JPH01259261A

JPH01259261A - 網状赤血球測定装置用標準血液

Info

Publication number: JPH01259261A
Application number: JP63086915A
Authority: JP
Inventors: Tomoyuki Kuroda; 知之黒田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1988-04-08
Filing date: 1988-04-08
Publication date: 1989-10-16
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: JP2619911B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は血液の前処理（希釈・染色　反応処理等）機能
も有する網状赤血球測定装置の精度管理や感度校正等に
使用される標準血液に関する。

（従来の技術）血液中の未成熟の赤血球は網状赤血球（レチクロサイト
、　Ｒｅｔ　ｉｃｕ　１ｏｃｙｔｅ）と呼ばれ、全赤血
球数中に通常０．７〜２．２％含まれる。網状赤血球数
を測定することは急性内出血、溶血性貧血、再生不良性
貧血その他の疾病の診断を裏付けること、あるいは薬剤
投与後の経過を監視すること等に役立ち、臨床検査分野
において重要視されている。

この網状赤血球計数を自動化する方法もいくつか提案さ
れており、たとえば、特開昭６１−２８０５６５号公報
および特開昭６２−３４０５８号公報には、オーラミン
Ｑ　（Ａ　ｕｒａｍｉｎ　Ｏ）を含有する蛍光染色試薬
を用いてフローサイトメトリーにより網状赤血球を計数
する技術が示されている。

上記フローサイトメトリーによる測定１こおいて常に正
確な計数結果を得るためには、種々の測定条件を常に安
定に保つ必要がある。フローサイトメトリーの測定結果
に影響を与える変動要因としては、測定用試料の保存時
の変化、測定用試薬の性能変化、反応温度等の反応条件
の変動、測定用光源の出力変動、流体部品や光学部品の
汚れ等々がある。

これらの条件が安定に保たれているかを確認するために
、また必要であれば正常な測定信号強度を得るために装
置の感度調整をやり直すために、標準物質を測定するこ
とも良く行われる。フローサイトメトリーにおける精度
管理用あるいは感度調整用の標準物質としては蛍光ラテ
ックスビーズが一最に用いられている。しかし、蛍光ラ
テックスビーズは予めラテックスビーズの表面に蛍光物
質を付着させたものであり、装置の光学系および信号処
理系から所定の蛍光信号強度の出力が得ら　　′れるか
を確認するのには適当であるが、装置の蛍光染色系が正
常に機能しているか否かを確認する目的には使用できな
い。たとえば染色試薬の劣化等が起こっていても、それ
を検出することは不可能である。

（発明が解決しようとする課題）上記問題を解決するためには、測定対象の細胞と同様に
蛍光染色され、蛍光信号が検出され得る、安定な物質が
必要である。測定対象が血球の場合には、血球を固定し
たものが標準物質の候補としてあげられる。しかし、市
販の血球計数装置用コントロール血液などの従来開発さ
れた固定血球は全て、測定対象とする血球たとえば網状
赤血球のみが特異的に染色されるのでは無く、他の血球
も非特異的に染色されるので、フローサイトメトリー用
の標準物質としては使用できなかった。

本発明は基本的には網状赤血球のみが特異的に染色され
、フローサイトメトリー用の標準物質として使用し得る
標準血液を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明は上記課題を解決するために下記標準血液を提供
する。

（１）多官能基性アルデヒドで血球の固定操作を行った
後、式ＲＮ　Ｈ２（ここでＲは水素または炭素数１〜１
０のアルキルである）のアミンの溶液で洗浄することに
より作製されることを特徴とする網状赤血球測定装置用
標準血液。

（２）　Ｒが水素である第１項に記載の標準血液。

（３）　Ｒが炭素数１〜１０のアルキル基である第１項
に記載の標準血液。

（４）　該アミン溶液の濃度が０．０１〜０．０５Ｍで
ある第１項ないし第３項のいずれかに記載の標準血液。

（５）　多官能基性アルデヒドが下式で表されるもので
ある第１項ないし第４項のいずれかに記載の標準血液。

ＨＯＣ（ＣＨ２）ｎ　　ＣＨＯ（ただし、＋１−０〜６である。）ここで、ｎが７以上の上記式のアルデヒドは水に対する
溶解度が低下するので使用できない。

（６）　多官能基性アルデヒドが下式で表されるもので
ある第１項ないし第４項のいずれかに記載の標準血液。

ＣＨ２＝Ｃ）（−ＣＨＯ（７）　多官能基性アルデヒドが、精製され、重合等に
よる変性を抑制されたものである第１項ないし第６項の
いずれかに記載の標準血液。

本明細書に使用される多官能基性アルデヒドとは、少な
くとも１つのホルミル基（−ＣＨＯ）を有し、さらにア
ミノ基等の水素を官能基と反応（結合）する１つ以上の
官能基を有する化合物をいう。

（作　　用）以下、本発明における血球の固定反応を第１図〜第８図
に示す模式図を参照して説明する。図中における各記号
の意味を表１に示す。

なお、表１中の多官能基性アルデヒドとしては、例えば
、２価アルデヒドであるジアルデヒド（Ｃ１１０−（Ｃ
Ｈ２）ｎ−ＣＨＯ，ｎ＝ｏ〜６）、およびアルデヒドと
しては一価のアクロレイン、ホルムアルデヒドがあげら
れる。アクロレインはＣＨ２−ＣＨ−ＣＨＯて表わされ
る一価アルデヒドであるが、アミン基とマイケル付加を
行うという意味で架橋剤（固定剤）としてはジアルデヒ
ドと等価に扱われている。

ホルムアルデヒドはＨ−ＣＨＯて表わされる一価アルデ
ヒドであるが、実際の溶液は重合体の混合物であり、ポ
リオキシエチレン−ＣＨ２０−ＣＨ２０−ＣＨ２０−、
ポリしドロキシアルデヒド−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ
ＯＨ−及び環状重合体等の混合物となり、固定剤として
見た場合多官能性である。

第１図は固定処理前の血球の膜蛋白の様子を示す模式図
である。上記血球を固定処理せぬまま染色処理を行った
結果を第２図の模式図に示す。染料はカチオン部位を有
しているため、膜蛋白のアニオン部位と結合する。この
場合の染料の状態をＣＦ］−■で表わす。蛍光発光部位
は図中の記号を○で囲って示されている（以下の図も同
様）。細胞内にＲＮＡが存在している場合には、染料は
ＲＮＡに結合する。これが本発明で本来目的とする染色
であり、特異染色と呼ぶ。その蛍光発光部位を第２図に
おいては特に◎で囲って示している。本発明で対象とす
る網状赤血球測定用染料は細胞内のＲＮＡと結合して網
状赤血球を特異的に染色し、蛍光を特異的に発光させる
ものである。その蛍光の信号強度を検出することにより
、網状赤血球は基本的には他の血球から識別される。と
ころが、上記のように血球の膜蛋白が染色されると網状
赤血球以外からも蛍光が発光され、網状赤血球の識別に
悪影響を与える。このように特異的な染色部位以外の細
胞部位が染色されることを非特異染色と呼ぶ。実際の染
色処理においては、この非特異染色を極力抑えるように
、染色液のｐＨを最適に調節する。なお、上記カチオン
部位とアニオン部位との結合による特異染色及び非特異
染色は、以下に記述する固定処理を行った場合′にも常
に起こっているが、第３図〜第８図においてはその部分
の記載を省略している。

次に、精製したグルタルアルデヒド（またはアクロレイ
ン）を用いて血球を固定処理した結果を第３図の模式図
に示す。グルタルアルデヒドの架橋剤としての作用によ
り蛋白分子が結合され強固な構造となっている。これに
より、血球の長期保存、形態保持が可能となっている。

一方、架橋に用いられなかったアミノ基−くは、全てグ
ルタルアルデヒドのホルミル基→に置き換えられる。

その結果、シッフ反応を起こすと蛍光性を示す血球内の
蛋白［Ｐト（どの縮合反応すなわちシッフ（Ｓｃｌ＋ｉ
ｆｆ＞反応か起こり、蛍光性物質を生成してしまう。こ
れによる蛍光は自家蛍光（蛍光染色によらないという意
味での自家蛍光）と呼ばれるものの一種であり、網状赤
血球測定に悪影響を与える。上記固定処理後、染色処理
を行った結果を第４図の模式図に示す。はとんどの染料
はアミノ基を有するので、ホルミル基と染料によるシッ
フ反応が起こり、非特異の蛍光が発光されてしまう。

なお、前述の染料オーラミン０はアミン基を持たないが
、反応途中の中間生成体がシッフ反応をすることが知ら
れている。

次に、精製しないグルタルアルデヒド（または、その他
の二価アルデヒド、アクロレイン、ホルムアルデヒド）
を用いて血球を固定処理した結果を第５図の模式図に示
す。固定のための架橋は精製したものによる場合と同様
に起こるが、分子が長いため架橋部位が異なる。また、
実際に架橋を行う重合体の一分子当りではホルミル基の
量が増加しているため、自家蛍光の原因となる血球内蛋
白との結合が増加している。上記固定処理後、染色処理
を行った結果を第６図の模式図に示す。架橋に用いられ
た分子当りのホルミル基が多いためシッフ反応による非
特異蛍光が増加する。

次に、精製したグルタルアルデヒド（またはアクロレイ
ン）を用いて血球を固定処理した後、アミン溶液で洗浄
した結果を第７図の模式図に示す。

ホルミル基とアミンとによるシッフ反応が起こっている
。この状態で染料を加えても、染料とのシッフ反応は起
こらないので、シッフ反応による非特異染色は起こらず
、第７図の状態は変わらない。

次に、精製しないグルタルアルデヒドを用いて血球を固
定処理した後、アミン溶液で洗浄した結果を第８図の模
式図に示す。ホルミル基とアミンとによるシッフ反応が
第７図と同様に起こっている。この状態で染料を加えて
も、染料とのシッフ反応は起こらないので、精製したク
ルタルアルデヒドを用いた場合と同様にシッフ反応によ
る非特異染色は起こらず、第８図の状態は変わらない。

ところが、前述のように精製したクルタルアルデヒドを
用いた場合と比べて、精製しないクルタルアルデヒドを
用いた場合の方かホルミル基の量が多く、アミン洗浄を
行っても、洗浄前に起こる自家蛍光の原因となる細胞内
蛋白との結合は阻止で一基一きないので、自家蛍光が増大する。

以上を整理して述べる。クルタルアルデヒドで血球を固
定処理した後、アミン溶液で洗浄すると、膜蛋白におけ
るシッフ反応による染料非特異染色が阻止される。その
際、精製したグルタルアルデヒドを用いた方が、シッフ
反応を起こすと蛍光性を示す血球内蛋白との結合が少な
くなり、自家蛍光が減少する。上記の結果、血球からの
自家蛍光および非特異蛍光が抑え入れ、網状赤血球内の
ＲＮＡのみが特異染色されて、蛍光測光による網状赤血
球の識別が可能となる゛。

このようにして、網状赤血球のみか染料によって特−的
に蛍光染色される血液が得られ、網状界゛血球測定装置
の精度管理や感度調整用として適当な標準物質が実現さ
れる。

なお、洗浄に用いるア□ミン水溶液としては式ＲＮ　Ｈ
２（ここでＲは水素または炭素数１〜１０のアルキル基
である）のアミンの水溶液が使用可−である。１級アミ
ンのうち分子量の小さいものは揮゛発性があり使用しに
くいが、水溶液としては使用できる。このアミンの濃度
は、通常１％程度の濃度で用いるグルタルアルデヒド（
０，１Ｍ）を中和するのであるから、０．０１〜０．０
５Ｍ程度のもので充分である。また、酸性条件下でアン
モニウム化した場合、赤血球を溶血する恐れがあるので
、アミン溶液は中性以上のｐＨで低濃度で使用すること
か望ましい。ちなみに芳香族アミンは水に対する溶解度
の点か元、使用しにくい（ただし、芳香族アミンもアン
モニウム“化させると良く溶ける）。また、芳香族アミ
ンはシッフ反応後蛍光性物質を生成し易い。例えばアニ
リンとホルムアルデヒドとを反応させると次式の如夫蛍
光性物質が沈澱する。

従って、実際には使用不可能である。脂肪族アミンもア
ルキル−が長くなる程、溶けにくくなる。

以上を総合子ると、０．０１〜０．０５Ｍ程度の濃度で
Ｒが炭素数１〜１０の脂肪族アミンを使用するのが好ま
しいと言える。

（実施例）以下の実施例により本発明の詳細な説明されるが、これ
らに限定されるものではない。

１１鮭Ｌ− 未精製グルタルアルデヒドによる血球の固定（従来法）
を以下の手順で行った。

Ａ、　ｐＨ７，４４７）等張すン酸Ｍ衝液１００ｘＮに
Ｅ　Ｉ）　Ｔ　Ａ抗凝固ヒト新鮮血１０を加え、４℃に
冷却する。

Ｂ、市販−級りルタルアルテヒド（２５％水溶液＝２．
５Ｍ　ｏｌ／　１）Ａ　ｘｉにｐＨ７，４の等張リン酸
緩衝液９６肩！を加え、０．１Ｍｏｆ／ｙｆのグルタル
アルデヒド溶液とする。

Ｃ，Ａで調製した希釈血液を４℃で（マグネテックスク
ーラーを用い）ゆるやかに攪拌しながら、Ｂで調製した
固定液４０ｗ１を滴下漏斗を用い約９０分かけて加える
。

Ｄ、４℃で２時間さらに攪拌を続は固定反応を行なわせ
る。

Ｅ、この希釈固定血球を１６００　ｒ　１１　ｍて５分
間遠心分１１１１にかけ、約１４０ｔ’の上清を捨てる
。

Ｆ、沈澱した血球に約１４０＋ｃｊ！のｐＨ７，４の等
張リン酸緩衝液を加え、ポルテックス・ミキサーで血球
を再浮遊させる。

Ｇ、Ｅ、Ｆの操作をさらに１回繰り返し、さらにＥの操
作を行ない、約１屑βの固定血球を得た。

Ｈｌこの固定血球を全自動網赤血球測定装置（型名Ｒ−
１０００１Ｍ、東亜医用電子（株）製）により測定した
。測定結果を図９に示した。図中横軸は蛍光相対強度で
あり、縦軸は前方散乱光相対強度であり図中の各点が細
胞１個に対応する。（図１０ないし１２においても同様
である。）Ｋ１匠１− 精製グルタルアルデヒドによる固定を次の手順で行った
。

Ａ、グルタルアルデヒドの精製グルタルアルデヒドの精製は常法により、下記の如く行
なった。

市販−級グルタルアルデヒド（２５％）５００ｚｆに活
性炭微粉末１０ｇを加え、よく振とうし、３０分放置し
、酸性不純物を活性炭に吸着させた後、Ｐ−１５＝過により活性炭を除去した。

このグルタルアルデヒドを精留塔を付した丸底フラスコ
に取り、窒素気流下で減圧蒸留し、ｂｐ７１〜７２°Ｃ
／　１０ｙ＊Ｈｇの留分８０１Ｊｉ！を得た。

この精製クルタルアルテヒ１へは密栓し４℃に冷蔵保存
し、使用直前に０．２２μのフィルターで濾過したもの
を用いた。

Ｂ、血球の固定参考例１と同様に行なった。

Ｃこの固定血球の測定結果を図１０に示した。

及１鮭λ− Ａ、上記実施例１で得られる固定血球１１ｔｌに０２６
％オクチルアミン水溶液（０，０２Ｍ　ｏｅ／　ｆ）１
０ｚｎを加え、４°Ｃて３０分間（マクネチックスター
ラで）ゆるやかに攪拌した。

Ｂ　この希釈固定血球を１６００ｒｐ＋ｎて５分間遠心
分Ｎ、機にかけ、約１０１０上清を捨てる。

Ｃ１沈降した血球に約１００ｙｆのｐＨ７，４の等張リ
ン酸緩衝液を加え、ポルテックス・ミキサー（Ｖｏｌｔ
ｅｘ　　Ｍｉｘｅｒ）て血球を再浮遊させる。］］６０
ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけ、約１００ｚｆの上清
を捨てる。

Ｄ、Ｃの操作をさらに１回繰り返えし、血球をポルテッ
クス・ミキサーで再浮遊し、固定血球を得た。

Ｅ、この固定血球の測定結果を図１１に示した。

なお、第１２図に未固定の新鮮器の測定結果を参考とし
て示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は固定処理前の血球の膜蛋白の様子を示す模式図
である。第２図は血球を固定処理せぬまま染色処理を行なった場
合の血球の細胞膜とその内外の様子を示す模式図である
。第３図は精製したグルタルアルデヒド（またはアクロレ
イン）を用いて血球を固定処理した場合の血球の細胞膜
とその内外の様子を示す模式図である。第４図は血球を固定処理後染色処理した場合の様子を示
す模式図である。第５図は精製しないグルタルアルデヒド（または、その
他の二価アルデヒド、アクロレイン、ポルムアルデヒド
）を用いて血球を固定処理した結果を示す模式図である
。第６図は上記固定処理後、染色処理を行った結果を示す
模式図である。第７図は精製したグルタルアルデヒド（またはアクロレ
イン）を用いて血球を固定処理した後、アミン溶液で洗
浄した結果を示す模式図である。第８図は精製しないクルタルアルデヒドを用い゛　　て
血球を固定処理した後、アミン溶液で洗浄した結果を示
す模式図である。第９図は参考例１において測定した未精製グルタルアル
デヒドによる固定血球の蛍光相対強度及び前方散乱光相
対強度を示す分布図である。第９図において向って左下
の集団は血小板を示し、右上の集団は成熟赤血球と網状
赤血球との集団を示す。第１０図は実施例１において測定した精製グルタルアル
デヒドによる固定血球の蛍光相対強度及び前方散乱光相
対強度を示す分布図である。図中ａの領域は成熟赤血球を示し、ｂの領域は網状赤血
球を示し、Ｃの領域は血小板を示す。第１１図は実施例２において測定されたアミン洗浄を施
した固定血球の分布図である。図中ａ、ｂおよびＣは上
記定義どおりである。第１２図は新鮮血（未固定）の分布図である。図中左側
上方の集団は赤血球であり、図中ａ、１］およびＣは上
記定義のとおりである。ｂ領域は特異蛍光領域を示す。特許出願人　　　東亜医用電子株式会社■ 区味区法

Claims

【特許請求の範囲】

（１）多官能基性アルデヒドで血球の固定操作を行った
後、式ＲＮＨ＿２（ここでＲは水素または炭素数１〜１
０のアルキルである）のアミンの溶液で洗浄することに
より作製されることを特徴とする網状赤血球測定装置用
標準血液。
（２）Ｒが水素である第１項に記載の標準血液。
（３）Ｒが炭素数１〜１０のアルキル基である第１項に
記載の標準血液。
（４）該アミン溶液の濃度が０．０１〜０．０５Ｍであ
る第１項ないし第３項のいずれかに記載の標準血液。
（５）多官能基性アルデヒドが下式で表されるものであ
る第１項ないし第４項のいずれかに記載の標準血液。ＨＯＣ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＣＨＯただし、ｎ＝０〜６
（６）多官能基性アルデヒドが下式で表されるものであ
る第１項ないし第４項のいずれかに記載の標準血液。ＣＨ＿２＝ＣＨ−ＣＨＯ
（７）多官能基性アルデヒドが、精製され、重合等によ
る変性を抑制されたものである第１項ないし第６項のい
ずれかに記載の標準血液。