JPH02312594A - 発酵法による５’―イノシン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、発酵法による５′−イノシン酸の製造法に関
する。５′−イノシン酸は調味料などとして広く用いら
れ、食品工業分野で有用な物質である。

従来の技術 従来、５′−イノシン酸を発酵生産する方法としては、
コリネバクテリウム属に属する微生物を０．１〜０．０
１％のし一プロリンを含む培地で培養する方法〔アプラ
イド　ミクロバイオロジー（ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ）　１６　９８１〜９８７（１９６８）
　：ｌ　、糖類より直接５′−イノシン酸を発酵生産す
る方法としてコリネバクテリウム属に属し、アデニン要
求性を有し、発酵培地の加圧蒸煮殺菌の影響を受けない
菌株を取得、培養し培地中に５′−イノシン酸を生成蓄
積させる方法（特公昭５８−４６３１９）、コリネバク
テリウム属に属し、アデニン要求性を有し、アデニン又
はリファンピシンに耐性を有する変異株を培養し、培地
中に５′−イノシン酸を生成蓄積させる方法（特開昭５
６−１６０９９９）などが知られている。

また、５′−イノシン酸生産能を有する微生物を０．２
〜５．０％のＬ−プロリンおよび／またはその類縁化合
物を含む培地で培養する方法が本出願人により開示され
ている。（特願平１−５５８３５）なお、本明細書中で
は従来ブレビバクテリウムし ・アンモニアゲネス−命名されている菌株をコ△ （′− リネバクテリウム・アンモニアゲネス変更して記△ 載する。本菌株種名の変更はインターナショナル・ジャ
ーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ＳｉｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　　
４４２〜４４３．１０月、１９８７年）に基づくものと
する。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、調味料として広く用いられている５′
−イノシン酸を直接発酵法により工業的に安価に効率よ
く製造する方法を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明によれば、コリネバクテリウム属に属し、Ｌ−プ
ロリン拮抗物質、たとえば３．４−デヒドロ−Ｄ、　　
Ｌ−プロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸および
Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸などに耐性を有し、
かつ５′−イノシン酸生産能を有する微生物を培地に培
養することにより、培養物中に５′−イノシン酸を生成
蓄積させ、該培養物から５′−イノシン酸を採取するこ
とができる。

以下に本発明の詳細な説明する。

用いられる微生物としては、コリネバクテリウム属に属
し、Ｌ−プロリン拮抗物質に耐性を有し、かつ５′−イ
ノシン酸生産能を有する微生物であればいずれでもよい
。Ｌ−プロリン拮抗物質に耐性を有する微生物とは、親
株が生育阻害を示す濃度のし一プロリン拮抗物質を含む
培地でも生育することのできる変異株のことをいう。

本発明においてＬ−プロリン拮抗物質とは、最少培地寒
天平板中にＬ−プロリン拮抗物質を添加しコリネバクテ
リウム属に属する５′−イノシン酸生産菌を培養したと
き、該生産菌の生育を阻害するが、この阻害がＬ−プロ
リンが存在することにより解除されるような化合物をい
う。Ｌ−プロリン拮抗物質としては、たとえば３．４−
デヒドロ−Ｄ、Ｌ−プロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カ
ルボン酸、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸などがあ
げられる。培地に添加されるＬ−プロリン拮抗物質の量
としては、１〜１５ｇ／βが適当である。

上記したような変異株は、コリネバクテリウム属に属す
る５′−イノシン酸生産菌にＬ−プロリン拮抗物質耐性
を付与したり、コリネバクテリウム属に属しＬ−プロリ
ン拮抗物質耐性を有している菌株に５′−イノシン酸生
産能を付与したりすることにより得ることができる。

本発明の変異株は、コリネバクテリウム・アンモニアゲ
ネス（Ｃｏｒｙｎａｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ａｍｍｏｎｉ
ａｇａｎｅｓ）ＫＹ１３１８４（ＰＢＲＭ　Ｐ−３７９
０）　　（以下、ＫＹ１３１８４株という）を親株とし
て、これにＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグ
アニジン、紫外線、Ｘ線など通常の変異処理を施すこと
により得られる。

以下に本発明で用いられる変異株の具体的取得方法を示
す。

親株としてＫＹ１３１８４株を用い、該菌株をＮ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン１００μｇ
／ｍｆ！で３０℃、３０分処理した後、親株が生育阻害
を示す濃度（３ｍｇ／ｎｆｌ）の３．４−デヒドロ−Ｄ
、　　Ｌ−ブＯＩＪンを含む最少培地寒天平板（グルコ
ース２０ｇ／Ｉｔ、塩化アンモニウム２ｇ／β、ＫＨ２
ＰＯ４０，１ｇ　／　ｊ！、Ｋ２ＨＰ０．０．３　ｇ　
／β、Ｍｇ［：Ａ２・２）１２００．３ｇ／β、Ｐｅ５
ｏ４・７Ｈ２０１０ｍｇ＃！、Ｍｎ５ｏ＜　・４〜６８
２０１ｍｇ＃！　、　Ｚｎ５Ｏ＜　・７Ｈ２０１ｍｇ＃
　、　ＣｕＳＯ４・５）１２００．２＋ｎｇ＃！　、　
ＣａＣｊ７２・２１１２０　１０ｍｇ＃！　、　Ｌ−シ
スティン４０ｍｇ／ｊ！、Ｌ−アスパラギン０．５ｇ／
Ｉ！、サイアミン塩酸塩１０ｍｇ／β、パントテン酸カ
ルシウム２０＋ｎｇ＃！、ビオチン６０ｔｉｇ／Ｉ！、
ニコチン酸３ｇ　／ｊ２、アデニン２０ｍｇ／ｊ’、グ
アニン２０ＩＩ１ｇ／１１寒天２０ｇ／１２、ｐ１４７
．２＞上に塗布した。３０℃で７〜１０日間培養後、生
育してくる変異株のうち、親株より５′−イノシン酸の
生産能が優れている菌株を選んだ。そのうちとくに優れ
ている一株をコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＨ
−７４６４（以下、Ｈ−７４６４株という。）と命名し
た。

また、３．４−デヒドロ−Ｄ、Ｌ−プロリンの代わりに
Ｌ−アゼチジン２−カルボン酸を用いる以外は上記と同
様の方法をおこなって、得られた菌株のうち、とくに生
産性の優れた一株をコリネバクテリウム・アンモニアゲ
ネスＨ４４６５（以下、１ト７４６５株という。）と命
名した。

Ｈ−７４６４株およびＨ−７４６５株は、ブダペスト条
約にに基づいて、平成元年５月１８日付で工業技術院微
生物工業技術研究所にそれぞれ微工研条寄第２４２５号
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２４２５）および第２４２６号（Ｆ
ＢＲＭ　ＥＩＰ−２４２６）として寄託されている。

ＫＹ１３１８４株、Ｈ−７４６４株および）ｌ−７４６
５株を、それぞれＬ−プロリン拮抗物質を含む最少培地
寒天平板上で３０℃で１０日間培養したときの生育度を
第１十→・十分な生育、　＋：生育、　−：非生育本発
明で用いられる微生物の培養に際しては、一般に核酸の
発酵生産に用いられる培地が使用される。微生物が資化
しつる炭素源、窒素源、無機塩類、成育因子などを含有
する培地であれば、合成培地、天然培地などいかなる培
地でも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロ
ースあるいは糖蜜、澱粉などの加水分解物のほか、酢酸
、フマール酸、クエン酸などの各種有機酸、エタノール
、グリセロールなどのアルコール類などが使用できる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸アンモニウムな
どの各種無機塩類やフマール酸アンモニウムなどの有機
酸のアンモニウム塩、エチルアミンなどのアミン類、尿
素などの含窒素化合物、な−らびにペプトン、肉エキス
、酵母エキス、コーン・ステイープ・リカー、カゼイン
加水分解物、大豆粕またはその加水分解物、アミノ酸発
酵、核酸発酵などの各種発酵菌体およびその消化物など
が用いられる。

無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム
、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化す）ＩＪ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシ
ウムなどが用いられる。

そのほか、ビオチン、サイアミン、ニコチン酸、β−ア
ラニンなどのビタミン類やグルタミン酸などのアミノ酸
類を添加することがある。

培養は、振盪、深部攪拌などの好気的条件下、温度２０
〜４０℃、好ましくは２５〜３８℃で、ｐＨ５〜９、好
ましくは中性付近に保持しておこなわれ、通常２〜７日
間で完了する。培地のｐＨは炭酸カルシウム、無機また
は有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐ（１緩衝液
などによって調整される。

培養終了後、培養液から菌体などの沈澱物を除去し、イ
オン交換処理法、吸着法、抽出法、沈澱法などを併用す
ることにより、培養液から５′−イノシン酸を採取する
ことができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例Ｉ ＫＹ１３１８４株、Ｈ−７４６４株およびドア４６５株
をそれぞれ２１容三角フラスコ中の下記組成からなる種
培地３００ｍ１に植菌し、３０℃で２４時間培養した。

種培地組成、グルコース２０ｇ／ｊｌ！、ペプトン１０
ｇ／１２．肉エキス１０ｇ／Ｉｌ、酵母エキス５ｇ／β
、Ｎａ１Ｊ！　３ｇ　／　Ｉｌ　、ビオチン２ｈｇ／ｊ
！、アデニン１００ｍｇ／　ｉ’　、グアニン１００ｍ
ｇ／　Ｒ（ｐＨ７，２、Ｎａ０ＩＩまたはＨ２ＳＯ，で
調整、１２０℃で１０分間加圧蒸煮殺菌） 得られた３つの種培養液３００−をそれぞれ５Ｉ！容培
養槽中の下記組成からなる生産培地３βに植菌し、３０
℃で９６時間培養（回転数６００ｒｐｍ　、通気量３０
ｊ！／ｍ１ｎ）　した。培養中のｐＨは、アンモニア水
で６．８前後に調整した。

生産培地組成ニゲルコース１５０ｇ／β、ＫＩＩ２Ｐ０
゜１０ｇ／ＣＫ２１１Ｐ０．１０ｇ／β、Ｍｇ５Ｏ＋・
７Ｈ２０１０ｇ／Ａ、ＣａＣβ２−２８２００．１ｇ／
Ｅ、Ｚｎ５Ｏ１・７）１２０　５ｍｇ＃！、Ｆｅ５０＜
　・７ｔｂＯ２０ｍｇ＃ｉ　ＸＭｎＣｊ！　２　・ｌｌ
Ｈ２Ｏ５ｍＦＺ／Ｉ！、ビオチン３０ｕｇ／　ｊ２、パ
ントテン酸カルシラム１０ｍｇ／β、ビタミンＢ＋　５
ｍｇ／β、ニコチン酸５ｍｇ／Ｒ、アデニン１００ｍｇ
／　ｊ！　、グアニン１００ｍｇ／Ｌコーン・ステイー
プ・リカ−２ロ 素２ｇ／ｊ！　　（別途加圧蒸煮殺菌１２０℃、５分間
）（ｐＨ７．２、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ．で調整、１
２０℃、１０分間加圧蒸煮殺菌）その結果、ＫＹ１３１
８４株、）Ｉ−７４６４株およびＨ〜７４６５株の培養
液中の５′−イノシン酸生成量はそれぞれ２６．３ｇ／
ｊ！、２８．７ｇ／ｊ！および２８、９ｇ／ｊ！であっ
た。

Ｈ−７４６４株の培養終了液から菌体を除去して得られ
た上清液ｌｊ２を塩酸でｐＨ１．　４とし、ダイヤイオ
ン５ＫＩｔｌ　（Ｈ型、三菱化成社製）の樹脂塔に通塔
後ただちに蒸留水を通塔し溶出液を得た。その後樹脂塔
を水洗し、水洗初期の流水液中５′−イノシン酸を含む
両分を既に得られている溶出液と合併し、水酸化ナトリ
ウムでｐＨ７．　２に調整した。これをロータリーエバ
ポレーターで減圧濃縮することにより、２０．１ｇの５
′−イノシン酸ナトリウム塩の粗結晶を得た。

発明の効果 本発明によれば、５′−イノシン酸を工業的に安価に効
率よく製造することができる。

特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社手続主甫正
書（自発） １、事件の表示 平成　１年特許願第１３３８３０号 ２、発明の名称 発酵法による５゛−イノシン酸の製造法３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳細な
説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書第３頁６行のｒＳｉｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｊ
を’　Ｓｙｓ　ｔｅｍａ　ｔ　ｉｃ　Ｊに訂正する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネバクテリウム属に属し、Ｌ−プロリン拮抗
   物質に耐性を有し、かつ５′−イノシン酸生産能を有す
   る微生物を培地に培養し、培養物中に５′−イノシン酸
   を生成蓄積させ、該培養物より５′−イノシン酸を採取
   することを特徴とする発酵法による５′−イノシン酸の
   製造法。
2. （２）Ｌ−プロリン拮抗物質が、３，４−デヒドロ−Ｄ
   ，Ｌ−プロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸およ
   びＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸からなる群から選
   ばれる物質である請求項（１）記載の発酵法による５′
   −イノシン酸の製造法。