JPH02298855A - 固定化酵素とレドックス重合体を用いた電気化学的バイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、酵素電極すなわち電気化学的バイオセンサ
ーに関し、これは液体混合物もしくは、液体環境中の１
種以上の選択された成分の、濃度の電気化学的測定およ
び／または量の監視に用いられる。

これらの電気化学的バイオセンサーは、化学工業、食品
工業、生化学工業および動物とヒトの医学における臨床
用途に用いられ、特に、体液中の成分の生体内の濃度を
測定するのに使用される。

これらの電気化学的バイオセンサーについては、特定の
測定すなわち水性混合物中のグルコース濃度の測定を例
示して説明する。グルコース濃度の測定は、この発明の
目的の１つであるが、これによってその外の広範な目的
が除外されるものではない。

グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）による代表的な電流測
定用グルコース電極は、い（つかの化学的・または電気
化学的段階を経て、グルコース濃度と直線関係の測定可
能な電流を発生する。最初の段階で、グルコースは、上
記酵素の、酸化されたフラビンアデニンジヌクレオチド
（ＦＡＤ）中心を、その還元形（ＦＡＤＨ，）に変換す
る。これらのレドックス中心は酵素分子内にうまく位置
しているので、通常の電極の表面へ電子が直接移動する
ことは、測定可能な程度には起こらない。還元されたグ
ルコースオキシダーゼの量を間接的に測定する一般的な
方法、従って存在するグルコースの量を測定する方法は
、天然の酵素の反応による方法であり、Ｂｉｏｓｅｎｓ
ｏｒｓ：　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ　Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ（オックスフォード大学出版局、米
国、ニューヨーク、１９８７年）の第１章に記載され、
下記反応式％式％ この反応では、酵素はグルコースオキシダーゼの電子受
容体である。グルコースは、グルコースオキシダーゼに
よって起こる触媒反応によって酸化されて（脱水素され
て）グルコノラクトンになり１．一方酸素は還元されて
Ｈ２０□になる。０□とＨ２Ｏ２の濃度は通常の電気化
学的方法で測定できるので、上記反応で支配される０２
の消費量とＨ２０□の生成量を測定することによって間
接的にグルコースの濃度を得ることができる。この測定
系ではバイオサンサーが酸素の濃度に鋭敏であるという
欠点がある。

天然の電子受容体０□の代わりに、人工の電子受容体〔
媒介体（ｍｅｄｉａｔｏｒ）　］は、Ａｎａ１．　Ｃｈ
ｅｍ、　５６巻、６６７〜６７１頁、１９８４年に記載
されている下記の機構： によって、還元されたフラビンアデニンジヌクレオチド
と電極との間を電子を往復させるのに利用することがで
きる。

好ましい媒介種（ｍｅｄｉａｔｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｅｓ
）Ｍは、限定はされないが、フェロセンまたは置換フェ
ロセンであってもよい。

米国特許第４．５４５．３８２号と同第４，７１１，２
４５号には、酵素電極が開示されているが、この電極中
の媒介体はフェロセン分子もしくは置換フェロセン分子
である。可能性のある臨床用途または長期間の安定性が
望ましい場合には、電子が往復するレドックスカップル
に基づくセンサーは固有の欠点がある。すなわち溶解性
もしくは部分的に溶解性の媒介種は、電極表面から大量
の溶液中に拡散することがある。そのためこれらの装置
を移植可能なプローブに用いることが妨げられる。

米国特許第４．２２４．１２５号には、酵素電極が開示
されているが、この電極中の水溶性の媒介体は、重合体
の形態である。これは、大きさが非常に大きく固定膜を
通じて多量の溶液中に拡散できないように電極表面の近
傍に固定化するためである。

この重合体レドックス媒介体は、酵素触媒反応で還元さ
れ、電極が入っている近傍で電極で再酸化される。この
電極を設計するには、微小電極を用いるとき、もしくは
迅速な反応と高感度が電極の重要な特徴の場合に不利な
固定膜が必要である。

酵素触媒反応の速度に対応する速度で、酵素と電極との
間を電子を容易に移動させることができる媒介体を見つ
けることが望ましい。

さらに、媒介種としては、被検溶液に水溶性にして、電
極表面から拡散するのを防止するしかたで共有結合させ
た媒介種を用いることが好ましい妨害物質、特に酸素の
存在に比較的鈍感な媒介体を見つけることが特に望まし
い。

これらの目的は、媒介種がフレキシブルな重合体の主鎖
に化学的に結合され、この重合体主鎖によって、酵素の
ＦＡＤ／ＦＡＤＨ，中心と、結合された媒介体とが密着
し、しかも媒介種が電極表面から拡散するのを防止する
この発明によって達成されるこの発明には、電極感知シ
ステムの酵素触媒反応を媒介する特別な性質を有する一
群のレドックス重合体が含有される。このレドックス重
合は、ＤｅｇａｎｉとＨｅ１ｌｅｒが発表した（Ｊ、　
Ｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｍ、　９１巻、１２８５〜１２８９
頁、１９８７年）のと類似のしかたで電子移動リレーシ
ステムとして作用し、このシステム中、電子リレーは酵
素自体に共有結合している。この従来技術の設計の欠点
は、酵素の活性が多少減少していることである。別の欠
点は、この設計の用途が、この特定の結合化学反応を起
こす酵素に制限されるということである。この発明にお
いて、ＦＡＤ／ＦＡＤＨ２の中心と電極間に必要な電気
的通信は、酵素を修飾することなく達成される。

この発明で重要なことは、非常にフレキシブルな重合体
主鎖を使用することである。そしてこの主鎖は、結合し
ている媒介種で酵素の触媒中に密着させるのに充分に、
局所に配位子が移動可能であり、その結果電子コレクタ
ーに対する有効な電子移動リレーとして作用する。この
発明のシステムは、Ｄｅｇａｎｉ　ａｎｄ　Ｈｅ１ｌｅ
ｒの体系にしたがって修飾された酵素を含む全ての酸化
還元酵素に適用できる。

この発明は、１つの態様として、フレキシブルな重合体
主鎖に共有結合した網目構造の供与体／受容体リレーを
提供するものである。この発明の他の態様では、フレキ
シブルな主鎖がシロキサンポリマーで提供される。ポリ
シロキサン主鎖は、回転に対して事実上エネルギ障壁が
ないが、その独特のフレキシビリティによって、これら
のリレ一部分が酵素分子と密接に相互に作用し、ＦＡＤ
／ＦＡＤＨ，の中心と密着する。　Ｊ、　Ｅｌｅｃｔｒ
ｏａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、２５０巻、４１７〜４２５頁
、１９８８年で例証されたように、ポリ（ビニルフェロ
セン）のようなフレキシビリティの小さいレドックス重
合体は、酵素のレドックス中心と充分密着して有効な電
子移動リレーシステムとして働くことができないので、
上記のことは重要な問題である。

この発明の目的は、成分の液体混合物に用いて、酵素触
媒反応を受けることができる１種以上の選択された成分
の存在を検出し、該成分の量を測定および／または該成
分のレベルを監視する酵素電極であって、酸化還元酵素
と、酵素が触媒的に活性の場合に電子を電子コレクター
に移動させる重合体の媒介体とがともに、固定化された
状態で、電子コレクターの少な°（とも外面に保持され
ている酵素電極を提供することである。

この発明の他の目的は、重合体の媒介体が、フレキシブ
ルな重合体主鎖からなり、この主鎖には分子の媒介体化
合物が共有結合されて、供与体／受容体電子リレーシス
テムを形成する、前述の形式の酵素電極を提供すること
である。

この発明のさらに他の目的は、水性混合物に水溶性で、
固定膜なしで電極面に固定化される重合体の媒介体化合
物を提供するにある。

この発明のさらに他の目的は、小規模に作製することが
可能で、生体内の濃度測定に用いられる、前記形式の酵
素電極を提供するにある。

この発明を添付図面を参照して説明する。

この発明の電気化学的センサーは、人工のレドックス化
合物を用いて、電子を還元型酵素から電子コレクターに
高効率で移動させて、非生理的電子移動媒介体として機
能することを特徴とするものである。その高い効率は、
局所の配位子を移動させることができる非常にフレキシ
ブルな重合体の主鎖に由来するものであり、この主鎖に
よって、これに共重合している媒介体化合物が酵素のレ
ドック中心に密着される。酵素のレドックス中心は、酵
素内の非常に深いところに位置しているので、電子を、
通常の電極面に直接移動させることはできない。

好ましい重合体の主鎖はシロキサン重合体であるが、こ
れは、回転に対して事実上エネルギー障壁がな（、その
ため容易に局所のセグメントの運動を行えるという特徴
を有する。フレキシブルな重合体主鎖の他の例は、ポリ
ホスファゼン、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピ
レンオキシドである。

好ましい媒介体化合物はメタロセン類であり、これは、
２つの有機環構造物からなる有機金属化合物であり、各
有機環構造物は共役不飽和構造を有し、金属原子が前記
環構造物量にサンドイッチされている。その結果金属原
子は、不飽和環と電子せん断接触をしている。

フェロセン（ジシクロペンタジェニル鉄）と置換フェロ
セン化合物は、特に有効な媒介体であり、ｐＨに非依存
性の電気化学的可逆−電子レドックス性、ｐＨに非依存
性のレドックス電位、還元形の化合物の遅い自動酸化、
毒性もしくは発癌性の公知の問題がないこと、拮抗する
高レドックス電位の反応からの過剰の干渉を避けるのに
充分低いレドックス電位、酸素からの過剰の干渉を避け
るのに充分な酸素の無感応性および重合体主鎖に共有結
合する性能を有する。好ましい態様においては、低分子
量のフェロセンの種は重合体中に存在しない。その理由
は、かような種は、自由に拡散する電子移動媒介体とし
て作用できるからである。

フェロセン媒介化合物のその外の利点は、シクロペンタ
ジェニル環の電子供与性基もしくは電子求引性基の置換
によって広範囲にわたってレドックス電位を制御できる
ことである。

好ましい置換フェロセン類としては、限定されないが、
１，１°−ジメチルフェロセン、ビニルフェロセン、ヒ
ドロキシエチルフェロセン、１４°−ビス（ヒドロキシ
メチル）フェロセン、カルボキシフェロセン、フェロセ
ニルモノカルボン酸、１，１゜−ジカルボキシフェロセ
ンおよびトリメチルアミノフェロセンが挙げられる。

シロキサン主鎖、および結合されたフェロセンもしくは
置換フェロセンの媒介化合物による好ましい重合体媒介
体系は、下記構造式１　：（式中、Ｆｃはフェロセニル
基もしくは置換フェロセニル基、およびｎは１０〜５０
、但しｎは３５近傍が好ましい）で表される。

゛　他の好ましい媒介化合物としては、ルテノセン、ジ
ベンゼンクロム、フェナジンとフェナジン誘導体、ビオ
ロゲン、リボフラビン、ｐ−ベンゾキノンおよびナツタ
キノンが挙げられる。一般に、ポリマー主鎖に共有結合
することが可能でレドックス電位が飽和カロメル電極（
ＳＣＥ）に対して−０，２〜０．６ｖの範囲にあるレド
ックス化合物を利用することができる。

フェロセンおよび置換フェロセン化合物が特に適切であ
る。というのはフェロセン類は広範囲の酵素に対する電
子の移動を媒介することができるからである。

好ましい酵素は、非酸素特異的フラボタンパク質酵素ま
たはキノタンパク質酵素、特にグルコースオキシダーゼ
とグルコースヒドロゲナーゼである。その外のフラボタ
ンパク質酵素には、アルデヒドオキシダーゼ（アルデヒ
ド類）、グリコール酸オキシダーゼ（グリコラート）グ
ルタチオンレダクターゼ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）　、乳酸オ
キシターゼ（ラクテート）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ
（Ｌ−アミ、）酸類）、リボアミドデヒドロゲナーゼ（
ＮＡＩ）Ｈ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ピルベート）
、サルコシンオキシダーゼ（サルコシン）、コリンオキ
シダーゼ（コリン）およびキサンチンオキシダーゼ（キ
サンチン）が含まれる。なお酵素が特異的な基質は括弧
内に示しである。

その外のキノタンパク質酵素としては、メチルアミンデ
ヒドロゲナーゼ（メチルアミン）およびメタノールデヒ
ドロデナーゼ（メタノールなどのアルコール類）が挙げ
られる。

フェロセン類によって酸化されうるヘム含有酵素類とし
ては、西洋ワサビペルオキシグーゼ（過酸化水素）、乳
酸デヒドロゲナーゼ（ラクテート）および酵母シトクロ
ムＣペルオキシダーゼ（過酸化水素）が挙げられる。

銅タンパク質酵素がラクトースオキシダーゼ（ガラクト
ース）とメタロフラビンタンパク質酵素−酸化炭素還元
酵素（−酸化炭素）も利用できる酵素電極は、黒鉛粉末
、シロキサン−フェロセン重合体およびグルコースオキ
シダーゼを混合し、獲られた混合物をペーストに混合し
、次に第１図に略図を示すように、電極ハウジングの低
部のウェル中に充填することによって作製される。

長期間の安定性を得るために、酵素なシロキサン重合体
の主鎖に共有結合させて固定化するのが有利である。こ
の固定化はＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、　３巻、４５〜５６
頁（１９８７年／　１９８８年）に記載された方法で達
成できるが、この方法は、シロキサン主鎖のいくつかの
重合体連鎖に選択的に結合させたアミン群、または上記
重合体連鎖に結合させたフェロセン類で行われる。

電子コレクターの材料としては、成形が容易で表面積が
大きいことから黒鉛のペーストが好ましい。その外の電
極の材料としては、銀、白金、ニッケル、グラッシーカ
ーボンまたは酸化錫であってもよい。

この発明の酸素電極の製造方法は、下記の実施例を参照
することによって一層充分に理解することができる。

この発明の下記の態様において、酸素はグルコースオキ
シダーゼであり、重合体は前記式１のシロキサン−フェ
ロセン重合体（式中Ｆｃはフェロセニル基およびｎは３
５近傍）である。

このフェロセンで修飾したシロキサン単独重合体を、ビ
ニルフェロセンをポリメチルヒドロシロキサンでヒドロ
シリル化することによって製造した。窒素雰囲気下、ポ
リメチルヒドロシロキサン（分子量２２７０）を、クロ
ロ白金酸の存在下、過剰量のビニルフェロセンのトルエ
ン溶液中に添加した。反応混合物を還流温度に加熱した
。反応は、５Ｌ−Ｈの赤外線吸収バンドが消えるまで続
けさせた。なおこのバンド消失は出発重合体がすべて生
成物に変換したことを示す。得られたフェロセン修飾シ
ロキサン重合体は、室温で大過剰量のアセトニトロルに
滴下することによってクロロホルム溶液から再沈澱させ
ることによって精製した。この再沈澱は、薄層クロマト
グラフィーが、沈澱中にビニルフェロセンが存在しない
ことを示すまで繰り返した。

図面について説明する。第１図は、この発明の酵素電極
の構造の詳細を示す。この酵素電極は、電気絶縁材料製
の円筒形電極ホルダー１、円板形に形成され電極ホルダ
ー内の凹所に設けられたカーボン製の電子コレクター２
、電子コレクター２に接続された引込線４およびカーボ
ンペースト３を含有する酵素−重合体系で構成されてい
る。カーボンペーストは、１００ｍｇの黒鉛粉末をＬｍ
ｇのフェロセン含有重合体と充分混合することによって
製造した。なお後者はクロロホルムに溶解したものを用
いた。溶媒を蒸発させた後、１０ｍｇのグルコースオキ
シダーゼ（１２９，０００単位／ｍｇ）と２０μｆｆの
パラフィン油を添加し、得られた混合物をベーストに混
合した。得られたペーストを、ガラス製の電極ホルダー
（内径６ｍｍ　）の低部の２ｍｍ深さの凹所に充填した
。電流反応を測定するために、参照電極は飽和カロメル
電極（ＳＣＥ　）とし、補助電極は白金線とした。溶液
類は、各実験を行う前に、窒素で脱酸素化した。

０．１ＭＫ１を添加したｐＨ７，０のリン酸緩衝液によ
る溶液中のグルコースの濃度の関数として測定した電流
の変化を示す電流反応曲線を、第２図に示す。この酵素
電極は、ポテンショスタットに接続し、ＳＣＥ参照電極
に対して４００ｍＶの一定電位差を保持した。発生する
電流はグルコースの濃度に比例している。９５％反応の
時間は約２分間である。

去ＪＬ［ｕ旦 下記の態様では、酵素はグルコースオキシダーゼで、重
合体は下記構造式■： （式中、Ｆｃは前記定義と同一でｏ：ｐ比は約２＝１で
、ｏ　＋ｐは１０に等しいか１０を超え、サブユニット
はランダムに分布してランダムブロック共重合体を形成
する）で表される共重合体であった。

この態様の共重合体は、１式の単独重合体よりフェロセ
ンの濃度が低い。立体障害が減少した結果、局所のセグ
メントの運動がより容易な一層フレキシブルな重合体が
得られ、フェロセン類と酵素のレドックス中心とが一層
よく密着する。

グルコースオキシダーゼ／メチル（フェロセニルエチル
）−〇−ジメチル（１：２　）シロキサン共重合体を用
いた実験結果は、特定のグルコース濃度１０−”ｍｏｌ
／βに対する電流の増加が３５μＡであることを示した
。この値は、実施例１の反応をこえた約３倍の改良であ
る。

白金線（直径０．０１インチ）を、実施例１のフェロセ
ン修飾シロキサン重合体の１０ｍｇ／ｎ＋１２溶液によ
って浸漬コートし、次にグリコール酸オキシダーゼ（３
０単位／ｍｊ２．　ｐＨ８，３トリス緩衝液中）で浸漬
コートした。グリコール酸ナトリウムに対する電流反応
を、リン酸緩衝液、０．１ＭＫＣｌ、からなりｐＨ８，
７の溶液中、ＳＣＨに対する電位差５００ｍＶで測定し
た。得られた溶液をＮ２で脱気した。３０ｍＭのグリコ
ール酸ナトリウムを添加した所、電流は０．１１μＡで
あった。

この発明の特定の態様を記載してきたが、この発明はそ
れに限定されず、多くの自明な改変およびそれらの変更
は当業者ならば行うことができ、またかような改変と変
更は特許請求の範囲の範囲内に含まれることは勿論理解
されるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の酵素電極の縦方向の断面を示す部
分概略図であり、第２図は、第１図の電極で検知された
電流をグルコース濃度に対して示すグラフである。 １・・・電極ホルダー ２・・・電子コレクター ３・・・カーボンペースト ４・・・引込線 イ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成分の混合物の少なくとも１つの成分の存在を感知
   する酵素電極であって； （ａ）その触媒活性が上記成分を表示する酵素、（ｂ）
   酵素と電子コレクター間の電子移動媒介体として作用し
   、不溶性のフレキシブルな重合体主鎖に、電子リレー系
   を形成するのに充分な数で共有結合された人工のレドッ
   クス化合物、および（ｃ）前記酵素と、前記媒介体を含
   有する重合体が接触して固定化されている電子コレクタ
   ー、からなる酵素電極。 ２、重合体主鎖がシロキサンである請求項１記載の酵素
   電極。 ３、レドックス化合物がフェロセンもしくは置換フェロ
   センである請求項１記載の酵素電極。 ４、レドックス化合物が、フェロセン、１，１′−ジカ
   ルボキシフェロセン、カルボキシフェロセン、ビニルフ
   ェロセン、１，１′−ジメチルフェロセン、フェロセニ
   ル−モノカルボン酸、ヒドロキシエチルフェロセンおよ
   び１，１′−ビス（ヒドロキシメチル）フェロセンから
   なる群から選択される請求項３記載の酵素電極。 ５、レドックス化合物がフェロセンもしくは置換フェロ
   センであり、重合体主鎖がシロキサンで、レドックス化
   合物が重合体主鎖に共有結合されている請求項１記載の
   酵素電極。 ６、酵素がグルコースオキシダーゼである請求項１記載
   の酵素電極。 ７、酵素がグリコール酸オキシダーゼである請求項１記
   載の酵素電極。 ８、グルコースを含有する液体混合物中で用いてグルコ
   ースの存在に対して反応する請求項６記載の酵素電極。 ９、グリコレートを含有する液体混合物中で用いてグリ
   コレートの存在に反応する請求項７記載の酵素電極。 １０、重合体主鎖がシロキサンであり、酵素がこの重合
   体主鎖に共有結合している請求項８記載の酵素電極。 １１、重合体主鎖がシロキサンであり、レドックス化合
   物がフェロセンで、酵素がグルコースオキシダーゼであ
   る請求項１記載の酵素電極。 １２、電子コレクターが黒鉛粉末で構成され、前記グル
   コースオキシダーゼと前記重合体と前記フェロセンが前
   記黒鉛粉末の外表面に位置する請求項１１記載の酵素電
   極。 １３、水とグルコース分子を透過可能な保護膜を備え、
   この膜が前記の黒鉛電子コレクターの前記外表面を被覆
   する請求項１１記載の酵素電極。 １４、電子コレクターが白金または無心炭素で構成され
   ている請求項６記載の酵素電極。 １５、前記酵素電極をヒト被験者に移植する手段を備え
   た請求項１記載の酵素電極。