる。得られた断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ で処理した。合成アダプターＣ３は次の通り同定される。

このアダプターを断片に結合した。新たな遺伝子断片を、制限酵素Ｘｍｎ　Ｉ及 びＡａｔ　ＩＩで切り取っであるｐＢＲ３２２に結紮した。正しいアンピシリン 反応性遺伝子型を含有するクローンを選択し、Ｘｍｎ　Ｉで切り取り、Ｃ５で示 される合成アダプターで結紮した。Ｃ５は下記に示すヌクレオチドのシーケンス を有している。

得られた断片を大腸菌で再び変換した（ｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｉｅｄ）。セクロ ビン（ｃｅｅｒｏｐｉｎ）遺伝子はＢｇｌｌＮによる分解によって大腸菌から救 出され、植物ベクターｐＭＯＮ２３７の中に組み込まれる。このように、セクロ ビン（ｅｅｅｒｏｐｉｎ）遺伝子は誘導ペプチドがなくども、アミノ終端部での 適当な開始メチオニンによって再生され（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）、カルボキ シ終端部で正しい翻訳信号（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）で終了す る。

セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）遺伝子は同定され、下記に示すヌクレオチドの シーケンスを有している。

ＡＴｒＧＡＡ　大人人ＡＴＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＡＴｒＣＧｋＡＡＣＣＯＴＡＴ ｒＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＣＣＡ　ＧＣＧ　ＡＴｃａｃｃ　ａｒｔ　ＴＴＡａ ａｃＣ人ＡＧＣＣＡＡＡＧＯＯＣＴＡａａ人丁人人ＡＧ大人ＣＴ。

このセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）遺伝子は、抗細菌性アミノ酸を有する付随 蛋白質又はポリペプチドを生産し、該アミノ酸のシーケンスは次の通りである。

Ｌｙｓ丁ｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｈｃ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓｌｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙ ｊＭｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ 　Ｖｍｌ　Ｌｙｓ　人１ｉ　ＧｌｙＰｒｏ　Ａｌｓ　Ｉｌｃ　Ａｉｍ　Ｍａｌ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ人１ｍ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｌｃｕ　Ｇｌｙ。

本発明の方法において、細菌性蛋白質を含有するアゲロバクチリア　チュームフ ェイシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）微生物 は、リゾチームの暗号に対応する遺伝子を含むものがｐＡＴ−ＬＹＳ、アタシン （ａｔｔａｃｉｎ）に対応する遺伝子を含むものがｐＡＴ−ＡＴＮ及びセクロビ ン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）に対応する遺伝子を含むものはｐＡＴ−ＣＮとして称さ れる。これらの新規な微生物は再生産及び維持が可能であって、本願が出願許可 された場合、商業的規模の保存が必要になる時まで、ルイジアナ州、ペイトン　 ル−ジにあるルイジアナ州立大学にて発明者により保存される。本発明のもう１ つの特徴は、微生物の中にプラスミドを含んだ組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ）を提供するものであって、微生物はヒアロフォラ（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）の 細菌感染に対する液素性反応から得られたポリペプチドの暗号を表わすＤＮＡシ ーケンスを含んでいる。本発明の組成物の中に１　　含まれる微生物はアゲロバ クチリア　チュームフェイシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓ）である。より具体的には、本発明の組成物に含まれる微生物はポ リペプチドを含んでおり、該ポリペプチドはりゾチーム、アタシン（ａｔｔａｃ ｉｎ）、セクロビン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）及びそれらの混合物から選択される。

−菌類を阻止する方法は、抗菌性コンパウンドの暗号に対応する遺伝子の選択、 クローン化及び適当な植物ベクターへの組込みを含んでいる。自然的に発生する 細菌の中には、菌類に対して毒性を生じるものもある。

このような細菌は暗号化した遺伝子を保有しており、抗菌性コンパウンドを生産 する。抗菌性コンパウンドを生産するこれらの細菌から分離したＤＮＡは、分離 され、ラムダベクターの中に手当たり次第にクローン化され、その後、大腸菌を トランスフェクトするために用いられる。更に、同じＤＮＡは、ジーン３８（１ ９８５）７３−８４においてＷｅｒｎｅｋｅ氏他が記載し民地ソイドモナスベク ターｐＷＳ３及びｐＷｓ６を直接用いてプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ）の中で手当たり次第にクローン化することができる。得られた変換体（ｔｒ ａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）を培地し、表示体（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）として単細 胞成熟核ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）を用いて過剰にスプレーした 。この強力な選択道具によって、抗菌性毒素コンパウンドの暗号に対応するＤＮ Ａ　（遺伝子）を探し出し、前述した要領にて、適当な植物ベクターを用いるこ とにより、植物内にそれらの遺伝子を充分にエクスプレスできる特徴を有してい る。抗菌性コンパウンドを暗号化した遺伝子即ちＤＮＡを組み込むことにより、 抗菌特性を備えた植物種を作ることができる。

大部分は同じようにして、キチナーゼ酵素を供給する特定の種属を選択し、クロ ーン化し、植物ベクターの中に組み込み、キチナーゼ酵素を生産する植物を作る 。ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）細菌属の中には、非常に活性なキチナーゼ酵素を生 産する細菌のあることを見出した。

本発明のもう１つの特徴は、キチナーゼ酵素を作る植物を提供することにより、 昆虫の侵入を抑制し、昆虫による植物の被害を阻止する方法を提供することにあ る。キチナーゼ酵素産物を暗号化したＤＮＡ又は遺伝子は、制限酵素ＨｉｎｄＩ ＩＩによる分解によって、ビブリオ細菌ＤＮＡから切り取ることができる。ＤＮ Ａシーケンスの分析によって遺伝子の適切な開始位置及び停止位置を求めること ができる。更に、前述したように、植物ゲノムの中に所定の遺伝子を移植し、抗 細菌を暗号化した遺伝子を植物ベクターの中に組み込むためには、クローン化す る必要がある。

ウィルス及びウィロイドを阻止する方法は、ウィルス又はウィロイドの複製を阻 止若しくは防止又はウィルスの翻訳を阻止する、アンチセンス又は相補的なオリ ゴヌクレオチドを与えることを含んでいる。

ＧＡＴＣＴＣＣＡＣＧＧＴｒＧＴＧＧＣＣ人ＴＡＴＡＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴｒＴ ＴＴＣ人人のシーケンスを有する４１塩基ＤＮ大人リゴヌクレオチドを用いるイ ンビトロ（Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ）の処理においては、ウィルスゲノムの翻訳を９８ ％遮断した。この処理は、２０ｍＭ　ＨｅｐｅｓＳｐＨ７，６，０，ＩＭ　Ｎａ Ｃ１及び１ｍＭ　ＥＴＤＡを含む８マイクロリツトルの反応混合物の中で、ＤＮ Ａをウィルスに交配（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）することによって実施した。

ウィルスのＲＮＡ濃度は０．５　ｍｇ／ｍｌであり、ＤＮＡは５倍モル過剰に添 加した。全般に、反応混合物は７０℃にて１０分間加熱した後、４５℃にて３時 間培養した。ウィルス性ＲＮＡの翻訳プロセスは、例えばＲＮＡラビットの網状 赤血球の分解質系の如き、細胞のない合成養生蛋白質の中で行なわれる。′この 分解質系については、プロシーディングオブザナショナルアカデミーオブサイエ ンスオブザυ、Ｓ、Ａ、７５．５８０７−５８１１　（１９７８）及びジャーナ ルオブバイロロジ−３０，４７２−４８０（１９７９）において、シー民地が記 載している。これら２つの文献は公知例として参照される。交配の結果、ウィル スの翻訳は効果的に遮断される。

ウィロイドの場合、ジャガイモの塊茎ウィロイド（ＰＳＴＶ）に、合成りＮＡの 断片を交配することによって、複製は防止される。この中央部の保存領域は、公 知のウィロイドがすべて存在しているものと思われ、複製に重要な役割を果たす ものと推定される。合成りＮＡの断片はオリゴヌクレオチドのシーケンスを有し 、下記の通り同定される。

ＧＡＴＣ丁ＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＣＣＴ　　ＰＳＴＶＩＧＡ丁Ｃ ＴＡＧＧｍＣＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴ　　ＰＳＴＶ２この交配は、種々のオ リゴヌクレオチドの９屑をアニーリングすることによって行なわれ、純化した感 染性ＰＳＴＶ　　ＲＮＡが得られる。試料の混合物は９０℃にて５分間加熱した 後、室温まで徐冷した。次に、これら混合物をＰＳＴＶ感受性トマト植物に接種 し、培養した。結果を表にして表わすと次の通りである。

（以下余白） 表（トマト植物に接種した組成物のモル比）皮王惣　　　　　ｉ庄ル　　惑、！ ＬＬな上１ユ員物（感染数／接種数） ＰＳＴＶ＋ＰＳＴＶ１　　　１　：　１　　　　　０／４ＰＳＴＶ＋ＰＳＴＶ１ 　　１０　：　１　　　　　０／４ＰＳＴＶ＋ＰＳＴｌ　　　　１　：　１０　 　　　０／４ＰＳＴＶ＋　ＰＳＴＶ　２　　　　　　　コ、　：　　１　　　　 　　　　　　０／４ＰＳＴＶ＋ＰＳＴＶ２　　１０　＋　１　　　　　２　／　 ４ＰＳＴＶ＋ＰＳＴＶ２　　　１　：　１０　　　　０／４ＰＳＴＶ＋ＰＳＴＶ ｆ＊　　　１：ｌ　　　　　　１／４ＰＳＴＶ＋ＰＳＴＶｆ　　　１０　：　１ 　　　　　０／４ＰＳＴＶ＋ＰＳＴＶｆ　　　　１　：　１０　　　　０／４Ｐ ＳＴＶ　　単独　　　　　　　　　　　　３１５＊　　ＰＳＴＶ　ｆ　Ｉｔ　Ｐ ＳＴＶ（７）全長ＤＮＡである。

交配が行なわれると、ＰＳＴＶ分子のそれ以降の複製は遮断された。

ウィロイドの転写を遮断する合成りＮＡ及びウィルスの翻訳を遮断する合成りＮ Ａは植物ベクターの中に組み入れ、前述したウィロイド及びウィルスに感染しな い植物を作ることができる。

本発明を説明したが、当該分野の専門家であれば本発明の範囲内及び精神の領域 内で種々の変更ができることに気付くであろう。従って、本発明は添付の請求の 範囲によってのみ限定されるものと理解されるべきである。

国際調査報告 ｈｌｌ針＋ｓ１ｍ’ｕＭ＾帥ｋｒゆ＊Ｎａ　　ＰＣ’ｒ／ｃｓ８７１０１７’０ −一−＾−”−１４’　Ｐｒ１Ｔ：５８７１０１７：０１″−’−＃゛−１１− ６１　Ａ　ｐｅｌｉｃａＩ−ｋ″、　、、、、／、、ｓ８７，０１７．。

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Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．病原性の植物状態を抑制する方法であって、天然又は人工ＤＮＡ源から結紮 によって得られた前記病原性植物状態の抑制因子を植物ゲノムの中にエクスプレ スし、１個又は２個以上のポリペプチド抑制因子又は抑制因子プリカーサを暗号 化した遺伝子を植物ペクターの中に組み込み、病原性の植物状態にある植物の中 に前記ペクターを組み込むことを特徴とする。
2. ２．植物のウイルス性感染、細菌性感染、菌性感染等の病原性植物状態又は昆虫 侵入による植物状態を抑制する方法であって、前記植物状態の抑制因子又は抑制 因子プリカーサを暗号化した少なくとも１個の遺伝子を植物ゲノムの中にエクス プレスし、抑制因子又はプリカーサは、（ａ）生体内で作られるウイルス性の転 写又は翻訳を遮断するための相補的オリゴヌクレオチド、（ｂ）ヒアロフォラ（ Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）の細菌性感染に対する液素性反応によって得られた１個 又は２個以上の蛋白質、（ｃ）抗菌性プラスミド、及び（ｄ）昆虫のキチン外皮 を破壊して得られ前記植物を糧とする昆虫が環境から感染されるようにするため のキチナーゼ酵素、の中から選択され、エクスプレスは、前記抑制因子又はプリ カーサの暗号に対応する遺伝子を含有したプラスミドをランダムに結紮して行な われ、Ｔ−ＤＮＡのハインドＩＩＩ（ＨｉｎｄＩＩＩ）１７の断片を組み込んだ 大腸菌の中に抑制因子含有プラスミドを取り込み、不変移Ｒ１プラスミドを運搬 するアグロパクテリア菌の中に組み込み、植物ゲノムで培養することにより、パ ッセンジャー（合成）ＤＮＡを含むＴ−ＤＮＡが植物ゲノムの中に組み込まれ、 植物ゲノムと共に再び生産されて、病原性状態を抑制する効果を発揮するように している。
3. ３．少なくとも１個のポリペプチド抑制因子又は抑制因子プリカーサを暗号化し た遺伝子は、結紮されて植物ペクターｐＭＯＮ２３７の中に組み入れられる請求 の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．通常はウイルスに感染しやすい植物におけるウイルスの成長又は生産を抑制 するため、ウイルスの翻訳を遮断する相補的なオリゴヌクレオチドを暗号化した 遺伝子を植物の中にエクスプレスする請求の範囲第２項に記載の方法。
5. ５．植物の細菌性感染を抑制する方法は、ヒアロフォラ（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ ）の細菌性感染に対する液素性反応によって生じた少なくとも１個の蛋白質を暗 号化した少なくとも１個の遺伝子を、細菌性感染を受けやすい植物のゲノムの中 にエクスプレスする請求の範囲第２項に記載の方法。
6. ６．通常は菌類に感染しやすい植物の菌性感染を抑制するため、菌の成長を抑制 するのに有効な細菌型蛋白質を暗号化した遺伝子を、菌感染を受けやすい植物に エクスプレスする請求の範囲第２項に記載の方法。
7. ７．経済的価値の高い穀類又は繊維植物が鱗翅類の幼虫による被害を受けるのを 阻止するため、キチナーゼ酵素の暗号に対応する遺伝子を穀類又は繊維植物にエ クスプレスし、鱗翅類の幼虫が植物を摂取したとき、キチナーゼ酵素が幼虫のキ チン外皮を破壊し、この破壊によって幼虫を外的環境に感染するようにしている 請求の範囲第２項に記載の方法。
8. ８．徴生物の中にプラスミドを含んだ組成物であって、徴生物は、ヒアロフォラ （Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）の細菌性感染に液素性反応して得られたポリペプチド を暗号化したＤＮＡシーケンスを含有していることを特徴とする組成物。
9. ９．微生物はアグロパクテリアチュームフェイシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である請求の範囲第８項に記載の組成物。
10. １０．ポリペプチドはリゾチーム（１ｙｓｏｚｙｍｅ）、セクロピン（ｃｅｃｒ ｏｐｉｎ）、アタシン（ａｔｔａｃｉｎ）及びそれらの混合物から選択される請 求の範囲第８項に記載の組成物。
11. １１．ポリペプチドはリゾチームである請求の範囲第１０項に記載の組成物。
12. １２．ポリペプチドはセクロピンである請求の範囲第１０項に記載の組成物。
13. １３．ポリペプチドはアタシンである請求の範囲第１０項に記載の組成物。
14. １４．ポリペプチドはリゾチーム、セクロピン及びアタシンの混合物である請求 の範囲第１０項に記載の組成物。
15. １５．ヒアロフォラ（Ｈｙｌｏｐｈｏｒａ）の細菌性感染に液素性反応して得ら れたポリペプチドの暗号に対応する遺伝子。
16. １６．下記のヌクレオチドシーケンスを含んでいる請求の範囲第１５項に記載の 遺伝子。 【配列があります】
17. １７．下記のヌクレオチドシーケンスを含んでいる請求の範囲第１５項に記載の 遺伝子。 【配列があります】
18. １８．下記のヌクレオチドシーケンスを含んでいる請求の範囲第１５項に記載の 遺伝子。 【配列があります】
19. １９．ヒアロフォラ（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）の細菌性感染に対する液素性反応 物を含んでいる合成ポリペプチド。
20. ２０．下記の抗細菌性アミノ酸シーケンスを含んでいる請求の範囲第１９項に記 載のポリペプチド。 【配列があります】
21. ２１．下記の抗細菌性アミノ酸シーケンスを含んでいる請求の範囲第１９項に記 載のポリペプチド。 【配列があります】
22. ２２．下記のアミノ酸シーケンスを含んでいる請求の範囲第１９項に記載の合成 ポリペプチド。 【配列があります】発明の詳細な説明