KR20170002504A - 딱정벌레류 해충에 대한 저항성을 부여하는 dre4 핵산 분자 - Google Patents
딱정벌레류 해충에 대한 저항성을 부여하는 dre4 핵산 분자 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 딱정벌레류 해충에서 표적 코딩 서열 및 전사된 비-코딩 서열의 RNA 간섭-매개된 억제를 통해 딱정벌레류 해충을 방제하기 위한 핵산 분자 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 제조 방법 및 그에 의해 수득된 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.
Description
우선권 주장
본 출원은 2014년 5월 7일에 출원된 발명의 명칭 "딱정벌레류 해충에 대한 저항성을 부여하는 DRE4 핵산 분자(DRE4 NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CONFER RESISTANCE TO COLEOPTERAN PESTS)"의 미국 특허 가출원 일련 번호 61/989,843의 출원일의 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 딱정벌레류 해충에 의해 야기되는 식물 손상의 유전적 방제에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명은 표적 코딩 및 비-코딩 서열의 확인, 및 딱정벌레류 해충의 세포에서의 표적 코딩 및 비-코딩 서열의 발현을 전사후 저해하거나 억제하여 식물 보호 효과를 제공하기 위한 재조합 DNA 기술의 용도에 관한 것이다.
서부 옥수수 뿌리벌레 (WCR)인 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)는 북미에서 가장 파괴적인 옥수수 뿌리벌레 종 중 하나이며, 미국 중서부의 옥수수 재배 지역에서 특히 우려시되고 있다. 북부 옥수수 뿌리벌레 (NCR)인 디아브로티카 바르베리 스미스 및 로렌스(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)는 WCR과 거의 동일한 범위에서 함께 서식하는 매우 밀접하게 관련된 종이다. 북미에서 유의한 해충인 디아브로티카의 여러 다른 관련된 아종이 존재한다: 멕시코 옥수수 뿌리벌레 (MCR), 디. 비르기페라 제아에 크리산 및 스미스(D. virgifera zeae Krysan and Smith); 남부 옥수수 뿌리벌레 (SCR), 디. 운데심푼크타타 호와르디 바버(D. undecimpunctata howardi Barber); 디. 발테아타 르콩트(D. balteata LeConte); 디. 운데심푼크타타 테넬라(D. undecimpunctata tenella); 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임(D. u. undecimpunctata Mannerheim). 미국 농무부(United States Department of Agriculture)는 현재 옥수수 뿌리벌레로 인해 8억 달러의 수확량 손실 및 2억 달러의 처리 비용을 포함하여 매년 10억 달러의 수익 손실을 입고 있다고 추정하고 있다.
WCR 및 NCR 알은 둘 다 여름 동안에 토양에 침착되어 있다. 곤충은 겨울 내내 알 단계로 유지된다. 알은 장방형이고, 백색이며, 길이는 0.004 인치 (0.010 cm) 미만이다. 유충은 5월말 또는 6월초에 부화되고, 정확한 알 부화 시기는 온도차 및 위치에 기인하여 해마다 달라진다. 새로 부화된 유충은 길이가 0.125 인치 (0.3175 cm) 미만인 백색 벌레이다. 일단 부화되고 나면, 유충은 옥수수 뿌리를 섭식하기 시작한다. 옥수수 뿌리벌레는 3회의 유충령 단계를 거친다. 수주 동안 섭식한 후, 유충은 번데기 단계로 탈피한다. 이들은 토양에서 용화된 후, 7월 및 8월에 토양으로부터 성충으로서 출현한다. 성충 뿌리벌레는 길이가 약 0.25 인치 (0.635 cm)이다.
옥수수 뿌리벌레 유충은 옥수수 및 여러 다른 종의 초목에서 발생을 완료한다. 금강아지풀에서 자란 유충은 더 늦게 출현하고, 성충으로서 머리통의 크기는 옥수수에서 자란 유충보다 더 작다 (Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-634). WCR 성충은 옥수수 수염, 화분, 및 이삭 끝에 노출된 커넬을 섭식한다. 옥수수 생식 조직이 존재하기 전에 WCR 성충이 출현하면, 이들은 잎 조직을 섭식할 수 있고, 이에 의해 식물 성장을 저하시키고 때로는 숙주 식물을 사멸시킨다. 그러나, 성충은 선호하는 수염 및 화분을 이용할 수 있게 되면 그쪽으로 빠르게 이동할 것이다. NCR 성충은 또한 옥수수 식물의 생식 조직을 섭식하지만, 대조적으로 옥수수 잎을 섭식하는 경우는 거의 없다.
옥수수에서 뿌리벌레 손상의 대부분은 유충의 섭식에 의해 야기된다. 새로 부화된 뿌리벌레는 초기에는 옥수수의 실뿌리털을 섭식하고, 근단으로 파고 들어간다. 유충의 크기가 점점 커짐에 따라, 이들은 주근을 섭식하고, 그 안으로 파고 들어간다. 옥수수 뿌리벌레가 풍부하게 존재할 때, 유충의 섭식을 통해 대개는 뿌리 전정이 옥수수 자루의 맨 아래 부분까지 이루어진다. 심각한 뿌리 손상은 뿌리가 물 및 영양소를 식물 내로 수송할 수 있는 능력을 방해하고, 식물 성장을 감소시키며, 곡실 생산을 감소시켜, 대개는 전체 수확량을 대폭 감소시킨다. 심각한 뿌리 손상은 또한 대개는 옥수수 식물을 도복시키며, 이로 인해 수확은 더 어려워지고, 수확량은 더 감소하게 된다. 추가로, 성충이 옥수수 생식 조직을 섭식하게 되면, 이삭 끝의 수염의 전정이 일어날 수 있다. 이러한 "수염 클리핑"이 화분 방출 동안에 충분히 심각하게 일어난다면, 수분은 파괴될 수 있다.
옥수수 뿌리벌레의 방제는 윤작, 화학 살곤충제, 생물살충제 (예를 들어, 포자-형성 그람-양성 박테리아인 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)) 또는 그의 조합에 의해 시도될 수 있다. 윤작시에는 농지 사용에 대해 원치않는 제한이 따른다는 유의한 단점으로 어려움을 겪게 된다. 더욱이, 일부 뿌리벌레 종의 산란은 대두 재배지에서 일어날 수 있고, 이에 의해 옥수수 및 대두로 실시되는 윤작의 효과는 경감될 수 있다.
화학 살곤충제는 옥수수 뿌리벌레 방제를 달성하는 전략에 가장 크게 의존한다. 화학 살곤충제 사용이 비록 불완전한 옥수수 뿌리벌레 방제 전략이기는 하지만; 살곤충제 사용에도 불구하고 일어날 수 있는 뿌리벌레 손상의 비용에 화학 살곤충제 비용을 더하였을 때, 매년 미국에서는 옥수수 뿌리벌레에 기인하여 10억 달러 초과의 비용이 손실될 수 있다. 고밀도 유충 집단, 폭우 및 살곤충제(들)의 부적절한 적용은 모두 옥수수 뿌리벌레의 부적절한 방제를 유발할 수 있다. 추가로, 살곤충제를 계속해서 사용하게 되면 살곤충제-저항성 뿌리벌레 균주가 선택될 수 있을 뿐만 아니라, 비-표적 종에 대한 다수의 독성으로 인해 환경에 대한 유의한 우려가 제기될 수 있다.
RNA 간섭 (RNAi)은 내인성 세포 경로를 이용하는 과정이며, 이에 의해 표적 유전자 서열의 모두 또는 그의 적절한 크기의 임의의 부분에 특이적인 간섭 RNA (iRNA) 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)는 그에 의해 코딩되는 mRNA의 분해를 유발한다. 최근 수년간, RNAi는 수많은 종 및 실험 시스템; 예를 들어 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 식물, 곤충 배아 및 조직 배양에서의 세포에서 유전자 "녹다운"을 수행하는데 사용되었다. 예를 들어, 문헌 [Fire et al. (1998) Nature 391:806-811; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747]을 참조한다.
RNAi는 DICER 단백질 복합체를 포함한 내인성 경로를 통해 mRNA의 분해를 달성한다. DICER는 긴 dsRNA 분자를, 소형 간섭 RNA (siRNA)로 칭해지는 대략 20개의 뉴클레오티드의 짧은 단편으로 절단한다. siRNA는 두 단일-가닥 RNA: 패신저 가닥 및 가이드 가닥으로 풀린다. 패신저 가닥은 분해되고, 가이드 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입된다. 마이크로 억제 리보핵산 (miRNA) 분자는 RISC 내로 유사하게 혼입될 수 있다. 가이드 가닥이 mRNA 분자의 상보적 서열에 특이적으로 결합하고, RISC 복합체의 촉매 성분인 아르고노트(Argonaute)에 의한 절단을 유도할 때, 전사후 유전자 침묵이 일어난다. 이러한 과정은 일부 진핵생물, 예컨대 식물, 선충류 및 일부 곤충에서는 초기에 siRNA 및/또는 miRNA의 농도가 제한됨에도 불구하고, 유기체 전반에 걸쳐 체계적으로 확산되는 것으로 알려져 있다.
미국 특허 번호 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860, 2010/0192265 및 2011/0154545에는, 디. 브이. 비르기페라 르콩트 번데기로부터 단리된 9112개의 발현된 서열 태그 (EST) 서열의 라이브러리가 개시되어 있다. 미국 특허 번호 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860에는, 식물 세포에서의 안티-센스 RNA의 발현을 위한 것으로 본원에 개시된 디. 브이. 비르기페라 공포-유형 H+-ATPase (V-ATPase)의 여러 특정한 부분적 서열 중 1종에 상보적인 핵산 분자를 프로모터에 작동가능하게 연결시키는 것이 시사되어 있다. 미국 특허 공개 번호 2010/0192265에는, 식물 세포에서의 안티-센스 RNA의 발현을 위해 기능하는 것으로 알려지지 않고 개시되지 않은 디. 브이. 비르기페라 유전자의 특정한 부분적 서열 (부분적 서열은 씨. 엘레간스에서의 C56C10.3 유전자 산물에 대해 58% 동일한 것으로 기재됨)에 상보적인 핵산 분자에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 것이 시사되어 있다. 미국 특허 공개 번호 2011/0154545에는, 식물 세포에서의 안티-센스 RNA의 발현을 위한 디. 브이. 비르기페라 코토머 베타 서브유닛 유전자 중 2종의 특정한 부분적 서열에 상보적인 핵산 분자에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 것이 시사되어 있다. 추가로, 미국 특허 번호 7,943,819에는, 디. 브이. 비르기페라 르콩트 유충, 번데기 및 해부된 미드젯으로부터 단리된 906개의 발현된 서열 태그 (EST) 서열의 라이브러리가 개시되어 있고, 식물 세포에서의 이중-가닥 RNA의 발현을 위한 디. 브이. 비르기페라 적재된 다소포체 단백질 4b 유전자의 특정한 부분적 서열에 상보적인 핵산 분자에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 것이 시사되어 있다.
미국 특허 번호 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860, 2010/0192265 및 2011/0154545에는, V-ATPase의 여러 특정한 부분적 서열 및 알려지지 않은 기능의 유전자의 특정한 부분적 서열 이외에, RNA 간섭을 위한 것으로 상기 문헌에 열거된 9천개 초과의 서열 중 임의의 특정한 서열을 사용하는 것에 대한 추가의 시사가 제공되어 있지 않다. 게다가, 미국 특허 번호 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860 및 2010/0192265 및 2011/0154545 중 어디에도, 제공된 9천개 초과의 서열 중 어느 다른 것이 dsRNA 또는 siRNA로서 사용될 때 옥수수 뿌리벌레 종에서 치명적일 수 있거나 또는 심지어 다르게는 유용할 수 있을 지에 관한 어떠한 지침도 제공되어 있지 않다. 미국 특허 번호 7,943,819에는, 적재된 다소포체 단백질 4b 유전자의 특정한 부분적 서열 이외에, RNA 간섭을 위한 것으로 상기 문헌에 열거된 9백개 초과의 서열 중 임의의 특정한 서열을 사용하는 것에 대한 시사가 제공되어 있지 않다. 추가로, 미국 특허 번호 7,943,819에는, 제공된 9백개 초과의 서열 중 어느 다른 것이 dsRNA 또는 siRNA로 사용될 때 옥수수 뿌리벌레 종에서 치명적일 수 있거나 또는 심지어 다르게는 유용할 수 있을 지에 관한 지침이 제공되어 있지 않다. 미국 특허 출원 공개 번호 U.S. 2013/040173 및 PCT 출원 공개 번호 WO 2013/169923에는, 메이즈에서 RNA 간섭을 위한 디아브로티카 비르기페라 Snf7 유전자로부터 유래된 서열의 사용이 기재되어 있다. (또한 문헌 [Bolognesi et al. (2012) PLos ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534]에 개시되어 있다).
옥수수 뿌리벌레 DNA에 상보적인 서열 (예컨대, 상기의 것) 중 압도적 다수가 dsRNA 또는 siRNA로 사용될 때 옥수수 뿌리벌레 종에서 치명적이지 않다. 예를 들어, 문헌 [Baum et al. (2007, Nature Biotechnology 25:1322-1326)]에는, RNAi에 의해 여러 WCR 유전자 표적을 억제하는 효과가 기재되어 있다. 이들 저자는, 그들이 시험한 26개의 표적 유전자 중 8개는 520 ng/cm2 초과의 매우 높은 iRNA (예를 들어, dsRNA) 농도에서 실험상 유의한 딱정벌레류 해충 사멸률을 제공할 수 없다는 것을 보고하였다.
핵산 분자 (예를 들어, 표적 유전자, DNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA 및 hpRNA), 및 예를 들어 디. 브이. 비르기페라 르콩트 (서부 옥수수 뿌리벌레, "WCR"); 디. 바르베리 스미스 및 로렌스 (북부 옥수수 뿌리벌레, "NCR"); 디. 유. 호와르디 바버 (남부 옥수수 뿌리벌레, "SCR"); 디. 브이. 제아에 크리산 및 스미스 (멕시코 옥수수 뿌리벌레, "MCR"); 디. 발테아타 르콩트; 디. 유. 테넬라; 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임을 포함한 딱정벌레류 해충의 방제를 위한 그의 사용 방법이 본원에 개시된다. 특정한 예에서, 딱정벌레류 해충에서의 1종 이상의 천연 핵산 서열 중 적어도 일부분에 상동일 수 있는 예시적인 핵산 분자가 개시된다.
이들 및 추가의 예에서, 천연 핵산 서열은 표적 유전자일 수 있고, 그의 산물은 예를 들어 및 비제한적으로: 대사 과정에 수반되거나; 생식 과정에 수반되거나; 또는 유충 발생에 수반될 수 있다. 일부 예에서, 표적 유전자의 발현을, 그에 상동인 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 번역후 억제하는 것은, 딱정벌레류 해충에서 치명적일 수 있거나, 또는 성장 및/또는 발생을 감소시킬 수 있다. 구체적 예에서, dre4 유전자는 전사후 침묵을 위한 표적 유전자로서 선택될 수 있다. 따라서, 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 dre4 유전자의 뉴클레오티드 서열; 서열식별번호: 1의 상보체; 및 상기 중 어느 것의 단편을 포함하는 단리된 핵산 분자가 본원에 개시된다.
또한, dre4의 유전자 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드로 인 실리코 역번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 개시된다. 추가로, dre4의 유전자 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드로 인 실리코 역번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열의 역 상보체인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 개시된다.
또한, dre4 딱정벌레류 해충 표적 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA) 분자를 생산하는데 사용될 수 있는 cDNA 서열이 개시된다. 특정한 실시양태에서, dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA는 유전자 변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관내 또는 생체내에서 생산될 수 있다. 특정한 예에서, 서열식별번호: 1의 dre4 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 iRNA 분자를 생산하는데 사용될 수 있는 cDNA 분자가 개시된다.
추가로, 딱정벌레류 해충에서의 필수 dre4 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단, 및 식물에 딱정벌레류 해충 저항성을 제공하기 위한 수단이 개시된다. 딱정벌레류 해충에서의 필수 dre4 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단은 서열식별번호: 2 (dre4 영역 1, 본원에서 때때로 dre4 reg1로 지칭됨), 서열식별번호: 3 (dre4 영역 2, 본원에서 때때로 dre4 reg2로 지칭됨), 서열식별번호: 4 (dre4 영역 3, 본원에서 때때로 dre4 reg3으로 지칭됨) 또는 그의 상보체 중 어느 것으로 이루어진 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. 딱정벌레류 해충에서의 필수 dre4 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 기능적 등가물은 서열식별번호: 1을 포함하는 WCR 유전자의 전부 또는 일부에 실질적으로 상동인 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. 식물에 딱정벌레류 dre4 해충 저항성을 제공하기 위한 수단은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 딱정벌레류 해충에서의 필수 dre4 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA 분자이며, 여기서 DNA 분자는 메이즈 식물의 게놈 내로 통합될 수 있다.
딱정벌레류 해충에 의해 흡수되었을 때 딱정벌레류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA) 분자를 딱정벌레류 해충에게 제공하는 것을 포함하며, 여기서 iRNA 분자는 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 전부 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1의 전부 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1의 전부 또는 일부를 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 및 서열식별번호: 1의 전부 또는 일부를 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것인, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법이 개시된다.
특정한 예에서, 딱정벌레류 해충에 의해 흡수되었을 때 딱정벌레류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA) 분자를 딱정벌레류 해충에게 제공하는 것을 포함하며, 여기서 iRNA 분자는 서열식별번호: 1의 전부 또는 일부; 서열식별번호: 1의 전부 또는 일부의 상보체; 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 2의 상보체; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 3의 상보체; 서열식별번호: 4; 및 서열식별번호: 4의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법이 개시된다.
또한, 먹이-기반 검정에서 또는 dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA를 발현하는 유전자 변형된 식물 세포에서 dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA를 딱정벌레류 해충에게 제공할 수 있는 방법이 본원에 개시된다. 이들 및 추가의 예에서, dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA는 딱정벌레류 해충 유충에 의해 섭취될 수 있다. 이어서, 본 발명의 dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA의 섭취를 통해 유충에서 RNAi가 생성될 수 있고, 차례로 딱정벌레류 해충의 생존율에 필수적인 유전자의 침묵이 일어날 수 있고, 이에 의해 궁극적으로는 유충 사멸에 이를 수 있다. 따라서, 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 예시적인 핵산 서열(들)을 포함하는 핵산 분자를 딱정벌레류 해충에게 제공하는 방법이 개시된다. 특정한 예에서, 본 발명의 핵산 분자를 사용하여 방제된 딱정벌레류 해충은 WCR, SCR 또는 NCR일 수 있다.
상기 및 다른 특색은 첨부 도면을 참조로 하여 진행되는, 여러 실시양태의 하기 상세한 설명으로부터 보다 분명해질 것이다.
도 1은 단일 전사 주형 (도 1A) 및 2개의 전사 주형 (도 1B)을 사용하여 dsRNA를 생성하기 위한 특정 주형을 제공하는데 사용된 전략의 도시를 포함한다.
[서열 목록]
첨부 서열 목록에 열거된 핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에 규정된 바와 같이 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 각 핵산 서열의 단지 한 가닥만이 제시되어 있지만, 디스플레이된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 상보적 가닥 및 역 상보적 가닥도 포함되는 것으로 이해된다. 첨부 서열 목록에서:
서열식별번호: 1은 예시적인 디아브로티카 dre4 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 2-4는 시험관내 dsRNA 합성에 사용된 디아브로티카 dre4 (dre4 reg1 (영역 1), dre4 reg2 (영역 2) 및 dre4 reg3 (영역 3))의 예시적인 비-인접 단편을 제시한다 (5' 및 3' 말단에서의 T7 프로모터 서열은 제시되지 않음).
서열식별번호: 5는 T7 파지 프로모터의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 6은 시험관내 dsRNA 합성에 사용된 YFP 코딩 영역 절편의 DNA 서열을 제시한다 (5' 및 3' 말단에서의 T7 프로모터 서열은 제시되지 않음).
서열식별번호: 7-12는 dre4 reg1, dre4 reg2 및 dre4 reg3을 포함하는 dre4 서열의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 제시한다.
서열식별번호: 13은 디아브로티카 dre4 헤어핀 v1-RNA-형성 서열 (핵산 분자, pDAB114546에서 발견된 바와 같은 것)을 제시한다. dre4 센스 가닥은 대문자로 열거된 염기 위치로 이루어지고, ST-LS1 인트론은 밑줄표시로 열거된 염기 위치로 이루어지고, dre4 안티센스 가닥은 밑줄표시되지 않은 소문자로 열거된 염기 위치로 이루어진다:
서열식별번호: 14는 디아브로티카 dre4 헤어핀 v2-RNA-형성 서열 (핵산 분자, pDAB114547에서 발견된 바와 같은 것)을 제시한다. dre4 센스 가닥은 대문자로 열거된 염기 위치로 이루어지고, ST-LS1 인트론은 밑줄표시로 열거된 염기 위치로 이루어지고, dre4 안티센스 가닥은 밑줄표시되지 않은 소문자로 열거된 염기 위치로 이루어진다:
서열식별번호: 15는 YFP 헤어핀-RNA-형성 서열 v2 (핵산 분자, pDAB110853에서 발견된 바와 같은 것)를 제시한다. YFP 센스 가닥은 대문자로 열거된 염기 위치로 이루어지고, ST-LS1 인트론은 밑줄표시로 열거된 염기 위치로 이루어지고, YFP 안티센스 가닥은 밑줄표시되지 않은 소문자로 열거된 염기 위치로 이루어진다.
서열식별번호: 16은 ST-LS1 인트론을 포함하는 서열을 제시한다.
서열식별번호: 17은 pDAB101556에서 발견된 바와 같은 YFP 단백질 코딩 서열을 제시한다.
서열식별번호: 18은 아넥신 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 19는 아넥신 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 20은 베타 스펙트린 2 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 21은 베타 스펙트린 2 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 22는 mtRP-L4 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 23은 mtRP-L4 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 24-51은 dsRNA 합성을 위한 아넥신, 베타 스펙트린 2, mtRP-L4 및 YFP의 유전자 영역을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 제시한다.
서열식별번호: 52는 TIP41-유사 단백질을 코딩하는 메이즈 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 53은 올리고뉴클레오티드 T20NV의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 54-58은 메이즈 전사체 수준을 측정하는데 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 59는 이원 벡터 백본 검출에 사용된 SpecR 코딩 영역의 일부분의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 60은 게놈 카피수 분석에 사용된 AAD1 코딩 영역의 일부분의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 61은 메이즈 인버타제 유전자의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 62-70은 유전자 카피수 분석에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 71-73은 메이즈 발현 분석에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 74는 메이즈 전사체 수준을 측정하는데 사용된 프로브의 서열을 제시한다.
[서열 목록]
첨부 서열 목록에 열거된 핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에 규정된 바와 같이 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 각 핵산 서열의 단지 한 가닥만이 제시되어 있지만, 디스플레이된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 상보적 가닥 및 역 상보적 가닥도 포함되는 것으로 이해된다. 첨부 서열 목록에서:
서열식별번호: 1은 예시적인 디아브로티카 dre4 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 2-4는 시험관내 dsRNA 합성에 사용된 디아브로티카 dre4 (dre4 reg1 (영역 1), dre4 reg2 (영역 2) 및 dre4 reg3 (영역 3))의 예시적인 비-인접 단편을 제시한다 (5' 및 3' 말단에서의 T7 프로모터 서열은 제시되지 않음).
서열식별번호: 5는 T7 파지 프로모터의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 6은 시험관내 dsRNA 합성에 사용된 YFP 코딩 영역 절편의 DNA 서열을 제시한다 (5' 및 3' 말단에서의 T7 프로모터 서열은 제시되지 않음).
서열식별번호: 7-12는 dre4 reg1, dre4 reg2 및 dre4 reg3을 포함하는 dre4 서열의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 제시한다.
서열식별번호: 13은 디아브로티카 dre4 헤어핀 v1-RNA-형성 서열 (핵산 분자, pDAB114546에서 발견된 바와 같은 것)을 제시한다. dre4 센스 가닥은 대문자로 열거된 염기 위치로 이루어지고, ST-LS1 인트론은 밑줄표시로 열거된 염기 위치로 이루어지고, dre4 안티센스 가닥은 밑줄표시되지 않은 소문자로 열거된 염기 위치로 이루어진다:
서열식별번호: 14는 디아브로티카 dre4 헤어핀 v2-RNA-형성 서열 (핵산 분자, pDAB114547에서 발견된 바와 같은 것)을 제시한다. dre4 센스 가닥은 대문자로 열거된 염기 위치로 이루어지고, ST-LS1 인트론은 밑줄표시로 열거된 염기 위치로 이루어지고, dre4 안티센스 가닥은 밑줄표시되지 않은 소문자로 열거된 염기 위치로 이루어진다:
서열식별번호: 15는 YFP 헤어핀-RNA-형성 서열 v2 (핵산 분자, pDAB110853에서 발견된 바와 같은 것)를 제시한다. YFP 센스 가닥은 대문자로 열거된 염기 위치로 이루어지고, ST-LS1 인트론은 밑줄표시로 열거된 염기 위치로 이루어지고, YFP 안티센스 가닥은 밑줄표시되지 않은 소문자로 열거된 염기 위치로 이루어진다.
서열식별번호: 16은 ST-LS1 인트론을 포함하는 서열을 제시한다.
서열식별번호: 17은 pDAB101556에서 발견된 바와 같은 YFP 단백질 코딩 서열을 제시한다.
서열식별번호: 18은 아넥신 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 19는 아넥신 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 20은 베타 스펙트린 2 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 21은 베타 스펙트린 2 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 22는 mtRP-L4 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 23은 mtRP-L4 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 24-51은 dsRNA 합성을 위한 아넥신, 베타 스펙트린 2, mtRP-L4 및 YFP의 유전자 영역을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 제시한다.
서열식별번호: 52는 TIP41-유사 단백질을 코딩하는 메이즈 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 53은 올리고뉴클레오티드 T20NV의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 54-58은 메이즈 전사체 수준을 측정하는데 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 59는 이원 벡터 백본 검출에 사용된 SpecR 코딩 영역의 일부분의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 60은 게놈 카피수 분석에 사용된 AAD1 코딩 영역의 일부분의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 61은 메이즈 인버타제 유전자의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 62-70은 유전자 카피수 분석에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 71-73은 메이즈 발현 분석에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 74는 메이즈 전사체 수준을 측정하는데 사용된 프로브의 서열을 제시한다.
I. 여러 실시양태의 개관
딱정벌레류 해충 침입의 유전적 방제를 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 딱정벌레류 해충 집단의 RNAi-매개된 방제를 위한 표적 유전자로서 사용하기 위한, 딱정벌레류 해충의 생활주기에 필수적인 1종 이상의 유전자(들)를 확인하는 방법이 또한 제공된다. 1종 이상의 dsRNA 분자를 코딩하는 DNA 플라스미드 벡터는 성장, 생존, 발생 및/또는 생식에 필수적인 1종 이상의 표적 유전자(들)를 억제하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자를 통해 표적 유전자의 발현을 전사후 저해하거나 또는 표적 유전자를 억제하는 방법이 제공된다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 딱정벌레류 해충은 표적 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자의 전부 또는 일부분으로부터 전사되는 1종 이상의 dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA 분자를 섭취할 수 있고, 이에 의해 식물-보호 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태는 표적 유전자(들)의 코딩 및/또는 비-코딩 서열에 상보적인 dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA를 사용하여 표적 유전자 산물의 발현을 서열 특이적으로 억제함으로써 딱정벌레류 해충의 적어도 부분적인 방제를 달성하는 것을 수반한다. 예를 들어, 서열식별번호: 1-4 중 어느 것에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 및 그의 단편을 포함하는 일련의 단리 및 정제된 핵산 분자가 개시된다. 일부 실시양태에서, 안정화된 dsRNA 분자는 표적 유전자의 전사후 침묵 또는 억제를 위해 이러한 서열, 그의 단편 또는 이들 서열 중 1종을 포함하는 유전자로부터 발현될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 핵산 분자는 서열식별번호: 1의 전부 또는 일부 또는 그의 상보체 (예를 들어, 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 2의 상보체; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 3의 상보체; 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 4의 상보체)를 포함한다.
일부 실시양태는 적어도 1종의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 적어도 1종의 재조합 DNA 서열을 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포)를 수반한다. 특정한 실시양태에서, dsRNA 분자(들)는 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되었을 때 생산되어 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자를 전사후 침묵시키거나 또는 그의 발현을 억제할 수 있다. 재조합 DNA 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 1-4 중 어느 것; 서열식별번호: 1-4 중 어느 것의 단편; 또는 서열식별번호: 1-4 중 1종 이상을 포함하는 유전자의 부분적 서열; 및 그의 상보체 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태는 서열식별번호: 1의 전부 또는 일부를 포함하는 적어도 1종의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 재조합 DNA 서열을 그의 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포를 수반한다. iRNA 분자(들)는, 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되었을 때, 딱정벌레류 해충에서 서열식별번호: 1을 포함하는 표적 유전자를 침묵시키거나 또는 그의 발현을 억제할 수 있고, 이에 의해 딱정벌레류 해충에서 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 중지시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 dsRNA 분자를 코딩하는 적어도 1종의 재조합 DNA 서열을 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포는 형질전환된 식물 세포일 수 있다. 일부 실시양태는 이러한 형질전환된 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물을 수반한다. 이러한 트랜스제닉 식물에 추가로, 각각의 것이 재조합 DNA 서열(들)을 포함하는 것인, 임의의 트랜스제닉 식물 세대의 자손 식물, 트랜스제닉 종자 및 트랜스제닉 식물 산물 모두가 제공된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 이들 및 다른 실시양태에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포로부터 단리될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)), 대두 (글리신 맥스(Glycine max)) 및 포아세아에(Poaceae) 과의 식물을 포함하는 군으로부터 선택되는 식물이다.
일부 실시양태는 딱정벌레류 해충 세포에서의 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법을 수반한다. 이들 및 다른 실시양태에서, dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공될 수 있다. 특정한 실시양태에서, dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이는 또한 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 세포에서의 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법은 (a) dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계; (b) 복수개의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물이 발생하도록 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계; (c) 벡터가 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계; 및 (d) 선택된 형질전환된 식물 세포가 벡터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 식물은, 게놈 내에 벡터가 통합되어 있으며 벡터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는 식물 세포로부터 재생될 수 있다.
따라서, dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터가 게놈 내에 통합되어 있는 트랜스제닉 식물이며, 여기서 트랜스제닉 식물은 벡터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는 것인 트랜스제닉 식물이 또한 개시된다. 특정한 실시양태에서, 식물에서 dsRNA 분자의 발현은, 예를 들어 형질전환된 식물, 식물의 일부 (예를 들어, 뿌리) 또는 식물 세포를 섭식함으로써 형질전환된 식물 또는 식물 세포와 접촉하는 딱정벌레류 해충의 세포에서의 표적 유전자의 발현을 조절하는데 충분하다. 본원에 개시된 트랜스제닉 식물은 딱정벌레류 해충 침입에 대해 저항성 및/또는 증진된 내성을 디스플레이할 수 있다. 특정한 트랜스제닉 식물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 딱정벌레류 해충에 대한 저항성 및/또는 증진된 내성을 디스플레이할 수 있다: WCR; NCR; SCR; MCR; 디. 발테아타 르콩트; 디. 유. 테넬라; 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임.
또한 방제제, 예컨대 iRNA 분자를 딱정벌레류 해충에게 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 이러한 방제제는 직접 또는 간접적으로, 섭식, 성장할 수 있는 딱정벌레류 해충의 능력에 장애를 야기할 수 있거나 또는 다르게는 숙주에 손상을 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화된 dsRNA 분자를 딱정벌레류 해충에게 전달하여 딱정벌레류 해충에서의 적어도 1종의 표적 유전자를 억제함으로써 딱정벌레류 해충에 의한 식물 손상을 감소시키거나 제거하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법은 딱정벌레류 해충에서의 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 중지시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 결국 딱정벌레류 해충을 사멸에 이르게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 침입을 제거 또는 감소시키기 위해 식물, 동물, 및/또는 식물 또는 동물의 환경에서 사용하기 위한 본 발명의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자를 포함하는 조성물 (예를 들어, 국소 조성물)이 제공된다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 딱정벌레류 해충에게 섭식될 영양 조성물 또는 먹이원일 수 있다. 일부 실시양태는 딱정벌레류 해충에게 이용가능한 영양 조성물 또는 먹이원을 제조하는 것을 포함한다. iRNA 분자를 포함하는 조성물을 섭취하게 되면 상기 분자는 딱정벌레류 해충의 1종 이상의 세포에 의해 섭취될 수 있고, 차례로 딱정벌레류 해충의 세포(들)에서의 적어도 1종의 표적 유전자의 발현이 억제될 수 있다. 본 발명의 iRNA 분자를 포함하는 1종 이상의 조성물을 딱정벌레류 해충의 숙주에 제공함으로써 딱정벌레류 해충에 의한 식물 또는 식물 세포의 섭취 또는 그에의 손상은 임의의 숙주 조직 내 또는 그 위에서 또는 딱정벌레류 해충이 존재하는 환경에서 제한되거나 또는 제거될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 딱정벌레류 해충에 의한 손상을 방제하기 위한 다른 방법 및 조성물과 함께 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 딱정벌레류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 것으로 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 분자는 딱정벌레류 해충에 대해 효과적인 1종 이상의 화학적 작용제, 딱정벌레류 해충에 대해 효과적인 생물살충제, 윤작, 또는 본 발명의 RNAi-매개된 방법 및 RNAi 조성물의 특색과 상이한 특색을 나타내는 재조합 유전자 기술 (예를 들어, 딱정벌레류 해충에게 유해한 단백질 (예를 들어, Bt 독소)을 식물에서 재조합적으로 생산하는 것)의 추가의 사용을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
II. 약어
dsRNA
이중-가닥 리보핵산
GI
성장 억제
NCBI
국립 생물 정보 센터
gDNA
게놈 DNA
iRNA
억제 리보핵산
ORF
오픈 리딩 프레임
RNAi
리보핵산 간섭
miRNA
마이크로 리보핵산
shRNA
짧은 헤어핀 리보핵산
siRNA
소형 억제 리보핵산
hpRNA
헤어핀 리보핵산
UTR
비번역 영역
WCR
서부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트)
NCR
북부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 바르베리 스미스 및 로렌스)
MCR
멕시코 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 제아에 크리산 및 스미스)
PCR
폴리머라제 연쇄 반응
RISC
RNA-유도 침묵 복합체
SCR
남부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디 바버)
YFP
황색 형광 단백질
III. 용어
하기 설명 및 표에서, 수많은 용어가 사용된다. 주어진 이러한 용어의 범주를 포함한, 본 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다:
딱정벌레류 해충: 본원에 사용된 용어 "딱정벌레류 해충"은 옥수수 및 다른 볏과 식물을 섭식하는 디아브로티카 속의 곤충을 지칭한다. 특정한 예에서, 딱정벌레류 해충은 디. 브이. 비르기페라 르콩트 (WCR); 디. 바르베리 스미스 및 로렌스 (NCR); 디. 유. 호와르디 (SCR); 디. 브이. 제아에 (MCR); 디. 발테아타 르콩트; 디. 유. 테넬라; 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
접촉 (유기체와): 핵산 분자에 관하여 본원에 사용된 용어 유기체 (예를 들어, 딱정벌레류 해충)"와 접촉하다" 또는 "에 의해 섭취되다"는 유기체 내로의 핵산 분자의 내재화, 예를 들어 및 비제한적으로: 유기체에 의한 분자의 섭취 (예를 들어, 섭식에 의함); 핵산 분자를 포함하는 조성물과 유기체를 접촉시키기는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 용액으로 유기체를 침지시키는 것을 포함한다.
콘티그: 본원에 사용된 용어 "콘티그"는 단일 유전자 공급원으로부터 유래된 중첩 DNA 절편의 세트로부터 재구성되는 DNA 서열을 지칭한다.
옥수수 식물: 본원에 사용된 용어 "옥수수 식물"은 제아 메이스 (메이즈) 종의 식물을 지칭한다.
dsRNA를 코딩하는: 본원에 사용된 용어 "dsRNA를 코딩하는"은 RNA 전사 산물이 분자내 dsRNA 구조 (예를 들어, 헤어핀)를 형성할 수 있거나 분자간 dsRNA 구조를 형성할 수 있는 (예를 들어, 표적 RNA 분자에 혼성화되는 것에 의함) 것인 유전자를 포함한다.
발현: 본원에 사용된, 코딩 서열 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스진)의 "발현"은 핵산 전사 단위 (예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA 포함)의 코딩된 정보가 세포의 작동적, 비-작동적 또는 구조적 일부로 전환되는 과정 (종종 단백질의 합성을 포함함)을 지칭한다. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에의 세포, 조직 또는 유기체 노출에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자의 발현은 DNA에서 RNA를 거쳐 단백질로의 경로 중 어디에서나 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은, 예를 들어 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 분해에 작용하는 방제를 통해, 또는 특정 단백질 분자가 제조된 후에 그에 대한 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 일어난다. 유전자 발현은 비제한적으로, 노던 (RNA) 블롯, RT-PCR, 웨스턴 (이뮤노-) 블롯, 또는 시험관내, 계내 또는 생체내 단백질 활성 검정(들)을 포함한, 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
유전 물질: 본원에 사용된 용어 "유전 물질"은 모든 유전자 및 핵산 분자, 예컨대 DNA 및 RNA를 포함한다.
억제: 본원에 사용된 용어 "억제"는 코딩 서열 (예를 들어, 유전자)에 대한 효과를 기재하는데 사용될 때, 코딩 서열로부터 전사된 mRNA, 및/또는 코딩 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 산물의 세포 수준이 측정가능할 정도로 감소된 것을 지칭한다. 일부 예에서, 코딩 서열의 발현은 발현이 거의 제거될 정도로 억제될 수 있다. "특이적 억제"는 특이적 억제가 달성되는 세포에서 결과적으로 다른 코딩 서열 (예를 들어, 유전자)의 발현에는 영향을 미치지 않으면서 표적 코딩 서열을 억제하는 것을 지칭한다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대, 핵산 또는 단백질)은 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)로부터 실질적으로 분리되거나, 그를 제외하고 생산되거나 또는 그로부터 정제된 것이다. "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 또한, 용어는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드를 포함한다.
핵산 분자: 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 RNA, cDNA, 게놈 DNA 및 상기한 것의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는, 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 어느 한 유형의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 핵산 분자는 보통 달리 명시되지 않는 한, 적어도 10개의 염기 길이이다. 관례상, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 분자의 5' 말단에서 3' 말단으로 판독된다. 뉴클레오티드 서열의 "상보체"는 뉴클레오티드 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성하는 (즉, A-T/U 및 G-C) 5'에서 3'로의 핵염기 서열을 지칭한다. 핵산 서열의 "역 상보체"는 뉴클레오티드 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성하는 3'에서 5'로의 핵염기 서열을 지칭한다.
"핵산 분자"는 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA; 단일-가닥 형태의 RNA; 및 이중-가닥 형태의 RNA (dsRNA)를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 개별 단일 가닥으로서 또는 듀플렉스로 핵산의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 지칭한다. 용어 "리보핵산" (RNA)은 iRNA (억제 RNA), dsRNA (이중 가닥 RNA), siRNA (소형 간섭 RNA), mRNA (메신저 RNA), miRNA (마이크로-RNA), hpRNA (헤어핀 RNA), tRNA (상응하는 아실화된 아미노산이 적재된 또는 적재되지 않은 전달 RNA), 및 cRNA (상보적 RNA)를 포함한다. 용어 "데옥시리보핵산" (DNA)은 cDNA, 게놈 DNA, 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다. 용어 "핵산 절편" 및 "뉴클레오티드 서열 절편" 또는 보다 일반적으로 "절편"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 게놈 서열, 리보솜 RNA 서열, 전달 RNA 서열, 메신저 RNA 서열, 오페론 서열, 및 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하거나 또는 그를 코딩하도록 적합화될 수 있는 보다 소형의 조작된 뉴클레오티드 서열 둘 다를 포함하는 기능적 용어로서 이해될 것이다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 단쇄의 핵산 중합체이다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 핵산 절편의 절단에 의해 또는 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합에 의해 형성될 수 있다. 자동 합성기를 통해 최대 수백 개의 염기 길이의 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, 이는 DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA로 구성된 올리고뉴클레오티드 (올리고데옥시리보뉴클레오티드)는 DNA 및 RNA (cDNA로 역전사됨) 서열의 증폭을 위한 기술인 PCR에서 사용될 수 있다. PCR에서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 DNA 폴리머라제가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적 가닥을 복제하도록 하는 "프라이머"로 지칭된다.
핵산 분자는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-자연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 표지, 메틸화, 자연 발생 뉴클레오티드 중 1종 이상의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비하전된 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 팬던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제: 예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스, 트리플렉스, 헤어핀, 원형 및 패드록 입체형태를 포함한 임의의 위상 입체형태를 또한 포함한다.
DNA와 관련하여 본원에 사용된 용어 "코딩 서열", "구조적 뉴클레오티드 서열" 또는 "구조적 핵산 분자"는 궁극적으로는 적절한 조절 서열의 제어 하에 배치되었을 때 전사 및 mRNA를 통해 폴리펩티드로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. RNA와 관련하여 용어 "코딩 서열"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단의 번역 개시 코돈 및 3'-말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA; cDNA; EST; 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
게놈: 본원에 사용된 용어 "게놈"은 세포의 핵 내에서 발견되는 염색체 DNA를 지칭하고, 이는 또한 세포의 세포하 성분 내에서 발견되는 소기관 DNA를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 DNA 분자가 식물 세포의 게놈 내로 통합되도록 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, DNA 분자는 식물 세포의 핵 DNA 내로 통합될 수 있거나 또는 식물 세포의 엽록체 또는 미토콘드리아의 DNA 내로 통합될 수 있다. 용어 "게놈"이 박테리아에 적용되는 경우에, 이는 박테리아 세포 내의 염색체 및 플라스미드 둘 다를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 DNA 분자가 박테리아의 게놈 내로 통합되도록 박테리아 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, DNA 분자는 안정한 플라스미드로서 또는 그러한 것으로 염색체-통합될 수 있거나 또는 위치할 수 있다.
서열 동일성: 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 윈도우에 대해 최대로 상응하도록 정렬하였을 때, 2개의 서열 중의 잔기가 동일한 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 대해 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있으며, 여기서 비교 윈도우에서의 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여, 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 두 서열에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매치된 위치의 수를 산출하고, 매치된 위치의 수를 비교 윈도우에서의 위치의 총수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 참조 서열과의 비교시 모든 위치에서 동일한 서열을 참조 서열에 대해 100% 동일하다고 말할 수 있으며, 그 반대의 경우도 그러하다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어 다음의 문헌들에 기재되어 있다: [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250]. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고찰은, 예를 들어 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에서 찾아볼 수 있다.
국립 생물 정보 센터 (NCBI) 베이식 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST™; 문헌 [Altschul et al. (1990)])은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베테스다)를 포함한 여러 공급원으로부터 및 인터넷 상에서 이용가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션 하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터로 설정된 디폴트 BLOSUM62 행렬을 사용하는 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능이 사용될 수 있다. 참조 서열에 대해 보다 큰 유사성을 갖는 핵산 서열은 이러한 방법에 의해 평가하는 경우에 증가하는 동일성 백분율을 나타낼 것이다.
특이적으로 혼성화가능한/특이적으로 상보적인: 본원에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 표적 핵산 분자 사이에 안정하고 특이적인 결합이 이루어지도록 하는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 두 핵산 분자 사이의 혼성화는 두 핵산 분자의 핵산 서열 사이의 역평행 정렬 형성을 수반한다. 이어서, 두 분자는 대향 가닥 상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여 듀플렉스 분자를 형성할 수 있으며, 이는 충분히 안정한 경우에 관련 기술분야에 널리 알려져 있는 방법을 사용하여 검출가능하다. 핵산 분자는 특이적으로 혼성화가능한 그의 표적 서열에 대해 100% 상보적이어야 할 필요는 없다. 그러나, 특이적인 혼성화를 위해 존재해야 하는 서열 상보성의 양은 사용되는 혼성화 조건의 함수이다.
특정한 정도의 엄격도를 가져오는 혼성화 조건은 선택 혼성화 방법의 성질 및 혼성화 핵산 서열의 조성과 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화의 이온 강도 (특히 Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄격도를 결정할 것이다. 세척 완충제의 이온 강도 및 세척 온도가 또한 엄격도에 영향을 미친다. 특정한 정도의 엄격도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11, and updates; 및 Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산 혼성화에 관한 추가의 상세한 지침 및 안내는, 예를 들어 문헌 [Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; 및 Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995, and updates]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 "엄격한 조건"은 혼성화 분자와, 표적 핵산 분자 내의 상동 서열 사이에 80% 초과의 서열 매치가 존재하는 경우에만 단지 혼성화가 일어나게 되는 조건을 포괄한다. "엄격한 조건"은 추가로 특정한 수준의 엄격도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중간 엄격도" 조건은 80% 초과의 서열 매치를 갖는 (즉, 20% 미만의 미스매치를 갖는) 분자가 혼성화될 조건이고; "고 엄격도" 조건은 90% 초과의 매치를 갖는 (즉, 10% 미만의 미스매치를 갖는) 서열이 혼성화될 조건이고; "매우 고도의 엄격도" 조건은 95% 초과의 매치를 갖는 (즉, 5% 미만의 미스매치를 갖는) 서열이 혼성화될 조건이다.
하기는 대표적인 비제한적 혼성화 조건이다.
고 엄격도 조건 (적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출함): 16시간 동안 65℃에서 5x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃에서 0.5x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
중간 엄격도 조건 (적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출함): 16-20시간 동안 65-70℃에서 5x-6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃에서 1x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
비-엄격한 대조군 조건 (적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 서열이 혼성화될 것임): 16-20시간 동안 실온 내지 55℃에서 6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온 내지 55℃에서의 2x-3x SSC 완충제 중에서의 적어도 2회 세척.
인접 핵산 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상동" 또는 "실질적 상동성"은 인접 뉴클레오티드 서열이 엄격한 조건 하에서 참조 핵산 서열을 갖는 핵산 분자에 대해 혼성화된다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 참조 핵산 서열에 대해 실질적으로 상동인 서열을 갖는 핵산 분자는 엄격한 조건 (예를 들어, 상기 기재된 중간 엄격도 조건) 하에서 서열식별번호: 1의 참조 핵산 서열을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자이다. 실질적으로 상동인 서열은 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 상동인 서열은 약 80% 내지 100% 서열 동일성, 예컨대 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94%; 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100%를 가질 수 있다. 실질적 상동성의 특성은 특이적 혼성화와 밀접한 관련이 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 특이적 결합을 목적하는 조건 하에서, 예를 들어 엄격한 혼성화 조건 하에서 핵산의 비-표적 서열에 대한 비-특이적 결합을 피할 수 있는 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 특이적으로 혼성화가능하다.
본원에 사용된 용어 "오르토로그"는 공통 조상 뉴클레오티드 서열로부터 진화하였고, 둘 이상의 종에서 동일한 기능을 보유할 수 있는 둘 이상의 종에서의 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된, 5'에서 3' 방향으로 판독되었을 때의 서열의 모든 뉴클레오티드가 3'에서 5' 방향으로 판독되었을 때의 다른 서열의 모든 뉴클레오티드에 상보적일 경우에 두 핵산 서열 분자는 "완전한 상보성"을 보인다라고 말할 수 있다. 참조 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은 참조 뉴클레오티드 서열의 역 상보체 서열과 동일한 서열을 나타낼 것이다. 이들 용어 및 설명은 관련 기술분야에 널리 정의되어 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 이를 용이하게 이해할 것이다.
작동가능하게 연결된: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때, 제1 뉴클레오티드 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 재조합적으로 생산되었을 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 동일한 리딩 프레임 내에서 (예를 들어, 번역 융합된 ORF 내에서) 두 단백질-코딩 영역에 일반적으로 인접해 있고, 필요할 경우 그를 연결한다. 그러나, 핵산은 작동가능하게 연결되기 위해 인접해 있을 필요는 없다.
조절 서열 및 코딩 서열과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열" 또는 "제어 요소"는 전사의 시기 및 수준/양, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 회합된 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열 등을 포함할 수 있다. 특정한 조절 서열은 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정한 조절 서열은 이중-가닥 핵산 분자의 회합된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.
프로모터: 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사 출발점으로부터 상류에 위치할 수 있고, RNA 폴리머라제, 및 전사를 개시하는 다른 단백질의 인식 및 결합에 수반될 수 있는 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포에서 발현시키기 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서 발현시키기 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생적 제어 하에 있는 프로모터의 예는 특정 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관 또는 후막조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-선호"인 것으로 지칭된다. 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적"인 것으로 지칭된다. "세포 유형-특이적" 프로모터는 주로 1종 이상 기관의 특정 세포 유형, 예를 들어 뿌리 또는 잎의 도관 세포에서의 발현을 구동한다. "유도성" 프로모터는 환경적 제어 하에 존재할 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 및 광의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호, 세포 유형 특이적 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에서, 또는 대부분의 세포 또는 조직 유형에서 활성일 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 임의의 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 문헌 [Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366]을 참조한다. 유도성 프로모터의 경우, 유도제에 대한 반응으로 전사 속도가 증가한다. 예시적인 유도성 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터, 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 대해 반응하는, 메이즈로부터의 In2 유전자; Tn10으로부터의 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는, 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터 (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425).
예시적인 구성적 프로모터로는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S 프로모터; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 메이즈 H3 히스톤 프로모터; 및 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조적 유전자에 대해 5'에 있는 XbaI/NcoI 단편인 ALS 프로모터 (또는 상기 XbaI/NcoI 단편에 유사한 뉴클레오티드 서열) (미국 특허 번호 5,659,026).
추가로, 본 발명의 일부 실시양태에서, 임의의 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터가 이용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특이적인 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 코딩 서열의 산물을 생산할 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 종자-선호 프로모터, 예컨대 파세올린 유전자로부터의 것; 잎-특이적 및 광-유도성 프로모터, 예컨대 캡(cab) 또는 루비스코(rubisco)로부터의 것; 또 다른-특이적 프로모터, 예컨대 LAT52로부터의 것; 화분-특이적 프로모터, 예컨대 Zm13으로부터의 것; 및 소포자-선호 프로모터, 예컨대 apg로부터의 것.
형질전환: 본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질도입"은 1종 이상의 핵산 분자(들)를 세포 내로 전달하는 것을 지칭한다. 세포 내로 형질도입된 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 혼입에 의해 또는 에피솜 복제 의해 세포에 의해 안정하게 복제될 때 세포는 상기 핵산 분자에 의해 "형질전환된다". 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 이러한 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-793); 리포펙션 (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417); 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-585); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807); 직접 DNA 흡수; 및 미세발사체 충격 (Klein et al. (1987) Nature 327:70).
트랜스진: 외인성 핵산 서열. 일부 예에서, 트랜스진은 딱정벌레류 해충에서 발견되는 핵산 분자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 dsRNA 분자의 한 가닥 또는 둘 다의 가닥들을 코딩하는 서열일 수 있다. 추가의 예에서, 트랜스진은 안티센스 핵산 서열일 수 있으며, 여기서 안티센스 핵산 서열의 발현이 표적 핵산 서열의 발현을 억제한다. 또 다른 추가의 예에서, 트랜스진은 유전자 서열 (예를 들어, 제초제-저항성 유전자), 산업상 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 이들 및 다른 예에서, 트랜스진은 트랜스진의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 함유할 수 있다.
벡터: 예를 들어 형질전환된 세포를 생산하기 위해 세포 내로 도입되는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제되도록 하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터는 또한 RNA 분자일 수 있다. 벡터는 또한 1종 이상의 유전자, 안티센스 서열 및/또는 선택 마커 유전자 및 관련 기술분야에 알려져 있는 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시킴으로써 세포가 벡터에 의해 코딩된 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하도록 야기할 수 있다. 벡터는 임의로 핵산 분자를 세포 내로 진입시키는데 도움을 주는 물질 (예를 들어, 리포솜, 단백질 코팅 등)을 포함한다.
수확량: 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장한 동일한 성장 지역에 있는 대비 품종의 수확량에 비해 약 100% 또는 그 초과의 안정화된 수확량. 특정한 실시양태에서, "개선된 수확량" 또는 "수확량 개선"은 품종이, 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장한 작물에게 유해한 딱정벌레류 해충을 유의한 밀도로 함유하는 동일한 성장 위치에 있는 대비 품종의 수확량에 비해 105% 내지 115% 또는 그 초과의 안정화된 수확량을 가진다는 것을 의미한다.
구체적으로 명시 또는 암시되지 않는 한, 용어 단수 형태는 본원에 사용된 "적어도 하나"를 의미한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상의 용어에 관한 정의는, 예를 들어 문헌 [Lewin's Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 찾아볼 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
IV. 딱정벌레류 해충 서열을 포함하는 핵산 분자
A. 개관
딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자가 본원에 기재된다. 기재된 핵산 분자는 표적 서열 (예를 들어, 천연 유전자 및 비-코딩 서열), dsRNA, siRNA, hpRNA 및 miRNA를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 1종 이상의 천연 핵산 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적일 수 있는 dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA 분자가 기재된다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 천연 핵산 서열(들)은 1종 이상의 표적 유전자(들)일 수 있고, 그의 산물은 예를 들어 및 비제한적으로, 대사 과정에 수반될 수 있거나; 생식 과정에 수반될 수 있거나; 또는 유충 발생에 수반될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 핵산 분자가 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 천연 핵산 서열(들)을 포함하는 세포 내로 도입되었을 때, 세포에서 RNAi를 개시할 수 있고, 그 결과 천연 핵산 서열(들)의 발현을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 예에서, 그에 특이적으로 상보적인 서열을 포함하는 핵산 분자에 의한 표적 유전자의 발현의 감소 또는 제거는 딱정벌레류 해충에 치명적일 수 있거나, 또는 성장 및/또는 생식을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 적어도 1종의 표적 유전자가 선택될 수 있으며, 여기서 표적 유전자는 dre4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 예에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자가 선택되며, 여기서 표적 유전자는 dre4의 신규 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자는 dre4의 단백질 산물의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 (예를 들어, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 100% 동일한) 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 인 실리코 역번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자일 수 있다. 표적 유전자는 딱정벌레류 해충에서의 임의의 핵산 서열일 수 있으며, 그의 전사후 억제는 딱정벌레류 해충에게 유해한 영향을 미칠 수 있거나, 또는 식물에게 딱정벌레류 해충에 대한 보호 이익을 제공한다. 특정한 예에서, 표적 유전자는 서열식별번호: 2-4 중 어느 것의 인 실리코 번역 산물인 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95% 동일한, 약 96% 동일한, 약 97% 동일한, 약 98% 동일한, 약 99% 동일한, 약 100% 동일한, 또는 100% 동일한 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 인 실리코 역번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자이다.
본 발명에 따르면, 딱정벌레류 해충에서의 코딩 서열에 의해 코딩되는 천연 RNA 분자의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자를 발현을 통해 생성시키는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현된 RNA 분자가 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되고 나면, 딱정벌레류 해충의 세포에서 코딩 서열은 하향-조절될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 세포에서의 코딩 서열의 하향-조절은 딱정벌레류 해충의 성장, 생존율, 증식 및/또는 생식에 유해한 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 서열은 전사된 비-코딩 RNA 서열, 예컨대 5'UTR; 3'UTR; 스플라이싱된 리더 서열; 인트론 서열; 아우트론 서열 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱으로 후속 변형되는 5'UTR RNA); 도나트론 서열 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱을 위한 공여자 서열을 제공하는데 요구되는 비-코딩 RNA); 및 표적 딱정벌레류 해충 유전자의 다른 비-코딩 전사된 RNA를 포함한다. 이러한 서열은 모노-시스트론 및 폴리-시스토론 유전자 둘 다로부터 유래될 수 있다.
따라서, 또한 본원에서는 일부 실시양태와 관련하여 딱정벌레류 해충에서의 표적 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA)도 기재된다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 복수개의 표적 서열; 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 표적 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열(들)을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자는 유전자 변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관내 또는 생체내에서 생산될 수 있다. 또한, 딱정벌레류 해충에서의 표적 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA 서열이 개시된다. 특정한 숙주 표적을 안정하게 형질전환시키는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물이 추가로 기재된다. 형질전환된 숙주 표적은 재조합 DNA 구축물로부터 dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA 분자를 유효 수준으로 발현할 수 있다. 따라서, 또한 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 통해 딱정벌레류 해충에서의 표적 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자가 생성되는 것인, 식물 형질전환 벡터가 기재된다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 다음을 포함할 수 있다: dre4 (예를 들어, 서열식별번호: 1-4 중 어느 것)를 포함하는 디아브로티카로부터 단리된 천연 핵산 서열의 전부 또는 일부; 발현되었을 때, dre4에 의해 코딩되는 천연 RNA 분자의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자를 생성시키는 뉴클레오티드 서열; dre4의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA); dre4의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA 서열; 및 특정한 숙주 표적의 안정한 형질전환을 달성하는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물 (여기서 형질전환된 숙주 표적은 상기 핵산 분자 중 1종 이상을 포함함).
B. 핵산 분자
본 발명은 특히 딱정벌레류 해충의 세포, 조직 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA) 분자; 및 세포 또는 미생물에서 딱정벌레류 해충의 세포, 조직 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다: 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 특정한 실시양태에서, 단리된 핵산 서열의 딱정벌레류 해충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 딱정벌레류 해충의 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 세포 또는 미생물에서 딱정벌레류 해충의 세포, 조직 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 DNA 서열(들)을 포함할 수 있다. 이러한 DNA 서열(들)은 dsRNA 분자(들)을 형성할 수 있는 코딩된 RNA의 전사를 개시하거나 또는 증진시키는 DNA 분자를 포함하는, 세포에서 기능하는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 DNA 서열(들)은 서열식별번호: 1을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있다. 서열식별번호: 1의 유도체는 서열식별번호: 1의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단편은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 적어도 약 19개의 인접 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 단편은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 인접 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 이러한 단편은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 약 19개 초과의 인접 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 따라서, 서열식별번호: 1의 단편은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 19, 20, 21, 약 25 (예를 들어, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 및 29), 약 30, 약 40 (예를 들어, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 45), 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태는 부분적- 또는 완전-안정화된 dsRNA 분자를 딱정벌레류 해충 내로 도입하여 딱정벌레류 해충의 세포, 조직 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 것을 포함할 수 있다. iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA)로서 발현되고, 딱정벌레류 해충에 의해 흡수되었을 때, 서열식별번호: 1의 1개 이상의 단편을 포함하는 핵산 서열은 사멸, 성장 억제, 성비 변화, 한배새끼 크기의 축소, 감염 중지 및/또는 딱정벌레류 해충에 의한 섭식 중지 중 하나 이상을 야기할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 표적 유전자 서열에 대해 실질적으로 상동인 약 19 내지 약 300개의 뉴클레오티드를 포함한 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열식별번호: 1을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 1개 이상의 단편을 포함하는 dsRNA 분자가 제공된다. 이러한 dsRNA 분자의 발현은, 예를 들어 dsRNA 분자를 흡수한 딱정벌레류 해충에서의 사멸 및/또는 성장 억제를 유발할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 dsRNA 분자는 서열식별번호: 1을 포함하는 표적 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열식별번호: 1의 단편에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 딱정벌레류 해충에서의 상기 표적 유전자의 억제는 딱정벌레류 해충의 성장, 발생 또는 다른 생물학적 기능에 필수적인 단백질 또는 뉴클레오티드 서열 작용제의 감소 또는 제거를 유발한다. 선택된 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열의 인접 단편, 또는 상기 중 어느 하나의 상보체에 대해 약 80% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 선택된 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열의 인접 단편, 또는 상기 중 어느 하나의 상보체에 대해 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94%; 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 또는 약 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 미생물에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 DNA 분자는 1종 이상의 표적 딱정벌레류 해충 종에서 발견되는 천연 핵산 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 단일 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나, 또는 DNA 분자는 복수개의 이러한 특이적으로 상보적인 서열로부터의 키메라로서 구축될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 "스페이서 서열"에 의해 이격되어 있는 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은, 목적하는 경우, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열 사이의 2차 구조 형성을 촉진시키는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 한 실시양태에서, 스페이서 서열은 mRNA에 대한 센스 또는 안티센스 코딩 서열의 일부이다. 대안적으로, 스페이서 서열은 핵산 분자에 공유적으로 연결될 수 있는 뉴클레오티드 또는 그의 상동체의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, DNA 분자는 1종 이상의 상이한 RNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 RNA 분자는 각각 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열은 서로에 상보적이다. 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열은 RNA 분자 내에서 스페이서 서열에 의해 연결될 수 있다. 스페이서 서열은 제1 뉴클레오티드 서열 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 일부로 구성될 수 있다. 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자가 발현되면 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열의 특이적 염기-쌍형성에 의해 본 발명의 dsRNA 분자가 형성될 수 있다. 제1 뉴클레오티드 서열 또는 제2 뉴클레오티드 서열은 딱정벌레류 해충에 고유한 핵산 서열 (예를 들어, 표적 유전자 또는 전사된 비-코딩 서열), 그의 유도체 또는 그에 상보적인 서열과 실질적으로 동일할 수 있다.
dsRNA 핵산 분자는 이중 가닥의 중합된 리보뉴클레오티드 서열을 포함하고, 포스페이트-당 백본 또는 뉴클레오시드에의 변형을 포함할 수 있다. RNA 구조에서의 변형은 특이적인 억제가 이루어질 수 있도록 적합화될 수 있다. 한 실시양태에서, dsRNA 분자는 편재하는 효소 방법을 통해 변형될 수 있으며, 이에 의해 siRNA 분자가 생성될 수 있다. 이러한 효소 방법은 시험관내 또는 생체내에서 RNAse III 효소, 예컨대 진핵생물에서는 DICER를 이용할 수 있다. 문헌 [Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498; 및 Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-952]을 참조한다. DICER 또는 기능상 등가인 RNAse III 효소는 보다 큰 dsRNA 가닥 및/또는 hpRNA 분자를, 각각의 길이가 약 19-25개의 뉴클레오티드인 보다 작은 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)로 절단한다. 이들 효소에 의해 생산된 siRNA 분자는 2 내지 3개의 뉴클레오티드 3' 오버행, 및 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는다. RNAse III 효소에 의해 생성된 siRNA 분자는 풀린 상태이고, 세포에서 단일 가닥 RNA로 분리된다. 이어서, siRNA 분자는 표적 유전자로부터 전사된 RNA 서열과 특이적으로 혼성화되고, 이후 두 RNA 분자는 고유한 세포 RNA-분해 메카니즘에 의해 분해된다. 이러한 과정을 통해 표적 유기체에서의 표적 유전자에 의해 코딩되는 RNA 서열은 효과적으로 분해 또는 제거될 수 있다. 결과는 표적화된 유전자의 전사후 침묵이다. 일부 실시양태에서, 내인성 RNAse III 효소에 의해 이종 핵산 분자로부터 생산된 siRNA 분자는 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 하향-조절을 효율적으로 매개할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 생체내 분자간 혼성화를 통해 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥 RNA 분자로 전사될 수 있는 적어도 1종의 비-자연 발생 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 dsRNA 서열은 전형적으로 자기-조립될 수 있고, 표적 유전자의 전사후 억제를 달성하기 위해 딱정벌레류 해충의 영양 공급원으로 제공될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는, 각각 딱정벌레류 해충에서 상이한 표적 유전자에 특이적으로 상보적인 상이한 두 비-자연 발생 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 핵산 분자가 dsRNA 분자로서 딱정벌레류 해충에게 제공되었을 때, dsRNA 분자는 딱정벌레류 해충에서 적어도 2종의 상이한 표적 유전자의 발현을 억제한다.
C. 핵산 분자 수득
딱정벌레류 해충에서의 다양한 천연 서열이 본 발명의 핵산 분자, 예컨대 iRNA 및 iRNA를 코딩하는 DNA 분자를 설계하기 위한 표적 서열로서 사용될 수 있다. 그러나, 천연 서열을 선택하는 것은 간단한 과정이 아니다. 딱정벌레류 해충에서 단지 소수의 천연 서열만이 효과적인 표적이 될 것이다. 예를 들어, 특정한 천연 서열이 본 발명의 핵산 분자에 의해 효과적으로 하향-조절될 수 있는지 여부, 또는 특정한 천연 서열의 하향-조절이 딱정벌레류 해충의 성장, 생존율, 증식 및/또는 생식에 유해한 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확신을 가지고 예측할 수 없다. 대부분의 천연 딱정벌레류 해충 서열, 예컨대 이들로부터 단리된 EST (예를 들어, 미국 특허 번호 7,612,194 및 미국 특허 번호 7,943,819에 열거된 것)은 딱정벌레류 해충, 예컨대 WCR 또는 NCR의 성장, 생존율, 증식 및/또는 생식에 유해한 영향을 미치지 않는다. 딱정벌레류 해충에 유해한 영향을 미칠 수 있는 천연 서열 중 어느 것이 숙주 식물에서 이러한 천연 서열에 상보적인 핵산 분자를 발현시키고 숙주 식물에는 해를 끼치지 않으면서 딱정벌레류 해충이 섭식하였을 때에 그에 대해 유해한 영향을 미치도록 하기 위한 재조합 기술에 사용될 수 있는지를 예측하는 것은 불가능하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, 딱정벌레류 해충의 숙주 식물에 제공하고자 하는 dsRNA 분자)는, 예컨대 대사 또는 이화 생화학적 경로, 세포 분열, 생식, 에너지 대사, 소화, 숙주 식물 인식 등에 수반되는 아미노산 서열과 같이, 딱정벌레류 해충 생존에 필수적인 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩하는 cDNA 서열을 표적화하는 것으로 선택된다. 본원에 기재된 바와 같이, 적어도 1개의 절편이 표적 해충 유기체의 세포에서 생산되는 RNA의 적어도 실질적으로 동일한 절편에 특이적으로 상보적인 1종 이상의 dsRNA를 함유하는 조성물을 표적 유기체가 섭취하면 표적은 사멸되거나 또는 다르게 억제될 수 있다. 딱정벌레류 해충으로부터 유래된, DNA 또는 RNA인 뉴클레오티드 서열을 사용하여 딱정벌레류 해충에 의한 침입에 대해 저항성을 띠는 식물 세포를 구축할 수 있다. 예를 들어, 딱정벌레류 해충의 숙주 식물 (예를 들어, 지. 메이스 또는 지. 맥스)은 본원에 제공된 바와 같은 딱정벌레류 해충으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열 중 1종 이상을 함유하도록 형질전환될 수 있다. 숙주 내로 형질전환되는 뉴클레오티드 서열은 형질전환된 숙주 내의 세포에서 또는 생물학적 유체에서 dsRNA 서열로 형성되는 1종 이상의 RNA를 코딩할 수 있고, 이에 의해 딱정벌레류 해충이 트랜스제닉 숙주와 영양면에서 관계를 맺게 되면/그러한 때에 dsRNA는 이용가능하다. 이를 통해 딱정벌레류 해충의 세포에서의 1종 이상의 유전자의 발현은 억제될 수 있고, 결국에는 사멸하게 되거나 그의 성장 또는 발생이 억제될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본질적으로 딱정벌레류 해충의 성장, 발생 및 생식에 수반되는 유전자가 표적화된다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 표적 유전자는, 예를 들어 딱정벌레류 해충 생존율, 운동, 이동, 성장, 발생, 감염성, 섭식 장소 확립 및 생식에서 중요한 역할을 하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 표적 유전자는 하우스키핑 유전자 또는 전사 인자일 수 있다. 추가로, 본 발명에서 사용하기 위한 천연 딱정벌레류 해충 뉴클레오티드 서열은 또한 식물, 바이러스, 박테리아 또는 곤충 유전자의 상동체 (예를 들어, 오르토로그)로부터 유래된 것일 수 있으며, 그의 기능은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있고, 그의 뉴클레오티드 서열은 표적 딱정벌레류 해충의 게놈 중 표적 유전자와 특이적으로 혼성화가능하다. 혼성화에 의해 알려져 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 상동체를 확인하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA) 분자를 생산하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 수득하는 방법을 제공한다. 한 실시양태는 (a) 딱정벌레류 해충에서 dsRNA-매개된 유전자 억제시 1종 이상의 표적 유전자(들)를 그의 발현, 기능 및 표현형에 대해 분석하는 단계; (b) dsRNA-매개된 억제 분석에서 성장 또는 발생 표현형이 변경된 (예를 들어 감소된) 것으로 나타난, 표적화된 딱정벌레류 해충으로부터의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상동체의 전부 또는 일부를 포함하는 프로브로 cDNA 또는 gDNA 라이브러리를 프로빙하는 단계; (c) 프로브와 특이적으로 혼성화되는 DNA 클론을 확인하는 단계; (d) 단계 (b)에서 확인된 DNA 클론을 단리하는 단계; (e) 단계 (d)에서 단리된 클론을 포함하는 cDNA 또는 gDNA 단편을 서열분석하며, 여기서 서열분석된 핵산 분자는 RNA 서열 또는 그의 상동체의 전부 또는 상당 부분을 포함하는 것인 단계; 및 (f) 유전자 서열, 또는 siRNA 또는 miRNA 또는 hpRNA 또는 mRNA 또는 dsRNA의 전부 또는 상당 부분을 화학적으로 합성하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA) 분자의 상당 부분을 생산하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편을 수득하는 방법은 (a) 표적화된 딱정벌레류 해충으로부터의 천연 뉴클레오티드 서열의 일부분에 특이적으로 상보적인 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 클로닝 벡터에 존재하는 cDNA 또는 gDNA 삽입물을 증폭시키며, 여기서 증폭된 핵산 분자는 siRNA 또는 miRNA 또는 hpRNA 또는 mRNA 또는 dsRNA 분자의 상당 부분을 포함하는 것인 단계를 포함한다.
본 발명의 핵산은 수많은 접근법에 의해 단리, 증폭 또는 생산될 수 있다. 예를 들어, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA) 분자는 gDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 유래된 표적 핵산 서열 (예를 들어, 표적 유전자 또는 표적 전사된 비-코딩 서열) 또는 그의 부분의 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. DNA 또는 RNA는 표적 유기체로부터 추출될 수 있고, 핵산 라이브러리는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 그로부터 제조될 수 있다. 표적 유기체로부터 생성된 gDNA 또는 cDNA 라이브러리는 PCR 증폭 및 표적 유전자의 서열분석에 사용될 수 있다. 확증된 PCR 산물은 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용될 수 있고, 이에 의해 최소 프로모터와 함께 센스 및 안티센스 RNA가 생성될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 자동 DNA 합성기 (예를 들어, 피.이. 바이오시스템즈, 인크.(P.E. Biosystems, Inc.) (캘리포니아주 포스터 시티) 모델 392 또는 394 DNA/RNA 합성기)를 사용하는 것, 표준 화학, 예컨대 포스포라미다이트 화학을 사용하는 것을 포함한 수많은 기술들 중 어느 것에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; 및 Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423] 참조). 예를 들어, 문헌 [Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311]; 미국 특허 번호 4,415,732, 4,458,066, 4,725,677, 4,973,679 및 4,980,460을 참조한다. 비-천연 백본 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포라미다이트 등을 생성하는 대안적 화학이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA 또는 hpRNA 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수동 또는 자동 반응을 통해, 또는 생체내에서 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA 또는 hpRNA 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포내에서 화학적으로 또는 효소적으로 생산될 수 있다. RNA는 또한 부분 또는 총 유기 합성에 의해 생산될 수 있고, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드가 시험관내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. RNA 분자는 세포 RNA 폴리머라제 또는 박테리오파지 RNA 폴리머라제 (예를 들어, T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제)에 의해 합성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현에 유용한 발현 구축물은 관련 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,593,874, 5,693,512, 5,698,425, 5,712,135, 5,789,214 및 5,804,693을 참조한다. 화학적으로 또는 시험관내 효소적 합성에 의해 합성된 RNA 분자는 세포 내로 도입되기 이전에 정제될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 용매 또는 수지를 사용한 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 그의 조합에 의해 혼합물로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 화학적으로 또는 시험관내 효소적 합성에 의해 합성된 RNA 분자는, 예를 들어 샘플 프로세싱에 기인하여 발생되는 손실을 피하기 위해 정제하지 않거나 최소의 정제를 수행한 후에 사용될 수 있다. RNA 분자를 보관을 위해 건조시킬 수 있거나 또는 수용액 중에 용해시킬 수 있다. 용액은 dsRNA 분자 듀플렉스 가닥의 어닐링 및/또는 안정화를 촉진시키기 위하여 완충제 또는 염을 함유할 수 있다.
실시양태에서, dsRNA 분자는 단일 자기-상보적 RNA 가닥에 의해 또는 2개의 상보적 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있다. dsRNA 분자는 생체내 또는 시험관내에서 합성될 수 있다. 세포의 내인성 RNA 폴리머라제는 생체내에서 한 또는 두 RNA 가닥의 전사를 매개할 수 있거나, 또는 클로닝된 RNA 폴리머라제는 생체내 또는 시험관내에서 전사를 매개하는데 사용될 수 있다. 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 전사후 억제는 (예를 들어, 조직-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 기관, 조직 또는 세포 유형에서의 특이적인 전사에 의해; (예를 들어, 감염, 스트레스, 온도 및/또는 화학 유도제에 대해 반응성인 유도성 프로모터의 사용에 의해) 숙주에서의 환경 조건의 자극에 의해; 및/또는 (예를 들어, 발생 단계-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 발생 단계 또는 연령에서의 조작적 전사에 의해 숙주-표적화될 수 있다. 시험관내 또는 생체내에서 전사되었든지 간에, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 가닥은 폴리아데닐화될 수 있거나 또는 그럴 수 없고, 세포의 번역 기구에 의해 폴리펩티드로 번역될 수 있거나 또는 그럴 수 없다.
D. 재조합 벡터 및 숙주 세포 형질전환
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포) 내로 도입시키기 위한 DNA 분자이며, 여기서 DNA 분자는, RNA로 발현되어 딱정벌레류 해충이 섭취하였을 때, 딱정벌레류 해충의 세포, 조직 또는 기관에서의 표적 유전자를 억제하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, DNA 분자를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태는 식물 세포에서 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자 발현을 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA) 분자로서 발현될 수 있는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 발현을 개시 또는 증진시키기 위해, 이러한 재조합 핵산 분자는 1종 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 이 조절 서열은 iRNA로서 발현될 수 있는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있을 수 있다. 식물에서 유전자 억제 분자를 발현시키는 방법은 알려져 있고, 이를 사용하여 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO06/073727; 및 미국 특허 공개 번호 2006/0200878 Al을 참조한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 재조합 DNA 분자는 섭취시 딱정벌레류 해충 세포에서 내인성 표적 유전자(들)의 발현을 억제할 수 있는 dsRNA 분자를 코딩할 수 있다. 다수의 실시양태에서, 전사된 RNA는 안정화된 형태로, 예를 들어 헤어핀 및 스템 및 루프 구조로 제공될 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있다.
이들 및 추가의 실시양태에서, dsRNA 분자 중 한 가닥은 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 뉴클레오티드 서열에 대해 실질적으로 상동인 뉴클레오티드 서열로부터의 전사에 의해 형성될 수 있다.
특정한 실시양태에서, dsRNA 분자를 코딩하는 재조합 DNA 분자는 전사된 서열 내에 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열 절편을 포함할 수 있고, 이러한 서열은 전사된 서열이 적어도 1종의 프로모터에 대하여 센스 배향의 제1 뉴클레오티드 서열 절편 및 안티센스 배향의 제2 뉴클레오티드 서열 절편 (제1 뉴클레오티드 서열 절편의 상보체를 포함함)을 포함하도록 배열되고, 여기서 센스 뉴클레오티드 서열 절편 및 안티센스 뉴클레오티드 서열 절편은 약 5 (~5) 내지 약 1,000 (~1,000)개의 뉴클레오티드의 스페이서 서열에 의해 연결되어 있거나 결합되어 있다. 스페이서 서열은 센스와 안티센스 서열 절편 사이에 루프를 형성할 수 있다. 센스 뉴클레오티드 서열 절편 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열 절편은 표적 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자) 또는 그의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 2-4 중 어느 것)의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 재조합 DNA 분자는 스페이서 서열이 없는 dsRNA 분자를 코딩할 수 있다. 실시양태에서, 센스 코딩 서열 및 안티센스 코딩 서열의 길이는 상이할 수 있다.
딱정벌레류 해충에 유해한 영향을 미치거나 또는 딱정벌레류 해충과 관련하여 식물 보호 효과가 있는 것으로 확인된 서열은 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 적절한 발현 카세트의 생성을 통해 발현된 dsRNA 분자 내로 용이하게 혼입될 수 있다. 예를 들어, 이러한 서열은 표적 유전자 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1 및 그의 단편)에 상응하는 제1 절편을 취하고; 이러한 서열을, 제1 절편에 상동이 아니거나 또는 상보적인 제2 절편 스페이서 영역에 연결시키고; 이를 제3 절편에 연결시키며, 여기서 제3 절편의 적어도 일부분은 제1 절편에 실질적으로 상보적인 것에 의해 스템 및 루프 구조를 갖는 헤어핀으로서 발현될 수 있다. 이러한 구축물은 제1 절편과 제3 절편과의 분자내 염기-쌍형성에 의해 스템 및 루프 구조를 형성하며, 여기서 루프 구조는 제2 절편을 형성하고 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0048814 및 2003/0018993; 및 국제 PCT 공개 번호 WO94/01550 및 WO98/05770을 참조한다. dsRNA 분자는, 예를 들어 이중-가닥 구조의 형태로, 예컨대 스템-루프 구조 (예를 들어, 헤어핀)로 생성될 수 있고, 이에 의해 천연 딱정벌레류 해충 서열에 대해 표적화된 siRNA의 생산은 표적화된 유전자의 단편의 공동-발현에 의해 증진되고, 예를 들어 추가의 식물 발현가능한 카세트 상에서 siRNA의 생산이 증진되거나 또는 메틸화가 감소됨으로써 dsRNA 헤어핀 프로모터의 전사 유전자 침묵이 방지된다.
본 발명의 실시양태는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 식물 내로 도입 (즉, 형질전환)하여 1종 이상의 iRNA 분자가 딱정벌레류 해충-억제성 수준으로 발현되도록 하는 것을 포함한다. 재조합 DNA 분자는, 예를 들어 벡터, 예컨대 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주의 게놈 내로 도입하고자 하는 총 DNA를 함께 함유하는 2종 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 추가로, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은, 예를 들어 적합하게는 1종 이상의 숙주에서 연결된 코딩 서열 또는 다른 DNA 서열의 발현을 구동하도록 기능하는 적합한 프로모터의 제어 하의 벡터 내로 삽입될 수 있다. 상기 목적을 위해 다수의 벡터가 이용가능하고, 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정한 숙주 세포에 주로 좌우될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (예를 들어, DNA의 증폭 또는 DNA의 발현), 및 그와 상용성인 특정한 숙주 세포에 따라 각종 성분을 함유한다.
딱정벌레류 해충 저항성을 트랜스제닉 식물에 부여하기 위해, 재조합 DNA는, 예를 들어 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 분자)로 전사될 수 있다. iRNA 분자는 숙주 식물 종에게 손상을 야기할 수 있는 딱정벌레류 해충 내의 상응하는 전사된 뉴클레오티드 서열에 대해 실질적으로 상동이고 그에 특이적으로 혼성화가능한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 딱정벌레류 해충은, 예를 들어 iRNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 숙주 식물의 세포 또는 유체를 섭취함으로써 트랜스제닉 숙주 식물의 세포에서 전사되는 iRNA 분자와 접촉할 수 있다. 따라서, 표적 유전자의 발현은 트랜스제닉 숙주 식물에 침입하는 딱정벌레류 해충 내에서 iRNA 분자에 의해 억제된다. 일부 실시양태에서, 표적 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현 억제를 통해 식물은 해충에 의한 공격에 대해 저항성을 띨 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포와 영양면에서 관계를 맺고 있는 딱정벌레류 해충에게 iRNA 분자를 전달할 수 있도록 하기 위해서는 식물 세포에서 iRNA 분자가 발현 (즉, 전사)되어야 한다. 따라서, 재조합 핵산 분자는 숙주 세포, 예컨대 핵산 분자가 증폭되는 박테리아 세포 및 핵산 분자가 발현되는 식물 세포에서 기능하는 1종 이상의 조절 서열, 예컨대 이종 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성 또는 구성적 프로모터를 포함하며, 이는 모두 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 이러한 프로모터를 기재하는 비-제한적인 예는 미국 특허 번호 6,437,217 (메이즈 RS81 프로모터); 5,641,876 (벼 액틴 프로모터); 6,426,446 (메이즈 RS324 프로모터); 6,429,362 (메이즈 PR-1 프로모터); 6,232,526 (메이즈 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 메이즈 프로모터); 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196 (CaMV 35S 프로모터); 6,433,252 (메이즈 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (벼 액틴 2 프로모터 및 벼 액틴 2 인트론); 6,294,714 (광-유도성 프로모터); 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 6,388,170 (양방향성 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 공개 번호 2009/757,089 (메이즈 엽록체 알돌라제 프로모터)를 포함한다. 추가의 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-5749) 및 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (이는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도성 플라스미드 상에 운반됨); 콜리모바이러스 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); 피그워트 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-6628); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148); R 유전자 복합적 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV 35S (미국 특허 번호 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196); FMV 35S (미국 특허 번호 5,378,619 및 6,051,753); PC1SV 프로모터 (미국 특허 번호 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 번호 6,677,503); 및 AGRtu.nos 프로모터 (진뱅크(GenBank)™ 수탁번호 V00087; 문헌 [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187])을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터, 예컨대 뿌리-특이적 프로모터를 포함한다. 뿌리-특이적 프로모터는 배타적으로 또는 우선적으로 뿌리 조직에서의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 구동한다. 뿌리-특이적 프로모터의 예는 관련 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,110,732; 5,459,252 및 5,837,848; 및 문헌 [Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; 및 Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 딱정벌레류 해충 방제를 위한 뉴클레오티드 서열 또는 단편은, 그 뉴클레오티드 서열 또는 단편에 대해 반대 전사 방향으로 배향되어 있으며 트랜스제닉 식물 세포에서 작동가능한 두 뿌리-특이적 프로모터 사이에 클로닝될 수 있고, 여기서 발현됨으로써 트랜스제닉 식물 세포에서 RNA 분자를 생산할 수 있고, 이후 상기 RNA 분자는 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 식물 조직에서 발현된 iRNA 분자는 딱정벌레류 해충에 의해 섭취될 수 있고, 이에 의해 표적 유전자 발현이 억제될 수 있다.
임의로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열은 번역 리더 서열로서의 기능을 하며 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 5'UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 완전히 프로세싱된 mRNA에 존재하며, 그것은 1차 전사체의 프로세싱 및/또는 RNA 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 메이즈 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 번호 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 5'UTR의 비제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 번호 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 번호 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (진뱅크™ 수탁번호 V00087; 및 문헌 [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
임의로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열은 또한 3' 비-번역 서열, 3' 전사 종결 영역 또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치한 유전 요소이며, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 기능하여 mRNA 전구체의 3' 말단에의 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드 첨가를 초래한다. 폴리아데닐화 서열은 다양한 식물 유전자로부터 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비-제한 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; 문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7])이다. 상이한 3' 비번역 영역의 사용에 관한 예는 문헌 [Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80]에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비-제한적인 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; 문헌 [Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9]) 및 AGRtu.nos (진뱅크™ 수탁번호 E01312) 중 하나를 포함한다.
일부 실시양태는 본 발명의 1종 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 상기 기재된 조절 서열 중 적어도 1종을 포함하는 단리 및 정제된 DNA 분자를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있다. 발현되었을 때, 1종 이상의 뉴클레오티드 서열을 통해 딱정벌레류 해충에서의 천연 RNA 분자의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1종 이상의 RNA 분자(들)가 생성된다. 따라서, 뉴클레오티드 서열(들)은 표적화된 딱정벌레류 해충 RNA 전사체 내에 존재하는 리보뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 코딩하는 절편을 포함할 수 있고, 표적화된 딱정벌레류 해충 전사체의 전부 또는 일부의 역위 반복부를 포함할 수 있다. 식물 형질전환 벡터는 1종 초과의 표적 서열에 특이적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 이에 의해 표적 딱정벌레류 해충의 1종 이상의 집단 또는 종의 세포에서의 2종 이상의 유전자의 발현을 억제하기 위한 1종 초과의 dsRNA가 제조될 수 있다. 상이한 유전자에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열의 절편은 트랜스제닉 식물에서의 발현을 위해 단일 조성 핵산 분자로 조합될 수 있다. 이러한 절편은 인접해 있을 수 있거나 또는 스페이서 서열에 의해 이격되어 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 이미 본 발명의 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)을 함유하고 있는 본 발명의 플라스미드는 동일한 플라스미드에서 추가의 뉴클레오티드 서열(들)의 순차적인 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 여기서 추가의 뉴클레오티드 서열(들)은 원래의 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)과 동일한 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 다중 표적 유전자 억제를 위한 것으로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제하고자 하는 다중 유전자는 같은 딱정벌레류 해충 종으로부터 수득할 수 있으며, 이는 핵산 분자의 유효성을 증진시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 유전자는 상이한 딱정벌레류 해충으로부터 유래될 수 있으며, 이에 의해 그에 대하여 작용제(들)가 유효한 것인 딱정벌레류 해충의 범위는 확장될 수 있다. 억제를 위해 또는 발현 및 억제의 조합을 위해 다중 유전자가 표적하되는 경우에, 폴리시스트론 DNA 요소가 제작될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 식물 세포와 같은 형질전환된 세포 상에 선택가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 세포의 선택에 또한 사용될 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 제네티신(Geneticin) (G418), 블레오마이신, 히그로마이신 등), 또는 제초제 저항성 (예를 들어, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다. 선택 마커의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 카나마이신 저항성을 코딩하고 카나마이신, G418 등의 사용에 대하여 선택될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포세이트 저항성을 코딩하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 유전자 (ALS); 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 저항성을 부여하는 다중 선택 마커가 이용가능하다. 이러한 선택 마커의 예는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 및 6,118,047에 예시되어 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 또한 스크리닝 마커를 포함할 수 있다. 스크리닝 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝 마커는 다양한 발색원성 기질이 알려져 있는 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 안료 (적색)의 생산을 조절하는 산물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 다양한 발색원성 기질이 알려져 있는 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PADAC, 발색원성 세팔로스포린); 루시페라제 유전자 (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); 발색원성 카테콜을 전환시키는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이들은 차례로 멜라닌으로 축합됨)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산 분자는 트랜스제닉 식물을 생산하고, 딱정벌레류 해충에 대해 감수성이 감소된 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 상기 식물에서 이종 핵산을 발현시키는 방법에서 사용될 수 있다. 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 iRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자를 식물 형질전환 벡터 내로 삽입하고, 이들을 식물 내로 도입함으로써 제조될 수 있다.
숙주 세포를 형질전환시키는 적합한 방법은, 예컨대 원형질체의 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,508,184 참조), 건조/억제-매개된 DNA 흡수에 의해 (예를 들어, 문헌 [Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8] 참조), 전기 천공에 의해 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,384,253 참조), 탄화규소 섬유와의 교반에 의해 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,302,523 및 5,464,765 참조), 아그로박테리움-매개된 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,563,055; 5,591,616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981,840; 및 6,384,301 참조) 및 DNA-코팅된 입자의 가속화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861 및 6,403,865 참조) 등에 의해 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 특히 옥수수를 형질전환시키는데 유용한 기술은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,591,616, 7,060,876 및 7,939,3281에 기재되어 있다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 사실상 임의의 종의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 다세포 종의 경우에, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체로 재생될 수 있다. 이들 기술 중 어느 것을 사용함으로써, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈 중에 1종 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 1종 이상의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다.
발현 벡터를 식물 내로 도입하는데 가장 널리 사용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 에이. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 각각 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전 형질전환을 담당하는 유전자를 운반한다. Ti (종양-유도)-플라스미드는 형질전환된 식물로 전달되는, T-DNA로서 알려져 있는 큰 절편을 함유한다. Ti 플라스미드의 또 다른 절편인 Vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역은 말단 반복물에 의해 경계지어진다. 변형된 이원 벡터에서, 종양-유도성 유전자는 결실되고, Vir 영역의 기능을 이용하여 T-DNA 보더 서열에 의해 경계지어진 외래 DNA를 전달한다. T-영역은 또한 트랜스제닉 식물 및 세포의 효율적인 회수를 위한 선택 마커, 및 dsRNA 코딩 핵산과 같은 전달용 서열의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 식물 형질전환 벡터는 에이. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937 및 5,501,967; 및 유럽 특허 번호 EP 0 122 791 참조) 또는 에이. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된다. 추가의 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 및 비제한적으로 문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42]에 의해; 및 유럽 특허 번호 EP 0 120 516에 기재된 것들, 및 상기 중 어느 것으로부터 유래된 것을 포함한다. 식물과 상호작용하는 다른 박테리아, 예컨대 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium) 및 메소리조비움(Mesorhizobium)은 자연적으로 변형되어 수많은 다양한 식물로의 유전자 전달을 매개할 수 있다. 이들 식물-연관 공생 박테리아는 디스아암드 Ti 플라스미드 및 적합한 이원 벡터 둘 다의 획득에 의해 유전자 전달에 적격으로 만들 수 있다.
외인성 DNA를 수용자 세포에 제공한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가 배양 및 식물 재생을 위해 확인된다. 형질전환된 세포를 확인할 수 있는 능력을 개선시키기 위해, 형질전환체를 생성하는데 사용된 형질전환 벡터와 함께, 상기 기재된 바와 같은 선택 또는 스크리닝 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선택 마커가 사용되는 경우, 세포를 선택적 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 안에서 형질전환된 세포가 확인된다. 스크리닝 마커가 사용되는 경우에, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대하여 스크리닝될 수 있다.
선택적 작용제에의 노출에서 살아남은 세포 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 채점된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예컨대 성장조절제를 포함시킴으로써 변형시킬 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하는데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동식 선택을 수회에 걸쳐 반복 수행한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 상태가 될 때까지 (예를 들어, 전형적으로 약 2주) 식물을 성장 조절제를 포함하는 기초 배지 상에서 유지시킬 수 있고, 이어서 이를 싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 싹이 충분히 형성될 때까지 주기적으로 배양물을 옮긴다. 일단 싹이 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 보유한다. 일단 뿌리가 형성되고 나면, 추가로 성장시키고 성숙화되도록 식물을 토양으로 옮길 수 있다.
재생 식물에 관심 핵산 분자 (예를 들어, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 1종 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 DNA 서열)이 존재하는지 여부를 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR 및 핵산 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대, 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 이뮤노 블롯)에 의해, 또는 효소 기능에 의해 단백질 산물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 재생된 전체 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
통합 사건은, 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 분석될 수 있다. PCR 유전자형 결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 산물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법은 잘 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53]), 세포 배양물을 포함한 식물 종 (예를 들어, 지. 메이스 또는 지. 맥스) 또는 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다.
아그로박테리움-의존적 형질전환 방법을 이용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로는 한 염색체 내로 삽입된 단일 재조합 DNA 서열을 함유한다. 그 단일 재조합 DNA 서열은 "트랜스제닉 사건" 또는 "통합 사건"으로서 언급된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 외인성 서열에 대해 반접합성이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진과 관련하여 동형접합성인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자 서열을 함유하는 독립 분리개체 트랜스제닉 식물을, 예를 들어 T0 식물과 유성 생식으로 자가 교배 (자가수분)시켜 T1 종자를 생산함으로써 수득할 수 있다. 생산된 T1 종자의 4분의 1은 트랜스진에 대하여 동형접합일 것이다. T1 종자의 발아는, 전형적으로 이형접합체와 동형접합체 사이의 구별을 가능케 하는 SNP 검정 또는 열 증폭 검정 (즉, 접합성 검정)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 생성한다.
특정한 실시양태에서, 딱정벌레류 해충-억제성 효과를 발휘하는, 식물 세포에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 상이한 iRNA 분자가 생산된다. iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)는 상이한 형질전환 사건으로 도입된 다중 핵산 서열로부터, 또는 단일 형질전환 사건으로 도입된 단일 핵산 서열로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수개의 iRNA 분자는 단일 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 복수개의 iRNA 분자는 다중 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 1종 이상의 딱정벌레류 해충 내의 상이한 유전자좌 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 의해 정의된 유전자좌)에 각각 상동인 다중 핵산 서열을 포함하는 단일 iRNA 분자는, 동일한 종의 딱정벌레류 해충으로 이루어진 상이한 집단, 또는 상이한 종의 딱정벌레류 해충 둘 다에서 발현될 수 있다.
재조합 핵산 분자를 사용한 식물의 직접적인 형질전환 이외에도, 트랜스제닉 식물은 적어도 1종의 트랜스제닉 사건을 갖는 제1 식물을 상기 사건을 포함하지 않는 제2 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를, 용이하게 형질전환되는 제1 식물 계통 내로 도입함으로써 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있고, 이 트랜스제닉 식물을 제2 식물 계통과 이종 교배시킴으로써 iRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제2 식물 계통 내로 유전자이입시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 서열 중 1종 이상을 함유하는 범용 제품을 포함한다. 특정한 실시양태는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 중 1종 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자로부터 생산된 범용 제품을 포함한다. 본 발명의 서열 중 1종 이상을 함유하는 범용 제품은 식물의 분말, 오일, 분쇄된 또는 전체의 곡실 또는 종자, 또는 본 발명의 서열 중 1종 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자의 임의의 분말, 오일, 또는 분쇄된 또는 전체의 곡실을 포함하는 임의의 먹이 또는 동물 사료 제품을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 의도된다. 본원에서 고려되는 1종 이상의 범용품 또는 범용 제품에서 본 발명의 서열 중 1종 이상을 검출하는 것은 사실상 범용품 또는 범용 제품이 dsRNA-매개된 유전자 억제 방법을 사용하여 딱정벌레류 식물 해충을 방제하기 위한 목적으로 본 발명의 뉴클레오티드 서열 중 1종 이상을 발현하도록 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산되었다는 것의 증거가 된다.
일부 측면에서, 형질전환된 식물 세포로부터 유래된 트랜스제닉 식물에 의해 생산되며, 본 발명의 핵산 서열을 검출가능한 양으로 포함하는 종자 및 범용 제품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 이러한 범용 제품은, 예를 들어 트랜스제닉 식물을 수득하고, 그로부터 먹이 또는 사료를 제조함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 중 1종 이상을 함유하는 범용 제품은, 예를 들어 및 비제한적으로 다음을 포함한다: 식물의 분말, 오일, 분쇄된 또는 전체의 곡실 또는 종자, 및 본 발명의 핵산 서열 중 1종 이상을 포함하는 재조합 식물 또는 종자의 임의의 분말, 오일 또는 분쇄된 또는 전체의 곡실을 포함하는 임의의 먹이 제품. 1종 이상의 범용품 또는 범용 제품에서 본 발명의 서열 중 1종 이상을 검출하는 것은 사실상 범용품 또는 범용 제품이 딱정벌레류 해충을 방제하기 위한 목적으로 본 발명의 iRNA 분자 중 1종 이상을 발현하도록 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산되었다는 것의 증거가 된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 또한 다음을 비제한적으로 포함하는, 게놈 내의 적어도 1종의 다른 트랜스제닉 사건을 포함할 수 있다: 딱정벌레류 해충에서 서열식별번호: 1에 의해 정의된 것 이외의 유전자좌, 예컨대, 예를 들어 Caf1-180 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174258), VatpaseC (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174259), Rho1 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174260), VatpaseH (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0198586), PPI-87B (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091600), RPA70 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091601) 및 RPS6 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0097730)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자좌를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 트랜스제닉 사건; 딱정벌레류 해충 이외의 유기체 (예를 들어, 식물-기생 선충류)에서의 유전자; 살곤충 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 바실루스 투린기엔시스 살곤충 단백질, 예컨대, 예를 들어 Cry34Ab1 (미국 특허 번호 6,127,180, 6,340,593 및 6,624,145), Cry35Ab1 (미국 특허 번호 6,083,499, 6,340,593 및 6,548,291), 단일 사건에서의 "Cry34/35Ab1" 조합 (예를 들어, 메이즈 사건 DAS-59122-7; 미국 특허 번호 7,323,556), Cry3A (예를 들어, 미국 특허 번호 7,230,167), Cry3B (예를 들어, 미국 특허 번호 8,101,826), Cry6A (예를 들어, 미국 특허 번호 6,831,062), 및 그의 조합 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2013/0167268, 2013/0167269 및 2013/0180016); 제초제 내성 유전자 (예를 들어, 글리포세이트, 글루포시네이트, 디캄바 또는 2,4-D에 내성을 제공하는 유전자 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,838,733)); 및 트랜스제닉 식물에서 바람직한 표현형, 예컨대 증가된 수확량, 변경된 지방산 대사 또는 세포질 웅성 불임의 회복에 기여하는 유전자를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 트랜스제닉 사건. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 iRNA 분자를 코딩하는 서열을 식물에서 다른 곤충 방제 또는 질병 저항성 형질과 조합하여 곤충 손상 및 식물 질병의 증진된 방제를 위한 목적하는 형질을 달성할 수 있다. 상이한 작용 방식을 사용하는 곤충 방제 형질을 조합하면, 예를 들어 재배지에서 형질(들)에 대한 저항성이 발생될 확률은 감소하기 때문에, 단일 방제 형질을 보유하는 식물에 비하여 내구성이 더 우수한 보호된 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다.
V. 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자 억제
A. 개관
본 발명의 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 방제에 유용한 적어도 1종의 핵산 분자를 딱정벌레류 해충에게 제공할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 분자를 통해 딱정벌레류 해충에서는 RNAi-매개된 유전자 침묵이 일어난다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA)는 딱정벌레류 해충에게 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 핵산 분자를 딱정벌레류 해충과 접촉시킴으로써 딱정벌레류 해충에게 제공될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 딱정벌레류 해충의 섭식 기질로, 예를 들어 영양 조성물로 제공될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 딱정벌레류 해충이 섭취하는 핵산 분자를 포함하는 식물 물질의 섭취를 통해 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는, 예를 들어 식물 세포를 재조합 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환하는 것에 의해 및 형질전환된 식물 세포로부터의 식물 물질 또는 전체 식물의 재생에 의해 식물 물질 내로 도입된 재조합 핵산 서열의 발현을 통해 식물 물질에 존재한다.
B. RNAi-매개된 표적 유전자 억제
실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어 표적 서열에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 한 가닥을 포함하는 iRNA 분자를 설계함으로써, 딱정벌레류 해충 (예를 들어, WCR, SCR 또는 NCR)의 트랜스크립톰에서 필수 천연 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 필수 유전자)을 표적화하도록 설계될 수 있는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA 및 hpRNA)를 제공한다. 이와 같이 설계된 iRNA 분자의 서열은 표적 서열과 동일할 수 있거나, 또는 iRNA 분자와 그의 표적 서열 사이의 특이적인 혼성화가 이루어지지 못하도록 하는 미스매치를 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 iRNA 분자는 딱정벌레류 해충에서 유전자를 억제하는 방법에서 사용될 수 있고, 이에 의해 식물 (예를 들어, iRNA 분자를 포함하는 보호되는 형질전환된 식물) 상의 해충에 의해 야기되는 손상 수준 또는 발생률이 감소될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유전자 억제"는 발현의 전사후 억제 및 전사 억제를 포함하는 유전자 또는 코딩 서열로부터의 단백질 발현의 감소를 포함한, mRNA로의 유전자 전사 및 이어지는 mRNA의 번역의 결과로서 생산된 단백질의 수준을 감소시키는 널리 알려져 있는 방법 중 어느 것을 지칭한다. 전사후 억제는 억제를 위해 표적화된 유전자로부터 전사된 mRNA의 전부 또는 일부와, 억제를 위해 사용된 상응하는 iRNA 분자 사이의 특이적 상동성에 의해 매개된다. 추가로, 전사후 억제는 세포에서 리보솜에 의한 결합에 이용가능한 mRNA 양의 실질적인 측정가능한 감소를 지칭한다.
iRNA 분자가 dsRNA 분자인 실시양태에서, dsRNA 분자는 효소 DICER에 의해 짧은 siRNA 분자 (대략 20개의 뉴클레오티드 길이)로 절단될 수 있다. dsRNA 분자에 대한 DICER 활성에 의해 생성된 이중-가닥 siRNA 분자는 두 단일 가닥 siRNA: "패신저 가닥" 및 "가이드 가닥"으로 분리될 수 있다. 패신저 가닥은 분해될 수 있고, 가이드 가닥은 RISC 내로 혼입될 수 있다. 가이드 가닥과, mRNA 분자의 특이적으로 상보적인 서열과의 특이적인 혼성화에 이어서, 효소 아르고너트 (RISC 복합체의 촉매 성분)에 의한 절단에 의해 전사후 억제가 일어난다.
본 발명의 실시양태에서, 임의의 형태의 iRNA 분자가 사용될 수 있다. dsRNA 분자는 전형적으로 제조 동안, 및 iRNA 분자를 세포에 제공하는 단계 동안, 단일 가닥 RNA 분자보다 더 안정하고, 이는 또한 전형적으로 세포에서 보다 안정하다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어 siRNA 및 miRNA 분자는 동일하게 유효할 수 있지만, 일부 실시양태에서 dsRNA 분자는 그의 안정성에 기인하여 선택될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 시험관내에서의 발현을 통해 딱정벌레류 해충의 게놈 내의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 핵산 분자에 실질적으로 상동인 iRNA 분자가 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시험관내에서 전사된 iRNA 분자는 스템-루프 구조를 포함하는 안정화된 dsRNA 분자일 수 있다. 딱정벌레류 해충이 시험관내에서 전사된 iRNA 분자와 접촉한 후에, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자 (예를 들어, 필수 유전자)의 전사후 억제가 일어날 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자의 발현은 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 전사후 억제 방법에 사용되며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 2-4 중 어느 것); 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 특정 실시양태에서, 상기 중 어느 것과 적어도 80% (예를 들어, 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 및 100%) 동일한 핵산 분자의 발현이 사용될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 적어도 1종의 세포에 존재하는 RNA 분자에 특이적으로 혼성화되는 핵산 분자가 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1종의 핵산 분자의 발현은 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 전사후 억제 방법에 사용될 수 있으며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 특정 실시양태에서, 상기 중 어느 것과 적어도 80% (예를 들어, 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 및 100%) 동일한 핵산 분자의 발현이 사용될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 적어도 1종의 세포에 존재하는 RNA 분자에 특이적으로 혼성화되는 핵산 분자가 발현될 수 있다. 특정한 예에서, 이러한 핵산 분자는 서열식별번호: 1-4 중 어느 것 및 그의 상보체를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다
실시양태에서, RNAi 전사후 억제 시스템은 유전자 돌연변이, 균주 다형성, 또는 진화적 분기에 기인한 것으로 예측될 수 있는, 표적 유전자 중의 서열 변이를 견딜 수 있다. 따라서, 도입된 핵산 분자가 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전하게 프로세싱된 mRNA에 특이적으로 혼성화가능하다면, 도입된 핵산 분자는 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전하게 프로세싱된 mRNA에 결코 전적으로 상동일 수는 없다. 더욱이, 도입된 핵산 분자는 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전하게 프로세싱된 mRNA에 비해, 전장보다 더 짧을 수 있다.
본 발명의 iRNA 기술을 사용하는 표적 유전자 억제는 서열-특이적이며; 즉, iRNA 분자(들)에 실질적으로 상동인 뉴클레오티드 서열이 유전적 억제를 위해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자 서열의 일부분과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자가 억제에 사용될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 표적 유전자 서열에 비해 1개 이상의 삽입, 결실 및/또는 점 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자 및 표적 유전자의 일부분은, 예를 들어 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100%, 및 100% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 대안적으로, dsRNA 분자의 듀플렉스 영역은 표적 유전자 전사체의 일부와 특이적으로 혼성화가능한 것일 수 있다. 특이적으로 혼성화가능한 분자에서, 전장의 서열보다는 더 짧은, 더 큰 상동성을 나타내는 서열이, 더 긴, 더 작은 상동 서열을 보완한다. 표적 유전자 전사체의 일부분과 동일한 dsRNA 분자의 듀플렉스 영역의 뉴클레오티드 서열의 길이는 적어도 약 20 (예를 들어, 19), 적어도 약 25, 적어도 약 50, 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500 및/또는 적어도 약 1000개 염기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 20 내지 약 100개 뉴클레오티드 초과의 서열이 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 약 200 내지 300개 뉴클레오티드 초과의 서열이 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적 유전자의 크기에 따라, 약 500 내지 1000개 뉴클레오티드 초과의 서열이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현은 딱정벌레류 해충의 세포 내에서 적어도 10%; 적어도 33%; 적어도 50%; 또는 적어도 80%만큼 억제될 수 있고, 이에 의해 유의한 억제가 일어날 수 있다. 유의한 억제는 역치를 초과하여 억제됨으로써 검출가능한 표현형 (예를 들어, 성장 중지, 섭식 중지, 발생 중지, 곤충 사멸 등)이 나타나거나, 또는 억제되는 표적 유전자에 상응하는 RNA 및/또는 유전자 산물이 검출가능하게 감소하게 되는 것을 지칭한다. 비록 본 발명의 특정 실시양태에서 억제는 실질적으로 딱정벌레류 해충의 모든 세포에서 일어나지만, 다른 실시양태에서는 억제가 오직 표적 유전자를 발현하는 하위세트의 세포에서만 일어난다.
일부 실시양태에서, 전사 억제는 프로모터 DNA 서열 또는 그의 상보체에 대하여 실질적 서열 동일성을 나타내는 dsRNA 분자의 세포내 존재에 의해 매개되며, 이를 통해 "프로모터 트랜스 억제"라고 지칭되는 효과가 발휘된다. 유전자 억제는, 예를 들어 dsRNA 분자를 함유하는 식물 물질을 섭취하거나 또는 그와 접촉함으로써 이러한 dsRNA 분자를 섭취하거나 또는 그와 접촉할 수 있는 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자에 대하여 효과적일 수 있다. 프로모터 트랜스 억제에 사용하기 위한 dsRNA 분자는 딱정벌레류 해충의 세포에서의 1종 이상의 상동인 또는 상보적인 서열의 발현을 억제하거나 또는 저해할 수 있도록 특이적으로 설계될 수 있다. 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위한 안티센스 또는 센스 배향의 RNA에 의한 전사후 유전자 억제는 미국 특허 번호 5,107,065, 5,231,020, 5,283,184, 및 5,759,829에 개시되어 있다.
C. 딱정벌레류 해충에 제공된 iRNA 분자의 발현
딱정벌레류 해충에서의 RNAi-매개된 유전자 억제를 위한 iRNA 분자의 발현은 많은 시험관내 또는 생체내 포맷 중 어느 하나로 수행될 수 있다. 이어서, iRNA 분자는, 예를 들어 iRNA 분자를 해충과 접촉시킴으로써, 또는 해충이 iRNA 분자를 섭취하도록 하거나 또는 다르게는 내재화하도록 함으로써 딱정벌레류 해충에게 제공할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태는 딱정벌레류 해충의 형질전환된 숙주 식물, 형질전환된 식물 세포 및 형질전환된 식물의 자손을 포함한다. 형질전환된 식물 세포 및 형질전환된 식물은, 예를 들어 이종 프로모터의 제어 하에 iRNA 분자 중 1종 이상을 발현하여 해충 보호 효과를 발휘할 수 있도록 조작될 수 있다. 따라서, 섭식 동안 딱정벌레류 해충이 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 소비하였을 때, 해충은 트랜스제닉 식물 또는 세포에서 발현된 iRNA 분자를 섭취할 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 또한 iRNA 분자 제조를 위해 매우 다양한 원핵 및 진핵 미생물 숙주 내로 도입될 수 있다. 용어 "미생물"은 원핵 및 진핵 종, 예컨대 박테리아 및 진균을 포함한다.
유전자 발현의 조절은 이러한 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 유전자 발현을 억제하는 방법은 해충 숙주의 조직에, 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 전사 후에 형성된 적어도 1종의 dsRNA 분자 (이의 적어도 1개의 절편은 딱정벌레류 해충의 세포 내의 mRNA 서열에 상보적임)를 유전자 억제량으로 제공하는 것을 포함한다. 본 발명에 따라 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되는, siRNA, miRNA 또는 hpRNA 분자와 같은 변형된 형태를 포함한 dsRNA 분자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로부터 전사된 RNA 분자에 대해 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 100% 동일할 수 있다. 따라서, 딱정벌레류 해충 내로 도입되었을 때, 그에서 내인성 코딩 서열 또는 표적 코딩 서열의 발현을 저해 또는 억제하는 것인, 본 발명의 dsRNA 분자를 제공하기 위한 비-자연 발생 뉴클레오티드 서열 및 재조합 DNA 구축물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단리된 및 실질적으로 정제된 핵산 분자가 제공된다.
특정한 실시양태는 딱정벌레류 식물 해충에서의 1종 이상의 표적 유전자(들)의 전사후 억제를 위해, 및 딱정벌레류 식물 해충 집단의 방제를 위해 iRNA 분자를 전달하기 위한 전달 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전달 시스템은 숙주 트랜스제닉 식물 세포, 또는 숙주 세포에서 전사된 RNA 분자를 포함하는 숙주 세포의 내용물의 섭취를 포함한다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 dsRNA 분자를 제공하는 재조합 DNA 구축물을 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물이 생성된다. 특정한 iRNA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포 및 트랜스제닉 식물은 본 발명의 iRNA 분자 (예를 들어, 안정화된 dsRNA 분자)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 구축하고; 식물 세포 또는 식물을 형질전환시키고; 전사된 iRNA 분자를 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물을 생성하는 재조합 DNA 기술 (그의 기본 기술은 관련 기술분야에 널리 알려져 있음)을 사용함으로써 생산될 수 있다.
딱정벌레류 해충 저항성을 트랜스제닉 식물에 부여하기 위해, 재조합 DNA 분자를, 예를 들어 iRNA 분자, 예컨대 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자 또는 hpRNA 분자로 전사시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자는 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 이러한 dsRNA 분자는 부분적으로는, 숙주 식물에 침입할 수 있는 유형인 딱정벌레류 해충 내 DNA 서열로부터 전사된 상응하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성될 수 있다. 딱정벌레류 해충 내 표적 유전자의 발현은 섭취된 dsRNA 분자에 의해 억제되고, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현의 억제는, 예를 들어 딱정벌레류 해충에 의한 섭식의 중지를 유발하고, 궁극적으로는 트랜스제닉 식물이 딱정벌레류 해충에 의한 추가의 손상으로부터 보호되게 된다. dsRNA 분자의 조절 효과는, 예를 들어 하우스키핑 유전자를 포함한, 세포 대사 또는 세포 형질전환을 담당하는 내인성 유전자; 전사 인자; 탈피-관련 유전자; 및 세포 대사 또는 정상적인 성장 및 발생에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 다른 유전자를 포함한, 해충에서 발현되는 다양한 유전자에 적용될 수 있는 것으로 나타났다.
생체내 트랜스진 또는 발현 구축물로부터의 전사를 위해, 일부 실시양태에서는 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일렌서 및 폴리아데닐화 신호)을 사용하여 RNA 가닥 (또는 가닥들)을 전사시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이, iRNA 분자를 제조하는데 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 식물 숙주 세포에서 기능적인 1종 이상의 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 보통 숙주 게놈 내에 상주하는 내인성 프로모터일 수 있다. 작동가능하게 연결된 프로모터 서열의 제어 하에 있는 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 추가로 그의 전사 및/또는 생성된 전사체의 안정성에 유리한 영향을 미치는 추가의 서열에 플랭킹될 수 있다. 이러한 서열은 작동가능하게 연결된 프로모터의 상류, 발현 구축물의 3' 말단의 하류에 위치할 수 있고, 프로모터의 상류 및 발현 구축물의 3' 말단의 하류 둘 다에 존재할 수 있다.
일부 실시양태는 식물을 섭식하는 딱정벌레류 해충에 의해 야기되는 숙주 식물 (예를 들어, 옥수수 식물)에 대한 손상을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포를 숙주 식물에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충에 의한 섭취 시에 딱정벌레류 해충 내에서의 표적 서열의 발현을 억제하는 기능을 하고, 발현 억제를 통해 딱정벌레류 해충의 사멸, 감소된 성장 및/또는 감소된 생식을 유발하고, 이에 의해 딱정벌레류 해충에 의해 야기되는 숙주 식물에 대한 손상이 감소된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 dsRNA 분자를 포함한다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 옥수수 작물의 수확량을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 옥수수 식물 내로 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 도입하는 단계; 옥수수 식물을 재배하여 상기 핵산 서열을 포함하는 iRNA 분자가 발현되도록 하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 핵산 서열을 포함하는 iRNA 분자의 발현을 통해 딱정벌레류 해충 성장 및/또는 딱정벌레류 해충 손상을 억제함으로써, 딱정벌레류 해충 침입에 기인하는 수확량 손실을 감소시키거나 또는 제거한다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 단계; 복수개의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물이 발생하도록 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계; 핵산 분자가 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계; 형질전환된 식물 세포를 통합된 핵산 분자에 의해 코딩된 iRNA 분자의 발현에 대해 스크리닝하는 단계; iRNA 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물 세포를 선택하는 단계; 및 선택된 트랜스제닉 식물 세포를 딱정벌레류 해충에게 섭식시키는 단계를 포함한다. 식물은 또한 통합된 핵산 분자에 의해 코딩된 iRNA 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
본 발명의 iRNA 분자는 식물 세포의 게놈 내로 혼입된 재조합 유전자로부터의 발현 산물로서, 또는 식재하기 전 종자에 적용되는 코팅제 또는 종자 처리제 내로 혼입됨에 따라, 식물 종 (예를 들어, 옥수수)의 종자 내에 혼입될 수 있다. 재조합 유전자를 포함하는 식물 세포는 트랜스제닉 사건인 것으로 간주된다. 딱정벌레류 해충에의 iRNA 분자의 전달을 위한 전달 시스템이 또한 본 발명의 실시양태에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 iRNA 분자는 딱정벌레류 해충의 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 도입 방법은 딱정벌레류 해충에 대한 숙주로부터의 식물 조직과 iRNA를 직접 혼합하는 것, 뿐만 아니라 본 발명의 iRNA 분자를 포함하는 조성물을 숙주 식물 조직에 적용시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자는 식물 표면 상에 분무될 수 있다. 대안적으로, iRNA 분자는 미생물에 의해 발현될 수 있고, 미생물은 식물 표면 상에 적용될 수 있거나 또는 물리적인 수단, 예컨대 주사에 의해 뿌리 또는 스템 내로 도입될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 트랜스제닉 식물은 또한 식물에 침입하는 것으로 알려져 있는 딱정벌레류 해충을 사멸시키는데 충분한 양으로 적어도 1종의 iRNA 분자를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생산된 iRNA 분자는 또한 농업상의 일반적인 관행과 일치하는 방식으로 제제화될 수 있고, 딱정벌레류 해충에 의한 식물 손상을 방제하기 위한 분무식 제품으로서 사용될 수 있다. 제제는 잎을 효율적으로 피복시키는데 요구되는 적절한 스티커 및 습윤제, 뿐만 아니라 UV 손상으로부터 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)를 보호하기 위한 UV 보호제를 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 생물살곤충제 산업에서 통상적으로 사용되며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다. 이러한 적용은 딱정벌레류 해충으로부터의 식물 보호를 증진시키기 위해 다른 분무식 살곤충제 적용 (생물학적 기반의 것 또는 다른 것)과 함께 조합될 수 있다.
본원에 인용된 공개, 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명시적 세부사항과 일관되는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 마치 각각의 참고문헌이 개별적이고도 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지며 그 전문이 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 그렇게 포함된다. 본원에 논의된 참고문헌은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서의 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 그러한 개시내용을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기 실시예는 특정의 특정한 특색 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 개시내용을 기재된 특정한 특색 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 샘플 제조 및 곤충 먹이 생물검정
수많은 dsRNA 분자 (dre4 reg1 (서열식별번호: 2), dre4 reg2 (서열식별번호: 3) 및 dre4 reg3 (서열식별번호: 4)에 상응하는 것 포함)를 메가스크립트(MEGASCRIPT)® RNAi 키트 또는 하이스크라이브(HiScribe)® T7 시험관내 전사 키트를 사용하여 합성 및 정제하였다. 정제된 dsRNA 분자를 100X 희석된 TE 완충제 pH 7.4 중에서 제조하였고, 모든 생물검정은 이러한 완충제로 이루어진 대조군 처리를 함유하였으며, 이는 WCR (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트)의 사멸 또는 성장 억제에 대한 배경 체크로서의 역할을 하였다. 생물검정 완충제 중 dsRNA 분자의 농도는 나노드롭(NANODROP)™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽(THERMO SCIENTIFIC), 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 측정하였다.
신생 곤충 유충을 사용하여 수행된 생물검정에서 인공 곤충 먹이에 대한 곤충 활성에 대해 샘플을 시험하였다. WCR 알은 크롭 캐릭터리스틱스, 인크.(CROP CHARACTERISTICS, INC.) (미네소타주 파밍톤)로부터 입수하였다.
생물검정은 곤충 생물검정을 위해 특이적으로 설계된 128-웰 플라스틱 트레이 (씨-디 인터내셔널(C-D INTERNATIONAL), 뉴저지주 피트만)에서 수행하였다. 각 웰은 딱정벌레류 곤충의 성장을 위해 설계된 인공 먹이 대략 1.0 mL를 함유하였다. dsRNA 샘플의 60 μL 분취물을 각 웰의 먹이 표면 상에 피펫팅 (40 μL/cm2)함으로써 전달하였다. 웰 내 표면적 (1.5 cm2)의 제곱 센티미터당 dsRNA의 양 (ng/cm2)으로서 dsRNA 샘플 농도를 계산하였다. 먹이 표면 상의 액체가 증발될 때까지 또는 먹이 내로 흡수될 때까지 처리된 트레이를 흄 후드에 유지시켰다.
부화 몇 시간 이내에, 개별 유충을 습윤된 낙타털 브러시를 사용하여 채취하고, 처리된 먹이 상에 침착시켰다 (웰당 1 또는 2마리의 유충). 이어서, 128-웰 플라스틱 트레이 중 침입된 웰을 투명 플라스틱 접착 시트로 밀봉하고, 환기구를 내어 가스 교환이 이루어질 수 있도록 하였다. 생물검정 트레이를 9일 동안 제어된 환경 조건 (28℃, ~40% 상대 습도, 16:8 (명기:암기)) 하에 유지시키고, 그 시간 후 각 샘플에 노출된 곤충의 총수, 사멸된 곤충의 수 및 생존한 곤충의 중량을 기록하였다. 각 처리에 대해 평균 퍼센트 사멸률 및 평균 성장 억제를 계산하였다. 성장 억제 (GI)는 하기와 같이 계산하였다:
GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)],
여기서 TWIT는 처리군에서 살아있는 곤충의 총 중량이고;
TNIT는 처리군에서의 곤충의 총수이고;
TWIBC는 배경 체크 (완충제 대조군)에서 살아있는 곤충의 총 중량이고;
TNIBC는 배경 체크 (완충제 대조군)에서의 곤충의 총수이다.
통계적 분석은 JMP™ 소프트웨어 (SAS, 노스캐롤라이나주 케리)를 사용하여 수행하였다.
LC50 (치사 농도)은 시험 곤충의 50%가 사멸된 투여량으로서 정의된다. GI50 (성장 억제)은 시험 곤충의 평균 성장 (예를 들어, 살아있는 중량)이 배경 체크 샘플에서 보이는 평균 값의 50%인 투여량으로서 정의된다.
반복된 생물검정은 특정한 샘플 섭취가 옥수수 뿌리벌레 유충의 놀라운 예상밖의 사멸 및 성장 억제를 유발하였다는 것을 입증하였다.
실시예 2: 후보 표적 유전자의 확인
RNAi 트랜스제닉 식물 곤충 저항성 기술에 의한 방제를 위한 후보 표적 유전자 서열을 제공하기 위해 풀링된 트랜스크립톰 분석에 대해 다중 발생 단계의 WCR (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트)을 선택하였다.
한 사례에서, 하기 페놀/트리 리에이전트(TRI REAGENT)®-기반 방법 (몰레큘라 리서치 센터(MOLECULAR RESEARCH CENTER), 오하이오주 신시내티)을 사용하여 약 0.9 gm 전체 제1령 WCR 유충 (부화 후 4 내지 5일; 16℃에서 유지)으로부터 총 RNA를 단리하고, 정제하였다:
균질 현탁액을 수득할 때까지, 실온에서 10 mL의 트리 리에이전트®를 사용하여 15 mL 균질화기 중에서 유충을 균질화시켰다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 균질물을 1.5 mL 미세원심분리기 튜브로 분배하고 (1 mL/튜브), 200 μL의 클로로포름을 첨가하고, 혼합물을 15초 동안 강력하게 진탕시켰다. 추출을 통해 실온에서 10분 동안 정치시킨 후, 4℃에서 12,000 x g로 원심분리에 의해 상을 분리하였다. 상부 상 (약 0.6 mL 포함)을 또 다른 멸균 1.5 mL 튜브 내로 조심스럽게 옮기고, 동량의 실온 이소프로판올을 첨가하였다. 실온에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션한 후, 혼합물을 12,000 x g (4℃ 또는 25℃)로 8분 동안 원심분리하였다.
상청액을 조심스럽게 제거하여 폐기하고, 75% 에탄올을 사용하여 볼텍싱에 의해 RNA 펠릿을 2회에 걸쳐 세척하고, 각 세척 후에는 7,500 x g (4℃ 또는 25℃)로 5분 동안 원심분리에 의해 회수하였다. 에탄올을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 3 내지 5분 동안 공기-건조시킨 다음, 뉴클레아제-무함유 멸균수 중에 용해시켰다. 260 nm 및 280 nm에서의 흡광도 (A)를 측정함으로써 RNA 농도를 결정하였다. 약 0.9 gm의 유충으로부터의 전형적인 추출을 통해 1 mg 초과의 총 RNA를 수득하였으며, 이때 A260/A280 비는 1.9였다. 이와 같이 추출된 RNA를 추가로 프로세싱할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
분취물을 1% 아가로스 겔을 통해 전개시킴으로써 RNA 품질을 결정하였다. DEPC (디에틸 피로카르보네이트)-처리된 물로 희석된 멸균 10x TAE 완충제 (트리스-아세테이트 EDTA; 1x 농도는 0.04 M 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA (에틸렌디아민 테트라-아세트산 나트륨 염), pH 8.0)를 사용하여 아가로스 겔 용액을 제조하였다. 1x TAE를 전개 완충제로서 사용하였다. 사용 전에, 전기영동 탱크 및 웰-형성 빗을 RNAse어웨이(RNAseAway)™ (인비트로젠 인크.(INVITROGEN INC.), 캘리포니아주 칼스배드)로 세정하였다. 2 μL의 RNA 샘플을 8 μL의 TE 완충제 (10 mM 트리스 HCl pH 7.0; 1 mM EDTA) 및 10 μL의 RNA 샘플 완충제 (노바젠(NOVAGEN)® 카탈로그 번호 70606; 이엠디4 바이오사이언스(EMD4 Bioscience), 뉴저지주 깁스타운)와 혼합하였다. 샘플을 70℃에서 3분 동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 웰당 5 μL (1 μg 내지 2 μg RNA 함유) 로딩하였다. 분자 크기 비교를 위해 상업적으로 입수가능한 RNA 분자량 마커를 별도의 웰에서 동시에 전개시켰다. 겔을 2시간 동안 60 볼트로 전개시켰다.
무작위 프라이밍을 사용하여 상업용 서비스 제공자 (유로핀스 엠더블유지 오페론(EUROFINS MWG Operon), 앨라배마주 헌츠빌)에 의해 유충의 총 RNA로부터 정규화된 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 유로핀스 엠더블유지 오페론에서 GS FLX 454 티타늄(Titanium)™ 시리즈 화학에 의해 1/2 플레이트 규모로 정규화된 유충 cDNA 라이브러리를 서열분석하여 평균 판독물 길이가 348 bp인 600,000개 초과의 판독물을 얻었다. 350,000개의 판독물을 50,000개 초과의 콘티그로 조립하였다. 공중 이용가능한 프로그램인 FORMATDB (NCBI로부터 이용가능)를 사용하여 조립되지 않은 판독물 및 콘티그 둘 다를 BLASTable 데이터베이스로 전환시켰다.
다른 WCR 발생 단계에서 수거된 물질로부터 총 RNA 및 정규화된 cDNA 라이브러리를 유사하게 제조하였다. 다양한 발생 단계를 나타내는 cDNA 라이브러리 구성원을 조합함으로써 표적 유전자 스크리닝을 위한 풀링된 트랜스크립톰 라이브러리를 구축하였다.
다른 곤충, 예컨대 드로소필라(Drosophila) 및 트리볼리움(Tribolium)에서의 특정한 유전자의 치사 RNAi 효과에 관한 정보를 사용하여 RNAi 표적화를 위한 후보 유전자를 선택하였다. 이들 유전자가 딱정벌레류 곤충에서의 생존 및 성장에 필수적인 것이라고 가정하였다. 하기 기재된 바와 같은 트랜스크립톰 서열 데이터베이스에서 선택된 표적 유전자 상동체를 확인하였다. 전장의 표적 유전자 또는 그의 부분적 서열을 PCR에 의해 증폭시켜 이중-가닥 RNA (dsRNA) 생산을 위한 주형을 제조하였다.
조립되지 않은 디아브로티카 서열 판독물 또는 조립된 콘티그를 함유하는 BLASTable 데이터베이스에 대하여 후보 단백질 코딩 서열을 사용하는 TBLASTN 검색을 실행하였다. NCBI 비-중복 데이터베이스에 대하여 BLASTX를 사용함으로써 (콘티그 상동성의 경우, e-20보다 우수한 것, 및 조립되지 않은 서열 판독물 상동성의 경우, e-10보다 우수한 것으로 정의되는) 디아브로티카 서열에 대한 유의한 히트를 확증하였다. 이러한 BLASTX 검색 결과를 통해, TBLASTN 검색에서 확인된 디아브로티카 상동체 후보 유전자 서열이 실제로 디아브로티카 유전자를 포함하거나, 또는 디아브로티카 서열에 존재하는 비-디아브로티카 후보 유전자 서열에 대한 최상의 히트라는 것을 확증하였다. 대부분의 경우에, 단백질을 코딩하는 것으로서 주석달린 트리볼리움 후보 유전자는 디아브로티카 트랜스크립톰 서열 중 한 서열 또는 서열들에 대해 명확한 서열 상동성을 주었다. 몇몇 경우에, 비-디아브로티카 후보 유전자에 대한 상동성에 의해 선택된 디아브로티카 콘티그 또는 조립되지 않은 서열 판독물 중 일부는 중첩되었고, 콘티그의 조립체는 이들 중첩부를 연결하지 못했다는 것이 명확하였다. 상기 경우에, 시퀀서(Sequencher)™ v4.9 (진 코드 코포레이션(GENE CODES CORPORATION), 미시간주 앤 아버)를 사용하여 서열을 보다 긴 콘티그로 조립하였다.
WCR에서 딱정벌레류 해충 사멸, 성장의 억제 또는 발생의 억제를 유도할 수 있는 유전자로서 디아브로티카 DRE4를 코딩하는 후보 표적 유전자 (dre4; 서열식별번호: 1)를 확인하였다.
드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서, DRE4는 뉴클레오솜 재조직화에 수반되는 염색질 전사 촉진(Facilitates Chromatin Transcription (FACT)) 복합체의 성분이다. FACT는 주형으로서 DNA가 요구되는 다중 과정, 예컨대 mRNA 신장, DNA 복제 및 DNA 복구에 수반된다. 전사 신장 동안 FACT 복합체는 뉴클레오솜 구조를 탈안정화시키고 또한 회복시키는 히스톤 샤페론으로서 작용하며 이때 RNA 폴리머라제 II의 통과를 촉진시킨다. 디아브로티카 dre4 서열 (서열식별번호: 1)은 아피스 멜리페라(Apis mellifera) (진뱅크 수탁번호 XM_624003.3)로부터의 dre4 유전자의 단편과 다소 관련된다. dre4 dsRNA 트랜스진은 과다한 RNAi 표적화 및 상승작용적 RNAi 효과를 제공하기 위해 다른 dsRNA 분자와 조합될 수 있다. dre4를 표적화하는 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 옥수수 사건은 옥수수 뿌리벌레에 의한 뿌리 섭식 손상을 방지하는데 유용하다. dre4 dsRNA 트랜스진은 곤충 저항성 관리 유전자 피라미드에서 바실루스 투린기엔시스 살곤충 단백질 기술과의 조합을 위한 새로운 작용 방식을 나타내어 이들 뿌리벌레 방제 기술 중 어느 하나에 대해 저항성을 갖는 뿌리벌레 집단의 발생을 경감시킨다.
본원에서 dre4로 지칭되는 상기 디아브로티카 후보 유전자의 서열의 전장 (서열식별번호: 1) 또는 부분적 클론 (서열식별번호: 2-4)을 사용하여 dsRNA 합성을 위한 PCR 앰플리콘을 생성하였다.
실시예 3: dsRNA를 생산하기 위한 표적 유전자의 증폭
PCR에 의해 표적 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키도록 프라이머를 설계하였다. 표 1을 참조한다. 적절한 경우에, T7 파지 프로모터 서열 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA; 서열식별번호: 5)을 증폭된 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 말단 내로 혼입시켰다. 표 1을 참조한다. 총 RNA를 트리졸(TRIzol)® (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 사용하여 WCR로부터 추출하였으며, 여기서 WCR 유충 및 성충을 페슬 모터 믹서(Pestle Motor Mixer) (콜-파머(Cole-Parmer), 일리노이주 베르논 힐스)를 사용하여 실온에서 1 mL의 트리졸®이 담긴 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에서 균질한 현탁액이 수득될 때까지 균질화하였다. 실온에서의 5분 인큐베이션 후에, 균질물을 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 1 mL 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 200 μL 클로로포름을 첨가하고, 혼합물을 15초 동안 강력하게 진탕시켰다. 추출을 통해 실온에서 2-3분 동안 정치시킨 후에, 4℃에서 12,000 x g로 원심분리에 의해 상을 분리하였다. 상부 상 (약 0.6 mL 포함)을 또 다른 멸균 1.5 mL 튜브 내로 조심스럽게 옮기고, 500 uL의 실온 이소프로판올을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후에, 혼합물을 4℃에서 12,000 x g로 10분 원심분리하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하여 폐기하고, 75% 에탄올을 사용하여 볼텍싱에 의해 RNA 펠릿을 2회 세척하고, 각 세척 후에는 7,500 x g (4℃ 또는 25℃)로 5분 동안 원심분리에 의해 회수하였다. 에탄올을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 3 내지 5분 동안 공기-건조시킨 다음, 뉴클레아제-무함유 멸균수 중에 용해시켰다.
이어서, 총 RNA는 슈퍼스크립트III(SuperScriptIII)® 제1-가닥 합성 시스템 및 제조업체 올리고 dT 프라이밍 지침서 (라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 사용하여 제1-가닥 cDNA를 제조하는데 사용하였다. 이 제1-가닥 cDNA는 천연 표적 유전자 서열의 전부 또는 일부를 증폭시키도록 배치된 대향 프라이머를 사용하는 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 또한 황색 형광 단백질 (YFP)에 대한 코딩 영역을 포함하는 DNA 클론 (서열식별번호: 6; 문헌 [Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50])으로부터 dsRNA를 증폭시켰다.
<표 1> 예시적인 dre4 표적 유전자 및 YFP 음성 대조군 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머 및 프라이머 쌍.
실시예 4: RNAi 구축물
PCR에 의한 주형 제조 및 dsRNA 합성
dre4 및 YFP dsRNA 생산을 위한 특이적 주형을 제공하는데 사용된 전략은 도 1A에 제시되어 있다. dre4 dsRNA 합성에 사용하고자 의도된 주형 DNA는 표 1에서의 프라이머 쌍 및 (PCR 주형으로서) WCR 제1령 유충 또는 성충으로부터 단리된 총 RNA로부터 제조된 제1 가닥 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 각각의 선택된 dre4 및 YFP 표적 유전자 영역에 대해, PCR 증폭은 증폭된 센스 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 도입하였다 (YFP 절편은 YFP 코딩 영역의 DNA 클론으로부터 증폭시켰다). 이어서, 표적 유전자의 각 영역에 대한 2개의 PCR 증폭된 단편을 대략 동일한 양으로 혼합하고, 혼합물을 dsRNA 생산을 위한 전사 주형으로서 사용하였다. 도 1A를 참조한다. 특정한 프라이머 쌍으로 증폭시킨 dsRNA 주형의 서열은 다음과 같았다: 서열식별번호: 2 (dre4 reg1), 서열식별번호: 3 (dre4 reg2), 서열식별번호: 4 (dre4 reg3) 및 YFP (서열식별번호: 6). 제조업체의 지침서에 따라 암비온(AMBION)® 메가스크립트® RNAi 키트 (인비트로젠) 또는 제조업체의 지침서에 따라 하이스크라이브® T7 시험관내 전사 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 곤충 생물검정을 위한 이중-가닥 RNA를 합성하고 정제하였다. 나노드롭™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽, 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 dsRNA의 농도를 측정하였다.
식물 형질전환 벡터의 구축
화학적으로 합성된 단편 (DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크) 및 표준 분자 클로닝 방법의 조합을 사용하여, dre4 (서열식별번호: 1)의 절편을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 표적 유전자 구축물을 보유하는 진입 벡터 (pDAB114540 및 pDAB114541)를 조립하였다. (단일 전사 단위 내에서) 표적 유전자 절편의 두 카피를 서로 반대 배향으로 배열함으로써 RNA 1차 전사체에 의한 분자내 헤어핀 형성을 촉진시켰으며, 상기 두 절편은 ST-LS1 인트론 서열 (서열식별번호: 16; 문헌 [Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50])에 의해 이격되어 있었다. 따라서, 1차 mRNA 전사체는 상기 인트론 서열에 의해 이격되어 있는, 서로의 큰 역위 반복부로서의 두 dre4 유전자 절편 서열을 함유하였다. 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터의 카피 (미국 특허 번호 5,510,474)를 사용하여 1차 mRNA 헤어핀 전사체의 생산을 구동하고, 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmPer5 3'UTR v2; 미국 특허 번호 6,699,984)을 포함하는 단편을 사용하여 헤어핀-RNA-발현 유전자의 전사를 종결시켰다.
진입 벡터 pDAB114540은 dre4 (서열식별번호: 1)의 절편을 포함하는 dre4 헤어핀 v1-RNA 구축물 (서열식별번호: 13)을 포함한다
진입 벡터 pDAB114541은 pDAB114540에서 발견된 것과는 다른 dre4 (서열식별번호: 1)의 절편을 포함하는 dre4 헤어핀 v2-RNA 구축물 (서열식별번호: 14)을 포함한다.
상기 기재된 진입 벡터 pDAB114540 및 pDAB114541을 전형적인 이원 목표 벡터 (pDAB115765)와의 표준 게이트웨이(GATEWAY)® 재조합 반응에 사용하여, 아그로박테리움-매개된 메이즈 배아 형질전환을 위한 dre4 헤어핀 RNA 발현 형질전환 벡터 (각각 pDAB114546 및 pDAB114547)를 생산하였다. 서열식별번호: 13은 pDAB114546에서 발견된 dre4 헤어핀 v1-RNA-형성 서열을 제시하고, 서열식별번호: 14는 pDAB114547에서 발견된 dre4 헤어핀 v2-RNA-형성 서열을 제시한다.
YFP 헤어핀 dsRNA를 발현하는 유전자를 포함하는 음성 대조군 이원 벡터인 pDAB110853은 전형적인 이원 목표 벡터 (pDAB109805) 및 진입 벡터 pDAB101670과의 표준 게이트웨이® 재조합 반응에 의해 구축하였다. 진입 벡터 pDAB101670은 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 제어 하의 YFP 헤어핀 서열 (서열식별번호: 15) 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
이원 목표 벡터 pDAB115765는 사탕수수 간균형 바드나바이러스 (ScBV) 프로모터 (Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-30)의 조절 하에 제초제 저항성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (미국 특허 번호 7838733(B2) 및 문헌 [Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5])를 포함한다. 메이즈 스트리크 바이러스 (MSV) 코트 단백질 유전자 5'UTR로부터의 서열 및 메이즈 알콜 데히드로게나제 1 (ADH1) 유전자로부터의 인트론 6이 포함된 합성 5'UTR 서열은 SCBV 프로모터 절편의 3' 말단과 AAD-1 코딩 영역의 개시 코돈 사이에 배치된다. 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 번호 7,179,902)을 포함하는 단편을 사용하여 AAD-1 mRNA의 전사를 종결시켰다.
YFP 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 추가의 음성 대조군 이원 벡터인 pDAB101556은 전형적인 이원 목표 벡터 (pDAB9989) 및 진입 벡터 pDAB100287과의 표준 게이트웨이® 재조합 반응에 의해 구축하였다. 이원 목표 벡터 pDAB9989는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 조절 하의 제초제 저항성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (상기와 같음) 및 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다. 진입 벡터 pDAB100287은 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 제어 하의 YFP 코딩 영역 (서열식별번호: 17) 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
실시예 5: 후보 표적 유전자의 스크리닝
실시예 2에서 확인된 표적 유전자 서열을 억제하도록 설계된 합성 dsRNA는 먹이-기반 검정에서 WCR에게 투여되었을 때 사멸 및 성장 억제를 야기하였다. 이러한 검정에서 dre4 reg1, dre4 reg2 및 dre4 reg3은 스크리닝된 다른 dsRNA에 비해 매우 증가된 효능을 나타내는 것으로 관찰되었다.
반복된 생물검정은 dre4 reg1, dre4 reg2 및 dre4 reg3으로부터 유래된 dsRNA 제제의 섭취가 서부 옥수수 뿌리벌레 유충의 사멸 및 성장 억제를 유발하였다는 것을 입증하였다. 표 2 및 표 3은 이들 dsRNA에 대한 9-일 노출 후 WCR 유충의 먹이-기반 섭식 생물검정의 결과, 뿐만 아니라 황색 형광 단백질 (YFP) 코딩 영역 (서열식별번호: 6)으로부터 제조된 dsRNA의 음성 대조군 샘플에 의해 수득된 결과를 제시한다.
<표 2> 섭식 9일 후에 서부 옥수수 뿌리벌레 유충에 의해 수득된 dre4 dsRNA 먹이 섭식 검정의 결과. ANOVA 분석은 평균 % 사멸률 및 평균 % 성장 억제 (GI)에서의 유의차를 나타냈다. 평균은 터키-크레이머(Tukey-Kramer) 검정을 사용하여 분리하였다.
*SEM = 평균의 표준 오차. 괄호 안의 문자는 통계적 수준을 지정한다. 동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의하게 상이하다 (P<0.05).
**TE = 트리스 HCl (1 mM) + EDTA (1 mM) 완충제, pH 7.2.
***YFP = 황색 형광 단백질
<표 3> WCR 유충에 대한 dre4 dsRNA의 경구 효력 (ng/cm2)의 요약.
디아브로티카 종의 특정 유전자가 RNAi-매개된 곤충 방제에 사용될 수 있다는 것은 이전에 시사되었다. 906개의 서열이 개시되어 있는 미국 특허 공개 번호 2007/0124836 및 9,112개의 서열이 개시되어 있는 미국 특허 7,612,194를 참조한다. 그러나, RNAi-매개된 곤충 방제에 유용한 것으로 시사된 많은 유전자는 디아브로티카를 방제하는데 있어서는 효과가 없는 것으로 결정되었다. 또한, 서열 dre4 reg1, dre4 reg2 및 dre4 reg3은 각각 RNAi-매개된 곤충 방제에 유용한 것으로 시사된 다른 유전자와 비교하여 디아브로티카를 방제함에 있어서 놀랍게도 예상 밖으로 우수한 것으로 결정되었다.
예를 들어, 미국 특허 번호 7,612,194에서 아넥신, 베타 스펙트린 2 및 mtRP-L4는 각각 RNAi-매개된 곤충 방제에 효과가 있는 것으로 시사되었다. 서열식별번호: 18은 아넥신 영역 1 (Reg 1)의 DNA 서열이고, 서열식별번호: 19는 아넥신 영역 2 (Reg 2)의 DNA 서열이다. 서열식별번호: 20은 베타 스펙트린 2 영역 1 (Reg 1)의 DNA 서열이고, 서열식별번호: 21은 베타 스펙트린 2 영역 2 (Reg 2)의 DNA 서열이다. 서열식별번호: 22는 mtRP-L4 영역 1 (Reg 1)의 DNA 서열이고, 서열식별번호: 23은 mtRP-L4 영역 2 (Reg 2)의 DNA 서열이다. YFP 서열 (서열식별번호: 6)은 또한 음성 대조군으로서의 dsRNA를 생산하는데 사용되었다.
각각의 상기 언급된 서열을 사용하여 실시예 3의 방법에 의해 dsRNA를 생산하였다. dsRNA 생산을 위한 특이적 주형을 제공하는데 사용된 전략은 도 1B에 제시되어 있다. dsRNA 합성에 사용하고자 의도된 주형 DNA는 표 4에서의 프라이머 쌍 및 (PCR 주형으로서) WCR 제1령 유충으로부터 단리된 총 RNA로부터 제조된 제1 가닥 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. (YFP는 DNA 클론으로부터 증폭시켰다.) 각각의 선택된 표적 유전자 영역에 대해, 2회에 걸쳐 별개로 PCR 증폭을 수행하였다. 제1 PCR 증폭에서는 증폭된 센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 도입하였다. 제2 반응에서는 안티센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 혼입시켰다. 이어서, 표적 유전자의 각 영역에 대한 2개의 PCR 증폭된 단편을 대략 동일한 양으로 혼합하고, 혼합물을 dsRNA 생산을 위한 전사 주형으로서 사용하였다. 도 1B를 참조한다. 제조업체의 지침서에 따라 암비온® 메가스크립트® RNAi 키트 (인비트로젠)를 사용하여 이중-가닥 RNA를 합성하고 정제하였다. 나노드롭™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽, 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 dsRNA의 농도를 측정하고, dsRNA를 각각 상기 기재된 것과 동일한 먹이-기반 생물검정 방법에 의해 시험하였다. 표 4는 아넥신 Reg1, 아넥신 Reg2, 베타 스펙트린 2 Reg1, 베타 스펙트린 2 Reg2, mtRP-L4 Reg1 및 mtRP-L4 Reg2 dsRNA 분자를 생산하는데 사용된 프라이머의 서열을 열거한다. 도 1B에 도시된 방법에 사용하기 위한 YFP 프라이머 서열이 또한 표 4에 열거되어 있다. 표 5에는 이들 dsRNA 분자에의 9-일 노출 후 WCR 유충의 먹이-기반 섭식 생물검정 결과가 제시되어 있다. 반복된 생물검정은 이들 dsRNA 섭취가 TE 완충제, 물 또는 YFP 단백질의 대조군 샘플에서 보인 것을 초과하는 서부 옥수수 뿌리벌레 유충의 사멸 또는 성장 억제를 유발하지 않았음을 입증하였다.
<표 4> 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머 및 프라이머 쌍.
<표 5> 9일 후 서부 옥수수 뿌리벌레 유충에 의해 수득된 먹이 섭식 검정의 결과.
*TE = 트리스 HCl (10 mM) + EDTA (1 mM) 완충제, pH8.
**YFP = 황색 형광 단백질
실시예 6: 살곤충 dsRNA를 포함하는 트랜스제닉 메이즈 조직
아그로박테리움-매개된 형질전환
아그로박테리움-매개된 형질전환에 따라, 식물 게놈 내로 안정하게 통합된 키메라 유전자의 발현을 통해 1종 이상의 살곤충 dsRNA 분자 (예를 들어, dre4; 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함하는 적어도 1종의 dsRNA 분자)를 생산하는 트랜스제닉 메이즈 세포, 조직 및 식물을 생산하였다. 초이원 또는 이원 형질전환 벡터를 사용하는 메이즈 형질전환 방법은 관련 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 8,304,604 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 형질전환된 조직을 할록시포프-함유 배지에서 성장하는 능력에 의해 선택하고, 적절한 경우에 dsRNA 생산에 대해 스크리닝하였다. 이러한 형질전환된 조직 배양물의 부분은, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생물검정을 위한 신생 옥수수 뿌리벌레 유충에게 제공될 수 있다.
아그로박테리움 배양 개시
상기 (실시예 4)에 기재된 이원 형질전환 벡터 pDAB114515, pDAB115770, pDAB110853 또는 pDAB110556을 보유하는 아그로박테리움 균주 DAt13192 세포 (WO 2012/016222A2)의 글리세롤 스톡을 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 상에 스트리킹하고 (Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-64), 3일 동안 20℃에서 성장시켰다. 이어서, 배양물을 동일한 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 (gm/L: 효모 추출물, 10; 펩톤, 10; NaCl 5) 상에 스트리킹하고, 1일 동안 20℃에서 인큐베이션하였다.
아그로박테리움 배양
실험 당일에, 물, 접종 배지의 원액 및 아세토시린곤을 실험에서의 구축물 수에 적절한 부피로 제조하고, 멸균 일회용 250 mL 플라스크 내로 피펫팅하였다. 접종 배지 (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)는 다음을 함유하였다: 2.2 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민 (Frame et al., 상기 문헌); 68.4 gm/L 수크로스; 36 gm/L 글루코스; 115 mg/L L-프롤린; 및 100 mg/L 미오-이노시톨 (pH 5.4). 아세토시린곤을 접종 배지를 함유하는 플라스크에 100% 디메틸 술폭시드 중 1 M 원액으로부터 200 μM의 최종 농도로 첨가하고, 용액을 철저히 혼합하였다.
각각의 구축물에 대해, YEP 플레이트로부터의 아그로박테리움의 1 또는 2 접종 루프 풀을 멸균 일회용 50 mL 원심분리 튜브 내의 15 mL의 접종 배지/아세토시린곤 원액에 현탁시키고, 550 nm에서의 용액의 광학 밀도 (OD550)를 분광광도계에서 측정하였다. 이어서, 현탁액을 추가의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물을 사용하여 0.3 내지 0.4의 OD550으로 희석하였다. 이어서, 아그로박테리움 현탁액의 튜브를 실온에서 약 75 rpm으로 설정된 플랫폼 진탕기 상에 수평으로 놓고, 배아 절개를 수행하면서 1 내지 4시간 동안 진탕시켰다.
이삭 멸균 및 배아 단리
메이즈 미성숙 배아를 온실에서 성장시킨 제아 메이스 근교계 B104의 식물 (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-6)로부터 수득하고, 자기- 또는 형매-수분시켜 이삭을 생산하였다. 수분 대략 10 내지 12일 후에 이삭을 수확하였다. 실험 당일에, 도정된 이삭을 상업용 표백제 (울트라 클로록스(ULTRA CLOROX)® 살균 표백제, 6.15% 차아염소산나트륨; 트윈(TWEEN) 20 2 방울 포함) 20% 용액 중에 침지시키고, 20 내지 30분 동안 진탕시키고, 이어서 층류 후드 내부의 멸균 탈이온수 중에서 3회 헹구어 표면-멸균하였다. 미성숙 접합 배아 (1.8 내지 2.2 mm 길이)를 각 이삭으로부터 무균 절개하고, 2 μL의 10% 브레이크-트루(BREAK-THRU)® S233 계면활성제 (에보닉 인더스트리즈(EVONIK INDUSTRIES); 독일 에센)가 첨가된, 200 μM 아세토시린곤을 갖는 액체 접종 배지에 적절한 아그로박테리움 세포의 현탁액 2.0 mL를 함유하는 마이크로원심분리 튜브 내로 무작위로 분배하였다. 주어진 실험 설정을 위해, 풀링된 이삭으로부터의 배아를 각 형질전환에 사용하였다.
아그로박테리움 공동-배양
단리 후에, 배아를 5분 동안 로커 플랫폼 상에 놓았다. 이어서, 튜브의 내용물을 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산 또는 3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO3; DMSO 중 200 μM 아세토시린곤; 및 3 gm/L 겔잔(GELZAN)™ (pH 5.8)을 함유하는 공동-배양 배지의 플레이트 상에 부었다. 액체 아그로박테리움 현탁액을 멸균 일회용 전달 피펫으로 제거하였다. 이어서, 배아를 현미경의 보조 하에 멸균 겸자를 사용하여 배반이 상부를 향하도록 배향하였다. 플레이트를 폐쇄하고, 3M™ 마이크로포어(MICROPORE)™ 의료 테이프로 밀봉하고, 광합성 유효 방사선 (PAR)의 대략 60 μmol m-2s-1에서의 연속광이 있는 25℃의 인큐베이터에 넣었다.
트랜스제닉 사건의 캘러스 선택 및 재생
공동-배양 기간 후에, 배아를 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바; 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO3; 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 1수화물; 피토테크놀로지 래보러토리즈(PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; 캔자스주 레넥사); 250 mg/L 카르베니실린; 및 2.3 gm/L 겔잔™ (pH 5.8)이 포함된 휴지 배지로 옮겼다. 36개 이하의 배아를 각 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 투명 플라스틱 상자에 넣고, 7 내지 10일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광을 사용하여 27℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 100 nM R-할록시포프 산 (0.0362 mg/L; AAD-1 유전자를 보유하는 캘러스의 선택을 위함)을 갖는 휴지 배지 (상기)가 포함된 선택 배지 I 상에 캘러스화 배아를 옮겼다 (<18개/플레이트). 플레이트를 투명한 상자로 복귀시키고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광을 사용하여 27℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 500 nM R-할록시포프 산 (0.181 mg/L)을 갖는 휴지 배지 (상기)가 포함된 선택 배지 II에 캘러스화 배아를 옮겼다 (<12개/플레이트). 플레이트를 투명한 상자로 복귀시키고, 14일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광을 사용하여 27℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 선택 단계는 트랜스제닉 캘러스가 추가로 증식하고 분화되도록 하였다.
증식
배아 캘러스를 예비-재생 배지에 옮겼다 (<9개/플레이트). 예비-재생 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 45 gm/L 수크로스; 350 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 미오-이노시톨; 50 mg/L 카세인 효소 가수 분해물; 1.0 mg/L AgNO3; 0.25 gm/L MES; NaOH 중 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산; 에탄올 중 2.5 mg/L 아브시스산; 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린; 250 mg/L 카르베니실린; 2.5 gm/L 겔잔™; 및 0.181 mg/L 할록시포프 산 (pH 5.8)을 함유하였다. 플레이트를 투명한 상자에 보관하고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광을 사용하여 27℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 재생 캘러스를 피타트레이스(PHYTATRAYS)™ (시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH)) 내의 재생 배지에 옮기고 (<6개/플레이트), 14일 동안 또는 싹 및 뿌리가 발생할 때까지 (대략 160 μmol m-2s-1 PAR에서) 일당 16시간 명기/8시간 암기 하에 28℃에서 인큐베이션하였다. 재생 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 60 gm/L 수크로스; 100 mg/L 미오-이노시톨; 125 mg/L 카르베니실린; 3 gm/L 겔란(GELLAN)™ 검; 및 0.181 mg/L R-할록시포프 산 (pH 5.8)을 함유하였다. 이어서, 주요 뿌리를 갖는 작은 싹을 단리하고, 선택 없이 신장 배지로 옮겼다. 신장 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 및 3.5 gm/L 겔라이트(GELRITE)™ (pH 5.8)를 함유하였다.
할록시포프를 함유하는 배지 상에서 성장하는 능력에 의해 선택된 형질전환된 식물 싹을 피타트레이스™로부터 성장 배지 (프로믹스 비엑스(PROMIX BX); 프리미어 테크 홀티컬쳐(PREMIER TECH HORTICULTURE))로 채워진 작은 용기로 이식하고, 컵 또는 휴이-돔스(HUMI-DOMES) (아르코 플라스틱스(ARCO PLASTICS))로 덮고, 이어서 콘비론(CONVIRON) 성장 챔버 (27℃ 낮/24℃ 밤, 16-시간 광주기, 50-70% RH, 200 μmol m-2s-1 PAR)에서 튼튼하게 했다. 일부 경우에, 추정 트랜스제닉 소식물체를 메이즈 게놈 내로 통합된 AAD1 제초제 내성 유전자를 검출하도록 설계된 프라이머를 사용하는 정량적 실시간 PCR 검정에 의해 트랜스진 상대 카피수를 분석하였다. 추가로, RNA qPCR 검정을 사용하여 추정 형질전환체의 발현된 dsRNA에서 ST-LS1 인트론 서열의 존재를 검출하였다. 선택된 형질전환된 소식물체를 추가의 성장 및 시험을 위한 온실 내로 이동시켰다.
생물검정 및 종자 생산을 위한 온실에서의 T0 식물의 전달 및 확립
식물이 V3-V4 단계에 도달했을 때, 이를 아이이 커스텀 블렌드(IE CUSTOM BLEND) (프로파일/메트로 믹스(PROFILE/METRO MIX) 160) 토양 혼합물로 이식하고, 성장시켜 온실 (광 노출 유형: 광 또는 동화; 높은 광 한계: 1200 PAR; 16시간 낮 길이; 27℃ 낮/24℃ 밤)에서 개화시켰다.
곤충 생물검정에 사용할 식물을 작은 용기로부터 티누스(TINUS)™ 350-4 루트레이너스(ROOTRAINERS)® (스펜서-르메르 인더스트리즈(SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES), 캐나다 앨버타주 애치슨)로 이식하였다 (루트레이너스®당 사건당 1종의 식물). 루트레이너스®로 이식한지 대략 4일 후에, 생물검정을 위해 식물을 침입시켰다.
T1 세대의 식물은 비-트랜스제닉 우량 근교계 B104의 식물로부터 수집한 화분 또는 다른 적절한 화분 공여자를 사용하여 T0 트랜스제닉 식물의 수염을 수분시키고 생성된 종자를 식재함으로써 수득하였다. 가능할 때 상반 교배를 수행하였다.
실시예 7: 트랜스제닉 메이즈 조직의 분자 분석
뿌리 섭식 손상을 평가한 날과 동일한 날에 온실에서 성장한 식물로부터 수집한 잎 및 뿌리로부터의 샘플에 대해 메이즈 조직의 분자 분석 (예를 들어 RNA qPCR)을 수행하였다.
StPIN-II 3'UTR에 대한 RNA qPCR 검정의 결과를 사용하여 헤어핀 트랜스진의 발현을 검증하였다. 발현된 RNA에서의 ST-LS1 인트론 서열 (이는 dsRNA 헤어핀 분자의 형성에 필수적임)에 대한 RNA qPCR 검정의 결과를 사용하여 헤어핀 전사체의 존재를 검증하였다. 트랜스진 RNA 발현 수준을 내인성 메이즈 유전자의 RNA 수준에 대하여 측정하였다.
게놈 DNA에서 AAD1 코딩 영역의 일부분을 검출하기 위한 DNA qPCR 분석을 사용하여 트랜스진 삽입 카피수를 추정하였다. 이들 분석을 위한 샘플을 환경 챔버에서 성장한 식물로부터 수집하였다. 결과를 단일-카피 천연 유전자의 일부분을 검출하도록 설계된 검정의 DNA qPCR 결과와 비교하고, 단순 사건 (1 또는 2 카피의 트랜스진을 가짐)을 온실에서 추가의 연구를 위해 진행시켰다.
추가로, 스펙티노마이신-저항성 유전자 (SpecR; T-DNA의 밖의 이원 벡터 플라스미드 상에 보유됨)의 일부분을 검출하도록 설계된 qPCR 검정을 사용하여 트랜스제닉 식물이 이질 통합된 플라스미드 백본 서열을 함유하는지 여부를 결정하였다.
헤어핀 RNA 전사체 발현 수준: Per 5 3'UTR qPCR
캘러스 세포 사건 또는 트랜스제닉 식물을 Per 5 3'UTR 서열의 실시간 정량적 PCR (qPCR)에 의해 분석하여, TIP41-유사 단백질 (즉, 진뱅크 수탁번호 AT4G34270의 메이즈 상동체; 74% 동일성의 tBLASTX 점수를 가짐)을 코딩하는 내부 메이즈 유전자 (서열식별번호: 52; 진뱅크 수탁번호 BT069734)의 전사체 수준에 비교하여 전장 헤어핀 전사체의 상대 발현 수준을 결정하였다. RNAEASY™ 96 키트 (퀴아젠(QIAGEN), 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 RNA를 단리시켰다. 용리 후에, 총 RNA를 키트의 제안된 프로토콜에 따라 DNAse1 처리에 적용하였다. 이어서, RNA를 나노드롭 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽) 상에서 정량화하고, 농도를 25 ng/μL로 정규화하였다. 실질적으로 제조업체의 권고된 프로토콜에 따라, 5 μL의 변성된 RNA와 함께 고 성능 cDNA 합성 키트(HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT) (인비트로젠)를 사용하여 10 μL 반응 부피로 제1 가닥 cDNA를 제조하였다. 조합된 무작위 프라이머 및 올리고 dT의 작업 스톡을 제조하기 위해, 무작위 프라이머 스톡 혼합물의 1 mL 튜브 내로 100 μM T20VN 올리고뉴클레오티드 (IDT) (서열식별번호: 53; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, 여기서 V는 A, C 또는 G이고, N은 A, C, G 또는 T/U임)의 10 μL 첨가를 포함하도록 프로토콜을 약간 변형하였다.
cDNA 합성 합성 후에, 뉴클레아제-무함유 물을 사용하여 샘플을 1:3으로 희석하고, 검정할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
StPIN-II 및 TIP41-유사 전사체에 대한 별도의 실시간 PCR 검정을 10 μL 반응 부피로 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)™ 480 (로슈 다이아그노스틱스(ROCHE DIAGNOSTICS), 인디애나주 인디애나폴리스) 상에서 수행하였다. PIN II 검정을 위해, 프라이머 StPinIIF2 태그 (서열식별번호: 54) 및 StPinIIR2 태그 (서열식별번호: 55) 및 StPinIIFAM2 태그 (서열식별번호: 74)를 사용하여 반응을 실행하였다. TIP41-유사 참조 유전자 검정을 위해, 프라이머 TIPmxF (서열식별번호: 56) 및 TIPmxR (서열식별번호: 57), 및 HEX (헥사클로로플루오레신)로 표지된 프로브 HXTIP (서열식별번호: 58)를 사용하였다.
모든 검정은 주형을 함유하지 않는 (단지 혼합물만 있는) 음성 대조군을 포함하였다. 표준 곡선을 위해, 샘플의 교차 오염을 체크하기 위해 소스 플레이트에 블랭크 (소스 웰 중 물)를 또한 포함하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 6에 기재된다. 다양한 전사체의 검출을 위한 반응 성분 레시피는 표 7에 개시되고 PCR 반응 조건은 표 8에 요약된다. FAM (6-카르복시 플루오레세인 아미다이트) 형광 모이어티를 465 nm에서 여기시키고, 형광을 510 nm에서 측정하였으며; HEX (헥사클로로플루오레세인) 형광 모이어티에 대한 상응하는 값은 533 nm 및 580 nm였다.
<표 6> 트랜스제닉 메이즈에서 전사체 수준의 분자 분석에 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열.
*TIP41-유사 단백질.
**NAv 공급업체로부터 이용가능하지 않은 서열.
<표 7> 전사체 검출을 위한 PCR 반응 레시피.
<표 8> RNA qPCR을 위한 써모사이클러 조건.
라이트사이클러™ 소프트웨어 v1.5를 사용하여, 공급업체의 권고에 따라 Cq 값 계산을 위한 2차 도함수 최대 알고리즘을 사용하여 상대 정량화에 의해 데이터를 분석하였다. 발현 분석을 위해, ΔΔCt 방법 (즉, 2-(Cq 표적 - Cq 참조))을 사용하여 발현 값을 계산하였으며, 상기 방법은 두 표적 간의 Cq 값 차이 비교에 의존하고, 최적화된 PCR 반응의 경우, 산물은 매 사이클마다 배가된다는 가정하에서 기준 값을 2로 선택하였다.
헤어핀 전사체 크기 및 완전성: 노던 블롯 검정
dre4 헤어핀 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 식물에서 dre4 헤어핀 RNA의 분자 크기를 결정하기 위해 노던 블롯 (RNA 블롯) 분석을 사용하여 트랜스제닉 식물의 추가의 분자 특징화를 수득하였다.
모든 물질 및 장비를 사용 전에 RNAZAP™ (암비온/인비트로젠)으로 처리하였다. 조직 샘플 (100 mg 내지 500 mg)을 2 mL 세이프록 에펜도르프(SAFELOCK EPPENDORF) 튜브에 수집하고, 5분 동안 1 mL 트리졸(TRIZOL) (인비트로젠) 중 3개의 텅스텐 비드를 사용하는 클렉코(KLECKO)™ 조직 미분쇄기 (가르시아 매뉴팩처링(GARCIA MANUFACTURING), 캘리포니아주 비살리아)로 분쇄하고, 이어서 10분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션하였다. 임의로, 샘플을 4℃에서 10분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 신선한 2 mL 세이프록 에펜도르프 튜브 내로 옮겼다. 200 μL 클로로포름을 균질물에 첨가한 후에, 튜브를 2 내지 5분 동안 반전에 의해 혼합하고, 10분 동안 RT에서 인큐베이션하고, 4℃에서 15분 동안 12,000 x g로 원심분리하였다. 상부 상을 멸균 1.5 mL 에펜도르프 튜브 내로 옮기고, 100% 이소프로판올 600 μL를 첨가하고, 이어서 10분 내지 2시간 동안 RT에서 인큐베이션한 다음, 4℃ 내지 25℃에서 10분 동안 12,000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, RNA 펠릿을 70% 에탄올 1 mL로 2회 세척하고, 세척 사이에 4℃ 내지 25℃에서 10분 동안 7,500 x g로 원심분리하였다. 에탄올을 폐기하고, 펠릿을 3 내지 5분 동안 간단히 공기 건조시킨 후에, 뉴클레아제-무함유 물 50 μL 중에 재현탁시켰다.
총 RNA를 나노드롭8000® (써모-피셔)를 사용하여 정량화하고, 샘플을 5 μg/10 μL로 정규화하였다. 이어서, 10 μL 글리옥살 (암비온/인비트로젠)을 각 샘플에 첨가하였다. DIG RNA 표준 마커 혼합물 (로슈 어플라이드 사이언스(ROCHE APPLIED SCIENCE), 인디애나주 인디애나폴리스) 5 내지 14 ng를 분배하고, 동등 부피의 글리옥살에 첨가하였다. 샘플 및 마커 RNA를 45분 동안 50℃에서 변성시키고, 노던맥스(NORTHERNMAX) 10X 글리옥살 전개 완충제 (암비온/인비트로젠) 중 1.25% 시켐 골드(SEAKEM GOLD) 아가로스 (론자(LONZA), 뉴저지주 앨런데일) 겔 상에 로딩할 때까지 얼음 상에 보관하였다. RNA를 2시간 15분 동안 65 볼트/30 mA로 전기영동에 의해 분리하였다.
전기영동 후에, 겔을 5분 동안 2X SSC 중에서 헹구고, 겔 독(GEL DOC) 스테이션 (바이오라드(BIORAD), 캘리포니아주 허큘레스) 상에서 영상화하였다. 이어서, RNA를 전달 완충제로서 10X SSC를 사용하여 (20X SSC는 3 M 염화나트륨 및 300 mM 시트르산삼나트륨으로 이루어짐, pH 7.0), RT에서 밤새 나일론 막 (밀리포어(MILLIPORE))에 수동으로 전달하였다. 전달 후에, 막을 5분 동안 2X SSC 중에서 헹구고, RNA를 막 (애질런트(AGILENT)/스트라타진(STRATAGENE))에 UV-가교시키고, 막을 최대 2일 동안 RT에서 건조되도록 하였다.
막을 1 내지 2시간 동안 울트라하이브(ULTRAHYB) 완충제 (암비온/인비트로젠)에서 예비혼성화시켰다. 프로브는 로슈 어플라이드 사이언스 DIG 절차에 의해 디옥시게닌으로 표지된 관심 서열 (예를 들어, 적절한 경우에 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 14의 안티센스 서열 부분)을 함유하는 PCR 증폭된 산물로 이루어졌다. 권고된 완충제 중에서의 혼성화는 혼성화 튜브에서 60℃의 온도에서 밤새 이루어졌다. 혼성화 후에, 블롯을 모두 DIG 키트의 공급업체에 의해 권고된 방법에 의해 DIG 세척에 적용하고, 랩핑하고, 1 내지 30분 동안 필름에 노출시키고, 이어서 필름를 현상하였다.
트랜스진 카피수 결정
대략 2개 잎 펀치와 동등한 메이즈 잎 단편을 96-웰 집합 플레이트 (퀴아젠)에 수집하였다. 한 스테인레스 스틸 비드를 갖는 바이오스프린트96(BIOSPRINT96) AP1 용해 완충제 (바이오스프린트96 플랜트 키트로 공급됨; 퀴아젠) 중에서 클렉코™ 조직 분쇄기 (가르시아 매뉴팩처링, 캘리포니아주 비살리아)를 사용하여 조직 파괴를 수행하였다. 조직 온침 후에, 게놈 DNA (gDNA)를 바이오스프린트96 플랜트 키트 및 바이오스프린트96 추출 로봇을 사용하여 고처리량 포맷으로 단리하였다. qPCR 반응을 설정하기 전에 게놈 DNA를 2:3 DNA:물로 희석하였다.
qPCR 분석
가수분해 프로브 검정에 의한 트랜스진 검출은 라이트사이클러®480 시스템을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행하였다. ST-LS1 인트론 서열 (서열식별번호: 16)을 검출하거나 또는 SpecR 유전자 (즉, 이원 벡터 플라스미드 상에 보유된 스펙티노마이신 저항성 유전자; 서열식별번호: 70; 표 9에서의 SPC1 올리고뉴클레오티드)의 일부분을 검출하기 위한 가수분해 프로브 검정에 사용할 올리고뉴클레오티드는, 라이트사이클러® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 사용하여 설계하였다. 추가로, AAD-1 제초제 내성 유전자 (서열식별번호: 64; 표 9에서의 GAAD1 올리고뉴클레오티드)의 절편을 검출하기 위한 가수분해 프로브 검정에 사용할 올리고뉴클레오티드는 프라이머 익스프레스 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 설계하였다. 표 9는 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다. gDNA가 각 검정에 존재하였다는 것을 보장하기 위해 내부 참조 서열로서의 역할을 하는 내인성 메이즈 염색체 유전자에 대한 시약 (인버타제 (서열식별번호: 61; 진뱅크 수탁번호 U16123; IVR1로 본원에 지칭됨))을 사용하여 검정을 멀티플렉스화하였다. 증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스)를 0.4 μM의 각 프라이머 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1x 최종 농도로 제조하였다 (표 10). 2 단계 증폭 반응을 표 11에 요약된 바와 같이 수행하였다. FAM- 및 HEX-표지된 프로브에 대한 형광단 활성화 및 방출은 상기 기재된 바와 같았으며; CY5 접합체는 650 nm에서 최대로 여기하고, 670 nm에서 최대로 형광을 내었다.
피트 포인트 알고리즘 (라이트사이클러® 소프트웨어 출시 1.5) 및 (ΔΔCt 방법에 기초한) 렐러티브 퀀트(Relative Quant) 모듈을 사용하여 실시간 PCR 데이터 분석으로부터 Cp 점수 (형광 신호가 배경 역치와 교차하는 지점)를 결정하였다. 데이터를 이전에 기재된 바와 같이 다루었다 (상기; RNA qPCR).
<표 9> 유전자 카피수 결정 및 이원 벡터 플라스미드 백본 검출에 사용된 프라이머 및 프로브 (형광 접합체 포함)의 서열.
CY5 = 시아닌-5
<표 10> 유전자 카피수 분석 및 플라스미드 백본 검출을 위한 반응 성분.
*NA = 적용가능하지 않음
**ND = 결정하지 않음.
<표 11> DNA qPCR을 위한 써모사이클러 조건.
실시예 8: 트랜스제닉 메이즈의 생물검정
시험관내 곤충 생물검정
식물 세포에서 생산된 본 발명의 dsRNA의 생물활성을 생물검정 방법에 의해 입증하였다. 예를 들어, 문헌 [Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6]을 참조한다. 예를 들어, 살곤충 dsRNA를 생산하는 식물로부터 유래된 다양한 식물 조직 또는 조직 조각을 방제형 섭식 환경에서 표적 곤충에게 섭식시킴으로써, 효능을 입증할 수 있었다. 대안적으로, 살곤충 dsRNA를 생산하는 식물로부터 유래된 다양한 식물 조직으로부터 추출물을 제조하고, 본원 상기에 기재된 바와 같은 생물검정을 위한 인공 먹이의 상단에 추출된 핵산을 분배하였다. 이러한 섭식 검정의 결과를, 살곤충 dsRNA를 생산하지 않는 숙주 식물로부터의 적절한 방제 조직을 사용하는 유사하게 수행된 생물검정과 또는 다른 대조군 샘플과 비교하였다.
트랜스제닉 메이즈 사건을 사용한 곤충 생물검정
세척란으로부터 부화한 2마리의 서부 옥수수 뿌리벌레 유충 (1 내지 3일령)을 선택하고, 생물검정 트레이의 각 웰 내에 넣었다. 이어서, 웰을 "풀 엔' 필(PULL N' PEEL)" 탭 덮개 (바이오(BIO)-CV-16, 바이오-서브(BIO-SERV))로 덮고, 18시간/6시간 명기/암기 주기 하에 28℃ 인큐베이터에 넣었다. 초기 침입 9일 후에, 유충을 사멸률에 대해 평가하였으며, 사멸률은 각 처리에서 곤충의 총수 중 사멸한 곤충의 백분율로 계산하였다. 곤충 샘플을 2일 동안 -20℃에서 동결시킨 다음, 각 처리로부터의 곤충 유충을 풀링하고 칭량하였다. 퍼센트 성장 억제는 실험 처리의 평균 중량을 2개 대조군 웰 처리의 평균 중량으로 나눔으로써 계산하였다. 데이터는 (음성 대조군에 대한) 퍼센트 성장 억제로 표현되었다. 대조군 평균 중량을 초과한 평균 중량은 0으로 정규화하였다.
온실에서의 곤충 생물검정
토양에 있는 서부 옥수수 뿌리벌레 (WCR, 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트) 알을 크롭 캐릭터리스틱스 (미네소타주 파밍톤)로부터 받았다. WCR 알을 10 내지 11일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 토양으로부터의 알을 세척하고, 0.15% 한천 용액 내에 넣고, 0.25 mL 분취물당 대략 75 내지 100개 알이 있도록 농도를 조정하였다. 부화율을 모니터링하기 위해 알 현탁액의 분취물을 갖는 페트리 디쉬에서 부화 플레이트를 설정하였다.
루트레이너스®에서 성장하는 메이즈 식물 주위의 토양에 150 내지 200개 WCR 알을 침입시켰다. 2주 동안 곤충이 섭식하도록 하고, 이 시간 후에 각 식물에 대해 "뿌리 등급화"가 주어졌다. 본질적으로 문헌 [Oleson et al. (2005, J. Econ. Entomol. 98:1-8)]에 따른 등급화에 마디-손상 척도를 이용하였다. 이러한 생물검정을 통과한 식물은 종자 생산을 위해 5-갤런 용기로 이식하였다. 온실에서 추가의 뿌리벌레 손상 및 곤충 방출을 방지하기 위해 이식물을 살곤충제로 처리하였다. 식물은 종자 생산을 위해 수동 수분시켰다. 이들 식물에 의해 생산된 종자를 식물의 T1 및 후속 세대에서 평가하기 위해 저장하였다.
온실 생물검정은 두 종류의 음성 대조군 식물을 포함하였다. 트랜스제닉 음성 대조군 식물은 황색 형광 단백질 (YFP) 또는 YFP 헤어핀 dsRNA를 생산하도록 설계된 유전자를 보유하는 벡터에 의한 형질전환에 의해 생성시켰다 (실시예 4 참조). 비-형질전환 음성 대조군 식물은 계통 7sh382 또는 B104의 종자로부터 성장시켰다. 생물검정을 별도의 2일에 수행하였으며, 음성 대조군은 각각의 식물 물질 세트에 포함되었다.
표 12는 dre4-헤어핀 식물에 대한 분자 분석 및 생물검정의 조합 결과를 제시한다. 표 12에 요약된 생물검정 결과의 검사는, 예를 들어 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14에 예시된 바와 같은 서열식별번호: 1의 절편을 포함하는 dre4 헤어핀 dsRNA를 발현하는 구축물을 보유하는 트랜스제닉 메이즈 식물의 대부분이 서부 옥수수 뿌리벌레 유충의 섭식에 의해 초래되는 뿌리 손상에 대하여 보호된다는 놀라운 예상 밖의 관찰을 나타냈다. 37개의 등급화된 사건 중 22개는 0.5 이하의 뿌리 등급을 가졌다. 표 13은 음성 대조군 식물에 대한 분자 분석 및 생물검정의 조합 결과를 제시한다. 비록 34개의 등급화된 식물 중 5개가 0.75 이하의 뿌리 등급을 가졌지만, 대부분의 식물은 WCR 유충 섭식에 대해 보호되지 않았다. 음성 대조군 식물 세트 사이에 낮은 뿌리 등급 점수를 갖는 일부 식물의 존재가 때때로 관찰되었고, 이는 온실 세팅에서 이러한 유형의 생물검정을 수행하는 변동성 및 어려움을 반영한다.
<표 12> dre4-헤어핀-발현 메이즈 식물의 온실 생물검정 및 분자 분석 결과.
*RTL = TIP4-유사 유전자 전사체 수준에 대하여 측정된 상대 전사체 수준.
**NG = 작은 식물 크기로 인해 등급화하지 않음.
***ND = 수행하지 않음.
<표 13> 트랜스제닉 및 비-형질전환 메이즈 식물을 포함하는 음성 대조군 식물의 온실 생물검정 및 분자 분석 결과.
*RTL = TIP4-유사 유전자 전사체 수준에 대하여 측정된 상대 전사체 수준.
**NG = 작은 식물 크기로 인해 등급화하지 않음.
***ND = 수행하지 않음.
실시예 9: 딱정벌레류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
10 내지 20종의 트랜스제닉 T0 제아 메이스 식물을 실시예 6에 기재된 바와 같이 생성하였다. 옥수수 뿌리벌레 챌린지를 위해 RNAi 구축물을 위해 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 제아 메이스 독립 계통을 수득하였다. 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14에 기재된 바와 같은 또는 다르게는 서열식별번호: 1을 추가로 포함하는 헤어핀 dsRNA가 유래될 수 있다. 추가의 헤어핀 dsRNA는, 예를 들어 딱정벌레류 해충 서열, 예컨대, 예를 들어 Caf1-180 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174258), VatpaseC (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174259), Rho1 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174260), VatpaseH (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0198586), PPI-87B (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091600), RPA70 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091601) 또는 RPS6 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0097730)으로부터 유래될 수 있다. 이들은 RT-PCR 또는 다른 분자 분석 방법을 통해 확증하였다. 각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 ST-LS1 인트론에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 RT-PCR에, 선택된 독립 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의로 사용하였다. 추가로, RNAi 구축물 중 각 표적 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의로 사용하여 식물내에서 siRNA 생산에 요구되는 예비-프로세싱된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확증하였다. 각 표적 유전자에 대한 목적하는 밴드의 증폭은 각 트랜스제닉 제아 메이스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확증시켜 주었다. 이후, 표적 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 프로세싱은 임의로 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립 트랜스제닉 계통에서 확증하였다.
더욱이, 표적 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 표적 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에서 보이는 것과 유사한 방식으로 옥수수 뿌리벌레에 영향을 미쳤다. 동일한 RNAi 구축물 중 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열과의 쌍형성은 섭식 딱정벌레류 해충의 성장, 발생 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-프로세싱된 siRNA를 전달하였다.
표적 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA 또는 miRNA를 식물내 전달한 후에, 이를 섭식을 통해 딱정벌레류 해충이 흡수하였을 때, RNA-매개된 유전자 침묵을 통해 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자가 하향-조절되었다. 표적 유전자의 기능이 하나 이상의 발생 단계에서 중요할 때, 딱정벌레류 해충의 성장, 발생 및 생식은 영향을 받았고, WCR, NCR, SCR, MCR, 디. 발테아타 르콩트, 디. 유. 테넬라 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임 중 적어도 1종의 경우에서, 성공적으로 침입, 섭식, 발생 및/또는 생식하지 못하게 되었거나 또는 딱정벌레류 해충의 사멸에 이르게 되었다. 이어서, 표적 유전자를 선택하고 RNAi를 성공적으로 적용하여 사용함으로써 딱정벌레류 해충을 방제하였다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비형질전환 제아 메이스의 표현형 비교
헤어핀 dsRNA를 생성시키기 위해 선택된 표적 딱정벌레류 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 알려져 있는 식물 유전자 서열에 대해서도 유사성을 갖지 않았다. 따라서, 이들 딱정벌레류 해충 유전자 또는 서열을 표적화하는 구축물에 의한 (체계적) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 임의의 유해한 영향을 미칠 것이라고는 예상하지 못했다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생학적 및 형태학적 특징을 비형질전환 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "빈" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 경우와 비교하였다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교하였다. 트랜스제닉 식물과 비형질전환 식물의 뿌리 길이 및 성장 패턴에 있어서는 어떠한 차이도 관찰가능하지 않았다. 식물 싹 특징, 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화 시기, 꽃의 크기 및 외관은 유사하였다. 일반적으로, 시험관내 및 온실 내 토양에서 배양하였을 때, 트랜스제닉 계통과 표적 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 형태학적 차이도 관찰가능하지 않았다.
실시예 10: 딱정벌레류 해충 서열 및 추가의 RNAi 구축물을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
딱정벌레류 해충 이외의 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 게놈 내의 이종 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스 식물을 아그로박테리움 또는 휘스커스(WHISKERS)™ 방법론을 통해 2차로 형질전환시켜 (문헌 [Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67] 참조) 1종 이상의 살곤충 dsRNA 분자 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 1종의 dsRNA 분자)를 생산하였다. 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 식물 형질전환 플라스미드 벡터를 아그로박테리움 또는 휘스커스™-매개된 형질전환 방법을 통해, 딱정벌레류 해충 이외의 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 게놈 내의 이종 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 Hi II 또는 B104 제아 메이스 식물로부터 수득된 미성숙 메이즈 배아 또는 메이즈 현탁 세포 내로 전달하였다.
실시예 11: RNAi 구축물 및 추가의 딱정벌레류 해충 방제 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
딱정벌레류 해충 유기체를 표적화하는 iRNA 분자 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 1종의 dsRNA 분자)로 전사되는 게놈 내의 이종 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스 식물을 아그로박테리움 또는 휘스커스™ 방법론을 통해 2차로 형질전환시켜 (문헌 [Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67] 참조) 1종 이상의 살곤충 단백질 분자, 예를 들어 Cry3, Cry34 및 Cry35 살곤충 단백질을 생산하였다. 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 식물 형질전환 플라스미드 벡터를 아그로박테리움 또는 휘스커스™-매개된 형질전환 방법을 통해, 딱정벌레류 해충 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 게놈 내의 이종 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 B104 제아 메이스 식물로부터 수득된 미성숙 메이즈 배아 또는 메이즈 현탁 세포 내로 전달하였다. 딱정벌레류 해충의 방제를 위한 iRNA 분자 및 살곤충 단백질을 생산하는 이중으로 형질전환된 식물을 수득하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Dow AgroSciences LLC
Fraunhofer IME
University of Giessen
Narva, Ken E.
Frey, Meghan
Rangasamy, Murugesan
Arora, Kanika S.
Veeramani, Balaji
Gandra, Premchand
Worden, Sarah E.
Vilcinskas, Andreas
Knorr, Eileen
<120> DRE4 NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CONFER RESISTANCE TO COLEOPTERAN PESTS
<130> 75747
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3423
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 1
atggctaatg tcaatttaga caaacagtct tttcaccgta gattaaagaa gctctacaat 60
tcatggcaaa ataccgatgg agaaaatggt ttctcaaaaa tggatgcttt agtcactgca 120
gtcggcaaag acgatgatat tgtgtacagc aaatcaggtg cattgcaaat atggctgttg 180
ggctacgaac ttacagatac tattatggtt cttgtagaga aaaaagctta tttcttaacc 240
agtaaaaaga aggttgaatt tcttcggcaa gccgaactta aagagaagga tgagaaccaa 300
atccaactaa acttgttggt ccgcgataaa gacagcgacg aagcaaaatt taaaattctt 360
tgtgaagcta taaaggagag caaaaatggt aaaactttgg gggtttttgc aaaggataat 420
tattctggat cttttgttga taattggaaa gcaatgctca agaaacaaga atttcaaact 480
gcggatatga gttctcagat tgcttacctc attagcccta aagaagaatc tgaaattact 540
accatgaaaa aagcatctca ggtaactgta gatgtattca caaagtattt aaaagatcag 600
attatggaga ttattgattc ggaaaagaaa gtcaagcata gcaaactagc agaaggagtt 660
gaatctgcca taagtgataa aaaatatgtc tcaggggttg atgttaatca agttgatatg 720
tgctaccctg ccattataca gtctggaggc acttacaatt taaaattcag tgttattagt 780
gataaaaatt cactacattt tggagccatt gtttgttctc taggcgctcg ctataagtca 840
tactgttcca acatcgtccg aaccttgtta gtaaacccca cagaggaaat ccaaaacaac 900
tataattttc ttttaacaat tgaagaggag ttaataaaag tgcttcagaa tggagtaaaa 960
ttgtcggaag tttatgacac tggttacaat atggttaaaa aggaaaagcc aaatttagct 1020
gaccatttga ccaaaaattt tggattcgca atggggatag aattcaaaga aaattccctg 1080
attattggac caaaaactac agttgaagcc aaaaagggga tggtgttcaa tttaaatata 1140
ggtttttcta atttggaaaa taaggaagct tctgacaagg agggaaaaat atatgcttta 1200
ttcattggag atactgtttt ggttaatgaa ggtcagccag caagtgtctt aacaccatcc 1260
aagaagaaga ttaagaacat cggtattttc cttaaagatg attctgacgc agaagaaaat 1320
gatgaggaaa aagaaaacac tccgaaaaag accgaaattt tgggaagggg taaaagaact 1380
gctgttattg aatcaaaact gcgtactgaa cacagcaccg aagaaaaaag aaaagagcac 1440
cagaaagaat tggcagctca actaaatgaa aaagcaaaag agcgtttggc aaaacaatct 1500
ggatctaaag ataaagagaa agtgagaaaa aatactgtgt catacaaaag tgtcaatcaa 1560
atgcctagag ttcccgaggt aaaagaacta aaattatatg tggaccagaa gtatgaaact 1620
gttattttac ctatttatgg aattgcggta cctttccata tttctacaat caaaaatatt 1680
tctcaatcta ttgagggaga ctacacctat ttgcgtatta actttttcca tcccggtaca 1740
actatgggca gaaatgaagg taatgtctgg tctcagcctg aagcaacttt ccttaaagaa 1800
ttaacatata ggagtaccaa tacaaaagaa ccaggagtag taactgctcc ctcgtctaac 1860
cttaatacag cctttcgtct aattaaagaa gttcaaagga aatttaagac acgagaagct 1920
gaagaaaaag aaaaagagga tttggttaaa caggacacat tagtactttc acagaataaa 1980
ggaaatccta aattaaaaga tctgtatatt aggccaaata ttgtttcaaa acgtatgaca 2040
ggatcattag aagctcacac taatggtttt aggtatactt ctgtgagggg tgataaagta 2100
gacattcttt acaacaacat caagaatgcc ttctttcaac cgtgtgatgg agaaatgata 2160
attctgttac attttcacct aaaacatgct atcatgttcg gaaaaaagaa acatgttgac 2220
gttcaattct atacggaagt cggagaaatt accacagatt tgggcaaaca tcaacacatg 2280
cacgatcgag atgatctggc tgctgagcag tcggaaagag agctcagaca aaaattgaaa 2340
actgcattca aaagtttttg tgaaaaggtt gaatctatga caaaacaaga aattgaattt 2400
gatacaccat tccgggagtt gggatttcca ggagccccct tccgctctac agtccttctc 2460
cagcctacat ctggttgttt ggttaacctg actgaatggc ctccatttgt tgtcacccta 2520
gaagatgtag agttagtaca ttttgaacgt gtacaattcc acctgaagaa cttcgatatg 2580
gtgtttgttt ttaaggagta tcttaaaaag actgtcatgg taaatgctat accaatgaat 2640
atgctggatc atgtaaaaga atggttaaat tcttgtgaca ttagatattc tgaaggagtt 2700
cagtctctta attgggtcaa aattatgaaa accattacag atgatccaga aggtttcttt 2760
gacagtggtg gttggacttt ccttgaccca gaatctgacg aagaacaagc taaagaagaa 2820
gaatcagaag aagaagatga agcgtatcaa ccgtctgatt tagaagaagt aggatctgat 2880
tggagcgaag aagactctga atattcggaa ggtgatactg aagatgatga cgatgatgaa 2940
gatgcttctg aagatctagg atctgacgaa gaatcgggaa aagactggtc tgatcttgaa 3000
cgtgaagcgg aagaagagga tagagaaaaa gtttatactg ctgaagacga aggtgacaga 3060
agaaataaac atcgcagcaa gggtcatgat aaattttcat ccaaaggtgg caaatcatca 3120
aaagataaaa gcagacatag cagtagcagt cataagagcc ctagcaaaca taactcctct 3180
tcaagcagta gtaaacattc accttcaaaa gataaggacc gaaacagcag ttcaaaaagt 3240
agggacaaag atagacactc atcatcgaac cataaatctt ctagccactc atcctcatct 3300
agagataagg acaaggacag aaaaaagagc tcgtcttctc acaaaagcag cagttctggc 3360
gataaaaaga gacaaagaag tcccagcggt gacaaacacc actcgaagaa atctagaaag 3420
tga 3423
<210> 2
<211> 175
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 2
taacagtttc atacttctgg tccacatata attttagttc ttttacctcg ggaactctag 60
gcatttgatt gacacttttg tatgacacag tattttttct cactttctct ttatctttag 120
atccagattg ttttgccaaa cgctcttttg ctttttcatt tagttgagct gccaa 175
<210> 3
<211> 127
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 3
ttttagttct tttacctcgg gaactctagg catttgattg acacttttgt atgacacagt 60
attttttctc actttctctt tatctttaga tccagattgt tttgccaaac gctcttttgc 120
tttttca 127
<210> 4
<211> 459
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 4
cttcatttct gcccatagtt gtaccgggat ggaaaaagtt aatacgcaaa taggtgtagt 60
ctccctcaat agattgagaa atatttttga ttgtagaaat atggaaaggt accgcaattc 120
cataaatagg taaaataaca gtttcatact tctggtccac atataatttt agttctttta 180
cctcgggaac tctaggcatt tgattgacac ttttgtatga cacagtattt tttctcactt 240
tctctttatc tttagatcca gattgttttg ccaaacgctc ttttgctttt tcatttagtt 300
gagctgccaa ttctttctgg tgctcttttc ttttttcttc ggtgctgtgt tcagtacgca 360
gttttgattc aataacagca gttcttttac cccttcccaa aatttcggtc tttttcggag 420
tgttttcttt ttcctcatca ttttcttctg cgtcagaat 459
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Promotor oligonucleotide
<400> 5
ttaatacgac tcactatagg gaga 24
<210> 6
<211> 503
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial coding region
<400> 6
caccatgggc tccagcggcg ccctgctgtt ccacggcaag atcccctacg tggtggagat 60
ggagggcaat gtggatggcc acaccttcag catccgcggc aagggctacg gcgatgccag 120
cgtgggcaag gtggatgccc agttcatctg caccaccggc gatgtgcccg tgccctggag 180
caccctggtg accaccctga cctacggcgc ccagtgcttc gccaagtacg gccccgagct 240
gaaggatttc tacaagagct gcatgcccga tggctacgtg caggagcgca ccatcacctt 300
cgagggcgat ggcaatttca agacccgcgc cgaggtgacc ttcgagaatg gcagcgtgta 360
caatcgcgtg aagctgaatg gccagggctt caagaaggat ggccacgtgc tgggcaagaa 420
tctggagttc aatttcaccc cccactgcct gtacatctgg ggcgatcagg ccaatcacgg 480
cctgaagagc gccttcaaga tct 503
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 7
ttaatacgac tcactatagg gagataacag tttcatactt ctggtccac 49
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 8
ttaatacgac tcactatagg gagattggca gctcaactaa atgaaaaag 49
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 9
ttaatacgac tcactatagg gagattttag ttcttttacc tcgggaactc 50
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 10
ttaatacgac tcactatagg gagatgaaaa agcaaaagag cgtttgg 47
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 11
ttaatacgac tcactatagg gagacttcat ttctgcccat agttgtac 48
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 12
ttaatacgac tcactatagg gagaattctg acgcagaaga aaatgatg 48
<210> 13
<211> 615
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 13
taacagtttc atacttctgg tccacatata attttagttc ttttacctcg ggaactctag 60
gcatttgatt gacacttttg tatgacacag tattttttct cactttctct ttatctttag 120
atccagattg ttttgccaaa cgctcttttg ctttttcatt tagttgagct gccaagaatc 180
cttgcgtcat ttggtgacta gtaccggttg ggaaaggtat gtttctgctt ctacctttga 240
tatatatata ataattatca ctaattagta gtaatatagt atttcaagta tttttttcaa 300
aataaaagaa tgtagtatat agctattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta 360
atttataact tttctaatat atgaccaaaa catggtgatg tgcaggttga tccgcggtta 420
agttgtgcgt gagtccattg ttggcagctc aactaaatga aaaagcaaaa gagcgtttgg 480
caaaacaatc tggatctaaa gataaagaga aagtgagaaa aaatactgtg tcatacaaaa 540
gtgtcaatca aatgcctaga gttcccgagg taaaagaact aaaattatat gtggaccaga 600
agtatgaaac tgtta 615
<210> 14
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 14
ttttagttct tttacctcgg gaactctagg catttgattg acacttttgt atgacacagt 60
attttttctc actttctctt tatctttaga tccagattgt tttgccaaac gctcttttgc 120
tttttcagaa tccttgcgtc atttggtgac tagtaccggt tgggaaaggt atgtttctgc 180
ttctaccttt gatatatata taataattat cactaattag tagtaatata gtatttcaag 240
tatttttttc aaaataaaag aatgtagtat atagctattg cttttctgta gtttataagt 300
gtgtatattt taatttataa cttttctaat atatgaccaa aacatggtga tgtgcaggtt 360
gatccgcggt taagttgtgc gtgagtccat tgtgaaaaag caaaagagcg tttggcaaaa 420
caatctggat ctaaagataa agagaaagtg agaaaaaata ctgtgtcata caaaagtgtc 480
aatcaaatgc ctagagttcc cgaggtaaaa gaactaaaa 519
<210> 15
<211> 471
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 15
atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga gatggaaggg 60
aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc ctcagtggga 120
aaggactagt accggttggg aaaggtatgt ttctgcttct acctttgata tatatataat 180
aattatcact aattagtagt aatatagtat ttcaagtatt tttttcaaaa taaaagaatg 240
tagtatatag ctattgcttt tctgtagttt ataagtgtgt atattttaat ttataacttt 300
tctaatatat gaccaaaaca tggtgatgtg caggttgatc cgcggttact ttcccactga 360
ggcatctccg tagcctttcc cacgtatgct aaaggtgtgg ccatcaacat tcccttccat 420
ctccacaacg taaggaatct tcccatgaaa gagaagtgct ccagatgaca t 471
<210> 16
<211> 225
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 16
gactagtacc ggttgggaaa ggtatgtttc tgcttctacc tttgatatat atataataat 60
tatcactaat tagtagtaat atagtatttc aagtattttt ttcaaaataa aagaatgtag 120
tatatagcta ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta taacttttct 180
aatatatgac caaaacatgg tgatgtgcag gttgatccgc ggtta 225
<210> 17
<211> 705
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 17
atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga gatggaaggg 60
aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc ctcagtggga 120
aaggttgatg cacagttcat ctgcacaact ggtgatgttc ctgtgccttg gagcacactt 180
gtcaccactc tcacctatgg agcacagtgc tttgccaagt atggtccaga gttgaaggac 240
ttctacaagt cctgtatgcc agatggctat gtgcaagagc gcacaatcac ctttgaagga 300
gatggcaact tcaagactag ggctgaagtc acctttgaga atgggtctgt ctacaatagg 360
gtcaaactca atggtcaagg cttcaagaaa gatggtcatg tgttgggaaa gaacttggag 420
ttcaacttca ctccccactg cctctacatc tggggtgacc aagccaacca cggtctcaag 480
tcagccttca agatctgtca tgagattact ggcagcaaag gcgacttcat agtggctgac 540
cacacccaga tgaacactcc cattggtgga ggtccagttc atgttccaga gtatcatcac 600
atgtcttacc atgtgaaact ttccaaagat gtgacagacc acagagacaa catgtccttg 660
aaagaaactg tcagagctgt tgactgtcgc aagacctacc tttga 705
<210> 18
<211> 218
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 18
tagctctgat gacagagccc atcgagtttc aagccaaaca gttgcataaa gctatcagcg 60
gattgggaac tgatgaaagt acaatmgtmg aaattttaag tgtmcacaac aacgatgaga 120
ttataagaat ttcccaggcc tatgaaggat tgtaccaacg mtcattggaa tctgatatca 180
aaggagatac ctcaggaaca ttaaaaaaga attattag 218
<210> 19
<211> 424
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> misc_feature
<222> (393)..(393)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (394)..(394)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (395)..(395)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 19
ttgttacaag ctggagaact tctctttgct ggaaccgaag agtcagtatt taatgctgta 60
ttctgtcaaa gaaataaacc acaattgaat ttgatattcg acaaatatga agaaattgtt 120
gggcatccca ttgaaaaagc cattgaaaac gagttttcag gaaatgctaa acaagccatg 180
ttacacctta tccagagcgt aagagatcaa gttgcatatt tggtaaccag gctgcatgat 240
tcaatggcag gcgtcggtac tgacgataga actttaatca gaattgttgt ttcgagatct 300
gaaatcgatc tagaggaaat caaacaatgc tatgaagaaa tctacagtaa aaccttggct 360
gataggatag cggatgacac atctggcgac tannnaaaag ccttattagc cgttgttggt 420
taag 424
<210> 20
<211> 397
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 20
agatgttggc tgcatctaga gaattacaca agttcttcca tgattgcaag gatgtactga 60
gcagaatagt ggaaaaacag gtatccatgt ctgatgaatt gggaagggac gcaggagctg 120
tcaatgccct tcaacgcaaa caccagaact tcctccaaga cctacaaaca ctccaatcga 180
acgtccaaca aatccaagaa gaatcagcta aacttcaagc tagctatgcc ggtgatagag 240
ctaaagaaat caccaacagg gagcaggaag tggtagcagc ctgggcagcc ttgcagatcg 300
cttgcgatca gagacacgga aaattgagcg atactggtga tctattcaaa ttctttaact 360
tggtacgaac gttgatgcag tggatggacg aatggac 397
<210> 21
<211> 490
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 21
gcagatgaac accagcgaga aaccaagaga tgttagtggt gttgaattgt tgatgaacaa 60
ccatcagaca ctcaaggctg agatcgaagc cagagaagac aactttacgg cttgtatttc 120
tttaggaaag gaattgttga gccgtaatca ctatgctagt gctgatatta aggataaatt 180
ggtcgcgttg acgaatcaaa ggaatgctgt actacagagg tgggaagaaa gatgggagaa 240
cttgcaactc atcctcgagg tataccaatt cgccagagat gcggccgtcg ccgaagcatg 300
gttgatcgca caagaacctt acttgatgag ccaagaacta ggacacacca ttgacgacgt 360
tgaaaacttg ataaagaaac acgaagcgtt cgaaaaatcg gcagcggcgc aagaagagag 420
attcagtgct ttggagagac tgacgacgtt cgaattgaga gaaataaaga ggaaacaaga 480
agctgcccag 490
<210> 22
<211> 330
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 22
agtgaaatgt tagcaaatat aacatccaag tttcgtaatt gtacttgctc agttagaaaa 60
tattctgtag tttcactatc ttcaaccgaa aatagaataa atgtagaacc tcgcgaactt 120
gcctttcctc caaaatatca agaacctcga caagtttggt tggagagttt agatacgata 180
gacgacaaaa aattgggtat tcttgagctg catcctgatg tttttgctac taatccaaga 240
atagatatta tacatcaaaa tgttagatgg caaagtttat atagatatgt aagctatgct 300
catacaaagt caagatttga agtgagaggt 330
<210> 23
<211> 320
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 23
caaagtcaag atttgaagtg agaggtggag gtcgaaaacc gtggccgcaa aagggattgg 60
gacgtgctcg acatggttca attagaagtc cactttggag aggtggagga gttgttcatg 120
gaccaaaatc tccaacccct catttttaca tgattccatt ctacacccgt ttgctgggtt 180
tgactagcgc actttcagta aaatttgccc aagatgactt gcacgttgtg gatagtctag 240
atctgccaac tgacgaacaa agttatatag aagagctggt caaaagccgc ttttgggggt 300
ccttcttgtt ttatttgtag 320
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 24
ttaatacgac tcactatagg gagacaccat gggctccagc ggcgccc 47
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 25
agatcttgaa ggcgctcttc agg 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 26
caccatgggc tccagcggcg ccc 23
<210> 27
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 27
ttaatacgac tcactatagg gagaagatct tgaaggcgct cttcagg 47
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 28
ttaatacgac tcactatagg gagagctcca acagtggttc cttatc 46
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 29
ctaataattc ttttttaatg ttcctgagg 29
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 30
gctccaacag tggttcctta tc 22
<210> 31
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 31
ttaatacgac tcactatagg gagactaata attctttttt aatgttcctg agg 53
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 32
ttaatacgac tcactatagg gagattgtta caagctggag aacttctc 48
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 33
cttaaccaac aacggctaat aagg 24
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 34
ttgttacaag ctggagaact tctc 24
<210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 35
ttaatacgac tcactatagg gagacttaac caacaacggc taataagg 48
<210> 36
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 36
ttaatacgac tcactatagg gagaagatgt tggctgcatc tagagaa 47
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 37
gtccattcgt ccatccactg ca 22
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 38
agatgttggc tgcatctaga gaa 23
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 39
ttaatacgac tcactatagg gagagtccat tcgtccatcc actgca 46
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 40
ttaatacgac tcactatagg gagagcagat gaacaccagc gagaaa 46
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 41
ctgggcagct tcttgtttcc tc 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 42
gcagatgaac accagcgaga aa 22
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 43
ttaatacgac tcactatagg gagactgggc agcttcttgt ttcctc 46
<210> 44
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 44
ttaatacgac tcactatagg gagaagtgaa atgttagcaa atataacatc c 51
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 45
acctctcact tcaaatcttg actttg 26
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 46
agtgaaatgt tagcaaatat aacatcc 27
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 47
ttaatacgac tcactatagg gagaacctct cacttcaaat cttgactttg 50
<210> 48
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 48
ttaatacgac tcactatagg gagacaaagt caagatttga agtgagaggt 50
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 49
ctacaaataa aacaagaagg acccc 25
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 50
caaagtcaag atttgaagtg agaggt 26
<210> 51
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 51
ttaatacgac tcactatagg gagactacaa ataaaacaag aaggacccc 49
<210> 52
<211> 1150
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 52
caacggggca gcactgcact gcactgcaac tgcgaatttc cgtcagcttg gagcggtcca 60
agcgccctgc gaagcaaact acgccgatgg cttcggcggc ggcgtgggag ggtccgacgg 120
ccgcggagct gaagacagcg ggggcggagg tgattcccgg cggcgtgcga gtgaaggggt 180
gggtcatcca gtcccacaaa ggccctatcc tcaacgccgc ctctctgcaa cgctttgaag 240
atgaacttca aacaacacat ttacctgaga tggtttttgg agagagtttc ttgtcacttc 300
aacatacaca aactggcatc aaatttcatt ttaatgcgct tgatgcactc aaggcatgga 360
agaaagaggc actgccacct gttgaggttc ctgctgcagc aaaatggaag ttcagaagta 420
agccttctga ccaggttata cttgactacg actatacatt tacgacacca tattgtggga 480
gtgatgctgt ggttgtgaac tctggcactc cacaaacaag tttagatgga tgcggcactt 540
tgtgttggga ggatactaat gatcggattg acattgttgc cctttcagca aaagaaccca 600
ttcttttcta cgacgaggtt atcttgtatg aagatgagtt agctgacaat ggtatctcat 660
ttcttactgt gcgagtgagg gtaatgccaa ctggttggtt tctgcttttg cgtttttggc 720
ttagagttga tggtgtactg atgaggttga gagacactcg gttacattgc ctgtttggaa 780
acggcgacgg agccaagcca gtggtacttc gtgagtgctg ctggagggaa gcaacatttg 840
ctactttgtc tgcgaaagga tatccttcgg actctgcagc gtacgcggac ccgaacctta 900
ttgcccataa gcttcctatt gtgacgcaga agacccaaaa gctgaaaaat cctacctgac 960
tgacacaaag gcgccctacc gcgtgtacat catgactgtc ctgtcctatc gttgcctttt 1020
gtgtttgcca catgttgtgg atgtacgttt ctatgacgaa acaccatagt ccatttcgcc 1080
tgggccgaac agagatagct gattgtcatg tcacgtttga attagaccat tccttagccc 1140
tttttccccc 1150
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 53
tttttttttt tttttttttt vn 22
<210> 54
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 54
gggtgacggg agagatt 17
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 55
cataacacac aactttgatg cc 22
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 56
tgagggtaat gccaactggt t 21
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 57
gcaatgtaac cgagtgtctc tcaa 24
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 58
tttttggctt agagttgatg gtgtactgat ga 32
<210> 59
<211> 151
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 59
gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 60
ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 120
cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa g 151
<210> 60
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial coding region
<400> 60
tgttcggttc cctctaccaa gcacagaacc gtcgcttcag caacacctca gtcaaggtga 60
tggatgttg 69
<210> 61
<211> 4233
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 61
agcctggtgt ttccggagga gacagacatg atccctgccg ttgctgatcc gacgacgctg 60
gacggcgggg gcgcgcgcag gccgttgctc ccggagacgg accctcgggg gcgtgctgcc 120
gccggcgccg agcagaagcg gccgccggct acgccgaccg ttctcaccgc cgtcgtctcc 180
gccgtgctcc tgctcgtcct cgtggcggtc acagtcctcg cgtcgcagca cgtcgacggg 240
caggctgggg gcgttcccgc gggcgaagat gccgtcgtcg tcgaggtggc cgcctcccgt 300
ggcgtggctg agggcgtgtc ggagaagtcc acggccccgc tcctcggctc cggcgcgctc 360
caggacttct cctggaccaa cgcgatgctg gcgtggcagc gcacggcgtt ccacttccag 420
ccccccaaga actggatgaa cggttagttg gacccgtcgc catcggtgac gacgcgcgga 480
tcgttttttt cttttttcct ctcgttctgg ctctaacttg gttccgcgtt tctgtcacgg 540
acgcctcgtg cacatggcga tacccgatcc gccggccgcg tatatctatc tacctcgacc 600
ggcttctcca gatccgaacg gtaagttgtt ggctccgata cgatcgatca catgtgagct 660
cggcatgctg cttttctgcg cgtgcatgcg gctcctagca ttccacgtcc acgggtcgtg 720
acatcaatgc acgatataat cgtatcggta cagagatatt gtcccatcag ctgctagctt 780
tcgcgtattg atgtcgtgac attttgcacg caggtccgct gtatcacaag ggctggtacc 840
acctcttcta ccagtggaac ccggactccg cggtatgggg caacatcacc tggggccacg 900
ccgtctcgcg cgacctcctc cactggctgc acctaccgct ggccatggtg cccgatcacc 960
cgtacgacgc caacggcgtc tggtccgggt cggcgacgcg cctgcccgac ggccggatcg 1020
tcatgctcta cacgggctcc acggcggagt cgtcggcgca ggtgcagaac ctcgcggagc 1080
cggccgacgc gtccgacccg ctgctgcggg agtgggtcaa gtcggacgcc aacccggtgc 1140
tggtgccgcc gccgggcatc gggccgacgg acttccgcga cccgacgacg gcgtgtcgga 1200
cgccggccgg caacgacacg gcgtggcggg tcgccatcgg gtccaaggac cgggaccacg 1260
cggggctggc gctggtgtac cggacggagg acttcgtgcg gtacgacccg gcgccggcgc 1320
tgatgcacgc cgtgccgggc accggcatgt gggagtgcgt ggacttctac ccggtggccg 1380
cgggatcagg cgccgcggcg ggcagcgggg acgggctgga gacgtccgcg gcgccgggac 1440
ccggggtgaa gcacgtgctc aaggctagcc tcgacgacga caagcacgac tactacgcga 1500
tcggcaccta cgacccggcg acggacacct ggacccccga cagcgcggag gacgacgtcg 1560
ggatcggcct ccggtacgac tatggcaagt actacgcgtc gaagaccttc tacgaccccg 1620
tccttcgccg gcgggtgctc tgggggtggg tcggcgagac cgacagcgag cgcgcggaca 1680
tcctcaaggg ctgggcatcc gtgcaggtac gtctcagggt ttgaggctag catggcttca 1740
atcttgctgg catcgaatca ttaatgggca gatattataa cttgataatc tgggttggtt 1800
gtgtgtggtg gggatggtga cacacgcgcg gtaataatgt agctaagctg gttaaggatg 1860
agtaatgggg ttgcgtataa acgacagctc tgctaccatt acttctgaca cccgattgaa 1920
ggagacaaca gtaggggtag ccggtagggt tcgtcgactt gccttttctt ttttcctttg 1980
ttttgttgtg gatcgtccaa cacaaggaaa ataggatcat ccaacaaaca tggaagtaat 2040
cccgtaaaac atttctcaag gaaccatcta gctagacgag cgtggcatga tccatgcatg 2100
cacaaacact agataggtct ctgcagctgt gatgttcctt tacatatacc accgtccaaa 2160
ctgaatccgg tctgaaaatt gttcaagcag agaggccccg atcctcacac ctgtacacgt 2220
ccctgtacgc gccgtcgtgg tctcccgtga tcctgccccg tcccctccac gcggccacgc 2280
ctgctgcagc gctctgtaca agcgtgcacc acgtgagaat ttccgtctac tcgagcctag 2340
tagttagacg ggaaaacgag aggaagcgca cggtccaagc acaacacttt gcgcgggccc 2400
gtgacttgtc tccggttggc tgagggcgcg cgacagagat gtatggcgcc gcggcgtgtc 2460
ttgtgtcttg tcttgcctat acaccgtagt cagagactgt gtcaaagccg tccaacgaca 2520
atgagctagg aaacgggttg gagagctggg ttcttgcctt gcctcctgtg atgtctttgc 2580
cttgcatagg gggcgcagta tgtagctttg cgttttactt cacgccaaag gatactgctg 2640
atcgtgaatt attattatta tatatatatc gaatatcgat ttcgtcgctc tcgtggggtt 2700
ttattttcca gactcaaact tttcaaaagg cctgtgtttt agttcttttc ttccaattga 2760
gtaggcaagg cgtgtgagtg tgaccaacgc atgcatggat atcgtggtag actggtagag 2820
ctgtcgttac cagcgcgatg cttgtatatg tttgcagtat tttcaaatga atgtctcagc 2880
tagcgtacag ttgaccaagt cgacgtggag ggcgcacaac agacctctga cattattcac 2940
ttttttttta ccatgccgtg cacgtgcagt caatccccag gacggtcctc ctggacacga 3000
agacgggcag caacctgctc cagtggccgg tggtggaggt ggagaacctc cggatgagcg 3060
gcaagagctt cgacggcgtc gcgctggacc gcggatccgt cgtgcccctc gacgtcggca 3120
aggcgacgca ggtgacgccg cacgcagcct gctgcagcga acgaactcgc gcgttgccgg 3180
cccgcggcca gctgacttag tttctctggc tgatcgaccg tgtgcctgcg tgcgtgcagt 3240
tggacatcga ggctgtgttc gaggtggacg cgtcggacgc ggcgggcgtc acggaggccg 3300
acgtgacgtt caactgcagc accagcgcag gcgcggcggg ccggggcctg ctcggcccgt 3360
tcggccttct cgtgctggcg gacgacgact tgtccgagca gaccgccgtg tacttctacc 3420
tgctcaaggg cacggacggc agcctccaaa ctttcttctg ccaagacgag ctcaggtatg 3480
tatgttatga cttatgacca tgcatgcatg cgcatttctt agctaggctg tgaagcttct 3540
tgttgagttg tttcacagat gcttaccgtc tgctttgttt cgtatttcga ctaggcatcc 3600
aaggcgaacg atctggttaa gagagtatac gggagcttgg tccctgtgct agatggggag 3660
aatctctcgg tcagaatact ggtaagtttt tacagcgcca gccatgcatg tgttggccag 3720
ccagctgctg gtactttgga cactcgttct tctcgcactg ctcattattg cttctgatct 3780
ggatgcacta caaattgaag gttgaccact ccatcgtgga gagctttgct caaggcggga 3840
ggacgtgcat cacgtcgcga gtgtacccca cacgagccat ctacgactcc gcccgcgtct 3900
tcctcttcaa caacgccaca catgctcacg tcaaagcaaa atccgtcaag atctggcagc 3960
tcaactccgc ctacatccgg ccatatccgg caacgacgac ttctctatga ctaaattaag 4020
tgacggacag ataggcgata ttgcatactt gcatcatgaa ctcatttgta caacagtgat 4080
tgtttaattt atttgctgcc ttccttatcc ttcttgtgaa actatatggt acacacatgt 4140
atcattaggt ctagtagtgt tgttgcaaag acacttagac accagaggtt ccaggagtat 4200
cagagataag gtataagagg gagcagggag cag 4233
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 62
tgttcggttc cctctaccaa 20
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 63
caacatccat caccttgact ga 22
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 64
cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 65
tggcggacga cgacttgt 18
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 66
aaagtttgga ggctgccgt 19
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 67
cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 68
cttagctgga taacgccac 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 69
gaccgtaagg cttgatgaa 19
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 70
cgagattctc cgcgctgtag a 21
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 71
gtatgtttct gcttctacct ttgat 25
<210> 72
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oligonucleotide
<400> 72
ccatgttttg gtcatatatt agaaaagtt 29
<210> 73
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 73
agtaatatag tatttcaagt atttttttca aaat 34
<210> 74
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 74
aagtctaggt tgtttaaagg ttaccgagc 29
Claims (56)
- 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 단리된 폴리뉴클레오티드이며, 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카(Diabrotica) 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 2의 상보체; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 3의 상보체; 서열식별번호: 4; 서열식별번호: 4의 상보체; 서열식별번호: 13; 서열식별번호: 13의 상보체; 서열식별번호: 14; 및 서열식별번호: 14의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)이 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터.
- 제1항에 있어서, 디아브로티카 유기체가 디. 브이. 비르기페라 르콩트(D. v. virgifera LeConte); 디. 바르베리 스미스 및 로렌스(D. barberi Smith and Lawrence); 디. 유. 호와르디(D. u. howardi); 디. 브이. 제아에(D. v. zeae); 디. 발테아타 르콩트(D. balteata LeConte); 디. 유. 테넬라(D. u. tenella); 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임(D. u. undecimpunctata Mannerheim)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 리보핵산 (RNA) 분자인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 데옥시리보핵산 (DNA) 분자인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제8항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry3, Cry34 및 Cry35를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제7항의 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생산된 이중-가닥 리보핵산 분자.
- 제10항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열을 딱정벌레류 해충과 접촉시키는 것이 제1항의 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 상보적인 내인성 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제하는 것인 이중-가닥 리보핵산 분자.
- 제11항에 있어서, 상기 리보뉴클레오티드 분자를 딱정벌레류 해충과 접촉시키는 것이 딱정벌레류 해충을 사멸시키거나 그의 성장, 생식 및/또는 섭식을 억제하는 것인 이중-가닥 리보핵산 분자.
- 제10항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중-가닥 리보핵산 분자이며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제3 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 제1 폴리뉴클레오티드 서열에 연결되고, 제3 폴리뉴클레오티드 서열은 실질적으로 제1 폴리뉴클레오티드 서열의 역 상보체이며, 이에 따라 제1 및 제3 폴리뉴클레오티드 서열은 리보핵산으로 전사될 때 혼성화되어 이중-가닥 리보뉴클레오티드 분자를 형성하는 것인 이중-가닥 리보핵산 분자.
- 제6항에 있어서, 약 19 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 리보핵산 분자 및 단일-가닥 리보핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
- 제7항의 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생산된 리보핵산 분자이며, 약 19 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 리보핵산 분자 및 단일-가닥 리보핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 리보핵산 분자.
- 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)은 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 식물 형질전환 벡터.
- 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포.
- 제17항에 있어서, 원핵 세포인 세포.
- 제17항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
- 제19항에 있어서, 식물 세포인 세포.
- 제17항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
- 제21항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry3, Cry34 및 Cry35를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 세포.
- 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물.
- 제23항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물.
- 제24항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry3, Cry34 및 Cry35를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 식물.
- 제23항의 식물의 종자이며, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 종자.
- 제23항에 있어서, 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)이 식물에서 이중-가닥 리보핵산 분자로서 발현되는 것인 식물.
- 제20항에 있어서, 제아 메이스(Zea mays) 세포인 세포.
- 제23항에 있어서, 제아 메이스인 식물.
- 제23항에 있어서, 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)이 식물에서 리보핵산 분자로서 발현되고, 딱정벌레류 해충이 식물의 일부를 섭취하는 경우에, 리보핵산 분자가 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)에 특이적으로 상보적인 내인성 딱정벌레류 해충 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제하는 것인 식물.
- 제1항에 있어서, 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 2의 상보체; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 3의 상보체; 서열식별번호: 4; 서열식별번호: 4의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 초과의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제31항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 각각 작동가능하게 연결되어 있는 것인 식물 형질전환 벡터.
- 제31항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포.
- 제31항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물.
- 제34항에 있어서, 1종 초과의 뉴클레오티드 서열이 식물 세포에서 이중-가닥 리보핵산 분자로서 발현되는 것인 식물.
- 제33항에 있어서, 제아 메이스 세포인 세포.
- 제35항에 있어서, 제아 메이스인 식물.
- 제30항에 있어서, 딱정벌레류 해충이 디아브로티카 종인 식물.
- 제31항에 있어서, 딱정벌레류 해충이 디. 비르기페라 비르기페라 르콩트(D. virgifera virgifera LeConte), 디. 바르베리 스미스 및 로렌스(D. barberi Smith and Lawrence), 디. 비르기페라 제아에 크리산 및 스미스(D. virgifera zeae Krysan and Smith), 디. 운데심푼크타타 호와르디 바버(D. undecimpunctata howardi Barber), 디. 발테아타 르콩트(D. balteata LeConte), 디. 운데심푼크타타 테넬라(D. undecimpunctata tenella) 및 디. 운데심푼크타타 운데심푼크타타 만네르헤임(D. undecimpunctata undecimpunctata Mannerheim)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 식물.
- 제23항에 따른 식물로부터 생산된 범용 제품이며, 검출가능한 양의 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 범용 제품.
- 딱정벌레류 해충과의 접촉 시에 딱정벌레류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 이중-가닥 리보핵산 분자를 포함하는 작용제를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 작용제는 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법.
- 딱정벌레류 해충과의 접촉 시에 딱정벌레류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 작용제를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1의 약 19 내지 약 30개의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 90% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타내는 영역을 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화되는 것인, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법.
- 제42항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 공포 ATPase의 C 서브유닛; 공포 ATPase의 H 서브유닛; 및 Rho1 소형 GTP-결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 딱정벌레류 해충 유전자의 약 19 내지 약 30개의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 90% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타내는 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 딱정벌레류 해충의 숙주 식물에 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 발현되어, 딱정벌레류 해충 집단에 속하는 딱정벌레류 해충과의 접촉 시에 딱정벌레류 해충 내의 표적 서열의 발현을 억제하도록 기능하는 리보핵산 분자를 생산하고, 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 종의 숙주 식물 상에서의 성장에 비해, 딱정벌레류 해충 또는 딱정벌레류 해충 집단의 성장을 감소시키는 것인, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법.
- 제44항에 있어서, 리보핵산 분자가 이중-가닥 리보핵산 분자인 방법.
- 제44항에 있어서, 딱정벌레류 해충 집단이 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 종의 숙주 식물에 침입하는 딱정벌레류 해충 집단에 비해 감소되는 것인 방법.
- 제1항의 폴리뉴클레오티드를 딱정벌레류 해충의 먹이에 제공하는 단계를 포함하는, 식물에서 식물 딱정벌레류 해충 침입을 방제하는 방법.
- 제47항에 있어서, 먹이가 제1항의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 형질전환된 식물 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제3항의 폴리뉴클레오티드를 옥수수 식물 내로 도입하여 트랜스제닉 옥수수 식물을 생산하는 단계; 및
옥수수 식물을 재배하여 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)이 발현되도록 하는 단계
를 포함하며, 여기서 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)의 발현은 딱정벌레류 해충 감염 또는 성장 및 딱정벌레류 해충 감염으로 인한 수확량 손실을 억제하는 것인,
옥수수 작물의 수확량을 개선하는 방법. - 제49항에 있어서, 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)의 발현으로 옥수수 식물의 일부분과 접촉한 딱정벌레류 해충에서의 적어도 제1 표적 유전자를 억제하는 RNA 분자가 생산되는 것인 방법.
- 식물 프로모터 및 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
복수개의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물이 발생하도록 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계;
적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)이 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계;
형질전환된 식물 세포를 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 코딩되는 리보핵산 분자의 발현에 대해 스크리닝하는 단계; 및
dsRNA를 발현하는 식물 세포를 선택하는 단계
를 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법. - 제51항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계; 및
트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 단계
를 포함하며, 여기서 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 코딩되는 리보핵산 분자의 발현은 형질전환된 식물과 접촉하는 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 조절하는데 충분한 것인,
딱정벌레류 해충-저항성 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법. - 제51항에 있어서, 형질전환된 식물 세포가 바실루스 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제53항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry3, Cry34 및 Cry35를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 딱정벌레류 해충에서의 필수 dre4 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 포함하는 작용제를 딱정벌레류 해충 집단에게 제공하는 단계를 포함하는, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법.
- 제55항에 있어서, 작용제를 제공하는 단계가 식물에 딱정벌레류 dre4 해충 저항성을 제공하기 위한 수단을 딱정벌레류 해충 침입에 감수성인 식물 내로 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
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